JP2010523081A - Ｃｄｃａ８−ａｕｒｋｂ複合体を標的とするスクリーニング方法およびｎｓｃｌｃの治療方法 - Google Patents

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Abstract

本発明は、ＣＤＣＡ８およびＡＵＲＫＢの同時活性化ならびにそれらの直接接触相互作用が、肺癌の進行において重要な役割を果たすという知見に基づく。したがって、ＣＤＣＡ８−ＡＵＲＫＢ複合体の形成を阻害することは、非小細胞肺癌の治療において有用性を見出す。本発明はまた、例えば、ＣＤＣＡ８遺伝子またはＡＵＲＫＢ遺伝子の転写調製領域を用いて、非小細胞肺癌の治療および／または予防に適した化合物を同定する方法、ならびにＣＤＣＡ８および／またはＡＵＲＫＢの発現レベルを判定指標として使用する診断法および予後診断法を提供する。

Description

本出願は、２００７年３月３０日に出願された米国特許仮出願第６０／９０９，３４７号の恩典を主張し、その内容は全体として参照により本明細書に組み入れられる。
発明の分野
本発明は、生物科学の分野、より具体的には癌治療の分野に関する。本発明は特に、ＣＤＣＡ８とＡＵＲＫＢとの間の相互作用を指標として使用するスクリーニング方法に関する。そのような方法を通じて、癌、特に非小細胞肺癌（ＮＳＣＬＣ）の治療および予防に適した薬剤を同定することができる。さらに、ＣＤＣＡ８およびＡＵＲＫＢの同時活性化およびそれらの直接接触相互作用が、肺癌の進行において重要な役割を果たすことが本明細書において実証されることを考慮して、本発明はまた、ＣＤＣＡ８−ＡＵＲＫＢ複合体の形成の阻害を含む、非小細胞肺癌を治療および予防する方法、ならびにＣＤＣＡ８および／またはＡＵＲＫＢの発現レベルを指標として使用する、ＮＳＣＬＣ患者の予後を評価する方法に関する。
発明の背景
肺癌は世界で最もよく見られる癌の１つであり、非小細胞肺癌（ＮＳＣＬＣ）は肺癌症例のほぼ８０％を占める（Greenlee RT., et al. CA Cancer J Clin. 2001 Jan-Feb;51(1):15-36）。肺癌の発症および進行に関連した多くの遺伝子変化が報告されているが、正確な分子機構は依然として不明である（Sozzi G. Eur J Cancer. 2001 Oct;37 Suppl 7:S63-73）。過去１０年間にわたって、パクリタキセル、ドセタキセル、ゲムシタビン、およびビノレルビンを含む新たに開発された細胞毒性薬が登場し、進行性ＮＳＣＬＣ患者に複数の治療選択肢が与えられた。しかしながら、これらのレジメンは、シスプラチンに基づいた治療方法と比較して、わずかな延命効果を提供するに過ぎない（Schiller JH, et al., N Engl J Med. 2002 Jan 10;346(2):92-8; Kelly K, et al., J Clin Oncol. 2001 Jul 1;19(13):3210-8）。
細胞毒性薬療法に加えて、ＶＥＧＦに対するモノクローナル抗体（すなわち、ベバシズマブ／抗ＶＥＧＦ）またはＥＧＦＲに対するモノクローナル抗体（すなわち、セツキシマブ／抗ＥＧＦＲ）、およびＥＧＦＲチロシンキナーゼの阻害薬（すなわち、ゲフィチニブおよびエルロチニブ）などの分子標的薬を含む治療方法が開発され、臨床診療に適用されている（Perrone F, et al., Curr Opin Oncol. 2005 Mar;17(2):123-9）。しかしながら、新たな治療方法のそれぞれは、患者のほんの一部にしか延命効果を提供することができないため（Thatcher N, et al., Lancet. 2005 Oct 29-Nov 4;366(9496):1527-37; Shepherd FA, et al., N Engl J Med. 2005 Jul 14;353(2):123-32）、新たな治療戦略が切に望まれている。具体的には、当技術分野において、毒性が低く、患者の大多数に適用できる、より効果的な分子標的薬の必要性が存在する。
ｃＤＮＡマイクロアレイ技術を用いて何千個もの遺伝子の発現レベルを体系的に解析することは、発癌経路に関与する未知の分子を同定するのに効果的なアプローチを提供し、この解析を用いて、新たな治療法および診断法を開発するための候補標的分子を効率的にスクリーニングすることができる。例えば、２７，６４８個の遺伝子を含むｃＤＮＡマイクロアレイ上で肺癌組織試料１０１例のゲノム全域の発現プロファイルを解析することによって、ＮＳＣＬＣを診断、治療、および／または予防するための新たな潜在的標的分子を単離する試み（Kikuchi T, et al. Oncogene. 2003 Apr 10;22(14):2192-205; Kakiuchi S, et al., Mol Cancer Res. 2003 May;1(7):485-99; Kakiuchi S, et al., Hum Mol Genet. 2004 Dec 15;13(24):3029-43 Epub 2004 Oct 20; Kikuchi T, et al., Int J Oncol. 2006 Apr;28(4):799-805; Taniwaki M, et al., Int J Oncol. 2006 Sep;29(3):567-75）が進行中である。
具体的には、各遺伝子産物の生物学的および臨床病理学的な重要性を検証するために、臨床肺癌材料の腫瘍組織マイクロアレイ解析とＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）を併用するスクリーニング系が開発された（Suzuki C, et al., Cancer Res. 2003 Nov l;63(21):7038-41; Ishikawa N, et al. Clin Cancer Res. 2004 Dec 15;10(24):8363-70; Kato T, et al., Cancer Res. 2005 Jul 1;65(13):5638-46; Furukawa C, et al., Cancer Res. 2005 Aug 15;65(16):7102-10; Ishikawa N, et al., Cancer Res. 2005 Oct 15;65(20):9176-84; Suzuki C, et al., Cancer Res. 2005 Dec 15;65(24):11314-25; Ishikawa N, et al., Cancer Sci. 2006 Aug;97(8):737-45; Takahashi K, et al., Cancer Res. 2006 Oct l;66(19):9408-19; Hayama S, et al., Cancer Res. 2006 Nov l;66(21):10339-48）。
この体系的なアプローチにより、ＮＳＣＬＣの診断マーカーおよび治療標的として、上方制御される遺伝子が６４２個および下方制御される遺伝子が８０６個同定された（その内容が参照により本明細書に組み入れられる、ＷＯ ２００４／３１４１３を参照されたい）。そのうちの特に１つは、原発性肺癌で頻繁に過剰発現され、肺癌細胞の増殖／生存および悪性度の性質に必須であることが示された遺伝子、細胞分裂関連遺伝子８（ＣＤＣＡ８）であった。
最近になって、ＣＤＣＡ８は、脊椎動物染色体パッセンジャー複合体の新たな構成要素として同定された。ＣＤＣＡ８は、オーロラキナーゼＢ（ＡＵＲＫＢ）によってインビトロでリン酸化されることが示唆されたが、正確なリン酸化部位、ならびに癌細胞および正常哺乳動物細胞におけるその機能的重要性は依然として不明である（Sampath SC, et al., Cell. 2004 Jul 23;118(2):187-202; Gassmann R, et al., J Cell Biol. 2004 Jul 19;166(2):179-91 Epub 2004 Jul 12）。染色体パッセンジャー複合体は、少なくとも４つのタンパク質；ＡＵＲＫＢ、内部セントロメアタンパク質抗原１３５／１５５ｋＤａ（ＩＮＣＥＮＰ）、ＢＩＲＣ５／サバイビン、およびＣＤＣＡ８から構成され（Vagnarelli P & Earnshaw WC. Chromosoma. 2004 Nov;113(5):211-22 Epub 2004 Sep 4）、これらはそれぞれ有糸分裂中に動的な細胞局在パターンを示す（Higuchi T & Uhlmann F. Nature. 2003 Dec 18;426(6968):780-1）。
中期の染色体整列の調節、姉妹染色分体の分離、紡錘体チェックポイントシグナル伝達、および細胞質分裂など、染色体パッセンジャー複合体のいくつかの有糸分裂機能が報告されているため（Carmena M & Earnshaw WC. Nat Rev Mol Cell Biol. 2003 Nov;4(11):842-54）、この複合体は有糸分裂調節因子として分類され得る。ＡＵＲＫＢおよびＢＩＲＣ５の活性化がいくつかのヒト癌で報告されており（Bischoff JR, et al., EMBO J. 1998 Jun 1;17(11):3052-65; Branca M, et al., Am J Clin Pathol. 2005 Jul;124(1):113-21）、多くの他の有糸分裂調節因子および／または細胞周期調節因子もまた腫瘍細胞において異常に発現され、有望な抗癌剤を開発するための標的とみなされる。
実際に、ＣＤＫ阻害薬（フラボピリドール、ＵＣＮ−０１、Ｅ７０７０、Ｒ−ロスコビチン、およびＢＭＳ−３８７０３２など）、特異的ＫＩＦ１１阻害薬（モナストロール）、およびヒストン脱アセチル化酵素（ＨＤＡＣ）阻害薬は、抗癌活性を有することが明らかになり、したがって前臨床期または臨床期に適用されている（Blagden S & de Bono J. Curr Drug Targets. 2005 May;6(3):325-35; Bergnes G, et al., Curr Top Med Chem. 2005;5(2): 127-45; Mork CN, et al., Curr Pharm Des. 2005;11(9):1091-104）。
本明細書において、肺癌の増殖および進行に重要であるＡＵＲＫＢによるＣＤＣＡ８の発癌活性化の新規な機構を説明する。本明細書では、ＣＤＣＡ８／ＡＵＲＫＢ相互作用の機能阻害が、肺癌患者を治療するための潜在的戦略をもたらし得るという発見もまた実証する。
本明細書においてより詳細に論じるように、肺癌をゲノム全域にわたり遺伝子発現解析したところ、試験した肺癌試料の大多数において、それぞれ脊椎動物染色体パッセンジャー複合体の構成要素とみなされる細胞分裂関連遺伝子８（ＣＤＣＡ８）（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１によってコードされる、ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＮＭ＿０１８１０１；ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２）およびオーロラキナーゼＢ（ＡＵＲＫＢ）（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３によってコードされる、ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＮＭ＿００４２１７；ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４）の同時トランス活性化が検出された。
加えて、肺癌組織マイクロアレイの免疫組織化学的解析から、ＣＤＣＡ８およびＡＵＲＫＢの過剰発現が肺癌患者の予後不良と有意に関連していることが実証された。
具体的には、ＡＵＲＫＢは、Ｓｅｒ−１５４、Ｓｅｒ−２１９、Ｓｅｒ−２７５、およびＴｈｒ−２７８残基においてＣＤＣＡ８を直接リン酸化することが示され、癌細胞においてＣＤＣＡ８タンパク質を安定化すると考えられた。ＣＤＣＡ８に対するｓｉＲＮＡを用いてＣＤＣＡ８発現を抑制すると、肺癌細胞の増殖が有意に抑制された。
さらに、例えば、２つのＡＵＲＫＢリン酸化部位を含む、ＣＤＣＡ８の２０アミノ酸配列断片に相当する細胞透過可能なペプチド（１１Ｒ−ＣＤＣＡ８２６１〜２８０）（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５）を使用して、ＣＤＣＡ８とＡＵＲＫＢとの間の相互作用を機能的に阻害すると、ＣＤＣＡ８のリン酸化は有意に減少し、肺癌細胞の増殖は抑制された。考え合わせると、本明細書におけるデータから、ＣＤＣＡ８−ＡＵＲＫＢ経路の選択的抑制が、肺癌患者のための有望な治療戦略を構成することが示唆される。
本発明の１つまたは複数の局面が特定の目的を満たすことができ、一方、１つまたは複数の他の局面が特定の他の目的を満たすことができることが、当業者によって理解されよう。各目的は、本発明のすべての局面にすべての点で等しく当てはまらない場合がある。したがって、以下の目的は、本発明のいずれか１つの局面に関して選択的に考慮することができる。
上記を考慮すると、本発明の目的は、ＮＳＣＬＣの治療および／または予防に適した化合物をスクリーニングする方法を提供することである。例示的な方法は、以下の段階を含む：
（ａ）試験化合物の存在下で、ＡＵＲＫＢポリペプチドまたはその機能的同等物をＣＤＣＡ８ポリペプチドまたはその機能的同等物と接触させる段階；
（ｂ）段階（１）のポリペプチド間の結合を試験する段階；および
（ｃ）該ポリペプチド間の結合を阻害する試験化合物を選択する段階。
ＣＤＣＡ８ポリペプチドの例示的な機能的同等物は、ＡＵＲＫＢ結合ドメインに相当するアミノ酸配列、例えば、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５のアミノ酸配列（ＮＩＫＫＬＳＮＲＬＡＱＩＣＳＳＩＲＴＨＫ）を有し得る。同様に、ＡＵＲＫＢポリペプチドの例示的な機能的同等物は、ＣＤＣＡ８結合ドメインに相当するアミノ酸配列を有し得る。
本発明のさらなる目的は、ＮＳＣＬＣの治療および／または予防に適した化合物をスクリーニングする方法を提供することである。例示的な方法は以下の段階を含む：
（ａ）試験化合物の存在下で、ＡＵＲＫＢポリペプチドまたはその機能的同等物をＣＤＣＡ８ポリペプチドまたはその機能的同等物と接触させる段階；
（ｂ）ＡＵＲＫＢポリペプチドによるＣＤＣＡ８ポリペプチドのリン酸化、またはＣＤＣＡ８ポリペプチドの量を試験する段階；および
（ｃ）ＣＤＣＡ８ポリペプチドのリン酸化を阻害するか、またはＣＤＣＡ８ポリペプチドの量を減少させる試験化合物を選択する段階。
ＣＤＣＡ８ポリペプチドの例示的な機能的同等物は、例えばＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２のアミノ酸配列のＳｅｒ−１５４、Ｓｅｒ−２１９、Ｓｅｒ−２７５、および／またはＴｈｒ−２７８残基を含むリン酸化部位を含むアミノ酸配列を有し得る。同様に、ＡＵＲＫＢポリペプチドの例示的な機能的同等物は、キナーゼドメインに相当するアミノ酸配列を有し得る。
本発明のさらなる目的は、上記の本発明のスクリーニング方法によって得られた化合物を投与する段階を含む、対象においてＮＳＣＬＣを治療および／または予防する方法を提供することである。
本発明のさらなる目的は、ＮＳＣＬＣの治療および／または予防に適した化合物をスクリーニングするためのキットをさらに提供することである。そのようなキットは、好ましくは、最低でも以下の構成要素を含む：
ａ：ＡＵＲＫＢポリペプチドまたはその機能的同等物、および
ｂ：ＣＤＣＡ８ポリペプチドまたはその機能的同等物。
本発明のさらなる目的は、ＡＵＲＫＢ遺伝子の発現を減少させるｓｉＲＮＡを含むｓｉＲＮＡ組成物を対象に投与する段階を含む、対象においてＮＳＣＬＣを治療および／または予防する方法を提供することであり、この場合、ｓｉＲＮＡは、標的配列としてセンス鎖中に、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３３、５９、および６０からなる群より選択されるヌクレオチド配列を有する。そのようなｓｉＲＮＡは、好ましくは下記の一般式を有する：
５’−［Ａ］−［Ｂ］−［Ａ’］−３’
式中、［Ａ］はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３３、５９、および６０からなる群より選択される配列に相当するリボヌクレオチド配列であり；［Ｂ］は３〜２３ヌクレオチドから構成されるリボヌクレオチド配列であり；かつ［Ａ’］は［Ａ］と相補的なリボヌクレオチド配列である。
本発明のさらなる目的は、ドミナントネガティブ効果を有するＣＤＣＡ８変異体またはそのような変異体をコードするポリヌクレオチドを投与することにより、対象においてＮＳＣＬＣを治療および／または予防する方法を提供することである。そのようなＣＤＣＡ８変異体は、例えば、いずれもＡＵＲＫＢによってリン酸化されるリン酸化部位Ｓｅｒ−１５４、Ｓｅｒ−２１９、Ｓｅｒ−２７５、およびＴｈｒ−２７８を含むＣＤＣＡ８タンパク質の一部といった、ＡＵＲＫＢ結合領域を含むアミノ酸配列を有し得る。好ましい態様において、ＣＤＣＡ８変異体は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５のアミノ酸配列を有する。ＣＤＣＡ８変異体はまた、一般式［Ｒ］−［Ｄ］を有してよく、式中、［Ｒ］は膜導入物質（membrane transducing agent）であり、かつ［Ｄ］はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５のアミノ酸配列を有するポリペプチドである。膜導入物質は以下からなる群より選択され得る：
ポリアルギニン；
Ｔａｔ／ＲＫＫＲＲＱＲＲＲ／ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６；
ペネトラチン／ＲＱＩＫＩＷＦＱＮＲＲＭＫＷＫＫ／ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：７；
ブホリンＩＩ／ＴＲＳＳＲＡＧＬＱＦＰＶＧＲＶＨＲＬＬＲＫ／ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：８；
トランスポータン／ＧＷＴＬＮＳＡＧＹＬＬＧＫＩＮＬＫＡＬＡＡＬＡＫＫＩＬ／ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：９；
ＭＡＰ（両親媒性ペプチドモデル）／ＫＬＡＬＫＬＡＬＫＡＬＫＡＡＬＫＬＡ／ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１０；
Ｋ−ＦＧＦ／ＡＡＶＡＬＬＰＡＶＬＬＡＬＬＡＰ／ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１１；
Ｋｕ７０／ＶＰＭＬＫ／ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１２；
Ｋｕ７０／ＰＭＬＫＥ／ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１３；
プリオン／ＭＡＮＬＧＹＷＬＬＡＬＦＶＴＭＷＴＤＶＧＬＣＫＫＲＰＫＰ／ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１４；
ｐＶＥＣ／ＬＬＩＩＬＲＲＲＩＲＫＱＡＨＡＨＳＫ／ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１５；
Ｐｅｐ−１／ＫＥＴＷＷＥＴＷＷＴＥＷＳＱＰＫＫＫＲＫＶ／ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１６；
ＳｙｎＢ１／ＲＧＧＲＬＳＹＳＲＲＲＦＳＴＳＴＧＲ／ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１７；
Ｐｅｐ−７／ＳＤＬＷＥＭＭＭＶＳＬＡＣＱＹ／ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１８；および
ＨＮ−１／ＴＳＰＬＮＩＨＮＧＱＫＬ／ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１９。
本発明のなおさらなる目的は、センス鎖がＡＵＲＫＢ標的配列に相当するリボヌクレオチド配列であり、アンチセンス鎖が該センス鎖と相補的なリボヌクレオチド配列であり、その結果センス鎖とアンチセンス鎖が互いにハイブリダイズして、ＡＵＲＫＢ遺伝子を発現する細胞内に導入された場合に、該遺伝子の発現を阻害する二本鎖分子を形成する、センス鎖およびアンチセンス鎖から構成される二本鎖分子を提供することである。二本鎖分子は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３３、５９、または６０のヌクレオチド配列から選択される、少なくとも約１０個の連続したヌクレオチドから構成されるＡＵＲＫＢ標的配列を含み得る。好ましい態様において、ＡＵＲＫＢ標的配列は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３のヌクレオチド配列から選択される約１９個〜約２５個の連続したヌクレオチドを含むか、またはＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３から完全に構成され得る。
二本鎖分子は、介在一本鎖、例えば一本鎖リボヌクレオチド配列によって連結されたセンス鎖およびアンチセンス鎖から構成される単一のリボヌクレオチド転写産物であってもよい。そのような二本鎖分子は、任意に３’オーバーハングを含み得る。二本鎖分子は典型的に、約１００ヌクレオチド長未満、好ましくは約７５ヌクレオチド長未満、より好ましくは約５０ヌクレオチド長未満、さらにより好ましくは約２５ヌクレオチド長未満のオリゴヌクレオチドである。好ましい態様において、二本鎖分子は約１９〜約２５ヌクレオチド長のオリゴヌクレオチドである。
本発明のさらなる目的は、上記の本発明の二本鎖分子をコードするベクターを提供することである。このベクターは、センス鎖およびアンチセンス鎖を含む二次構造を有する転写産物をコードし得る。転写産物は、センス鎖とアンチセンス鎖を連結する介在一本鎖、例えば一本鎖リボヌクレオチド配列をさらに含み得る。
または、ベクターはセンス鎖とアンチセンス鎖の両方をコードして、２つの転写産物として両鎖を発現させることによって二本鎖分子を形成させる。さらに、センス鎖とアンチセンス鎖の組み合わせをコードし得るベクターもまた提供される。
本発明のなおさらなる目的は、センス鎖核酸がＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３３、５９、および６０からなる群より選択されるヌクレオチド配列を有し、アンチセンス鎖核酸が該センス鎖と相補的な配列を有する、センス鎖核酸およびアンチセンス鎖核酸の組み合わせから構成されるポリヌクレオチドを含むベクターを提供することである。
ポリヌクレオチドは、下記の一般式を有し得る：
５’−［Ａ］−［Ｂ］−［Ａ’］−３’
式中、［Ａ］はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３３、５９、および６０からなる群より選択されるヌクレオチド配列であり；［Ｂ］は３〜２３ヌクレオチドからなるヌクレオチド配列であり；かつ［Ａ’］は［Ａ］と相補的なヌクレオチド配列である。
本発明のなおさらなる目的は、ＡＵＲＫＢ遺伝子に対するｓｉＲＮＡの薬学的有効量を含む、ＮＳＣＬＣを治療または予防するための組成物を提供することである。ｓｉＲＮＡは、標的配列として、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３３、５９、および６０からなる群より選択されるヌクレオチド配列を有するセンス鎖を含み得る。
本発明のなおさらなる目的は、有効成分としての、上記の本発明のスクリーニング方法によって選択された化合物の薬学的有効量、および薬学的に許容される担体を含む、ＮＳＣＬＣを治療または予防するための組成物を提供することである。
本発明のなおさらなる目的は、本発明のＣＤＣＡ８変異体の薬学的有効量を含む、ＮＳＣＬＣを治療または予防するための組成物を提供することである。
本発明のなおさらなる目的は、以下の段階を含む、ＮＳＣＬＣの予後を評価する方法を提供することである：
（ａ）ＮＳＣＬＣの予後を評価しようとする対象から採取した試料において、ＣＤＣＡ８およびＡＵＲＫＢのいずれか一方またはその両方の発現レベルを検出する段階、ならびに
（ｂ）ＣＤＣＡ８およびＡＵＲＫＢのいずれか一方またはその両方の発現レベルの上昇が検出された場合に、予後不良が示される段階。
上記の方法は、ＣＤＣＡ８またはＡＵＲＫＢのいずれか一方の発現レベルを検出する段階もまた含み得る。発現レベルは、以下の方法のうちいずれか１つによって検出することができる：
（ａ）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２（ＣＤＣＡ８）またはＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４（ＡＵＲＫＢ）のアミノ酸配列をコードするｍＲＮＡの存在を検出する段階、
（ｂ）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２（ＣＤＣＡ８）またはＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４（ＡＵＲＫＢ）のアミノ酸配列を有するタンパク質の存在を検出する段階、および
（ｃ）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２（ＣＤＣＡ８）またはＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４（ＡＵＲＫＢ）のアミノ酸配列を有するタンパク質の生物活性を検出する段階。
本発明のなおさらなる目的は、以下からなる群より選択される１つまたは複数の構成要素を含む、ＮＳＣＬＣの予後を評価するためのキットを提供することである：
（ａ）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２（ＣＤＣＡ８）またはＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４（ＡＵＲＫＢ）のアミノ酸配列をコードするｍＲＮＡを検出するための試薬、
（ｂ）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２（ＣＤＣＡ８）またはＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４（ＡＵＲＫＢ）のアミノ酸配列を有するタンパク質を検出するための試薬、および
（ｃ）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２（ＣＤＣＡ８）またはＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４（ＡＵＲＫＢ）のアミノ酸配列を有するタンパク質の生物活性を検出するための試薬。
本発明のなおさらなる目的は、以下の段階を含む、非小細胞肺癌を治療または予防するための化合物をスクリーニングする方法を提供することである：
（ａ）ＣＤＣＡ８遺伝子またはＡＵＲＫＢ遺伝子の転写調節領域と該転写調節領域の制御下で発現されるレポーター遺伝子とを含むベクターが導入された細胞を、試験化合物と接触させる段階、
（ｂ）レポーター遺伝子の発現レベルまたは活性を測定する段階；ならびに
（ｃ）対照と比較して、レポーター遺伝子の発現レベルまたは活性を低下させる化合物を選択する段階。
上記の方法において、転写調節領域はＥ２Ｆ−１モチーフを含み得る。
本発明のなおさらなる目的は、以下の構成要素を含む、ＮＳＣＬＣを治療または予防するための化合物をスクリーニングするためのキットを提供することである：
（ａ）ＣＤＣＡ８遺伝子またはＡＵＲＫＢ遺伝子の転写調節領域と該転写調節領域の制御下で発現されるレポーター遺伝子とを含むベクターが導入された細胞、ならびに
（ｂ）レポーター遺伝子の発現レベルまたは活性を測定するための試薬。
本発明のなおさらなる目的は、以下からなる群より選択される少なくとも１つの機能を有する阻害剤を投与する段階を含む、対象においてＮＳＣＬＣを治療または予防する方法を提供することである：
ｉ．ＣＤＣＡ８とＡＵＲＫＢとの間の結合を阻害する；
ｉｉ．ＡＵＲＫＢによるＣＤＣＡ８のリン酸化を阻害する；ならびに
ｉｉｉ．ＣＤＣＡ８遺伝子およびＡＵＲＫＢ遺伝子のいずれか一方またはその両方の転写を阻害する。
本発明のなおさらなる目的は、以下からなる群より選択される少なくとも１つの機能を有する阻害剤の薬学的有効量から構成される、ＮＳＣＬＣを治療または予防するための組成物を提供することである：
ｉ．ＣＤＣＡ８とＡＵＲＫＢとの間の結合を阻害する；
ｉｉ．ＡＵＲＫＢによるＣＤＣＡ８のリン酸化を阻害する；ならびに
ｉｉｉ．ＣＤＣＡ８遺伝子およびＡＵＲＫＢ遺伝子のいずれか一方またはその両方の転写を阻害する。
本発明のこれらおよびその他の目的および特徴は、添付の図面および／または実施例と併せて下記の詳細な説明を読むことによって、より十分に明らかになるであろう。しかし、前述の発明の概要および下記の詳細な説明はいずれも好ましい態様のものであり、本発明または本発明のその他の代替的な態様を限定するものではないことが理解されるべきである。特に、本明細書において本発明をいくつかの特定の態様を参照しながら説明するが、説明は本発明を例証するものであり、本発明を限定するものと解釈されるべきではない。
添付の特許請求の範囲によって記載される本発明の精神および範囲から逸脱することなく、当業者は様々な変更および適用に思い至ることができる。同様に、本発明のその他の目的、特徴、利益、および利点は、本概要および下記に記載する特定の態様から明らかになると考えられ、かつ当業者に容易に明白であろう。そのような目的、特徴、利益、および利点は、添付の実施例、データ、図面、およびそれらから引き出されるすべての妥当な推論を、単独で、または本明細書に組み入れられる参考文献を考慮して組み合わせた場合に、上記から明白であろう。
