KR20140041888A - 신경발달 장애, 신경 장애 또는 신경정신계 장애의 치료에서 임상적 이점을 예측하는 방법 - Google Patents

Abstract

본 발명은 i) 환자의 샘플에서 보체 인자 H 계열의 1종, 2종, 3종, 4종, 5종 또는 6종의 구성원, 또는 이의 혼합물 또는 조합물의 단백질 농도를 결정하는 단계; ii) 단계 i)에서 결정된 단백질 농도를, 신경발달 장애, 신경 장애 또는 신경정신계 장애를 앓는 환자에서의 보체 인자 H 계열의 1종, 2종, 3종, 4종, 5종 또는 6종의 구성원의 단백질 농도의 대표값과 비교하는 단계; iii) 신경발달 장애, 신경 장애 또는 신경정신계 장애를 앓는 환자의 샘플에서의 보체 인자 H 계열로부터의 1종, 2종, 3종, 4종, 5종 또는 6종의 구성원의 더 높은 단백질 농도가, 글루타메이트 신경전달 경로를 표적화하는 화합물에 의한 치료로부터 임상적 이점을 얻을 환자를 나타내는 단계; 및 iv) 신경발달 장애, 신경 장애 또는 신경정신계 장애를 앓는 환자를 위하여 이러한 치료를 선택하는 단계를 포함하는, 글루타메이트 신경전달 경로를 표적화하는 화합물에 의해 치료되는 경우, 신경발달 장애, 신경 장애 또는 신경정신계 장애를 앓는 환자에 대한 반응을 예측하는 시험관내 방법에 관한 것이다.

Description

신경발달 장애, 신경 장애 또는 신경정신계 장애의 치료에서 임상적 이점을 예측하는 방법{A METHOD FOR PREDICTING CLINICAL BENEFIT IN THE TREATMENT OF NEURODEVELOPMENTAL, NEUROLOGICAL OR NEUROPSYCHIATRIC DISORDERS}

본 발명은 글루타메이트 신경전달(glutamatergic) 경로를 표적화하는 화합물에 의해 신경발달 장애, 신경 장애 또는 신경정신계 장애를 앓는 환자를 치료하기 위한 임상적 이점에 대해 예측하는 방법에 관한 것이다.

신경발달 장애는 뇌 또는 중추 신경계의 성장 및 발달의 손상이다. 이 용어는 더 좁게는 감정, 학습 능력 및 기억력, 및 사회적 유능성, 기량 및 행동에 영향을 주고, 개개인의 성장에 따라 전개되는 뇌 기능 장애를 지칭하기 위해 사용된다. 선천적 신경발달 장애로 고려되는 장애 또는 유아기 및 유년기에 초래될 경우 신경발달 문제를 갖는 것으로 고려되는 장애로는, 자폐증 및 자폐 스펙트럼 장애, 예컨대 아스퍼거(Asperger) 증후군, 정신적 외상성 뇌 손상(선천적 손상 포함), 예컨대 뇌성마비, 의사소통 장애, 구어 장애(speech disorder) 및 언어 장애를 일으키는 손상, 유전적 장애, 예컨대 취약-X 증후군(fragile-X syndrome) 및 다운 증후군(Down syndrome)이 포함된다. 신경발달 장애는 일반적으로 개인, 가계 및 사회에게 지워지는 광범위한 정도의 정신적, 감정적, 신체적 및 경제적 부담과 연관된다.

신경 장애는 신체 신경계의 장애이다. 뇌, 척수, 또는 이들로의 신경 유도 또는 이들로부터의 신경 유도에 있어서의 구조적, 생화학적 또는 전기적 비정상성은, 증후, 예컨대 마비, 근육 약화, 불량한 협응(coordination), 감각의 손실, 발작, 혼란, 통증, 무관심 및 의식의 변경된 상태를 초래할 수 있다. 어느 정도 상대적으로는 보편적이지만 상당히 드문 많은 인식된 신경 장애가 존재한다. 세계 보건 기구(World Health Organization)는 2006년도에 신경 장애 및 이들의 후유증이 10억명이나 되는 전세계 사람들에게 영향을 준 것으로 추정하였고, 연관된 무능력 및 고통에 기인하는 주요 인자로서 건강 불균형 및 사회적 오명/차별을 확인하였다.

신경정신병학은 신경계 질환에 기인하는 정신 장애를 다루는 의학 분야이고, 이는 또한 뇌 손상 또는 뇌 질환에 의해 초래되는 인식 및/또는 행동의 임상적 문제를 다루는 신경학의 하위 전문 분야인 정신의학 및 행동 신경학의 분야에 밀접하게 관련된다.

신경발달 장애, 신경 장애 또는 신경정신계 장애로는 정신분열증, 양극성 장애, 물질 의존증(알코올, 코카인), 자폐증 및 집착성 강박 장애(OCD: obsessive compulsive disorder)가 포함되고, 이는 본 발명과 관련된 가장 바람직한 증상이다.

본 발명은 글루타메이트 신경전달 경로를 표적화하는 화합물, 예를 들면 글리신 재흡수 저해제로 치료되는 환자를 위한 임상적 이점에 대한 예측적 마커로서의 보체 인자 H 계열의 단백질의 용도를 개시한다. 더욱이, 이는 특별히 시험관내에서 개별체로부터 얻은 샘플중의 보체 인자 H 계열의 단백질을 측정함으로써 상기 샘플로부터의 약물 반응을 예측하는 방법에 관한 것이다.

보체 인자 H 계열은, CFH, CFHR1, CFHR2, CFHR3, CFHR4A, CFHR4B 및 CFHR5를 포함하는 개개의 CFH 단백질일 수 있거나 이들의 혼합물일 수 있음을 의미한다.

GlyT1을 표적화하는 글리신 재흡수 저해제(GRI: Glycine Reuptake Inhibitor)는 글리신의 세포외 농도를 상승시킴으로써 NMDA 수용체(NMDA-R) 중재된 전달을 증진시키는 것으로 교시된 신규 화합물 부류이다. 건강한 개인, 정신병 환자 및 동물에서의 연구, 뿐만 아니라 유전적 분석으로부터, 신경발달 장애, 신경 장애 또는 신경정신계 장애의 병리생리학에 NMDA 수용체(NMDA-R) 기능저하가 관여된다는 증거가 지난 15년 이상 축적되어 왔다.

CNS에서, 글리신은 감각 기능 및 더 높은 뇌 기능을 제어하기 위해 2가지 주요 역할을 갖는다: 이는 글리신에 의해 활성화된(glycinergic) 뉴런에서의 저해 신경전달물질, 및 NMDA 수용체의 글루타메이트 신경전달의 글루타메이트와 공동-작용물질로서의 흥분성 신경전달물질이다.

글루타메이트는 뇌에서 주요 흥분성 신경전달물질이고 NMDA 및 비-NMDA 수용체를 활성화한다[리간드-게이트화(ligand-gated) 이온 채널, 즉 AMPA, 카이나이트(kainite) 및 대사자극성 수용체, 즉 mGluR 1 - 8]. NMDA 수용체는 상이한 뉴런들, 예컨대 글루타메이트 신경전달성 뉴런, 도파민에 의해 활성화되는(dopaminergic) 뉴런, 및 GABA에 의해 활성화되는(GABAergic) 뉴런 상에 위치된다. 따라서 NMDA 수용체는 글루타메이트, GABA 및 도파민에 직접적으로 영향을 줄 수 있다.

NMDA 수용체는 리간드 게이트화 이온 채널이고, 이는 이들이 글루타메이트 및 글리신 둘 다의 결합을 활성화시키는데 필요함을 의미한다. 글리신은 글루타메이트의 조절자로서 작용한다: 이는 글루타메이트의 효능을 증가시키고, 이에 따라 수용체를 활성화시키는 이의 영향을 증진시킨다. 발달중인 뇌에서, 및 더 적은 정도로 성숙된 뇌에서, NMDA 수용체는 시냅스 형성, 및 시냅스 유지와 안정화를 촉진시키는데 있어서 중요한 역할을 한다(증가된 시냅스 가소성을 통해). 따라서 NMDA 수용체는 성숙된 뇌 및 발달중인 뇌 둘다에서의 몇몇의 뇌 기능에 관여된다.

글루타메이트 신경전달에서의 기능장애는 기분 장애 및 정신분열증의 병리생리학에 관여된다. 이와 같이, NMDA 수용체 글리신-조절 부위는 정신분열증에서 인지 능력을 개선시키고 음성 증후를 감소시키기 위한 치료학적 표적일 것이다.

글리신이 NMDA-R 착체에서 절대적인 공동-작용물질이므로, NMDA-R 중재된 신경전달을 증진시키기 위한 하나의 전략은 NMDA 수용체의 국소적 미세환경에서 글리신의 세포외 농도를 상승시키는 것이다. 글리신 상승은 시냅스 간극으로부터의 글리신의 제거에 책임이 있는 GRI의 저해에 의해 달성된다. 기존의 신경 치료법 및 신경정신계 치료법에 대한 가능한 이점은 양호한 효능을 갖는데 있어서 글리신 재흡수 저해제의 잠재력, 뿐만 아니라 정신분열증, 양극성 장애, 물질 의존증(알코올, 코카인), 자폐증 또는 집착성 강박 장애(OCD)에서의 음성 및 양성 증후의 치료를 위한 개선된 내성 프로파일을 포함한다.

GlyT1은 신경전달물질 수송체의 상위계열에 속하고, 예컨대 SERT, NET 또는 DAT이다. GlyT1은 전뇌에서 글루타메이트 신경전달 시냅스를 둘러싼다. 이는 시냅스중의 세포외 글리신 농도를 NMDA 수용체의 NR1 부위 상의 그의 결합 부위에서 포화 수준 미만으로 유지시킨다. 미측(caudal) 뇌 영역 및 척수에서, GlyT1은 글루타메이트 신경전달(NMDA 수용체를 통해) 및 글리신에 의해 활성화된 전달 둘 다를 제어한다.

글리신 재흡수 저해제는 신경발달 장애, 신경 장애 또는 신경정신계 장애, 예컨대 정신분열증의 치료에 사용될 수 있는 것으로 공지되어 있다.

본 발명에 사용되는 적합한 글리신 재흡수 저해제(GRI)는 [4-(3-플루오로-5-트리플루오로메틸-피리딘-2-일)-피페라진-1-일]-[5-메탄설포닐-2-((S)-2,2,2-트리플루오로-1-메틸-에톡시)-페닐]-메타논이다.

정신분열증은, 큰 사회적 및 경제적 충격을 받은 성인 집단의 대략 1%의 세계적 유병률을 갖는, 청소년 후기 및 초기 성인기에 전형적으로 나타나는 심각한 정신적 장애이다. 정신분열증의 진단에 필요한 유럽 정신과 의사협회(ICD: Association of European Psychiatrists) 및 미국 정신과 의사협회(DSM: American Psychiatric Association)의 기준은 하기 둘 이상의 특징적 증후의 존재를 필요로 하고: 망상, 환각, 와해된 언어, 심하게 와해되거나 긴장된 행동, 또는 음성 증후[무언어증, 정신적 플래트닝(affective flattening), 동기 결여, 성욕장애]; 기타 요건, 예컨대 배제성 정동 장애(excluding affective disorder), 및 손상된 기능이 존재한다. 집단적으로, 정신분열증을 앓는 사람들은 유년기에 시작되어 성인 시절을 통해 지속되며 대부분의 환자들이 정상적인 고용을 유지하거나 달리는 정상적인 사회적 기능을 가질 수 없도록 만드는 기능 손상을 갖는다[2,3]. 이들은 또한 일반적 집단에 비해 수명이 단축되고, 항정신병 치료 이전에 증가된 유병률의 다양한 다른 신경정신계 증후군, 예컨대 심각한 물질 남용, 집착성 강박증 및 비정상적 비자발적 행동으로 고통받는다. 정신분열증은 또한 광범위한 인지 손상과 연관되고, 이의 위중성은, 심지어 정신병 증후가 잘 제어되는 경우 조차도, 이들의 기능을 제한한다.

글루타메이트 신경전달과 연관된 다른 증상은 양극성 장애, 물질 의존증(알코올, 코카인), 자폐증 및 집착성 강박 장애(OCD)이다.

CNS 질환, 예컨대 정신분열증, 양극성 장애, 물질 의존증(알코올, 코카인), 자폐증 및 집착성 강박 장애(OCD)의 치료를 개별화하는 방법을 개발할 필요가 있음이 오랫동안 인식되어 왔다.

표적화된 질환 치료의 개발에 의해, 표적의 분자 프로파일을 제공할 수 있는 방법(즉, 임상적 이점에 대해 예측하는 방법)이 특히 주목받는다.

따라서, 본 발명의 목적은 글루타메이트 신경전달 경로를 표적화하는 화합물에 대한 임상적 이점을 예측하는, 예를 들어 정신분열증, 양극성 장애, 물질 의존증(알코올, 코카인), 자폐증 및 집착성 강박 장애(OCD)와 같은 관련된 질환에서 글루타메이트 신경전달 경로를 표적화하는 화합물에 의한 치료에 대해 임상적 이점을 얻을 수 있는 환자를 식별하는 시험관내 방법을 제공하는 것이다.

이러한 목적을 위해, 체액(예를 들어, 혈액, 혈청 또는 혈장)에서 검출가능한 순환계에 존재하는 예측적 마커가 발견되어야 한다.

임상적으로 유용하기 위해, 예측적 마커는 글루타메이트 신경전달 경로를 표적화하는 화합물에 의한 치료로부터 임상적 이점을 얻지 못할 개별체들을, 임상적 이점을 얻을 개별체와 구별할 수 있어야 한다. 시험의 예측적 선택성 또는 특이성은 그의 수용자-작동 특징에 의해 가장 잘 평가된다.

전혈, 혈청 또는 혈장은 임상적 관례에서 가장 광범위하게 사용되는 샘플 공급원이다. 정신분열증 및 다른 질환에서 글루타메이트 신경전달 경로를 표적화하는 화합물에 의한 치료에 반응할 것 같은 개별체의 식별에 도움을 주는 예측적 마커의 식별은 이들 질환의 치료 및 처치에 크게 도움을 주는 방법을 유도할 수 있었다. 따라서, 글루타메이트 신경전달 경로를 표적화하는 질환, 예를 들면 GRI 관련된 질환의 치료를 개선하기 위한 임상적 요구가 시급하다.

본 발명의 목적은 추가로 시험관내 체액 샘플에서 글루타메이트 신경전달 경로를 표적화하는 화합물, 예를 들면 GRI에 대한 반응을 예측하는데 사용될 수 있는 생화학적 마커가 식별될 수 있는지의 여부를 추가로 조사하는 것이다.

