JP2012501165A - Depdc1ポリペプチドを使用した膀胱癌の治療または予防のための方法 - Google Patents
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Abstract
Description
本願は、2008年8月28日付で出願された米国特許仮出願第61/190,531号の恩典を主張するものである。その内容全体は参照により本明細書に組み入れられる。
本発明は、膀胱癌を治療または予防するための方法、および膀胱癌を治療または予防するための化合物をスクリーニングする方法に関する。特に、本発明はDEPDC1に関する。
膀胱癌は、2番目に多い尿生殖器腫瘍であり、世界中で毎年およそ357,000の新症例という発生率を有する(Parkin DM, et al., Cancer J Clin 2005 55:74-108(非特許文献1))。それらのおよそ3分の1は、診断の時点で浸潤性または転移性の疾患であると推測される(非特許文献1〜3)。世界の多くの地域で、浸潤性膀胱癌のための根治的膀胱切除が、治療の標準のままであるが、そのような患者のほぼ半分は、膀胱切除後2年以内に転移を発症し、その後、その疾患により死亡する。過去20年間に、CMV(シスプラチン、メトトレキサート、およびビンブラスチン)またはM−VAC(メトトレキサート、ビンブラスチン、ドキソルビシン、およびシスプラチン)などのシスプラチンに基づく組み合わせ化学療法レジメンが、進行膀胱癌を有する患者のために処方されるようになった(非特許文献3〜6)。しかしながら、全体の予後は依然として非常に不十分なままであり、これらの組み合わせ化学療法によって引き起こされる有害反応は著しく重篤である(非特許文献7)。したがって、膀胱癌に対する新たな分子標的薬の開発が、切実に望まれている。
本明細書に記載されたものと類似しているかまたは等価である任意の方法および材料を、本発明の態様の実施または試行において使用することができるが、好ましい方法、装置、および材料を以下に記載する。しかしながら、本材料および本方法を記載する前に、本発明が、本明細書に記載された特定のサイズ、形、寸法、材料、方法論、プロトコル等に限定されず、これらがルーチンの実験法および最適化に従い変動し得ることを理解されたい。また、明細書中で使用される用語は、特定の形式または態様を記載するためのものに過ぎず、添付の特許請求の範囲によってのみ限定される本発明の範囲を限定することを意図していないことも理解されたい。
「1つの(a)」、「1つの(an)」、および「その(the)」という単語は、本明細書で使用される場合、特に指定のない限り、「少なくとも1つの」を意味する。
本発明の関心対象である遺伝子の核酸配列およびポリペプチド配列は、以下の番号で示されるが、これらに限定されない;
DEPDC1:SEQ ID NO:44および45、または46および47;
ZNF224:SEQ ID NO:48および49;
DLG1:SEQ ID NO:50および51;ならびに
A20(TNFAIP3):SEQ ID NO:52および53。
追加的な配列データは以下のアクセッション番号を介して入手可能である;
DEPDC1:AB382287またはNM_017779.4;
ZNF224:NM_013398;
DLG1:NM_001098424;および
A20(TNFAIP3):NM_006290。
1)アラニン(A)、グリシン(G);
2)アスパラギン酸(D)、グルタミン酸(E);
3)アスパラギン(N)、グルタミン(Q);
4)アルギニン(R)、リシン(K);
5)イソロイシン(I)、ロイシン(L)、メチオニン(M)、バリン(V);
6)フェニルアラニン(F)、チロシン(Y)、トリプトファン(W);
7)セリン(S)、スレオニン(T);および
8)システイン(C)、メチオニン(M)(例えば、Creighton, Proteins 1984を参照されたい)。
本明細書に開示されるタンパク質のドミナントネガティブ変異体は、がんを治療または予防するために使用され得、該がんは膀胱癌である。例えば、本発明は、ドミナントネガティブ効果を有するDEPDC1変異体またはそのような変異体をコードするポリヌクレオチドを投与することにより、対象におけるがんを治療または予防する方法を提供する。DEPDC1変異体は、ZNF224結合領域を含むアミノ酸配列を含み得る(図4および図5を参照されたい)。DEPDC1変異体は、SEQ ID NO:45の611〜628位またはSEQ ID NO:47の327〜344位に相当するSEQ ID NO:28のアミノ酸配列を有し得る。
[R]−[D]
を有してもよく、式中、[R]は膜伝達剤であり、かつ[D]はSEQ ID NO:28のアミノ酸配列を有するポリペプチドである。該一般式において、[R]は、[D]に直接連結されていてもよいし、またはリンカーを通して[D]に間接的に連結されていてもよい。複数の官能基を有するペプチドまたは化合物が、リンカーとして使用され得る。特に、−GGG−であるアミノ酸配列が、リンカーとして使用され得る。あるいは、膜伝達剤およびSEQ ID NO:28のアミノ酸配列を有するポリペプチドが、微粒子の表面に結合していてもよい。
[ポリアルギニン]; Matsushita, M. et al, J Neurosci. 21, 6000-7 (2003).
[Tat/RKKRRQRRR](SEQ ID NO:29) Frankel, A. et al, Cell 55,1189-93 (1988).
Green, M. & Loewenstein, P. M. Cell 55, 1179-88 (1988).
[ペネトラチン(Penetratin)/RQIKIWFQNRRMKWKK](SEQ ID NO:30)
Derossi, D. et al, J. Biol. Chem. 269, 10444-50 (1994).
[ブフォリンII/TRSSRAGLQFPVGRVHRLLRK](SEQ ID NO:31)
Park, C. B. et al. Proc. Natl Acad. Sci. USA 97, 8245-50 (2000).
[トランスポータン/GWTLNSAGYLLGKINLKALAALAKKIL](SEQ ID NO: 32)
Pooga, M. et al. FASEB J. 12, 67-77 (1998).
[MAP(model amphipathic peptide) / KLALKLALKALKAALKLA](SEQ ID NO:33)
Oehlke, J. et al. Biochim. Biophys. Acta. 1414, 127-39 (1998).
[K−FGF/AAVALLPAVLLALLAP](SEQ ID NO:34)
Lin, Y. Z. et al. J. Biol. Chem. 270, 14255-14258 (1995).
[Ku70/VPMLK](SEQ ID NO:35)
Sawada, M. et al. Nature Cell Biol. 5, 352-7 (2003).
[Ku70/PMLKE](SEQ ID NO:36)
Sawada, M. et al. Nature Cell Biol. 5, 352-7 (2003).
[プリオン/MANLGYWLLALFVTMWTDVGLCKKRPKP](SEQ ID NO:37)
Lundberg, P. et al. Biochem. Biophys. Res. Commun. 299, 85-90 (2002).
[pVEC/LLIILRRRIRKQAHAHSK](SEQ ID NO:38)
Elmquist, A. et al. Exp. Cell Res. 269, 237-44 (2001).
[Pep−1/KETWWETWWTEWSQPKKKRKV](SEQ ID NO:39)
Morris, M. C. et al. Nature Biotechnol. 19, 1173-6 (2001).
[SynB1/RGGRLSYSRRRFSTSTGR](SEQ ID NO:40)
Rousselle, C. et al. Mol. Pharmacol. 57, 679-86 (2000).
[Pep−7/SDLWEMMMVSLACQY](SEQ ID NO:41)
Gao, C. et al. Bioorg. Med. Chem. 10, 4057-65 (2002).
[HN−1/TSPLNIHNGQKL](SEQ ID NO:42)
Hong, F. D. & Clayman, G. L. Cancer Res. 60, 6551-6 (2000).