本発明の様々な局面および適用は、下記の図面の簡単な説明ならびに発明の詳細な説明およびその好ましい態様を考慮することで、当業者に明白となるであろう。
肺腫瘍試料におけるＣＤＣＡ８タンパク質およびＡＵＲＫＢタンパク質の活性化を示す。Ａ部は、半定量的ＲＴ−ＰＣＲによって調べた、１４例のＮＳＣＬＣ（Ｔ）および対応する正常肺組織（Ｎ）の臨床試料におけるＣＤＣＡ８およびＡＵＲＫＢの発現を示す。臨床肺癌試料のｍＲＮＡから各一本鎖ｃＤＮＡの適切な希釈物を調製し、β−アクチン（ＡＣＴＢ）発現のレベルを定量的対照とした。Ｂ部は、ウェスタンブロット解析によって調べた、１１例の肺癌細胞株におけるＣＤＣＡ８タンパク質およびＡＵＲＫＢタンパク質の発現を示す。Ｃ部は、ノーザンブロット解析によって検出した、２３例の正常ヒト組織におけるＣＤＣＡ８の発現を示す。Ｄ部は、ＣＤＣＡ８またはＡＵＲＫＢに対するウサギポリクローナル抗体によって検出した、ＬＣ３１９細胞における内因性ＣＤＣＡ８（上部パネル）および内因性ＡＵＲＫＢ（下部パネル）の細胞内局在性を示す。いずれも、α−チューブリンおよびＤＡＰＩにより三重染色した（融合画像を参照されたい）。ＣＤＣＡ８またはＡＵＲＫＢは、ＤＡＰＩ染色位置で染色された。 ＣＤＣＡ８およびＡＵＲＫＢの過剰発現とＮＳＣＬＣの臨床転帰不良との関連を示す。Ａ部は、組織マイクロアレイ上で抗ＣＤＣＡ８ポリクローナル抗体（上部パネル）および抗ＡＵＲＫＢポリクローナル抗体（下部パネル）を用いて、外科切除したＳＣＣ組織由来の代表的試料を免疫組織化学的に評価した結果を示す（×１００）。Ｂ部は、組織マイクロアレイ上でのＣＤＣＡ８（上部左側パネル）、ＡＵＲＫＢ（上部右側パネル）、またはＣＤＣＡ８とＡＵＲＫＢの組み合わせ（下パネル）の発現に基づいた、腫瘍特異的生存期間のカプラン・マイヤー解析の結果を示す。 ＣＤＣＡ８に対するｓｉＲＮＡによる、肺癌細胞の増殖の阻害を示す。２つのｓｉ−ＣＤＣＡ８（ｓｉ−ＣＤＣＡ８−＃１およびｓｉ−ＣＤＣＡ８−＃２）ならびに２つの対照ｓｉＲＮＡ（ｓｉ−ＥＧＦＰおよびｓｉ−ルシフェラーゼ）による、ＬＣ３１９細胞におけるＣＤＣＡ８タンパク質発現に及ぼす遺伝子ノックダウン効果を示すウェスタンブロット解析の結果を上部パネルに示す。ｓｉ−ＣＤＣＡ８または対照プラスミドをトランスフェクションしたＬＣ３１９細胞のコロニー形成アッセイ（中間パネル）およびＭＴＴアッセイ（下パネル）の結果。エラーバーは、３回のアッセイの標準偏差を表す。 Ｅ２Ｆ−１によるＣＤＣＡ８およびＡＵＲＫＢの転写調節を示す。Ａ部（上部パネル）は、ヒトＣＤＣＡ８遺伝子の５’隣接領域のヌクレオチド配列および推定調節エレメント（ＣＤＥ−ＣＨＲ）を含む、ヒトＣＤＣＡ８遺伝子の５’隣接領域の構造を示す。公知のＣＤＣＡ８転写産物の最初のヌクレオチドを＋１とした。転写因子の推定結合エレメントを四角で囲んだ。Ａ部（下部パネル）は、その配列と、コンセンサスなＣＤＥ配列およびＣＨＲ配列との、ならびにヒトＡＵＲＫＢ、ヒトＣＣＮＤＡ、およびヒトＣＤＣ２５由来のプロモーターの配列とのアライメントを示す。Ｂ部は、半定量的ＲＴ−ＰＣＲによって調べた、１４例のＮＳＣＬＣ（Ｔ）および対応する正常肺組織（Ｎ）の臨床試料におけるＣＤＣＡ８、ＡＵＲＫＢ、およびＥ２Ｆ−１の発現を示す。Ｃ部は、Ｅ２Ｆ−１によって増強される、ヒトＣＤＣＡ８遺伝子およびヒトＡＵＲＫＢ遺伝子の５’隣接領域のプロモーター活性を示す。 ＡＵＲＫＢによるＣＤＣＡ８のリン酸化を示す。Ａ部は、λ−ホスファターゼを用いた処理による、ＬＣ３１９細胞における内因性ＣＤＣＡ８タンパク質の脱リン酸化を示す。白い矢印はリン酸化ＣＤＣＡ８を示し、黒い矢印は非リン酸化型を示す。Ｂ部は、組換えＡＵＲＫＢ（ｒｈＡＵＲＫＢ）による組換えＣＤＣＡ８（ｒｈＣＤＣＡ８）のインビトロリン酸化を示す。Ｃ部（上部パネル）は、ＡＵＲＫＢに対するｓｉＲＮＡ（ｓｉ−ＡＵＲＫＢ：ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３３）をトランスフェクションしたＬＣ３１９細胞における、ウェスタンブロット解析によって検出した、内因性のＡＵＲＫＢタンパク質およびＣＤＣＡ８タンパク質の発現レベルを示す。ｓｉ−ＡＵＲＫＢをトランスフェクションしたＬＣ３１９細胞における、半定量的ＲＴ−ＰＣＲによって検出した、内因性のＡＵＲＫＢ転写産物およびＣＤＣＡ８転写産物の発現レベルもまた示す。Ｃ部（下部パネル）は、ｓｉ−ＡＵＲＫＢ、ＡＵＲＫＢに対するｓｉＲＮＡオリゴ（＃１および＃２：ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５９および６０）をトランスフェクションしたＬＣ３１９細胞における、ウェスタンブロット解析によって検出した、内因性のＡＵＲＫＢタンパク質およびＣＤＣＡ８タンパク質の発現レベルを示す。ＡＵＲＫＢに対するｓｉＲＮＡオリゴ（＃１および＃２）をトランスフェクションしたＬＣ３１９細胞における、半定量的ＲＴ−ＰＣＲによって検出した、内因性のＡＵＲＫＢ転写産物およびＣＤＣＡ８転写産物の発現レベルもまた示す。 ＡＵＲＫＢによるＣＤＣＡ８上の直接接触リン酸化部位を同定する。Ａ部（上部パネル）は、推定セリン／スレオニンリン酸化部位をアラニンに置換した６つの全長組換えＣＤＣＡ８変異体を示す。各構築物は２つまたは３つの置換を含む（ＣＤＣＡ８Δ１、ＣＤＣＡ８Δ２、ＣＤＣＡ８Δ３、ＣＤＣＡ８Δ４、ＣＤＣＡ８Δ５、およびＣＤＣＡ８Δ６）。Ａ部（下部パネル）は、６つのセリン／スレオニン残基のいずれかをアラニン残基に置換した、さらなる６つの全長組換えＣＤＣＡ８変異体を示す（ＣＤＣＡ８Δ７、ＣＤＣＡ８Δ８、ＣＤＣＡ８Δ９、ＣＤＣＡ８Δ１０、ＣＤＣＡ８Δ１１、およびＣＤＣＡ８Δ１２）。Ｂ部は、野生型および変異体ＣＤＣＡ８タンパク質を組換えＡＵＲＫＢと共にインキュベートするインビトロキナーゼアッセイの結果を示す。ＣＤＣＡ８Δ１、ＣＤＣＡ８Δ３、およびＣＤＣＡ８Δ４は、野生型ＣＤＣＡ８と比較して同レベルのリン酸化を示したのに対し、ＣＤＣＡ８Δ２、ＣＤＣＡ８Δ５、およびＣＤＣＡ８Δ６構築物では、ＡＵＲＫＢによるリン酸化レベルが低下した（各置換残基を下線上の太字として示した）。Ｃ部に示されるように、ＣＤＣＡ８Δ７およびＣＤＣＡ８Δ１０は野生型と比較して同レベルのリン酸化を示したのに対し、ＣＤＣＡ８Δ８、ＣＤＣＡ８Δ９、ＣＤＣＡ８Δ１１、およびＣＤＣＡ８Δ１２ではリン酸化が減少し、これにより、ＣＤＣＡ８がＡＵＲＫＢによってＳｅｒ−１５４、Ｓｅｒ−２１９、Ｓｅｒ−２７５、およびＴｈｒ−２７８（下線上の太字として表示）の位置でリン酸化されたことが示された。Ｄ部は、野生型ＣＤＣＡ８タンパク質、および４つのセリン／スレオニンのすべてをアラニンに置換した変異体ＣＤＣＡ８タンパク質（ＣＤＣＡ８Δ１３）を、組換えＡＵＲＫＢと共にインキュベートしたインビトロキナーゼアッセイの結果を示す。ＣＤＣＡ８Δ１３構築物では、ＡＵＲＫＢによるＣＤＣＡ８リン酸化が完全に減少した。 細胞透過性ＣＤＣＡ８ペプチドによる肺癌細胞の増殖の阻害を示す。Ａ部は、インビトロキナーゼアッセイ法によって検出した、細胞透過性ＣＤＣＡ８ペプチド（１１Ｒ−ＣＤＣＡ８２６１〜２８０）によるＡＵＲＫＢ依存性ＣＤＣＡ８リン酸化の低下を示す。Ｂ部（上部パネル）は、１１Ｒ−ＣＤＣＡ８２６１〜２８０をトランスフェクションしたＬＣ３１９細胞のウェスタンブロット解析によって検出した、内因性ＣＤＣＡ８タンパク質の発現レベルを示す。Ｂ部（下部パネル）は、１１Ｒ−ＣＤＣＡ８２６１〜２８０をトランスフェクションしたＬＣ３１９細胞の半定量的ＲＴ−ＰＣＲ解析によって検出した、内因性ＣＤＣＡ８転写産物の発現レベルを示す。Ｃ部（上部パネル）は、１１Ｒ−ＣＤＣＡ８２６１〜２８０の増殖抑制効果を検出する、ＬＣ３１９細胞のＭＴＴアッセイの結果を示す。エラーバーは、３回のアッセイの標準偏差を表す。Ｃ部（下部パネル）は、１１Ｒ−ＣＤＣＡ８２６１〜２８０ペプチドまたはスクランブルペプチドで処理した後のＬＣ３１９細胞の細胞周期解析の結果を示す。Ｄ部（上部パネル）は、ウェスタンブロット解析によって調べた、肺癌細胞株ＬＣ３１９と比較した、正常ヒト肺線維芽細胞由来ＭＲＣ５細胞およびＣＣＤ１９−Ｌｕ細胞におけるＣＤＣＡ８タンパク質の発現を示す。Ｄ部（下部パネル）は、ＣＤＣＡ８タンパク質およびＡＵＲＫＢタンパク質をほとんど発現しないＭＲＣ５細胞に対して、１１Ｒ−ＣＤＣＡ８２６１〜２８０ペプチドのオフターゲット効果がないことを検出する、ＭＴＴアッセイの結果を示す。Ｅ部（上部パネル）は、ウェスタンブロット解析によって調べた、肺癌細胞株ＬＣ３１９と比較した、ヒト気管支上皮由来ＢＥＡＳ−２Ｂ細胞におけるＣＤＣＡ８タンパク質の発現を示す。Ｅ部（下部パネル）は、ＢＥＡＳ−２Ｂ細胞に対して、１１Ｒ−ＣＤＣＡ８２６１〜２８０ペプチドの有意な増殖抑制効果がないことを検出する、ＭＴＴアッセイの結果を示す。
発明の詳細な説明
本発明は、ＣＤＣＡ８とＡＵＲＫＢとの間の相互作用を標的とするスクリーニング方法および治療方法を提供することにより、癌治療の分野における進展を構成する。本明細書において詳細に論じるように、ＣＤＣＡ８およびＡＵＲＫＢの同時活性化、ならびにそれらの直接接触相互作用は、肺癌の進行において重要な役割を果たす。したがって、ＣＤＣＡ８もしくはＡＵＲＫＢまたはその両方の発現を阻害することによって、ＣＤＣＡ８とＡＵＲＫＢとの間の結合を阻害することによって、またはＡＵＲＫＢによるＣＤＣＡ８のリン酸化を阻害することによって、ＣＤＣＡ８−ＡＵＲＫＢ複合体の形成を直接または間接的に阻害する薬剤は、癌、より詳細には非小細胞肺癌の治療および／または予防において有用性を見出す。加えて、ＣＤＣＡ８および／またはＡＵＲＫＢの発現レベルは、肺癌の進行と相関し得る。
本発明の態様を実施または試験するにあたって、本明細書に記載の方法および材料と類似のまたは同等な任意の方法および材料を用いることができるが、好ましい方法、装置、および材料をここに記載する。しかしながら、本材料および方法について記載する前に、本明細書に記載の特定の分子、組成物、方法論、およびプロトコルは慣行的な実験および最適化に従って変更可能であるため、本発明がこれらに限定されないことが理解されるべきである。記載に使用する専門用語は特定の型または態様を説明する目的のためのみのものであり、添付の特許請求の範囲によってのみ限定される本発明の範囲を限定することは意図されないこともまた理解されるべきである。
特記しない限り、本明細書で使用する技術用語および科学用語はすべて、本発明が属する技術分野の当業者が通常理解している意味と同じ意味を有する。しかし、矛盾する場合には、定義も含め、本明細書が優先する。したがって、本発明との関連では、以下の定義が適用される。
本明細書において使用される語「１つの（ａ）」、「１つの（ａｎ）」、および「その（ｔｈｅ）」は、別に具体的に指示しない限り「少なくとも１つの」を意味する。
「有効な」という用語は、対象におけるＮＳＣＬＣのサイズ、罹患率、または転移能の低減をもたらす治療を意味する。ある治療が予防的に適用される場合、「有効な」とは、その治療が、ＮＳＣＬＣの発生を遅延もしくは予防するか、またはＮＳＣＬＣの臨床症状を緩和することを意味する。ＮＳＣＬＣの評価は、標準的な臨床的プロトコルを用いて実施することができる。さらに、治療の有効性は、ＮＳＣＬＣを診断または治療するための任意の公知の方法と関連して決定してもよい。例えば、ＮＳＣＬＣは、組織病理学的に、または慢性の咳、嗄声、喀血、体重減少、食欲低下、息切れ、喘鳴、気管支炎もしくは肺炎の発作の繰り返し、および胸痛など症候性異常を確認することによって、しばしば診断される。
本明細書において、「予防すること」という用語は、腫瘍の形成を遅延させるもしくは抑制するために、または癌の少なくとも１つの臨床症状を遅延させる、抑制する、もしくは緩和するために、薬剤を予防的に投与することを意味する。対象における腫瘍の状態の評価は、標準的な臨床的プロトコルを用いて行うことができる。予防的投与は、疾患または障害が妨げられるかまたはその進行が遅延されるように、疾患の明白な臨床症状が現れる前に行うことができる。したがって、本発明との関連において、「予防」は、疾患による死亡率または罹患率の負荷を軽減する任意の働きを包含する。予防は、一次、二次、および三次予防レベルで行われ得る。一次予防は疾患の発症を回避するのに対して、予防の二次および三次レベルは、疾患の進行および症状の出現を妨げること、ならびに機能を回復させることおよび疾患関連合併症を軽減することによって、既存の疾患の悪影響を軽減することを目的とした働きを包含する。したがって、本発明は、癌、特にＮＳＣＬＣの重症度を緩和することを目的とした、広範囲に及ぶ予防的治療法を包含する。
物質（例えば、ポリペプチド、抗体、ポリヌクレオチド等）に関連して本明細書で使用する「単離された」および「精製された」という用語は、その物質が、天然源中には含まれ得る少なくとも１つの物質を実質的に含まないということを示す。したがって、単離されたまたは精製された抗体とは、そのタンパク質（抗体）の由来元である細胞もしくは組織源に由来する、糖質、脂質、もしくは他の混入タンパク質などの細胞材料を実質的に含まないか、または化学合成した場合には化学的前駆体もしくは他の化学物質を実質的に含まない抗体を指す。
「細胞材料を実質的に含まない」という用語は、ポリペプチドがそこから単離されるかまたは組換えによって産生される細胞の細胞成分から該ポリペプチドが分離されている、ポリペプチドの調製物を含む。したがって、細胞材料を実質的に含まないポリペプチドは、約３０％、２０％、１０％、または５％（乾燥重量で）未満の異種タンパク質（本明細書では「混入タンパク質」とも称する）を有するポリペプチドの調製物を含む。ポリペプチドを組換えによって作製した場合、ポリペプチドはまた、好ましくは培養液を実質的に含まず、タンパク質調製物の体積の約２０％、１０％、または５％未満の培養液しか有しないポリペプチドの調製物を含む。ポリペプチドを化学合成によって作製した場合、ポリペプチドは好ましくは化学的前駆体または他の化学物質を実質的に含まず、タンパク質合成に関与した化学的前駆体または他の化学物質を、タンパク質調製物の体積の約３０％、２０％、１０％、５％（乾燥重量で）未満しか有しないポリペプチドの調製物を含む。特定のタンパク質調製物が単離されたまたは精製されたポリペプチドを含むことは、例えば、タンパク質調製物のドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）−ポリアクリルアミドゲル電気泳動およびそのゲルのクーマシーブリリアントブルー染色等の後に単一のバンドが出現することによって示され得る。好ましい態様において、本発明の抗体は単離されているかまたは精製されている。
ｃＤＮＡ分子などの「単離された」または「精製された」核酸分子は、組換え技術によって作製した場合には、他の細胞材料もしくは培養液を実質的に含まなくてよく、または化学合成した場合には、化学的前駆体もしくは他の化学物質を実質的に含まなくてよい。好ましい態様において、本発明の抗体をコードする核酸分子は単離されているかまたは精製されている。
「ポリペプチド」、「ペプチド」、および「タンパク質」という用語は本明細書で互換的に用いられ、アミノ酸残基の重合体を指す。本用語は、１つまたは複数のアミノ酸残基が、対応する天然アミノ酸の人工的な化学的模倣体などの修飾残基または非天然残基であるアミノ酸重合体、ならびに天然アミノ酸重合体に適用される。
「アミノ酸」という用語は、天然および合成アミノ酸、ならびに天然アミノ酸と同様に機能するアミノ酸類似体およびアミノ酸模倣体を指す。天然アミノ酸とは、遺伝暗号によってコードされるアミノ酸、ならびに細胞内で翻訳後に修飾されたアミノ酸（例えば、ヒドロキシプロリン、γ−カルボキシグルタミン酸、およびＯ−ホスホセリン）である。「アミノ酸類似体」という語句は、天然アミノ酸と同じ基本化学構造を有する（α炭素が水素、カルボキシ基、アミノ基、およびＲ基に結合している）が、修飾されたＲ基または修飾された骨格を有する化合物（例えば、ホモセリン、ノルロイシン、メチオニン、スルホキシド、メチオニンメチルスルホニウム）を指す。「アミノ酸模倣体」という語句は、一般的なアミノ酸とは異なる構造を有するが、同様の機能を有する化合物を指す。
アミノ酸は、本明細書において、ＩＵＰＡＣ−ＩＵＢ生化学命名法委員会（Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ Ｎｏｍｅｎｃｌａｔｕｒｅ Ｃｏｍｍｉｓｓｉｏｎ）の推奨する、一般に公知の３文字記号または１文字記号により参照され得る。
「ポリヌクレオチド」、「ヌクレオチド」、「核酸」、および「核酸分子」という用語は、特記しない限り互換的に用いられ、アミノ酸と同様に、一般に是認されている１文字コードにより参照される。アミノ酸と同様に、これらの用語は天然の核酸重合体および非天然の核酸重合体の両方を包含する。
本明細書で使用する「二本鎖分子」という用語は、例えば、短鎖干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ；例えば二本鎖リボ核酸（ｄｓＲＮＡ）または低分子ヘアピンＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ））、および短鎖干渉ＤＮＡ／ＲＮＡ（ｓｉＤ／Ｒ−ＮＡ；例えば、ＤＮＡとＲＮＡの二本鎖キメラ（ｄｓＤ／Ｒ−ＮＡ）またはＤＮＡとＲＮＡの低分子ヘアピンキメラ（ｓｈＤ／Ｒ−ＮＡ））を含む、標的遺伝子の発現を阻害する核酸分子を指す。
本明細書の他の箇所に記載されるように、本発明はＣＤＣＡ８およびＡＵＲＫＢの機能的同等物もまた意図する。本明細書において用いられる、参照タンパク質の「機能的同等物」とは、参照タンパク質と同等な生物活性、特に結合活性を有するポリペプチドである。本発明との関連において、「ＣＤＣＡ８の機能的同等物」という用語は、このタンパク質がＡＵＲＫＢによってリン酸化され得て、リン酸化部位を含むことを意味する。このタンパク質がリン酸化の標的であるかどうかは、本発明に従って決定することができる。例えば、ＣＤＣＡ８のリン酸化に適した条件下でポリペプチドをインキュベートし、リン酸化ＣＤＣＡ８レベルを検出することによって、ＣＤＣＡ８に対するキナーゼ活性を決定することができる。例えば、ＡＵＲＫＢによるＣＤＣＡ８の公知のリン酸化部位は、Ｓｅｒ−１５４、Ｓｅｒ−２１９、Ｓｅｒ−２７５、およびＴｈｒ−２７８残基である。好ましい態様において、ＣＤＣＡ８の機能的同等物はＡＵＲＫＢによってリン酸化されて、細胞増殖を促進し得る。細胞増殖を促進する活性もまた、本発明に従って評価することができる。一方、「ＡＵＲＫＢの機能的同等物」という用語は、このタンパク質がキナーゼ活性を有すること、より好ましくはこのタンパク質がＣＤＣＡ８またはその機能的同等物をリン酸化し得ることを意味する。好ましい態様において、ＡＵＲＫＢの機能的同等物はＣＤＣＡ８をリン酸化して、細胞増殖を促進し得る。
したがって、本発明との関連において、「ＣＤＣＡ８遺伝子」という語句は、ＣＤＣＡ８タンパク質またはＣＤＣＡ８タンパク質の任意の機能的同等物をコードするポリヌクレオチドを包含する。同様に、「ＡＵＲＫＢ遺伝子」という語句は、ＡＵＲＫＢタンパク質またはＡＵＲＫＢタンパク質の任意の機能的同等物をコードするポリヌクレオチドを包含する。
本明細書で使用する「抗体」という用語は、抗体を合成するために使用した抗原またはそれと近縁の抗原とのみ相互作用する（すなわち、結合する）、特異的構造を有する免疫グロブリン分子を指す。本発明との関連において、抗体は、ＣＤＣＡ８遺伝子またはＡＵＲＫＢ遺伝子によってコードされるタンパク質に結合する限り、抗体の断片または改変抗体であってもよい。
本発明との関連において、２つのタンパク質間の「結合の阻害」とは、タンパク質間の結合を少なくとも減少させることを指す。したがって、場合によっては、試料中の結合対の割合は、適切な（例えば、試験化合物で処理していない、または非癌試料由来の、または癌試料に由来の）対照と比較して減少する。結合しているタンパク質の量の減少は、例えば、対照試料中で結合している対の９０％、８０％、７０％、６０％、５０％、４０％、２５％、１０％、５％、１％未満、またはそれよりも低くてよい（例えば０％）。
ＮＳＣＬＣを治療または予防するための化合物のスクリーニング
上記の通り、本発明の過程において、ＮＳＣＬＣ細胞においてＣＤＣＡ８がＡＵＲＫＢと相互作用することが発見された。したがって、本発明は、ＮＳＣＬＣの治療および／または予防に適した化合物をスクリーニングする方法を提供する。または、ＮＳＣＬＣの治療および／または予防に適した候補化合物を、本発明によって同定することができる。そのような方法は、以下の段階を含む：
（ａ）試験化合物の存在下で、ＡＵＲＫＢポリペプチドまたはその機能的同等物をＣＤＣＡ８ポリペプチドまたはその機能的同等物と接触させる段階；
（ｂ）段階（ａ）のポリペプチド間の結合を試験する段階；および
（ｃ）ＡＵＲＫＢポリペプチドとＣＤＣＡ８ポリペプチドと間の結合を阻害する試験化合物を選択する段階。
本発明との関連において、ＣＤＣＡ８ポリペプチドまたはＡＵＲＫＢポリペプチドの機能的同等物は、それぞれＣＤＣＡ８ポリペプチド（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２）またはＡＵＲＫＢポリペプチド（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４）と同等な生物活性を有するポリペプチドである。
ＡＵＲＫＢによるＣＤＣＡ８のリン酸化を阻害する化合物をスクリーニングする方法として、当業者に周知の多くの方法を使用することができる。例えば、細胞系などのインビトロアッセイ系を用いて、スクリーニングを行うことができる。
本発明はまた、ＡＵＲＫＢがＣＤＣＡ８に対するキナーゼ活性を有するという発見に基づく。例えば、ＡＵＲＫＢによるＣＤＣＡ８のリン酸化部位は、Ｓｅｒ−１５４、Ｓｅｒ−２１９、Ｓｅｒ−２７５、およびＴｈｒ−２７８残基である。したがって、１つの局面において、本発明は、ＡＵＲＫＢが媒介するＣＤＣＡ８のリン酸化を調節する試験化合物を同定することを含む。したがって、本発明は、ＮＳＣＬＣの治療および／または予防に適した化合物をスクリーニングする方法を提供する。または、ＮＳＣＬＣの治療および／または予防に適した候補化合物を、本発明によって同定することができる。そのような方法は、以下の段階を含む：
（ａ）ＡＵＲＫＢによるＣＤＣＡ８のリン酸化に適した条件下において、試験化合物の存在下でＣＤＣＡ８とＡＵＲＫＢをインキュベートする段階であって、
ＣＤＣＡ８が、
ｉ．ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２（ＣＤＣＡ８）のアミノ酸配列を有するポリペプチド、
ｉｉ．ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２のアミノ酸配列からなるポリペプチドと同等な生物活性を有するという条件で、１つまたは複数のアミノ酸が置換、欠失、または挿入されたＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２のアミノ酸配列を有する、ポリペプチド、
ｉｉｉ．ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２のアミノ酸配列からなるポリペプチドと同等な生物活性を有するという条件で、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１のヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチドにストリンジェントな条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチドによってコードされる、ポリペプチド
からなる群より選択されるポリペプチドであり、かつ
ＡＵＲＫＢが、
ｉ．ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４（ＡＵＲＫＢ）のアミノ酸配列を有するポリペプチド、
ｉｉ．ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４のアミノ酸配列からなるポリペプチドと同等な生物活性を有するという条件で、１つまたは複数のアミノ酸が置換、欠失、または挿入されたＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４のアミノ酸配列を有する、ポリペプチド、
ｉｉｉ．ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４のアミノ酸配列からなるポリペプチドと同等な生物活性を有するという条件で、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３のヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチドにストリンジェントな条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチドによってコードされる、ポリペプチド
からなる群より選択されるポリペプチドである、段階；
（ｂ）ＣＤＣＡ８のリン酸化レベルを検出する段階；
（ｃ）ＣＤＣＡ８のリン酸化レベルを対照レベルと比較する段階；および
（ｄ）対照レベルと比較してＣＤＣＡ８のリン酸化レベルを低下させる化合物を選択する段階。
本明細書において、非小細胞肺癌（ＮＳＣＬＣ）の治療および／または予防に適した化合物をスクリーニングする方法は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２のアミノ酸配列のＳｅｒ−１５４、Ｓｅｒ−２１９、Ｓｅｒ−２７５、およびＴｈｒ−２７８残基、またはそのポリペプチドの相同位置からなる群より選択される１つまたは複数のリン酸化部位におけるＣＤＣＡ８のリン酸化レベルを決定する段階を含み得る。
本発明の別の局面では、ＮＳＣＬＣの治療および／または予防に適した化合物をスクリーニングするためのキットもまた提供される。キットは任意に以下の構成要素を含む：
（ａ）
ｉ．ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２（ＣＤＣＡ８）のアミノ酸配列を有するポリペプチド、
ｉｉ．ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２のアミノ酸配列のポリペプチドと同等な生物活性を有するという条件で、１つまたは複数のアミノ酸が置換、欠失、または挿入されたＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２のアミノ酸配列を有する、ポリペプチド、および
ｉｉｉ．ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２のアミノ酸配列のポリペプチドと同等な生物活性を有するという条件で、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１のヌクレオチド配列のポリヌクレオチドにストリンジェントな条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチドによってコードされる、ポリペプチド
からなる群より選択されるポリペプチド；
（ｂ）
ｉ．ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４（ＡＵＲＫＢ）のアミノ酸配列を有するポリペプチド、
ｉｉ．ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４のアミノ酸配列のポリペプチドと同等な生物活性を有するという条件で、１つまたは複数のアミノ酸が置換、欠失、または挿入されたＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４のアミノ酸配列を有する、ポリペプチド、および
ｉｉｉ．ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４のアミノ酸配列のポリペプチドと同等な生物活性を有するという条件で、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３のヌクレオチド配列のポリヌクレオチドにストリンジェントな条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチドによってコードされる、ポリペプチド
からなる群より選択されるポリペプチド；ならびに
（ｃ）ＣＤＣＡ８のリン酸化レベルを検出するための試薬。
さらに、本発明はまた、ＮＳＣＬＣの治療および／または予防に適した化合物をスクリーニングするためのキットを提供する。キットは任意に以下の構成要素を含む：
（ａ）
ｉ．ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２（ＣＤＣＡ８）のアミノ酸配列を有するポリペプチド、
ｉｉ．ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２のアミノ酸配列のポリペプチドと同等な生物活性を有するという条件で、１つまたは複数のアミノ酸が置換、欠失、または挿入されたＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２のアミノ酸配列を有する、ポリペプチド、
ｉｉｉ．ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２のアミノ酸配列のポリペプチドと同等な生物活性を有するという条件で、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１のヌクレオチド配列のポリヌクレオチドにストリンジェントな条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチドによってコードされる、ポリペプチド
からなる群より選択されるポリペプチドを発現する細胞；および
（ｂ）ＣＤＣＡ８のリン酸化レベルを検出するための試薬。
