WO2015083685A1 - Ｄｌｇ１／ＳＡＰ９７遺伝子のスプライシングバリアント、及びスプライシングバリアントを利用した統合失調症の検出 - Google Patents

Ｄｌｇ１／ＳＡＰ９７遺伝子のスプライシングバリアント、及びスプライシングバリアントを利用した統合失調症の検出 Download PDF

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schizophrenia
sap97
splicing variant
dlg1
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西川　徹
山本　直樹
彰仁 上里
麻未 海野
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国立大学法人東京医科歯科大学
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    • G01N2800/30—Psychoses; Psychiatry
    • G01N2800/302—Schizophrenia

Definitions

  • the present invention relates to a novel splicing variant of the Dlg1 / SAP97 gene associated with schizophrenia.
  • Schizophrenia is a serious mental illness that occurs after puberty at a high frequency of about 1%. Positive symptoms such as hallucinations / delusions and psychomotor excitement, negative symptoms such as inactivity / autism, emotional bluntness, and cognitive function Various mental symptoms such as disability occur. It is thought that abnormalities of glutamate neurotransmission are related to the pathological condition. To date, our group has been administered phencyclidine (PCP, 1- (1-phenylcyclohexyl) piperidine), an antagonist of N-methyl-D-aspartate (NMDA) type glutamate receptor, to rats.
  • PCP 1- (1-phenylcyclohexyl) piperidine
  • NMDA N-methyl-D-aspartate
  • Dlg1 / SAP97 interacts with alpha-amino-3-hydroxy-5-methyl isoxazole-4-propionate (AMPA), kainic acid, NMDA glutamate receptors and other synaptic protein subunits through various domains
  • AMPA alpha-amino-3-hydroxy-5-methyl isoxazole-4-propionate
  • NMDA glutamate receptors NMDA glutamate receptors
  • SNPs single nucleotide polymorphisms
  • the present invention aims to provide a novel splicing variant of the Dlg1 / SAP97 gene associated with schizophrenia and a method for determining the risk of developing schizophrenia by measuring the expression level of the splicing variant.
  • the present inventors have affected gene expression from a single SNP (Uezato A et al., Behav Brain Funct (2012 8: 2)) in Dlg1 / SAP97, which has been suggested to be related so far.
  • SNPs single nucleotide polymorphisms
  • the present invention is as follows.
  • a method for determining the risk of schizophrenia comprising measuring the expression level of a splicing variant expressed by inserting exon 3b between exon 3a and exon 4 of the Dlg1 / SAP97 gene, If the expression level of the splicing variant is low compared to healthy subjects, the risk of schizophrenia is determined to be high, and if the expression level is high compared to healthy subjects, the risk of schizophrenia is determined to be low Method.
  • the splicing variant expressed by inserting exon 3b between exon 3a and exon 4 of the Dlg1 / SAP97 gene consists of the amino acid sequence of 65 amino acids represented by SEQ ID NO: 2, [1] or [2] the method of.
  • the expression level of the splicing variant expressed by inserting exon 3b between exon 3a and exon 4 of the Dlg1 / SAP97 gene is the position of the 310th base of the base sequence of exon 3b of the Dlg1 / SAP97 gene.
  • the method according to any one of [1] to [3], wherein the expression level of the splicing variant is decreased when it is associated with a single nucleotide polymorphism and the base at the position is T.
  • [5] Measure the expression level of the splicing variant by measuring the mRNA of the splicing variant that is expressed by inserting exon 3b between exon 3a and exon 4 of the Dlg1 / SAP97 gene in the blood sample. Any one of [1] to [4].
  • the level of expression of the splicing variant is measured by measuring the splicing variant protein expressed by inserting exon 3b between exon 3a and exon 4 of the Dlg1 / SAP97 gene in the blood sample. Any one of [1] to [4].
  • [12] A nucleic acid that is DNA or RNA encoding the splicing variant of [11].
  • the expression level of the exon-inserted SAP97 splicing variant which is a novel splicing variant that can be expressed by inserting a new exon into the Dlg1 / SAP97 gene, is related to the expression of schizophrenia. Therefore, by measuring the expression level of exon-inserted SAP97 splicing variant in the subject, the risk of developing schizophrenia, the risk of malignant schizophrenia and the risk of cognitive decline due to schizophrenia, Can be determined.
  • the exon-inserted SAP97 splicing variant when the exon-inserted SAP97 splicing variant is normally expressed, the risk of developing schizophrenia, the risk of malignant schizophrenia and the risk of cognitive decline due to schizophrenia are low, but the exon-splicing variant If the expression level is low, the risk of developing schizophrenia, the risk of malignant schizophrenia, and the risk of cognitive decline due to schizophrenia are increased.
  • a novel exon is inserted into the human Dlg1 / SAP97 (synapse-associated protein 97) gene to analyze the splicing variant that is expressed, and to evaluate and determine the risk of developing schizophrenia
  • auxiliary data for predicting, evaluating, and determining the risk of developing schizophrenia Evaluation and determination are also called prediction.
  • the test inspection for evaluating and determining the risk of malignant transformation of schizophrenia is performed, and the auxiliary data for predicting, evaluating, and determining the risk of the onset of schizophrenia is acquired.
  • a test is conducted to evaluate and assess the risk of mental function decline due to schizophrenia, and to predict, evaluate and assess the risk of mental function decline due to schizophrenia. Get ancillary data.
  • the risk of schizophrenia includes the risk of developing schizophrenia, the risk of schizophrenia becoming malignant, and the risk of lowering mental functions such as cognitive function due to schizophrenia.
  • Schizophrenia is a typical mental illness whose main symptoms are hallucinations and delusions. It affects mental functions such as cognitive functions, resulting in mental dysfunction such as cognitive dysfunction. Clinical diagnosis of schizophrenia is performed based on, for example, DSM-IV.
  • the expression level of the splicing variant that is expressed by inserting a novel exon into the human Dlg1 / SAP97 gene is related to single nucleotide polymorphisms (SNPs) of the human Dlg1 / SAP97 gene.
  • SNPs single nucleotide polymorphisms
  • FIG. 1 The gene structure of the human Dlg1 / SAP97 gene and the position of single nucleotide polymorphisms (SNPs) are shown in FIG.
  • the circle indicated as Exon 3b represents the position of the gene regulatory sequence and the splicing silencer sequence upstream of the gene, and the site represented by a box represents an exon.
  • a box with a dot indicates an untranslated region, and a portion with a line (vertical line, horizontal line, diagonal line) indicates a domain code area.
  • the sizes (number of bases) of exons and introns are indicated by numbers.
  • the analyzed SNPs are represented by IV-1: rs13064360, IV-2: rs113174552, IV-3: rs147083146, IV-4: rs3915512, IV-5: rs338213, I-3: rs9843659.
  • rsXXXXXXX (X is an arbitrary number) indicates an rs number which is a reference number of the SNP database (dbSNP BUILD137) of NCBI (National Center for Biotechnology Information).
  • the splicing variant used to determine the risk of developing schizophrenia is that exon 3b (95 (bp) is inserted between exons 3a and 4 in the human Dlg1 / SAP97 gene of FIG. Is a splicing variant expressed by Exons 3a and 4 form an L27 domain in the Dlg1 / SAP97 protein, but when exon 3b is inserted between exons 3a and 4, a stop codon appears, the original L27 domain is interrupted, and the C-terminal A peptide consisting of 65 amino acids in total, containing 15 amino acids specific to the side, is generated.
  • the risk of developing schizophrenia is determined by detecting the peptide consisting of 65 amino acids.
  • FIG. 2 shows the splicing variants expressed by inserting exon 3b (95 bp) between newly found exons 3a and 4, and five previously reported splicing variants (transcript variants 1-5). The structure is shown.
  • a splicing variant expressed by insertion of newly found exon 3b is referred to as an exon-inserted SAP97 splicing variant.
  • the expression of the splicing variant is associated with a specific single nucleotide polymorphism of the Dlg1 / SAP97 gene.
  • the present inventors have found that multiple single nucleotide polymorphisms (SNPs) of the Dlg1 / SAP97 gene are associated with schizophrenia.
  • SNPs single nucleotide polymorphisms
  • Examples of a plurality of single nucleotide polymorphisms include IV-1: rs13064360, IV-2: rs113174552, IV-3: rs147083146, IV-4: rs3915512, IV-5: rs338213, I-3: rs9843659 shown in FIG. It is done.