놀랍게도, 샘플중 단백질 CFH 계열 농도의 시험관내 결정은 신경발달 장애, 신경 장애 또는 신경정신계 장애를 앓는 환자를 위한 GRI에 의한 치료로부터 임상적 이점을 예측할 수 있음이 밝혀졌다.

이와 관련하여, 환자의 혈액, 혈청 또는 혈장 샘플에서 보체 인자 H 계열 구성원의 단백질 농도를 결정하는 것이 치료로부터 임상적 이점을 얻을 환자를 나타내는 것으로 밝혀졌다. 이러한 목적을 위하여, 보체 인자 H 계열 구성원의 단백질 농도는 치료로부터 임상적 이점을 얻지 못하는 환자 집단의 보체 인자 H 계열 구성원의 단백질 농도의 대표값에 비교되고, 여기서 환자의 혈액, 혈청 또는 혈장 샘플에서 보체 인자 H 계열 구성원의 더 높은 단백질 농도는 치료로부터의 임상적 이점을 얻을 환자를 나타낸다.

도 1: 상 II 혈청 기선 샘플에서의 CFHR1 농도의 막대그래프(histogram). 3개의 곡선은 군집 기법(clustering algorithm)[가우시안(Gaussian)의 혼합물]으로부터의 가능한 밀도 추정값을 보여준다. 군집 분석은 CFHR1 발현의 유전적 상태에 기초한 3가지 상이한 농도 군을 가정하였다. 2개의 천연 컷-오프는 CFHR1 ECLIA 면역 검정에 의해 식별될 수 있다: 8 ㎍/㎖에서 및 28 ㎍/㎖에서. 28 ㎍/㎖의 컷-오프(화살표로 표시됨)는 CFHR1 이형접합성 결실 또는 동형접합성 결실을 갖는 환자를 결실이 수반되지 않는 환자로부터 분리하고, 환자 계층화를 위해 사용되었다.
도 2: CFHR1에 대한 천연 컷-오프를 사용하는, 모든 환자(상부 패널), CFHR1-낮은 환자(중간 패널) 및 CFHR1-높은 환자(하부 패널)에서의 기선으로부터의 PANSS 음성 증후 인자 스코어의 변화. 혈청 농도 ≤28 ㎍/㎖의 환자를 CFHR1-낮음으로 분류하고 혈청 농도 >28 ㎍/㎖의 환자를 CFHR1-높음으로 분류한다. MMRM 분석으로부터의 표준 에러 막대 및 예측된 반응의 추정값이다. 점선 및 원형은 플라세보이고; 실선 및 사각형은 10 mg GRI이며; 실선 및 위쪽으로 뾰족한 삼각형은 30 mg GRI이고; 점선 및 다이아몬드는 60 mg GRI이다.
도 3: 8주째 이분화된(dichotomized) PANSS 음성 증후 인자 스코어(반응은 기선으로부터 ≥20% 하강으로 정의됨)의 반응률. 빗금친 배경 막대는 프로토콜 순응 집단 전체에서의 반응률이다. 전체가 회색인 막대는 CFHR1에 대한 천연 컷-오프를 사용하는 CFHR1 계층화된 하위집단에서의 반응률이다.
도 4: 8주째 이분화된 CGI-I 음성 증후 등급 스코어(반응은 "매우 개선됨" 또는 "매우 많이 개선됨"으로 정의됨)의 반응률. 빗금친 배경 막대는 프로토콜 순응 집단 전체에서의 반응률이다. 전체가 회색인 막대는 CFHR1에 대한 천연 컷-오프를 사용하는 CFHR1 계층화된 하위집단에서의 반응률이다.
도 5: 상 II 혈청 기선 샘플에서의 CFHR1/CFH 비 분포의 막대그래프. 3개의 곡선은 군집 기법(가우시안의 혼합물)으로부터의 가능한 밀도 추정값을 보여준다. 군집 분석은 CFHR1 발현의 유전적 상태에 기초한 3가지 상이한 농도 군을 가정하였다. 2개의 천연 컷-오프는 CFHR1/CFH 비를 사용하여 식별될 수 있다(ECLIA 검정에 의해 측정됨): 0.01 및 0.08. 0.01 미만의 CFHR1/CFH 비를 갖는 샘플은 CFHR1 동형접합성 결실을 나타내고, 0.01 초과 내지 0.08 미만의 CFHR1/CFH 비를 갖는 샘플은 CFHR1 이형접합성 결실을 나타내며, 0.08 초과의 CFHR1/CFH 비를 갖는 샘플은 CFHR1 결실이 없음을 나타낸다.
도 6: 8주째 이분화된 CGI-I 음성 증후 등급 스코어(반응은 "매우 개선됨" 또는 "매우 많이 개선됨"으로 정의됨)의 반응률. 빗금친 배경 막대는 프로토콜 순응 집단 전체에서의 반응률이다. 전체가 회색인 막대는 CFHR1/CFH 비를 사용하는 CFHR1 계층화된 하위집단에서의 반응률이고, L(낮음)은 0.01 미만의 CFHR1/CFH 비에 상응하고, M(중간)은 0.01 초과 내지 0.08 미만의 CFHR1/CFH 비에 상응하며, H(높음)는 0.08 초과의 CFHR1/CFH 비에 상응한다.
도 7: CFHR1 유전자의 유전적 상태 대 RBM 검정을 사용한 CFHR1 단백질 농도(할당량 10:1로 CFHR1:CFH를 인식함).
도 8: SNP rs7542235에 대한 대립유전자 상태 대 RBM 검정을 사용한 CFHR1 단백질 농도(할당량 10:1로 CFHR1:CFH를 인식함).
도 9: 8주째 이분화된 CGI-I 음성 증후 등급 스코어(반응은 "매우 개선됨" 또는 "매우 많이 개선됨"으로 정의됨)의 반응률. 빗금친 배경 막대는 DNA 샘플에 대해 동의한 사람들로부터의 프로토콜 순응 집단 전체에서의 반응률이다. 전체가 회색인 막대는 CFHR1 대립유전자의 유전적 상태를 사용한 CFHR1 계층화된 하위집단에서의 반응률이다.

글루타메이트 신경전달 경로를 표적화하는 화합물에 의해, 예를 들면 GRI에 의해 환자가 치료되는, 신경발달 장애, 신경 장애 또는 신경정신계 장애를 앓는 환자의 반응을 예측하는 신규한 시험관내 방법이 제공되고, 이 방법은:

- 환자의 혈액, 혈청 또는 혈장 샘플에서의 보체 인자 H 계열 구성원(들)의 단백질 농도를 결정하는 단계; 및

- 보체 인자 H 계열 구성원(들)의 단백질 농도를 치료로부터 임상적 이점을 얻지 못하는 환자 집단의 보체 인자 H 계열 구성원(들)의 단백질 농도의 대표값과 비교하는 단계

를 포함하고, 여기서 환자의 혈액, 혈청 또는 혈장 샘플에서의 보체 인자 H 계열 구성원(들)의 더 높은 단백질 농도는 치료로부터 임상적 이점을 얻을 환자를 나타낸다.

추가의 실시태양에서 본 발명은 샘플에서 특정 CNS 질환, 예컨대 정신분열증의 시험관내 평가에 있어서의 보체 인자 H 계열 구성원(들)의 용도에 관한 것이고, 여기서 기준 농도를 초과하는 단백질 보체 인자 H 계열 구성원(들)의 농도는 상기 질환의 약물 치료에 기인한 임상적 이점을 나타낸다.

보체 인자 H는 189개 단백질로 구성된 패널(panel)로부터 선택된다[룰스 베이스드 메디슨(Rules Based Medicine), 휴먼 디스커버리 맵(Human Discovery Map) v 1.0]. GRI로 치료된 정신분열증 환자로부터의 치료 혈청 샘플 및 기선을 루미넥스(Luminex)에 기초한 멀티플렉스(multiplex) ELISA 휴먼 디스커버리 맵(등록상표) v 1.0 상에서 분석하였다.

디스커버리맵(등록상표)은 189개의 단백질 분석물질을 포함한, 포괄적 정량적 면역검정 시험이다. 이는 사이토카인(cytokine), 케모카인(chemokine), 대사 마커, 호르몬, 성장 인자, 조직 개조 단백질, 혈관형성 마커, 급성기 반응물질, 암 마커, 신장 독성 마커, CNS 바이오마커 및 기타 중요한 혈청 단백질에 대한 10년간의 검정 개발의 축적물을 나타낸다.

보체 인자 H는 하기 장점의 관점에서 나머지 189개 단백질 분석물질에 비해 우수한 것으로 밝혀졌다:

- 보체 인자 H는 치료 군에서 반응자 및 비반응자 사이에 강한 구별을 나타낸다;

- 보체 인자 H는 플라세보(placebo) 군에서 예후적 영향을 나타내지 않는다;

- 보체 인자 H 혈청 농도는 8주 이내에 GRI에 의한 치료에 의해 영향받지 않는다;

- 보체 인자 H 혈청 농도는 시간에 따라 안정하다.

인자 H로서도 공지된 보체 인자 H는, 미생물 방어, 면역 착체 과정, 프로그램화된 세포 사멸 및 노인성 황반 변성에 관여된 보체-중재된 면역 시스템의 조절에 있어서 필수적 역할을 수행하는 시알산 함유 당단백질이다. 보체 인자 H는 보체 인자 H 단백질 계열의 가장 잘 특징화된 구성원이다. 보체 인자 H 계열은 다음의 구성원으로 이루어 진다: 보체 인자 H(CFH), 보체 인자 H-관련된 단백질 1(CFHR1), 보체 인자 H-관련된 단백질 2(CFHR2), 보체 인자 H-관련된 단백질 3(CFHR3), 이소형(isoform) 4A 및 4B를 갖는 보체 인자 H-관련된 단백질 4(CFHR4A 및 CFHR4B), 보체 인자 H-관련된 단백질 5(CFHR5). 보체 인자 H-관련된 단백질은 보체 인자 H 유전자의 하류에 암호화되고 보체 인자 H의 하위도메인과 높은 농도의 상동성을 공유한다. 보체 인자 H 관련된 단백질은 또한 기능적 유사성을 공유한다[4].

보체 시스템은 체액에 또는 세포 및 조직 표면 상에 존재하는 약 40개의 단백질로 구성되고 3가지 주요 경로에 의해 폭포-방식으로 활성화된다[1]. 다른 경로는 중심 성분 C3의 자발적 가수분해에 의해 낮은 비율로 연속적으로 활성화되고, 렉틴 경로는 미생물 탄수화물을 인식하는 만노스 결합 렉틴 또는 피콜린(ficolin)에 의해 개시되고, 고전적 경로는 항원 결합된 면역글로불린으로의 Clq의 결합에 의해 활성화된다. 효소적 단계는 보체 성분의 활성 단편을 생성하고 추가의 증폭을 개시한다. 3가지 경로는 C3의 집결시 합쳐지고, 이는 활성화시에 C3a 및 C3b로 분할된다. 보체 인자 H는 속박되지 않은 보체 활성화로부터 일어나는 손상으로부터 숙주 세포를 보호한다. 보체 인자 H는 인자 I 중재된 C3b 분할에 대한 보조인자 활성 둘다를 가짐으로써 자가 세포 상에서 보체 활성화를 조절하고, 다른 경로 C3 전환효소, C3bBb에 대하여 활성의 가속화를 늦춘다.

보체 인자 H는 보체 활성화로부터의 자가 세포를 보호하지만 박테리아/바이러스로부터 보호하지는 않는다. 보체 인자 H가 보체의 조절에서 행하는 중심적 역할에 기인하여, 비정상적 CFH 활성으로부터 야기되는 많은 임상적 연관성이 존재한다. 보체 인자 H 유전자에서의 돌연변이는 위중하고 다양한 질환, 예컨대 희귀 신장 장애 용혈성 요독 증후군(HUS: hemolytic uremic syndrome) 및 막성증식성 사구체신염(MPGN: membranoproliferative glomerulonephritis)[또한 조밀 침착병(DDD: dense deposit disease), 막성증식성 사구체신염 유형 II 또는 조밀 침착병으로도 지칭됨], 뿐만 아니라 더욱 빈번한 망막 질환, 노인성 황반 변성(AMD)과 연관된다. 이의 보체 조절 활성에 더하여, 보체 인자 H는 다수의 생리학적 활성을 갖는데, 1) 세포외 기질 성분으로서 작용하고; 2) 인테그린(integrin) 유형의 세포 수용체에 결합하고; 3) 다양하게 선택된 리간드, 예컨대 C-반응성 단백질, 프롬보스폰딘(thrombospondin), 골 시알로프로테인(bone sialoprotein), 오스테오폰틴(osteopontin), 및 헤파린(heparin)과 상호작용한다.

보체 인자 H 관련된 단백질 1(CFHR1)은 43 kDa이고, 당단백질의 인자 H 계열의 분비된 구성원이다. 이는 간세포에 의해 생산되고, 2종의 차등적으로 글리코실화된 이소형(37 kDa 및 43 kDa)으로서 순환된다. 성숙한 인간 CFHR1은 312 아미노산의 길이이다. 이는 기본적으로 전체 분자를 구성하는 5종의 대략 60 아미노산의 SCR(짧은 컨센서스 반복부/CCP/SUSHI 반복부)을 포함한다. CFHR1은 LPS를 호중구에 결합시키는 리포단백질 착체에서 일정 역할을 담당한다. CFHR1에 대한 설치류 대응물은 보고되어 있지 않다. CFHR1 전구체의 아미노산 19143에 대하여, 인간 CFHR2 및 CFHR5는 각각 98% 및 86%의 아미노산 동일성을 나타낸다.

본원에 사용될 경우, 용어 "바이오마커 또는 마커"는 생물학적 상태, 즉 치료학적 상호작용에 대한 생물학적 과정 또는 약리학적 반응의 지시자로서 사용되는 물질을 의미한다. 바이오마커 또는 마커는 질환의 위험 또는 진행, 또는 소정의 치료에 대한 질환의 감수성과 관련된 단백질의 상태 또는 발현에 있어서의 변화를 나타낸다.

용어 "유전자"는 숙주 유기체중의 DNA의 조각을 의미한다.

유전자 발현은, 기능적 유전자 산물, 예를 들어 단백질의 합성에 유전자로부터의 정보가 사용되는 과정이다. 용어 "발현 농도"는 특정 유전자가 세포, 조직 또는 유기체내에서 발현되는 농도를 의미한다. 단백질과 관련되는 경우 용어 "발현 농도"는 특정 시간에 세포에 존재하는 특정 단백질의 양을 반영한다.

용어 "단백질"은 유전자로부터 합성된 기능적 유전자 산물을 의미한다.

용어 "치료로부터 임상적 이점을 얻지 못하는 환자 집단의 보체 인자 H 계열 구성원의 단백질 농도의 대표값"은 치료로부터 임상적 이점을 얻지 못하는 환자의 집단의 평균 발현 농도의 추정값을 지칭한다. 임상적 이점은 8주 이상째에 플라세보에 비교하여 측정가능한 반응을 갖는 것으로 정의된다.