さらに、ＮＳＣＬＣの治療および／または予防に適した化合物をスクリーニングするためのキットは、以下からなる群より選択されるポリペプチドをさらに発現する細胞を任意に含み得る：
ｉ．ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４（ＡＵＲＫＢ）のアミノ酸配列を有するポリペプチド；
ｉｉ．ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４のアミノ酸配列のポリペプチドと同等な生物活性を有するという条件で、１つまたは複数のアミノ酸が置換、欠失、または挿入されたＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４のアミノ酸配列を有する、ポリペプチド；および
ｉｉｉ．ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４のアミノ酸配列のポリペプチドと同等な生物活性を有するという条件で、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３のヌクレオチド配列のポリヌクレオチドにストリンジェントな条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチドによってコードされる、ポリペプチド。
別の局面において、キットに用いられる細胞はＮＳＣＬＣ細胞である。
本発明において、キットはリン酸供与体をさらに含み得る。本発明のキットはまた、リン酸化ＣＤＣＡ８を検出するための試薬として、ＣＤＣＡ８のリン酸化Ｓｅｒ−２７５、Ｓｅｒ−２１９、Ｓｅｒ−２７５、およびＴｈｒ−２７８を認識する抗体を含み得る。結果として、本発明は、ＣＤＣＡ８のリン酸化レベルを検出するための試薬が、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２のアミノ酸配列のＳｅｒ−１５４、Ｓｅｒ−２１９、Ｓｅｒ−２７５、およびＴｈｒ−２７８残基からなる群より選択されるリン酸化部位のいずれか１つにおけるリン酸化を認識する抗体である、ＮＳＣＬＣの治療および／または予防に適した化合物をスクリーニングするためのキットもまた提供する。さらに、本発明は、薬学的に許容される担体と組み合わせた、ＣＤＣＡ８に対するＡＵＲＫＢのキナーゼ活性を低下させる化合物の薬学的有効量から構成される、非小細胞肺癌（ＮＳＣＬＣ）を治療または予防するための組成物もまた提供する。
本発明との関連において、ＡＵＲＫＢによるＣＤＣＡ８のリン酸化に適した条件は、リン酸供与体、例えばＡＴＰの存在下における、ＣＤＣＡ８とＡＵＲＫＢのインキュベーションによって提供され得る。ＡＵＲＫＢによるＣＤＣＡ８リン酸化に適した条件はまた、ＡＵＲＫＢのポリペプチドを発現する細胞を培養する段階を含む。例えば、その細胞は、該ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含む発現ベクターを有する形質転換細胞であってよい。インキュベーション後、リン酸化ＣＤＣＡ８を認識する抗体を用いて、ＣＤＣＡ８のリン酸化レベルを検出することができる。
リン酸化ＣＤＣＡ８を検出する前に、ＣＤＣＡ８を他の要素、またはＣＤＣＡ８発現細胞の細胞溶解物から分離することができる。例えば、残りの成分からＣＤＣＡ８を分離するには、ゲル電気泳動を使用することができる。または、抗ＣＤＣＡ８抗体を有する担体とＣＤＣＡ８を接触させることによって、ＣＤＣＡ８を捕獲することも可能である。標識リン酸供与体を使用する場合には、標識を追跡することによってＣＤＣＡ８のリン酸化レベルを検出することができる。例えば、放射標識ＡＴＰ（例えば、３２Ｐ−ＡＴＰ）をリン酸供与体として使用する場合、分離されたＣＤＣＡ８の放射活性はＣＤＣＡ８のリン酸化レベルと相関する。または、非リン酸化ＣＤＣＡ８からリン酸化ＣＤＣＡ８を特異的に認識する抗体を用いて、リン酸化ＣＤＣＡ８を検出することも可能である。好ましくは、この抗体は、Ｓｅｒ−１５４、Ｓｅｒ−２１９、Ｓｅｒ−２７５、およびＴｈｒ−２７８残基のいずれかにおけるリン酸化ＣＤＣＡ８を認識する。
さらに、本発明はまた、ＡＵＲＫＢによるリン酸化ＣＤＣＡ８が分解を回避し得るという発見に基づく。より具体的には、ＣＤＣＡ８タンパク質の量は、ＡＵＲＫＢタンパク質の発現レベルがｓｉＲＮＡによって低下する細胞において劇的に減少するが、同じ細胞内のＣＤＣＡ８転写産物のレベルはｓｉ−ＡＵＲＫＢによって影響されないことが確認された（図５Ｃ、下部パネル）。したがって、ＣＤＣＡ８ポリペプチドの量は、ＮＳＣＬＣの治療および／または予防に適した化合物のスクリーニングの好ましい指標である。または、ＮＳＣＬＣの治療および／または予防に適した候補化合物を、本発明によって同定することができる。そのような方法は、以下の段階を含む：
（ａ）非リン酸化ＣＤＣＡ８の分解に適した条件下において、試験化合物の存在下でＣＤＣＡ８とＡＵＲＫＢをインキュベートする段階であって、
ＣＤＣＡ８が、
ｉ．ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２（ＣＤＣＡ８）のアミノ酸配列を有するポリペプチド、
ｉｉ．ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２のアミノ酸配列からなるポリペプチドと同等な生物活性を有するという条件で、１つまたは複数のアミノ酸が置換、欠失、または挿入されたＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２のアミノ酸配列を有する、ポリペプチド、
ｉｉｉ．ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２のアミノ酸配列からなるポリペプチドと同等な生物活性を有するという条件で、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１のヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチドにストリンジェントな条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチドによってコードされる、ポリペプチド
からなる群より選択されるポリペプチドであり；
ＡＵＲＫＢが、
ｉ．ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４（ＡＵＲＫＢ）のアミノ酸配列を有するポリペプチド、
ｉｉ．ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４のアミノ酸配列からなるポリペプチドと同等な生物活性を有するという条件で、１つまたは複数のアミノ酸が置換、欠失、または挿入されたＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４のアミノ酸配列を有する、ポリペプチド、
ｉｉｉ．ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４のアミノ酸配列からなるポリペプチドと同等な生物活性を有するという条件で、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３のヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチドにストリンジェントな条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチドによってコードされる、ポリペプチド
からなる群より選択されるポリペプチドである、段階；
（ｂ）ＣＤＣＡ８の量を検出する段階；
（ｃ）ＣＤＣＡ８の量を、試験薬剤の非存在下などの対照量と比較する段階；および
（ｄ）対照と比較してＣＤＣＡ８の量を減少させる化合物を選択する段階。
本発明との関連において、非リン酸化ＣＤＣＡ８の分解に適した条件は、非リン酸化ＣＤＣＡ８タンパク質を特異的に切断するプロテアーゼの存在下における、ＣＤＣＡ８とＡＵＲＫＢのインキュベーションによって提供され得る。本発明において、ＣＤＣＡ８が、そのリン酸化を通してプロテアーゼによる切断に対する抵抗性を獲得した場合、プロテアーゼは非リン酸化ＣＤＣＡ８を特異的に切断する。または、ＣＤＣＡ８に対する切断活性がＣＤＣＡ８のリン酸化によって低下するプロテアーゼを、本発明において非リン酸化ＣＤＣＡ８特異的プロテアーゼと定義することができる。好ましい態様において、非リン酸化ＣＤＣＡ８特異的プロテアーゼの切断活性は、リン酸化によって、非リン酸化ＣＤＣＡ８の切断活性と比較して、例えば５０％もしくはそれよりも低く、好ましくは６０％もしくはそれよりも低く、より好ましくは７０％または８０％もしくはそれよりも低く低下する。例えば、ユビキチンプロテアーゼ系成分は、好ましい非リン酸化ＣＤＣＡ８特異的プロテアーゼである。
いくつかの好ましい態様では、ＡＵＲＫＢによるＣＤＣＡ８のリン酸化、および非リン酸化ＣＤＣＡ８の分解の両方に適した条件下において、ＣＤＣＡ８とＡＵＲＫＢを試験化合物と共にインキュベートすることができる。そのような条件は、それらのポリペプチドを発現する細胞またはその溶解物を培養することによって提供され得る。例えば、細胞は、該ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含む発現ベクターを有する形質転換細胞であってよい。試験化合物とのインキュベーション後、ＣＤＣＡ８を認識する抗体を用いて、ＣＤＣＡ８の量を検出することができる。例えば、本発明では、免疫測定法またはウェスタンブロットアッセイ法をＣＤＣＡ８の検出に適用することができる。
ＡＵＲＫＢによるＣＤＣＡ８のリン酸化を特異的に妨げる化合物を同定するために、上記のスクリーニング方法の前または後に、さらなるスクリーニングを実施することができる。例えば、スクリーニングの前または後にＡＵＲＫＢに結合する化合物を選択することにより、ＡＵＲＫＢの機能を阻害する候補化合物を同定することができる。そのような化合物は、試験化合物をＡＵＲＫＢまたはその断片と接触させ、ＡＵＲＫＢまたはその断片に結合する化合物を同定することによって選択することができる。または、ＣＤＣＡ８転写産物の量を決定することによって、試験化合物がＣＤＣＡ８の発現レベルに影響するかどうかを確認することも可能である。
さらに、本発明はまた、ＮＳＣＬＣの治療および／または予防に適した化合物をスクリーニングするためのキットを提供する。キットは任意に以下の構成要素を含む：
（ａ）
ｉ．ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２（ＣＤＣＡ８）のアミノ酸配列を含むポリペプチド；
ｉｉ．ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２のアミノ酸配列からなるポリペプチドと同等な生物活性を有するという条件で、１つまたは複数のアミノ酸が置換、欠失、または挿入されたＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２のアミノ酸配列を含む、ポリペプチド；
ｉｉｉ．ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２のアミノ酸配列からなるポリペプチドと同等な生物活性を有するという条件で、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１のヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチドにストリンジェントな条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチドによってコードされる、ポリペプチド
からなる群より選択されるポリペプチドを発現する細胞；および
（ｂ）ＣＤＣＡ８のレベルを検出するための試薬。
さらに、ＮＳＣＬＣの治療および／または予防に適した化合物をスクリーニングするためのキットは、以下からなる群より選択されるポリペプチドをさらに発現する細胞を任意に含み得る：
ｉ．ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４（ＡＵＲＫＢ）のアミノ酸配列を含むポリペプチド；
ｉｉ．ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４のアミノ酸配列からなるポリペプチドと同等な生物活性を有するという条件で、１つまたは複数のアミノ酸が置換、欠失、または挿入されたＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４のアミノ酸配列を含む、ポリペプチド；および
ｉｉｉ．ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４のアミノ酸配列からなるポリペプチドと同等な生物活性を有するという条件で、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３のヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチドにストリンジェントな条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチドによってコードされる、ポリペプチド。
好ましくは、ＣＤＣＡ８およびＡＵＲＫＢまたはそれらの機能的同等物を発現する細胞はＮＳＣＬＣ細胞である。
ＣＤＣＡ８を検出する前に、ＣＤＣＡ８を他の要素、またはＣＤＣＡ８発現細胞の細胞溶解物から分離することができる。例えば、残りの成分からＣＤＣＡ８を分離するには、ゲル電気泳動を使用することができる。または、ＣＤＣＡ８を特異的に認識する抗体を用いて、ＣＤＣＡ８を検出することができる。
所与のタンパク質と機能的に同等なポリペプチドを調製する方法は当業者に周知であり、これには、タンパク質中に変異を導入する公知の方法が含まれる。一般的に、タンパク質中の１つまたは複数のアミノ酸の改変は、該タンパク質の機能に影響しないことが知られている（Mark DF et al., Proc Natl Acad Sci USA 1984, 81: 5662-6; Zoller MJ & Smith M, Nucleic Acids Res 1982, 10: 6487-500; Wang A et al., Science 1984, 224:1431-3; Dalbadie-McFarland G et al., Proc Natl Acad Sci USA 1982, 79: 6409-13）。実際に、変異したまたは改変されたタンパク質、すなわち特定のアミノ酸配列の１つまたは複数のアミノ酸残基の置換、欠失、挿入、および／または付加によって改変されたアミノ酸配列を有するタンパク質は、元の生物活性を保持することが知られている（Mark et al., Proc Natl Acad Sci USA 81: 5662-6 (1984); Zoller and Smith, Nucleic Acids Res 10:6487-500 (1982); Dalbadie-McFarland et al., Proc Natl Acad Sci USA 79: 6409-13 (1982)）。したがって、当業者は、単一アミノ酸または少数のアミノ酸を変更する、アミノ酸配列に対する個々の付加、欠失、挿入、もしくは置換、またはタンパク質の変化により類似の機能を有するタンパク質が生じる「保存的改変」であるとみなされるものが、本発明との関連で意図されることを認識するであろう。
例えば当業者は、ＣＤＣＡ８またはＡＵＲＫＢと機能的に同等なポリペプチドを、例えば部位特異的突然変異誘発を用いて、これらのタンパク質のいずれかのアミノ酸配列中に適切な変異を導入することによって調製することができる（Hashimoto-Gotoh et al., Gene 152:271-5 (1995); Zoller and Smith, Methods Enzymol 100: 468-500 (1983); Kramer et al., Nucleic Acids Res. 12:9441-56 (1984); Kramer and Fritz, Methods Enzymol 154: 350-67 (1987); Kunkel, Proc Natl Acad Sci USA 82: 488-92 (1985); Kunkel TA, et al., Methods Enzymol. 1991;204:125-39）。本発明のポリペプチドには、結果として生じる変異ポリペプチドがそれぞれＣＤＣＡ８またはＡＵＲＫＢと機能的に同等であるという条件で、１つまたは複数のアミノ酸が変異しているＣＤＣＡ８またはＡＵＲＫＢのアミノ酸配列を有するポリペプチドが含まれる。タンパク質の活性が維持される限り、アミノ酸変異の数は特に限定されない。しかしながら、アミノ酸配列の５％またはそれ未満を変更することが一般的に好ましい。したがって、好ましい態様において、このような変異体において変異させるアミノ酸の数は、一般的には３０アミノ酸またはそれ未満、典型的には２０アミノ酸またはそれ未満、より典型的には１０アミノ酸またはそれ未満、好ましくは５〜６アミノ酸またはそれ未満、およびより好ましくは１〜３アミノ酸である。
変異させるアミノ酸残基は、好ましくはアミノ酸側鎖の特性が保存される異なるアミノ酸に変異させられる（保存的アミノ酸置換として公知のプロセス）。アミノ酸側鎖の特性の例は、疎水性アミノ酸（Ａ、Ｉ、Ｌ、Ｍ、Ｆ、Ｐ、Ｗ、Ｙ、Ｖ）、親水性アミノ酸（Ｒ、Ｄ、Ｎ、Ｃ、Ｅ、Ｑ、Ｇ、Ｈ、Ｋ、Ｓ、Ｔ）、ならびに以下の官能基または特徴を共通に有する側鎖：脂肪族側鎖（Ｇ、Ａ、Ｖ、Ｌ、Ｉ、Ｐ）；ヒドロキシル基を含む側鎖（Ｓ、Ｔ、Ｙ）；硫黄原子を含む側鎖（Ｃ、Ｍ）；カルボン酸およびアミドを含む側鎖（Ｄ、Ｎ、Ｅ、Ｑ）；塩基を含む側鎖（Ｒ、Ｋ、Ｈ）；および芳香族を含む側鎖（Ｈ、Ｆ、Ｙ、Ｗ）である。括弧内の文字はアミノ酸の一文字表記を示すことに留意されたい。さらに、機能的に類似したアミノ酸を提供する保存的置換表が、当技術分野において周知である。例えば、以下の８群はそれぞれ、互いに保存的置換であるアミノ酸を含む：
（１）アラニン（Ａ）、グリシン（Ｇ）；
（２）アスパラギン酸（Ｄ）、グルタミン酸（Ｅ）；
（３）アスパラギン（Ｎ）、グルタミン（Ｑ）；
（４）アルギニン（Ｒ）、リジン（Ｋ）；
（５）イソロイシン（Ｉ）、ロイシン（Ｌ）、メチオニン（Ｍ）、バリン（Ｖ）；
（６）フェニルアラニン（Ｆ）、チロシン（Ｙ）、トリプトファン（Ｗ）；
（７）セリン（Ｓ）、スレオニン（Ｔ）；および
（８）システイン（Ｃ）、メチオニン（Ｍ）（例えば、Creighton, Proteins 1984を参照されたい）。
そのような保存的改変ポリペプチドは、本ＣＤＣＡ８タンパク質または本ＡＵＲＫＢタンパク質に含まれる。しかしながら、本発明はこれらに限定されず、ＣＤＣＡ８タンパク質およびＡＵＲＫＢタンパク質には、元のタンパク質の結合活性が保持される限り、非保存的改変物が含まれる。さらに、改変タンパク質は、多型変種、種間相同体、およびこれらのタンパク質の対立遺伝子によってコードされるものを排除しない。
ＣＤＣＡ８またはＡＵＲＫＢのアミノ酸配列に１つまたは複数のアミノ酸残基を付加したポリペプチドの例は、ＣＤＣＡ８またはＡＵＲＫＢをそれぞれ含む融合タンパク質である。したがって、融合タンパク質、すなわちＣＤＣＡ８またはＡＵＲＫＢおよび他のペプチドまたはタンパク質の融合物が、本発明に含まれる。当業者に周知の技術によって、例えばＣＤＣＡ８またはＡＵＲＫＢをコードするＤＮＡを、フレームが合致するように、他のペプチドもしくはタンパク質をコードするＤＮＡと連結し、その融合ＤＮＡを発現ベクター中に挿入し、かつ宿主中でそれを発現させることによって、融合タンパク質を作製することができる。本発明のタンパク質に融合されるペプチドまたはタンパク質に関して制限はない。
ＣＤＣＡ８タンパク質またはＡＵＲＫＢタンパク質と融合させるペプチドとして用いることができる公知のペプチドには、例えば、ＦＬＡＧ（Hopp TP et al., Biotechnology 1988 6: 1204-10）、６個のＨｉｓ（ヒスチジン）残基を含む６×Ｈｉｓ、１０×Ｈｉｓ、インフルエンザ凝集素（ＨＡ）、ヒトｃ−ｍｙｃ断片、ＶＳＰ−ＧＰ断片、ｐ１８ＨＩＶ断片、Ｔ７タグ、ＨＳＶタグ、Ｅタグ、ＳＶ４０Ｔ抗原断片、ｌｃｋタグ、α−チューブリン断片、Ｂタグ、プロテインＣ断片等が含まれる。本発明のタンパク質と融合させることができるタンパク質の例には、ＧＳＴ（グルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ）、インフルエンザ凝集素（ＨＡ）、免疫グロブリン定常領域、β−ガラクトシダーゼ、ＭＢＰ（マルトース結合タンパク質）等が含まれる。
融合タンパク質は、上記の融合ペプチドまたは融合タンパク質をコードする市販のＤＮＡを、ＣＤＣＡ８タンパク質またはＡＵＲＫＢタンパク質をコードするＤＮＡと融合させ、調製された融合ＤＮＡを発現させることによって調製することができる。
機能的に等価なポリペプチドを単離するための当技術分野において公知の代替方法は、例えばハイブリダイゼーション技術（Sambrook et al., Molecular Cloning 2nd ed. 9.47-9.58, Cold Spring Harbor Lab.Press(1989)）を含む。当業者は、ＣＤＣＡ８またはＡＵＲＫＢ（すなわち、それぞれＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１およびＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３）と高い相同性を有するＤＮＡを容易に単離することができ、単離したＤＮＡから、ＣＤＣＡ８またはＡＵＲＫＢと機能的に等価なポリペプチドを単離することができる。本発明のタンパク質には、ＣＤＣＡ８またはＡＵＲＫＢをコードするＤＮＡ配列の全体または一部とハイブリダイズするＤＮＡによってコードされ、かつＣＤＣＡ８またはＡＵＲＫＢと機能的に等価であるものが含まれる。これらのポリペプチドには、ヒト由来のタンパク質に対応する哺乳動物のホモログ（例えば、サル、ラット、ウサギ、およびウシの遺伝子によってコードされたポリペプチド）が含まれる。動物由来のＣＤＣＡ８またはＡＵＲＫＢをコードするＤＮＡとの相同性が高いｃＤＮＡを単離する際、肺癌組織を使用することが特に好ましい。
ヒトＣＤＣＡ８タンパク質またはヒトＡＵＲＫＢタンパク質と機能的に同等なタンパク質をコードするＤＮＡを単離するためのハイブリダイゼーションの条件は、当業者によって慣行的に選択され得る。「ストリンジェントな（ハイブリダイゼーション）条件」という語句は、典型的には核酸の複雑な混合物中で、核酸分子がその標的配列とはハイブリダイズするが、その他の配列とは検出可能な程度にハイブリダイズしない条件を指す。ストリンジェントな条件は配列に依存し、種々の状況によって異なる。配列が長いほど、より高い温度で特異的にハイブリダイズする。核酸のハイブリダイゼーションに関する広範な手引きは、Tijssen, Techniques in Biochemistry and Molecular Biology--Hybridization with Nucleic Probes, 「Overview of principles of hybridization and the strategy of nucleic acid assays」(1993)において見出される。本発明との関連において、適切なハイブリダイゼーション条件は当業者によって慣行的に選択され得る。
一般的に、ストリンジェントな条件は、所定のイオン強度、ｐＨにおいて、特定の配列に対する融解温度（Ｔｍ）より約５〜１０℃低くなるよう選択される。Ｔｍとは、平衡状態で、標的に相補的なプローブの５０％が標的配列とハイブリダイズする（所定のイオン強度、ｐＨ、および核酸濃度における）温度である（標的配列が過剰に存在する場合、Ｔｍでは、平衡状態でプローブの５０％が占有される）。ストリンジェントな条件はまた、ホルムアミドなどの不安定化剤を添加することによって達成してもよい。選択的または特異的ハイブリダイゼーションに関して、陽性シグナルは好ましくはバックグラウンドの少なくとも２倍、より好ましくはバックグラウンドハイブリダイゼーションの１０倍である。
例示的なストリンジェントなハイブリダイゼーション条件には、以下のものが含まれる：５０％ホルムアミド、５×ＳＳＣ、および１％ ＳＤＳ、４２℃でのインキュベーション、または５×ＳＳＣ、１％ ＳＤＳ、６５℃でのインキュベーション、ならびに０．２×ＳＳＣおよび０．１％ ＳＤＳ、５０℃での洗浄。適切なハイブリダイゼーション条件には、「Ｒａｐｉｄ−ｈｙｂ緩衝液」（Ａｍｅｒｓｈａｍ ＬＩＦＥ ＳＣＩＥＮＣＥ）を使用する６８℃での３０分間またはそれ以上のプレハイブリダイゼーション、標識プローブの添加、および６８℃での１時間またはそれ以上の加温もまた含まれ得る。
洗浄段階は、例えば低ストリンジェンシー条件下で行うことができる。したがって、例示的な低ストリンジェンシー条件には、例えば、４２℃、２×ＳＳＣ、０．１％ ＳＤＳ、または好ましくは５０℃、２×ＳＳＣ、０．１％ ＳＤＳが含まれる。また、例示的な高ストリンジェンシー条件には、例えば、室温における２×ＳＳＣ、０．０１％ ＳＤＳ中での２０分間の洗浄３回、その後の３７℃における１×ＳＳＣ、０．１％ ＳＤＳ中での２０分間の洗浄３回、および５０℃における１×ＳＳＣ、０．１％ ＳＤＳ中での２０分間の洗浄２回が含まれる。しかし、温度および塩濃度などのいくつかの要因はハイブリダイゼーションのストリンジェンシーに影響を及ぼし得るため、当業者は必要なストリンジェンシーを得るためにこれらの要因を適切に選択することができる。
好ましくは、機能的に等価なポリペプチドは、本明細書において開示される天然のＣＤＣＡ８またはＡＵＲＫＢの配列との相同性（配列同一性とも呼ばれる）が少なくとも約８０％、より好ましくは相同性が少なくとも約８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％であるアミノ酸配列を有する。ポリペプチドの相同性は、「Wilbur and Lipman, Proc Natl Acad Sci USA 80:726-30(1983)」のアルゴリズムに従って決定することができる。他の態様において、機能的に等価なポリペプチドは、（下記に定義する）ストリンジェントな条件下で、そのような機能的に等価なポリペプチドをコードするポリヌクレオチドにハイブリダイズするポリヌクレオチドによってコードされ得る。
ハイブリダイゼーションの代わりに、遺伝子増幅法、例えばポリメラーゼ連鎖反応法（ＰＣＲ）を使用し、ＣＤＣＡ８またはＡＵＲＫＢの配列情報に基づいて合成されたプライマーを用いて、ＣＤＣＡ８またはＡＵＲＫＢと機能的に等価なポリペプチドをコードするＤＮＡを単離することができる。
本発明との関連において有用なＣＤＣＡ８またはＡＵＲＫＢの機能的等価物は、それを作製するために使用する細胞もしくは宿主または使用する精製方法によって、アミノ酸配列、分子量、等電点、糖鎖の有無、または形態における変形を有してもよい。それでもなお、ＣＤＣＡ８ポリペプチドまたはＡＵＲＫＢポリペプチドいずれかの機能的等価物である限り、それは本発明の範囲内である。
いくつかの好ましい態様において、ＣＤＣＡ８ポリペプチドの機能的等価物は、ＡＵＲＫＢ結合ドメインに対応するアミノ酸配列、例えばＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５のアミノ酸配列（ＮＩＫＫＬＳＮＲＬＡＱＩＣＳＳＩＲＴＨＫ）を含み得る。同様に、ＡＵＲＫＢポリペプチドの機能的等価物は、ＣＤＣＡ８結合ドメインに対応するアミノ酸配列を含み得る。
上述したように、ＣＤＣＡ８とＡＵＲＫＢとの結合を阻害すると、細胞増殖が抑制される。さらに、ＡＵＲＫＢによるＣＤＣＡ８のリン酸化を阻害すると、細胞増殖が抑制される。したがって、この結合過程またはリン酸化過程を阻害する化合物は、ＮＳＣＬＣを治療または予防するための薬剤として役立つ可能性がある。
本発明のスクリーニング方法に使用するＣＤＣＡ８ポリペプチドおよびＡＵＲＫＢポリペプチドは、組換えポリペプチドもしくは天然由来のタンパク質でよく、または完全長タンパク質の結合能力またはリン酸化能力を保持する限り、その部分ペプチドでもよい。結合能力またはリン酸化能力を保持するこのような部分ペプチドは、本明細書において「機能的等価物」と呼ばれる。スクリーニング方法において使用するＣＤＣＡ８ポリペプチドおよびＡＵＲＫＢポリペプチドは、例えば、精製したポリペプチド、可溶性タンパク質、担体に結合した形態、または他のポリペプチドと融合した融合タンパク質であり得る。
ＣＤＣＡ８とＡＵＲＫＢとの結合を阻害する化合物をスクリーニングする方法として、当業者に周知の多くの方法を使用することができる。例えば、スクリーニングは、細胞系のようなインビトロのアッセイ系を用いて実施することができる。より具体的には、最初にＣＤＣＡ８またはＡＵＲＫＢのいずれかを支持体に結合させ、他のタンパク質を試験化合物と共にそこへ添加してもよい。次に、この混合物をインキュベートし、洗浄し、支持体に結合した他のタンパク質を検出および／または測定してもよい。
タンパク質を結合するのに使用され得る支持体の例には、例えばアガロース、セルロース、およびデキストランなどの不溶性多糖、ならびにポリアクリルアミド、ポリスチレン、およびシリコンなどの合成樹脂が含まれ；好ましくは、上記の材料から調製される市販のビーズおよびプレート（例えば、マルチウェルプレート、バイオセンサーチップなど）を使用してもよい。ビーズを使用する場合、これらをカラム中に充填してもよい。また、磁性ビーズの使用も当技術分野において公知であり、これにより、磁気を介してビーズに結合したタンパク質を容易に単離することが可能になる。
支持体へのタンパク質の結合は、例えば化学的結合および物理的吸着などの常法に従って実施してよい。または、タンパク質は、そのタンパク質を特異的に認識する抗体を介して支持体に結合され得る。さらに、支持体へのタンパク質の結合は、アビジンおよびビオチンを用いて実施することもできる。