  • the single nucleotide polymorphism represented by IV-4: rs3915512 is associated with the expression level of the splicing variant.
  • the expression level of the splicing variant varies depending on the base at the single nucleotide polymorphism site represented by IV-4: rs3915512.
  • IV-4 The single nucleotide polymorphism represented by rs3915512 is in the consensus sequence part of exonic splicing enhancer (ESE) in exon 3b between exons 3a and 4.
  • ESE exonic splicing enhancer
  • FIG. 3 shows the relationship between exon-inserted SAP97 splicing variants and gene polymorphisms.
  • the single nucleotide polymorphism represented by rs3915512 is located at the position of the 310th base of the nucleotide sequence of exon 3b inserted into the Dlg1 / SAP97 gene, and the base of the single nucleotide polymorphism site is A or T It is.
  • FIG. 3A shows the case where the base at the single nucleotide polymorphism site is A, the triplet codon containing the single nucleotide polymorphism site is AAA, and the amino acid of the expressed peptide is lysine (K) (K allele).
  • SEQ ID NO: 1 shows the base sequence of exon 3b K allele inserted into Dlg1 / SAP97
  • SEQ ID NO: 2 shows the deduced total amino acid sequence (K allele) consisting of 65 amino acids including exon 3b.
  • FIG. 3B shows the case where the base at the single nucleotide polymorphism site is T, and the triplet codon containing the single nucleotide polymorphism site is AUA and the amino acid of the expressed peptide is isoleucine (I) (I allele).
  • SEQ ID NO: 3 shows the nucleotide sequence of the I allele of exon 3b inserted into Dlg1 / SAP97
  • SEQ ID NO: 4 shows the deduced total amino acid sequence (I allele) consisting of 65 amino acids including exon 3b. Due to the single nucleotide polymorphism, the 64th amino acid of the 65 amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2 is lysine (K), and the 64th amino acid of the 65 amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 4 is It becomes isoleucine (I).
  • exon-inserted SAP97 splicing variants consisting of the amino acid sequence of 65 amino acids represented by SEQ ID NO: 2 may be measured.
  • That the risk of developing schizophrenia, the risk that schizophrenia becomes malignant, or the risk of mental disorders such as cognitive dysfunction due to schizophrenia is statistically related That the expression level of the exon-inserted SAP97 splicing variant and the risk that the subject will develop schizophrenia or the risk of mental impairment such as cognitive dysfunction due to schizophrenia are statistically related Say. That is, when the exon-inserted SAP97 splicing variant is normally expressed, the risk of developing schizophrenia, the risk of malignant schizophrenia and the risk of cognitive decline due to schizophrenia are low, but the exon-splicing variant If the expression level is low, the risk of developing schizophrenia, the risk of malignant schizophrenia, and the risk of cognitive decline due to schizophrenia are increased.
  • the exon insertion SAP97 splicing variant level in a biological sample of a subject is measured, and depending on the level, the risk of developing schizophrenia in the subject, the risk of malignant schizophrenia, or due to schizophrenia Determine the risk of cognitive decline.
  • the subject to which the present invention can be applied is a subject whose schizophrenia has not been found or a subject who has been found to have developed schizophrenia.
  • the risk of the subject developing schizophrenia and the risk of cognitive decline due to schizophrenia can be determined, and for the latter the risk of worsening schizophrenia, cognitive function due to schizophrenia It is possible to determine the risk of such a decrease or the therapeutic effect.
  • the age of the subject is not limited. Schizophrenia includes juvenile-onset schizophrenia that develops in childhood and adolescence with an onset age of 17 years or younger, and schizophrenia that develops in age 18 years or older. Thus, any schizophrenia can be determined.
  • a biological sample such as whole blood, serum, or plasma can be used.
  • Peripheral blood can be collected and the exon-inserted SAP97 splicing variant expression level in the sample can be measured.
  • the expression level may be measured by measuring the mRNA level of the exon-inserted SAP97 splicing variant or the exon-inserting splicing variant protein.
  • mRNA in blood cells may be measured using whole blood containing cells as a biological sample.
  • Whole blood, serum and plasma are preferably used for measurement of exon insertion splicing variant protein.
  • total RNA is extracted from the biological sample of the subject. Extraction of total RNA includes, for example, guanidine thiocyanate / cesium chloride ultracentrifugation method, guanidine thiocyanate / hot phenol method, guanidine hydrochloride method, acidic thiocyanate guanidine / phenol / chloroform method (Chomczynski, P. and Sacchi, N., (1987) (Anal. Biochem., 162, 156-159).
  • the degree of expression may be measured using nucleotides containing all or part of the base sequence of mRNA of the exon-inserted SAP97 splicing variant as a probe or primer.
  • the degree of expression can be measured by a method using a microarray (microchip), a Northern blot method, a quantitative PCR method targeting a gene to be quantified or a fragment thereof.
  • known quantitative PCR methods include agarose gel electrophoresis, fluorescent probe method, RT-PCR method, real-time PCR method, Taqman PCR method (SYBR (registered trademark) Green method) (Schmittgen TD, Methods 25, 383-385). 2001), ATAC-PCR method (Kato, K. et al., Nucl.
  • a nucleotide probe or primer that hybridizes to the mRNA may be used, and the amount of exon-inserted SAP97 splicing variant mRNA may be measured using the method described above.
  • the base length of the probe or primer used for the measurement is 10 to 50 bp, preferably 15 to 25 bp.
  • a DNA microarray (DNA chip) can be prepared by immobilizing a nucleotide comprising the base sequence of the gene or a nucleotide containing a partial sequence thereof on an appropriate substrate such as a glass plate or a quartz plate. Immobilization can be performed by a known method.
  • the present invention also encompasses nucleotides that are probes or primers for measuring splicing variant mRNA.
  • the exon-inserted SAP97 splicing variant protein may be measured by measuring the translated protein present in the biological sample. Protein quantification can be performed by immunoassay using an antibody against exon-inserted SAP97 splicing variant, mass spectrometry, or the like, but a method using an antibody is preferred.
  • the antibody can be prepared by a known method, and both a monoclonal antibody and a polyclonal antibody can be used. Examples of the immunoassay include, but are not limited to, immunochromatography, ELISA (Enzyme Linked ImmunoSorbent Assay), latex bead agglutination, radioimmunoassay and the like.
  • the antibody is labeled with an enzyme, a fluorescent substance, an insoluble carrier particle, a radioisotope, or the like, if necessary, and the antibody can be labeled by a known method.
  • the present invention also includes an anti-exon inserted SAP97 splicing variant antibody that specifically binds to an exon inserted SAP97 splicing variant protein.
  • the expression level of the exon-inserted SAP97 splicing variant is measured using the above method, if the expression level is low, the subject is at risk of developing schizophrenia, risk of malignant schizophrenia, or cognition by schizophrenia If it can be determined that the risk of functional decline is high and the expression level is high, the risk of developing schizophrenia, the risk of malignant schizophrenia, or the risk of decline in cognitive function due to schizophrenia Can be determined to be low.
  • the expression level of the exon-inserted SAP97 splicing variant is low compared to a healthy person who does not develop schizophrenia, and a high expression level does not develop schizophrenia. It means that it is high compared to healthy people.
  • the expression level of the exon-inserted SAP97 splicing variant in a biological sample of a healthy person can be measured in advance, and the value can be compared as a cutoff level.
  • the present invention encompasses exon-inserted SAP97 splicing variant proteins.
  • the exon insertion splicing variant protein consists of an amino acid sequence of 65 amino acids represented by SEQ ID NO: 2. Further, in the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2, at least 1, preferably 1 or several amino acids, more preferably 1 to 5, particularly preferably 1 or 2 amino acids are deleted, substituted or added.
  • a protein that is a splicing variant protein expressed by insertion of exon 3b between exon 3a and exon 4 of the Dlg1 / SAP97 gene is also an exon-inserted SAP97 splicing variant. Is included.
  • amino acid sequence in which one or several amino acids are deleted, substituted or added in the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2 the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2 and BLAST (Basic Local Alignment Search Tool at the National Center for Biological Information (E.g., US National Biological Information Center Basic Local Alignment Search Tool)) etc. (e.g., default or default parameters) at least 85%, preferably 90% or more, more preferably 95% As described above, those having a sequence identity of 97% or more are particularly preferable.