本発明との関連において、本スクリーニング法により同定される剤には、任意の化合物、または幾つかの化合物を含む組成物が含まれる。さらに、本発明のスクリーニング法によって細胞またはタンパク質に曝露される試験剤または試験化合物は、単一の化合物であっても、または化合物の組み合わせであってもよい。化合物の組み合わせを前記方法において使用する場合には、化合物を逐次的に接触させてもよいし、または同時に接触させてもよい。
試験剤/試験化合物ライブラリの構築は、求められる特性を有することが既知の化合物の分子構造、および/またはDEPDC1またはZNF224の分子構造の知識により容易になる。さらなる評価のために好適な試験剤または試験化合物を予備スクリーニングするための1つのアプローチは、試験剤/試験化合物とその標的との間の相互作用のコンピュータモデリングを利用する。
試験剤または試験化合物のコンビナトリアルライブラリは、既知の阻害剤に存在しているコア構造の知識を含む、合理的薬物設計プログラムの一部として作製され得る。このアプローチにより、ハイスループットスクリーニングを容易にする適度のサイズにライブラリを維持することが可能になる。あるいは、ライブラリを構成する分子ファミリーの全順列を簡便に合成することにより、単純な、特に短い、重合体分子ライブラリを構築することもできる。この後者のアプローチの一例は、6アミノ酸長の全ペプチドのライブラリである。そのようなペプチドライブラリは、6アミノ酸配列のあらゆる順列を含み得る。この種類のライブラリは、線形コンビナトリアルケミカルライブラリと称される。
もう1つのアプローチは、ライブラリを作製するために組換えバクテリオファージを使用する。「ファージ法」(Scott & Smith, Science 1990, 249: 386-90;Cwirla et al., Proc Natl Acad Sci USA 1990, 87: 6378-82;Devlin et al., Science 1990, 249: 404-6)を使用すれば、極めて大きいライブラリを構築することができる(例えば、106〜108個の化学物質)。第2のアプローチは、主として化学的な方法を使用し、Geysenの方法(Geysen et al., Molecular Immunology 1986, 23: 709-15;Geysen et al., J Immunologic Method 1987, 102: 259-74);およびFodorらの方法(Science 1991, 251: 767-73)がその例である。Furkaら(14th International Congress of Biochemistry 1988, Volume #5, Abstract FR: 013; Furka, Int J Peptide Protein Res 1991, 37: 487-93)、Houghten(米国特許第4,631,211号)、およびRutterら(米国特許第5,010,175号)は、アゴニストまたはアンタゴニストとして試験され得るペプチドの混合物を作製する方法を記載している。
本発明との関連において、DEPDC1とZNF224との間の相互作用は、免疫沈降により確認される(図1B)。したがって、本発明は、DEPDC1とZNF224との間の結合を阻害する化合物をスクリーニングする方法を提供する。DEPDC1とZNF224との間の結合を阻害する化合物は、DEPDC1を発現しているがん細胞の増殖を抑制し、DEPDC1と関係のあるがんの治療または予防のために有用であると予想される。したがって、本発明は、DEPDC1とZNF224との間の結合を阻害して、がん細胞の増殖を抑制する化合物をスクリーニングする方法、およびがんを治療または予防するための化合物をスクリーニングする方法も提供し、特に、該がんは膀胱癌である。
(a)試験化合物の存在下で、DEPDC1ポリペプチドまたはその機能的等価物を、ZNF224ポリペプチドまたはその機能的等価物と接触させる工程;
(b)前記ポリペプチド間の結合を検出する工程;および
(c)前記ポリペプチド間の結合を阻害する試験化合物を選択する工程。
(a)試験剤または試験化合物の存在下で、DEPDC1ポリペプチドまたはその機能的等価物を、ZNF224ポリペプチドまたはその機能的等価物と接触させる工程;
(b)前記ポリペプチド間の結合のレベルを検出する工程;および
(c)DEPDC1タンパク質とZNF224タンパク質との結合レベルを、試験剤または試験化合物の非存在下で検出されるものと比較する工程;および
(d)(c)の結合レベルを試験剤または試験化合物の治療効果と相関させる工程。
本発明との関連において、DLG1またはA20(TNFAIP3)の発現は、DEPDC1またはZNF224のsiRNAにより増加した(図3A)。さらに、DEPDC1のドミナントネガティブタンパク質によるDLG1またはA20(TNFAIP3)の増加は、細胞周期に関係していた(図6)。したがって、本発明は、DEPDC1およびZNF224を発現しているがん細胞の増殖を抑制する化合物、またはDEPDC1と関係のあるがんを治療もしくは予防するために有用な化合物をスクリーニングする方法を提供し、特に、該がんは膀胱癌である。本発明との関連において、そのようなスクリーニングは、例えば、以下の工程を含み得る:
(a)候補化合物を、DEPDC1およびZNF224を発現している細胞と接触させる工程、ならびに
(b)試験化合物の非存在下で検出される発現レベルと比較して、DLG1またはA20(TNFAIP3)の発現レベルを増加させる候補化合物を選択する工程。
(a)試験剤または試験化合物を、DEPDC1遺伝子およびZNF224遺伝子を発現している細胞と接触させる工程;
(b)DLG1遺伝子またはA20(TNFAIP3)遺伝子の発現レベルを検出する工程;ならびに
(c)(b)の発現レベルを試験剤または試験化合物の治療効果と相関させる工程。
(a)DLG1またはA20(TNFAIP3)の転写調節領域と、該転写調節領域の制御下で発現されるレポーター遺伝子とを含むベクターが導入されている、DEPDC1およびZNF224を発現している細胞に、候補化合物を接触させる工程;
(b)レポーター遺伝子の発現または活性を測定する工程;および
(c)対照と比較して、レポーター遺伝子の発現または活性のレベルを増加させる候補化合物を選択する工程。
(a)DLG1遺伝子またはA20(TNFAIP3)遺伝子の転写調節領域と、該転写調節領域の制御下で発現されるレポーター遺伝子とを含むベクターが導入されている細胞に、試験剤または試験化合物を接触させる工程;
(b)レポーター遺伝子の発現または活性を検出する工程;および
(c)(b)の発現レベルを試験剤または試験化合物の治療効果と相関させる工程。
本明細書で使用される場合、「単離二本鎖分子」という用語は標的遺伝子の発現を阻害する核酸分子を意味し、例えば短鎖干渉RNA(siRNA、例えば二本鎖リボ核酸(dsRNA)または低分子ヘアピン型RNA(shRNA))および短鎖干渉DNA/RNA(siD/R−NA、例えばDNAとRNAとの二本鎖キメラ(dsD/R−NA)またはDNAとRNAとの低分子ヘアピンキメラ(shD/R−NA))を含む。
[1]互いにハイブリダイズすることで二本鎖分子を形成するセンス鎖と該センス鎖に相補的なアンチセンス鎖とから構成され、かつ細胞に導入された場合にZNF224のインビボ発現および細胞増殖を阻害する、単離された二本鎖分子;
[2]SEQ ID NO:57(SEQ ID NO:48の494〜510位);およびSEQ ID NO:58(SEQ ID NO:48の576〜592位)の中から選択される標的配列に一致するmRNAに対して作用する、[1]に記載の二本鎖分子;
[3]センス鎖が、SEQ ID NO:57および58の中から選択される標的配列に対応する配列を含有している、[2]に記載の二本鎖分子;
[4]約100ヌクレオチド長未満である、[3]に記載の二本鎖分子;
[5]約75ヌクレオチド長未満である、[4]に記載の二本鎖分子;
[6]約50ヌクレオチド長未満である、[5]に記載の二本鎖分子;
[7]約25ヌクレオチド長未満である、[6]に記載の二本鎖分子;
[8]約19〜約25ヌクレオチド長である、[7]に記載の二本鎖分子;
[9]センス鎖が、SEQ ID NO:9および10の中から選択される配列に対応する配列からなる、[7]に記載の二本鎖分子;
[10]介在一本鎖により連結されたセンス鎖およびアンチセンス鎖の両方を有する単一のポリヌクレオチドから構成される、[1]に記載の二本鎖分子;
[11]一般式5’−[A]−[B]−[A’]−3’ を有する二本鎖分子であって、式中、[A]はSEQ ID NO:57および58の中から選択される標的配列に対応する配列を含有しているセンス鎖であり、[B]は3〜23個のヌクレオチドから構成される介在一本鎖であり、かつ[A’]は[A]に相補的な配列を含有しているアンチセンス鎖である、[10]に記載の二本鎖分子;
[12][A]が、SEQ ID NO:9および10の中から選択される配列に対応する配列からなる、[11]に記載の二本鎖分子;
[13]RNAから構成される、[1]に記載の二本鎖分子;
[14]DNAおよびRNAの両方から構成される、[1]に記載の二本鎖分子;
[15]DNAポリヌクレオチドとRNAポリヌクレオチドとのハイブリッドである、[14]に記載の二本鎖分子;
[16]センス鎖およびアンチセンス鎖がそれぞれDNAおよびRNAから構成される、[15]に記載の二本鎖分子;
[17]DNAとRNAとのキメラである、[14]に記載の二本鎖分子;
[18]アンチセンス鎖の3’末端に隣接する領域、またはセンス鎖の5'末端に隣接する領域およびアンチセンス鎖の3’末端に隣接する領域の両方がRNAである、[17]に記載の二本鎖分子;
[19]隣接領域が9個〜13個のヌクレオチドから構成される、[18]に記載の二本鎖分子;ならびに
[20]3’オーバーハングを含有する、[1]に記載の二本鎖分子。
1. 転写産物のAUG開始コドンから始めて、AAジヌクレオチド配列について下流を探索する。潜在的なsiRNA標的部位として、それぞれのAAの存在とその3’側に隣接した19個のヌクレオチドとを記録する。Tuschl et al.は、5’および3’非翻訳領域(UTR)および開始コドン近くの領域(75塩基以内)に対してsiRNAを設計することを避けることを推奨している。これは、これらの領域に調節タンパク質結合部位がより多く存在する可能性があり、UTR結合タンパク質および/または翻訳開始複合体が、siRNAエンドヌクレアーゼ複合体の結合に干渉する可能性があるためである。