タンパク質間の結合は、好ましくは緩衝液中で実施され、緩衝液の例には、リン酸緩衝液およびトリス緩衝液が含まれるがこれらに限定されない。しかしながら、選択される緩衝液は、タンパク質間の結合を阻害してはならない。
本発明との関連において、表面プラズモン共鳴現象を使用するバイオセンサーは、結合したタンパク質を検出または定量するための手段として使用され得る。このようなバイオセンサーを使用する場合、タンパク質間の相互作用は、ごくわずかな量のポリペプチドを用い、かつ標識せずに表面プラズモン共鳴シグナルとしてリアルタイムで観察することができる（例えば、ＢＩＡｃｏｒｅ、Ｐｈａｒｍａｃｉａ）。したがって、ＢＩＡｃｏｒｅのようなバイオセンサーを用いてＣＤＣＡ８とＡＵＲＫＢとの結合を評価することが可能である。
ＣＤＣＡ８またはＡＵＲＫＢのいずれかを標識してもよく、結合したタンパク質の標識を使用して、結合したタンパク質を検出または測定してもよい。具体的には、これらのタンパク質のうち１種を前標識した後、標識されたタンパク質を、試験化合物の存在下でもう一方のタンパク質と接触させ、次いで、洗浄後に、結合したタンパク質を標識に従って検出または測定してもよい。
本発明との関連において使用するのに適している標識物質は、放射性同位体（例えば、３Ｈ、１４Ｃ、３２Ｐ、３３Ｐ、３５Ｓ、１２５Ｉ、１３１Ｉ）、酵素（例えば、アルカリホスファターゼ、西洋ワサビペルオキシダーゼ、β−ガラクトシダーゼ、β−グルコシダーゼ）、蛍光性物質（例えば、フルオレセインイソチオシアネート（ＦＩＴＣ）、ローダミン）、およびビオチン／アビジンを含むがこれらに限定されない。タンパク質が放射性同位体で標識される場合、検出または測定は液体シンチレーションによって実施することができる。または、酵素で標識されたタンパク質は、酵素の基質を添加して、色の生成のような基質の酵素的変化を吸光光度計で検出することによって、検出または測定することができる。さらに、蛍光物質を標識として使用する場合は、蛍光光度計を用いて結合したタンパク質を検出または測定してもよい。
さらに、ＣＤＣＡ８とＡＵＲＫＢの結合は、ＣＤＣＡ８またはＡＵＲＫＢに対する抗体を用いて検出または測定することもできる。例えば、支持体上に固定されたＣＤＣＡ８ポリペプチドを試験化合物およびＡＵＲＫＢと接触させた後、この混合物をインキュベートおよび洗浄し、かつＡＵＲＫＢに対する抗体を用いて検出および測定を実施することができる。または、ＡＵＲＫＢを支持体上に固定してよく、ＣＤＣＡ８に対する抗体をその抗体として使用してもよい。
本発明のスクリーニング方法との関連において抗体を使用する場合、好ましくは抗体を、前述の標識物質の１つで標識し、標識物質に基づいて検出または測定する。または、ＣＤＣＡ８もしくはＡＵＲＫＢに対する抗体を、標識物質で標識した二次抗体で検出される一次抗体として使用してもよい。さらに、本発明のスクリーニングにおいてタンパク質に結合する抗体は、プロテインＧカラムまたはプロテインＡカラムを用いて検出または測定してもよい。
本発明のスクリーニング方法の別の態様において、細胞を利用するツーハイブリッドシステムを使用してもよい（「ＭＡＴＣＨＭＡＫＥＲ Ｔｗｏ−Ｈｙｂｒｉｄ ｓｙｓｔｅｍ」、「Ｍａｍｍａｌｉａｎ ＭＡＴＣＨＭＡＫＥＲ Ｔｗｏ−Ｈｙｂｒｉｄ Ａｓｓａｙ Ｋｉｔ」、「ＭＡＴＣＨＭＡＫＥＲ ｏｎｅ−Ｈｙｂｒｉｄ ｓｙｓｔｅｍ」（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）；「ＨｙｂｒｉＺＡＰ Ｔｗｏ−Ｈｙｂｒｉｄ Ｖｅｃｔｏｒ Ｓｙｓｔｅｍ」（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）；参考文献：「Dalton and Treisman, Cell 68:597-612(1992)」、「Fields and Sternglanz, Trends Genet 10:286-92(1994)」）。
ツーハイブリッドシステムでは、例えばＣＤＣＡ８ポリペプチドは、ＳＲＦ結合領域またはＧＡＬ４結合領域に融合され、酵母細胞において発現される。ＣＤＣＡ８ポリペプチドに結合するＡＵＲＫＢポリペプチドは、ＶＰ１６またはＧＡＬ４の転写活性化領域に融合され、同様に試験化合物の存在下で酵母細胞において発現される。または、ＡＵＲＫＢポリペプチドをＳＲＦ結合領域またはＧＡＬ４結合領域に融合し、かつＣＤＣＡ８ポリペプチドをＶＰ１６またはＧＡＬ４の転写活性化領域に融合してもよい。試験化合物がＣＤＣＡ８とＡＵＲＫＢとの結合を阻害しない場合、これら２つの結合はレポーター遺伝子を活性化し、陽性クローンが検出可能になる。レポーター遺伝子として、ＨＩＳ３遺伝子に加え、適切な例には、Ａｄｅ２遺伝子、ｌａｃＺ遺伝子、ＣＡＴ遺伝子、ルシフェラーゼ遺伝子などが含まれるが、これらに限定されない。
本発明のスクリーニング方法はレポーターアッセイ系を含み得る。そのようなスクリーニング方法に必要なレポーター構築物は、ＣＤＣＡ８遺伝子またはＡＵＲＫＢ遺伝子の転写調節領域およびレポーター遺伝子をベクターに導入することによって調製することができる。次いでベクターを宿主細胞に導入し、様々な試験化合物の影響下で、レポーター遺伝子の発現レベルまたは活性を対照と比較して測定することができる。適切なレポーター遺伝子および宿主細胞は、当技術分野において周知である。
転写調節領域は、例えば、ＣＤＣＡ８遺伝子またはＡＵＲＫＢ遺伝子のプロモーター配列であってよい。スクリーニングに必要なレポーター構築物は、ＣＤＣＡ８遺伝子またはＡＵＲＫＢ遺伝子の転写調節領域にレポーター遺伝子配列を結合することによって調製することができる。本明細書におけるＣＤＣＡ８遺伝子またはＡＵＲＫＢ遺伝子の転写調節領域は、開始コドンから少なくとも上流５００ ｂｐ、好ましくは上流１０００ ｂｐ、より好ましくは上流５０００または１００００ ｂｐまでの領域である。転写調節領域を含むヌクレオチドセグメントは、ゲノムライブラリから単離することができ、またはＰＣＲによって増殖させることができる。転写調節領域を同定する方法、およびまたアッセイプロトコルは周知である（Molecular Cloning third edition chapter 17, 2001, Cold Springs Harbor Laboratory Press）。
さらに、ＣＤＣＡ８遺伝子またはＡＵＲＫＢ遺伝子それぞれの転写調節領域の配列は当業者に公知である。例えば、ＣＤＣＡ８遺伝子またはＡＵＲＫＢ遺伝子の５’隣接領域から選択され、かつＥ２Ｆ−１結合モチーフを含むヌクレオチド配列を、転写調節領域として使用することができる。本発明との関連において、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５６などのポリヌクレオチド配列をＡＵＲＫＢプロモーター配列として使用することができ、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５７などのポリヌクレオチド配列をＣＤＣＡ８プロモーター配列として使用することができる。実際に、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５６および５７のヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチド配列は、それぞれＡＵＲＫＢおよびＣＤＣＡ８の好ましいプロモーター配列を構成する。本発明との関連において、例えば、レポーター構築物は、公知のレポーター構築物のプロモーター領域をＡＵＲＫＢ遺伝子またはＣＤＣＡ８遺伝子のプロモーター領域と置換することによって調製することができる。
任意の試験化合物、例えば細胞抽出物、細胞培養上清液、発酵微生物の産物、海洋生物からの抽出物、植物抽出物、精製タンパク質または粗製タンパク質、ペプチド、非ペプチド化合物、合成低分子化合物、および天然化合物が、本発明のスクリーニング方法との関連において使用することができる。本発明の試験化合物はまた、
（１）生物ライブラリ、
（２）空間的にアドレス可能なパラレルな固相ライブラリまたは液相ライブラリ、
（３）デコンボリューションを必要とする合成ライブラリ法、
（４）「１ビーズ１化合物」ライブラリ法、および
（５）アフィニティクロマトグラフィー選別を使用する合成ライブラリ法
を含む、当技術分野において公知のコンビナトリアルライブラリ法における多数のアプローチのいずれかを用いて得ることもできるが、これらに限定されない。
アフィニティクロマトグラフィー選別を使用する生物ライブラリ法は、ペプチドライブラリに限定されるが、他の４種のアプローチは、ペプチドライブラリ、非ペプチドオリゴマーライブラリ、または化合物の小分子ライブラリに適用可能である（Lam, Anticancer Drug Des 12:145-67(1997)）。分子ライブラリの合成方法の例は、当技術分野において見出すことができる（DeWitt et al., Proc. Natl. Acad. Sci.USA 1993 Aug 1; 90(15):6909-13; Erb et al., Proc. Natl. Acad. Sci.USA 91:11422-6(1994); Zuckermann et al., J.Med.Chem. 37:2678-85(1994); Cho et al., Science 261:1303-5(1993); Carell et al., Angew.Chem.Int.Ed.Engl. 33:2059(1994); Carell et al., Angew.Chem.Int.Ed.Engl. 33:2061(1994); Gallop et al., J.Med.Chem. 37:1233-51(1994)）。
化合物のライブラリは、溶液中（Houghten, Bio/Techniques 13:412-21(1992)を参照されたい）、またはビーズ上（Lam, Nature 354:82-4(1991)）、チップ上（Fodor, Nature 364:555-6(1993)）、細菌上（米国特許第５，２２３，４０９号）、胞子上（米国特許第５，５７１，６９８号、第５，４０３，４８４号、および第５，２２３，４０９号）、プラスミド上（Cull et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89:1865-9(1992)）、もしくはファージ上（Scott and Smith, Science 249:386-90(1990); Devlin, Science 249:404-6(1990); Cwirla et al., Proc. Natl. Acad. Sci.USA 87:6378-82(1990); Felici, J.Mol.Biol. 222:301-10(1991)；米国特許出願第２００２０１０３３６０号）に提示され得る。本発明のスクリーニング方法によって細胞またはタンパク質に曝露される試験化合物は、単一の化合物または化合物の組み合わせであってよい。化合物の組み合わせを本発明のスクリーニング方法において使用する場合、これらの化合物を逐次的にまたは同時に接触させてもよい。
本発明のスクリーニング方法によって単離された化合物は、ＣＤＣＡ８およびＡＵＲＫＢの活性を阻害する薬物の候補であり、このような薬物は、例えばＮＳＣＬＣなどの細胞増殖性疾患に起因する疾患の治療および／または予防に適している。例えば、本発明のスクリーニング方法によって単離された化合物は、
ｉ．ＣＤＣＡ８とＡＵＲＫＢとの間の結合を阻害する；
ｉｉ．ＡＵＲＫＢによるＣＤＣＡ８のリン酸化を阻害する；
ｉｉｉ．ＣＤＣＡ８遺伝子およびＡＵＲＫＢ遺伝子のいずれか一方またはその両方の転写を阻害する；ならびに
ｉｖ．ＡＵＲＫＢによるＣＤＣＡ８安定化を阻害する、
からなる群より選択される少なくとも１つの機能を有する可能性があり、かつ
そのような化合物は、例えばＮＳＣＬＣなどの細胞増殖性疾患に起因する疾患を治療または予防するために使用することができる。
本発明の本スクリーニング方法によって得られた化合物の構造の一部分が、付加、欠失、および／または置換によって変換されている化合物は、本発明のスクリーニング方法によって得られる化合物に含まれる。過剰発現された遺伝子、すなわちＣＤＣＡ８遺伝子およびＡＵＲＫＢ遺伝子の発現の抑制に有効な化合物は、臨床的な利益を有するとみなされ、動物モデルもしくは試験対象において癌細胞増殖を低減させるか、または防止する能力についてさらに試験され得る。
本発明はまた、ＣＤＣＡ８ポリペプチドまたはＡＵＲＫＢポリペプチドに結合してそれらの間の相互作用を阻害するタンパク質のスクリーニングも含み得る。このために、当業者に周知の多くの方法を使用することができる。このようなスクリーニングは、例えば当技術分野において周知の方法を用いる免疫沈降アッセイ法により実施することができる。
本発明のタンパク質は、標準的な方法を用いて組換えにより作製することができる。例えば、関心対象のポリペプチドをコードする遺伝子を、ｐＳＶ２ｎｅｏ、ｐｃＤＮＡ Ｉ、ｐｃＤＮＡ３．１、ｐＣＡＧＧＳ、およびｐＣＤ８など外来遺伝子用の発現ベクター中にその遺伝子を挿入することによって、動物細胞において発現させてもよい。発現に使用するプロモーターは、一般に使用され得る任意のプロモーターでよく、例えばＳＶ４０初期プロモーター（Rigby, Williamson(編), Genetic Engineering, vol. 3.Academic Press, London, 83-141,(1982)）、ＥＦ−αプロモーター（Kim et al., Gene 91, 217-23(1990)）、ＣＡＧプロモーター（Niwa et al., Gene 108:193-9(1991)）、ＲＳＶ ＬＴＲプロモーター（Cullen, Methods in Enzymology 152:684-704(1987)）、ＳＲαプロモーター（Takebe et al., Mol Cell Biol 8:466-72(1988)）、ＣＭＶ最初期プロモーター（Seed and Aruffo, Proc Natl Acad Sci USA 84:3365-9(1987)））、ＳＶ４０後期プロモーター（Gheysen and Fiers, J Mol Appl Genet 1:385-94(1982)）、アデノウイルス後期プロモーター（Kaufman et al., Mol Cell Biol 9:946-58(1989)）、ＨＳＶ ＴＫプロモーターなどが含まれる。
外来遺伝子を発現させるための、動物細胞中への遺伝子の導入は、任意の従来の方法、例えばエレクトロポレーション法（Chu et al., Nucleic Acids Res 15:1311-26(1987)）、リン酸カルシウム法（Chen and Okayama, Mol Cell Biol 7:2745-52(1987)）、ＤＥＡＥデキストラン法(Lopata et al., Nucleic Acids Res 12:5707-17(1984); Sussman and Milman, Mol Cell Biol 4:1641-3(1984)）、リポフェクチン法（Derijard B, Cell 76:1025-37(1994); Lamb et al., Nature Genetics 5:22-30(1993): Rabindran et al., Science 259:230-4(1993)）などに従って実施することができる。
ポリペプチドはまた、特異性が明らかにされているモノクローナル抗体のエピトープをポリペプチドのＮ末端またはＣ末端に導入することによって、モノクローナル抗体の認識部位（エピトープ）を含む融合タンパク質としても発現させることができる。市販されているエピトープ−抗体系もまた、使用することができる（Experimental Medicine 13:85-90(1995)）。例えば、β−ガラクトシダーゼ、マルトース結合タンパク質、グルタチオンＳ−トランスフェラーゼ、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）などとの融合タンパク質を、そのマルチクローニング部位を用いることにより発現できるベクターが市販されている。
上記のように、融合によって元のポリペプチドの特性を変更しないように、数個〜数十個のアミノ酸から構成される小さなエピトープのみを導入することによって調製した融合タンパク質もまた、本明細書において提供される。ポリヒスチジン（Ｈｉｓ−タグ）、インフルエンザ凝集体ＨＡ、ヒトｃ−ｍｙｃ、ＦＬＡＧ、水疱性口内炎ウイルス糖タンパク質（ＶＳＶ−ＧＰ）、Ｔ７遺伝子１０タンパク質（Ｔ７−タグ）、ヒト単純ヘルペスウイルス糖タンパク質（ＨＳＶ−タグ）、Ｅ−タグ（モノクローナルファージ上のエピトープ）などのエピトープ、ならびにそれらを認識するモノクローナル抗体が、ＣＤＣＡ８ポリペプチドまたはＡＵＲＫＢポリペプチドに結合するタンパク質をスクリーニングするためのエピトープ−抗体系として使用され得る（Experimental Medicine 13:85-90(1995)）。
免疫沈降法では、適切な界面活性剤を用いて調製した細胞溶解物にこれらの抗体を添加することにより、免疫複合体が形成される。免疫複合体は、ＣＤＣＡ８ポリペプチドまたはＡＵＲＫＢポリペプチド、ＣＤＣＡ８ポリペプチドまたはＡＵＲＫＢポリペプチドに対する結合親和力を有するポリペプチド、および抗体から構成されてもよい。免疫沈降法はまた、上記のエピトープに対する抗体に加え、ＣＤＣＡ８ポリペプチドまたはＡＵＲＫＢポリペプチドに対する抗体を用いて実施することもでき、これらの抗体は、従来の方法に従って調製することができ、かつモノクローナル抗体またはポリクローナル抗体などの任意の形態でよく、例えばウサギなどの動物をそのポリペプチドで免疫することによって得られる抗血清、全クラスのポリクローナル抗体およびモノクローナル抗体、ならびに組換え抗体（例えばヒト化抗体）が含まれる。
具体的には、ＣＤＣＡ８ポリペプチドまたはＡＵＲＫＢポリペプチドに対する抗体は、当技術分野において周知の技術を用いて調製することができる。例えば、抗体を得るために抗原として使用するＣＤＣＡ８ポリペプチドまたはＡＵＲＫＢポリペプチドは、任意の動物種に由来してよいが、好ましくはヒト、マウス、ウサギ、またはラットなどの哺乳動物、より好ましくはヒトに由来する。抗原として使用するポリペプチドは、組換えによって作製するか、または天然源から単離することができる。本発明との関連において、免疫抗原として使用するポリペプチドは、完全なタンパク質またはＣＤＣＡ８ポリペプチドもしくはＡＵＲＫＢポリペプチドの部分ペプチドであってよい。
任意の哺乳動物を抗原で免疫してよい。しかしながら好ましくは、細胞融合に使用する親細胞との適合性が考慮される。一般に、げっ歯目（Ｒｏｄｅｎｔｉａ）、ウサギ目（Ｌａｇｏｍｏｒｐｈａ）、または霊長目（Ｐｒｉｍａｔｅ）の動物を使用する。げっ歯目の動物には、例えばマウス、ラット、およびハムスターが含まれる。ウサギ目の動物には、例えばノウサギ、ナキウサギ、およびイエウサギが含まれる。霊長目の動物には、例えばカニクイザル（Ｍａｃａｃａ ｆａｓｃｉｃｕｌａｒｉｓ）、アカゲザル、マントヒヒ、およびチンパンジーなどの狭鼻下目（Ｃａｔａｒｒｈｉｎｉ）のサル（旧世界ザル）が含まれる。
動物を抗原で免疫するための方法は、当技術分野において周知である。抗原の腹腔内注射または皮下注射は、哺乳動物を免疫するための標準的な方法である。より具体的には、抗原は、適切な量のリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）、生理食塩水などに希釈および懸濁してもよい。所望の場合、抗原懸濁液を、適切な量のフロイント完全アジュバントのような標準的なアジュバントと混合し、エマルジョンにし、次いで哺乳動物に投与してよい。好ましくは、それに続いて、適切な量のフロイント不完全アジュバントと混合した抗原を４日〜２１日毎に数回投与する。適切な担体もまた、免疫化のために使用され得る。前述の免疫化の後、標準的な方法により、所望の抗体の量の増加に関して血清を検査する。
ＣＤＣＡ８ポリペプチドまたはＡＵＲＫＢポリペプチドに対するポリクローナル抗体は、血清中の所望の抗体の増加に関して検査した免疫化哺乳動物から血液を採取することによって、および任意の従来の方法によりその血液から血清を分離することによって、調製してもよい。ポリクローナル抗体には、ポリクローナル抗体を含む血清、ならびに該血清から単離されたポリクローナル抗体を含む画分が含まれる。免疫グロブリンＧまたは免疫グロブリンＭは、ＣＤＣＡ８ポリペプチドまたはＡＵＲＫＢポリペプチドのみを認識する画分から、例えばそのポリペプチドが結合したアフィニティカラムを用い、さらにプロテインＡカラムまたはプロテインＧカラムを用いてこの画分を精製して、調製することができる。
モノクローナル抗体を調製するために、前述したように抗原で免疫し、かつ血清中の所望の抗体のレベルの上昇を確認した哺乳動物から免疫細胞を採取し、かつそれらを細胞融合に供する。細胞融合のために使用する免疫細胞は、好ましくは脾臓から得られる。上記の免疫細胞と融合される他の好ましい親細胞には、例えば哺乳動物の骨髄腫細胞、およびより好ましくは、薬物によって融合された細胞の選択のための獲得された性質を有する骨髄腫細胞が含まれる。
上記の免疫細胞および骨髄腫細胞は、公知の方法、例えばＭｉｌｓｔｅｉｎらの方法（Galfre and Milstein, Methods Enzymol 73:3-46(1981)）に従って融合することができる。
細胞融合により得られる、結果として生じるハイブリドーマは、ＨＡＴ培地（ヒポキサンチン、アミノプテリン、およびチミジンを含む培地）のような標準的な選択培地中でそれらを培養することによって選択することができる。典型的に、ＨＡＴ培地中で数日間〜数週間、所望のハイブリドーマを除く他の細胞（非融合細胞）すべてを死滅させるのに充分な期間、細胞培養を継続する。次いで、標準的な限界希釈を実施して、所望の抗体を産生するハイブリドーマ細胞をスクリーニングおよびクローニングする。
ハイブリドーマを調製するために非ヒト動物を抗原で免疫する上記の方法に加えて、ＥＢウイルスに感染させたものなどのヒトリンパ球を、ＣＤＣＡ８ポリペプチドもしくはＡＵＲＫＢポリペプチド、このようなポリペプチドを発現する細胞、またはそれらの溶解物によりインビトロで免疫してもよい。次いで、免疫されたリンパ球を、Ｕ２６６のような無制限に分裂することができるヒト由来骨髄腫細胞と融合させて、ＣＤＣＡ８ポリペプチドまたはＡＵＲＫＢポリペプチドに結合できる所望のヒト抗体を産生するハイブリドーマを得る（特開昭（ＪＰ−Ａ）６３−１７６８８号）。
続いて、得られたハイブリドーマをマウスの腹腔中に移植し、腹水を取り出してよい。得られたモノクローナル抗体は、例えば硫酸アンモニウム沈殿法、プロテインＡカラムもしくはプロテインＧカラム、ＤＥＡＥイオン交換クロマトグラフィー、または本発明の標的タンパク質（ＣＤＣＡ８ポリペプチドもしくはＡＵＲＫＢポリペプチド）のいずれかが結合したアフィニティカラムによって、精製することができる。この抗体は、本発明のスクリーニング方法においてだけでなく、ＣＤＣＡ８ポリペプチドまたはＡＵＲＫＢポリペプチドの精製および検出のためにも使用することができる。それらはさらに、関心対象のポリペプチドのアゴニストおよびアンタゴニストの候補にもなり得る。さらに、アンタゴニストの候補となるこのような抗体は、後述のＮＳＣＬＣを含むＣＤＣＡ８ポリペプチドまたはＡＵＲＫＢポリペプチドに関係した疾患の抗体治療に適用することができる。
このようにして得られるモノクローナル抗体は、遺伝子工学技術を用いて組換えによって調製することもできる（例えば、MacMillan Publishers LTDによって英国で出版されたBorrebaeck and Larrick, Therapeutic Monoclonal Antibodies(1990)を参照されたい）。例えば、ある抗体をコードするＤＮＡを、その抗体を産生するハイブリドーマまたは免疫化リンパ球などの免疫細胞からクローニングし、適切なベクター中に挿入し、かつ宿主細胞中に導入して、組換え抗体を調製してよい。このような組換え抗体は、本発明のスクリーニングとの関連においても使用することができる。
さらに、スクリーニングなどにおいて使用する抗体は、ＣＤＣＡ８およびＡＵＲＫＢの一方または両方に結合する限り、抗体断片または修飾抗体であってよい。例えば、抗体断片は、Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆｖ、またはＨ鎖およびＬ鎖由来のＦｖ断片が適切なリンカーによって連結される単鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）であってよい（Huston et al., Proc Natl Acad Sci USA 85:5879-83(1988)）。より具体的には、抗体断片は、パパインまたはペプシンなどの酵素で抗体を処理することによって作製してもよい。または、抗体断片をコードする遺伝子を構築し、発現ベクター中に挿入し、かつ適切な宿主細胞中で発現させてもよい（例えば、Co et al., J Immunol 152:2968-76(1994); Better and Horwitz, Methods Enzymol 178:476-96(1989); Pluckthun and Skerra, Methods Enzymol 178:497-515(1989); Lamoyi, Methods Enzymol 121:652-63(1986); Rousseaux et al., Methods Enzymol 121:663-9(1986); Bird and Walker, Trends Biotechnol 9:132-7(1991)を参照されたい）。
抗体は、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）のような様々な分子と結合させることによって、修飾してもよい。修飾抗体は、抗体を化学的に修飾することによって得ることができる。これらの修飾方法は、当技術分野において常套である。
また、抗体は、非ヒト抗体由来の可変領域とヒト抗体由来の定常領域とのキメラ抗体として、または非ヒト抗体由来の相補性決定領域（ＣＤＲ）、ヒト抗体由来のフレームワーク領域（ＦＲ）、および定常領域から構成されるヒト化抗体として、得ることもできる。このような抗体は、公知の技術を用いて調製することができる。
ヒト化は、げっ歯動物のＣＤＲまたはＣＤＲ配列で、ヒト抗体の対応する配列を置換することによって実施することができる（例えば、Verhoeyen et al., Science 239:1534-6(1988)を参照されたい）。したがって、このようなヒト化抗体は、実質的に完全ではないヒト可変ドメインが、非ヒト種由来の対応する配列によって置換されるキメラ抗体である。ヒトのフレームワーク領域および定常領域に加えて、ヒト可変領域から構成される完全なヒト抗体もまた使用することができる。このような抗体は、当技術分野において公知の様々な技術を用いて作製することができる。例えば、インビトロの方法は、バクテリオファージ上に提示されたヒト抗体断片の組換えライブラリの使用を含む（例えば、Hoogenboom and Winter, J.Mol.Biol. 227:381-8(1992)）。同様に、ヒト抗体は、ヒト免疫グロブリン遺伝子座をトランスジェニック動物、例えば内在性の免疫グロブリン遺伝子が部分的または完全に不活性化されたマウスに導入することによって、作製することができる。このアプローチは、例えば米国特許第６，１５０，５８４号、第５，５４５，８０７号、第５，５４５，８０６号、第５，５６９，８２５号、第５，６２５，１２６号、第５，６３３，４２５号、第５，６６１，０１６号において記載されている。
前述のように得られた抗体を、均一になるまで精製してよい。例えば、抗体の分離および精製は、一般のタンパク質に対して使用する分離方法および精製方法に従って実施することができる。例えば抗体は、適切に選択し組み合わせた、アフィニティクロマトグラフィーのようなカラムクロマトグラフィー、ろ過、限外ろ過、塩析、透析、ＳＤＳポリアクリルアミドゲル電気泳動、等電点電気泳動などによって、分離および単離してもよい（Antibodies:A Laboratory Manual. Ed Harlow and David Lane, Cold Spring Harbor Laboratory(1988)）。しかしながら、本発明はこれらに限定されない。プロテインＡカラムおよびプロテインＧカラムをアフィニティカラムとして使用することができる。使用する例示的なプロテインＡカラムには、例えばＨｙｐｅｒ Ｄ、ＰＯＲＯＳ、およびセファロース Ｆ．Ｆ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）が含まれる。
アフィニティクロマトグラフィー以外に、例示的なクロマトグラフィーには、例えばイオン交換クロマトグラフィー、疎水性クロマトグラフィー、ゲルろ過、逆相クロマトグラフィー、吸着クロマトグラフィーなどが含まれる（Strategies for Protein Purification and Characterization:A Laboratory Course Manual. Ed Daniel R.Marshak et al., Cold Spring Harbor Laboratory Press(1996)）。クロマトグラフィーの方法は、ＨＰＬＣおよびＦＰＬＣなどの液相クロマトグラフィーによって実施することができる。
抗体がマウスＩｇＧ抗体である場合、免疫複合体は、例えばプロテインＡセファロースまたはプロテインＧセファロースを用いて沈殿させることができる。ＣＤＣＡ８ポリペプチドまたはＡＵＲＫＢポリペプチドが、ＧＳＴのようなエピトープとの融合タンパク質として調製される場合、グルタチオン−セファロース４Ｂのような、これらのエピトープに特異的に結合する物質を用いて、ＣＤＣＡ８ポリペプチドまたはＡＵＲＫＢポリペプチドに対する抗体を使用する場合と同じ様式で、免疫複合体を形成することができる。
免疫沈降法は、例えば文献（Harlow and Lane, Antibodies, 511-52, Cold Spring Harbor Laboratory publications, New York(1988)）中の方法にならって、または従って、実施することができる。