  • the present invention further includes nucleic acids that are DNA and RMA encoding the exon insertion splicing variant protein.
  • the present invention further includes a kit containing at least an mRNA level probe or primer for measuring the expression level of an exon-inserted SAP97 splicing variant, or at least an anti-exon-inserted SAP97 splicing variant antibody.
  • a kit containing at least an mRNA level probe or primer for measuring the expression level of an exon-inserted SAP97 splicing variant, or at least an anti-exon-inserted SAP97 splicing variant antibody.
  • the expression level of the exon-inserted SAP97 splicing variant in a biological sample is measured, and the risk of developing schizophrenia, risk of malignant schizophrenia, and cognitive function reduction due to schizophrenia are reduced. Risk can be evaluated and determined.
  • the risk of developing schizophrenia can also be determined by analyzing the single nucleotide polymorphism.
  • Single nucleotide polymorphisms can be analyzed by determining the type of base, i.e., allele, of a single nucleotide polymorphism site, and even if determined for one chromosome on a pair of chromosomes, it is determined for both chromosomes
  • genotypes that are homozygous or heterozygous at a single nucleotide polymorphism site can be determined by determining for both chromosomes.
  • a genotype can be determined by detecting each allele that opposes a particular allele in a sample isolated from a subject. When only one allele is detected, it is homozygous having the allele as a homozygote, and when two alleles are detected, it is heterozygous having the two alleles as heterogeneous.
  • the present invention by detecting a mutation at a single nucleotide polymorphism site of the Dlg / SAP97 gene, the risk of developing schizophrenia, the risk of malignant schizophrenia, cognitive function due to schizophrenia, etc. It is possible to evaluate and determine the risk of decrease in
  • Antipsychotics used for treatment include type antipsychotics such as chlorbromazine, levomebromazine, thioridazine and fluphenazine, and atypical antipsychotics such as risperidone, perospirone, olanzapine, quetiapine and aripiprazole.
  • the analyzed SNPs correspond to IV-1: rs13064360, IV-2: rs113174552, IV-3: rs147083146, IV-4: rs3915512, IV-5: rs338213, I-3: rs9843659, respectively.
  • the TaqMan SNP Genotyping Assay method (Applied Biosystems, Foster City, CA, USA) was used to examine the genotype of these SNPs. After PCR cloning of the obtained PCR product, the base sequence was confirmed using an autosequencer.
  • Case-control analysis uses the PLINK 1.07 software package (http: //pngu.mgh) for Fisher's exact test, multiple test correction, and chi-square test to assess deviations from Hardy-Weinberg equilibrium (HWE). .harvard.edu / ⁇ purcell / plink /) was used. Haploview (ver. 4.2) (www.broad.mit.edu/mpg/haploview/) for Linkage disequilibrium (LD) block creation and transmission disequilibrium tests, UNPHASED (http://unphased.sourceforge.net) for haplotype correlation analysis /) was used. For meta-analysis, Case-control And TDT Meta-Analysis Package of R project program (http://www.r-project.org/) was used.
  • the subjects were 34 patients with schizophrenia (including 8 patients with an onset age of 17 years or younger and 26 patients with an age of 18 years or older), 33 patients with bipolar disorder (including 7 patients with an age of onset of 17 years or younger, 18 years) The above are 26 cases) and the non-psychiatric disorder control group is 34 cases (joint research with RIKEN).
  • the expression of Dlg1 / SAP97 gene at the mRNA level in individual postmortem brain tissues was detected. Both the transcript containing the novel exon 3b discovered by the present inventor and the transcript not containing it were quantitatively analyzed. In addition, the SNP genotypes present in the exons were individually identified using genomic DNA samples.
  • the genotype frequency was significant in SNP IV-1, IV-4 and I-3 women, and the allele frequency was significant in SNP IV IV-1 and IV-4 women. The difference was recognized. Significant differences were also observed in multiple tests for the SNP IV-1 and IV-4 genotype frequencies and the SNP IV-1 allele frequency.
  • the disease group was divided into 17 years old and younger and 18 years old and older and compared with the healthy group. As a result, a significant difference was observed only in the group with the onset of SNP IV-1 and IV-4 over 18 years old. The allele frequency of SNP IV-4 was also significantly different in multiple tests.
  • SNP IV-4 and IV-5 may form one haplotype block. Furthermore, haplotype correlation analysis was performed to examine the correlation between SNPs. Only 5% or more of allele combinations are used. As a result, SNP IV-1 and IV-4, which are considered not to form haplotype blocks in the LD block, showed a significant difference when viewed in the entire combination of two alleles (CA and CT). When we looked at each of the two combinations, there was a significant difference even when multiple tests were performed on CT with lower P values. Between SNP IV-4 and IV-5, the total of 3 combinations (AA, AG and TG) was 5% or more, and the total P value of 3 was less than 0.05.
  • SNP IV-4 which was observed in the large-scale sample of this example and found to be associated with disease, is on the sequence considered to be exonic splicing enhancer (ESE). SNP IV-4 is located in an intron between exons 3a and 4, and it has been shown statistically that alleles that represent the consensus of exonic splicing enhancer (ESE) are protective alleles affected by schizophrenia. It was.
  • exon 3b as a novel exon from cDNA derived from human postmortem brain, and determined the primary structure of the protein deduced from the base sequence of the transcript containing this exon by alternative splicing.
  • a transcript in which exon 3b is inserted subsequent to exon 3a is translated, a novel variant protein having only the 65 amino acid sequence on the N-terminal side of the original Dlg1 / SAP97 protein is generated due to the appearance of the stop codon.
  • the selection of the SNPIV-4 allele present in this exon 3b can result in amino acid substitutions and also has a decisive influence on the regulation of alternative splicing due to differences in ESE consensus (FIG. 3).
  • FIG. 3A shows a case where the single nucleotide polymorphism site represented by IV-4: rs3915512 is A, and the corresponding amino acid is lysine (K).
  • IV-4 When the single nucleotide polymorphism represented by rs3915512 is A (K allele), exon 3b is inserted between exons 3a and 4, and when the transcript is translated, the start codon appears, An exon-inserted SAP97 splicing variant with only the N-terminal 65 amino acid sequence of the Dlg1 / SPA97 protein results.
  • FIG. 3B shows a case where the single nucleotide polymorphism site represented by IV-4: rs3915512 is T, and the corresponding amino acid is isoleucine (I).
  • exon 3b is more likely to be skipped when exonic splicing enhancer (ESE) consensus sequence is not satisfied, and exons 3a and 4 are connected Normal splicing occurs, and exon-inserted SAP97 splicing variants with only 65 amino acid sequences are unlikely to occur.
  • ESE exonic splicing enhancer
  • FIG. 4 shows the relationship between the single nucleotide polymorphism and the expression of the Dlg1 / SAP97 gene in the postmortem brain, and is the result of measuring the expression of the Dlg1 / SAP97 gene in human postmortem tissue by RT-PCR.
  • the horizontal axis indicates the expression (relative value) of Exon 3b ( ⁇ ), and the vertical axis indicates the expression (relative value) of Exon 3b (+).
  • Exon 3b (+) expression the exon inserted SAP97 splicing variant is expressed.
  • ⁇ indicates the case where the single nucleotide polymorphism site represented by IV-4: rs3915512 is A / A
  • ⁇ indicates the case of T / A
  • ⁇ indicates the case of T / T.
  • the expression of the exon inserted SAP97 splicing variant is increased. This indicates that the expression of the exon-inserted SAP97 splicing variant is associated with the base at the single nucleotide polymorphism site represented by IV-4: rs3915512.
  • Table 1 shows the results of analyzing the sequence ratio of exon3b (+) mRNA in the healthy control group post-mortem brain of the A / T heterogroup using the TA cloning method.
  • Fig. 5 shows the expression level of SAP97 exon 3b (+) transcript in postmortem brain.
  • the vertical axis shows the expression level of SAP97 exon 3b (+) transcript
  • the horizontal axis shows the control group, early-onset schizophrenia group, non-early-onset schizophrenia group, early-onset bipolar disorder group, non-early-onset bipolar
  • Each genotype (A / A, T / A, T / T) of the sexual disorder group is shown.
  • the expression of variants including exon 3b is reduced. This result is consistent with the result of FIG. 4 in which the expression of the exon inserted SAP97 splicing variant is increased when the allele is A / A or T / A.