본원에 사용될 경우 용어 "샘플" 또는 "시험 샘플"은 시험관내 평가를 위하여 개별체로부터 수득된 생물학적 샘플을 지칭한다. 본 발명의 방법에서, 샘플 또는 환자 샘플은 본 발명의 실시태양에서 임의의 체액을 포함할 수 있다. 바람직한 샘플은 체액, 예컨대 혈액, 혈청 또는 혈장이고, 혈청 또는 혈장이 가장 바람직하다.

용어 "혼합물"은 단백질 검정, 예를 들어 샌드위치(sandwich) 검정에 의해 동시에 검출된 2종 이상의 단백질에 의해 구성된 단백질 혼합물을 지칭한다. 동시적 검출은 샌드위치 검정에서 사용된 항체에 의해 검출되는 단백질 상에 존재하는 유사한 에피토프에 기인할 수 있다.

용어 "조합"은 보다 큰 군의 단백질들로부터 측정된 2종 이상의 단백질 분석물질의 독립적인 측정에 관한 것으로, 여기서 순서는 중요하지 않다. 독립적인 측정 결과는 수학적으로, 예를 들어 2개의 측정 결과의 비를 계산함으로써 조합된다.

보체 인자 H 계열 구성원(들)의 단백질 농도, 특별히 보체 인자 H 계열 구성원(들)의 단백질 농도의 가용성 형태(CFH, CFHR1, CFHR2, CFHR3, CFHR4A, CFHR4B 및 CFHR5 또는 이의 혼합물)는 적절한 샘플에서 시험관내에서 결정된다. 바람직하게는, 샘플은 인간 피험체, 예를 들어 정신분열증 환자, 또는 정신분열증 위험이 있는 환자, 또는 정신분열증을 앓는 것으로 의심되는 환자로부터 얻어진다. 보체 인자 H 계열 구성원(들)의 단백질 농도는 혈액, 혈청 또는 혈장 샘플에서 결정된다.

본 발명은,

i) 환자의 샘플에서 보체 인자 H 계열의 1종, 2종, 3종, 4종, 5종 또는 6종의 구성원, 또는 이의 혼합물 또는 조합물의 단백질 농도를 결정하는 단계;

ii) 단계 i)에서 결정된 단백질 농도를, 신경발달 장애, 신경 장애 또는 신경정신계 장애를 앓는 환자에서의 보체 인자 H 계열의 1종, 2종, 3종, 4종, 5종 또는 6종의 구성원의 단백질 농도의 대표값과 비교하는 단계;

iii) 신경발달 장애, 신경 장애 또는 신경정신계 장애를 앓는 환자의 샘플에서의 보체 인자 H 계열로부터의 1종, 2종, 3종, 4종, 5종 또는 6종의 구성원의 더 높은 단백질 농도가, 글루타메이트 신경전달 경로를 표적화하는 화합물에 의한 치료로부터 임상적 이점을 얻을 환자를 나타내는 단계; 및

iv) 신경발달 장애, 신경 장애 또는 신경정신계 장애를 앓는 환자를 위하여 이러한 치료를 선택하는 단계

를 포함하는, 글루타메이트 신경전달 경로를 표적화하는 화합물에 의해 치료되는 경우, 신경발달 장애, 신경 장애 또는 신경정신계 장애를 앓는 환자에 대한 반응을 예측하는 방법을 포함한다.

보다 구체적으로, 본 발명은

i) 환자의 샘플에서 보체 인자 H 계열의 1종, 2종, 3종, 4종, 5종 또는 6종의 구성원, 또는 이의 혼합물 또는 조합물의 단백질 농도를 결정하는 단계;

ii) 단계 i)에서 결정된 단백질 농도를, 신경발달 장애, 신경 장애 또는 신경정신계 장애를 앓는 환자에서의 보체 인자 H 계열의 1종, 2종, 3종, 4종, 5종 또는 6종의 구성원의 단백질 농도의 대표값과 비교하는 단계;

iii) 신경발달 장애, 신경 장애 또는 신경정신계 장애를 앓는 환자의 샘플에서의 보체 인자 H 계열로부터의 1종, 2종, 3종, 4종, 5종 또는 6종의 구성원의 더 높은 단백질 농도가, 글리신 재흡수 저해제(GRI)에 의한 치료로부터 임상적 이점을 얻을 환자를 나타내는 단계; 및

iv) 신경발달 장애, 신경 장애 또는 신경정신계 장애를 앓는 환자를 위하여 GRI 치료를 선택하는 단계

를 포함하는, 글리신 재흡수 저해제(GRI)에 의해 치료되는 경우, 신경발달 장애, 신경 장애 또는 신경정신계 장애를 앓는 환자에 대한 반응을 예측하는 시험관내 방법을 포함한다.

보체 인자 H 계열 구성원은 보체 인자 H(CFH)의 단백질, 보체 인자 H 관련된 단백질 1(CFHR1), 보체 인자 H 관련된 단백질 2(CFHR2), 보체 인자 H 관련된 단백질 3(CFHR3), 보체 인자 H 관련된 단백질 4A(CFHR4A), 보체 인자 H 관련된 단백질 4B(CFHR4B), 및 보체 인자 H 관련된 단백질 5(CFHR5)를 포함한다.

본 발명의 하나의 실시태양은 상기 언급된 바와 같은 보체 인자 H 계열 구성원, 또는 이의 혼합물 또는 조합물이다.

본 발명의 하나의 실시태양은 보체 인자 H 계열 구성원이 보체 인자 H 관련된 단백질 1, 또는 보체 인자 H 관련된 단백질 1 및 보체 인자 H의 혼합물인 경우이다.

본 발명의 추가의 실시태양은 보체 인자 H 계열 구성원이 보체 인자 H 관련된 단백질 1인 시험관내 방법이다.

본 발명의 추가의 실시태양은 보체 인자 H 계열 구성원이 보체 인자 H 관련된 단백질 1 및 보체 인자 H의 조합물인 시험관내 방법이다.

본 발명의 특히 바람직한 실시태양은 보체 인자 H 계열 구성원이 보체 인자 H 관련된 단백질 1 및 보체 인자 H의 일정 비율인 시험관내 방법이다.

본 발명의 하나의 실시태양은 추가로 보체 인자 H 계열 구성원이 보체 인자 H 관련된 단백질 3 및 보체 인자 H의 조합물인 시험관내 방법이다.

본 발명의 하나의 실시태양은 추가로 보체 인자 H 계열 구성원이 보체 인자 H 관련된 단백질 3 및 보체 인자 H의 일정 비율인 시험관내 방법이다.

본 발명의 하나의 실시태양은 추가로 보체 인자 H 계열 구성원이 보체 인자 H 관련된 단백질 3 또는 보체 인자 H 관련된 단백질 1 및 하기 보체 인자들중 하나의 조합물인 시험관내 방법이다: 보체 인자 H 관련된 단백질 2, 보체 인자 H 관련된 단백질 4A, 보체 인자 H 관련된 단백질 4B, 보체 인자 H 관련된 단백질 5 및 보체 인자 H.

본 발명의 하나의 실시태양은 추가로 보체 인자 H 계열 구성원이 보체 인자 H 관련된 단백질 3 또는 보체 인자 H 관련된 단백질 1 및 하기 보체 인자들중 하나의 일정 비율인 시험관내 방법이다: 보체 인자 H 관련된 단백질 2, 보체 인자 H 관련된 단백질 4A, 보체 인자 H 관련된 단백질 4B, 보체 인자 H 관련된 단백질 5 및 보체 인자 H.

신경발달 장애, 신경 장애 또는 신경정신계 장애를 앓는 환자에 대한 반응을 예측하는 방법은 정신분열증, 양극성 장애, 물질 의존증, 자폐증 및 강박 장애의 음성 또는 양성 증후를 포함한다.

본 발명의 하나의 실시태양은 환자가 분열정동 장애를 겪는 방법이다.

본 발명의 추가의 실시태양은 보체 인자 H 계열의 개별 구성원, 또는 이의 혼합물 또는 조합물의 단백질 농도가 ELISA에 기초한 기술에 의해 결정되는 경우이다.

본 발명은 글리신 재흡수 저해제(GRI)일 수 있는, 글루타메이트 신경전달 경로를 표적화하는 화합물에 의해 치료될 경우, 신경발달 장애, 신경 장애 또는 신경정신계 장애를 앓는 환자에 대한 반응을 예측하는 시험관내 방법을 추가로 포함하고, 여기서 보체 인자 H 계열의 개별 구성원, 또는 이의 혼합물 또는 조합물의 단백질 농도는 보체 인자 H 계열 구성원의 유전적 변형체를 측정함으로써 결정된다[5].

본 발명은 글리신 재흡수 저해제(GRI)로 치료될 경우, 신경발달 장애, 신경 장애 또는 신경정신계 장애를 앓는 환자에 대한 반응을 예측하는 시험관내 방법을 추가로 포함하고, 여기서 CFHR1의 단백질 농도는 CFHR1 변형체의 복사물 수의 측정을 통해 CFHR1의 유전적 변형체를 측정하거나, 결실에 대한 대용물로서 SNP를 측정함으로써 결정된다.

본 발명의 추가의 실시태양은 보체 인자 H 계열의 단백질에 특이적으로 결합하는 항체의 용도이다.

시험관내 방법은 GRI의 사용을 포함하고, 이는 [4-(3-플루오로-5-트리플루오로메틸-피리딘-2-일)-피페라진-1-일]-[5-메탄설포닐-2-[[(2S)-1,1,1-트리플루오로프로판-2-일]옥시]페닐]메타논이다.

본 발명의 추가의 실시태양은 글루타메이트 신경전달 경로를 표적화하는 화합물에 의해, 예를 들면 글리신 재흡수 저해제(GRI)에 의해 치료되는 환자에 대한 예측적 마커로서 사용하기 위한 보체 인자 H 계열 구성원이다.

본 발명의 추가의 실시태양은, 글루타메이트 신경전달 경로를 표적화하는 화합물에 의해, 예를 들면 글리신 재흡수 저해제(GRI)에 의해 치료될 경우, 신경발달 장애, 신경 장애 또는 신경정신계 장애를 앓는 환자를 위한 임상적 이점에 대한 예측적 마커로서의 보체 인자 H 계열 구성원의 용도이다.

본 발명의 추가의 실시태양은 글루타메이트 신경전달 경로를 표적화하는 화합물에 의해, 예를 들면 글리신 재흡수 저해제(GRI)에 의해 치료될 경우, 신경발달 장애, 신경 장애 또는 신경정신계 장애를 앓는 환자를 위한 임상적 이점에 대한 예측적 마커로서의 보체 인자 H 계열 구성원이다.

용어 "기준 샘플"은 본원에 사용될 경우 시험관내 평가를 위해 치료로부터 임상적 이점을 얻지 못한 환자의 기준 군으로부터 제공된 생물학적 샘플을 지칭한다. 용어 "기준 농도"는 본원에 사용될 경우 치료로부터 임상적 이점을 얻지 못한 환자의 기준 군에서 확립된 값을 지칭한다.

본 발명의 방법(들)에 따른 단계 (i)의 측정 결과가 기준 농도에 비교될 것임은 당분야의 숙련가에게 공지되어 있다. 이러한 기준 농도는 음성적 기준 샘플, 양성적 기준 샘플, 또는 이러한 유형의 대조군중 하나 이상을 포함하는 혼합된 기준 샘플을 사용하여 결정될 수 있다.

"기준 농도로 결정된 농도를 비교하는"이라는 표현은 단지 당분야의 숙련가에게 명확한 것을 추가로 예시하기 위해 사용된다. 기준 농도는 대조 샘플에서 확립된다. 대조 샘플은 내부 또는 외부 대조 샘플일 수 있다. 하나의 실시태양에서 내부 대조 샘플이 사용되고, 즉 마커 농도(들)는, 상기 마커(들)의 농도(들)에 임의의 변화가 존재한다면, 시험 샘플, 뿐만 아니라 동일한 피험체로부터 취해진 하나 이상의 다른 샘플(들)에서 평가된다. 또 다른 실시태양에서 외부 대조 샘플이 사용된다. 외부 대조 샘플의 경우, 개별체로부터 얻어진 샘플에서 마커의 존재 또는 양은 소정의 증상을 앓는 것으로 공지된 개별체, 이러한 증상의 위험에 처한 것으로 공지된 개별체, 또는 소정의 증상이 없는 것으로 공지된 개별체, 즉 "정상 개별체"에서의 그의 존재 또는 양과 비교된다. 예를 들면, 환자 샘플에서의 마커 농도는 신경발달 장애, 신경 장애 또는 신경정신계 장애의 구체적인 과정과 연관된 것으로 공지된 농도와 비교될 수 있다.

대체적으로, 샘플의 마커 농도는 진단과 직접적으로 또는 간접적으로 관련되고, 마커 농도는, 예를 들어 개별체가 신경발달 장애, 신경 장애 또는 신경정신계 장애에 대한 위험에 처하였는지의 여부를 결정하기 위해 사용된다.

다르게는, 샘플의 마커 농도는 예를 들어 정신분열증 환자에서 치료법에 대한 반응, 정신분열증의 진단, 정신분열증에 대한 적절한 약물을 선택하기 위한 지침, 질환 진행의 위험에 대한 판단, 또는 정신분열증 환자의 후속 조치와 관련된 것으로 공지된 마커 농도와 비교될 수 있다. 의도된 진단학적 용도에 따라서, 적절한 대조 샘플이 선택되고, 마커에 대한 대조 또는 기준 값이 확립된다. 당분야의 숙련가라면, 하나의 실시태양에서 이러한 대조 샘플이 연령-부합되고 혼재된 질환이 없는 기준 집단으로부터 수득됨을 인식할 것이다. 당분야의 숙련가에게 또한 분명하듯이, 대조 샘플에서 확립된 절대 마커 값은 사용되는 검정에 좌우될 것이다. 바람직하게는 적절한 기준 집단으로부터의 100명의 잘-특징화된 개별체로부터의 샘플이 기준 값을 확립하기 위해 사용된다. 또한 20명, 30명, 50명, 200명, 500명 또는 1000명의 개별체로 구성된 기준 집단이 선택되는 것이 바람직하다. GRI 치료로부터 임상적 이점을 얻지 못한 정신분열증 환자는 기준 값을 확립하기 위한 바람직한 기준 집단을 대표한다.