ＳＤＳ−ＰＡＧＥは、免疫沈降させたタンパク質の解析に通常使用され、結合したタンパク質は、適切な濃度のゲルを用いてそのタンパク質の分子量によって解析することができる。ＣＤＣＡ８ポリペプチドまたはＡＵＲＫＢポリペプチドに結合するタンパク質は、クーマシー染色または銀染色など従来の染色方法で検出することが困難であるため、このタンパク質に対する検出感度は、放射性同位体である３５Ｓ−メチオニンまたは ３５Ｓ−システインを含む培地中で細胞を培養し、細胞中のタンパク質を標識し、これらのタンパク質を検出することによって向上させることができる。標的タンパク質は、ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲルから直接精製することができ、そのタンパク質の分子量が明らかにされた場合は、その配列を決定することができる。
ＣＤＣＡ８ポリペプチドまたはＡＵＲＫＢポリペプチドに結合する化合物もまた、アフィニティクロマトグラフィーを用いてスクリーニングすることができる。例えば、ＣＤＣＡ８ポリペプチドまたはＡＵＲＫＢポリペプチドは、アフィニティカラムの担体上に固定してもよく、試験化合物をそのカラムに添加する。本明細書における試験化合物は、例えば細胞抽出物、細胞溶解物などであってよい。試験化合物を添加した後、カラムを洗浄し、ＣＤＣＡ８ポリペプチドまたはＡＵＲＫＢポリペプチドに結合した化合物を調製することができる。
試験化合物がタンパク質である場合、得られたタンパク質のアミノ酸配列を解析し、その配列に基づいてオリゴＤＮＡを合成し、かつそのオリゴＤＮＡをプローブとして用いてｃＤＮＡライブラリをスクリーニングして、そのタンパク質をコードするＤＮＡを得る。
表面プラズモン共鳴現象を使用するバイオセンサーは、本発明において結合した化合物を検出または定量するための手段として使用され得る。このようなバイオセンサーを使用する場合、ＣＤＣＡ８ポリペプチドまたはＡＵＲＫＢポリペプチドと試験化合物との相互作用は、ごくわずかな量のポリペプチドを用い、かつ標識せずに、表面プラズモン共鳴シグナルとしてリアルタイムで観察することができる（例えば、ＢＩＡｃｏｒｅ、Ｐｈａｒｍａｃｉａ）。したがって、ＢＩＡｃｏｒｅのようなバイオセンサーを用いてＣＤＣＡ８ポリペプチドまたはＡＵＲＫＢポリペプチドと試験化合物との結合を評価することが可能である。
固定されたＣＤＣＡ８ポリペプチドまたはＡＵＲＫＢポリペプチドを、合成化学化合物、または天然物質バンクもしくはランダムペプチドファージディスプレイライブラリに曝露させた場合に結合する分子をスクリーニングする方法、ならびにＣＤＣＡ８タンパク質またはＡＵＲＫＢタンパク質に結合するタンパク質だけでなく化学化合物（アゴニストおよびアンタゴニストを含む）も単離する、コンビナトリアルケミストリー技術に基づくハイスループットを用いたスクリーニング方法（Wrighton et al., Science 273:458-64(1996); Verdine, Nature 384:11-3(1996)）は、当業者に周知である。
試験薬剤ライブラリの構築は当技術分野において周知であるが、試験薬剤の同定、および本スクリーニング方法のためのそのような薬剤のライブラリ構築におけるさらなる手引を本明細書において以下に提供する。
（ｉ）分子モデリング
試験薬剤ライブラリの構築は、求める特性を有することが知られている化合物の分子構造、ならびに／または阻害する標的分子、すなわちＣＤＣＡ８およびＡＵＲＫＢの分子構造の知識によって容易になる。さらなる評価に適した試験薬剤の予備スクリーニングに対する１つのアプローチは、試験薬剤とその標的との間の相互作用のコンピュータモデリングである。本発明では、ＣＤＣＡ８とＡＵＲＫＢとの間の相互作用をモデリングすることにより、相互作用自体の両者の詳細に対する洞察が提供され、また相互作用の潜在的分子阻害剤を含む、相互作用を阻害するために可能な戦略が示唆される。
コンピュータモデリング技術により、選択した分子の三次元原子構造の視覚化、およびその分子と相互作用する新規化合物の合理的設計が可能になる。三次元構築物は典型的に、選択した分子のＸ線結晶構造解析またはＮＭＲ画像化のデータに依存する。分子動力学は力場データを必要とする。コンピュータグラフィックスシステムは、新規化合物がどのように標的分子と結合するかを予測できるようにし、結合特異性を完全にするように化合物および標的分子の構造を実験操作することを可能にする。一方または両方に小さな変化を起こした場合に分子−化合物間相互作用がどうなるかの予測には、分子設計プログラムとユーザーとの間の使いやすいメニュー選択式のインターフェースと通常は連係した、分子力学ソフトウェアおよび計算集約型コンピュータが必要である。
上記に一般的に記載した分子モデリングシステムの一例には、ＣＨＡＲＭｍプログラムおよびＱＵＡＮＴＡプログラム、Ｐｏｌｙｇｅｎ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ、マサチューセッツ州、ウォルサムが含まれる。ＣＨＡＲＭｍは、エネルギー最小化および分子動力学機能を行う。ＱＵＡＮＴＡは、分子構造の構築、グラフィックモデリング、および解析を行う。ＱＵＡＮＴＡによって、分子の互いの挙動の相互的な構築、改変、視覚化、および解析が可能になる。
Rotivinen et al. Acta Pharmaceutica Fennica 1988, 97: 159-66;Ripka, New Scientist 1988, 54-8; McKinlay & Rossmann, Annu Rev Pharmacol Toxiciol 1989, 29: 111-22; Perry & Davies, Prog Clin Biol Res 1989, 291: 189-93; Lewis & Dean, Proc R Soc Lond 1989, 236: 125-40, 141-62; および核酸成分に対するモデル受容体に関するAskew et al., J Am Chem Soc 1989, 111: 1082-90などのいくつかの論文が、特定のタンパク質と相互作用する薬物のコンピュータモデリングについて概説している。
化学物質をスクリーニングし、画像として描写する他のコンピュータプログラムは、ＢｉｏＤｅｓｉｇｎ， Ｉｎｃ．、カリフォルニア州、パサディナ、Ａｌｌｅｌｉｘ， Ｉｎｃ、カナダ、オンタリオ州、ミシサーガ、およびＨｙｐｅｒｃｕｂｅ， Ｉｎｃ．、オンタリオ州、ケンブリッジなどの会社から入手可能である。例えば、DesJarlais et al., J Med Chem 1988, 31: 722-9; Meng et al., J Computer Chem 1992, 13: 505-24; Meng et al., Proteins 1993, 17: 266-78;Shoichet et al., Science 1993, 259: 1445-50を参照されたい。
ＣＤＣＡ８とＡＵＲＫＢとの間の相互作用の推定阻害剤が同定されたならば、下記に詳述するように、同定された推定阻害剤の化学構造に基づき、コンビナトリアル化学技術を使用して任意の数の変種を構築することができる。結果として得られた推定阻害剤または「試験薬剤」のライブラリを本発明の方法を用いてスクリーニングし、ＣＤＣＡ８とＡＵＲＫＢとの間の会合を破壊するライブラリの試験薬剤を同定することができる。
（ｉｉ）コンビナトリアル化学合成
試験薬剤のコンビナトリアルライブラリは、ＣＤＣＡ８とＡＵＲＫＢとの間の相互作用の公知の阻害剤に存在するコア構造の知識を含む合理的薬物設計プログラムの一部として作製することができる。このアプローチにより、ライブラリを適切なサイズに維持することが可能となり、ハイスループットスクリーニングが容易になる。または、ライブラリを構成する分子ファミリーのすべての並べ換えを単純に合成することによって、単純な、特に短いポリマー分子ライブラリを構築することも可能である。この後者のアプローチの一例は、すべてのペプチドが６アミノ酸長のライブラリである。このようなペプチドライブラリは、６アミノ酸配列のあらゆる並べ換えを含み得る。この種のライブラリは、直線的コンビナトリアル化学ライブラリと称される。
コンビナトリアル化学ライブラリの調製は当業者に周知であり、化学合成または生物学的合成のいずれかによって作製することができる。コンビナトリアル化学ライブラリにはペプチドライブラリ（例えば、米国特許第５，０１０，１７５号；Furka, Int J Pept Prot Res 1991, 37: 487-93; Houghten et al., Nature 1991, 354:84-6を参照されたい）が含まれるが、これに限定されない。化学的多様性ライブラリを作製するための他の化学も用いることができる。そのような化学には以下のものが含まれるが、これらに限定されない：
ペプチド（例えば、ＰＣＴ公開公報 ＷＯ ９１／１９７３５）、
コードされたペプチド（例えば、ＷＯ ９３／２０２４２）、
ランダムバイオオリゴマー（例えば、ＷＯ ９２／０００９１）、
ベンゾジアゼピン（例えば、米国特許第５，２８８，５１４号）
ヒダントイン、ベンゾジアゼピン、およびジペプチドなどのダイバーソマー（ｄｉｖｅｒｓｏｍｅｒ）（DeWitt et al., Proc Natl Acad Sci USA 1993, 90:6909-13）、
ビニル性ポリペプチド（Hagihara et al., J Amer Chem Soc 1992, 114: 6568）、
グルコース骨格を有する非ペプチド性ペプチド模倣体（Hirschmann et al., J Amer Chem Soc 1992, 114: 9217-8）、
小化合物ライブラリの類似の有機合成（Chen et al., J. Amer Chem Soc 1994, 116: 2661）、
オリゴカルバメート（Cho et al., Science 1993, 261: 1303）、および／または
ペプチジルホスホネート（Campbell et al., J Org Chem 1994, 59: 658）、
核酸ライブラリ（Ausubel, Current Protocols in Molecular Biology 1995 supplement;Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 1989, Cold Spring Harbor Laboratory, New York, USAを参照されたい）、
ペプチド核酸ライブラリ（例えば、米国特許第５，５３９，０８３号を参照されたい）、
抗体ライブラリ（例えば、Vaughan et al., Nature Biotechnology, 1996, 14(3):309-14、およびＰＣＴ／ＵＳ９６／１０２８７を参照されたい）、
糖質ライブラリ（例えば、Liang et al., Science 1996, 274: 1520-22；米国特許第５，５９３，８５３号を参照されたい）、ならびに
小有機分子ライブラリ（例えば、ベンゾジアゼピン、Gordon EM. Curr Opin Biotechnol. 1995 Dec 1;6(6):624-31.；イソプレノイド、米国特許第５，５６９，５８８号；チアゾリジノンおよびメタチアザノン、米国特許第５，５４９，９７４号；ピロリジン、米国特許第５，５２５，７３５号および同第５，５１９，１３４号；モルフォリノ化合物、米国特許第５，５０６，３３７号；ベンゾジアゼピン、米国特許第５，２８８，５１４号等を参照されたい）。
（ｉｉｉ）ファージディスプレイ
別のアプローチでは、組換えバクテリオファージを用いてライブラリを作製する。「ファージ法」（Scott & Smith, Science 1990, 249: 386-90;Cwirla et al., Proc Natl Acad Sci USA 1990, 87: 6378-82;Devlin et al., Science 1990, 249: 404-6）を用いて、非常に大きなライブラリを構築することができる（例えば１０６〜１０８個の化学的実体）。第２のアプローチは主に化学的方法を用いるものであり、Ｇｅｙｓｅｎ法（Geysen et al., Molecular Immunology 1986, 23: 709-15;Geysen et al., J. Immunologic Method 1987, 102: 259-74）；およびＦｏｄｏｒらの方法（Science 1991, 251: 767-73)がその例である。Furka et al.(14th International Congress of Biochemistry 1988, Volume #5, Abstract FR:013;Furka, Int J Peptide Protein Res 1991, 37: 487-93)、Houghten（米国特許第４，６３１，２１１号）、およびRutter et al.（米国特許第５，０１０，１７５号）は、アゴニストまたはアンタゴニストとして試験できるペプチドの混合物を作製する方法を記載している。
コンビナトリアルライブラリを調製するための装置は市販されている（例えば、３５７ ＭＰＳ、３９０ ＭＰＳ、Ａｄｖａｎｃｅｄ Ｃｈｅｍ Ｔｅｃｈ、ケンタッキー州、ルイビル、Ｓｙｍｐｈｏｎｙ、Ｒａｉｎｉｎ、マサチューセッツ州、ウォバーン、４３３Ａ Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ、カリフォルニア州、フォスターシティー、９０５０ Ｐｌｕｓ、Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ、マサチューセッツ州、ベッドフォードを参照されたい）。加えて、多数のコンビナトリアルライブラリ自体が市販されている（例えば、ＣｏｍＧｅｎｅｘ、ニュージャージー州、プリンストン、Ｔｒｉｐｏｓ， Ｉｎｃ．、ミズーリ州、セントルイス、３Ｄ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ、ペンシルバニア州、エクストン、Ｍａｒｔｅｋ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、メリーランド州、コロンビア等を参照されたい）。
個体の遺伝子構成の差異が、様々な薬物を代謝する相対的な能力の差をもたらす可能性がある。対象中で代謝されて抗ＮＳＣＬＣ物質として作用する化合物は、癌性状態に特徴的な遺伝子発現パターンから、非癌性状態に特徴的な遺伝子発現パターンへの、対象の細胞における遺伝子発現パターンの変化を誘導することによって、顕在化させることができる。したがって、本明細書において開示される、差次的に発現されるＣＤＣＡ８遺伝子またはＡＵＲＫＢ遺伝子により、選択された対象由来の試験細胞（または試験細胞集団）において候補化合物を試験することによって、対象に特異的に適した推定上のＮＳＣＬＣの治療用または予防用阻害剤を選択することが可能になる。
個々の対象にとって適切な抗ＮＳＣＬＣ物質を同定するために、対象由来の試験細胞または試験細胞集団を治療物質に曝露し、ＣＤＣＡ８遺伝子もしくはＡＵＲＫＢ遺伝子の１つまたは複数の発現を決定する。
試験細胞はＣＤＣＡ８遺伝子もしくはＡＵＲＫＢ遺伝子を発現するＮＳＣＬＣ細胞であるか、または試験細胞集団は該ＮＳＣＬＣ細胞を含む。好ましくは、試験細胞または試験細胞集団は肺細胞を含む。例えば、試験細胞または試験細胞集団は、候補物質の存在下でインキュベートしてよく、かつ試験細胞または試験細胞集団の遺伝子発現パターンを測定し、１種または複数種の参照プロファイル、例えばＮＳＣＬＣの参照発現プロファイルまたは非ＮＳＣＬＣの参照発現プロファイルと比較してもよい。
ＮＳＣＬＣを含む参照細胞集団と比較して試験細胞または試験細胞集団におけるＣＤＣＡ８またはＡＵＲＫＢの発現が減少する場合、その物質が治療的に有効であることが示唆される。
ＮＳＣＬＣを治療または予防するための方法
本発明はさらに、対象においてＮＳＣＬＣを治療、緩和、および／または予防するための方法を提供する。治療的化合物を、ＮＳＣＬＣに罹患しているか、またはＮＳＣＬＣを発症するリスクがある（もしくは発症しやすい）対象に予防的または治療的に投与してもよい。標準的な臨床的方法を用いて、またはＣＤＣＡ８もしくはＡＵＲＫＢの遺伝子もしくはポリペプチドの異常な発現レベルもしくは活性を検出することによって、このような対象を特定してもよい。疾患もしくは障害が予防されるか、またはその進行が遅延されるように、典型的には、疾患の顕性の臨床症状が発現する前に予防的投与を実施する。
本発明の方法は、ＮＳＣＬＣ細胞が由来する同じ組織型の正常細胞と比較して、ＮＳＣＬＣ細胞において発現が異常に増大する遺伝子の１種または複数種の遺伝子産物の発現もしくは機能、または両方における低減をもたらすことが好ましい。発現は、当技術分野において公知の任意の方法によって阻害してもよい。例えば、対象中のＣＤＣＡ８遺伝子またはＡＵＲＫＢ遺伝子の量を減少させる有効量の化合物で、対象を処置してもよい。化合物の投与は全身的または局所的であってよい。このような治療的化合物には、ＮＳＣＬＣ細胞中に内因的に存在するこのような遺伝子の発現レベルを低下させる化合物（すなわち、ＣＤＣＡ８遺伝子またはＡＵＲＫＢ遺伝子の発現を下方制御する化合物）が含まれる。このような治療的化合物の投与は、対象のＮＳＣＬＣ細胞中の異常に過剰発現された遺伝子の影響に対抗し、対象の臨床状態を改善すると予想される。このような化合物は、前述した本発明のスクリーニング方法によって得ることができる。
ＣＤＣＡ８もしくはＡＵＲＫＢの発現は、過剰発現された遺伝子の発現を阻害するか、またはそれに拮抗する核酸を対象に投与することによって阻害することができる。過剰発現された遺伝子の発現を妨害するアンチセンスオリゴヌクレオチド、ｓｉＲＮＡ、またはリボザイムを、過剰発現された遺伝子の発現を阻害するために使用することができる。
上記のように、ＣＤＣＡ８遺伝子またはＡＵＲＫＢ遺伝子のヌクレオチド配列のいずれかに対応するアンチセンスオリゴヌクレオチドを用いて、その遺伝子の発現レベルを低下させることができる。ＮＳＣＬＣにおいて上方制御されるＣＤＣＡ８遺伝子またはＡＵＲＫＢ遺伝子に対応するアンチセンスオリゴヌクレオチドは、ＮＳＣＬＣの治療または予防において有用である。具体的には、これらの遺伝子に対するアンチセンスオリゴヌクレオチドは、これらの遺伝子によってコードされた対応するポリペプチドのいずれか、もしくはそれに対応するｍＲＮＡに結合し、それによって遺伝子の転写もしくは翻訳を阻害し、ｍＲＮＡの分解を促進し、かつ／またはＣＤＣＡ８ヌクレオチドもしくはＡＵＲＫＢヌクレオチドによってコードされるタンパク質の発現を阻害し、最終的にそれらのタンパク質の機能を阻害することによって、作用し得る。本明細書において使用される「アンチセンスオリゴヌクレオチド」という用語は、そのアンチセンスオリゴヌクレオチドが標的配列に特異的にハイブリダイズすることができる限り、標的配列に完全に相補的であるヌクレオチドおよび１つまたは複数のヌクレオチドのミスマッチを有するものの両方を包含する。例えば、本発明のアンチセンスオリゴヌクレオチドには、ＣＤＣＡ８遺伝子またはＡＵＲＫＢ遺伝子のヌクレオチド配列のいずれかの少なくとも１５個の連続するヌクレオチドから最長で完全長配列までの範囲に渡って、少なくとも７０％またはそれ以上、好ましくは８０％またはそれ以上、より好ましくは９０％またはそれ以上、さらにより好ましくは９５％またはそれ以上の相同性（配列同一性とも呼ばれる）を有するポリヌクレオチドが含まれる。当技術分野において公知のアルゴリズムを使用して、相同性を決定することができる。さらに、アンチセンスオリゴヌクレオチドの誘導体または修飾産物もまた、本発明においてアンチセンスオリゴヌクレオチドとして使用され得る。このような修飾産物の例には、メチルホスホナート型またはエチルホスホナート型などの低級アルキルホスホナート修飾、ホスホロチオアート修飾、およびホスホロアミダート修飾が含まれる。
本発明のｓｉＲＮＡ分子はまた、本明細書において開示される遺伝子由来のｍＲＮＡまたはｃＤＮＡに特異的にハイブリダイズする能力によって定義することができる。本発明との関連において、「ハイブリダイズする」および「特異的にハイブリダイズする」という用語は同義的に使用され、「ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件」下でハイブリダイズする２つの核酸分子の能力を意味する。「ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件」という語句は、ある核酸分子が、典型的には核酸の複合混合物中でその標的配列にハイブリダイズするが、他の配列には検出可能な程度にはハイブリダイズしない条件を意味する。ストリンジェントな条件は配列依存性であり、異なる状況においては異なる。配列が長いほど、より高い温度で特異的にハイブリダイズする。核酸のハイブリダイゼーションに関する広範な指針は、Tijssen, Techniques in Biochemistry and Molecular Biology-Hybridization with Nucleic Probes, 「Overview of principles of hybridization and the strategy of nucleic acid assays」(1993)において見出される。
一般にストリンジェントな条件は、規定のイオン強度、ｐＨにおける個々の配列の溶融点（Ｔｍ）より約５℃〜１０℃低くなるように選択される。Ｔｍは（規定のイオン強度、ｐＨ、および核酸濃度下で）標的に相補的なプローブの５０％が、平衡状態で標的配列にハイブリダイズする温度である（標的配列が過剰に存在するため、Ｔｍでは５０％のプローブが平衡状態で占有される）。ストリンジェントな条件は、ホルムアミドのような不安定化剤を添加することによって実現してもよい。選択的または特異的ハイブリダイゼーションの場合、陽性シグナルは、バックグラウンドの少なくとも２倍、好ましくはバックグラウンドハイブリダイゼーションの１０倍である。例示的なストリンジェントなハイブリダイゼーション条件は、以下を含む：５０％ホルムアミド、５×ＳＳＣ、および１％ＳＤＳ、４２℃でインキュベーション、または５×ＳＳＣ、１％ＳＤＳ、６５℃でインキュベーションし、０．２×ＳＳＣおよび０．１％ＳＤＳ中、５０℃で洗浄。アンチセンスオリゴヌクレオチドおよびその誘導体は、ＣＤＣＡ８遺伝子またはＡＵＲＫＢ遺伝子によってコードされるタンパク質を産生する細胞に対して、そのタンパク質をコードするＤＮＡまたはｍＲＮＡに結合し、それらの転写または翻訳を阻害し、ｍＲＮＡの分解を促進し、かつタンパク質の発現を阻害することによって作用し、それによってタンパク質機能の阻害がもたらされる。
アンチセンスオリゴヌクレオチドおよびその誘導体は、その誘導体に対して不活性である適切な基材と混合することによって、リニメント剤またはパップ剤などの外用製剤に調剤することができる。
本発明のアンチセンスオリゴヌクレオチドは、ＣＤＣＡ８遺伝子またはＡＵＲＫＢ遺伝子よってコードされる少なくとも１種のタンパク質の発現を阻害し、したがってそれぞれのタンパク質の生物活性を抑制するのに有用である。
過剰発現された遺伝子の１種または複数種の遺伝子産物を阻害するポリヌクレオチドには、ＣＤＣＡ８遺伝子またはＡＵＲＫＢ遺伝子によってコードされる過剰発現タンパク質をコードするヌクレオチド配列のセンス鎖核酸およびアンチセンス鎖核酸の組み合わせから構成される低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）も含まれる。「ｓｉＲＮＡ」という用語は、標的ｍＲＮＡの翻訳を妨げる二本鎖ＲＮＡ分子を意味する。ＤＮＡがＲＮＡの転写元の鋳型であるものを含む、ｓｉＲＮＡを細胞中に導入する標準技術は、本発明の治療または予防において使用することができる。ｓｉＲＮＡは、単一の転写物が標的遺伝子由来のセンス配列および相補的なアンチセンス配列の両方、例えば、一部の態様においてマイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）の産生をもたらすヘアピンを有するように構築されてもよい。ｓｉＲＮＡは、ｄｓＲＮＡであってもｓｈＲＮＡであってもよい。
本明細書で使用する「ｄｓＲＮＡ」という用語は、互いに相補的な配列を含み、相補的配列を介して共にアニールして二本鎖ＲＮＡ分子を形成した、２つのＲＮＡ分子の構築物を指す。２本の鎖のヌクレオチド配列は、標的遺伝子配列のタンパク質コード配列から選択される「センス」ＲＮＡまたは「アンチセンス」ＲＮＡのみならず、標的遺伝子の非コード領域から選択されるヌクレオチド配列を有するＲＮＡ分子もまた含み得る。
本明細書で使用する「相補的な」という用語は、核酸分子のヌクレオチド単位間のワトソン・クリック型またはフーグスティーン型の塩基対形成を指し、「結合する」という用語は、２つの核酸もしくは化合物、または関連する核酸もしくは化合物、またはそれらの組み合わせ間の物理的または化学的相互作用を意味する。ポリヌクレオチドが修飾ヌクレオチドおよび／または非ホスホジエステル結合を含む場合にも、これらのポリヌクレオチドは同様の様式で互いに結合し得る。一般的に、相補的な核酸配列は適切な条件下でハイブリダイズして、ミスマッチをほとんど含まないかまったく含まない安定した二重鎖を形成する。本発明の目的に関して、５個またはそれ未満のミスマッチを有する２つの配列を相補的であるとみなす。さらに、本発明の単離されたヌクレオチドのセンス鎖およびアンチセンス鎖は、ハイブリダイゼーションによって二本鎖ヌクレオチドまたはヘアピンループ構造を形成し得る。
本明細書で使用する「ｓｈＲＮＡ」という用語は、互いに相補的な第１領域および第２領域、すなわちセンス鎖およびアンチセンス鎖を含む、ステムループ構造を有するｓｉＲＮＡを指す。それらの領域の相補性の程度および配向は、その領域間で塩基対形成が起こるのに十分であり、第１領域および第２領域はループ領域によって結合されており、ループは、ループ領域内のヌクレオチド（またはヌクレオチド類似体）間の塩基対形成の欠如に起因する。ｓｈＲＮＡのループ領域はセンス鎖とアンチセンス鎖との間に介在する一本鎖領域であり、「介在一本鎖」とも称され得る。
本明細書で使用する「ｓｉＤ／Ｒ−ＮＡ」という用語は、ＲＮＡおよびＤＮＡの両方から構成され、ＲＮＡとＤＮＡのハイブリッドおよびキメラを含み、かつ標的ｍＲＮＡの翻訳を妨げる二本鎖ポリヌクレオチド分子を指す。本明細書において、ハイブリッドは、ＤＮＡから構成されるポリヌクレオチドとＲＮＡからなるポリヌクレオチドが互いにハイブリダイズして二本鎖分子を形成する分子を示し、キメラは、二本鎖分子を構成する鎖の一方または両方がＲＮＡおよびＤＮＡを含み得ることを示す。ｓｉＤ／Ｒ−ＮＡを細胞に導入する標準的な技術が用いられる。ｓｉＤ／Ｒ−ＮＡは、センス核酸配列（「センス鎖」とも称される）、アンチセンス核酸配列（「アンチセンス鎖」とも称される）、またはその両方を含む。ｓｉＤ／Ｒ−ＮＡは、単一の転写産物が、標的遺伝子由来のセンス核酸配列および相補的なアンチセンス核酸配列の両方、例えばヘアピンを有するように構築されてもよい。ｓｉＤ／Ｒ−ＮＡは、ｄｓＤ／Ｒ−ＮＡまたはｓｈＤ／Ｒ−ＮＡのいずれかであってよい。
本明細書で使用する「ｄｓＤ／Ｒ−ＮＡ」という用語は、互いに相補的な配列を含み、相補的配列を介して共にアニールして二本鎖ポリヌクレオチド分子を形成した、２つの分子の構築物を指す。２本の鎖のヌクレオチド配列は、標的遺伝子配列のタンパク質コード配列から選択される「センス」または「アンチセンス」ポリヌクレオチド配列のみならず、標的遺伝子の非コード領域から選択されるヌクレオチド配列を有するポリヌクレオチドもまた含み得る。ｄｓＤ／Ｒ−ＮＡを構築する２つの分子の一方または両方が、ＲＮＡおよびＤＮＡの両方から構成されるか（キメラ分子）、またはあるいは分子の一方がＲＮＡから構成され、他方がＤＮＡから構成される（ハイブリッド二本鎖）。
本明細書で使用する「ｓｈＤ／Ｒ−ＮＡ」という用語は、互いに相補的な第１領域および第２領域、すなわちセンス鎖およびアンチセンス鎖を含む、ステムループ構造を有するｓｉＤ／Ｒ−ＮＡを指す。それらの領域の相補性の程度および配向は、その領域間で塩基対形成が起こるのに十分であり、第１領域および第２領域はループ領域によって結合されており、ループは、ループ領域内のヌクレオチド（またはヌクレオチド類似体）間の塩基対形成の欠如に起因する。ｓｈＤ／Ｒ−ＮＡのループ領域はセンス鎖とアンチセンス鎖との間に介在する一本鎖領域であり、「介在一本鎖」とも称され得る。
この方法は、ＣＤＣＡ８遺伝子またはＡＵＲＫＢ遺伝子の発現が上方制御される細胞の遺伝子発現を抑制するのに使用される。標的細胞中のＣＤＣＡ８遺伝子またはＡＵＲＫＢ遺伝子の転写物にｓｉＲＮＡが結合すると、細胞によるＣＤＣＡ８タンパク質またはＡＵＲＫＢタンパク質の産生が減少する。オリゴヌクレオチドの長さは、少なくとも約１０ヌクレオチドであり、天然の転写物と同じくらい長くてよい。好ましくは、オリゴヌクレオチドの長さは、約７５、約５０、または約２５ヌクレオチドである。最も好ましくは、オリゴヌクレオチドの長さは、約１９〜約２５ヌクレオチド未満である。
本発明の二本鎖分子は１つまたは複数の修飾ヌクレオチドおよび／または非ホスホジエステル結合を含み得る。当技術分野において周知の化学的修飾は、二本鎖分子の安定性、利用可能性、および／または細胞取り込みを増大させることができる。当業者は、本分子に取り込むことができる他の型の化学的修飾を認識している（ＷＯ０３／０７０７４４；ＷＯ２００５／０４５０３７）。１つの態様では、修飾を用いて、分解に対する抵抗性の向上または取り込みの向上を提供することができる。そのような修飾の例には、ホスホロチオエート結合、２’−Ｏ−メチルリボヌクレオチド（特に二本鎖分子のセンス鎖において）、２’−デオキシ−フルオロリボヌクレオチド、２’−デオキシリボヌクレオチド、「ユニバーサル塩基」ヌクレオチド、５’−Ｃ−メチルヌクレオチド、および逆方向デオキシ脱塩基残基（ｉｎｖｅｒｔｅｄ ｄｅｏｘｙａｂａｓｉｃ ｒｅｓｉｄｕｅ）の取り込みが含まれる（ＵＳ２００６０１２２１３７）。