  • FIG. 6 shows the mRNA tissue distribution (result of agarose electrophoresis).
  • FIG. 7 shows the results of linkage disequilibrium analysis of the Dlg1 / SAP97 gene SNPs.
  • LD block with 4 SNPs was created using Haploview.
  • FIG. 7A shows D ′ with 4 SNPs and
  • FIG. 7B shows r 2 with 4 SNPs.
  • the method of the present invention can evaluate and determine the risk of developing schizophrenia, the risk of malignant schizophrenia, or the risk of cognitive decline due to schizophrenia.

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Abstract

　統合失調症に関連するDlg1/SAP97遺伝子の新規スプライシングバリアント、及び該スプライシングバリアントの発現レベルを測定することにより統合失調症を発症するリスクを判定する方法の提供。　Dlg1/SAP97遺伝子のエキソン3aとエキソン4の間にエキソン3bが挿入することにより発現するスプライシングバリアントの発現レベルを測定することを含む統合失調症のリスクを判定する方法であって、前記スプライシングバリアントの発現レベルが健常者に比較して低い場合に、統合失調症のリスクが高いと判定し、発現レベルが健常者に比較して高い場合に、統合失調症のリスクが低いと判定する方法。

Description

Ｄｌｇ１／ＳＡＰ９７遺伝子のスプライシングバリアント、及びスプライシングバリアントを利用した統合失調症の検出
　本発明は、統合失調症に関連するDlg1/SAP97遺伝子の新規スプライシングバリアントに関する。
　統合失調症は約１％の高頻度で思春期以降に発症する重篤な精神疾患で、幻覚・妄想、精神運動興奮などの陽性症状、無為・自閉、感情鈍麻などの陰性症状及び認知機能障害といった多彩な精神症状が生じる。その病態にはグルタミン酸神経伝達の異常が関係していると考えられている。これまで本発明者らのグループは、N-methyl-D-aspartate(NMDA)型グルタミン酸受容体のアンタゴニストであるフェンサイクリジン(PCP, 1-(1-phenylcyclohexyl)piperidine)をラットに投与したときに、統合失調症モデルが成立する臨界期以降に、大脳皮質においてRNA量が上昇する応答遺伝子を解析し、Dlg1/SAP97を単離した(非特許文献１を参照)。Dlg1/SAP97は様々なドメインによって、alpha-amino-3-hydroxy-5-methyl isoxazole-4-propionate (AMPA)、カイニン酸、NMDA型グルタミン酸受容体及びその他のシナプスタンパク質のサブユニットと相互作用することが示されており、発現の変化による統合失調症への影響が考えられる。さらにこれまで本発明者らが報告した小規模ゲノムDNAサンプルによるヒトDlg1/SAP97遺伝子の一塩基多型(SNPs)解析から、一部のSNPと統合失調症との関連が示唆された(非特許文献２及び非特許文献３を参照）。
Hiraoka S et al., Eur Neuropsychopharm (2010 Mar;20(3)), 176-186 Sato J et al., J Neural Transm (2008) 115:1355-1365 Uezato A et al., Behav Brain Funct (2012 8:2)
　本発明は、統合失調症に関連するDlg1/SAP97遺伝子の新規スプライシングバリアント、及び該スプライシングバリアントの発現レベルを測定することにより統合失調症を発症するリスクを判定する方法の提供を目的とする。
　本発明者らは、これまでに関連が示唆されたDlg1/SAP97内の1箇所のSNP（Uezato A et al., Behav Brain Funct (2012 8:2)）と、新たにデータベースから遺伝子発現に影響を与える領域にあると考えられる5 SNPsを加えた計6 SNPsについて、日本人の統合失調症患者2012人及び日本人の健常者2170人のゲノムDNAを用いてSNP解析を行い、発症との関連を検討した。この大規模ゲノムDNAサンプルによるヒトDlg1/SAP97遺伝子の一塩基多型(SNPs)解析から、一部のSNPと統合失調症との関連が確認された。また、Dlg1/SAP遺伝子のこれまで発見されていなかった特定のスプライシングバリアントの脳内での発現量に統合失調症において有意な差が見出された。さらに、特定のSNPとDlg1/SAP遺伝子スプライシングバリアントの脳内での発現との関連が示された。これらの結果は、統合失調症におけるグルタミン酸神経伝達機能障害仮説を分子レベルで支持する。さらに、これらの新知見は、統合失調症のあらたな診断法の開発や疾患罹患脆弱性の解明に寄与するものである。
　すなわち、本発明は以下のとおりである。
[１]　Dlg1/SAP97遺伝子のエキソン3aとエキソン4の間にエキソン3bが挿入することにより発現するスプライシングバリアントの発現レベルを測定することを含む統合失調症のリスクを判定する方法であって、前記スプライシングバリアントの発現レベルが健常者に比較して低い場合に、統合失調症のリスクが高いと判定し、発現レベルが健常者に比較して高い場合に、統合失調症のリスクが低いと判定する方法。
[２]　統合失調症のリスクが、被験体の統合失調症を発症するリスク、統合失調症の悪性化のリスク、又は統合失調症による認知機能等の低下のリスクである、[１]の方法。
[３]　Dlg1/SAP97遺伝子のエキソン3aとエキソン4の間にエキソン3bが挿入することにより発現するスプライシングバリアントが配列番号２に表される65アミノ酸のアミノ酸配列からなる、[１]又は[２]の方法。
[４]　Dlg1/SAP97遺伝子のエキソン3aとエキソン4の間にエキソン3bが挿入することにより発現するスプライシングバリアントの発現レベルが、Dlg1/SAP97遺伝子のエキソン3bの塩基配列の310番目の塩基の位置の一塩基多型と関連しており、該位置の塩基がTである場合に、スプライシングバリアントの発現レベルが低下する、[１]～[３]のいずれかの方法。
[５]　血液試料中の、Dlg1/SAP97遺伝子のエキソン3aとエキソン4の間にエキソン3bが挿入することにより発現するスプライシングバリアントのmRNAを測定することにより、前記スプライシングバリアントの発現レベルを測定する、[１]～[４]のいずれかの方法。
[６]　プローブ又はプライマーを用いてmRNAを測定する、[５]の方法。
[７]　血液試料中の、Dlg1/SAP97遺伝子のエキソン3aとエキソン4の間にエキソン3bが挿入することにより発現するスプライシングバリアントタンパク質を測定することにより、前記スプライシングバリアントの発現レベルを測定する、[１]～[４]のいずれかの方法。
[８]　Dlg1/SAP97遺伝子のエキソン3aとエキソン4の間にエキソン3bが挿入することにより発現するスプライシングバリアントタンパク質に対する抗体を用いてタンパク質を測定する、[７]の方法。
[９]　[６]の方法に用いる、血液試料中の、Dlg1/SAP97遺伝子のエキソン3aとエキソン4の間にエキソン3bが挿入することにより発現するスプライシングバリアントのmRNAを測定するためのプローブ又はプライマーであるヌクレオチド。
[１０]　[８]の方法に用いる、Dlg1/SAP97遺伝子のエキソン3aとエキソン4の間にエキソン3bが挿入することにより発現するスプライシングバリアントに対する抗体。
[１１]　配列番号２に表される65アミノ酸のアミノ酸配列からなる、Dlg1/SAP97遺伝子のエキソン3aとエキソン4の間にエキソン3bが挿入することにより発現するスプライシングバリアント。
[１２]　[１１]のスプライシングバリアントをコードするDNA又はRNAである核酸。
　本明細書は本願の優先権の基礎である日本国特許出願2013-251488号の明細書および／または図面に記載される内容を包含する。