2. 潜在的な標的部位と、適当なゲノムデータベース(ヒト、マウス、ラット等)とを比較し、他のコード配列との相同性が大きい任意の標的配列を考慮から外す。基本的には、www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/でのNCBIサーバーにあるBLASTを用いる(Altschul SF et al., Nucleic Acids Res 1997 Sep 1, 25(17):3389-402)。
3. 合成のために適格である標的配列を選択する。評価するために、遺伝子の長さに沿って標的配列を幾つか選択するのが一般的である。
ZNF224遺伝子に関して、SEQ ID NO:57および58。
ZNF224遺伝子に関して、
SEQ ID NO:57(SEQ ID NO:48の494〜510位)、および
SEQ ID NO:58(SEQ ID NO:48の576〜592位)。
センス鎖:5’−[−−−DNA−−−]−3’
3’−(RNA)−[DNA]−5’:アンチセンス鎖、
センス鎖:5’−(RNA)−[DNA]−3’
3’−(RNA)−[DNA]−5’:アンチセンス鎖、および
センス鎖:5’−(RNA)−[DNA]−3’
3’−(−−−RNA−−−)−5’:アンチセンス鎖。
CCC、CCACC、またはCCACACC:Jacque JM et al., Nature 2002 Jul 25, 418(6896): 435- 8, Epub 2002 Jun 26;
UUCG:Lee NS et al., Nat Biotechnol 2002 May, 20(5): 500-5、Fruscoloni P et al., Proc Natl Acad Sci USA 2003 Feb 18, 100(4): 1639-44, Epub 2003 Feb 10;および
UUCAAGAGA:Dykxhoorn DM et al., Nat Rev Mol Cell Biol 2003 Jun, 4(6): 457-67。
GAUUUGGAUGAUGAAGA−[B]−UCUUCAUCAUCCAAAUC(標的配列SEQ ID NO:57用);
GCAGGAACACAUCAAGA−[B]−UCUUGAUGUGUUCCUGC(標的配列SEQ ID NO:58用);
CCGAUUUGGAUGAUGAAGA−[B]−UCUUCAUCAUCCAAAUCGG(SEQ ID NO:9用);
CCGCAGGAACACAUCAAGA−[B]−UCUUGAUGUGUUCCUGCGG(SEQ ID NO:10用)
本明細書に記載の二本鎖分子を1つまたは複数含有するベクター、および該ベクターを含有する細胞も本発明に包含される。
[1]互いにハイブリダイズすることで二本鎖分子を形成するセンス鎖とセンス鎖に相補的なアンチセンス鎖とから構成され、細胞に導入された場合にZNF224のインビボ発現および細胞増殖を阻害する二本鎖分子をコードするベクター;
[2]SEQ ID NO:57(SEQ ID NO:48の494〜510位)、およびSEQ ID NO:58(SEQ ID NO:48の576〜592位)の中から選択される標的配列に一致するmRNAに対して作用する二本鎖分子をコードする、[1]に記載のベクター;
[3]センス鎖が、SEQ ID NO:57および58の中から選択される標的配列に対応する配列を含有している、[1]に記載のベクター;
[4]約100ヌクレオチド長未満である二本鎖分子をコードする[3]に記載のベクター;
[5]約75ヌクレオチド長未満である二本鎖分子をコードする[4]に記載のベクター;
[6]約50ヌクレオチド長未満である二本鎖分子をコードする[5]に記載のベクター;
[7]約25ヌクレオチド長未満である二本鎖分子をコードする[6]に記載のベクター;
[8]約19〜約25ヌクレオチド長である二本鎖分子をコードする[7]に記載のベクター;
[9]センス鎖が、SEQ ID NO:9および10の中から選択される配列に対応する配列からなる、[1]に記載のベクター;
[10]二本鎖分子が、介在一本鎖により連結されたセンス鎖およびアンチセンス鎖の両方を有する単一のポリヌクレオチドから構成される、[1]に記載のベクター;ならびに
[11]一般式5’−[A]−[B]−[A’]−3’を有する二本鎖分子をコードするベクターであって、式中、[A]はSEQ ID NO:57および58の中から選択される標的配列に対応する配列を含有しているセンス鎖であり、[B]は3〜23個のヌクレオチドから構成される介在一本鎖であり、かつ[A’]は[A]に相補的な配列を含有しているアンチセンス鎖である、[10]に記載のベクター。
[12][A]が、SEQ ID NO:9および10の中から選択される配列に対応する配列からなる、[11]に記載のベクター。
特定のsiRNAの、がんを阻害する能力は、参照として本明細書に組み入れられるWO2006/085684において以前に説明されている。本発明において、ZNF224についての2つの異なるdsRNAを、細胞増殖を阻害する能力について試験した。がん細胞株における遺伝子の発現を効果的にノックダウンした、ZNF224についての2つのdsRNAは、細胞増殖の抑制と一致した(図2)。
[1]互いにハイブリダイズすることで二本鎖分子を形成するセンス鎖とこれに相補的なアンチセンス鎖とから構成され、かつZNF224遺伝子を過剰発現している細胞におけるZNF224発現および細胞増殖を阻害する単離された二本鎖分子を、少なくとも1つ、投与する工程を含む、がん細胞の増殖を阻害してがんを治療するための方法であって、該がん細胞またはがんがZNF224遺伝子を発現している、方法;
[2]二本鎖分子が、SEQ ID NO:57(SEQ ID NO:48の494〜510位)、およびSEQ ID NO:58(SEQ ID NO:48の576〜592位)の中から選択される標的配列に一致するmRNAにおいて作用する、[1]に記載の方法;
[3]センス鎖が、SEQ ID NO:57および58の中から選択される標的配列に対応する配列を含有している、[2]に記載の方法;
[4]治療されるがんが膀胱癌である、[1]に記載の方法;
[5]複数種の二本鎖分子が投与される、[1]に記載の方法;
[6]二本鎖分子が約100ヌクレオチド長未満である、[3]に記載の方法;
[7]二本鎖分子が約75ヌクレオチド長未満である、[6]に記載の方法;
[8]二本鎖分子が約50ヌクレオチド長未満である、[7]に記載の方法;
[9]二本鎖分子が約25ヌクレオチド長未満である、[8]に記載の方法;
[10]二本鎖分子が約19〜約25ヌクレオチド長である、[9]に記載の方法;
[11]センス鎖が、SEQ ID NO:9および10の中から選択される配列に対応する配列からなる、[10]に記載の方法;
[12]二本鎖分子が、介在一本鎖により連結されたセンス鎖およびアンチセンス鎖の両方を含有している単一のポリヌクレオチドから構成される、[10]に記載の方法;
[13]二本鎖分子が、一般式5’−[A]−[B]−[A’]−3’を有する方法であって、式中、[A]はSEQ ID NO:9および10の中から選択される標的配列に対応する配列を含有しているセンス鎖であり、[B]は3〜23個のヌクレオチドから構成される介在一本鎖であり、かつ[A’]は[A]に相補的な配列を含有しているアンチセンス鎖である、[12]に記載の方法;
[14][A]が、SEQ ID NO:9および10の中から選択される配列に対応する配列からなる、[13]に記載の方法;
[15]二本鎖分子がRNAである、[1]に記載の方法;
[16]二本鎖分子がDNAおよびRNAの両方を含有している、[1]に記載の方法;
[17]二本鎖分子がDNAポリヌクレオチドとRNAポリヌクレオチドとのハイブリッドである、[16]に記載の方法;
[18]センス鎖ポリヌクレオチドおよびアンチセンス鎖ポリヌクレオチドが、それぞれDNAおよびRNAから構成される、[17]に記載の方法;
[19]二本鎖分子がDNAおよびRNAのキメラである、[16]に記載の方法;
[20]アンチセンス鎖の3’末端に隣接する領域、またはセンス鎖の5’末端に隣接する領域およびアンチセンス鎖の3’末端に隣接する領域の両方が、RNAから構成される、[19]に記載の方法;
[21]隣接領域が9〜13個のヌクレオチドから構成される、[20]に記載の方法;
[22]二本鎖分子が3’オーバーハングを含有している、[1]に記載の方法;
[23]二本鎖分子が、該分子に加えて、トランスフェクション増強剤および薬学的に許容可能な担体を含む組成物に含有されている、[1]に記載の方法;
[24]二本鎖分子がベクターによりコードされる、[1]に記載の方法;
[25]ベクターによりコードされる二本鎖分子が、SEQ ID NO:57(SEQ ID NO:48の455〜485位)、およびSEQ ID NO:58(SEQ ID NO:48の576〜592位)の中から選択される標的配列に一致するmRNAにおいて作用する、[24]に記載の方法;
[26]ベクターによりコードされる二本鎖分子のセンス鎖が、SEQ ID NO:57および58の中から選択される標的配列に対応する配列を含有している、[25]に記載の方法;
[27]治療されるがんが膀胱癌である、[24]に記載の方法;
[28]複数種の二本鎖分子が投与される、[24]に記載の方法;
[29]ベクターによりコードされる二本鎖分子が約100ヌクレオチド長未満である、[26]に記載の方法;
[30]ベクターによりコードされる二本鎖分子が約75ヌクレオチド長未満である、[29]に記載の方法;
[31]ベクターによりコードされる二本鎖分子が約50ヌクレオチド長未満である、[30]に記載の方法;
[32]ベクターによりコードされる二本鎖分子が約25ヌクレオチド長未満である、[31]に記載の方法;
[33]ベクターによりコードされる二本鎖分子が約19〜約25ヌクレオチド長である、[32]に記載の方法;
[34]センス鎖が、SEQ ID NO:9および10の中から選択される配列に対応する配列からなる、[33]に記載の方法;
[35]ベクターによりコードされる二本鎖分子が、介在一本鎖により連結されたセンス鎖およびアンチセンス鎖の両方を含有している単一のポリヌクレオチドから構成される、[24]に記載の方法;
[36]ベクターによりコードされる二本鎖分子が、一般式5’−[A]−[B]−[A’]−3’を有する方法であって、式中、[A]はSEQ ID NO:9および10の中から選択される標的配列に対応する配列を含有しているセンス鎖であり、[B]は3〜23個のヌクレオチドから構成される介在一本鎖であり、かつ[A’]は[A]に相補的な配列を含有しているアンチセンス鎖である、[35]に記載の方法;
[37][A]が、SEQ ID NO:9および10の中から選択される配列に対応する配列からなる、[36]に記載の方法;ならびに