GRI 치료로부터 임상적 이점을 얻지 못한 정신분열증 환자는 치료 이후에 이들의 증후가 전혀 개선되지 않거나 단지 최소한으로 개선된 환자로서 정의된다. 하나의 실시태양에서, 증후가 개선되지 않거나 최소한 개선됨은 양성 및 음성 증후 척도(PANSS: Positive and Negative Symptom Scale)에서 20% 미만의 변화로서 정의된다. 또 다른 실시태양에서, 증후가 개선되지 않거나 최소한 개선됨은 포괄적 임상 인상 척도(CGI: Clinical Global Impression scale)에 따라 악화된 증후, 변화가 없는 증후, 또는 최소한으로 개선된 증후로 정의된다.

CFH 계열 유전자의 특이적 유전자형을 갖는 정신분열증 환자는 대조 값을 확립하기 위한 또 다른 바람직한 기준 집단을 대표한다. 하나의 실시태양에서, CFHR1 및 CFHR3 유전자의 동형접합성 결실을 갖는 정신분열증 환자는 대조 값을 확립하기 위한 하나의 바람직한 기준 집단을 대표한다. 또 다른 실시태양에서, CFHR1 및 CFHR3 유전자의 동형접합성 또는 이형접합성 결실을 갖는 정신분열증 환자는 대조 값을 확립하기 위한 하나의 바람직한 기준 집단을 대표한다.

용어 "측정", "측정하는" 또는 "결정하는"은 바람직하게는 정성적, 반-정량적 또는 정량적 측정을 포함한다. 본 발명에서 보체 인자 H 계열 구성원 또는 이의 혼합물의 단백질은 체액 샘플에서 측정된다. 하나의 바람직한 실시태양에서 측정은 반-정량적 측정이고, 즉 보체 인자 H 계열 구성원 또는 이들의 혼합물의 단백질 농도가 컷-오프(cut-off) 값을 초과하는지 이에 모자라는지의 여부가 결정된다.

대조군 또는 대조 집단에서 결정될 경우 보체 인자 H 계열 구성원의 단백질 또는 이들의 혼합물의 값은 예를 들면 컷-오프 값 또는 기준 범위를 확립하기 위해 사용된다. 이러한 컷-오프 값을 초과하는 값은 신경발달 장애, 신경 장애 또는 신경정신계 장애의 치료에 있어서 임상적 이점을 예측함을 나타내는 것으로 고려된다.

하나의 실시태양에서 고정된 컷-오프 값이 확립된다. 이러한 컷-오프 값은 흥미로운 진단학적 문제에 부합되도록 선택된다.

하나의 실시태양에서, 컷-오프는 90%의 특이성을 생성하도록 설정되고, 또한 바람직한 컷-오프는 95%의 특이성을 생성하도록 설정되거나, 또한 바람직한 컷-오프는 98%의 특이성을 생성하도록 설정된다.

하나의 실시태양에서, 컷-오프는 90%의 감수성을 생성하도록 설정되고, 또한 바람직한 컷-오프는 95%의 감수성을 생성하도록 설정되거나, 또한 바람직한 컷-오프는 98%의 감수성을 생성하도록 설정된다.

하나의 실시태양에서, 대조군 또는 대조 집단에서 결정될 경우 보체 인자 H 계열의 단백질에 대한 값은 기준 범위를 확립하기 위해 사용된다. 하나의 바람직한 실시태양에서, 보체 인자 H 계열의 단백질의 농도는, 값이 결정된 기준 범위의 90%-백분위수를 초과할 경우 상승된 것으로 고려된다. 추가의 바람직한 실시태양에서, 보체 인자 H 계열 구성원의 단백질 농도는, 결정된 값이 기준 범위의 95%-백분위수, 96%-백분위수, 97%-백분위수 또는 97.5%-백분위수를 초과할 경우 상승된 것으로 고려된다.

컷-오프 값을 초과하는 값은 예를 들면 신경발달 장애, 신경 장애 또는 신경정신계 장애의 치료에서 증가된 임상적 이점을 나타낼 수 있다.

추가의 바람직한 실시태양에서, 보체 인자 H 계열 구성원(들)의 단백질의 측정은 정량적 측정이다. 추가의 실시태양에서, 보체 인자 H 계열 구성원(들)의 단백질 농도는 신경발달 장애, 신경 장애 또는 신경정신계 장애의 치료에서 증가된 임상적 이점과 관련된다.

당분야의 숙련가라면, 임의의 이러한 평가가 시험관내에서 이루어짐을 인식할 것이다. 샘플(시험 샘플)은 이후 폐기된다. 샘플은 단지 본 발명의 시험관내 진단 방법을 위해 사용되고, 샘플의 물질은 환자 신체내로 다시 옮겨지지 않는다. 전형적으로, 샘플은 체액 샘플, 예를 들어, 혈청, 혈장, 또는 전혈이다. 본 발명에 따른 방법은 개별체로부터 수득된 액체 또는 체액 샘플, 및 이러한 샘플중의 보체 인자 H 계열 구성원 또는 이의 혼합물의 단백질 농도의 시험관내 결정에 기초한다. "개별체"는 본원에서 사용될 경우 1명의 인간을 지칭한다.

바람직하게는 보체 인자 H 계열 구성원(들)의 단백질 농도는 특정 결합 제제의 사용에 의해 액체 샘플로부터 시험관내에서 특이적으로 결정된다.

달리 정의되지 않는 한, 본원에 사용된 기술적 및 과학적 용어는 본 발명이 속하는 분야에서 통상의 숙련가에 의해 공통적으로 이해되는 것과 동일한 의미를 갖는다. 싱글레턴(Singleton) 등의 문헌 "Dictionary of Microbiology and Molecular Biology, 2nd ed., John Wiley & Sons, New York, N.Y. (1994)"; 마치(March)의 문헌 "Advanced Organic Chemistry Reactions, Mechanisms and Structure, 4th ed., John Wiley & Sons, New York, N.Y. (1992)"; 레윈(Lewin, B.), 게네스(Genes V)의 문헌 "published by Oxford University Press(1994), ISBN 0-19-854287 9"; 켄드류(Kendrew, J.) 등(편집)의 문헌 "The Encyclopedia of Molecular Biology, published by Blackwell Science Ltd. (1994), ISBN 0-632-02182-9"; 및 메이어스(Meyers, R.A.)(편집)의 문헌 "Molecular Biology and Biotechnology: a Comprehensive Desk Reference, published by VCH Publishers, Inc. (1995), ISBN 1-56081-569 8)"은 당분야의 숙련가에게 본원에 사용된 많은 용어에 대한 일반적 지침을 제공한다.

본 발명에 의해 설명된 개개의 유전자의 단백질 발현을 검출하기 위한 기법으로는, 제한되지 않지만, 효소 연결된 면역흡착 검정(ELISA: enzyme linked immunosorbent assay)이 포함된다.

본 발명의 실행은, 달리 지시되지 않는 한, 분자 생물학(재조합 기법 포함), 미생물학, 세포 생물학, 생화학, 및 면역학의 종래의 기법을 이용할 것이고, 이는 당분야의 기술에 속한다. 이러한 기법들은 예컨대 샘브룩(Sambrook) 등의 문헌 "Molecular Cloning: A Laboratory Manual, second edition, (1989)"; 게이트(Gait, M.J.)(편집)의 문헌 "Oligonucleotide Synthesis (1984)"; 프레쉬네이(Freshney, R.L)(편집)의 문헌 "Animal Cell Culture (1987); Methods in Enzymology (Academic Press, Inc.)"; 어수벨(Ausubel, F.M.) 등(편집)의 문헌 "Current Protocols in Molecular Biology (1987)" 및 정기적 업데이트; 물리스(Mullis) 등(편집)의 문헌 "PCR: The Polymerase Chain Reaction (1994)"에 충분히 설명되어 있다. 본 발명에 따른 방법은 개별체로부터 수득된 액체 또는 체액 샘플, 및 이러한 샘플중의 보체 인자 H 계열 구성원(들)의 단백질 농도의 시험관내 결정에 기초한다. "개별체"는 본원에 사용될 경우 1명의 인간을 지칭한다.

본 발명에 따른 하나의 바람직한 실시태양에서 보체 인자 H 계열 구성원(들)의 단백질 농도가 결정된다. 하나의 실시태양에서, 보체 인자 H 계열 구성원(들)의 단백질 농도는 특이적 결합 제제의 사용에 의해 샘플로부터 시험관내에서 특이적으로 결정된다.

특이적 결합 제제는, 예를 들어, 보체 인자 H 계열 구성원(들)에 대한 수용체, 보체 인자 H 계열 구성원(들)에 결합하는 렉틴, 보체 인자 H 계열 구성원(들)에 결합하는 항체, 보체 인자 H 계열 구성원(들)에 결합하는 펩타이드체, 2특이적 2중 바인더(binder) 또는 2특이적 항체 포맷이다. 특이적 결합 제제는 그의 상응하는 표적 분자에 대해 10⁷ ℓ/몰 이상의 친화도를 갖는다. 특이적 결합 제제는 바람직하게는 그의 표적 분자에 대하여 10⁸ ℓ/몰의 친화도를 갖고, 또한 바람직하게는 10⁹ ℓ/몰의 친화도를 갖는다.

당분야의 숙련가라면 용어 "특이적"은 샘플에 존재하는 다른 생물분자가 서열 번호 1의 보체 인자 H 단백질 서열 또는 서열 번호 2 내지 7의 보체 인자 H 관련된 단백질 1 내지 5에 대해 특이적인 결합 제제에 그다지 결합하지 않음을 나타내기 위해 사용됨을 인식할 것이다. 바람직하게는, 표적 분자 이외의 생물분자에 결합하는 농도는 각각 표적 분자에 대한 친화도의 단지 10% 이하, 단지 5% 이하, 또는 단지 2% 이하인 결합 친화도를 초래한다. 바람직한 특이적 결합 제제는 친화도 뿐만 아니라 특이성에 대한 상기 최소 기준 둘 다를 충족시킬 것이다.

특이적 결합 제제의 예는 펩타이드, 펩타이드 유사체, 압타머(aptamer), 스피에겔머(spiegelmer), 달핀(darpin), 안키린(ankyrin) 반복 단백질, 쿠니츠(Kunitz) 유형 도메인, 항체, 단일 도메인 항체[6] 및 항체의 1가 단편이다. 특정한 바람직한 실시태양에서, 특이적 결합 제제는 폴리펩타이드이다. 특정한 바람직한 실시태양에서, 특이적 결합 제제는 항체 또는 1가 항체 단편이고, 바람직하게는 단일클론성 항체로부터 유도된 1가 단편이다.

용어 "항체"는 본원에서 가장 넓은 의미로 사용되고, 구체적으로 단일클론성 항체, 다중클론성 항체, 다중특이적 항체(예를 들어 2중특이적 항체)(둘 이상의 손상되지 않은 항체로부터 형성됨), 및 원하는 생물 활성을 나타내는 한 항체 단편을 포함한다. 특정한 바람직한 실시태양에서 특이적 결합 제제는 항체 또는 1가 항체 단편이고, 바람직하게는 단일클론성 항체로부터 유도된 1가 단편이다.

특이적 결합 제제는, 바람직하게는 보체 인자 H 계열의 하나의 구성원 또는 이의 조합물, 예를 들어 보체 인자 H(서열 번호 1), 보체 인자 H 관련된 단백질 1(서열 번호 2), 보체 인자 H 관련된 단백질 2(서열 번호 3), 보체 인자 H 관련된 단백질 3(서열 번호 4), 보체 인자 H 관련된 단백질 4A(서열 번호 5), 보체 인자 H 관련된 단백질 4B(서열 번호 6), 보체 인자 H 관련된 단백질 5(서열 번호 7), 선형 에피토프 또는 배좌 에피토프와 반응하는 항체 또는 항체 집합이다.

당분야의 숙련가라면 보체 인자 H 계열 구성원의 단백질 농도가 신경발달 장애, 신경 장애 또는 신경정신계 장애의 치료에 대해 임상적 이점을 평가하는데 유용한 마커로서 식별됨을 이제 인식할 것이다.

보체 인자 H 계열 구성원(들)의 단백질 농도를 결정하기 위해, 개별체로부터 수득된 샘플은 결합 제제 및 보체 인자 H 계열 구성원(들) 사이에 착체를 형성하기에 적절한 조건하에 보체 인자 H 계열 구성원(들)에 대한 특이적 결합 제제와 함께 시험관내에서 항온처리된다. 이러한 조건은 특정화될 필요가 없는데, 이는 어떠한 발명적 노력 없이도 당분야의 숙련가라면 이러한 적절한 항온처리 조건을 쉽게 식별할 수 있기 때문이다. 결합 제제 및 보체 인자 H 계열 구성원(들) 사이의 착체의 양은, 예를 들면 상기 기재된 효소-연결된 면역검정(ELISA)에 의해 결정된다.

면역검정은 당분야의 숙련가에게 잘 공지되어 있다. 이러한 검정을 수행하기 위한 방법, 뿐만 아니라 실제적 적용 및 절차는 관련된 교재에 요약되어 있다. 관련된 교재의 예는 티즈센(Tijssen, P.)의 문헌 "효소-항체 또는 다른 효소-거대분자 컨주게이트의 제조(Preparation of enzyme-antibody or other enzyme-macromolecule conjugates), Practice and theory of enzyme immunoassays, pp. 221-278", 및 문헌 "Methods in Enzymology, Colowick, S.P., and Caplan, N.O. (eds.), Academic Press"의 다양한 권수(이는 면역학 검출 방법을 다루고 있고, 특히 70권, 73권, 74권, 84권, 92권 및 121권에 기재됨)이다.

이러한 검정 형식을 사용하여, 환자로부터 얻은 샘플이 치료에 의한 환자를 위한 임상적 이점을 평가하기 위해 사용될 수 있는 것으로 나타났다. 결과는 본원의 실시예에 제시된다.

실시예

이제 본 발명은 아래의 실시예에서 추가로 설명될 것이고, 이는 예시를 위한 것으로 본 발명의 범주를 제한하지 않는다.

상 2 GRI 정신분열증 시험에 대한 환자 및 연구 고안

상 II 연구를 음성 증후가 우세한 정신분열증을 앓는 성인에서 수행하였다. 개별체를 임상적으로 안정화시켰고 2세대 정신병치료제로 안정하게 치료하였다. 연구를 국제 임상시험 실시기준(ICH Guidelines for Good Clinical Practice)에 따라 브라질, 프랑스, 독일, 헝가리, 일본, 멕시코, 폴란드, 러시아 및 미국에서 다수의 지역에서 수행하였다(ClinicalTrials.gov Identifier: NCT00616798). 연구 프로토콜은 각 나라의 보건 당국 및 각 지역의 윤리 위원회에 의해 승인되었다. 모든 323명의 환자는 연구에 참여하기 위해 서면 동의서를 제공하였고, 224명의 환자는 탐색적 바이오마커 분석을 위한 혈청 샘플의 수집 및 사용에 동의하였다. 스크리닝 및 4주간의 임상시험 전단계(run-in period) 이후, 환자를 무작위로 나누고 환자에게 플라세보, 10 mg, 30 mg, 또는 60 mg의 GRI에 의해 8주 동안 1일 1회 2중-맹검 보조 치료를 제공하였고, 이후 4주간의 후속 주기(follow-up period)가 뒤따랐다. 4가지 치료 부문에서 환자의 유사한 백분율로 연구를 완료하였다.