　Dlg1/SAP97遺伝子に新規なエキソンが挿入されることにより発現し得る新規スプライシングバリアントであるエキソン挿入SAP97スプライシングバリアントの発現レベルは統合失調症の発現と関連している。従って、被験体におけるエキソン挿入SAP97スプライシングバリアントの発現レベルを測定することにより、統合失調症の発症のリスク、統合失調症の悪性化のリスク及び統合失調症による認知機能等の低下のリスクを評価、判定することができる。すなわち、エキソン挿入SAP97スプライシングバリアントが正常に発現する場合、統合失調症の発症のリスク、統合失調症の悪性化のリスク及び統合失調症による認知機能等の低下のリスクは低いが、エキソン挿入スプライシングバリアントの発現レベルが低いと統合失調症の発症のリスク、統合失調症の悪性化のリスク及び統合失調症による認知機能等の低下のリスクが高くなる。
ヒトDlg1/SAP97遺伝子の遺伝子構造と解析したSNPsの位置を示す図である。 ヒトDlg1/SAP97のスプライシングバリアントを示す図である。既知のスプライシングバリアントを　transcript variant１～5で示し、新規に見出されたスプライシングバリアントをnewで示す。新たなスプライシングバリアントは、エキソン3bを含み、終始コドンが出現する。 新規なエキソン挿入SAP97スプライシングバリアントとDlg1/SAP97遺伝子の一塩基多型との関係を示す図である。新規エキソン(exon 3b)内に図２に示したSNP　IV-4が存在する。アミノ酸置換をともなうSNPであるが、スプライシングの選択自体にも影響をあたえるESEのコンセンサスが変化する。その結果、アリルが新規バリアントの発現量を規定する。 一塩基多型と死後脳におけるDlg1/SAP97遺伝子の発現の関係を示す図である。 死後脳におけるSAP97 exon 3b (+)/exon 3b (-)比を示す図である。 Dlg1/SAP97 エキソン3b(+)及びエキソン3b(-)のmRNA組織分布（アガロース電気泳動結果）を示す図である。 Dlg1/SAP97遺伝子SNPsの連鎖不平衡解析の結果を示す図である。
　以下、本発明を詳細に説明する。
　本発明においては、ヒトDlg1/SAP97(synapse-associated protein 97)遺伝子に、新規なエキソンが挿入されることにより、発現するスプライシングバリアントを分析し、統合失調症の発症のリスクを評価、判定するための検査を行い、統合失調症の発症のリスクを予測、評価、判定するための補助的データを取得する。評価、判定とは予測ともいう。また、また、統合失調症の悪性化のリスクを評価、判定するための検査を行い、統合失調症の発症のリスクを予測、評価、判定するための補助的データを取得する。さらに、統合失調症による認知機能等の精神機能の低下のリスクを評価、判定するための検査を行い、統合失調症による認知機能等の精神機能の低下のリスクを予測、評価、判定するための補助的データを取得する。本発明において、統合失調症のリスクは、統合失調症を発症するリスク、統合失調症が悪性化するリスク、及び統合失調症による認知機能等の精神機能の低下のリスクを含む。
　ヒトDlg1/SAP97遺伝子は、alpha-amino-3-hydroxy- 5-methyl isoxazole- 4-propionate (AMPA)、カイニン酸、NMDA型グルタミン酸受容体及びその他のシナプスタンパク質のサブユニットと相互作用することが報告されている遺伝子である。
　統合失調症は、幻覚や妄想を主症状とする代表的な精神疾患であり、認知機能等の精神機能に影響し、認知機能障害等の精神機能障害が生じる。統合失調症の臨床診断は、例えば、DSM-IVに基づいて行われる。
　ヒトDlg1/SAP97遺伝子に、新規なエキソンが挿入されることにより、発現するスプライシングバリアントの発現レベルは、ヒトDlg1/SAP97遺伝子の一塩基多型（SNPs）と関連している。ヒトDlg1/SAP97遺伝子の遺伝子構造と一塩基多型(SNPs)の位置を図１に示す。図１において、Exon 3bと記載された丸印は遺伝子上流の遺伝子調節配列とスプライシングサイレンサー配列の位置を表し、ボックスで表された部位はエキソンを示している。このうち、点が付されたボックスは非翻訳領域を示し、線（縦線、横線、斜線）が付いている部分はドメインコード領域を示す。図１において、エキソンとイントロンのサイズ(塩基数)を数字で示す。解析したSNPsは、IV-1: rs13064360、IV-2: rs113174552、IV-3: rs147083146、IV-4: rs3915512、IV-5: rs338213、I-3: rs9843659で表される。ここで、「rsXXXXXX（Ｘは任意の数字）」は、NCBI(National Center for Biotechnology Information)のSNPデータベース(dbSNP BUILD137)のリファレンス番号であるrs番号を示す。
　本発明において、統合失調症を発症するリスク等を判定するために用いるスプライシングバリアントは、図１のヒトDlg1/SAP97遺伝子において、エキソン3aと4の間にエキソン3b(95 bp)が挿入されることにより発現するスプライシングバリアントである。エキソン3a及び4はDlg1/SAP97タンパク質においてL27ドメインを形成しているが、エキソン3aと4の間にエキソン3bが挿入されると、終始コドンが出現し、本来のL27ドメインが中断され、C末端側に特異的な15アミノ酸を含む、全長65アミノ酸からなるペプチドが生じる。本発明においては、この65アミノ酸からなるペプチドを検出することにより、統合失調症を発症するリスク等を判定する。図２に、新たに見出されたエキソン3aと４の間にエキソン3b(95 bp)が挿入されることにより発現するスプライシングバリアント及び既に報告されている５つのスプライシングバリアント（transcript variant１～５）の構造を示す。新たに見出されたエキソン3bが挿入されることにより発現するスプライシングバリアントをエキソン挿入SAP97スプライシングバリアントという。
　該スプライシングバリアントの発現は、Dlg1/SAP97遺伝子の特定の一塩基多型と関連している。
　本発明者らは、Dlg1/SAP97遺伝子の複数の一塩基多型（SNPs）が統合失調症と関連していることを見出した。複数の一塩基多型として、図１に記載のIV-1: rs13064360、IV-2: rs113174552、IV-3: rs147083146、IV-4: rs3915512、IV-5: rs338213、I-3: rs9843659が挙げられる。このうち、IV-4: rs3915512で表される一塩基多型がスプライシングバリアントの発現レベルと関連している。すなわち、IV-4: rs3915512で表される一塩基多型部位の塩基により、前記スプライシングバリアントの発現レベルが変化する。IV-4: rs3915512で表される一塩基多型は、エキソン3aと4の間のエキソン3b中のexonic splicing enhancer(ESE)のコンセンサス配列部分にある。 
　図３にエキソン挿入SAP97スプライシングバリアントと遺伝子多型との関係を示す。IV-4: rs3915512で表される一塩基多型は、Dlg1/SAP97遺伝子に挿入されるエキソン3bの塩基配列の310番目の塩基の位置にあり、その一塩基多型部位の塩基はA又はTである。図３Aは、一塩基多型部位の塩基がAの場合を示し、一塩基多型部位を含むトリプレットコドンはAAAとなり発現するペプチドのアミノ酸はリジン（K）となる（Kアレル）。配列番号１にDlg1/SAP97に挿入されるエキソン3bのKアレルの塩基配列を示し、配列番号２にエキソン3bを含む65アミノ酸からなる推定全アミノ酸配列（Kアレル）を示す。図３Bは、一塩基多型部位の塩基がTの場合を示し、一塩基多型部位を含むトリプレットコドンはAUAとなり発現するペプチドのアミノ酸はイソロイシン（I）となる（Iアレル）。配列番号３にDlg1/SAP97に挿入されるエキソン3bのIアレルの塩基配列を示し、配列番号４にエキソン3bを含む65アミノ酸からなる推定全アミノ酸配列（Iアレル）を示す。一塩基多型により、配列番号２で表される65アミノ酸からなるアミノ酸配列の64番目のアミノ酸はリジン（K）となり、配列番号４で表される65アミノ酸からなるアミノ酸配列の64番目のアミノ酸はイソロイシン（I）となる。IV-4: rs3915512で表される一塩基多型がAの場合（Kアレル）、エキソン3bがエキソン3aと4の間に挿入され、転写産物が翻訳されると終始コドンの出現により、本来のDlg1/SPA97タンパク質のN末端側65アミノ酸配列のみを有するエキソン挿入SAP97スプライシングバリアントが生じる。しかしながら、IV-4: rs3915512で表される一塩基多型がTの場合（Iアレル）、エキソン3b内にあるexonic splicing enhancer(ESE)のコンセンサス配列が変わり、エキソン3bはスキップされやすくなり、正常なスプライシングが起こり、65アミノ酸配列のみを有するエキソン挿入SAP97スプライシングバリアントは生じにくくなる。本願発明においては、配列番号２で表される65アミノ酸のアミノ酸配列からなるエキソン挿入SAP97スプライシングバリアントを測定すればよい。