[38]ベクターによりコードされる二本鎖分子が、該分子に加えて、トランスフェクション増強剤および薬学的に許容可能な担体を含む組成物に含有されている、[24]に記載の方法。
上記に加えて、本発明は、本二本鎖分子または該分子をコードするベクターのうちの少なくとも1つを含む医薬組成物も提供する。具体的には、本発明は以下の[1]〜[38]の組成物を提供する:
[1]ZNF224遺伝子の発現および細胞増殖を阻害する少なくとも1つの単離された二本鎖分子を含む、がん細胞の増殖を阻害してがんを治療するための組成物であって、該がんおよびがん細胞がZNF224遺伝子を発現し、さらに該分子が、互いにハイブリダイズすることで二本鎖分子を形成するセンス鎖とこれに相補的なアンチセンス鎖とから構成される、組成物;
[2]二本鎖分子が、SEQ ID NO:57(SEQ ID NO:48の494〜510位)、およびSEQ ID NO:58(SEQ ID NO:48の576〜592位)の中から選択される標的配列に一致するmRNAにおいて作用する、[1]に記載の組成物;
[3]二本鎖分子、センス鎖が、SEQ ID NO:57および58の中から選択される標的配列に対応する配列を含有している、[2]に記載の組成物;
[4]治療されるがんが膀胱癌である、[1]に記載の組成物;
[5]複数種の二本鎖分子を含有している、[1]に記載の組成物;
[6]二本鎖分子が約100ヌクレオチド長未満である、[3]に記載の組成物;
[7]二本鎖分子が約75ヌクレオチド長未満である、[6]に記載の組成物;
[8]二本鎖分子が約50ヌクレオチド長未満である、[7]に記載の組成物;
[9]二本鎖分子が約25ヌクレオチド長未満である、[8]に記載の組成物;
[10]二本鎖分子が約19〜約25ヌクレオチド長である、[9]に記載の組成物;
[11]二本鎖分子が、介在一本鎖により連結されたセンス鎖およびアンチセンス鎖を含有している単一のポリヌクレオチドから構成される、[1]に記載の組成物;
[12]センス鎖が、SEQ ID NO:9および10の中から選択される配列に対応する配列からなる、[11]に記載の方法;
[13]二本鎖分子が、一般式5’−[A]−[B]−[A’]−3’を有する組成物であって、式中、[A]はSEQ ID NO:9および10の中から選択される標的配列に対応する配列を含有しているセンス鎖配列であり、[B]は3〜23個のヌクレオチドからなる介在一本鎖であり、かつ[A’]は[A]に相補的な配列を含有しているアンチセンス鎖である、[12]に記載の組成物;
[14][A]が、SEQ ID NO:9および10の中から選択される配列に対応する配列からなる、[13]に記載の方法;
[15]二本鎖分子がRNAである、[1]に記載の組成物;
[16]二本鎖分子がDNAおよび/またはRNAである、[1]に記載の組成物;
[17]二本鎖分子がDNAポリヌクレオチドとRNAポリヌクレオチドとのハイブリッドである、[16]に記載の組成物;
[18]センス鎖ポリヌクレオチドおよびアンチセンス鎖ポリヌクレオチドが、それぞれDNAおよびRNAから構成される、[17]に記載の組成物;
[19]二本鎖分子がDNAおよびRNAのキメラである、[16]に記載の組成物;
[20]アンチセンス鎖の3’末端に隣接する領域、またはセンス鎖の5’末端に隣接する領域およびアンチセンス鎖の3’末端に隣接する領域の両方が、RNAから構成される、[19]に記載の組成物;
[21]隣接領域が9〜13個のヌクレオチドから構成される、[20]に記載の組成物;
[22]二本鎖分子が3’オーバーハングを含有している、[1]に記載の組成物;
[23]トランスフェクション増強剤および薬学的に許容可能な担体を含む、[1]に記載の組成物;
[24]二本鎖分子がベクターによりコードされ、かつ組成物に含有されている、[1]に記載の組成物;
[25]ベクターによりコードされる二本鎖分子が、SEQ ID NO:57(SEQ ID NO:48の494〜510位)、およびSEQ ID NO:58(SEQ ID NO:48の576〜592位)の中から選択される標的配列に一致するmRNAにおいて作用する、[24]に記載の組成物;
[26]ベクターによりコードされる二本鎖分子のセンス鎖が、SEQ ID NO:57および58の中から選択される標的配列に対応する配列を含有している、[25]に記載の組成物;
[27]治療されるがんが膀胱癌である、[24]に記載の組成物;
[28]複数種の二本鎖分子が投与される、[24]に記載の組成物;
[29]ベクターによりコードされる二本鎖分子が約100ヌクレオチド長未満である、[26]に記載の組成物;
[30]ベクターによりコードされる二本鎖分子が約75ヌクレオチド長未満である、[29]に記載の組成物;
[31]ベクターによりコードされる二本鎖分子が約50ヌクレオチド長未満である、[30]に記載の組成物;
[32]ベクターによりコードされる二本鎖分子が約25ヌクレオチド長未満である、[31]に記載の組成物;
[33]ベクターによりコードされる二本鎖分子が約19〜約25ヌクレオチド長である、[32]に記載の組成物;
[34]センス鎖が、SEQ ID NO:9および10の中から選択される配列に対応する配列からなる、[33]に記載の方法;
[35]ベクターによりコードされる二本鎖分子が、介在一本鎖により連結されたセンス鎖およびアンチセンス鎖の両方を含有している単一のポリヌクレオチドから構成される、[24]に記載の組成物;
[36]二本鎖分子が、一般式5’−[A]−[B]−[A’]−3’を有する組成物であって、式中、[A]はSEQ ID NO:9および10の中から選択される標的配列に対応する配列を含有しているセンス鎖であり、[B]は3〜23個のヌクレオチドから構成される介在一本鎖であり、かつ[A’]は[A]に相補的な配列を含有しているアンチセンス鎖である、[24]に記載の組成物;
[37][A]が、SEQ ID NO:9および10の中から選択される配列に対応する配列からなる、[36]に記載の方法;ならびに
[38]トランスフェクション増強剤および薬学的に許容可能な担体を含む、[24]に記載の組成物。
1.膀胱癌細胞株および組織試料
ヒト膀胱癌細胞株UM−UC−3およびJ82は、アメリカンタイプカルチャーコレクション(ATCC;Rockville, MD)から購入した。全ての膀胱癌細胞株およびCOS−7細胞は、以前に記載されたような適切な培地で単層で培養した(Takata R,et al., Semin Oncol 1999 Suppl 2:117-22)。外科的に切除された侵潤性膀胱癌または表在性膀胱癌からの組織試料、ならびにそれらの対応する臨床的情報は、書面によるインフォームドコンセントをとった上で、高知大学医学部(Kochi Medical School)、京都府立医科大学(Kyoto Prefectural University of Medicine)、名古屋市立大学大学院医学研究科(Nagoya City University Graduate School of Medical Sciences)、金沢大学大学院医学系研究科(Kanazawa University Graduate School of Medical Sciences)、および岩手医科大学(Iwate Medical University)の5つの病院から入手した。
膀胱癌細胞株UM−UC−3からの細胞抽出物を、プロテイナーゼ阻害剤の存在下で、1mLの最終量の免疫沈降緩衝液(0.5%のNP−40、50mMのトリス−HCl、150mMのNaCl)中で、100μLのプロテインG−アガロースビーズと共に4℃で1時間インキュベートすることにより予め浄化(preclear)した。80g、4℃での5分間の遠心分離の後、上清を、抗DEPDC1ポリクローナル抗体またはノーマルウサギIgGと共に4℃で2時間インキュベートした。次いで、ビーズを、2000gで2分間の遠心分離により収集し、各1mLの免疫沈降緩衝液で5回洗浄した。洗浄されたビーズを、50μLのレムリ(Laemmli)試料緩衝液に再懸濁し、5分間煮沸し、タンパク質を5〜20%SDSポリアクリルアミドゲル電気泳動(PAGE)ゲル(Bio−Rad,Hercules,CA)で分離した。電気泳動後、ゲルを銀染色した。抗DEPDC1ポリクローナル抗体により免疫沈降した抽出物に特異的に見出されたタンパク質バンドを切り出し、マトリックス支援レーザ脱離/イオン化飛行時間型質量分析(MALDI−TOF−MS)(AXIMA−CFR plus(SHIMADZU BIOTECH))に使用した。
膀胱癌細胞のマイクロダイセクションを、以前に記載されたようにして実施した(Takata R,et al., Semin Oncol 1999 Suppl 2:117-22)。本発明者らは、培養細胞ならびにマイクロダイセクションした膀胱臨床試料および正常ヒト膀胱上皮細胞の各々から、RNeasy Micro Kit(Qiagen, Valencia, CA)を使用して抽出された全RNA、ならびに心臓、肺、肝臓、腎臓、および膀胱から単離されたポリA(+)RNA(タカラクロンテック(Takara Clontech)、京都、日本)を調製した。その後、T7に基づく増幅および逆転写を、以前に記載されたようにして実施した(Takata R, et al., Semin Oncol 1999 Suppl 2:117-22)。定量対照としてグリセルアルデヒド3−リン酸デヒドロゲナーゼ(GAPDH)の量をモニタリングすることにより、その後のPCRのための各一本鎖cDNAの適切な希釈物を調製した。各プライマーセットの配列は以下の通りであった;
ZNF224:5’−GAGCAGCATGGGAAGAACAT−3’(SEQ ID NO:1)および
5’−TGAGGCCTGACTAAAGCACA−3’(SEQ ID NO:2);
GAPDH:5’−CGACCACTTTGTCAAGCTCA−3’ (SEQ ID NO:3)および
5’−GGTTGAGCACAGGGTACTTTATT−3’(SEQ ID NO:4);
DEPDC1:5’−GCTACAAGTAAAGAGGGGATGG−3’(SEQ ID NO:59)および
5’−GGACAGAAAGGTAAGTCAGTGGG−3’(SEQ ID NO:60);
IkB−alpha;5’−TATATCCACACTGCACACTGC−3’(SEQ ID NO:61)および
5’−CCATTTACAGGAGGGTAACAC−3’(SEQ ID NO:62)。
ZNF224のオープンリーディングフレーム配列に対応するcDNA、およびDEPDC1のコーディング配列の一部を、以下のようなプライマーと共にKOD−Plus DNAポリメラーゼ(東洋紡、大阪、日本)を使用したPCRにより入手した。
ZNF224−フォワード:5’−GGAAAGCGGCCGCATGACCACGTTCAA−3’(SEQ ID NO:5)、