別の態様では、修飾を用いて、二本鎖分子の安定性を高めること、または二本鎖分子の標的化効率を増大させることができる。修飾には、二本鎖分子の２つの相補鎖間の化学的架橋、二本鎖分子の鎖の３’または５’末端の化学的修飾、糖修飾、核酸塩基修飾および／または骨格修飾、２−フルオロ修飾リボヌクレオチドおよび２’−デオキシリボヌクレオチドが含まれる（ＷＯ２００４／０２９２１２）。別の態様では、修飾を用いて、標的ｍＲＮＡ中および／または相補的二本鎖分子鎖中の相補的ヌクレオチドに対する親和性を増大または減少させることができる（ＷＯ２００５／０４４９７６）。例えば、非修飾ピリミジンヌクレオチドを２−チオ、５−アルキニル、５−メチル、または５−プロピニルピリミジンで置換することができる。さらに、非修飾プリンを７−デアザ、７−アルキル、または７−アルケニルプリンで置換することができる。別の態様では、二本鎖分子が３’オーバーハングを有する二本鎖分子である場合、３’末端ヌクレオチドオーバーハングヌクレオチドをデオキシリボヌクレオチドによって置換することができる（Elbashir SM et al., Genes Dev 2001 Jan 15, 15(2): 188-200）。さらなる詳細については、ＵＳ２００６０２３４９７０などの公表された文献が利用可能である。本発明はこれらの例に限定されず、結果として得られる分子が標的遺伝子の発現を阻害する能力を保持する限り、本発明の二本鎖分子に対して任意の公知の化学的修飾を使用することが可能である。
さらに、本発明の二本鎖分子はＤＮＡとＲＮＡを両方含んでよく、例えばｄｓＤ／Ｒ−ＮＡまたはｓｈＤ／Ｒ−ＮＡであってよい。具体的には、ＤＮＡ鎖とＲＮＡ鎖のハイブリッドポリヌクレオチドまたはＤＮＡ−ＲＮＡキメラポリヌクレオチドは、安定性の増加を示す。二本鎖分子の安定性を高めるために、ＤＮＡとＲＮＡの混合物、すなわちＤＮＡ鎖（ポリヌクレオチド）およびＲＮＡ鎖（ポリヌクレオチド）からなるハイブリッド型二本鎖分子、または一本鎖（ポリヌクレオチド）のいずれかもしくは両方にＤＮＡおよびＲＮＡを両方含むキメラ型二本鎖分子等を形成することができる。ＤＮＡ鎖とＲＮＡ鎖のハイブリッドは、標的遺伝子を発現する細胞に導入した場合に該遺伝子の発現を阻害する活性を有する限り、センス鎖がＤＮＡでありアンチセンス鎖がＲＮＡであるか、またはその逆であるハイブリッドであってよい。好ましくは、センス鎖ポリヌクレオチドがＤＮＡであり、アンチセンス鎖ポリヌクレオチドがＲＮＡである。同様に、キメラ型二本鎖分子も、標的遺伝子を発現する細胞に導入した場合に該遺伝子の発現を阻害する活性を有する限り、センス鎖とアンチセンス鎖の両方がＤＮＡおよびＲＮＡから構成されるか、またはセンス鎖およびアンチセンス鎖のいずれか一方がＤＮＡおよびＲＮＡからなるものであってよい。
二本鎖分子の安定性を高めるには、分子はＤＮＡをできるだけ多く含むことが好ましいが、標的遺伝子発現の阻害を誘導するには、発現の十分な阻害を誘導する範囲内で分子はＲＮＡであることが必要である。キメラ型二本鎖分子の好ましい例として、二本鎖分子の上流側の一部の領域（すなわち、センス鎖またはアンチセンス鎖内の、標的配列またはその相補的配列に隣接する領域）はＲＮＡである。好ましくは、上流側の一部の領域とは、センス鎖の５’側（５’末端）およびアンチセンス鎖の３’側（３’末端）を示す。
したがって、好ましい態様において、アンチセンス鎖の３’末端に隣接する領域、またはセンス鎖の５’末端に隣接する領域およびアンチセンス鎖の３’末端に隣接する領域の両方はＲＮＡからなる。例えば、本発明のキメラ型またはハイブリッド型二本鎖分子は、以下の組み合わせを含む。
センス鎖： ５’−［ＤＮＡ］−３’
３’−（ＲＮＡ）−［ＤＮＡ］−５’：アンチセンス鎖、
センス鎖：５’−（ＲＮＡ）−［ＤＮＡ］−３’
３’−（ＲＮＡ）−［ＤＮＡ］−５’：アンチセンス鎖、および
センス鎖：５’−（ＲＮＡ）−［ＤＮＡ］−３’
３’−（ＲＮＡ）−５’ ：アンチセンス鎖。
上流側の一部の領域は、好ましくは、二本鎖分子のセンス鎖またはアンチセンス鎖内の、標的配列またはそれに対する相補的配列の末端から数えて９〜１３ヌクレオチドからなるドメインである。さらに、そのようなキメラ型二本鎖分子の好ましい例には、鎖長が１９〜２１ヌクレオチドであり、ポリヌクレオチドの少なくとも上流側半分の領域（センス鎖の５’側領域およびアンチセンス鎖の３’側領域）がＲＮＡであり、残りの半分がＤＮＡであるものが含まれる。そのようなキメラ型二本鎖分子では、標的遺伝子の発現を阻害する効果は、アンチセンス鎖全体がＲＮＡである場合よりもはるかに高い（ＵＳ２００５０００４０６４）。
本発明において、二本鎖分子は、短鎖ヘアピンＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）、ならびにＤＮＡおよびＲＮＡからなる短鎖ヘアピン（ｓｈＤ／Ｒ−ＮＡ）などのヘアピンを形成し得る。ｓｈＲＮＡまたはｓｈＤ／Ｒ−ＮＡは、ＲＮＡ干渉により遺伝子発現をサイレンシングするために使用できる堅固なヘアピンターンを形成する、ＲＮＡまたはＲＮＡとＤＮＡの混合物の配列である。ｓｈＲＮＡまたはｓｈＤ／Ｒ−ＮＡは、一本鎖上に、ループ配列によって分離されているセンス標的配列およびアンチセンス標的配列を含む。一般的に、ヘアピン構造は細胞機構によってｄｓＤＮＡまたはｄｓＤ／Ｒ−ＮＡへと切断され、これは次にＲＮＡ誘導サイレンシング複合体（ＲＩＳＣ）に結合する。この複合体は、ｄｓＲＮＡまたはｄｓＤ／Ｒ−ＮＡの標的配列と一致するｍＲＮＡに結合し、これを切断する。
本明細書で使用する好ましいｓｉＲＮＡは、下記の一般式を有する：
５’−［Ａ］−［Ｂ］−［Ａ’］−３’
式中、［Ａ］はＣＤＣＡ８遺伝子またはＡＵＲＫＢ遺伝子の標的配列に相当するリボヌクレオチド配列であり；［Ｂ］は、介在一本鎖、例えば約３〜約２３ヌクレオチドからなるリボヌクレオチド配列であり；かつ［Ａ’］は［Ａ］と相補的なリボヌクレオチド配列である。本明細書において、「ＣＤＣＡ８遺伝子またはＡＵＲＫＢ遺伝子の標的配列」という語句は、ＮＳＣＬＣ細胞株に導入した場合に、細胞の生存能を抑制するのに効果的である配列を指す。
ｓｉＲＮＡは任意に３’オーバーハングを含み得る。好ましいｓｉＲＮＡは、ＡＵＲＫＢ遺伝子の発現を減少させるｓｉＲＮＡであって、標的配列としてセンス鎖中に、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３３、５９、または６０のヌクレオチド配列を有するｓｉＲＮＡである。ｓｉＲＮＡは、下記の一般式を有する：
５’−［Ａ］−［Ｂ］−［Ａ’］−３’
式中、［Ａ］はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３３、５９、または６０に相当するリボヌクレオチド配列であり；［Ｂ］は、介在一本鎖、例えば３〜２３ヌクレオチドから構成されるリボヌクレオチド配列であり；かつ［Ａ’］は［Ａ］と相補的なリボヌクレオチド配列である。
ＣＣＣ、ＣＣＡＣＣ、またはＣＣＡＣＡＣＣ：Jacque, J. M, et al., (2002) Nature, Vol. 418: 435-8。
ＵＵＣＧ：Lee, N.S.,et al., (2002) Nature Biotechnology 20 : 500-5、Fruscoloni, P., et al., (2003) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 100(4): 1639-44。
ＵＵＣＡＡＧＡＧＡ：Dykxhoorn, D. M., et al., (2002) Nature Reviews Molecular Cell Biology 4: 457-67。
したがって、ループ配列は、ＣＣＣ、ＵＵＣＧ、ＣＣＡＣＣ、ＣＣＡＣＡＣＣ、およびＵＵＣＡＡＧＡＧＡからなる群より選択され得る。好ましいループ配列はＵＵＣＡＡＧＡＧＡ（ＤＮＡでは「ｔｔｃａａｇａｇａ」）である。本発明との関連における使用に適した例示的なヘアピンｓｉＲＮＡには、以下のものが含まれる：
ＡＵＲＫＢ−ｓｉＲＮＡに関して（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３３、５９、または６０の標的配列に関して）
５’−ＧＧＴＧＡＴＴＣＡＣＡＧＡＧＡＣＡＴＡ−［Ｂ］−ＴＡＴＧＴＣＴＣＴＧＴＧＡＡＴＣＡＣＣ−３’（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４８）、
標的配列がＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５９である場合、５’−ＣＣＡＡＡＣＴＧＣＴＣＡＧＧＣＡＴＡＡ−［Ｂ］−ＴＴＡＴＧＣＣＴＧＡＧＣＡＧＴＴＴＧＧ−３’、および
標的配列がＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６０である場合、５’−ＡＣＧＣＧＧＣＡＣＴＴＣＡＣＡＡＴＴＧ−［Ｂ］−ＣＡＡＴＴＧＴＧＡＡＧＴＧＣＣＧＣＧＴ−３’。
さらにｓｉＲＮＡのヌクレオチド配列は、Ａｍｂｉｏｎ社のウェブサイト（http://www.ambion.com/techlib/ misc/siRNA_finder.html）から入手可能なｓｉＲＮＡ設計コンピュータプログラムを用いて設計してもよい。ｓｉＲＮＡのためのヌクレオチド配列は、以下のプロトコルに基づくコンピュータプログラムによって選択してもよい。
ｓｉＲＮＡ標的部位の選択：
１．転写物のＡＵＧ開始コドンから開始して、下流へとスキャンしてＡＡジヌクレオチド配列を探す。潜在的なｓｉＲＮＡ標的部位として、個々のＡＡおよび３’側に隣接する１９ヌクレオチドの出現を記録する。Tuschl, et al. Genes Dev 13(24):3191-7(1999)では、５’および３’の非翻訳領域（ＵＴＲ）ならびに開始コドン近傍の領域（７５塩基以内）は調節タンパク質結合部位においてより豊富である可能性があり、したがってエンドヌクレアーゼとこれらの領域に対して設計されたｓｉＲＮＡとの複合体は、ＵＴＲ結合タンパク質および／または翻訳開始複合体の結合を妨害し得ることから、これらの領域に対するｓｉＲＮＡを設計することを推奨していない。
２．潜在的な標的部位をヒトゲノムデータベースと比較し、他のコード配列に対して有意な相同性を有する任意の標的配列を、考慮の対象から排除する。相同性検索は、ＢＬＡＳＴ（Altschul SF, et al., Nucleic Acids Res. 1997;25:3389-402; J Mol Biol. 1990;215:403-10）を用いて実施することができ、これはＮＣＢＩサーバー上のwww.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/で確認することができる。
３．合成に適した標的配列を選択する。Ａｍｂｉｏｎのウェブサイトでは、評価のためにいくつかの好ましい標的配列を遺伝子の全長に沿って選択することができる。
本発明のｓｉＲＮＡポリヌクレオチドを発現するベクターのトランスフェクションを用いて、ＮＳＣＬＣ細胞の増殖を阻害することができる。したがって、センス鎖およびアンチセンス鎖から構成され、ＣＤＣＡ８またはＡＵＲＫＢに対するｓｉＲＮＡとして機能する二本鎖分子、ならびにその二本鎖分子をコードするベクターを提供することが、本発明の別の局面である。
本発明の二本鎖分子は、センス鎖およびアンチセンス鎖を含み、センス鎖はＣＤＣＡ８標的配列またはＡＵＲＫＢ標的配列に対応するリボヌクレオチド配列であり、アンチセンス鎖は該センス鎖に相補的であるリボヌクレオチド配列であり、該センス鎖および該アンチセンス鎖は互いにハイブリダイズして二本鎖分子を形成し、該二本鎖分子は、ＣＤＣＡ８遺伝子またはＡＵＲＫＢ遺伝子を発現する細胞中に導入された場合に該遺伝子の発現を阻害する。
本発明の二本鎖分子は、その本来の環境（すなわち、それが天然分子である場合、天然の環境）に由来するポリヌクレオチドであってもよく、その天然の状態から物理的もしくは化学的に改変されてもよく、または化学的に合成されてもよい。本発明によれば、このような二本鎖分子には、ＤＮＡ、ＲＮＡ、およびそれらの誘導体から構成されるものが含まれる。ＤＮＡは、Ａ、Ｔ、Ｃ、およびＧなどの塩基から適切に構成され、かつＴはＲＮＡ中ではＵに置き換えられる。
例えば、ＡＵＲＫＢ遺伝子を発現する細胞（例えば、ＬＣ３１９細胞）をオリゴヌクレオチドと共にインキュベートすることができる。オリゴヌクレオチドを細胞内に導入するのを助けるＬｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅなどの試薬を、インキュベーション混合物中に添加することができる。次いで、細胞増殖に及ぼすオリゴヌクレオチドの阻害効果を、オリゴヌクレオチドなしでインキュベートした細胞の細胞増殖と比較することによって決定することができる。または、悪性新生物を有するラットおよびマウスなどの実験動物にオリゴヌクレオチドを投与することによりオリゴヌクレオチドの阻害効果を試験して、インビボにおいてＡＵＲＫＢ遺伝子発現の減少または腫瘍細胞増殖の減少を確認することができる。
本発明のベクターは好ましくは、本発明の二本鎖分子をコードする領域に隣接し、適切な細胞においてその分子の発現を指示する調節配列を含む。例えば本発明の二本鎖分子は、例えば核内低分子ＲＮＡ（ｓｎＲＮＡ）Ｕ６由来のＲＮＡポリメラーゼＩＩＩ転写単位またはヒトＨ１ ＲＮＡプロモーターを含むベクター中にそれらのコード配列をクローニングすることにより、細胞内で転写される。
目的の配列の発現（ＤＮＡ分子の転写）を可能にする様式で、その配列がベクターの調節配列に機能的に連結されるように、例えば発現ベクター中に標的配列をクローニングすることによって、本発明のベクターを作製することができる（Lee, N.S. et al., Nature Biotechnology 20:500-5(2002)）。例えば、標的配列に対するアンチセンス配列を有するＲＮＡ分子の転写は、第１のプロモーター（例えば、クローン化ＤＮＡの３’末端に連結されたプロモーター配列）によって駆動され得、かつ標的配列に対するセンス配列を有するものは、第２のプロモーター（例えば、クローン化ＤＮＡの５’末端に連結されたプロモーター配列）によって駆動され得る。発現されたセンス鎖およびアンチセンス鎖は、インビボで互いにハイブリダイズして、標的配列を含む遺伝子をサイレンシングするｓｉＲＮＡ構築物を生じる。さらに、２つの構築物（ベクター）を使用して、ｓｉＲＮＡ構築物のセンス鎖およびアンチセンス鎖をそれぞれ作製してもよい。
細胞中にベクターを導入するために、トランスフェクション促進剤を使用することができる。ＦｕＧＥＮＥ６（Ｒｏｃｈｅ ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ）、Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ ２０００（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、Ｏｌｉｇｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、およびＮｕｃｌｅｏｆｅｃｔｏｒ（Ｗａｋｏ ｐｕｒｅ Ｃｈｅｍｉｃａｌ）が、トランスフェクション促進剤として有用である。
ＣＤＣＡ８またはＡＵＲＫＢを阻害する核酸には、そのような遺伝子に対するリボザイムも含まれる。本発明との関連において、リボザイムは、過剰発現されたＣＤＣＡ８タンパク質またはＡＵＲＫＢタンパク質の発現を阻害し、それによってそのようなタンパク質の生物活性を抑制するのに有用である。したがって、このようなリボザイムから構成される組成物は、ＮＳＣＬＣを治療または予防するのに有用である。
一般に、リボザイムは、大型リボザイムおよび小型リボザイムに分類される。大型リボザイムは、核酸のリン酸エステル結合を切断する酵素として公知である。大型リボザイムとの反応後、反応した部位は、５’−リン酸基および３’−ヒドロキシル基からなる。大型リボザイムはさらに、（１）グアノシンによる５’−スプライス部位でのエステル転移反応を触媒するグループＩイントロンＲＮＡ、（２）ラリアット構造を経た２段階反応による自己スプライシングを触媒するグループＩＩイントロンＲＮＡ、および（３）加水分解により、５’部位でｔＲＮＡ前駆体を切断するリボヌクレアーゼＰのＲＮＡ構成要素に分類される。これに対して、小型リボザイムは、大型リボザイムと比較してサイズが小さく（約４０ｂｐ）、ＲＮＡを切断して５’−ヒドロキシル基および２’−３’環状リン酸を生じさせる。ハンマーヘッド型リボザイム（Koizumi et al., FEBS Lett. 228:225(1988)）およびヘアピン型リボザイム（Buzayan, Nature 323:349-53(1986);Kikuchi and Sasaki, Nucleic Acids Res. 19:6751-5(1991)）は、小型リボザイムに含まれる。リボザイムを設計および構築するための方法は当技術分野において公知であり（Koizumi et al., FEBS Lett. 228:228(1988);Koizumi et al., Nucleic Acids Res. 17:7059-71(1989); Kikuchi and Sasaki, Nucleic Acids Res. 19:6751-5(1991)を参照されたい）、過剰発現されたＮＳＣタンパク質の発現を阻害するリボザイムは、リボザイムを作製するための従来の方法に従って、ＣＤＣＡ８タンパク質またはＡＵＲＫＢタンパク質をコードするヌクレオチド配列の配列情報に基づいて構築することができる。
ＣＤＣＡ８またはＡＵＲＫＢの機能は、この遺伝子産物に結合するか、または別の方法でその機能を阻害する化合物を投与することによって阻害することができる。このような化合物の例は、過剰発現された１種または複数種の遺伝子産物に結合する抗体である。
本発明は、抗体、特に上方制御された遺伝子ＣＤＣＡ８もしくはＡＵＲＫＢのいずれかよってコードされるタンパク質に対する抗体、またはそのような抗体の断片の使用に関する。上記のように、「抗体」という用語は、抗体を合成するために使用する抗原（すなわち、上方制御された遺伝子産物）またはそれに密接に関連した抗原と特異的に相互作用（結合）する、特異的な構造を有する免疫グロブリン分子を意味する。過剰発現されたＣＤＣＡ８ヌクレオチドまたはＡＵＲＫＢヌクレオチドに結合する抗体は、モノクローナル抗体またはポリクローナル抗体など任意の形態でよく、ウサギなどの動物をポリペプチドで免疫することによって得られる抗血清、全クラスのポリクローナル抗体およびモノクローナル抗体、ヒト抗体、ならびに遺伝子組換えによって作製されるヒト化抗体が含まれる。さらに、ＮＳＣＬＣを治療または予防する本発明の方法において使用する抗体は、マーカー遺伝子（ＣＤＣＡ８遺伝子またはＡＵＲＫＢ遺伝子）によってコードされる１種または複数種のタンパク質に結合する限り、抗体の断片または修飾抗体でもよい。ＮＳＣＬＣを治療または予防する本発明の方法との関連において使用する抗体および抗体断片は、修飾されてもよく、化学的に修飾された抗体およびキメラ抗体が含まれる。このような抗体および抗体断片は、前記の上述した方法に従って得ることができる。
得られた抗体がヒトの身体に投与される場合（抗体治療）、免疫原性を減少させるために、ヒト抗体またはヒト化抗体が好ましい。例えば、ヒト抗体遺伝子のレパートリーを有するトランスジェニック動物を、ＣＤＣＡ８ポリペプチドもしくはＡＵＲＫＢポリペプチドなどの抗原、そのポリペプチドを発現する細胞、またはそれらの溶解物で免疫してもよい。次いで、抗体産生細胞を動物から採取し、骨髄腫細胞と融合させてハイブリドーマを得、そこからそのポリペプチドに対するヒト抗体を調製することができる（ＷＯ９２−０３９１８、ＷＯ９４−０２６０２、ＷＯ９４−２５５８５、ＷＯ９６−３３７３５、およびＷＯ９６−３４０９６を参照されたい）。
免疫されたリンパ球のような、抗体を産生する免疫細胞を、癌遺伝子によって不死化し、モノクローナル抗体を調製するのに使用してもよい。本発明は、過剰発現されたＣＤＣＡ８ポリペプチドまたはＡＵＲＫＢポリペプチドに対する抗体を用いてＮＳＣＬＣを治療または予防するための方法を提供する。この方法に従い、ＣＤＣＡ８ポリペプチドまたはＡＵＲＫＢポリペプチドに対する抗体の薬学的有効量を投与する。過剰発現されたＣＤＣＡ８ポリペプチドまたはＡＵＲＫＢポリペプチドに対する抗体は、ＣＤＣＡ８タンパク質またはＡＵＲＫＢタンパク質の活性を低下させるのに充分な投薬量で投与される。または、腫瘍細胞に特異的な細胞表面マーカーに結合する抗体を薬物送達のためのツールとして使用することもできる。したがって、例えば細胞毒性薬と結合した、過剰発現されたＣＤＣＡ８ポリペプチドまたはＡＵＲＫＢポリペプチドに対する抗体を、腫瘍細胞を損傷するのに充分な投薬量で投与してもよい。
さらに、本明細書において開示するタンパク質のドミナントネガティブ変異体を使用して、ＮＳＣＬＣを治療または予防することもできる。例えば本発明は、ドミナントネガティブな効果を有するＣＤＣＡ８変異体、またはそのような変異体をコードするポリヌクレオチドを投与することにより、対象においてＮＳＣＬＣを治療または予防するための方法を提供する。ＣＤＣＡ８変異体は、ＡＵＲＫＢ結合領域を含むアミノ酸配列、例えば、ＣＤＣＡ８タンパク質の一部分を含んでよく、かつＡＵＲＫＢによる２つのリン酸化領域、Ｓｅｒ−１５４、Ｓｅｒ−２１９、Ｓｅｒ−２７５、およびＴｈｒ−２７８を含んでもよい。ＣＤＣＡ８変異体は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５のアミノ酸配列を有し得る。
いくつかの好ましい態様において、ＣＤＣＡ８変異体は膜導入物質に連結している。いくつかのペプチド配列が、生細胞中に移行する能力について特徴付けられており、本発明のこの目的のために使用され得る。このような膜導入物質（典型的にはペプチド）は、内部移行後、生細胞中の細胞質コンパートメントおよび／または核コンパートメントに到達する能力によって定義される。導入物質が由来し得るタンパク質の例には、ＨＩＶ Ｔａｔトランス活性化因子１、２、キイロショウジョウバエ（Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ ｍｅｌａｎｏｇａｓｔｅｒ）転写因子アンテナペディア３が含まれる。さらに、導入活性を有する非天然ペプチドも使用される。これらのペプチドは典型的に、移行に関して試験される膜相互作用特性が公知である小型ペプチドである。Ｋ−線維芽細胞増殖因子（ＦＧＦ）、ハチ毒素マストパラン（トランスポータン）１３、およびブホリンＩ１４（両生類の抗菌ペプチド）の分泌シグナル配列内の疎水性領域が、導入物質として有用であることが示される。本発明において有用な導入物質の総説については、Joliot et al. Nature Cell Biology 6:189-96(2004)を参照されたい。
ＣＤＣＡ８変異体は、下記の一般式を有してもよい：
［Ｒ］−［Ｄ］
式中、［Ｒ］は膜導入物質であり、［Ｄ］はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５のアミノ酸配列を有するポリペプチドである。一般式において、［Ｒ］は［Ｄ］と直接結合してよく、またはリンカーを介して間接的に［Ｄ］と結合してよい。複数の官能基を有するペプチドまたは化合物がリンカーとして使用され得る。具体的には、アミノ酸配列−ＧＧＧ−がリンカーとして使用され得る。または、膜導入物質およびＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５のアミノ酸配列を有するポリペプチドは、微小粒子の表面に結合することができる。本発明において、［Ｒ］は［Ｄ］の任意の領域と結合してよい。例えば［Ｒ］は、［Ｄ］のＮ末端もしくはＣ末端、または［Ｄ］を構成するアミノ酸残基の側鎖と結合してよい。さらに、複数の分子の［Ｒ］が、１分子の［Ｄ］と結合してもよい。いくつかの態様において、複数の分子の［Ｒ］が［Ｄ］の異なる部位と結合してよい。別の態様において、［Ｄ］は相互に連結されたいくつかの［Ｒ］で修飾されてよい。
膜導入物質は、以下に挙げる群より選択することができる；
［ポリアルギニン］；Matsushita, M. et al, J Neurosci. 21, 6000-7(2003)
［Ｔａｔ／ＲＫＫＲＲＱＲＲＲ］（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６）Frankel, A. et al, Cell 55,1189-93(1988)
Green, M. & Loewenstein, P. M. Cell 55, 1179-88(1988)
［ペネトラチン／ＲＱＩＫＩＷＦＱＮＲＲＭＫＷＫＫ］（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：７）
Derossi, D. et al, J. Biol. Chem. 269, 10444-50(1994)
［ブホリンＩＩ／ＴＲＳＳＲＡＧＬＱＦＰＶＧＲＶＨＲＬＬＲＫ］（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：８）
Park, C. B. et al. Proc. Natl Acad. Sci. USA 97, 8245-50(2000)
［トランスポータン／ＧＷＴＬＮＳＡＧＹＬＬＧＫＩＮＬＫＡＬＡＡＬＡＫＫＩＬ］（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：９）
Pooga, M. et al. FASEB J. 12, 67-77(1998)
［ＭＡＰ（両親媒性ペプチドモデル）／ＫＬＡＬＫＬＡＬＫＡＬＫＡＡＬＫＬＡ］（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１０）
Oehlke, J. et al. Biochim. Biophys. Acta. 1414, 127-39(1998)
［Ｋ−ＦＧＦ／ＡＡＶＡＬＬＰＡＶＬＬＡＬＬＡＰ］（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１１）
Lin, Y. Z. et al. J. Biol. Chem. 270, 14255-14258(1995)
［Ｋｕ７０／ＶＰＭＬＫ］（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１２）
Sawada, M. et al. Nature Cell Biol. 5, 352-7(2003)
［Ｋｕ７０／ＰＭＬＫＥ］（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１３）
Sawada, M. et al. Nature Cell Biol. 5, 352-7(2003)
［プリオン／ＭＡＮＬＧＹＷＬＬＡＬＦＶＴＭＷＴＤＶＧＬＣＫＫＲＰＫＰ］（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１４）
Lundberg, P. et al. Biochem. Biophys. Res. Commun. 299, 85-90(2002)
［ｐＶＥＣ／ＬＬＩＩＬＲＲＲＩＲＫＱＡＨＡＨＳＫ］（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１５）
Elmquist, A. et al. Exp. Cell Res. 269, 237-44(2001)
［Ｐｅｐ−１／ＫＥＴＷＷＥＴＷＷＴＥＷＳＱＰＫＫＫＲＫＶ］（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１６）
Morris, M. C. et al. Nature Biotechnol. 19, 1173-76(2001)
［ＳｙｎＢ１／ＲＧＧＲＬＳＹＳＲＲＲＦＳＴＳＴＧＲ］（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１７）
Rousselle, C. et al. Mol. Pharmacol. 57, 679-86(2000)
［Ｐｅｐ−７／ＳＤＬＷＥＭＭＭＶＳＬＡＣＱＹ］（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１８）
Gao, C. et al. Bioorg. Med. Chem. 10, 4057-65(2002)
［ＨＮ−１／ＴＳＰＬＮＩＨＮＧＱＫＬ］（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１９）
Hong, F. D. & Clayman, G. L. Cancer Res. 60, 6551-6(2000)。
本発明において、ポリアルギニンを構成するアルギニン残基の数は限定されていない。いくつかの好ましい態様において、５個〜２０個の連続的なアルギニン残基が例示され得る。好ましい態様において、ポリアルギニンのアルギニン残基の数は１１個である（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２０）。
本明細書において使用される場合、「ＣＤＣＡ８のドミナントネガティブな断片」という語句は、ＡＵＲＫＢと複合体を形成することができるＣＤＣＡ８の変異型を意味する。したがって、ドミナントネガティブな断片は、完全長ＣＤＣＡ８ポリペプチドと機能的に等価ではないものである。好ましいドミナントネガティブな断片は、ＡＵＲＫＢ結合領域、例えば、ＣＤＣＡ８タンパク質の一部分を含み、かつＡＵＲＫＢによる２つのリン酸化領域、Ｓｅｒ−１５４、Ｓｅｒ−２１９、Ｓｅｒ−２７５、およびＴｈｒ−２７８を含む。
ＮＳＣＬＣを治療または予防するための薬学的組成物
本発明はまた、ＣＤＣＡ８遺伝子もしくはＡＵＲＫＢ遺伝子の発現または活性を改変する化合物をスクリーニングする本発明の方法によって選択された化合物を含む、ＮＳＣＬＣを治療または予防するための組成物を提供する。例えば、本発明は、以下からなる群より選択される少なくともいずれか１つの機能を有する阻害剤の薬学的有効量を含む、ＮＳＣＬＣを治療または予防するための組成物を提供する：
ｉ．ＣＤＣＡ８とＡＵＲＫＢとの間の結合を阻害する；
ｉｉ．ＡＵＲＫＢによるＣＤＣＡ８のリン酸化を阻害する；
ｉｉｉ．ＣＤＣＡ８遺伝子およびＡＵＲＫＢ遺伝子のいずれか一方またはその両方の転写を阻害する；ならびに