상 2 GRI 정신분열증 시험의 성과 측정

환자들을 스크리닝, 2주 전, 기선, 1주, 2주, 4주, 6주, 8주, 10주 및 12주에 평가하였다. 평가는 PANSS, 포괄적 임상 인상 - 질병의 위중성(Severity of Illness)(CGI-S) 및 포괄적 임상 인상 - 포괄적 개선(Global Improvement)(CGI-I)(전체 정신병리학 56에 대해), 음성 증후의 CGI-S 및 CGI-I(CGI-S-N, CGI-I-N)(단지 57종의 음성 증후의 평가를 위해), 및 추체외로 증후(extrapyramidal symptom)에 대한 표준 검사(BAS58, SAS59, AIMS60)를 포함한다. 음성 증후에 대한 효과를 평가하는데 중요한 1차 효능은 PANSS 음성 증후 인자 스코어64에서 기선으로부터의 변화였다. 2차 효능 변수는 i) PANSS 음성 증후 인자 스코어에서 기선으로부터의 ≥ 20% 변화로서 정의되는 음성 증후에서 임상적 반응을 보여주는 환자의 비율, 및 ii) CGI-I-N이었다. 추가의 분석은 PANSS 총 스코어에서의 변화를 포함하였고, 남은 PANSS 인자는 스코어64 CGI-S 및 CGI-I였다.

혈청 샘플의 제조

탐색적 바이오마커 분석을 위한 혈청 샘플의 수집 및 사용에 서면 동의한 환자로부터 혈청 샘플을 기선 및 치료 8주에 수집하였다. 샘플을 EDTA가 없는 플레인 튜브(plain tube)에 수집하고 대략 30분 동안 또는 실온에서 응고될 때까지 정치시켰다. 혈액을 수집한지 60분 이내에, 샘플을 원심분리기로 옮기고 1500 g에서 10분 동안 4℃(또는 냉장 원심분리기가 이용가능하지 않는다면 실온)에서 회전시켰다. 원심분리 직후, 상청액(즉, 혈청)을 신선한 예비-표지된 튜브로 옮기고 -70℃에서 저장하였다.

상 2 GRI 정신분열증 시험에서의 환자로부터의 CFH의 농도의 결정 및 결과

기선 혈청 샘플을 룰스 베이스드 메디슨(Rules Based Medicine)(미국 텍사스주 오스틴 소재)이 제공한 루미넥스에 기초한 멀티플렉스 ELISA 인간 디스커버리맵(등록상표) v 1.0 상에서 분석하였다. 189개 단백질 분석물질의 분석을 위해 상 II 연구로부터의 동결된 혈청-샘플을 무작위로, 보지 않고, 드라이 아이스 위에 올려서 룰스 베이스드 메디슨으로 보냈다. 단백질 바이오마커 측정을 1 배치로 수행하였고, 결과를 측정 유닛(예를 들어, ng/㎖)으로 기록하였다.

측정 값이 표준 보정 곡선내에 존재할 경우 이를 기록하였다. 보정 곡선 밖의 값은 보정 한계를 사용하여 귀속시켰다. 189개의 측정된 단백질 분석물질중, 26개는 환자 샘플의 70% 이상에 대한 최저 보정자 미만의 측정 값을 기록하였다. 이들 분석물질을 분석으로부터 제거하였다. 2개의 관련된 분석물질(프로인슐린 및 인슐린)에 대한 측정값을 평균하여 합하였는데, 이는 이들이 매우 상관된 측정 값을 보였기 때문이다. 예비-처리후, 162개의 단백질 분석물질이 분석 데이터 집합에 남았다.

상 2 GRI 정신분열증 시험의 바이오마커 하위군 대 총 연구 집단의 인구통계, 기선 정신병리학 및 기능

상 2 GRI 정신분열증 시험으로부터의 323명 환자들중 224명은 탐색적 바이오마커 분석을 위한 혈청 샘플의 수집 및 사용에 동의하였다. 바이오마커 하위군은 전체 연구 집단을 대표한다.

반응 예측을 위한 바이오마커 후보의 식별

전체적으로 임상 시험에서, 1차 분석 종점을 PANSS 음성 증후 인자 스코어에서 기선으로부터 변경시켰다[8]. 이러한 분석을 위한 반응 변수는 기선 및 8주 사이의 PANSS 음성 증후 인자 스코어에 있어서의 변화였다. 반응 예측을 위한 바이오마커의 식별을 위해, RBM에 의해 측정되는 단백질 분석물질을 다음과 같이 분석하였다: 이러한 분석을 위한 유일한 설명 변수(explanatory variable)는 개별 단백질의 기선 측정값이고, 프로토콜 순응(PP: per protocol) 집단을 사용하여 통합된 10 mg 및 30 mg의 바이오마커 집단에 대해 분석을 수행하였다. 각각의 단백질 마커 후보를 위하여, 시험 통계학으로서 확고한 선형 모델의 R＾2를 사용하여 PANSS에서의 변화가 단백질 측정에 관련되지 않는다는 귀무 가설을 시험하였다. 귀무 가설은 다중 시험을 위한 보정과 병행하여 모든 검정된 단백질 마커에 대해 시험되었다. 표 1에서와 같이 "보체 인자 H"로 지칭되는 분석물질이 최적 수행 마커로서 순위가 매겨졌지만, 다중 시험에 대한 조정 이후, 이는 통계적 유의성을 수득하지 못하였다.

임상 시험에서 2차 종점으로서, 기선 및 8주 평가 사이의 음성 증후의 포괄적 임상 인상(CGI) 개선이 사용되었다. 이러한 성과 측정을 이진 변수로서 취급하였다. 양성 군은 "매우 많이 개선된" 및 "많이 개선된" 스코어로 구성되고, 음성 군은 "최소한으로 개선된", "변화가 없는", "최소한으로 악화된", "많이 악화된", 및 "매우 악화된" 스코어로 구성된다. PP(프로토콜 순응) 집단을 사용하여 조합된 플라세보, 10 mg 및 30 mg의 바이오마커 집단에 대하여 분석을 수행하였다. 이러한 분석에 대한 설명 변수는 모든 측정된 단백질의 기선 측정값, 치료(플라세보 또는 통합된 10 mg/30 mg 치료) 및 치료-단백질의 상호작용이다. 로지스틱 회귀 모델(logistic regression model)을 예측자로서 사용하였다.

이러한 분석에 기초하여, 10 mg 및 30 mg의 치료 부문에서 CGI에서의 개선이 없는 환자로부터 개선된 환자를 구별하는 마커의 능력에 의해 마커의 순위를 매겼다.

RBM 패널내에서 "보체 인자 H"로 지칭되는 분석물질은 0.006의 조정된 p 값을 가지면서 다중 시험에 대한 보정 후 통계적 유의성에 도달한 유일한 마커로서 식별되었다(표 1 참조).

임상적 효과를 예측하는 혈청 "보체 인자 H" 기선 수준의 능력은 인구통계 및 임상적 공변량(기선 PANSS 포함)과 무관하였고, 상이한 치료 부문 사이의 "보체 인자 H" 기선 혈청 농도에서 유의적인 차이가 존재하지 않았다. "보체 인자 H"는 플라세보 군에서의 반응과 어떠한 연관성도 나타내지 않았다(PANSS 또는 CGI-I).

RBM 검정에서 사용되는 항체의 추가의 특징으로부터, 포획 및 검출 항체 둘다 CFH의 마지막 3개의 짧은 컨센서스 반복부(SCR: short consensus repeat) 내에서 결합함을 알 수 있었다. 이러한 영역은 보체 인자 H 관련된 단백질 1에 매우 상동성이다(CFHR1: SCR18, SCR19 및 SCR20은 각각 CFHR1의 SCR3, SCR4 및 SCR5와 100%, 100% 및 97%의 동일성을 공유한다)[4].

인간 CFH 및 CFHR1 단백질을 혈청으로부터 단리하고 정제하였다. RBM 검정에서 두 단백질을 특징화함으로써, CFHR1이 CFH에 비해 CFHR1에 대해 10배 우세하게 인식되었음을 알 수 있었다.

CFHR1-특이적 검정을 위해 사용된 항체

CFHR1-특이적 검정의 개발을 위해, 하기 단일클론성 항체가 사용되었다: MAB<CFH/CFHR1>M-L20/3[공급업체: 써모 사이언티픽(Thermo Scientific), 카탈로그 번호: GAU 020-03-02] 및 MAB<CFHR1>M-442127[공급업체: 알앤디-시스템스(R&D-systems), 카탈로그 번호: MAB4247].

단일클론성 L20/3 Fab-단편의 비오티닐화, 화학양론 1:1.3

단일클론성 마우스 IgG(클론: L20/3; 공급업체: 써모 사이언티픽, 카탈로그 번호: GAU 020-03-02)를 파파인(Papain)(3 mU/mg IgG)으로 분해하여 Fab-단편을 생성하였다. 분해된 Fc-단편을 DAE-세파로스(Sepharose) 상에서 크로마토그래피하여 제거하였다. 남은 Fc를 Fcγ-흡착하고 수퍼덱스(Superdex) 200 크기 배제를 수행하여 Fab를 정제하였다.

100 mM KP0₄(pH 8.5)중 10 mg/㎖의 L20/3-Fab 단편의 용액에, 50 ㎕의 비오틴-N-하이드록시석신이미드(DMSO중 3.6 mg/㎖)를 ㎖당 첨가하였다. 실온에서 45분 후, 샘플을 100 mM KP0₄, 150 mM NaCl(pH 7.2)에 대해 투석시키고 동결하였다.

단일클론성 442127 IgG의 루테닐화, 화학양론 1:3

100 mM KP0₄(pH 8.5)중 5 mg/㎖의 단일클론성 마우스 IgG(클론 442127, 공급업체: 알앤디-시스템스, 카탈로그 번호: MAB4247) 용액에, 125 ㎍의 루테늄-(bpy)2-bpyCO-Osu를 첨가하였다. 실온에서 75분 후, 10 mM 라이신을 첨가하여 루테닐화를 중단시켰다. 응집물을 분리하기 위해, 샘플의 적절한 분별물을 수퍼덱스 200 크기 배제 크로마토그래피로부터 수집하였다.

인간 혈청으로부터의 CFHR1의 정제

보정자 물질로서 사용하기 위해, 하기 절차에 따라 CFH 및 CFHR1에 대해 특이적인 단일클론성 항체 L20/3을 사용하여 면역흡착시킴으로써 고유의 CFHR1을 인간 혈청으로부터 정제하였다: MAB L20/3<CFH,CFHR1>M-IgG-스페로실(Spherosil) 수지를 인간 혈청으로부터의 CFHR1의 정제를 위해 사용한다. 미리 희석된(50 mM 트리스HCl, 150 mM NaCl중 1:4, pH 7.5) 혈청을 사토클린(Sartoclean) CA(0.8 ㎛) 및 사토브란(Sartobran) P(0.2 ㎛) 필터 캡을 통해 통과시킨다. 칼럼 상에 적재된 예비처리된 혈청을 세척하고(1O mM 트리스HCl, 500 mM NaCl, 0.05% 트윈20, pH 7.5), 이후 Q-세파로스 이동 완충액을 흘려보내고, 분석물질과 흡착제의 분해를 방지하기 위해 용출 완충액(써모 사이언티픽)으로 부드럽게 용출시킨다. 공동-결합된 CFHR1 및 CFH를 분리하기 위해, 면역흡착제-용출물을 크기 의존성 용출을 위해 모노큐(MonoQ) 칼럼 상에서 이동시킨다. CFHR1, 뿐만 아니라 SDS-PAGE 분석에서 상이한 높이에서 이동하는 공동-정제된 단백질을 포함한 용출물을 모노에스(MonoS) 칼럼 상에서 등전점에 대해 추가로 분리하여 순수한 CFHR1의 분별물을 생성한다. 순수한 CFHR1을, 혈청 CFHR1 값에 대한 엘렉시스(Elecsys)-ECLIA 시험에서 CFHR1의 결정을 위한 보정자 물질로서 적용한다.

ECLIA 면역검정을 사용하는 인간 혈청 또는 혈장 샘플에서의 CFHR1의 측정

CFHR1을 위한 ECLIA 면역검정은, 엘렉시스(등록상표) 분석기를 사용하여 인간 혈청 또는 혈장 샘플에서의 CFHR1의 특이적 결정을 위해 개발된다

다음은 엘렉시스(등록상표) 분석기를 사용하여 CFHR1을 결정하기 위한 검정 절차를 설명한다.

엘렉시스 CFHR1 면역검정은 샌드위치 원리를 통해 작용하는 전자화학발광 면역검정(ECLIA: electrochemiluminescence immunoassay)이다. 이러한 검정에는 2가지 항체가 포함된다 - 단일클론성 항체 L20/3-Bi의 비오티닐화된 Fab 단편(포획 항체) 및 루테닐화된 단일클론성 항-CFHR1 항체 442127-Ru(검출 항체); 이는 샘플중에서 CFHR1과 함께 샌드위치형 면역검정 착체를 형성한다. 이어서 착체를 고체 상 스트렙타비딘(streptavidin)-코팅된 미립자에 결합시킨다. 미립자를 전극의 표면 상으로 자석으로 포획시키고, 전극에 전압을 적용하여 화학발광을 유도하며, 이를 판독을 위해 광전자증배관으로 측정한다. 결과를 기기-특이적 보정 곡선을 통해 결정한다.

샘플을 딜류언트(Diluent)[로슈 딜류언트 멀티어세이(Roche Diluent MultiAssay), 엘렉시스 참조 번호 03609987-190]에서 1:400으로 자동 희석한다. 검정 프로토콜 3을 적용하여 10 ㎕의 희석된 샘플을 80 ㎕의 루테닐화된 <CFHR1>-442127과 0.5 ㎍/㎖으로 반응 완충액[헤페스(Hepes) 50 mM, NaCl 150 mM; 테시트(Thesit)/폴리도카놀(Polidocanol) 0.1%; EDTA 1mM; 소 혈청 알부민 0.5%]에서 9분 동안 예비 항온처리하고, 이후 반응 완충액중 1.5 ㎍/㎖으로의 80 ㎕의 비오티닐화된 <CFH,CFHR1>-L20/3 + 30 ㎕의 미립자를 첨가하고, 추가로 9분 동안 항온처리한다. 항온처리 동안, 미립자에 결합되는 항체 분석물질 항체 샌드위치가 형성된다. 최종적으로 미립자를 신호 생성 및 판독을 위해 엘렉시스 시스템의 검출 챔버로 옮긴다. 보정을 위해, 정제된 CFHR1(125 ng/㎖, 62.5 ng/㎖, 31.25 ng/㎖, 15.63 ng/㎖, 7.81 ng/㎖, 3.9 ng/㎖, 1.95 ng/㎖, 0 ng/㎖)의 1:2 희석 연속물을 멀티어세이 딜류언트에서 제조한다. 보정 곡선의 식을 비선형 최소자승 곡선 정합[알씨엠-로드바드(RCM-Rodbard)]에 의해 계산하고, 신호 판독을 상응하는 농도 값으로 전환하기 위해 사용한다. 결과에 예비-희석 인자를 곱하여 개개 샘플 자체의 농도를 구한다.