ZNF224−リバース:5’−GCCGCTCGAGAGGTTTTTCTCCAACATGAA−3’(SEQ ID NO:6)、
DEPDC11−147−フォワード:5’−ATTCGCGGCCGCGGATGGAGAGTCAGGGTGTG−3’(SEQ ID NO:63)、
DEPDC11−147−リバース:5’−CCCGCTCGAGAGTTCTACGAGATAAGTTTCG−3’(SEQ ID NO:64)、
DEPDC11−300−フォワード:5’−ATTCGCGGCCGCGGATGGAGAGTCAGGGTGTG−3’(SEQ ID NO:65)、
DEPDC11−300−リバース:5’−CCCGCTCGAGTACAAATAATTCGTAATATTC−3’(SEQ ID NO:66)、
DEPDC1177−597−フォワード:5’−ATTCGCGGCCGCTTGATAATAGAGAACTAAGCCA−3’(SEQ ID NO:67)、
DEPDC1177−597−リバース:5’−CCCGCTCGAGAACCCTCTCTAAATGAGGTTG−3’(SEQ ID NO:68)、
DEPDC1300−669−フォワード:5’−ATTCGCGGCCGCACCATGGTAAACATTTTGGTTGTTTGTG−3’(SEQ ID NO:69)、
DEPDC1300−669−リバース:5’−CCCGCTCGAGTCCAGCAAGAAGCTCATC−3’(SEQ ID NO:70)、
DEPDC1587−740−フォワード:5’−ATTCGCGGCCGCACCATGCAAAGCTTGCTGCAACCTCA −3’(SEQ ID NO:71)、
DEPDC1587−740−リバース:5’−CCCGCTCGAGAGCTTGAGAGGTAGAAAC−3’(SEQ ID NO:72)、
DEPDC1654−811−フォワード:5’−ATTCGCGGCCGCACCATGTCTTACTTACAGACTGCAGTG−3’(SEQ ID NO:73)、
DEPDC1654−811−リバース:5’−CCCGCTCGAGTCTTAGACTACGGAACTTTG−3’(SEQ ID NO:74)。
フォワードプライマーの下線はNotI部位を示し、リバースプライマーの下線はXhoI部位を示す。
UM−UC−3細胞を、1ウェル当たり1×105細胞で播いた(Lab−tek II chamber slide(Nalgen Nunc, International, Naperville, IL))。24時間後、細胞を、Flagタグ付きZNF224により一過性にトランスフェクトした。トランスフェクションの48時間後、細胞を4%パラホルムアルデヒドを含有しているPBS(−)で固定し、次いで、室温で2分間、0.1%トリトンX−100を含有しているPBS(−)で透過性化した。その後、非特異的なハイブリダイゼーションをブロッキングするために、4℃で12時間、PBS(−)中3%BSAで細胞を覆った。次いで、ブロッキング溶液で100倍希釈された、アフィニティ精製された抗DEPDC1ポリクローナル抗体または抗ZNF224ポリクローナル抗体と共に、細胞をインキュベートした。PBS(−)で洗浄した後、1000倍希釈のAlexa488結合型抗ウサギ二次抗体およびAlexa597結合型抗ウサギ二次抗体(Molecular Probe, Eugene, OR)により、細胞を染色した。核を、4’,6’−ジアミジン−2’−フェニルインドール二塩酸塩(DAPI)で対比染色した。蛍光画像を、TCS SP2 AOBS顕微鏡(ライカ、東京、日本)下で入手した。
哺乳動物細胞において低分子干渉RNA(siRNA)を発現するよう設計された、ベクターに基づくRNA干渉(RNAi)システム、psiU6BX3.0は、以前に確立されている(Shimokawa T,et al., Cancer Res 2003 63:6116-20)。二本鎖オリゴヌクレオチドをpsiU6BXベクターのBbsI部位へクローニングすることにより、ZNF224に対するsiRNAを発現するよう設計されたプラスミドを調製した。RNAiの合成オリゴヌクレオチドの標的配列は以下の通りであった:
対照としての、
EGFP(高感度緑色蛍光タンパク質遺伝子、オワンクラゲ(Aequorea Victoria)緑色蛍光タンパク質の変異体):
5’−GAAGCAGCACGACTTCTTC−3’(SEQ ID NO:7);
SCR(5S rRNAおよび16S rRNAをコードするユーグレナ・グラシリス(Euglena gracilis)葉緑体遺伝子):
5’−GCGCGCTTTGTAGGATTCG−3’(SEQ ID NO:8);
ZNF224に特異的な配列に対する、
si−ZNF224#1:5’−CCGATTTGGATGATGAAGA−3’(SEQ ID NO:9);
si−ZNF224#2:5’−CCGCAGGAACACATCAAGA−3’(SEQ ID NO:10)。
全ての構築物のDNA配列は、DNA配列決定により確認した。各8μgのsiRNA発現ベクターを、供給元の推奨に従い、FuGENE6トランスフェクション試薬(Roche)を使用して、UM−UC−3細胞へそれぞれトランスフェクトした(10cmディッシュ1枚当たり1×106細胞)。特異的なプライマー(以下を参照されたい)を用いた半定量的RT−PCRによりsiRNAのノックダウン効果を評価するために、ネオマイシン(ジェネテシン、Invitrogen)と共に4日間インキュベートした後、トランスフェクトされた細胞から全RNAを抽出した。RT−PCRのための特異的なプライマーセットは以下の通りである;
ZNF224については、
5’−GAGCAGCATGGGAAGAACAT−3’(SEQ ID NO:11)および
5’−TGAGGCCTGACTAAAGCACA−3’(SEQ ID NO:12);ならびに
定量対照としてのGAPDHについては、
5’−CGACCACTTTGTCAAGCTCA−3’(SEQ ID NO:13)および
5’−GGTTGAGCACAGGGTACTTTATT−3’(SEQ ID NO:14)。
トランスフェクトされたUM−UC−3細胞を、1.0mg/mlのネオマイシンの存在下で21日間または14日間培養し、コロニーの数をギムザ染色により計数した。ネオマイシン処理の14日後、製造業者の推奨に従い、Cell Counting Kit−8(和光純薬工業、大阪、日本)を用いて、3−(4,5−ジメチルチアゾール−2−イル)−2,5−ジフェニルテトラゾリウムブロミド(MTT)アッセイにより、UM−UC−3細胞の生存能を評価した。570nm波長での吸光度を、マイクロプレートリーダー550(Bio−Rad, Hercules, CA)で測定した。これらの実験は3回実施した。
UM−UC−3細胞を、DEPDC1に対するsiRNA(si−DEPDC1)、ZNF224に対するsiRNA(si−ZNF224−2)、またはEGFPに対するsiRNA(対照siRNA)によりトランスフェクトした。DEPDC1に対するsiRNAの合成オリゴ二重鎖(Sigma Aldrich)の標的配列は、以下の通りであった:
5’−CCAAAGUUCCGUAGUCUAA−3’(SEQ ID NO:75)、
ZNF224に対するもの(si−ZNF224−2)、またはEGFPに対するものは、「RNA干渉アッセイ」セクションに記載された通り。
DLG1、
5’−ATGGTGAGAGCGATGAGGTC−3’(SEQ ID NO:15)および
5’− AATCGGGCTCGTTCTTTCTT−3’(SEQ ID NO:16);
A20、
5’−TGCACACTGTGTTTCATCGAG−3’(SEQ ID NO:76)および
5’−ACGCTGTGGGACTGACTTTC−3’(SEQ ID NO:77 );
β2−MG(対照)、
5’−TCTCTCTTTCTGGCCTGGAG−3’(SEQ ID NO:17)および
5’−AATGTCGGATGGATGAAACC−3’(SEQ ID NO:18)。
DLG1プロモーターの断片(−1211〜+19位)を、以下のプライマー:
5’−GATCACGCGTCACCGTTTGACCCTTCTATC−3’(SEQ ID NO:19)(下線はMluI部位を示す)および
5’−GATCCTCGAGCAGCAGTGCCGTTTCCAACT−3’(SEQ ID NO:20)(下線はXhoI部位を示す)
を使用したPCRにより増幅し、pGL3−エンハンサールシフェラーゼレポーターベクター(Promega, Madison, WI)へクローニングした。FuGENE6試薬(Roche)を使用して、1.6μgのpRL−TKプロモーターベクターと組み合わせた、1.6μgのpGL3−エンハンサー−DLG1ベクターまたはモックベクターのいずれかにより、Cos7細胞をコトランスフェクトした。トランスフェクションの48時間後、細胞をPBS(−)で濯ぎ、passive lysis buffer(Promega)により溶解した。特異的な基質に関するホタルルシフェラーゼ活性およびウミシイタケルシフェラーゼ活性の連続的な測定に依るDual Luciferaseアッセイシステム(Promega)において、直接、溶解物を使用した。ルシフェラーゼ活性の定量化および相対比の計算は、Dual−Lightキット(Tropix, Bedford, MA)を用いて手動で実施した。
A20プロモーターの断片(−330〜−35位)を、以下のプライマー:
5’−GATCACGCGTAGCCCGACCCAGAGAGTCACGT−3’(SEQ ID NO:78)(下線はMluI部位を示す)および
5’−GATCCTCGAGCTTTCGCAAAGTCCCAAGTC−3’(SEQ ID NO:79)(下線はXhoI部位を示す)
を使用したPCRにより増幅し、pGL3−エンハンサールシフェラーゼレポーターベクター(Promega, Madison, WI)へクローニングした。ヒト皮膚線維芽細胞Nucleofectorキット(Lonza, NJ, USA)を使用して、0.5μgのpRL−TK−プロモーターベクターと組み合わせた、1μgのpGL3−エンハンサー−A20プロモーターまたはモックベクターのいずれかにより、NHDF細胞をコトランスフェクトした。24時間後、Dual−Luciferaseレポーターアッセイキット(東洋インキ、東京、日本)を使用して、ルシフェラーゼ活性を測定した。ウミシイタケ発現プラスミドを、トランスフェクション効率を標準化するために使用した。ルシフェラーゼ活性の定量化および相対比の計算は、ルミノメーター(EG&G Berthold, Bad Wildbad, Germany)を用いて自動的に実施した。これらの実験は3回実施した。