ｉｖ．ＡＵＲＫＢによるＣＤＣＡ８安定化を阻害する。
本発明は、ＮＳＣＬＣを治療または予防するための薬学的組成物を製造するための、以下からなる群より選択される少なくともいずれか１つの機能を有する阻害剤の使用を提供する：
ｉ．ＣＤＣＡ８とＡＵＲＫＢとの間の結合を阻害する；
ｉｉ．ＡＵＲＫＢによるＣＤＣＡ８のリン酸化を阻害する；
ｉｉｉ．ＣＤＣＡ８遺伝子およびＡＵＲＫＢ遺伝子のいずれか一方またはその両方の転写を阻害する；ならびに
ｉｖ．ＡＵＲＫＢによるＣＤＣＡ８安定化を阻害する。
本発明はさらに、ＮＳＣＬＣを治療または予防するための、以下からなる群より選択される少なくともいずれか１つの機能を有する阻害剤を提供する：
ｉ．ＣＤＣＡ８とＡＵＲＫＢとの間の結合を阻害する；
ｉｉ．ＡＵＲＫＢによるＣＤＣＡ８のリン酸化を阻害する；
ｉｉｉ．ＣＤＣＡ８遺伝子およびＡＵＲＫＢ遺伝子のいずれか一方またはその両方の転写を阻害する；ならびに
ｉｖ．ＡＵＲＫＢによるＣＤＣＡ８安定化を阻害する。
好ましい態様では、ＣＤＣＡ８またはＡＵＲＫＢを特異的に阻害する化合物または薬剤を、本発明における阻害剤として使用することができる。阻害ポリヌクレオチドおよび阻害ポリペプチドとの関連における「特異的に阻害する」という用語は、ＣＤＣＡ８および／またはＡＵＲＫＢの発現または生物学的機能を阻害する薬剤またはリガンドの能力を指す。特異的阻害は、典型的に、ＣＤＣＡ８および／またはＡＵＲＫＢの発現（例えば、転写または翻訳）または測定される生物学的機能（例えば、細胞の成長または増殖、アポトーシスの阻害、ＣＤＣＡ８からの細胞内シグナル伝達、例えばＡＵＲＫＢによるリン酸化）の、バックグラウンドと比較して少なくとも約２倍の阻害、好ましくは約１０倍超、および最も好ましくは１００倍超の阻害を引き起こす。発現レベルおよび／または生物学的機能は、処理した細胞と未処理の細胞、または処理前の細胞集団と処理後の細胞集団を比較する状況において測定することができる。いくつかの態様において、ＣＤＣＡ８および／またはＡＵＲＫＢの発現または生物学的機能は完全に阻害される。典型的に、特異的阻害は、適切な統計的検定を用いて、ＣＤＣＡ８および／またはＡＵＲＫＢの発現または生物学的機能の統計的に有意な減少（例えば、ｐ≦０．０５）である。
ＣＤＣＡ８遺伝子およびＡＵＲＫＢ遺伝子のいずれか一方の転写を阻害する（（ｉｉｉ）および（ｉｖ））そのような有効成分は、上記のような、該遺伝子に対するアンチセンスオリゴヌクレオチド、ｓｉＲＮＡ、もしくはリボザイム、またはアンチセンスオリゴヌクレオチド、ｓｉＲＮＡ、もしくはリボザイムの発現ベクターなどの誘導体であってもよい。または、ＡＵＲＫＢによるＣＤＣＡ８のリン酸化を阻害する（（ｉｉ）および（ｉｖ））有効成分は、上記のような、ＣＤＣＡ８のドミナントネガティブ変異体であってよい。さらに、ＣＤＣＡ８のアンタゴニストを、ＣＤＣＡ８とＡＵＲＫＢとの間の結合を阻害する（（ｉ））有効成分として使用することができる。または、そのような有効成分は、上記のスクリーニング方法によって選択することができる。
本発明のスクリーニング方法によって単離された化合物を、細胞増殖性疾患（例えば非小細胞肺癌）を治療するために、ヒト、およびマウス、ラット、モルモット、ウサギ、ネコ、イヌ、ヒツジ、ブタ、ウシ、サル、ヒヒ、またはチンパンジーなど他の哺乳動物用の薬剤として投与する場合、単離された化合物は直接投与するか、または従来の薬学的調製方法を用いて剤形へ製剤化することもできる。本発明の組成物のこのような薬学的製剤には、経口投与、直腸投与、経鼻投与、局所投与（頬側および舌下を含む）、膣内投与もしくは非経口投与（筋肉内、皮下、および静脈内を含む）、または吸入もしくは吹入による投与に適したものが含まれる。製剤は任意で、個別の投薬単位で包装されてもよい。
例えば、必要に応じて、薬剤は糖衣錠、カプセル剤、エリキシル剤、およびマイクロカプセルとして経口投与することができ、または水もしくは任意の他の薬学的に許容される液体を含む滅菌溶液もしくは滅菌懸濁液である注射剤の形態として非経口投与することができる。例えば、薬剤は、一般的に許容される薬物投与に必要な単位投与剤形として、薬学的に許容される担体または媒体、具体的には滅菌水、生理食塩水、植物油、乳化剤、懸濁剤、界面活性剤、安定化剤、着香剤、賦形剤、溶媒、保存剤、結合剤等と共に混合することができる。これらの調製物中の有効成分の量により、指定された範囲内の適切な投与量を得ることができる。
製剤は任意で、個別の投薬単位で包装されてもよい。経口投与に適した薬学的製剤には、限定されないが、カプセル剤、カシェ剤、または錠剤が含まれ、それぞれ、所定の量の活性成分を含む。例示的な製剤には、散剤、顆粒剤、液剤、懸濁剤、および乳剤もさらに含まれる。活性成分は任意で、ボーラス舐剤、またはペースト剤として投与される。経口投与に適した錠剤およびカプセル剤は、結合剤、増量剤、滑沢剤、崩壊剤、および／または湿潤剤など従来の賦形剤を含んでもよい。錠剤は、任意で１種または複数種の製剤用成分と共に、圧縮または成形することによって製造してもよい。粉末または顆粒など易流動性の形態の活性成分を、任意で結合剤、滑沢剤、不活性な希釈剤、潤滑剤、表面活性剤、または分散剤と混合して、適切な機械中で圧縮することによって、圧縮錠剤を調製してもよい。不活性な液体希釈剤で湿らせた粉末状化合物の混合物を適切な機械中で成形することによって、成形錠剤を製造してもよい。当技術分野において周知の方法によって、錠剤をコーティングしてもよい。
経口用液体製剤は、例えば水性もしくは油性の懸濁剤、液剤、乳剤、シロップ剤、もしくはエリキシル剤の形態でもよく、または使用前に水もしくは他の適切な溶剤を用いて溶解するための乾燥製品として提供されてもよい。このような液体製剤は、懸濁化剤、乳化剤、非水性溶剤（食用油を含んでもよい）、または保存剤など従来の添加剤を含んでもよい。錠剤を任意で、インビボでの活性成分の徐放または制御放出を提供するように製剤化してもよい。錠剤のパッケージは、各月に服用されるべき１つの錠剤を含んでもよい。これらの製剤中の薬剤の配合および用量により、指定された範囲内の適切な投薬量が得られる。
非経口投与用の例示的な製剤には、抗酸化剤、緩衝剤、静菌剤、および対象とするレシピエントの血液とその製剤とを等張性にする溶質を任意で含む、水性および非水性の無菌注射液剤、ならびに限定されないが懸濁化剤および増粘剤を含んでもよい水性および非水性の滅菌懸濁剤が含まれる。製剤を、単位投与用容器または複数回投与用容器、例えば密閉されたアンプルおよびバイアルに入れて提供してもよく、使用する直前に、無菌の液体担体、例えば生理食塩水、注射用水の添加のみを必要とする、フリーズドライ（凍結乾燥）状態で保存してもよい。または、製剤を持続注入用に提供してもよい。用時溶解注射用の液剤および懸濁剤は、先に述べた種類の無菌の散剤、顆粒剤、および錠剤から調製され得る。
直腸投与用の例示的な製剤には、ココアバターまたはポリエチレングリコールなど標準的な担体を伴う坐剤が含まれる。口に、例えば口腔内または舌下に局所投与するための製剤には、スクロースおよびアラビアゴムまたはトラガカントゴムなどの風味付きの基剤中に活性成分を含むトローチ剤、ならびにゼラチン、グリセリン、スクロース、またはアラビアゴムなどの基剤中に活性成分を含む香錠が含まれる。活性成分を鼻腔内投与する場合、液体スプレーもしくは分散性の散剤、または滴剤の形態で使用され得る。滴剤はまた、１種もしくは複数種の分散剤、可溶化剤、もしくは懸濁化剤もまた含む水性または非水性の基剤と共に製剤化することができる。
吸入による投与の場合、組成物は、注入器、ネブライザー、加圧パック、またはエアロゾルスプレーを送達する他の好都合な手段から都合よく送達してもよい。加圧パックは、ジクロロジフルオロメタン、トリクロロフルオロメタン、ジクロロテトラフルオロエタン、二酸化炭素、または他の適切な気体など適切な噴射剤を含み得る。加圧したエアロゾルの場合、投薬単位は、計量された量を送達するバルブを提供することによって決定され得る。
吸入もしくは吹入による投与の場合、組成物は、乾燥粉末組成物、例えば活性成分とラクトースまたはデンプンなど適切な粉末基剤との粉末混合物の形態をとってもよい。粉末組成物は、単位剤形、例えばカプセル、カートリッジ、ゼラチンまたはブリスターパックに入れて提供されてもよく、散剤は、吸入器または注入器の補助によりこれらから投与され得る。
他の適切な製剤には、治療物質を放出する、埋め込み可能な器具および接着性のパッチが含まれる。
所望の場合には、前述の製剤は、活性成分の持続放出を提供するように適合され得る。薬学的組成物はまた、限定されないが、抗菌剤、免疫抑制剤、および保存剤を含む他の活性成分も含んでもよい。
具体的に前述した成分に加えて、本発明の製剤は、該当する製剤のタイプを考慮して、当技術分野において慣例的な他の物質を含み得ること、例えば経口投与に適したものは矯味剤を含み得ることが、理解されるべきである。
好ましい単位投薬製剤は、後述するような有効な用量の活性成分またはその適切な分割量を含むものである。
当業者に周知の方法を用いて、本方法のスクリーニング方法によって同定された薬剤を患者に、例えば動脈内、静脈内、または経皮注射として投与することができ、また鼻腔内、筋肉内、または経口投与として投与することもできる。使用する用量は、対象の年齢および性別、治療される障害の詳細、ならびにその重症度を含むいくつかの要因に依存する。同様に投与経路も、状態およびその重症度に応じて変わり得る。例えば、薬剤がＤＮＡによってコードされ得る場合、そのＤＮＡを遺伝子治療用のベクターに挿入し、そのベクターを患者に投与して治療を行うことができる。
前述した各状態に対して、組成物、例えばポリペプチドおよび有機化合物は、１日当たり約０．１ ｍｇ／ｋｇ〜約２５０ ｍｇ／ｋｇの用量で経口的に、または注射によって投与され得る。ヒト成人に対する用量範囲は、一般に約５ ｍｇ／日〜約１７．５ ｇ／日、好ましくは約５ ｍｇ／日〜約１０ ｇ／日、および最も好ましくは約１００ ｍｇ／日〜約３ ｇ／日である。錠剤、または個別の単位で提供される形態の他の単位剤形は、便宜的に、そのような投薬量で、またはその倍数量として効果的である量を含んでよく、例えば各単位は、約５ ｍｇ〜約５００ ｍｇ、通常約１００ ｍｇ〜約５００ ｍｇを含む。
上記のように、本発明はさらに、過剰発現された遺伝子の発現を阻害する活性成分を含む、ＮＳＣＬＣを治療または予防するための組成物も提供する。活性成分は、その誘導体に対して不活性である適切な基剤材料と混合することによって、リニメント剤またはパップ剤などの外用製剤に調剤することができる。
同様に必要に応じて、活性成分は、賦形剤、等張化剤、可溶化剤、保存剤、鎮痛剤などを添加することによって、錠剤、散剤、顆粒剤、カプセル剤、リポソームカプセル剤、注射剤、液剤、点鼻剤、および凍結乾燥剤に製剤化することができる。これらは、核酸を含む薬剤を調製するための従来の方法に従って調製することができる。
好ましくは、アンチセンスオリゴヌクレオチド誘導体、ｓｉＲＮＡ誘導体、またはリボザイム誘導体は、患部に直接適用することによって、または疾患部位に到達するように血管中に注射することによって、患者に与えられる。封入剤もまた、耐久性および膜透過性を高めるために、組成物中で使用することができる。封入剤の例には、リポソーム、ポリ−Ｌ−リシン、脂質、コレステロール、リポフェクチン、およびそれらの誘導体が含まれる。
このような組成物の投薬量を、患者の状態によって適切に調整し、所望の量で使用することができる。例えば、０．１ ｍｇ／ｋｇ〜１００ ｍｇ／ｋｇ、好ましくは０．１ ｍｇ／ｋｇ〜５０ ｍｇ／ｋｇの用量範囲を投与することができる。
本発明の別の態様は、ＣＤＣＡ８ポリペプチドもしくはＡＵＲＫＢポリペプチドに対する抗体、またはそのポリペプチドに結合する抗体の断片から構成される、ＮＳＣＬＣを治療または予防するための組成物である。
投薬量は症状によって変動し得るが、ＮＳＣＬＣを治療または予防するための抗体またはその断片の例示的な用量は、通常の成人（体重６０ ｋｇ）に経口投与する場合、１日当たり約０．１ ｍｇ〜約１００ ｍｇ、好ましくは１日当たり約１．０ ｍｇ〜約５０ ｍｇ、およびより好ましくは１日当たり約１．０ ｍｇ〜約２０ ｍｇである。
通常の成人（体重６０ ｋｇ）へ注射の形態で非経口的に投与する場合、患者の状態、疾患の症状、および投与方法によっていくらかの違いはあるが、１日当たり約０．０１ ｍｇ〜約３０ ｍｇ、好ましくは１日当たり約０．１ ｍｇ〜約２０ ｍｇ、およびより好ましくは１日当たり約０．１ ｍｇ〜約１０ ｍｇの用量を静脈内注射することが好都合である。同様に、他の動物の場合も、体重６０ ｋｇに変換した量を投与することが可能である。
ＮＳＣＬＣの予後を評価するための方法
本明細書において同定される差次的に発現されるＣＤＣＡ８遺伝子またはＡＵＲＫＢ遺伝子はまた、ＮＳＣＬＣの治療の経過を予測、試験、またはモニターすることを可能にし得る。この方法では、試験生物試料は、ＮＳＣＬＣの治療を受けている対象から提供される。所望の場合は、複数の試験生物試料が、様々な時点、例えば治療前、治療中、または治療後に対象から採取される。次いで、試料中の１つまたは複数のＣＤＣＡ８遺伝子またはＡＵＲＫＢ遺伝子の発現レベルを測定し、治療を受けていないＮＳＣＬＣの公知の状態を有する参照試料と比較する。本発明のいくつかの好ましい態様において、ＣＤＣＡ８遺伝子およびＡＵＲＫＢ遺伝子の両方の発現レベルを検出してもよい。
本発明との関連では、予後不良の決定を用いて、例えば、生活の質を落とすさらなる治療を中止する、以前に用いられたものと異なる様式で癌を治療する、またはより積極的に癌を治療するといった、さらなる治療を決定することができる。言い換えれば、予後の評価によって、臨床医は、組織試料採取に関する日常的な手順を用いて疾患の慣例的な臨床病期の情報を得ることもなく、個々のＮＳＣＬＣ患者に最も適した治療を予め選択することができる。
さらに、本発明の方法を用いて、治療過程の有効性を評価することもできる。例えば、ＣＤＣＡ８および／またはＡＵＲＫＢ発現のレベル上昇を含むことが見出された生体試料が得られた、癌を有する哺乳動物において、経時的にＣＤＣＡ８およびＡＵＲＫＢの発現レベルをモニターすることによって、抗癌治療の有効性を評価することができる。例えば、治療開始前または治療初期に哺乳動物から採取した試料で認められたレベルと比べて、治療過程後のその哺乳動物から採取した生体試料におけるＣＤＣＡ８および／またはＡＵＲＫＢの発現レベルが低下していれば、その治療が有効な治療であることが示され得る。
本発明に従って、対象の予後を評価するための他の試験結果に加えて、中間結果もまた提供され得る。そのような中間結果は、医師、看護師、または他の医療関係者が対象の予後を評価、決定、または推定するのに役立つ。予後を評価するために、本発明によって得られる中間結果と組み合わせて考慮され得るさらなる情報には、対象の臨床症状および健康状態が含まれる。
本発明との関連において、参照試料がＮＳＣＬＣ細胞を含まない場合、試験生物試料中および参照試料中のＣＤＣＡ８遺伝子またはＡＵＲＫＢ遺伝子の発現レベルが類似するならば、治療の有効性が示唆される。しかしながら、試験中のＣＤＣＡ８遺伝子またはＡＵＲＫＢ遺伝子の発現レベルが参照試料と比較して異なるならば、臨床転帰または予後があまり好ましくないことが示唆される。
本発明との関連において、予後の好ましい患者から得たＮＳＣＬＣ細胞を、参照試料として使用してもよい。例えば一般に、患者が手術後５年より長く生存できた場合、患者の予後は良好であった。より具体的には、長期生存者（すなわち予後良好）群および短期生存者（すなわち予後不良）群は、腫瘍特異的５年生存率の平均がそれぞれ６９％超および４５％未満であった患者を含む。したがって、このような短期生存者に由来し、かつ強い染色を示す試料は、予後不良の陽性対照として使用することができる。
患者由来の試料の代わりに、患者由来の試料と同様の強い染色を示す試料または肺癌細胞株も、陽性対照として使用することができる。さらに、いくつかの態様において、ＣＤＣＡ８およびＡＵＲＫＢを発現していない正常な肺細胞、肺癌細胞、または他の細胞を、予後不良の陰性対照として使用することができる。
本発明はまた、以下からなる群より選択される１つまたは複数の構成要素を含む、ＮＳＣＬＣの予後を試験および評価するためのキットも含む：
（ａ）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２（ＣＤＣＡ８）またはＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４（ＡＵＲＫＢ）のアミノ酸配列をコードするｍＲＮＡの存在を検出するための試薬、
（ｂ）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２（ＣＤＣＡ８）またはＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４（ＡＵＲＫＢ）のアミノ酸配列を有するタンパク質の存在を検出するための試薬、および
（ｃ）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２（ＣＤＣＡ８）またはＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４（ＡＵＲＫＢ）のアミノ酸配列を有するタンパク質の生物活性を検出するための試薬。
いくつかの好ましい態様において、（ａ）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２（ＣＤＣＡ８）またはＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４（ＡＵＲＫＢ）のアミノ酸配列をコードするｍＲＮＡの存在を検出するための試薬は、ＣＤＣＡ８核酸またはＡＵＲＫＢ核酸に相補的なオリゴヌクレオチド配列のような、ＣＤＣＡ８核酸もしくはＡＵＲＫＢ核酸に特異的に結合するか、またはそれを特定する核酸であってよい。具体的には、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２（ＣＤＣＡ８）およびＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４（ＡＵＲＫＢ）のアミノ酸配列は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１およびＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３のヌクレオチド配列によってコードされる。したがって、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１およびＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３のヌクレオチド配列より選択されるヌクレオチド配列を含むオリゴヌクレオチドは、本発明の好ましいプライマーまたはプローブとして使用され得る。また、本発明において、（ｂ）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２（ＣＤＣＡ８）またはＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４（ＡＵＲＫＢ）のアミノ酸配列を含むタンパク質の存在を検出するための試薬は、ＣＤＣＡ８タンパク質またはＡＵＲＫＢタンパク質に結合する抗体であってよい。
さらに、ＣＤＣＡ８またはＡＵＲＫＢの生物活性、例えば、Ｓｅｒ−１５４、Ｓｅｒ−２１９、Ｓｅｒ−２７５、およびＴｈｒ−２７８における、ＣＤＣＡ８のＡＵＲＫＢ依存性リン酸化もまた、任意の適切な分析方法を用いて検出され得る。これらの検出試薬は、キットの形態で一緒に包装してもよい。これらの試薬、例えば（固体マトリックスに結合するか、もしくはマトリックスにそれらを結合させるための試薬と共に別々に包装される）核酸もしくは抗体、対照試薬（陽性および／もしくは陰性）、ならびに／または検出可能な標識は、好ましくは、別々の容器に包装される。アッセイ法を実施するための取扱い説明書（例えば、文書、テープ、ＶＣＲ、ＣＤ−ＲＯＭなど）もキットに含まれてよい。キットのアッセイ形式は、ノーザンハイブリダイゼーションまたはサンドイッチＥＬＩＳＡでよく、いずれも当技術分野において公知である。
例えば検出試薬を、多孔質ストリップのような固体マトリックス上に固定して、少なくとも１つのＮＳＣＬＣ検出部位を形成させてもよい。多孔質ストリップの測定領域または検出領域は、それぞれが核酸を含む複数の部位を含んでもよい。テストストリップは、陰性対照および／または陽性対照用の部位も含んでもよい。または対照部位を、テストストリップとは別のストリップ上に配置してもよい。任意で、異なる検出部位が、異なる量の固定された核酸を含んでもよく、すなわち第１の検出部位により多くの量を含み、次の部位により少ない量を含んでもよい。試験試料を添加した際、検出可能なシグナルを提示する部位の数が、試料の予後の定量的な指標を提供する。検出部位は、適切に検出することができる任意の形状で構成されてよく、典型的には、テストストリップの幅にわたる棒または点の形状である。
好ましい態様において、本発明のキットは、（ａ）〜（ｃ）から選択される少なくとも１つの要素に加えて、（ｄ）それぞれ予後不良または予後良好を有する患者に由来する陽性対照試料および陰性対照試料のいずれか一方または両方をさらに含み得る。特に、患者のＮＳＣＬＣ病巣から採取した固定された肺細胞または肺組織を、免疫染色におけるこれらの対照試料として使用することができる。
以下に、実施例を参照しながら本発明をさらに詳細に説明する。しかしながら、以下の材料、方法、および実施例は、本発明を例証するため、ならびにその作製および使用において当業者を補助するために提示するに過ぎない。本実施例は、決して他に本発明の範囲を限定することを意図するものではない。したがって、本明細書に記載するものと類似のまたは同等な方法および材料を、本発明の実施または試験において用いることができる。
実施例
材料および方法：
（ａ）肺癌細胞株および組織試料：
本実施例で使用したヒト肺癌細胞株は、以下の通りであった：肺腺癌（ＡＤＣ）、Ａ４２７、Ａ５４９、ＬＣ３１９、ＰＣ１４、およびＮＣＩ−Ｈ１３７３；肺扁平上皮癌（ＳＣＣ）、ＳＫ−ＭＥＳ−１、ＥＢＣ−１、およびＮＣＩ−Ｈ２２６；ならびに小細胞肺癌（ＳＣＬＣ）、ＤＭＳ１１４、ＤＭＳ２７３、ＳＢＣ−３、およびＳＢＣ−５。本実施例で使用したヒト肺由来細胞は、以下の通りであった：アメリカンタイプカルチャーコレクション（ＡＴＣＣ；バージニア州、マナッサス）から購入したＭＲＣ−５（線維芽細胞）、ＣＣＤ−１９Ｌｕ（線維芽細胞）、およびＢＥＡＳ−２Ｂ（肺上皮、気管支）。
細胞はすべて、１０％ウシ胎仔血清（ＦＣＳ）を添加した適切な培地中で単層で培養し、５％ ＣＯ２を含む加湿大気雰囲気中、３７℃で維持した。ヒト小気道上皮細胞（ＳＡＥＣ）は、Ｃａｍｂｒｅｘ Ｂｉｏ Ｓｃｉｅｎｃｅ Ｉｎｃ．（メリーランド州、ウォーカーズビル）から購入した最適化培地（ＳＡＧＭ）中で培養した。原発性肺癌試料は、以前に記載された通りに（Kato T, et al., Cancer Res. 2005 Jul 1;65(13):5638-46）、書面によるインフォームドコンセントを得て取得した。組織マイクロアレイ解析における免疫染色用の全部で２７３例のＮＳＣＬＣ試料および隣接する正常肺組織試料もまた、患者から取得した。本明細書に記載する実験およびすべての臨床材料の使用は、個々の施設内倫理委員会によって承認された。
（ｂ）半定量的ＲＴ−ＰＣＲ：
製造業者のプロトコルに従ってＴｒｉｚｏｌ試薬（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ， Ｉｎｃ．、メリーランド州、ゲイサーズバーグ）を用いて、培養細胞および臨床組織から全ＲＮＡを抽出した。抽出したＲＮＡおよび正常ヒト組織ポリ（Ａ）ＲＮＡをＤＮａｓｅ Ｉ（ニッポンジーン、日本、東京）で処理し、オリゴ（ｄＴ）プライマーおよびＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔ ＩＩ逆転写酵素（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、カリフォルニア州、カールズバッド）を用いて逆転写した。以下の合成ＣＤＣＡ８特異的プライマー、ＡＵＲＫＢ特異的プライマー、Ｅ２Ｆ−１特異的プライマーを用いて、または内部標準としてのβ−アクチン（ＡＣＴＢ）特異的プライマーを用いて、半定量的ＲＴ−ＰＣＲ実験を行った：
ＣＤＣＡ８、５’−ＣＡＴＣＴＧＧＣＡＴＴＴＣＴＧＣＴＣＴＣＴＡＴ−３’（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２１）および５’−ＣＴＣＡＧＧＧＡＡＡＧＧＡＧＡＡＴＡＡＡＡＧＡＡＣ−３’（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２２）；
ＡＵＲＫＢ、５’−ＣＣＣＡＴＣＴＧＣＡＣＴＴＧＴＣＣＴＣＡＴ−３’ （ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２３）および５’−ＡＡＣＡＧＡＴＡＡＧＧＧＡＡＣＡＧＴＴＡＧＧＧＡ−３’（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２４）；
Ｅ２Ｆ−１、５’−ＧＧＡＧＴＣＴＧＴＧＴＧＧＴＧＴＧＴＡＴＧＴＧ−３’（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２５）および５’−ＧＡＧＧＧＡＡＣＡＧＡＧＣＴＧＴＴＡＧＧＡＡＧ−３’（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２６）；
ＡＣＴＢ、５’−ＧＡＧＧＴＧＡＴＡＧＣＡＴＴＧＣＴＴＴＣＧ−３’（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２７）および５’−ＣＡＡＧＴＣＡＧＴＧＴＡＣＡＧＧＴＡＡＧＣ−３’（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２８）。
ＰＣＲ反応は、増幅の対数期の範囲内で産物の強度を確保するように、サイクル数を最適化した。
（ｃ）ノーザンブロット解析：
２３の組織を含むヒト多組織ブロット（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ Ｃｌｏｎｔｅｃｈ、カリフォルニア州、パロアルト）を、ＣＤＣＡ８の３２Ｐ標識ＰＣＲ産物とハイブリダイズさせた。ＣＤＣＡ８のｃＤＮＡプローブは、上記のプライマーを用いてＲＴ−ＰＣＲにより調製した。供給業者の推奨に従って、プレハイブリダイゼーション、ハイブリダイゼーション、および洗浄を行った。増感ＢＡＳスクリーン（ＢＩＯ−ＲＡＤ、カリフォルニア州、ハーキュリーズ）を用いて、室温で３０時間、ブロットをオートラジオグラフ撮影した。
（ｄ）抗体：
抗ＣＤＣＡ８抗体を得るために、ｐＥＴ２８ベクター（Ｎｏｖａｇｅｎ、ウィスコンシン州、マディソン）を用いて、ＮＨ２（Ｎ）末端にＨｉｓタグ化エピトープを含むＣＤＣＡ８の全長を発現するプラスミドを調製した。組換えタンパク質を大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）、ＢＬ２１ ＣｏｄｏｎＰｌｕｓ株（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ、カリフォルニア州、ラ・ホーヤ）で発現させ、供給業者のプロトコルに従ってＴＡＬＯＮ樹脂（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）を用いて精製した。ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルに抽出したタンパク質をウサギに接種し、標準的な方法論に従って、免疫血清をアフィニティーカラムで精製した。アフィニティー精製したウサギポリクローナル抗ＣＤＣＡ８抗体を、ウェスタンブロットおよび免疫染色に使用した。ウサギポリクローナル抗ＡＵＲＫＢ抗体は、ａｂｃａｍ Ｉｎｃ．から購入した（カタログ番号ａｂ２２５４；英国、ケンブリッジ）。ウェスタンブロットにおいて、ＣＤＣＡ８およびＡＵＲＫＢを内因的に発現するかもしくは発現しないＮＳＣＬＣ細胞株、またはＣＤＣＡ８もしくはＡＵＲＫＢ発現ベクターをトランスフェクションした細胞の溶解物を用いて、この抗体がＣＤＣＡ８またはＡＵＲＫＢに特異的であることを確認した。
（ｅ）ウェスタンブロット：
細胞を溶解緩衝液；５０ ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ ８．０）、１５０ ｍＭ ＮａＣｌ、０．５％ ＮＰ−４０、０．５％デオキシコール酸Ｎａ、０．１％ ＳＤＳ、およびプロテアーゼ阻害剤（プロテアーゼ阻害剤カクテルセットＩＩＩ；Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ、ドイツ、ダルムシュット）中に溶解した。以前に記載された通りに（Kato T, et al., Cancer Res. 2005 Jul 1;65(13):5638-46; Furukawa C, et al., Cancer Res. 2005 Aug 15;65(16):7102-10）、ＥＣＬウェスタンブロット解析系（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ Ｂｉｏ−ｓｃｉｅｎｃｅｓ、ニュージャージー州、ピスカタウェイ）を使用した。
（ｆ）免疫細胞化学：
培養細胞をＰＢＳ（−）で２回洗浄し、４％ホルムアルデヒド溶液中で室温で６０分間固定し、０．１％ Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００を含むＰＢＳ（−）で１．５分間処理することによって透過性にした。一次抗体反応の前に、細胞をＰＢＳ（−）中の３％ ＢＳＡで６０分間覆って、非特異的結合をブロックした。次いで、これらの細胞をヒトＣＤＣＡ８タンパク質もしくはヒトＡＵＲＫＢタンパク質に対する抗体、または抗ＦＬＡＧモノクローナル抗体（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ Ｃｏ．、ミズーリ州、セントルイス）と共にインキュベートした。免疫複合体をＡｌｅｘａ５９４結合ヤギ抗ウサギ二次抗体（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ、オレゴン州、ユージーン）で染色し、レーザー共焦点顕微鏡（ＴＣＳ ＳＰ２ ＡＯＢＳ：Ｌｅｉｃａ Ｍｉｃｒｏｓｙｓｔｅｍｓ、ドイツ、ウェッツラー）で観察した。