적용된 항체 샌드위치의 교차-반응성을, 잠재적 교차-반응 혈청 성분 CFH, CFHL1, CFHR2, CFHR3, CFHR4 및 CFHR5의 개별 농도를 측정함으로써 결정한다. 적용된 항체 샌드위치의 경우, CFHL1, CFHR2, CFHR3, CFHR4 및 CFHR5에 대해 교차-반응성이 결정되지 않았고, 단지 4.4%의 CFH의 미미한 인식이 결정되었다.

상 2 GRI 정신분열증 시험으로부터의 혈청 샘플의 측정은 CHFR1 에서의 천연 컷- 오프를 식별한다

CFHR1 ECLIA 면역검정으로 측정된 CFHR1 농도는 다봉 분포를 나타내었고, 이는 CFHR1 유전자의 희석 상태와 관련된다.

도 1은 상 II 혈청-샘플에서의 CFHR1 농도의 분포를 도시한다. 3가지 군이 식별되었다:

⊙ 8 ㎍/㎖ 미만의 CFHR1 농도를 갖는 군; 이는 CFHR1에 대한 동형접합성 결실을 수반하는 군과 관련되고, 이에 따라 CFHR1을 발현하지 않는다. 측정된 신호는 CFHR1 ECLIA 면역검정의 CFH와의 잔여 교차-반응성에 기인한다.

⊙ 8 ㎍/㎖ 초과 내지 28 ㎍/㎖ 미만의 CFHR1 농도를 갖는 군. 이러한 군은 CFHR1에 대한 이형접합성 결실을 수반한다.

⊙ 28 ㎍/㎖를 초과하는 CFHR1을 갖는 군. 이러한 군은 CFHR1에 대한 결실을 수반하지 않는다.

CFHR1은, 인종적 기원에 따라, 집단의 약 5 내지 17%로 결실된다[5,9]. 코카시안(caucasian) 인종의 경우, 집단의 약 5%가 동형접합성 결실을 갖고, 약 40%가 이형접합성 결실을 수반한다.

CFHR1 천연 컷-오프를 사용하는 환자 계층화(stratification)

도 1에 제시된 각각의 3가지 군에서의 CFHR1 단백질 농도를 치료 반응과의 연관성에 대해 분석하였다. 동형접합성 결실을 수반하는 환자에서, CFHR1은 검출될 수 없고; 잔여 신호는 검정과 CFH의 교차-반응성에 기인한다. CFHR1의 이형접합성 결실을 수반하는 환자에서, CFHR1 단백질 농도와 치료 반응 사이에 어떠한 연관성도 없었다. CFHR1의 결실을 수반하지 않는 환자에서, 더 높은 CFHR1 농도는 더 높은 치료 반응과 관련되는 경향이 있었다. 이로써, 실제로 반응률은 CFHR1의 유전적 상태에 의해 주로 예측되고, CFHR1의 이형접합성 또는 동형접합성 결실은 GRI에 대한 더 낮은 반응으로 귀결됨을 알 수 있다.

결과적으로, 환자 계층화를 위하여, CFHR1에 특이적인 ECLIA 면역검정을 사용하여 28 ㎍/㎖에서 식별된 CFHR1 기선 혈청 농도의 천연 컷-오프가 선택되었다(도 1). 28 ㎍/㎖ 이하의 CFHR1 혈청 값을 갖는 환자를 "CFHR1-낮음"으로 계층화한 반면, 28 ㎍/㎖를 초과하는 CFHR1 혈청 값을 갖는 환자를 "CFHR1-높음"으로 계층화한다. 표 2는 상이한 용량 군에서의 CFHR1-높은 환자 및 CFHR1-낮은 환자의 분포를 제시한다.

CFHR1-높은(N=75) 하위군 및 CFHR1-낮은(N=75) 하위군을 1차 종점에 대해 분석하고, 상 II 연구의 2차 임상적 종점을 선택하고, 계층화되지 않은 CFHR1 혈청-샘플 PP 하위군(N=150)과 비교하였다.

도 2는 시간에 따라 기선으로부터의 PANSS 음성 증후 인자 스코어(PANSS NFS)에서의 변화에 대한 분석을 도시한다. 전체 환자 집단에 대한 결과는 상부 패널에 제시되고, CFHR1-낮은 환자는 중간 패널에 제시되고, CFHR1-높은 환자는 하부 패널에 제시된다. 10 mg 부문의 경우, CFHR1-높은 군에서의 효과 크기는 계층화되지 않은 군에서 -0.42인 것에 비교하여 -1.01이었고, 30 mg 부문의 경우, CFHR1-높은 군에서의 효과 크기는 계층화되지 않은 군에서 -0.47인 것에 비교하여 -0.76이었다.

도 3은 2차 임상적 종점인 PANSS 음성 증후 인자 스코어 반응자 비율에 대한 분석을 도시하고 치료 8주 후 PANSS 음성 증후 인자 스코어에 있어서 기선으로부터 적어도 20% 감소된 환자가 반응자로서 정의되었다. 전체 혈청 하위군에서 모든 4가지 치료 부문에 대한 반응률은 흰색 줄무늬 배경 막대로서 제공되고, CFHR1-높은 하위군 및 CFHR1-낮은 하위군은 회색 막대로서 제공된다. 10 mg 부문의 경우 CFHR1-높은 군에서의 반응률은 계층화되지 않은 군에서 69%인 것에 비교하여 88%였고, 30 mg 부문의 경우 CFHR1-높은 군에서의 반응률은 계층화되지 않은 군에서 66%인 것에 비교하여 78%였다.

도 4는 또 다른 2차 임상적 종점인 음성 증후 반응자 비율의 포괄적 임상 인상(CGI)에 대한 분석을 도시한다. CGI 반응자 비율의 분석을 위해, "개선된" 또는 "매우 많이 개선된" 환자가 반응자로서 정의되었다. 전체 혈청 하위군에서 모든 4가지 치료 부문에 대한 반응률은 흰색 줄무늬 배경 막대로서 제공되고, CFHR1-높은 하위군 및 CFHR1-낮은 하위군은 회색 막대로서 제공된다. 10 mg 부문의 경우 CFHR1-높은 군에서의 반응률은 계층화되지 않은 군에서 39%인 것에 비교하여 69%였고, 30 mg 부문의 경우 CFHR1-높은 군에서의 반응률은 계층화되지 않은 군에서 45%인 것에 비교하여 67%였다.

CFH-특이적 검정을 위해 사용되는 항체

CFHR1-특이적 검정의 개발을 위해, 하기 단일클론성 항체를 사용하였다: MAB<CFH/CFHR1>M-L20/3(공급업체: 써모 사이언티픽, 카탈로그 번호: GAU 020-03-02) 및 MAB<CFH>OX-24(공급업체: 써모 사이언티픽, 카탈로그 번호: MA1-70057).

OX24 IgG의 루테닐화, 화학양론 1:3

100 mM KP0₄(pH 8.5)중 5 mg/㎖의 단일클론성 마우스 IgG(클론 OX-24, 써모 사이언티픽, 카탈로그 번호: MA1-70057)의 용액에 125 ㎍의 루테늄-(bpy)2-bpyCO-Osu를 제공하였다. 실온에서 75분 후, 1O mM 라이신을 첨가하여 루테닐화를 중단시켰다. 응집물을 분리하기 위해 샘플의 적절한 분별물을 수퍼덱스 200 크기 배제 크로마토그래피로부터 수집하였다.

인간 혈청으로부터의 CFH의 정제

기준 보정자 물질로서 사용하기 위해, 하기 절차에 따라서 CFH 및 CFHR1에 특이적인 단일클론성 항체 L20/3을 사용하여 면역흡착에 의해 고유의 CFH를 인간 혈청으로부터 정제하였다. MAB L20/3<CFH,CFHR1>M-IgG-세파로실 수지를 정제를 위해 사용하였다. 미리 희석된(50 mM 트리스HCl, 150 mM NaCl중 1:4, pH 7.5) 혈청을 사토클린 CA(0.8 ㎛) 및 사토브란 P(0.2 ㎛) 필터 캡을 통해 통과시킨다. 칼럼 상에 적재된 예비처리된 혈청을 세척하고(1O mM 트리스HCl, 500 mM NaCl, 0.05% 트윈20, pH 7.5), 이후 Q-세파로스 이동 완충액을 흘려보내고, 분석물질과 흡착제의 분해를 방지하기 위해 용출 완충액(써모 사이언티픽)으로 부드럽게 용출시킨다. 공동-결합된 CFHR1을 배제하기 위해, 면역흡착제로부터의 용출물을 크기 의존성 용출을 위해 모노큐(MonoQ) 칼럼 상에서 이동시킨다. 순수한 CFH를, 혈청 CFH 값에 대한 엘렉시스-ECLIA 시험에서 CFH의 결정을 위한 기준 보정자 물질로서 적용한다.

ECLIA 면역검정을 사용하는 인간 혈청 또는 혈장 샘플에서의 CFH의 측정

CFH를 위한 ECLIA 면역검정은, 엘렉시스(등록상표) 분석기를 사용하여 인간 혈청 또는 혈장 샘플에서의 CFH의 특이적 측정을 위해 개발된다

다음은 엘렉시스(등록상표) 분석기를 사용하여 CFH를 결정하기 위한 검정 절차를 설명한다.

엘렉시스 CFH 면역검정은 샌드위치 원리를 통해 작용하는 전자화학발광 면역검정(ECLIA)이다. 이러한 검정에는 2가지 항체가 포함된다 - 단일클론성 항-CFH 항체 L20/3-Bi의 비오티닐화된 Fab 단편(포획 항체) 및 루테닐화된 단일클론성 항-CFH 항체 OX-24-Bi Ru(검출 항체); 이는 샘플에서 CFH와 함께 샌드위치형 면역검정 착체를 형성한다. 이어서 착체를 고체 상 스트렙타비딘-코팅된 미립자에 결합시킨다. 미립자를 전극의 표면 상으로 자석으로 포획시키고, 전극에 전압을 적용하여 화학발광을 유도하며, 이를 판독을 위해 광전자증배관으로 측정한다. 결과는 2-포인트 보정에 의해 생성되는 기기-특이적 보정 곡선, 및 시약 바코드 곡선(barcodecurve)을 경유해 제공된 마스터 곡선(master curve)을 통해 결정된다. 검정을 수행하는데 필요한 총 시간은 18분이다.

샘플을 엘렉시스용 멀티어세이 딜류언트(로슈 03609987-190)에서 1:400으로 자동 희석한다. 검정 프로토콜 2에 따라, 반응 완충액(헤페스50 mM, NaCl 150 mM; 테시트/폴리도카놀 0.1%; EDTA 1 mM; 소 혈청 알부민 0.5%)중 80 ㎕의 비오티닐화된 <CFH,CFHR1>-L20/3(1.5 ㎍/㎖에서) 및 80 ㎕의 루테닐화된 <CFH>-OX24(1.5 ㎍/㎖에서)를 10 ㎕의 샘플과 함께 항온처리한다. 항온처리 동안, 미립자에 결합되는 항체 분석물질 항체 샌드위치가 형성된다. 최종적으로 미립자를 신호 생성 및 판독을 위해 엘렉시스 시스템의 검출 챔버로 옮긴다. 보정을 위해, 정제된 CFH의 1:4 희석 연속물(1.25 ㎍/㎖, 312.5 ng/㎖, 78.1 ng/㎖, 19.5 ng/㎖, 0 ng/㎖) (500 ㎍/㎖, 125 ㎍/㎖, 31.25 ㎍/㎖, 7.81 ㎍/㎖, 0 ㎍/㎖)을 멀티어세이 딜류언트에서 제조하였다. 보정 곡선의 식을 비선형 최소자승 곡선 정합[알씨엠-로드바드]에 의해 계산하고, 신호 판독을 상응하는 농도 값으로 전환하기 위해 사용한다. 결과에 예비-희석 인자를 곱하여 개개 샘플 자체의 농도를 구한다.

적용된 항체 샌드위치의 교차-반응성을, 잠재적 교차-반응 혈청 성분의 농도를 측정함으로써 결정한다. 적용된 항체 샌드위치의 경우, CFHR1에 대해 2.9%의 교차 반응성이 결정되었다.

상 2 GRI 정신분열증 시험으로부터의 혈청 샘플에서 측정된 CFHR1/CFH 비의 측정은 천연 컷-오프를 확인한다

CFHR1 농도 및 CFH 농도를 CFHR1 및 CFH ECLIA 면역검정과 독립적으로 측정하고, CFHR1/CFH 비의 계산을 허용하였다. 도 1에 도시된 바와 같이 CFHR1 농도 단독인 경우와 유사하게, CFHR1/CFH 비는 다봉 분포를 나타내고, 이는 CFHR1 유전자의 결실 상태와 관련된다.

도 5는 상 II 혈청-샘플에서의 CFHR1/CFH 비의 분포를 도시한다. 3가지 군이 식별되었다:

⊙ 0.01 미만의 CHFR1/CFH 비를 갖는 군; 이는 CFHR1에 대한 동형접합성 결실을 수반하는 군과 관련되고, 이에 따라 CFHR1을 발현하지 않는다. 측정된 잔여 신호는 CFHR1 ECLIA 면역검정의 CFH와의 낮은 교차-반응성에 기인한다.

⊙ 0.01 초과 내지 0.08 미만의 CHFR1/CFH 비를 갖는 군. 이러한 군은 CFHR1에 대한 이형접합성 결실을 수반한다.

⊙ 0.08을 초과하는 CHFR1/CFH 비를 갖는 군. 이러한 군은 CFHR1에 대한 결실을 수반하지 않는다.

CFHR1/CFH 비를 사용하는 환자 계층화

도 5에 도시된 바와 같이 각각의 3가지 군에서의 CFHR1/CFH 비를 치료 반응과의 연관성에 대해 분석하였다. 이러한 목적을 위하여, 0.01 미만의 CFHR1/CFH 비를 낮음("L")으로 지칭하고, 0.01 초과 내지 0.08 미만의 CFHR1/CFH 비를 중간("M")으로 지칭하고, 0.08을 초과하는 CFHR1/CFH 비를 높음("H")으로 지칭한다.