膀胱癌細胞におけるDEPDC1とZNF224との間の相互作用を確認し、DEPDC1におけるZNF224結合領域を同定するために、免疫沈降実験を以下のように実施した。まず、免疫沈降のために抗DEPDC1ポリクローナル抗体を使用し、イムノブロッティングのために抗FLAGM2抗体(Amersham)を使用した免疫沈降実験により、内在性DEPDC1と外来ZNF224との間の相互作用を確認した。さらにDEPDC1におけるZNF224結合領域を決定するために、DEPDC1の6種の部分構築物(DEPDC11−147、DEPDC1141−300、DEPDC1177−597、DEPDC1300−669、DEPDC1587−740、およびDEPDC1654−811)を、COOH末端HAタグ付きpCAGGSベクターの適切な部位へクローニングした。各クローンのヌクレオチド配列は、各プライマーを使用して、ABI Prism 3700 DNAシーケンサー(Applied Biosystems, Foster City, CA)により決定した。これらの6種のDEPDC1の部分セグメントのうちの1つを発現する各プラスミドによりトランスフェクトされたCos7細胞株からの細胞抽出物を、プロテイナーゼ阻害剤の存在下で、2mLの最終量の免疫沈降緩衝液(0.5%NP40、50mmol/Lトリス−HCl、150mmol/L NaCl)中で100μlのプロテインG−アガロースビーズと共に4℃で1時間インキュベートすることにより予め浄化した。1,000rpm、4℃での5分間の遠心分離の後、上清を抗HAラットと共に4℃で1時間インキュベートした。5,000rpmでの2分間の遠心分離により各試料からビーズを収集し、免疫沈降緩衝液1mLにより6回洗浄した後、洗浄したビーズを50uLのレムリ試料緩衝液に再懸濁し、3分間煮沸した後、タンパク質を10%SDS−PAGEゲル上で分離した。それぞれ、抗HAラット抗体および抗FLAGM2モノクローナル抗体(Sigma−Aldrich Co., St. Louis, MO)を使用して、イムノブロットを行った。
DEPDC1における2つの最小ZNF224結合ドメイン(コドン148〜176(第1領域)およびコドン598〜653(第2領域);図4Aを参照されたい)に由来する18アミノ酸配列を、そのNH2末端で、膜伝達11ポリアルギニン配列(11R)に共有結合的に連結した。コドン148〜176の領域(第1領域):
DEPDC1148−166、
RRRRRRRRRRR−GGG−PKRHGLHLSQENGEKIKHE(SEQ ID NO:21);
DEPDC1159−176、
RRRRRRRRRRR−GGG−NGEKIKHEIINEDQENAI(SEQ ID NO:22)、
およびコドン598〜653の領域(第2領域):
DEPDC1598−615、
RRRRRRRRRRR−GGG−AIDALQLCCLLLPPPNRR(SEQ ID NO:23);
DEPDC1611−628、
RRRRRRRRRRR−GGG−PPNRRKLQLLMRMISRMS(SEQ ID NO:24);
DEPDC1624−641、
RRRRRRRRRRR−GGG−ISRMSQNVDMPKLHDAMG(SEQ ID NO:25);
DEPDC1636−653、
RRRRRRRRRRR−GGG−LHDAMGTRSLMIHTFSRC(SEQ ID NO:26)
をカバーする4種のドミナントネガティブペプチドを合成した。最も有効なDEPDC1611−639ペプチドに由来するスクランブルペプチドを対照として合成した:
スクランブル611−628、
RRRRRRRRRRR−GGG−LRMSRLSPNMIMQRPKRL (SEQ ID NO:27)。
ペプチドを調製用逆相高速液体クロマトグラフィにより精製し、>90%の純度とした。
膀胱癌(UM−UC−3)および正常ヒト細胞株(HEK293、HMEC、SAEC、およびNHDF−Ad)における内在性DEPDC1タンパク質および内在性ZNF224タンパク質の発現を検出するために、これらの細胞の各々を、0.1%のプロテアーゼインヒビターカクテルIII(Calbiochem, San Diego, CA)を含む溶解緩衝液(50mMトリス−HCL(pH8.0)/150mM NaCL/0.5%NP−40)中でインキュベートした。全タンパク質の量をタンパク質アッセイキット(Bio−Rad, Hercules, CA)により推定し、次いで、タンパク質をSDS試料緩衝液と混合し、3分間煮沸した後、10%SDS−PAGEゲルへ負荷した。電気泳動後、タンパク質を、ニトロセルロース膜(GE Healthcare, Buckinghamshire, United Kingdom)にブロットした。4%のBlockAce(大日本製薬、大阪、日本)によるブロッキングの後、内在性DEPDC1タンパク質または内在性ZEF224タンパク質の検出のため、それぞれ、抗DEP11DC1ポリクローナル抗体または抗ZNF224ポリクローナル抗体(Abcam)と共に膜をインキュベートした。最後に、膜をHRP結合型二次抗体と共にインキュベートし、バンドをECL検出試薬(GE Healthcare)により可視化した。βアクチン(ACTB)を負荷対照として使用した。細胞透過性ペプチド(下記参照)による処理後の内在性A20タンパク質および内在性IkB−αタンパク質の発現を検出するためには、抗A20(TNFAIP3)モノクローナル抗体(50倍希釈)(59A426;Abcam)および抗IkBαモノクローナル抗体(100倍希釈)(C−15;BD Biosciences, San Jose, CA, USA)を使用して、実験を実施した。
ノコダゾールへの6時間の曝露およびドミナントネガティブペプチドDEPDC1611−628による16時間の処理の後、細胞を分析した。細胞をトリプシン処理により採集し、PBSで洗浄し、固定し、4℃で保存した後、DNA分析を行った。遠心分離によるエタノールの除去の後、細胞を30分間37℃でRNaseと共にインキュベートした。次いで、遠心分離の後、細胞を、ヨウ化プロピジウム(PI)溶液により1時間染色した。染色された核を、Becton Dickinson FACScanフローサイトメーターを使用して、DNA−PI蛍光について分析した。得られたDNA分布を、細胞周期のsub−G0期、G1期、S期、およびG2−M期の細胞の割合について、Modfit(Verity Software House, Topsham, ME)により分析した。
細胞増殖に対するDEPDC1およびZNF224の効果を調査するために、UM−UC−3細胞(1×106細胞/10cmディッシュ)を、FuGENE6トランスフェクション試薬(Roche)を使用して、各8μgのpCAGGSn−DEPDC1−HAまたはpCAGGSn−ZNF224−FLAGまたはその両方によりトランスフェクトした。24時間後、1×106細胞/ディッシュの密度で10cmディッシュプレートに細胞を再び播き、さらに5日間、1mg/mLネオマイシン(ジェネテシン、Invitrogen, Carlsbad,CA,USA)を含有しているEMEMで培養した。ネオマイシンによる処理の7日後、製造業者の推奨に従ってCell Counting Kit−8(和光純薬工業)を用いて、MTTアッセイにより、UM−UC−3細胞の生存能を評価した。570nmの波長での吸光度をマイクロプレートリーダー550(Bio−Rad)により測定した。これらの実験は2回実施した。
UM−UC−3細胞およびNHDF細胞の細胞増殖に対するDEPDC1611−628ペプチドの効果を調査するために、それぞれ、0、1、2、または3μMの濃度のDEPDC1611−628またはスクランブルペプチドと共に、細胞を5日間インキュベートした。各ペプチドを適切な濃度で24時間毎に添加し、細胞の生存能を、毎日、MTTアッセイにより評価した。570nmの波長での吸光度を、マイクロプレートリーダー550(Bio−Rad)により測定した。これらの実験は3回実施した。
UM−UC−3細胞を、DEPDC1611−628またはスクランブルペプチドによる処理の後、12時間インキュベートした。TUNELアッセイのため、供給元の推奨に従いアポトーシスin situ検出キット(和光純薬工業、大阪、日本)を使用して、細胞を評価した。アポトーシス細胞をTCS SP2 AOBS顕微鏡検査により観察した。各実験についてランダムに200個の細胞を観察することにより、TUNEL陽性を決定した。アッセイは3回独立に実施した。
HEK293細胞を、15cmディッシュ(Becton Dickinson, NJ, USA)1枚当たり4×106細胞で播いた。24時間後、FuGENE6トランスフェクション試薬(Roche)を使用して、HAタグ付きDEPDC1およびFLAGタグ付きZNF224構築物により、細胞を、一過性にコトランスフェクトした。24時間後、細胞を、37℃で10分間、1%ホルムアルデヒドで架橋させた。本明細書においては抗HAタグ抗体を使用した以外は、製造業者により推奨された通りに、クロマチン免疫沈降(ChIP)アッセイキット(Upstate, Charlottesvile, VA)を使用して、固定されたクロマチン試料を免疫沈降に供した。回収されたDNAを、A20プロモーター領域(−330〜−35位)をカバーする以下のプライマーを使用して分析した:
5’−AGCCCGACCCAGAGAGTCACGT−3’(SEQ ID NO:80)および
5’−CTTTCGCAAAGTCCCAAGTC−3’(SEQ ID NO:81)。
統計的有意性は、Statview 5.0ソフトウェア(SAS Institute, Cary, NC)を使用して、スチューデントt検定により決定した。P<0.05の差を、統計的に有意であると見なした。
1.DEPDC1と相互作用する分子の同定