　IV-4: rs3915512で表される一塩基多型と統合失調症との間に関連があり、その結果、エキソン挿入SAP97スプライシングバリアントの発現レベルと統合失調症と間に関連が生じる。ここでDlg/SAP97遺伝子の一塩基多型と統合失調症が関連している、あるいはエキソン挿入SAP97スプライシングバリアントの発現レベルが関連しているとは、一塩基多型のアレルと該一塩基多型を保持する被験体が統合失調症を発症するリスク、統合失調症が悪性化するリスク、あるいは統合失調症による認知機能障害等の精神機能障害を起こすリスクが統計学的に関連していることをいい、あるいはエキソン挿入SAP97スプライシングバリアントの発現レベルと被験体が統合失調症を発症するリスク、あるいは統合失調症による認知機能障害等の精神機能障害を起こすリスクが統計学的に関連していることをいう。すなわち、エキソン挿入SAP97スプライシングバリアントが正常に発現する場合、統合失調症の発症のリスク、統合失調症の悪性化のリスク及び統合失調症による認知機能等の低下のリスクは低いが、エキソン挿入スプライシングバリアントの発現レベルが低いと統合失調症の発症のリスク、統合失調症の悪性化のリスク及び統合失調症による認知機能等の低下のリスクが高くなる。
　本発明においては、被験体の生体試料中のエキソン挿入SAP97スプライシングバリアントレベルを測定し、レベルにより、被験体の統合失調症を発症するリスク、統合失調症の悪性化のリスク、又は統合失調症による認知機能等の低下のリスクを判定する。
　本発明を適用することのできる被験体は、統合失調症を発症しているか否かが判明していない被験体又は統合失調症を発症していることが判明している被験体である。前者については、被験体が統合失調症を発症するリスク、統合失調症による認知機能等の低下のリスクを判定することができ、後者については統合失調症が悪化するリスク、統合失調症による認知機能等の低下のリスク、あるいは治療効果の判定を行うことができる。被験体の年齢は限定されない。また、統合失調症には、発症年齢が17歳以下の児童期、青年期で発症する若年発症統合失調症と18歳以上で発症する統合失調症があるが、エキソン挿入SAP97スプライシングバリアントを発現レベルによりいずれの統合失調症についても判定することができる。
　生体試料として、全血、血清、血漿等の血液試料を用いることができ、末梢血を採取し、試料中のエキソン挿入SAP97スプライシングバリアント発現レベルを測定すればよい。
　発現レベルの測定は、エキソン挿入SAP97スプライシングバリアントのmRNAレベルを測定してもよいし、エキソン挿入スプライシングバリアントタンパク質を測定してもよい。
　mRNAレベルの測定には、生体試料として細胞を含む全血を用い血球細胞中のmRNAを測定すればよい。エキソン挿入スプライシングバリアントタンパク質の測定には、全血、血清、血漿を用いるのが好ましい。
　mRNAを測定する場合、被験体の生体試料から全RNAを抽出する。全RNAの抽出は、例えば、チオシアン酸グアニジン・塩化セシウム超遠心法、チオシアン酸グアニジン・ホットフェノール法、グアニジン塩酸法、酸性チオシアン酸グアニジン・フェノール・クロロホルム法（Chomczynski, P. and Sacchi, N., (1987) Anal. Biochem., 162, 156-159）等の公知の方法により行うことができる。mRNAの測定は、エキソン挿入SAP97スプライシングバリアントのmRNAの塩基配列の全部又は一部を含むヌクレオチドをプローブ又はプライマーとして用いて発現の程度を測定すればよい。発現の程度は、マイクロアレイ（マイクロチップ）を用いた方法、ノーザンブロット法、定量しようとする遺伝子又はその断片をターゲットとした定量PCR法等で測定することができる。例えば、公知の定量PCR法としては、アガロースゲル電気泳動法、蛍光プローブ法、RT-PCR法、リアルタイムPCR法、Taqman PCR法（SYBR（登録商標）グリーン法）（Schmittgen TD,Methods25,383-385,2001）、ATAC-PCR法(Kato,K.et al.,Nucl.Acids Res.,25,4694-4696,1997)、Body Map法(Gene,174,151-158(1996))、MAGE法(Micro-analysis of Gene Expression)（特開2000-232888号）等が挙げられる。該mRNAにハイブリダイズするヌクレオチドプローブ又はプライマーを使用し、上記方法を用いて、エキソン挿入SAP97スプライシングバリアントmRNAの量を測定すればよい。測定に用いるプローブ又はプライマーの塩基長は、10～50bp、好ましくは15～25bpである。DNAマイクロアレイ（DNAチップ）は、前記遺伝子の塩基配列からなるヌクレオチド又はその一部配列を含むヌクレオチドをガラス板、石英板等の適当な基板上に固定化することにより作製することができる。固定化は公知の方法で行うことができる。本発明は、スプライシングバリアントのmRNAを測定するためのプローブ又はプライマーであるヌクレオチドも包含する。
　エキソン挿入SAP97スプライシングバリアントタンパク質の測定は、生体試料中に存在する翻訳されたタンパク質を測定すればよい。タンパク質の定量はエキソン挿入SAP97スプライシングバリアントに対する抗体を用いた免疫測定法、質量分析等により行うことができるが抗体を用いた方法が好ましい。抗体は公知の方法により、作製することができ、モノクローナル抗体もポリクローナル抗体も用いることができる。免疫測定法としては、イムノクロマトグラフィー法、ELISA（Enzyme Linked ImmunoSorbent Assay)法、ラテックスビーズ凝集法、ラジオイムノアッセイ等の免疫凝集法などが挙げられるが、これらには限定されない。抗体は必要に応じて、酵素、蛍光物質、不溶性担体粒子、放射性同位元素等により標識して用いるが、抗体の標識は公知の方法により行うことができる。
　本発明は、エキソン挿入SAP97スプライシングバリアントタンパク質に特異的に結合する抗エキソン挿入SAP97スプライシングバリアント抗体も含む。
　上記方法で、エキソン挿入SAP97スプライシングバリアントの発現レベルを測定した場合に、発現レベルが低い場合、被験体は統合失調症を発症するリスク、統合失調症の悪性化のリスク、又は統合失調症による認知機能等の低下のリスクが高いと判定することができ、発現レベルが高い場合、統合失調症を発症するリスク、統合失調症の悪性化のリスク、又は統合失調症による認知機能等の低下のリスクが低いと判定することができる。ここで、エキソン挿入SAP97スプライシングバリアントの発現レベルが低いとは、統合失調症を発症していない健常者に比較して低いことをいい、発現レベルが高いとは、統合失調症を発症していない健常者に比較して高いことをいう。例えば、あらかじめ健常者の生体試料中のエキソン挿入SAP97スプライシングバリアントの発現レベルを測定し、その値をカットオフレベルとして比較することができる。
　本発明は、エキソン挿入SAP97スプライシングバリアントタンパク質を包含する。エキソン挿入スプライシングバリアントタンパク質は、配列番号２に表す65アミノ酸のアミノ酸配列からなる。また、配列番号２に表されるアミノ酸配列において、少なくとも１個、好ましくは１若しくは数個のアミノ酸、さらに好ましくは１～５個、特に好ましくは１若しくは２個のアミノ酸に欠失、置換、付加等の変異が生じたアミノ酸配列からなるタンパク質であって、Dlg1/SAP97遺伝子のエキソン3aとエキソン4の間にエキソン3bが挿入することにより発現するスプライシングバリアントタンパク質であるタンパク質もエキソン挿入SAP97スプライシングバリアントに包含される。また、配列番号２のアミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列として、配列番号２のアミノ酸配列と、BLAST（Basic Local Alignment Search Tool at the National Center for Biological Information（米国国立生物学情報センターの基本ローカルアラインメント検索ツール））等（例えば、デフォルトすなわち初期設定のパラメータ）を用いて計算したときに、少なくとも85％以上、好ましくは90％以上、さらに好ましくは95％以上、特に好ましくは97％以上の配列同一性を有しているものが挙げられる。本発明は、さらに上記エキソン挿入スプライシングバリアントタンパク質をコードするDNA及びRMAである核酸も包含する。