도 6은 음성 증후 반응자 비율의 포괄적 임상 인상(CGI)에 대한 분석을 도시한다. CGI 반응자 비율의 분석을 위해, "개선된" 또는 "매우 많이 개선된" 환자가 반응자로서 정의되었다. 전체 혈청 하위군에서 모든 4가지 치료 부문에 대한 반응률은 흰색 줄무늬 배경 막대로서 제공되고, CFHR1/CFH 비 하위군 L, M 및 H는 회색 막대로서 제공된다. L 군의 경우, 반응률은 플라세보 부문, 및 10 mg 및 30 mg 부문에서 0%인 반면, 60 mg 부문에서 반응은 100%였다. L 군은 작은 샘플 크기로 구성되었고, 이에 따라 결과는 어느 정도 주의를 갖고 설명될 필요가 있다. M 하위군의 경우, 플라세보 부문에서 24%이고 60 mg 부문에서 25%인 반응률은, 플라세보의 경우 20%이고 60 mg 부문의 경우 34%인 계층화되지 않은 군(빗금친 막대)에 필적할만하였다. 그러나, 10 mg 및 30 mg 부문에서, M 하위군은 39%(1O mg의 경우) 및 45%(30 mg의 경우)를 갖는 계층화되지 않은 군과 비교하여 더 낮은 반응률, 19%(1O mg의 경우) 및 28%(30 mg의 경우)를 나타내었다. H 하위군은 플라세보 부문의 경우 20%의 반응률을 나타내고 60 mg 부문의 경우 33%의 반응률을 나타내었는데, 이는 20%(플라세보의 경우) 및 34%(60 mg의 경우)인 계층화된 군의 반응률에 필적할만하다. 1O mg 부문 및 30 mg 부문의 두 치료군에서, H 하위 군은 증가된 치료 반응률을 나타내었다: 10 mg 부문의 경우 H 하위군에서의 69%의 반응률은 계층화되지 않은 군에서의 39%와 비교되고, 30 mg 부문의 경우 H 하위군에서의 67%의 반응률은 비계층화된 군에서의 45%와 비교된다.

DNA 샘플의 제조

탐색적 바이오마커 분석을 위한 DNA 샘플의 수집 및 사용에 서면 동의한 환자로부터 DNA 샘플을 수집하였다(320명의 환자중 170명). DNA 샘플을 전혈로서 수집하고, 9 ㎖ EDTA 튜브에서 수집하고, -20℃에서 저장하였다. DNA 샘플을 이중으로 코딩하고, 확인하였다. 로슈 MagNA 퓨어(Pure) 96 LC DNA 단리 시스템을 사용하여 50 내지 200 ㎕의 전혈의 샘플로부터, 게놈성 DNA를 추출하였다. DNA 단리의 원리는 자성 비이드 기술에 기초한다. 간단히, 샘플을 우선 혼란성 염(chaotropic salt) 및 프로테이나아제(Proteinase) K를 포함하는 완충액과 함께 항온처리함으로써 용해시킨다. 이어서 자성 유리 입자(MGP: Magnetic Glass Particle)를 첨가하고, DNA는 이들 표면에 결합한다. 결합되지 않은 물질을 수 회의 세척 단계로 제거하고, 정제된 DNA를 용출한다. 생성된 DNA를 분광광도 정량에 의해 5 ng/ul의 농도로 정규화하였다.

CFHR1 복사물 수의 결정을 위한 검정

염색체 1:196796257-196796381[게놈 빌드(Genome Build) 37에 따른 조정, 조립체 GRCh37]에서의 게놈 자리에서 복사물 수를 결정하기 위해 정량적 실시간 PCR 검정을 착수하였다. 올리고누클레오타이드 서열은 서열 번호 8, 서열 번호 9 및 서열 번호 10으로 제공된다. 형광 탐침자를 5' 말단에서 5'-플루오레세인에 의해, 3' 말단에서 3' 말단 블랙홀(BlackHole: 등록상표) 다크 켄처(Dark Quencher)-1에 의해 개질하였다.

이러한 CFHR1 복사물 수 검정은 2배체 게놈에서 2개의 복사물로 존재하는 것으로 공지된 서열을 검출하는 분리가능한 형광 리포터(reporter)로 표지화된 검정을 참조하여 설정되었다. 기준 검정으로서, RN아제 PHI RNA 및 hTERT 유전자를 위해 타크만 복사물 수 기준 검정(TaqMan Copy Number Reference Assay)[라이프 테크놀로지스(Life Technologies), 미국 캘리포니아주 카를스배드 소재]을 각각 사용하였다. RN아제P 및 hTERT 기준 검정을 사용하여 독립적인 2중 설정으로부터 생성된 CFHR1 복사물 수가 부합된다면 결과는 유효한 것으로 고려되었다.

PCR 반응은 0.9 μM의 최종 농도에서의 PCR 올리고누클레오타이드를 포함하였고, 0.25 μM 실시간 PCR 반응의 최종 농도에서의 탐침자 올리고누클레오타이드를, 라이트사이클러(LightCycler)R 480 II 실-시간 PCR 시스템 및 하기 순환 매개변수를 사용하여 수행하였다: 10 분 95℃, 40×[15 초 95℃, 1 분 60℃], 1분 40℃. "절대 정량화/2차 유도 최대값(Absolute Quantitation/2nd Derivative Max)" 기기 세팅을 사용하여, 역치 주기(C_T: threshold cycle) 값을 계산하였다. 비교용 상대 정량 분석 △△CT[10]를 사용하여, CFHR1 표적 서열의 복사물 수를 계산하였다.

CFHR1의 복사물 수에 대한 외부 기준으로서, 세포주 NA07000[코리엘 인스티튜트 포 메디칼 리써치(Coriell Institute for Medical Research), 미국 뉴저지주 캄덴 소재]으로부터의 DNA를 사용하였고, 이는 CFHR3-1 결실 이내의 위치에서 2개의 복사물을 갖는 것으로 기재되어 있다[11]. CFHR3-CFHR1 유전자자리에서 하나 또는 0개의 복사물을 갖는 것으로 기재된 다중 세포주 상에서 검정을 시험하였고[11], 검정의 특이성을 확인하였다.

rs7542235의 결정을 위한 검정

DNA 샘플은 제조 절차에 따라 일루미나(Illumina)로부터 인간 1M-듀오 비드칩(Duo Beadchip)(v.3)을 사용하여 제조된 유전자형이다. 이어서 샘플을 SNP rs7542235에 대해 분석하였다.

CFHR1 복사물 수와 단일 누클레오타이드 동질이상 rs7542235의 상관관계

게놈 위치 Chr 1: 196823613(게놈 빌드 37, 조립체 GRCh37)에 위치한 단일 누클레오타이드 동질이상(SNP: Single Nucleotide Polymorphism) rs7542235는 통상의 CFHR1-CFHR3 결실을 위한 대용물로서 기재되어 있다[12]. 이러한 연관성은 유럽계 조상을 갖는 인종의 개별체의 경우 매우 높지만(r2 = 1.00) 다른 인종의 군에서는 덜 관련되는 것으로 제시되었다[5, 9].

표 3은 개별 맞춤된 복사물 수 변형 검정과 SNP rs7542235 대립유전자의 상관관계를 제시하고 이는 문헌과 일치한다. 다수의 A/A 대립유전자 태그는 2개의 CFHR1 복사물(CFHR1 +/+로 표시됨)을 갖고, 대립유전자 A/G 태그는 1개의 CFHR1 복사물(CFHR1 +/-로 표시됨)을 가지며, 소수의 대립유전자 G/G 태그는 0개의 CFHR1 복사물(CFHR1 -/-로 표시됨)을 갖는다.

주목할 만하게, CFHR1 -/- 및 rs7542235 A/A 대립유전자를 갖는 샘플 둘 다 비-히스패닉계(non-hispanic) 흑인 인종이고, CFHR1 +/- 및 rs7542235 A/A 대립유전자를 갖는 5명의 환자중 4명은 비-유럽계 인종이다.

CFHR1 복사물 수와 CFHR1 단백질 농도의 상관관계

도 7은 유전적 CFHR1 상태 대 RBM 검정(주로 CFHR1을 검출함)에 의해 측정된 단백질 농도의 상자 그림(box plot)을 도시한다. CFHR1 +/+ 유전적 상태는 높은 CFHR1 혈청 농도와 관련되고, CFHR1 +/- 유전적 상태는 더 낮은 CFHR1 혈청 농도와 관련되며, CFHR1 -/- 유전적 상태는 가장 낮은 단백질 신호와 관련된다(CFH와 검정의 교차-반응성에 기인됨).

SNP rs7542235와 CFHR1 단백질 농도의 상관관계

도 8은 SNP rs7542235의 대립유전자 상태 대 RBM 검정(주로 CFHR1을 검출함)에 의해 측정된 단백질 농도의 상자 그림을 도시한다. rs7542235 대립유전자 A/A는 높은 CFHR1 혈청 농도와 관련되고, rs7542235 대립유전자 A/G는 더 낮은 CFHR1 혈청 농도와 관련되며, rs7542235 대립유전자 A/A는 가장 낮은 단백질 신호와 관련된다(CFH와 검정의 교차-반응성에 기인됨).

CFHR1 유전자 분석을 사용한 환자 계층화

도 9는 음성 증후 반응자 비율의 포괄적 임상 인상(CGI)에 대한 분석을 도시한다. CGI 반응자 비율의 분석을 위해, "개선된" 또는 "매우 많이 개선된" 환자가 반응자로서 정의되었다. DNA 샘플에 대해 동의한 환자에 대한 반응률은 흰색 줄무늬 배경 막대로서 제공되고, CFHR1-유전적 상태는 회색 막대로서 제공된다. 10 mg 부문의 경우 CFHR1 +/+ 군에서의 반응률은 계층화되지 않은 군에서 39%인 것에 비교하여 57%였고, 30 mg 부문의 경우 CFHR1 +/+ 군에서의 반응률은 계층화되지 않은 군에서 46%인 것에 비교하여 67%였다.

서열(서열 번호)에 대한 설명:

서열 번호 1은 인간 보체 인자 H의 단백질 서열을 나타낸다.

서열 번호 2는 인간 보체 인자 H 관련된 단백질 CFHR1의 단백질 서열을 나타낸다.

서열 번호 3은 인간 보체 인자 H 관련된 단백질 CFHR2의 단백질 서열을 나타낸다.

서열 번호 4는 인간 보체 인자 H 관련된 단백질 CFHR3의 단백질 서열을 나타낸다.

서열 번호 5는 인간 보체 인자 H 관련된 단백질 CFHR4A의 단백질 서열을 나타낸다.

서열 번호 6은 인간 보체 인자 H 관련된 단백질 CFHR4B의 단백질 서열을 나타낸다.

서열 번호 7은 인간 보체 인자 H 관련된 단백질 CFHR5의 단백질 서열을 나타낸다.

서열 번호 8은 개별 맞춤된 CFHR1 복사물 수 검정에서 사용되는 순방향 프라이머를 위한 올리고누클레오타이드 서열을 나타낸다.

서열 번호 9는 개별 맞춤된 CFHR1 복사물 수 검정에서 사용되는 역방향 프라이머를 위한 올리고누클레오타이드 서열을 나타낸다.

서열 번호 10은 개별 맞춤된 CFHR1 복사물 수 검정에서 사용되는 탐침자를 위한 올리고누클레오타이드 서열을 나타낸다.

CFHR1 낮음은 기선 CFHR1 혈청 농도가 ≤28 ㎍/㎖인 환자이고, CFHR1 높은 군은 기선 CFHR1 혈청 농도가 >28 ㎍/㎖인 환자이다. ECLIA CFHR1 검정에 의해 CFHR1을 결정하였다.