DEPDC1は膀胱癌細胞の生存または増殖に関与していることが、siRNA実験により、以前に証明された(Kanehira M, et al., Oncogene 2007 26:6448-55)。しかしながら、その正確な分子的機序は依然として未知であった。膀胱癌細胞におけるその生物学的機能を解明するために、DEPDC1と相互作用するタンパク質を、免疫沈降および質量分析により検索した。UM−UC−3細胞からの細胞抽出物を、抗DEPDC1抗体またはウサギIgG(陰性対照)を用いて免疫沈降させた。タンパク質複合体をSDS−PAGEゲル上で銀染色した。抗DEPDC1抗体による免疫沈降物には見られたが、ウサギIgGによるものには見られなかった、およそ93kDaのタンパク質を抽出し、そのペプチド配列をMALDI−TOF分析により決定した(データ非提示)。このアプローチにより、DEPDC1と相互作用する候補としての、このタンパク質が、クルッペル関連ボックス含有ジンクフィンガータンパク質であるzinc finger protein 224(ZNF224)(Medugno L, et al., FEBS Lett. 2003 534: 93-100)であることが明確になった。臨床膀胱癌例でのZNF224の発現レベルを、半定量的RT−PCR分析によりまず調査した;ZNF224およびDEPDC1のコアップレギュレーションが、膀胱癌例10例あたり9例で観察された(図1A)。この相互作用を実証するために、FLAGタグ付きZNF224(ZNF224−FLAG)を発現するよう設計されたプラスミドを構築し、免疫共沈降実験を実施した(材料および方法を参照されたい)。この構築物プラスミドをUM−UC−3膀胱癌細胞へトランスフェクトし、タンパク質を抗FLAG抗体により免疫沈降させた。ウサギ抗DEPDC1抗体による沈降物のイムノブロッティングは、内在性DEPDC1がZNF224−FLAGタンパク質と共沈降することを明らかにした(図1B)。さらに、ZNF224−FLAG構築物をUM−UC−3細胞へトランスフェクトした時の、DEPDC1およびZNF224の細胞内局在を調査した。図1Cは、内在性DEPDC1が細胞の核において外来ZNF224と共局在したことを明らかにしており、このことは、膀胱癌細胞の核におけるそれらの相互作用を意味している。
さらに、DEPDC1と相互作用するパートナーとしてのZNF224の、膀胱癌発生における生物学的意義を調査するために、ZNF224特異的siRNA発現ベクターを構築し、UM−UC−3膀胱癌細胞における各構築物のノックダウン効果を調査した;ZNF224の過剰発現が観察された。半定量的RT−PCR分析は、ZNF224特異的siRNA(si−ZNF224−1およびsi−ZNF224−2)が、対照としてのsi−EGFPと比較して、ZNF224転写物の量を有意に抑制することを示した(図2左上)。次いで、MTTアッセイおよびコロニー形成アッセイ(図2左下)を実施した。ノックダウン効果の結果と一致して、si−ZNF224−1およびsi−ZNF224−2の導入が、UM−UC−3細胞の増殖の顕著な抑制をもたらすことが発見された(si−ZNF224−1、P=0.000019、または、si−ZNF224−2、P=0.00013、スチューデントt検定)(図2右パネル)。そのような結果は、ZNF224が、膀胱癌細胞の増殖において重大な役割を有する可能性が高いことを明白に示している。
ZNF224は、調節性クルッペル様ジンクフィンガータンパク質ファミリーに属することが報告されており、そのファミリーのメンバーは転写リプレッサーとして機能することが公知である(Medugno L, et al., FEBS Lett 2003 534:93-100)。ZNF224は、ウィルムス腫瘍抑制因子(WT1)との相互作用を通して、WT1タンパク質により媒介される転写活性化を阻害することが、さらに報告されており(Lee TH, et al., J Biol Chem 2002 277:44826-37)、このことは、ZNF224が転写リプレッサーであると考えられることを示している。したがって、膀胱癌細胞におけるDEPDC1/ZNF224複合体により調節される下流遺伝子を同定すべく努力した。siRNA−DEPDC1、siRNA−ZNF224、またはsiRNA−EGFP(対照siRNA)を、DEPDC1およびZNF224が高発現されているUM−UC−3膀胱癌細胞へトランスフェクトし、36468種の遺伝子からなるcDNAマイクロアレイ分析を使用して、様々な時点で遺伝子発現の変化をモニタリングした。さらに、臨床膀胱癌試料において発現が有意に下方制御されていた遺伝子を、cDNAマイクロアレイデータ(Takata R, et al., Clin Cancer Res 2005 11:2625-36)を通して選択した。DLG1およびA20(TNFAIP3としても公知)を、DEPDC1/ZNF224複合体における候補下流遺伝子として同定した。定量的RT−PCR分析は、si−DEPDC1およびsi−ZNF224によりそれぞれトランスフェクトされたUM−UC−3細胞において、siEGFPによりトランスフェクトされた細胞と比較して、両転写物が時間依存的に増加することを確認した(図3A)。特に、UM−UC−3におけるDEPDC1およびZNF224のコトランスフェクションにより、DLG1発現の抑止が検出された(図3B)。さらに、DEPDC1/ZNF224コトランスフェクションによってのみ、DLG1プロモーターのトランス活性化が阻害されることが、ルシフェラーゼアッセイシステムを使用して認識された(図3C)。これらの結果は、DEPDC1/ZNF224複合体が、腫瘍抑制遺伝子の転写を抑止し得ることを示唆している。
その後、これらの2つのタンパク質の結合の生物学的重要性、および膀胱癌の治療標的としてのそれらの可能性を調査した。まず、ZNF224との相互作用に必要とされるDEPDC1内のドメインを決定するために、COOH末端にHAタグ配列を有するDEPDC1の6種の部分構築物(DEPDC11−147、DEPDC1141−300、DEPDC1177−597、DEPDC1300−669、DEPDC1587−740、およびDEPDC1654−811;図4A、図9A)のうちの1つと、Flagタグ付きZNF224(ZNF224−Flag)とを、Cos7細胞へコトランスフェクトした。モノクローナル抗HAラット抗体による免疫沈降は、DEPDC1141−300、DEPDC1300−669、およびDEPDC1587−740は、ZNF224と相互作用することができるが、DEPDC11−147、DEPDC1177−597、およびDEPDC1654−811はZNF224と相互作用できないことを示した(図4B、図9B)。これらの所見は、DEPDC1内のNH2末端の29アミノ酸ポリペプチド(コドン148〜176)およびCOOH末端の56アミノ酸ポリペプチド(コドン598〜653)が、ZNF224との相互作用において重要な役割を果たすことを示唆している。
上に示されるように、NH2末端部分の29アミノ酸ペプチドのDEPDC1148−176、およびCOOH末端部分の56アミノ酸ペプチドのDEPDC1598−653は、ZNF224と相互作用する領域を含有していると推定された。したがって、DEPDC1のZNF224との機能的結合を阻害することができる細胞透過性の生理活性ペプチドを開発するために、膜透過性の11アルギニン残基(11R)がNH2末端に付加された、DEPDC1148−176およびDEPDC1598−653におけるZNF224結合ドメインをカバーする、6種の異なる18アミノ酸ポリペプチドを合成した。膀胱癌細胞の増殖または生存に対するこれらポリアルギニンペプチドの阻害効果を試験するために、UM−UC−3細胞株を6種のペプチドの各々により処理した。様々な濃度の6種のペプチドを、培養培地へ処理したところ、MTTアッセイにより測定されるように、11R−DEP611−628ペプチドが、細胞生存能の有意な減少を用量依存的にもたらし(図5A;P<0.001、1.0μM、2.0μM、3.0μMのペプチド処理について、独立t検定による)、11R−DEP598−615ペプチドが、細胞生存能の中程度の抑制を用量依存的に引き起こすことが発見された。
11R−DEP611−628ペプチドによる腫瘍抑制の機序を明らかにするために、DEPDC1−ZNF224複合体の候補下流遺伝子の発現を、定量的RT−PCR分析により調査した。DLG1およびA20の発現は、ペプチドによる処理により増強されるが、スクランブル611−628ペプチドによる処理では増強されないことが示された(図6A、B)。さらに、これらのペプチドにより処理した腫瘍細胞のフローサイトメトリー分析を実施したところ、細胞がG1−S停止を引き起こし、処理の24時間後、G1画分が有意に増加することが発見された(図6B)。
DEPDC1−ZNF224複合体の増殖促進効果をさらに調査するため、HAタグ付きDEPDC1、FLAGタグ付きZNF224、またはその両方をUM−UC−3細胞へトランスフェクトし、次いで、MTTアッセイにより、細胞生存能を調査した。抗HA抗体および抗FLAG抗体を使用したウェスタンブロット分析により、外来DEPDC1−HAタンパク質および外来ZNF224−FLAGタンパク質の発現を確認した(図8下パネル)。二重にトランスフェクトしたUM−UC−3細胞は、モックプラスミドによりトランスフェクトされたものと比較して、DEPDC1単独またはZNF224単独によりトランスフェクトされたものよりはるかに高い細胞増殖を示した(P<0.05、独立t検定;図8上パネル)。総合すると、本発明者らの結果は、DEPDC1−ZNF224複合体が、膀胱癌発生において重大な役割を果たす可能性が高いことを意味している。
DEPDC1とZNF224との間の相互作用の阻害に対する細胞透過性ペプチドのドミナントネガティブ効果の可能性を調査するために、本発明者らは、ZNF224結合ドメインであるDEPDC1598−653をカバーすることができ、NH2末端に膜透過性の11アルギニン残基(11R)を有する、4種の18アミノ酸ポリペプチドを合成した。本発明者らは、タンパク質間相互作用および膀胱癌細胞増殖に対するこれらのペプチドの効果を調査した。まず、DEPDC1−HAおよびZNF224−FLAG構築物をCOS7細胞へコトランスフェクトし、次いで、トランスフェクションの6時間後に4種のペプチドの各々により細胞を処理した。24時間後、本発明者らは、抗HAタグ抗体による免疫沈降実験を実施し、その後、抗FLAG抗体によるウェスタンブロット分析を実施した。11R−DEP611−628による処理は、COS7細胞におけるDEPDC1−HAとZNF224−FLAGとの複合体形成を明白に阻害し、11R−DEP598−615による処理は中程度の効果を示したが、その他のペプチドは複合体形成に対する効果を示さないことが証明された(図7A)。さらに、11R−DEP611−628のスクランブル配列ペプチド(スクランブル)による効果が存在しないことを確認することにより、複合体形成の阻害に関する11R−DEP611−628の特異性を確認した(図5B)。
DEPDC1−ZNF224複合体による、可能性のあるプロモーター特異的なA20転写の抑止を調査するために、まず、A20遺伝子のプロモーター領域を、コンピュータ予測プログラムWWW Promoter Scan(www−bimas.cit.nih.gov/molbio/proscan/)により検索した。次いで、ルシフェラーゼレポーター遺伝子と融合したA20遺伝子のプロモーター領域に相当するおよそ300bpの断片を含有しているレポータープラスミドと、DEPDC1もしくはZNF224を発現するよう設計された2つのプラスミドクローンのいずれかまたは両クローンとを、UM−UC−3細胞へコトランスフェクトした。A20レポータープラスミドを使用したルシフェラーゼレポーターアッセイにおいて、DEPDC1−HAおよびZNF224−FLAG構築物の両方によりコトランスフェクトされたNHDF細胞は、DEPDC1単独、ZNF224単独、またはモックプラスミドによりトランスフェクトされたものと比較して、ルシフェラーゼレポーター活性の有意な低下を示した(図10A)。