　本発明はさらに、エキソン挿入SAP97スプライシングバリアントの発現レベルを測定するための、少なくともmRNAレベルを測定するプローブ又はプライマーを含むキット、あるいは少なくとも抗エキソン挿入SAP97スプライシングバリアント抗体を含むキットを包含する。該キットにより、生体試料中のエキソン挿入SAP97スプライシングバリアントの発現レベルを測定し、被験体の統合失調症の発症のリスク、統合失調症の悪性化のリスク及び統合失調症による認知機能等の低下のリスクを評価、判定することができる。
　なお、上記の一塩基多型を解析することによっても、統合失調症を発症するリスク等を判定することができる。
　一塩基多型は、一塩基多型部位の塩基の種類、すなわちアレルを決定することにより分析することができ、１対の染色体上の一方の染色体について決定する場合も、両方の染色体について決定する場合も含まれ、両方の染色体について決定することにより、一塩基多型部位においてホモ接合性かヘテロ接合性かの遺伝子型を決定することができる。被験体から単離した試料に含まれる特定のアレルに対立する各々のアレルを検出することにより、遺伝子型を決定することができる。一方のアレルのみが検出された場合は当該アレルをホモに有するホモ接合性であり、２つのアレルが検出された場合には該２つのアレルをヘテロに有するヘテロ接合性である。
　本発明においては、Dlg/SAP97遺伝子の一塩基多型部位における変異を検出することにより、被験体の統合失調症の発症のリスク、統合失調症の悪性化のリスク及び統合失調症による認知機能等の低下のリスクを評価、判定することができる。
　本発明の方法により、統合失調症の発症のリスクが高いと評価、判定され、あるいは、統合失調症による認知機能等の精神機能の低下のリスクが高いと判定された被験体に対して、適切な時期に抗精神病薬を投与し、統合失調症の発症を予防し、あるいは既に統合失調症に罹患している被験体の統合失調症を治療し、認知機能等の精神機能を改善することが可能である。治療に用いる抗精神病薬として、クロルブロマジン、レボメブロマジン、チオリダジン、フルフェナジン等の型抗精神病薬、リスペリドン、ペロスピロン、オランザピン、クエチアピン、アリピプラゾール等の非定型抗精神病薬が挙げられる。
　本発明を以下の実施例によって具体的に説明するが、本発明はこれらの実施例によって限定されるものではない。
1.　遺伝子関連解析
　ケース・コントロール解析に対して、日本人の統合失調症患者2012人(男性1111人: 47.2±14.1歳, 女性901人: 49.2±14.7歳)及び日本人の健常者2170人(男性889人: 39.2±13.8歳, 女性1281人: 44.6±14.1歳)から採取した末梢血由来のgenomic DNAを解析対象とした。伝達不平衡試験は、ケース・コントロール解析にも含まれている日本人の統合失調症患者(男性124人, 女性87人)、親401人を解析対象とした。なお、臨床診断はDSM-IVに基づいて行われた。
SNP解析
　これまでのヒトDlg1/SAP97の小規模SNP解析において統合失調症と有意な関連が見出されたSNP I-3: rs9843659の他に、Dlg1/SAP97遺伝子の構造上、遺伝子の上流10 kbを含んだ領域において、遺伝子発現に影響を与えると考えられるエンハンサー領域、インスレーター機能、及びスプライシングに関係する配列に関与する可能性のあるSNPsを選択した。解析したSNPsは、IV-1: rs13064360、IV-2: rs113174552、IV-3: rs147083146、IV-4: rs3915512、IV-5: rs338213、I-3: rs9843659にそれぞれ相当する。TaqMan SNP Genotyping Assay method (Applied Biosystems, Foster City, CA, USA)を用いて、これらのSNPsのgenotypeを調べた。得られたPCR産物をTA cloning後にオートシーケンサーを用いて塩基配列を確認した。
　一部のSNPについては、SAP97遺伝子の脳内発現への影響を検討した。
統計学的解析
　ケース・コントロール解析では、Fisherの正確検定、多重検定補正、及びハーディ・ワインベルグ平衡(HWE)からの逸脱を評価するカイ二乗検定にPLINK 1.07 software package (http://pngu.mgh.harvard.edu/~purcell/plink/)を用いた。Linkage disequilibrium (LD) ブロックの作成と伝達不平衡試験にHaploview (ver. 4.2) (www.broad.mit.edu/mpg/haploview/)、ハプロタイプ相関分析にUNPHASED (http://unphased.sourceforge.net/)を用いた。メタ解析にはRプロジェクトプログラム(http://www.r-project.org/)のCase-control And TDT Meta-Analysis Packageを使用した。
2.　死後脳解析
　対象は、統合失調症34例（うち発症年齢17歳以下が8例、18歳以上が26例）、双極性障害33例（うち発症年齢17歳以下が7例、18歳以上が26例）、非精神疾患対照群が34例である（理化学研究所との共同研究）。
　TaqMan Real Time PCR 法(Applied Biosystems, Foster City, CA, USA)を用いて個々の死後脳組織におけるDlg1/SAP97遺伝子のmRNAレベルでの発現を検出した。本発明者が発見した新規エキソン3bを含む転写産物と含まない転写産物の両者を定量解析した。また、同エキソンに存在するSNPのジェノタイプを個別的にジェノミックDNA検体を用いて同定した。
結果
　Dlg1/SAP97の統合失調症における遺伝子関連解析（ケース・コントロール解析）を行った。健常者における4 SNPsすべてにおいて、HWEからの有意な逸脱は認められなかった。疾患患者においては、SNP IV-4とI-3でHWEが有意に逸脱していた。SNP IV-4においてのみ、genotype頻度とallelic頻度で有意差があった。今回のサンプルでは有意差が認められなかったが、先行研究において疾患との関連が示唆されていたSNP I-3については、家系サンプルにおける伝達不平衡試験も含めてメタ解析を行ったところ、有意差が認められた。
　疾患群と健常者群をそれぞれ性別で分けて比較したところ、genotype頻度ではSNP IV-1、IV-4及びI-3の女性に、allele頻度ではSNP IV-1とIV-4の女性において有意な差が認められた。SNP IV-1及びIV-4のgenotype頻度、SNP IV-1のallele頻度では多重検定においても有意差が認められた。
　疾患群を発症年齢が17歳以下と18歳以上に分けて健常者群と比較した。その結果、SNP IV-1及びIV-4の発症が18歳以上のグループでのみ、有意な差が認められた。SNP IV-4のallele頻度では多重検定においても有意差が認められた。
　個々のSNPの結果から連鎖不平衡の検定を行い、SNP IV-4とIV-5が1つのハプロタイプブロックを形成している可能性があることがわかった。さらに、ハプロタイプ相関分析を行い、それぞれSNPsの間での相関を調べた。アレルの組み合わせが５％以上組み合わせのみ採用されている。その結果、LDブロックではハプロタイプブロックを形成していないと考えられるSNP IV-1とIV-4で、2つのアレルの組み合わせ(C-AとC-T)全体で見たときに有意な差が認められた。2つの組み合わせをそれぞれ見たとき、よりP値が低かったC-Tで多重検定を行っても有意な差は認められた。SNP IV-4とIV-5の間では3つの組み合わせ(A-A, A-G及びT-G)が全体で５%以上となり、3つの全体でのP値が0.05以下となった。そのうち最もP値が低かったT-Gにおいて多重検定でも有意な差が認められた。さらに、LDブロックでr2の高いDlg1/SNP IV-4とI-3の組み合わせで分析したところ、A-Cの組み合わせにおいて多重検定でも有意な差が認められた。
　現在、精神疾患に関してGWAS (Genome-wide association)とCNV (copy number variants)の研究から得られた情報が非常に注目されている。Dlg1/SAP97が存在している3q29では欠失が知られており、統合失調症とのオッズ比は63.0となっている(Gejman PV et al., Annu Rev Genet (2011) 12:121-144)。稀なCNVで非特異的なリスク因子ではあるが、強いオッズ比が出ている。したがって、Dlg1/SAP97をコードする領域はCNVでも統合失調症の関連が示唆される。本解析では、ケース・コントロール解析による疾患に関連するSNPsの探索に加えて、複数のSNPsの組み合わせによる疾患への影響も検討した。本実施例の大規模サンプルで行った、疾患との関連が見られたSNP IV-4は、exonic splicing enhancer (ESE)と考えられる配列上にある。SNP IV-4はエキソン3aと4の間のイントロンにあり、exonic splicing enhancer (ESE)のコンセンサスをみたす配列となるアレルが、統合失調症の罹患プロテクティブアレルとなることが統計的に有意に示された。