참고문헌

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VAR SEQ 450-1231 Missing (in isoform 2). VARIANT 62 V -> I VARIANT 78 R -> G VARIANT 127 R -> L VARIANT 224 missing VARIANT 325 C -> Y VARIANT 400 Q -> K VARIANT 402 Y -> H VARIANT 431 C -> S VARIANT 493 T -> R VARIANT 536 C -> R VARIANT 551 I -> T VARIANT 567 R -> G VARIANT 609 V -> I VARIANT 630 C -> W VARIANT 673 C -> S VARIANT 673 C -> Y VARIANT 850 E -> K VARIANT 890 S -> I VARIANT 893 H -> R VARIANT 915 C -> S VARIANT 936 E -> D VARIANT 950 Q -> H VARIANT 951 Y -> H VARIANT 956 T -> M VARIANT 959 C -> Y VARIANT 978 W -> C VARIANT 997 N -> T VARIANT 1007 V -> I VARIANT 1007 V -> L VARIANT 1010 A -> T VARIANT 1017 T -> I VARIANT 1021 Y -> F VARIANT 1043 C -> R VARIANT 1050 N -> Y VARIANT 1059 I -> T VARIANT 1076 Q -> E VARIANT 1078 R -> S VARIANT 1119 D -> G VARIANT 1134 V -> G VARIANT 1142 Y -> D VARIANT 1143 Q -> E VARIANT 1157 W -> R VARIANT 1163 C -> W VARIANT 1169 I -> L VARIANT 1183 W -> C VARIANT 1183 W -> L VARIANT 1183 W -> R VARIANT 1184 T -> R VARIANT 1189 L -> R VARIANT 1191 S -> L VARIANT 1194 G -> D VARIANT 1197 V -> A VARIANT 1198 E -> A VARIANT 1199 F -> S VARIANT 1210 R -> C VARIANT 1215 R -> G VARIANT 1215 R -> Q VARIANT 1225-1231 YPTCAKR -> FQS VARIANT 1226 P -> S <210> 2 <211> 330 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <223> Human complement factor H related protein CFHR1 <400> 2 1 MWLLVSVILI SRISSVGGEA TFCDFPKINH GILYDEEKYK PFSQVPTGEV 51 FYYSCEYNFV SPSKSFWTRI TCTEEGWSPT PKCLRLCFFP FVENGHSESS 101 GQTHLEGDTV QIICNTGYRL QNNENNISCV ERGWSTPPKC RSTDTSCVNP 151 PTVQNAHILS RQMSKYPSGE RVRYECRSPY EMFGDEEVMC LNGNWTEPPQ 201 CKDSTGKCGP PPPIDNGDIT SFPLSVYAPA SSVEYQCQNL YQLEGNKRIT 251 CRNGQWSEPP KCLHPCVISR EIMENYNIAL RWTAKQKLYL RTGESAEFVC 301 KRGYRLSSRS HTLRTTCWDG KLEYPTCAKR with variants VARIANT 157 H -> Y VARIANT 159 L -> V VARIANT 175 E -> Q VARIANT 296 A -> V <210> 3 <211> 270 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <223> Human complement factor H related protein CFHR2 <400> 3 1 MWLLVSVILI SRISSVGGEA MFCDFPKINH GILYDEEKYK PFSQVPTGEV 51 FYYSCEYNFV SPSKSFWTRI TCAEEGWSPT PKCLRLCFFP FVENGHSESS 101 GQTHLEGDTV QIICNTGYRL QNNENNISCV ERGWSTPPKC RSTISAEKCG 151 PPPPIDNGDI TSFLLSVYAP GSSVEYQCQN LYQLEGNNQI TCRNGQWSEP 201 PKCLDPCVIS QEIMEKYNIK LKWTNQQKLY SRTGDIVEFV CKSGYHPTKS 251 HSFRAMCQNG KLVYPSCEEK with variant ISOFORM 144-171 ISAEKCGPPPPIDNGDITSFLLSVYAPG -> S (in isoform Short). <210> 4 <211> 330 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <223> Human complement factor H related protein CFHR3 <400> 4 1 MLLLINVILT LWVSCANGQV KPCDFPDIKH GGLFHENMRR PYFPVAVGKY 51 YSYYCDEHFE TPSGSYWDYI HCTQNGWSPA VPCLRKCYFP YLENGYNQNY 101 GRKFVQGNST EVACHPGYGL PKAQTTVTCT EKGWSPTPRC IRVRTCSKSD 151 IEIENGFISE SSSIYILNKE IQYKCKPGYA TADGNSSGSI TCLQNGWSAQ 201 PICINSSEKC GPPPPISNGD TTSFLLKVYV PQSRVEYQCQ PYYELQGSNY 251 VTCSNGEWSE PPRCIHPCII TEENMNKNNI KLKGRSDRKY YAKTGDTIEF 301 MCKLGYNANT SILSFQAVCR EGIVEYPRCE with variant VARIANT 71 H -> Y <210> 5 <211> 578 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <223> Human complement factor H related protein CFHR4A <400> 5 1 MLLLINVILT LWVSCANGQE VKPCDFPEIQ HGGLYYKSLR RLYFPAAAGQ 51 SYSYYCDQNF VTPSGSYWDY IHCTQDGWSP TVPCLRTCSK SDVEIENGFI 101 SESSSIYILN EETQYNCKPG YATADGNSSG SITCLQNGWS TQPICIKFCD 151 MPVFENSRAK SNGMWFKLHD TLDYECYDGY ESSYGNTTDS IVCGEDGWSH 201 LPTCYNSSEN CGPPPPISNG DTTSFPQKVY LPWSRVEYQC QSYYELQGSK 251 YVTCSNGDWS EPPRCISMKP CEFPEIQHGH LYYENTRRPY FPVATGQSYS 301 YYCDQNFVTP SGSYWDYIHC TQDGWLPTVP CLRTCSKSDI EIENGFISES 351 SSIYILNKEI QYKCKPGYAT ADGNSSGSIT CLQNGWSAQP ICIKFCDMPV 401 FENSRAKSNG MRFKLHDTLD YECYDGYEIS YGNTTGSIVC GEDGWSHFPT 451 CYNSSEKCGP PPPISNGDTT SFLLKVYVPQ SRVEYQCQSY YELQGSNYVT 501 CSNGEWSEPP RCIHPCIITE ENMNKNNIQL KGKSDIKYYA KTGDTIEFMC 551 KLGYNANTSV LSFQAVCREG IVEYPRCE <210> 6 <211> 331 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <223> Human complement factor H related protein CFHR4B <400> 6 1 MLLLINVILT LWVSCANGQE VKPCDFPEIQ HGGLYYKSLR RLYFPAAAGQ 51 SYSYYCDQNF VTPSGSYWDY IHCTQDGWSP TVPCLRTCSK SDIEIENGFI 101 SESSSIYILN KEIQYKCKPG YATADGNSSG SITCLQNGWS AQPICIKFCD 151 MPVFENSRAK SNGMRFKLHD TLDYECYDGY EISYGNTTGS IVCGEDGWSH 201 FPTCYNSSEK CGPPPPISNG DTTSFLLKVY VPQSRVEYQC QSYYELQGSN 251 YVTCSNGEWS EPPRCIHPCI ITEENMNKNN IQLKGKSDIK YYAKTGDTIE 301 FMCKLGYNAN TSVLSFQAVC REGIVEYPRC E with variant VARIANT 306 G -> E <210> 7 <211> 569 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <223> Human complement factor H related protein CFHR5 <400> 7 1 MLLLFSVILI SWVSTVGGEG TLCDFPKIHH GFLYDEEDYN PFSQVPTGEV 51 FYYSCEYNFV SPSKSFWTRI TCTEEGWSPT PKCLRMCSFP FVKNGHSESS 101 GLIHLEGDTV QIICNTGYSL QNNEKNISCV ERGWSTPPIC SFTKGECHVP 151 ILEANVDAQP KKESYKVGDV LKFSCRKNLI RVGSDSVQCY QFGWSPNFPT 201 CKGQVRSCGP PPQLSNGEVK EIRKEEYGHN EVVEYDCNPN FIINGPKKIQ 251 CVDGEWTTLP TCVEQVKTCG YIPELEYGYV QPSVPPYQHG VSVEVNCRNE 301 YAMIGNNMIT CINGIWTELP MCVATHQLKR CKIAGVNIKT LLKLSGKEFN 351 HNSRIRYRCS DIFRYRHSVC INGKWNPEVD CTEKREQFCP PPPQIPNAQN 401 MTTTVNYQDG EKVAVLCKEN YLLPEAKEIV CKDGRWQSLP RCVESTAYCG 451 PPPSINNGDT TSFPLSVYPP GSTVTYRCQS FYKLQGSVTV TCRNKQWSEP 501 PRCLDPCVVS EENMNKNNIQ LKWRNDGKLY AKTGDAVEFQ CKFPHKAMIS 551 SPPFRAICQE GKFEYPICE with variants VARIANT 46 P -> S VARIANT 216 N -> S VARIANT 277 Y -> N VARIANT 356 R -> H VARIANT 379 V -> L VARIANT 521 L -> I VARIANT 529 L -> R <210> 8 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> oligonucleotide sequence for the forward primer used in the customized CFHR1 copy number assay <400> 8 CAGTTCCAAT TGTGTCCAAG TGGATGT 27 <210> 9 <211> 29 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> oligonucleotide sequence for the reverse primer used in the customized CFHR1 copy number assay <400> 9 CATTTCAAAC AATCTCCAAG GAGATGATG 29 <210> 10 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> oligonucleotide sequence for the probe used in the customized CFHR1 copy number assay <400> 10 CAAATGTTCT CAAAGTGTGG TCGCT 25

Claims (20)

1. i) 환자의 샘플에서 보체 인자 H 계열의 1종, 2종, 3종, 4종, 5종 또는 6종의 구성원, 또는 이의 혼합물 또는 조합물의 단백질 농도를 결정하는 단계;
   ii) 단계 i)에서 결정된 단백질 농도를, 신경발달 장애, 신경 장애 또는 신경정신계 장애를 앓는 환자에서의 보체 인자 H 계열의 1종, 2종, 3종, 4종, 5종 또는 6종의 구성원의 단백질 농도의 대표값과 비교하는 단계;
   iii) 신경발달 장애, 신경 장애 또는 신경정신계 장애를 앓는 환자의 샘플에서의 보체 인자 H 계열로부터의 1종, 2종, 3종, 4종, 5종 또는 6종의 구성원의 더 높은 단백질 농도가, 글루타메이트 신경전달(glutamatergic) 경로를 표적화하는 화합물에 의한 치료로부터 임상적 이점을 얻을 환자를 나타내는 단계; 및
   iv) 신경발달 장애, 신경 장애 또는 신경정신계 장애를 앓는 환자를 위하여 이러한 치료를 선택하는 단계
   를 포함하는, 글루타메이트 신경전달 경로를 표적화하는 화합물에 의해 치료되는 경우, 신경발달 장애, 신경 장애 또는 신경정신계 장애를 앓는 환자에 대한 반응을 예측하는 시험관내 방법.
2. 제1항에 있어서,
   i) 환자의 샘플에서 보체 인자 H 계열의 1종, 2종, 3종, 4종, 5종 또는 6종의 구성원, 또는 이의 혼합물 또는 조합물의 단백질 농도를 결정하는 단계;
   ii) 단계 i)에서 결정된 단백질 농도를, 신경발달 장애, 신경 장애 또는 신경정신계 장애를 앓는 환자에서의 보체 인자 H 계열의 1종, 2종, 3종, 4종, 5종 또는 6종의 구성원의 단백질 농도의 대표값과 비교하는 단계;
   iii) 신경발달 장애, 신경 장애 또는 신경정신계 장애를 앓는 환자의 샘플에서의 보체 인자 H 계열로부터의 1종, 2종, 3종, 4종, 5종 또는 6종의 구성원의 더 높은 단백질 농도가, 글리신 재흡수 저해제(GRI: Glycine Reuptake Inhibitor)에 의한 치료로부터 임상적 이점을 얻을 환자를 나타내는 단계; 및
   iv) 신경발달 장애, 신경 장애 또는 신경정신계 장애를 앓는 환자를 위하여 GRI 치료를 선택하는 단계
   를 포함하는, 글리신 재흡수 저해제(GRI)에 의해 치료되는 경우, 신경발달 장애, 신경 장애 또는 신경정신계 장애를 앓는 환자에 대한 반응을 예측하는 시험관내 방법.
3. 제1항 또는 제2항에 있어서,
   보체 인자 H 계열 구성원(들)이 보체 인자 H(CFH), 보체 인자 H 관련된 단백질 1(CFHR1), 보체 인자 H 관련된 단백질 2(CFHR2), 보체 인자 H 관련된 단백질 3(CFHR3), 보체 인자 H 관련된 단백질 4A(CFHR4A), 보체 인자 H 관련된 단백질 4B(CFHR4B), 및 보체 인자 H 관련된 단백질 5(CFHR5)를 포함하는 보체 인자 H 계열의 개별 구성원, 또는 이의 혼합물 또는 조합물인 시험관내 방법.
4. 제1항 내지 제3항중 어느 한 항에 있어서,
   보체 인자 H 계열 구성원이 보체 인자 H 및 보체 인자 H 관련된 단백질 1의 혼합물인 시험관내 방법.
5. 제1항 내지 제3항중 어느 한 항에 있어서,
   보체 인자 H 계열 구성원이 보체 인자 H 및 보체 인자 H 관련된 단백질 1의 조합물인 시험관내 방법.
6. 제1항 내지 제3항중 어느 한 항에 있어서,
   보체 인자 H 계열 구성원이 보체 인자 H 관련된 단백질 1인 시험관내 방법.
7. 제1항 내지 제6항중 어느 한 항에 있어서,
   신경발달 장애, 신경 장애 또는 신경정신계 장애가 정신분열증, 양극성 장애, 물질 의존증, 자폐증 및 강박 장애의 음성 증후 또는 양성 증후를 포함하는 시험관내 방법.
8. 제1항 내지 제6항중 어느 한 항에 있어서,
   보체 인자 H 계열의 개별 구성원, 또는 이의 혼합물 또는 조합물의 단백질 농도를 ELISA에 기초한 기술에 의해 결정하는 시험관내 방법.
9. 보체 인자 H 계열 구성원의 유전적 변형체를 측정함으로써 보체 인자 H 계열의 개별 구성원, 또는 이의 혼합물 또는 조합물의 단백질 농도를 결정하는, 글루타메이트 신경전달 경로를 표적화하는 화합물로 치료되는 경우, 신경발달 장애, 신경 장애 또는 신경정신계 장애를 앓는 환자에 대한 반응을 예측하는 시험관내 방법.
10. 제9항에 있어서,
    보체 인자 H 계열 구성원의 유전적 변형체를 측정함으로써 보체 인자 H 계열의 개별 구성원, 또는 이의 혼합물 또는 조합물의 단백질 농도를 결정하는, 글리신 재흡수 저해제(GRI)로 치료되는 경우, 신경발달 장애, 신경 장애 또는 신경정신계 장애를 앓는 환자에 대한 반응을 예측하는 시험관내 방법.
11. 제9항 또는 제10항에 있어서,
    CFHR1의 변형체의 복사물 수의 측정을 통해, 또는 결실에 대한 대용물로서의 SNP의 측정에 의해 CFHR1의 유전적 변형체를 측정함으로써 CFHR1의 단백질 농도를 결정하는, 글리신 재흡수 저해제(GRI)로 치료되는 경우, 신경발달 장애, 신경 장애 또는 신경정신계 장애를 앓는 환자에 대한 반응을 예측하는 시험관내 방법.
12. 제1항 내지 제9항중 어느 한 항에 따른 방법에서 보체 인자 H 계열의 단백질에 특이적으로 결합하는 항체의 용도.
13. 제1항 내지 제11항중 어느 한 항에 있어서,
    환자가 분열정동 장애를 앓는 시험관내 방법.
14. 제1항 내지 제13항중 어느 한 항에 있어서,
    글루타메이트 신경전달 경로를 표적화하는 화합물이 GRI[4-(3-플루오로-5-트리플루오로메틸-피리딘-2-일)-피페라진-1-일]-[5-메탄설포닐-2-[[(2S)-1,1,1-트리플루오로프로판-2-일]옥시]페닐]메타논인 시험관내 방법.
15. 글루타메이트 신경전달 경로를 표적화하는 화합물로 치료되는 환자에 대한 예측적 마커로서 사용하기 위한 보체 인자 H 계열 구성원.
16. 제15항에 있어서,
    글리신 재흡수 저해제(GRI)로 치료되는 환자에 대한 예측적 마커로서 사용하기 위한 보체 인자 H 계열 구성원.
17. 글루타메이트 신경전달 경로를 표적화하는 화합물로 치료되는 환자를 위한 임상적 이점에 대한 예측적 마커로서의 보체 인자 H 계열 구성원의 단백질의 용도.
18. 제17항에 있어서,
    글리신 재흡수 저해제로 치료되는 환자를 위한 임상적 이점에 대한 예측적 마커로서의 보체 인자 H 계열 구성원의 단백질의 용도.
19. 글루타메이트 신경전달 경로를 표적화하는 화합물로 치료되는 경우, 신경발달 장애, 신경 장애 또는 신경정신계 장애를 앓는 환자를 위한 임상적 이점에 대한 예측적 마커로서의 보체 인자 H 계열 구성원.
20. 제19항에 있어서,
    글리신 재흡수 저해제(GRI)로 치료되는 경우, 신경발달 장애, 신경 장애 또는 신경정신계 장애를 앓는 환자를 위한 임상적 이점에 대한 예측적 마커로서의 보체 인자 H 계열 구성원.

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