A20は、最初、腫瘍壊死因子α(TNFα)の刺激後に急速に誘導され、NF−κB古典的経路の負の調節因子として機能する細胞質ジンクフィンガータンパク質として同定された(Krikos A, Laherty CD, Dixit VM. Krikos A, Laherty CD, Dixit VM. J Biol Chem. 1992;267:17971-6.、Beyaert R, Heyninck K, Van Huffel S, Biochem Pharmacol. 2000;60:1143-51)。したがって、本発明者らは、NF−κBシグナル伝達経路におけるA20の効果に焦点を当てた。ウェスタンブロット分析は、DEPDC1−ZNF224複合体形成を阻害する11R−DEP611−628ペプチドによる処理の6時間後に、A20の発現が上昇することを示した(図11A;最初のパネル)。
がん治療のための分子標的薬の開発における著しい進歩が、過去20年間に達成された。しかしながら、現在利用可能な治療に対して良好な応答を示す患者の割合は依然として非常に限定されており、患者の一部は、利益なしに重篤な有害反応に苦しんでいる(Ardavanis A, et al., Br J Cancer 2005 92:645-50)。したがって、本発明は、現在の療法よりも特異的かつ効率的な抗がん効果を有し、かつ有害効果のリスクが最小限である低分子化合物を開発するという目標に向けて、治療標的およびその機能的に関連するパートナーを同定するための有効なスクリーニングシステムを確立する。DEPDC1(DEP domain containing 1)は、膀胱癌細胞において高度かつ特異的にトランス活性化されることが以前に報告されている。さらに、DEPDC1発現は、精巣以外の調査された24種の正常ヒト組織のいずれにおいてもほぼ検出不可能であるので、DEPDC1は、薬物標的としての可能性を有する(Kanehira M, et al., Oncogene 2007 26:6448-55)。DEPDC1−ZNF224複合体は、膀胱癌発生において重大な役割を果たす可能性が高い。DEPDC1は、膀胱癌において過剰発現される遺伝子の遺伝子発現プロファイル検索を通して以前に同定されている。RT−PCR分析は、膀胱癌における増加したDEPDC1発現を検出した。また、その相互作用タンパク質ZNF224が、膀胱癌における増加した発現を有するものとして検出された。
本発明は、DEPDC1とZNF224との間の結合を同定し、がんの発生におけるこの結合の重要性を証明する。
Claims (34)
- SEQ ID NO:28のアミノ酸配列を含むポリペプチドまたはそれと機能的に等価なポリペプチドであって、SEQ ID NO:45または47からなるペプチドの生物学的機能を欠くポリペプチド。
- 生物学的機能が細胞増殖活性である、請求項1に記載のポリペプチド。
- 8〜30個の残基からなる、請求項1に記載のポリペプチド。
- 細胞膜透過性物質により修飾されている、請求項1に記載のポリペプチド。
- 以下の一般式を有する、請求項4に記載のポリペプチド:
[R]−[D]
式中、[R]および[D]は直接連結されていてもよいしまたはリンカーにより間接的に連結されていてもよく、[R]は細胞膜透過性物質を表し;かつ[D]は請求項1に記載のポリペプチドのアミノ酸配列を表す。 - 細胞膜透過性物質が以下のものからなる群より選択される、請求項5に記載のポリペプチド:
ポリアルギニン/RRRRRRRRRRR (SEQ ID NO:43);
Tat/RKKRRQRRR (SEQ ID NO:29);
ペネトラチン(Penetratin)/RQIKIWFQNRRMKWKK (SEQ ID NO:30);
ブフォリンII/TRSSRAGLQFPVGRVHRLLRK (SEQ ID NO:31);
トランスポータン/GWTLNSAGYLLGKINLKALAALAKKIL (SEQ ID NO:32);
MAP(model amphipathic peptide)/KLALKLALKALKAALKLA (SEQ ID NO:33);
K−FGF/AAVALLPAVLLALLAP (SEQ ID NO:34);
Ku70/VPMLK (SEQ ID NO:35);
Ku70/PMLKE (SEQ ID NO:36);
プリオン/MANLGYWLLALFVTMWTDVGLCKKRPKP (SEQ ID NO:37);
pVEC/LLIILRRRIRKQAHAHSK (SEQ ID NO:38);
Pep−1/KETWWETWWTEWSQPKKKRKV (SEQ ID NO:39);
SynB1/RGGRLSYSRRRFSTSTGR (SEQ ID NO:40);
Pep−7/SDLWEMMMVSLACQY (SEQ ID NO:41);および
HN−1/TSPLNIHNGQKL (SEQ ID NO:42)。 - 請求項1〜6のいずれか一項に記載のポリペプチドを活性成分として含む、がんの治療および予防のいずれかまたは両方のための剤。
- がんが膀胱癌である、請求項7に記載の剤。
- 請求項1〜6のいずれか一項に記載のポリペプチドを、その必要のある対象に投与する工程を含む、対象におけるがんを治療または予防する方法。
- がんが膀胱癌である、請求項9に記載の方法。
- DEPDC1に関連したがんを治療もしくは予防するか、またはDEPDC1とZNF224との間の結合を阻害するための候補化合物をスクリーニングする方法であって、以下を含む方法:
(a)試験化合物の存在下で、DEPDC1ポリペプチドまたはその機能的等価物を、ZNF224ポリペプチドまたはその機能的等価物と接触させる工程;
(b)ポリペプチド間の結合を検出する工程;および
(c)これらのポリペプチド間の結合を阻害する試験化合物を選択する工程。 - DEPDC1ポリペプチドの機能的等価物がZNF224結合ドメインのアミノ酸配列を含む、請求項11に記載の方法。
- DEPDC1ポリペプチドの機能的等価物がSEQ ID NO:28、54、および55のアミノ酸配列を含む、請求項12に記載の方法。
- ZNF224ポリペプチドの機能的等価物がDEPDC1結合ドメインのアミノ酸配列を含む、請求項11に記載の方法。
- DEPDC1に関連したがんを治療もしくは予防するか、またはDEPDC1およびZNF224を発現しているがん細胞の増殖を阻害するための候補化合物をスクリーニングする方法であって、以下を含む方法:
(a)候補化合物を、DEPDC1およびZNF224を発現している細胞と接触させる工程;ならびに
(b)試験化合物の非存在下で検出される発現レベルと比較して、DLG1またはA20(TNFAIP3)の発現レベルを増加させる候補化合物を選択する工程。 - DEPDC1に関連したがんを治療もしくは予防するか、またはDEPDC1を発現しているがん細胞の増殖を阻害するための候補化合物をスクリーニングする方法であって、以下を含む方法:
(a)DLG1またはA20(TNFAIP3)の転写調節領域と、該転写調節領域の制御下で発現されるレポーター遺伝子とを含むベクターが導入されている、DEPDC1およびZNF224を発現している細胞に、候補化合物を接触させる工程;
(b)レポーター遺伝子の発現または活性を測定する工程;ならびに
(c)対照と比較して、前記レポーター遺伝子の発現または活性のレベルを増加させる候補化合物を選択する工程。 - DLG1の転写調節領域がSEQ ID NO:56のヌクレオチド配列である、請求項16に記載の方法。
- A20(TNFAIP3)の転写調節領域がSEQ ID NO:82のヌクレオチド配列である、請求項16に記載の方法。
- がんが膀胱癌である、請求項11、15、および16のいずれか一項に記載の方法。
- センス鎖とアンチセンス鎖とを含む二本鎖分子であって、該センス鎖がSEQ ID NO:57または58からなる標的配列に対応するヌクレオチド配列を含み、かつ該アンチセンス鎖が該センス鎖に相補的なヌクレオチド配列を含み、センス分子および前記二本鎖分子が、ZNF224遺伝子を発現している細胞に導入された場合に該遺伝子の発現を阻害する、二本鎖分子。
- 約19〜約25ヌクレオチド長であるオリゴヌクレオチドである、請求項20に記載の二本鎖分子。
- センス鎖がSEQ ID NO:9および10の中から選択される配列に対応する配列からなる、請求項21に記載の二本鎖分子。
- 一本鎖ヌクレオチド配列を介して連結されたセンス鎖およびアンチセンス鎖を含む単一のヌクレオチド転写物である、請求項20に記載の二本鎖分子。
- ポリヌクレオチドが、下記一般式を有する、請求項23に記載の二本鎖分子:
5’−[A]−[B]−[A’]−3’
式中、[A]はSEQ ID NO:57または58を含むヌクレオチド配列であり;[B]は約3〜約23個のヌクレオチドからなるヌクレオチド配列であり;かつ[A’]は[A]に相補的なヌクレオチド配列である。 - [A]が、SEQ ID NO:9および10の中から選択される配列に対応する配列からなる、請求項24に記載の二本鎖分子。
- 請求項20〜25のいずれか一項に記載の二本鎖分子をコードするベクター。
- 薬学的に有効な量の、ZNF224遺伝子に対する二本鎖分子、または該二本鎖分子をコードするベクターと、薬学的に許容可能な担体とを対象へ投与する工程を含む、対象におけるがんを治療または予防する方法であって、該二本鎖分子および該ベクターが、ZNF224遺伝子を発現している細胞と接触して細胞増殖を阻害する、方法。
- 二本鎖分子が請求項20に記載の二本鎖分子である、請求項27に記載の方法。
- ベクターが請求項26に記載のベクターである、請求項27に記載の方法。
- 治療されるがんが膀胱癌である、請求項27に記載の方法。
- 薬学的に有効な量の、ZNF224遺伝子に対する二本鎖分子、または該二本鎖分子を含むベクターと、薬学的に許容可能な担体とを含む、がんを治療または予防するための組成物であって、該二本鎖分子および該ベクターが、ZNF224遺伝子を発現している細胞と接触して細胞増殖を阻害する、組成物。
- 請求項20に記載の二本鎖分子を含む、請求項31に記載の組成物。
- 請求項26に記載のベクターを含む、請求項31に記載の組成物。
- 治療されるがんが膀胱癌である、請求項31に記載の組成物。
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