　本発明者らは、ヒト死後脳由来cDNAからエキソン3bを新規エキソンとして同定し、選択的スプライシングによってこのエキソンを含む転写産物の塩基配列と推定されるタンパク質の一次構造を決定した。エキソン3aに引き続いてエキソン3bが挿入された転写産物が翻訳されると、終始コドンの出現により本来のDlg1/SAP97タンパク質のN末端側65アミノ酸配列のみを有する新規バリアントタンパク質が生じる。さらに、このエキソン3b内に存在するSNPIV-4のアレルの選択によりアミノ酸置換が生じうるとともに、ESEのコンセンサスのちがいにより選択的スプライシングの調節にも決定的な影響を与える（図３）。図３AはIV-4: rs3915512で表される一塩基多型部位がAである場合を示し、対応するアミノ酸はリジン（K）となる。IV-4: rs3915512で表される一塩基多型がAの場合（Kアレル）、エキソン3bがエキソン3aと4の間に挿入され、転写産物が翻訳されると終始コドンの出現により、本来のDlg1/SPA97タンパク質のN末端側65アミノ酸配列のみを有するエキソン挿入SAP97スプライシングバリアントが生じる。図３BはIV-4: rs3915512で表される一塩基多型部位がTである場合を示し、対応するアミノ酸はイソロイシン（I）となる。IV-4: rs3915512で表される一塩基多型がTの場合（Iアレル）、exonic splicing enhancer(ESE)のコンセンサス配列を満たさなくなると、エキソン3bはスキップされやすくなり、エキソン3aと4が接続する通常のスプライシングが起こり、65アミノ酸配列のみを有するエキソン挿入SAP97スプライシングバリアントは生じにくい。図３Aの場合をエキソン3bが発現するという意味でExon 3b(+)といい、図３Bの場合は、エキソン3bがスキップされ発現しないという意味でExon 3b(-)という。 
　実際に死後脳の発現とアレルに強い関係を見出した。死後脳組織における統合失調症のDlg1/SAP97遺伝子の発現を検討し、対照群に比較して統合失調症早期発症群においてexon 3bを含む転写産物の低下を見出した。図４は、一塩基多型と死後脳におけるDlg1/SAP97遺伝子の発現の関係を示し、ヒト死後の組織のDlg1/SAP97遺伝子の発現をRT-PCRにより測定した結果である。図４中、横軸はExon 3b (-)の発現（相対値）を示し、縦軸はExon 3b (+)の発現（相対値）を示す。Exon 3b(+)の発現の場合に、エキソン挿入SAP97スプライシングバリアントが発現する。図４中、■はIV-4: rs3915512で表される一塩基多型部位がA/Aである場合、◆はT/Aである場合、▲はT/Tである場合を示す。図４に示すように、アレルがA/A又はT/Aの場合、エキソン挿入SAP97スプライシングバリアントの発現が増大する。このことは、エキソン挿入SAP97スプライシングバリアントの発現がIV-4: rs3915512で表される一塩基多型部位の塩基と関連していることを示す。
　健常対照群死後脳のうちの遺伝子型がA/Tヘテロ群の、exon3b (+) mRNAの配列比を、TAクローニング法をもちいて解析した結果は表１の通りであった。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000001
　この結果は、ヘテロ群では、脳で発現するexon3b (+) mRNAの由来染色体がヒトによって異なることを意味する（T由来の発現の全くないヒトもいれば、A/Tがほぼ等分で発現しているヒトもいる）。
　図５は、死後脳におけるSAP97 exon 3b (+)の転写産物の発現量を示す。縦軸はSAP97 exon 3b (+)の転写産物の発現量を示し、横軸はコントロール群、早期発症統合失調症群、非早期発症統合失調症群、早期発症双極性障害群、非早期発症双極性障害群のそれぞれの遺伝子型(A/A、T/A、T/T)を示す。図５に示すように、T/T型では、exon 3bを含むバリアントの発現が低下している。この結果は、アレルがA/A又はT/Aの場合、エキソン挿入SAP97スプライシングバリアントの発現が増大するという図４の結果に合致している。
　さらに、各組織におけるエキソン3b(+)及びエキソン3b(-)の発現をRT-PCRにより調べた。図６にmRNA組織分布（アガロース電気泳動結果）を示す。
　図７には、Dlg1/SAP97遺伝子SNPsの連鎖不平衡解析の結果を示す。Haploview を用いて4 SNPsでのLDブロックを作成した。図７Aは4 SNPsでのD'を示し、図７Bは4 SNPsでのr2を示す。
　エキソン3aと4はL27ドメインを形成し、SAP97はL27ドメインを介して重合することが報告されているため、アレルの違いがsplicingに影響し、SAP97タンパク質の発現・構造や、グルタミン酸受容体との相互作用に変化が生ずることから、統合失調症の発症及び脆弱性にかかわる可能性が示唆される。
　本発明の方法により、被験体の統合失調症を発症するリスク、統合失調症の悪性化のリスク、又は統合失調症による認知機能等の低下のリスクを評価、判定することができる。
　本明細書で引用した全ての刊行物、特許および特許出願をそのまま参考として本明細書にとり入れるものとする。

Claims (12)

  1. 　Dlg1/SAP97遺伝子のエキソン3aとエキソン4の間にエキソン3bが挿入することにより発現するスプライシングバリアントの発現レベルを測定することを含む統合失調症のリスクを判定する方法であって、前記スプライシングバリアントの発現レベルが健常者に比較して低い場合に、統合失調症のリスクが高いと判定し、発現レベルが健常者に比較して高い場合に、統合失調症のリスクが低いと判定する方法。
  2. 　統合失調症のリスクが、被験体の統合失調症を発症するリスク、統合失調症の悪性化のリスク、又は統合失調症による認知機能等の低下のリスクである、請求項１記載の方法。
  3. 　Dlg1/SAP97遺伝子のエキソン3aとエキソン4の間にエキソン3bが挿入することにより発現するスプライシングバリアントが配列番号２に表される65アミノ酸のアミノ酸配列からなる、請求項１又は２に記載の方法。
  4. 　Dlg1/SAP97遺伝子のエキソン3aとエキソン4の間にエキソン3bが挿入することにより発現するスプライシングバリアントの発現レベルが、Dlg1/SAP97遺伝子のエキソン3bの塩基配列の310番目の塩基の位置の一塩基多型と関連しており、該位置の塩基がTである場合に、スプライシングバリアントの発現レベルが低下する、請求項１～３のいずれか１項に記載の方法。
  5. 　血液試料中の、Dlg1/SAP97遺伝子のエキソン3aとエキソン4の間にエキソン3bが挿入することにより発現するスプライシングバリアントのmRNAを測定することにより、前記スプライシングバリアントの発現レベルを測定する、請求項１～４のいずれか１項に記載の方法。
  6. 　プローブ又はプライマーを用いてmRNAを測定する、請求項５記載の方法。
  7. 　血液試料中の、Dlg1/SAP97遺伝子のエキソン3aとエキソン4の間にエキソン3bが挿入することにより発現するスプライシングバリアントタンパク質を測定することにより、前記スプライシングバリアントの発現レベルを測定する、請求項１～４のいずれか１項に記載の方法。
  8. 　Dlg1/SAP97遺伝子のエキソン3aとエキソン4の間にエキソン3bが挿入することにより発現するスプライシングバリアントタンパク質に対する抗体を用いてタンパク質を測定する、請求項７記載の方法。
  9. 　請求項６に記載の方法に用いる、血液試料中の、Dlg1/SAP97遺伝子のエキソン3aとエキソン4の間にエキソン3bが挿入することにより発現するスプライシングバリアントのmRNAを測定するためのプローブ又はプライマーであるヌクレオチド。
  10. 　請求項８記載の方法に用いる、Dlg1/SAP97遺伝子のエキソン3aとエキソン4の間にエキソン3bが挿入することにより発現するスプライシングバリアントに対する抗体。
  11. 　配列番号２に表される65アミノ酸のアミノ酸配列からなる、Dlg1/SAP97遺伝子のエキソン3aとエキソン4の間にエキソン3bが挿入することにより発現するスプライシングバリアント。
  12. 　請求項１１に記載のスプライシングバリアントをコードするDNA又はRNAである核酸。
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