Ａ５４９細胞で安定に発現させた野生型ＣＤＣＡ８または変異体ＣＤＣＡ８の細胞周期依存性発現および局在性を決定するために、以前に記載された通りに（Suzuki C, et al., Cancer Res. 2005 Dec 15;65(24):11314-25）、Ｇ１／Ｓ境界における同調をアフィディコリンブロックによって達成した。細胞を１マイクログラム／ｍｌのアフィディコリン（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ， Ｃｏ．）で２４時間処理し、ＰＢＳで４回洗浄することによって細胞周期停止から解放した。これらの細胞を培地中で培養し、細胞周期停止の解放から１．５時間および９時間後に解析のため回収し、免疫ブロットおよび免疫染色に使用した。
（ｇ）免疫組織化学および組織マイクロアレイ解析：
臨床材料中のＣＤＣＡ８／ＡＵＲＫＢタンパク質を調べるために、ＥＮＶＩＳＩＯＮ＋キット／ＨＲＰ（ＤａｋｏＣｙｔｏｍａｔｉｏｎ、デンマーク、グロストルップ）を用いて組織切片を染色した。内因性のペルオキシダーゼおよびタンパク質をブロックした後、アフィニティー精製した抗ＣＤＣＡ８抗体または抗ＡＵＲＫＢ抗体を添加し、各切片を二次抗体としてのＨＲＰ標識抗ウサギＩｇＧと共にインキュベートした。基質−色素原を添加し、ヘマトキシリンで試料を対比染色した。
公開されたプロトコルに従って、ホルマリン固定したＮＳＣＬＣを用いて腫瘍組織マイクロアレイを構築した（Chin SF, et al., Mol Pathol. 2003 Oct;56(5):275-9; Callagy G, et al., Diagn Mol Pathol. 2003 Mar;12(l):27-34; Callagy G, et al., J Pathol. 2005 Feb;205(3):388-96）。ＣＤＣＡ８およびＡＵＲＫＢに対する陽性を、臨床追跡データの事前知識を持たない独立した研究者３名によって半定量的に評価した。組織化学染色の強度は、なし（０としてスコア化）、弱い（１＋）、または強い（２＋）として記録した。全スコアが強い陽性として判断された場合に、その症例は２＋としてスコア化された。
（ｈ）統計解析：
年齢、性別、および病理学的ＴＮＭ病期などの臨床病理学的変数と、組織マイクロアレイ解析によって決定されたＣＤＣＡ８タンパク質およびＡＵＲＫＢタンパク質の発現レベルとを相関させることを試みた。腫瘍特異的生存曲線を、手術日からＮＳＣＬＣに関連した死亡時まで、または最後の追跡観察時まで算出した。各関連変数に関して、およびＣＤＣＡ８またはＡＵＲＫＢ発現に関してカプラン・マイヤー曲線を算出し、患者サブグループ間の生存期間の差異をログランク検定を用いて解析した。コックス比例ハザード回帰モデルを用いて単変量解析を行って、臨床病理学的変数と癌関連死亡率との関連を決定した。
（ｉ）ＲＮＡ干渉アッセイ：
哺乳動物細胞中でｓｉＲＮＡを合成するように設計した、ベクターに基づくＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）系、ｐｓｉＨ１ＢＸ３．０を以前に確立した（Suzuki C, et al., Cancer Res. 2003 Nov 1;63(21):7038-41; Kato T, et al., Cancer Res. 2005 Jul 1;65(13):5638-46; Furukawa C, et al., Cancer Res. 2005 Aug 15;65(16):7102-10; Suzuki C, et al., Cancer Res. 2005 Dec 15;65(24):11314-25. Ishikawa N, et al., Cancer Sci. 2006 Aug;97(8):737-45; Takahashi K, et al., Cancer Res. 2006 Oct 1;66(19):9408-19; Hayama S, et al., Cancer Res. 2006 Nov 1;66(21):10339-48）。Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ ２０００（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ） ３０マイクロリットルを用いて、肺癌細胞株であるＬＣ３１９およびＳＢＣ−５にｓｉＲＮＡ発現ベクター１０マイクログラムをトランスフェクションした。トランスフェクションした細胞を、適切な濃度のジェネテシン（Ｇ４１８）の存在下で７日間培養し、ギムザ染色によってコロニー数を計数し、Ｇ４１８処理の７日後にＭＴＴアッセイ法（Ｃｅｌｌ Ｃｏｕｎｔｉｎｇ Ｋｉｔ−８溶液：同仁化学、日本、熊本）によって細胞生存率を評価した。ＣＤＣＡ８タンパク質発現の抑制を確認するために、標準的なプロトコルに従って、ＣＤＣＡ８に対するアフィニティー精製ポリクローナル抗体を用いてウェスタンブロットを行った。ＲＮＡｉ用の合成オリゴヌクレオチドの標的配列は、以下の通りであった：
対照１（ＥＧＦＰ：強化緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）遺伝子、オワンクラゲ（Ａｅｑｕｏｒｅａ ｖｉｃｔｏｒｉａ）ＧＦＰの変異体）、５’−ＧＡＡＧＣＡＧＣＡＣＧＡＣＴＴＣＴＴＣ−３’（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２９）；
対照２（ルシフェラーゼ：北アメリカホタル（Ｐｈｏｔｉｎｕｓ ｐｙｒａｌｉｓ）ルシフェラーゼ遺伝子）、５’−ＣＧＴＡＣＧＣＧＧＡＡＴＡＣＴＴＣＧＡ−３’（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３０）；
ｓｉ−ＣＤＣＡ８−＃１、５’−ＣＡＧＣＡＧＡＡＧＣＴＡＴＴＣＡＧＡＣ−３’（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３１）；
ｓｉ−ＣＤＣＡ８−＃２、５’−ＧＣＣＧＴＧＣＴＡＡＣＡＣＴＧＴＴＡＣ−３’（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３２）；
ｓｉ−ＡＵＲＫＢ、５’−ＧＧＴＧＡＴＴＣＡＣＡＧＡＧＡＣＡＴＡ−３’（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３３）。
（表１）ｓｉＲＮＡ発現ベクター中に挿入された特異的二本鎖オリゴヌクレオチドの配列および各ｓｉＲＮＡの標的配列
Figure 2010523081
さらに、哺乳動物細胞におけるＡＵＲＫＢ活性を阻害するために、ＡＵＲＫＢに対するｓｉＲＮＡオリゴ（ｓｉ−ＡＵＲＫＢ−＃１およびｓｉ−ＡＵＲＫＢ−＃２）およびＥＧＦＰ用の対照ｓｉＲＮＡオリゴを構築した。ＲＮＡｉ用の合成オリゴヌクレオチドの標的配列は、以下の通りであった：
対照３（ＥＧＦＰ）、５’−ＧＡＡＧＣＡＧＣＡＣＧＡＣＴＴＣＴＴＣ−３’（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５８）；
ｓｉ−ＡＵＲＫＢ−＃１、５’−ＣＣＡＡＡＣＴＧＣＴＣＡＧＧＣＡＴＡＡ−３’（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５９）；
ｓｉ−ＡＲＵＲＫＢ−＃２、５’−ＡＣＧＣＧＧＣＡＣＴＴＣＡＣＡＡＴＴＧ−３’（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６０）。
１０ ｃｍディッシュに播種した細胞を、Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ（Ｉｎｖｉｔｏｒｏｇｅｎ）と、最終濃度１００ ｎＭの
対照３（５’−ＧＡＡＧＣＡＧＣＡＣＧＡＣＵＵＣＵＵＣ−３’（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６１））
またはｓｉ−ＡＵＲＫＢ
（＃１：５’−ＣＣＡＡＡＣＵＧＣＵＣＡＧＧＣＡＵＡＡ−３’（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６２）；
＃２：５’−ＡＣＧＣＧＧＣＡＣＵＵＣＡＣＡＡＵＵＧ−３’（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６３））
との混合物中でインキュベートした。トランスフェクションの４時間後に、ｓｉＲＮＡ−ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ混合物を新鮮な培地と交換した。さらに７２時間培養した後、細胞を回収して解析した。
（ｊ）ルシフェラーゼアッセイ：
ＬＣ３１９細胞からヒトゲノムＤＮＡを抽出し、ＰＣＲの鋳型として使用した。ヒトＣＤＣＡ８遺伝子またはヒトＡＵＲＫＢ遺伝子の５’隣接領域を、以下の合成物を用いてＰＣＲにより増幅した：
ＣＤＣＡ８特異的プライマーの５’領域
５’−ＣＧＧＧＧＴＡＣＣＣＣＧＡＣＡＡＧＧＣＣＴＧＣＣＧＧＧＡＧＴＡＧＴ−３’（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４９）および
５’−ＣＣＣＡＡＧＣＴＴＧＧＧＣＧＡＡＴＣＴＧＴＧＣＡＧＣＴＣＧＴＧＴＣ−３’（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５０）、
およびＡＵＲＫＢ特異的プライマーの５’領域
５’−ＡＡＣＧＴＡＧＧＣＡＴＧＴＡＧＡＧＧＣＴＣ−３’（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５１）および
５’−ＣＧＧＧＧＡＡＧＡＡＡＧＴＧＣＴＴＡＡＡＧＧＡ−３’（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５２）。
プロモーター領域の断片をＫｐｎＩおよびＨｉｎｄＩＩＩ制限酵素で切り取り、ｐＧＬ３−Ｂａｓｉｃベクターの対応する酵素部位に挿入した。Ｅ２Ｆ−１の全コード配列を、ｐｃＤＮＡ３．１／ｍｙｃ−Ｈｉｓプラスミドベクター（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）の適切な部位にクローニングして、ｐｃＤＮＡ３．１−Ｅ２Ｆ−１を得た。Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ Ｐｌｕｓ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いて、ＣＤＣＡ８遺伝子の５’隣接領域を含むプラスミドおよびｐｈＲＬ−ＳＶ４０（Ｐｒｏｍｅｇａ、ウィスコンシン州、マディソン）を、ｐｃＤＮＡ３．１−Ｅ２Ｆ−１またはモックベクターと共にＬＣ３１９細胞に同時トランスフェクションした。ホタルルシフェラーゼ活性と、ｐｈＲＬ−ＳＶ４０から発現されたウミシイタケルシフェラーゼ活性を比較することによってホタルルシフェラーゼ活性値を規準化して、トランスフェクション効率の差異を許容した。
（ｋ）組換えＣＤＣＡ８タンパク質：
野生型ＣＤＣＡ８タンパク質、またはそれぞれセリン／スレオニンをアラニンに変異させ、Ｎ末端にＨｉｓタグ化エピトープを含む種々の欠失変異体ＣＤＣＡ８タンパク質（ＣＤＣＡ８Δ１〜ＣＤＣＡ８Δ１２）を発現する１３種のプラスミドを、ｐＥＴ２８ベクター（Ｎｏｖａｇｅｎ）を用いて調製した。組換えタンパク質を大腸菌、ＢＬ２１ ＣｏｄｏｎＰｌｕｓ株（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）で発現させ、製造業者のプロトコルに従ってＴＡＬＯＮ樹脂（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）を用いて精製した。
（ｌ）インビトロキナーゼアッセイ：
精製した組換え野生型または変異体ＣＤＣＡ８タンパク質を、プロテアーゼ阻害剤、１０ ｍＭ ＮａＦ、５ ｎＭミクロシスチンＬＲ、および５０マイクロモルＡＴＰの混合物を添加したキナーゼ緩衝液（２０ｍＭ Ｔｒｉｓ、ｐＨ ７．５、１０ ｍＭ ＭｇＣｌ２、２ ｍＭ ＭｎＣｌ２、１ ｍＭ ＰＭＳＦ、および１ ｍＭ ジチオスレイトール）中で、組換えＡＵＲＫＢ（カタログ番号１４−４８９；ｕｐｓｔａｔｅ、ニューヨーク州、レークプラシッド）および［γ−３２Ｐ］ＡＴＰと共にインキュベートした。０．２容量の５×タンパク質試料緩衝液を添加することによって反応を停止させ、タンパク質をＳＤＳ−ＰＡＧＥによって解析した。
（ｍ）合成されたドミナントネガティブペプチド：
ＡＵＲＫＢによる予想されるリン酸化部位を含む、ＣＤＣＡ８タンパク質の一部に対応するドミナントネガティブな１９または２０アミノ酸ペプチド配列を、そのＮ末端で、膜導入１１ポリアルギニン配列（１１Ｒ）に共有結合させた（Hayama S, et al., Cancer Res. 2006 Nov 1;66(21):10339-48; Matsushita M, et al., J Neurosci. 2001 Aug 15;21(16):6000-7）。３種の細胞透過性ペプチドを合成した：１１Ｒ−ＣＤＣＡ８１４７〜１６５、ＲＲＲＲＲＲＲＲＲＲＲ−ＧＧＧ−ＰＳＫＫＲＴＱＳＩＱＧＫＧＫＧＫＲＳＳ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５３）；１１Ｒ−ＣＤＣＡ８２０９〜２２８、ＲＲＲＲＲＲＲＲＲＲＲ−ＧＧＧ−ＥＲＩＹＮＩＳＧＮＧＳＰＬＡＤＳＫＥＩＦ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５４）；１１Ｒ−ＣＤＣＡ８２６１〜２８０、ＲＲＲＲＲＲＲＲＲＲＲ−ＧＧＧ−ＮＩＫＫＬＳＮＲＬＡＱＩＣＳＳＩＲＴＨＫ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５５）。ペプチドは、分取逆相ＨＰＬＣによって精製した。
ＬＣ３１９細胞、ＳＢＣ−５細胞、およびＢＥＡＳ−２Ｂ細胞を、２．５マイクロモル、５マイクロモル、および７．５マイクロモルの濃度の１１Ｒ−ペプチドと共に７日間インキュベートした。培地は適切な濃度の各ペプチドにおいて４８時間ごとに交換し、処理の７日後にＭＴＴアッセイ法によって細胞生存率を評価した。ペプチドの導入効率を確認するために、Ｎ末端をフルオロセインイソチオシアネート（ＦＩＴＣ）で標識した１１Ｒ−ＣＤＣＡ８２６１〜２８０およびその対照ペプチドを合成した。ペプチドを細胞株と共に３７℃で３時間インキュベートした後に蛍光顕微鏡観察することにより、ペプチド（２．５〜７．５マイクロモル）の導入をモニターした。１１Ｒ−ＣＤＣＡ８２６１〜２８０およびその対照ペプチドは、他で報告されている通り（Futaki S, et al. J Biol Chem 2001 276:5836-40）、ほぼすべての培養細胞に導入された。
結果：
（ａ）肺癌におけるＣＤＣＡ８およびＡＵＲＫＢの同時活性化：
２７，６４８個の遺伝子を表すｃＤＮＡマイクロアレイを１０１例の肺癌組織に用いることで、ＣＤＣＡ８が大多数の肺癌において過剰発現されると同定された。そのトランス活性化はその後、半定量的ＲＴ−ＰＣＲにより、さらなる１４例のＮＳＣＬＣ症例のうち１１例（ＡＤＣ ７例のうち４例；ＳＣＣ ７例のすべて）において確認された（図１Ａ、上部パネル）。高レベルの内因性ＣＤＣＡ８発現は、ウサギポリクローナル抗ＣＤＣＡ８抗体を用いたウェスタンブロット解析により、１１例の肺癌細胞株のすべてにおいてさらに確認された（図１Ｂ、上部パネル）。ＣＤＣＡ８ ｃＤＮＡをプローブとして用いてノーザンブロット解析を行ったところ、２．５ ｋｂの転写産物が、調べた２３のヒト組織の中で精巣において独占的に同定された（図１Ｃ）。
肺癌細胞における内因性ＣＤＣＡ８の細胞内局在性を決定するために、抗ＣＤＣＡ８抗体を用いてＬＣ３１９細胞に対して免疫細胞化学的解析を行った。ＣＤＣＡ８タンパク質は、Ｇ１／Ｓ期では細胞内の核において、ならびにＧ２／Ｍ期では細胞内の核および収縮環において主に検出された（図１Ｄ、上部パネル）。ＣＤＣＡ８は、以前に脊椎動物染色体パッセンジャー複合体の新たなメンバーとして単離され（Sampath SC, et al., Cell. 2004 Jul 23;118(2):187-202）、インビトロキナーゼアッセイによって、ｒｈＡＵＲＫＢによるＧＳＴタグ化ＣＤＣＡ８のＣ末端領域のリン酸化が示された（Gassmann R, et al., J Cell Biol. 2004 Jul 19;166(2):179-91 Epub 2004 Jul 12）。
しかしながら、正確なリン酸化部位および癌細胞におけるその機能的重要性は依然として不明である。肺癌細胞におけるＣＤＣＡ８活性化の生物学的役割を明らかにするために、以前に記載された遺伝子発現データベース（Kikuchi T, et al. Oncogene. 2003 Apr 10;22(14):2192-205; Kakiuchi S, et al., Mol Cancer Res. 2003 May;1(7):485-99; Kakiuchi S, et al., Hum Mol Genet. 2004 Dec 15;13(24):3029-43 Epub 2004 Oct 20; Kikuchi T, et al., Int J Oncol. 2006 Apr;28(4):799-805; Taniwaki M, et al., Int J Oncol. 2006 Sep;29(3):567-75）を用いて、最初にＡＵＲＫＢの発現状態を調べた。ＡＵＲＫＢは、正常肺細胞と比較して、肺癌において頻繁に過剰発現されることが見出された。さらに、本明細書におけるデータから、ＡＵＲＫＢ発現のレベルがＣＤＣＡ８の発現レベルと相関するらしいことが示された。
したがって、次に原発性肺癌組織を再度調べたところ、半定量的ＲＴ−ＰＣＲによって調べた１６例のＮＳＣＬＣ臨床試料のうち１２例（ＡＤＣ ７例のうち５例およびＳＣＣ ７例のすべて）において、ＡＵＲＫＢ発現の増加が見出された（図１Ａ、中間パネル）。肺癌におけるＡＵＲＫＢの発現パターンは、ＣＤＣＡ８の発現パターンとよく似ていた。ウェスタンブロット解析により、調べた肺癌細胞株のほぼすべてにおいて、ＣＤＣＡ８タンパク質およびＡＵＲＫＢタンパク質が同時に活性化されることもさらに確認された（図１Ｂ、中間パネル）。ウサギポリクローナル抗ＡＵＲＫＢ抗体を用いた免疫細胞化学的解析により、ＡＵＲＫＢタンパク質が、Ｇ１／Ｓ期では細胞内の核に、ならびにＧ２／Ｍ期では細胞内の核および収縮環に主に位置することが検出され、他で報告されている通り（Sampath SC, et al., Cell. 2004 Jul 23;118(2):187-202）、肺癌細胞におけるＡＵＲＫＢの細胞内局在性はＣＤＣＡ８のものとよく似ていた（図１Ｄ、右側パネル）。
（ｂ）ＣＤＣＡ８およびＡＵＲＫＢの陽性とＮＳＣＬＣ患者の予後不良との関連：
外科切除した２７３例のＮＳＣＬＣから調製した組織マイクロアレイを使用して、アフィニティー精製した抗ＣＤＣＡ８ポリクローナル抗体および抗ＡＵＲＫＢポリクローナル抗体を用いて免疫組織化学的解析を行った。ＣＤＣＡ８／ＡＵＲＫＢ発現のパターンは、なし（０としてスコア化）、弱い（１＋としてスコア化）、または強い（２＋としてスコア化）として分類した。調べた２７３例のＮＳＣＬＣ症例のうち、１１３例（４１％）が強いＣＤＣＡ８発現を示し、１００例（３７％）が弱いＣＤＣＡ８発現を示し、６０例（２２％）ではその発現はなかった。ＡＵＲＫＢに関しては、１１６例（４２％）で強い発現が認められ、９４例（３４％）で弱い発現が認められ、６３例（２４％）で発現なしが認められた。それらに隣接する正常肺組織のいずれにおいても、ＣＤＣＡ８またはＡＵＲＫＢのいずれに関しても染色は認められなかった（図２Ａ）。
２７３例の腫瘍のうち１８３例がＣＤＣＡ８およびＡＵＲＫＢの両方について陽性であり（１＋〜２＋としてスコア化）、３３例が両タンパク質について陰性であった。２７３例のうち３０例はＣＤＣＡ８についてのみ陽性であり、２７例はＡＵＲＫＢについてのみ陽性であった。ＲＴ−ＰＣＲおよびウェスタンブロットによる結果と同様に、これらの腫瘍において、ＣＤＣＡ８タンパク質の発現パターンはＡＵＲＫＢタンパク質発現と有意に一致した（χ２検定によりＰ＜０．０００１）。ＮＳＣＬＣにおけるＣＤＣＡ８の強い発現（２＋としてスコア化）は、腫瘍の大きさ（ｐＴ１対ｐＴ２〜４；χ２検定によりＰ＝０．０４１４）、リンパ節転移（ｐＮ０対ｐＮ１〜４；χ２検定によりＰ＝０．０００５）、およびより短い腫瘍特異的５年生存期間（ログランク検定によりＰ＝０．０００９）と有意に関連していることが見出された（図２Ｂ、上部左側パネル）。ＮＳＣＬＣにおけるＡＵＲＫＢの強い発現（２＋としてスコア化）も、腫瘍の大きさ（ｐＴ１対ｐＴ２〜４；χ２検定によりＰ＝０．０３６１）、リンパ節転移（ｐＮ１対ｐＮ２〜４；χ２検定によりＰ＝０．０００４）、および５年生存（ログランク検定によりＰ＝０．０００１）と有意に関連していた（図２Ｂ、上部右側パネル）。腫瘍においてＣＤＣＡ８発現もＡＵＲＫＢ発現も認められないＮＳＣＬＣ患者は、最も長い生存期間を示し得るのに対して、両マーカーについて強い陽性染色を有するＮＳＣＬＣ患者は、最も短い腫瘍特異的生存を示した（ログランク検定によりＰ＜０．０００１；図２Ｂ、下部パネル）。単変量解析を用いて、リンパ節転移（ｐＮ０対ｐＮ１、Ｎ２：Ｐ＜０．０００１；スコア検定）、腫瘍の大きさ（ｐＴ１対ｐＴ２、Ｔ３、Ｔ４：Ｐ＜０．０００１；スコア検定）、および高いＣＤＣＡ８／ＡＵＲＫＢ発現（それぞれＰ＝０．０００９およびＰ＝０．０００１；スコア検定）が、ＮＳＣＬＣ患者の予後不良の重要な相関特性であることが見出された。
（ｃ）ＣＤＣＡ８に対する特異的ｓｉＲＮＡによる肺癌細胞の増殖阻害：
ＣＤＣＡ８が肺癌細胞の増殖または生存に必須であるかどうかを評価するために、ＥＧＦＰおよびルシフェラーゼに対するｓｉＲＮＡを対照として用いて、ＣＤＣＡ８に対するｓｉＲＮＡ（ｓｉ−ＣＤＣＡ８−＃１およびｓｉ−ＣＤＣＡ８−＃２）を発現するようにプラスミドを構築した。ＬＣ３１９細胞またはＳＢＣ−５細胞にｓｉ−ＣＤＣＡ８−＃１またはｓｉ−ＣＤＣＡ８−＃２をトランスフェクションすると、２つの対照と比較して内因性ＣＤＣＡ８タンパク質の発現は有意に抑制され、ＭＴＴアッセイ法およびコロニー形成アッセイ法によって測定された細胞生存率およびコロニー数は有意に減少した（ＬＣ３１９の代表的なデータを図３に示した）。
（ｄ）Ｅ２Ｆ−１によって調節されるＣＤＣＡ８およびＡＵＲＫＢの同時活性化
肺癌においてＣＤＣＡ８およびＡＵＲＫＢが調和して活性化されることから、これら２つの遺伝子が同じ転写因子によって調節され得ることが示唆された。この仮説を検証するために、ＣＤＣＡ８およびＡＵＲＫＢプロモーター領域のＤＮＡ配列を調べ、ＡＵＲＫＢならびにサイクリンＡ（ＣＣＮＤＡ）およびＣＤＣ２５の転写を調節する、細胞周期依存性エレメント（ＣＤＥ）および細胞周期遺伝子相同領域（ＣＨＲ）のコンセンサス配列（ＣＤＥ−ＣＨＲ）を有することを見出した（図４）。ＮＳＣＬＣ症例の半定量的ＲＴ−ＰＣＲ解析によって検出されるように、ＡＵＲＫＢ遺伝子のＣＤＥ−ＣＨＲに結合し得る転写因子のうち、Ｅ２Ｆ−１がＣＤＣＡ８およびＡＵＲＫＢと同時に活性化されることが確認された（図４Ｂ）。
Ｅ２Ｆ−１によるＣＤＣＡ８遺伝子プロモーターの直接的な転写調節を調べるために、ＬＣ３１９細胞に、ルシフェラーゼレポーター遺伝子に融合させた推定調節エレメント（ＣＤＥ−ＣＨＲ）を含むＣＤＣＡ８またはＡＵＲＫＢ（陽性対照）プロモーター構築物と共に、Ｅ２Ｆ−１ベクターまたはモックベクターを一過性に同時トランスフェクションした。予想通り、ＣＤＣＡ８プロモーター機能およびＡＵＲＫＢプロモーター機能のいずれもが、Ｅ２Ｆ−１によって活性化された（図４Ｃ）。内因性ＣＤＣＡ８およびＡＵＲＫＢの誘導は、ＬＣ３１９細胞への外因性Ｅ２Ｆ−１の導入によってさらに確認された（データは示さず）。
（ｅ）肺癌細胞におけるＡＵＲＫＢによるＣＤＣＡ８のリン酸化：
ウェスタンブロット解析により、２つの異なる大きさのＣＤＣＡ８タンパク質が検出された（図１Ｂ、上部パネル）。ＣＤＣＡ８のリン酸化の可能性を調べるため、ＬＣ３１９細胞からの抽出物を、タンパク質ホスファターゼ（ＢＩＯ−ＲＡＤ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、カリフォルニア州、ハーキュリーズ）の存在下または非存在下でインキュベートし、ウェスタンブロット解析によってＣＤＣＡ８タンパク質の分子量を解析した。ホスファターゼで処理した抽出物中のＣＤＣＡ８タンパク質の大部分の測定された分子量は、未処理細胞における分子量よりも小さかったため（図５Ａ）、肺癌細胞においてＣＤＣＡ８がリン酸化されたと考えられた。以前に報告された通りに、ＡＵＲＫＢがインビトロでＣＤＣＡ８をリン酸化し得るかどうかの問題を、次に調べた（Gassmann R, et al., J Cell Biol. 2004 Jul 19;166(2):179-91 Epub 2004 Jul 12）。
全長組換えＣＤＣＡ８タンパク質を、［γ−３２Ｐ］ＡＴＰを含むキナーゼ緩衝液中で組換えＡＵＲＫＢタンパク質と共にインキュベートした場合、ＣＤＣＡ８はＡＵＲＫＢ用量依存性様式でリン酸化された（図５Ｂ）。癌細胞において内因性ＡＵＲＫＢの大量発現が内因性ＣＤＣＡ８のリン酸化に重要であるかどうかを評価するために、これら２つの遺伝子が大量に発現されるＬＣ３１９細胞におけるＡＵＲＫＢ発現を、ＡＵＲＫＢに対するｓｉＲＮＡ（ｓｉ−ＡＵＲＫＢ）で選択的にノックダウンした（図５Ｃ、上部パネル）。
ｓｉ−ＡＵＲＫＢ（ｓｉ−ＡＵＲＫＢ−＃１およびｓｉ−ＡＵＲＫＢ−＃２）によるＡＵＲＫＢタンパク質の減少により、ＣＤＣＡ８タンパク質の量は劇的に減少したが、同じ細胞内のＣＤＣＡ８転写産物のレベルはｓｉ−ＡＵＲＫＢによって影響されなかった（図５Ｃ、下部パネル）。ｓｉ−ＡＵＲＫＢによるＡＵＲＫＢタンパク質の減少により、ＣＤＣＡ８タンパク質の量およびＣＤＣＡ８のリン酸化レベルは減少したが、同じ細胞内のＣＤＣＡ８転写産物のレベルはｓｉ−ＡＵＲＫＢによって影響されなかった（図５Ｃ）。したがって、内因性ＣＤＣＡ８タンパク質は、それが内因性ＡＵＲＫＢによってリン酸化され、かつ／またはあるタンパク質複合体中に組み入れられた場合に、安定化され得ると仮定された。
本明細書におけるデータから、肺癌細胞においてヒトＣＤＣＡ８およびヒトＡＵＫＲＢが同時に活性化されること、ならびにＡＵＲＫＢによるＣＤＣＡ８リン酸化が肺癌形成において重要な役割を果たし得ることが示唆されるため、次にＡＵＲＫＢによるＣＤＣＡ８のリン酸化部位を調べた。２つまたは３つのセリン／スレオニン残基をアラニンに置換した６つのＨｉｓタグ化ＣＤＣＡ８タンパク質（ＣＤＣＡ８Δ１〜ＣＤＣＡ８Δ６）を調製した（図６Ａ、上部パネル）。
これらの変異体ＣＤＣＡ８タンパク質を用いてインビトロキナーゼアッセイを行ったところ、３つの変異構築物（ＣＤＣＡ８Δ２、ＣＤＣＡ８Δ５、およびＣＤＣＡ８Δ６）において、野生型と比較してリン酸化レベルの低下が検出され、置換部位に対応する６つのセリン／スレオニンが推定リン酸化部位であり得ることが示唆された（図６Ｂ）。６つのセリン／スレオニンのいずれかをアラニンに置換した６つのさらなる変異体ＣＤＣＡ８構築物、ＣＤＣＡ８Δ７〜ＣＤＣＡ８Δ１２をさらに調製した（図６Ａ、下部パネル）。これら６つの変異体のインビトロキナーゼアッセイから、４つのセリン／スレオニン残基、Ｓｅｒ−１５４、Ｓｅｒ−２１９、Ｓｅｒ−２７５、およびＴｈｒ−２７８のいずれかに置換を含む４つの変異構築物（ＣＤＣＡ８Δ８、ＣＤＣＡ８Δ９、ＣＤＣＡ８Δ１１、およびＣＤＣＡ８Δ１２）において、リン酸化レベルの低下が明らかになった（図６Ｃ）。
これら４つのセリン／スレオニンのすべてをアラニンに置換した変異体構築物（ＣＤＣＡ８Δ１３）を次に作製し、ＡＵＲＫＢを用いてインビトロキナーゼアッセイを行った。ＡＵＲＫＢによるＣＤＣＡ８リン酸化の完全な消失を示す結果（図６Ｄ）から、ＣＤＣＡ８が、Ｓｅｒ−１５４、Ｓｅｒ−２１９、Ｓｅｒ−２７５、およびＴｈｒ−２７８の４つのセリン／スレオニン残基において、ＡＵＲＫＢによってリン酸化されることが明らかに実証された。
（ｆ）細胞透過性ペプチドによる肺癌細胞の増殖阻害：
肺癌細胞の増殖または生存に対する、ＣＤＣＡ８とＡＵＲＫＢとの間の相互作用およびＣＤＣＡ８リン酸化の機能的重要性を調べるために、ＡＵＲＫＢによるＣＤＣＡ８のインビボリン酸化を阻害することが予測される生物活性細胞透過性ペプチドを開発した。４つのＣＤＣＡ８リン酸化部位（Ｓｅｒ−１５４、Ｓｅｒ−２１９、Ｓｅｒ−２７５、およびＴｈｒ−２７８）を含む、１９または２０アミノ酸の３つの異なるペプチドを合成した。これらのペプチドをＮ末端で膜導入１１アルギニン残基（１１Ｒ）に共有結合させた。最初に、インビトロキナーゼアッセイ法を用いて、組換えＡＵＲＫＢ（ｒｈＡＵＲＫＢ）による組換えＣＤＣＡ８（ｒｈＣＤＣＡ８）のリン酸化に及ぼす３つの１１Ｒ−ＣＤＣＡ８ペプチドの効果を調べた。［γ−３２Ｐ］ＡＴＰを含むキナーゼ緩衝液中で、全長ｒｈＣＤＣＡ８タンパク質を、ｒｈＡＵＲＫＢタンパク質および３つの１１Ｒ−ＣＤＣＡ８ペプチドまたはそれらのスクランブルペプチドのいずれかと共にインキュベートした場合、ｒｈＣＤＣＡ８のリン酸化レベルは、Ｓｅｒ−１５４、Ｓｅｒ−２１９、Ｓｅｒ−２７５、およびＴｈｒ−２７８を含む１１Ｒ−ＣＤＣＡ８２６１〜２８０ペプチドによる処理によって、そのスクランブルペプチドと比較して有意に抑制された（図７Ａ）。
ＬＣ３１９細胞の培養液中に１１Ｒ−ＣＤＣＡ８２６１〜２８０を添加すると、内因性ＣＤＣＡ８タンパク質のリン酸化が阻害され、その安定性が低下したが、ＣＤＣＡ８転写産物のレベルに及ぼす影響は認められなかった（図７Ｂ）。ＬＣ３１９細胞を１１Ｒ−ＣＤＣＡ８２６１〜２８０で処理すると、ＭＴＴアッセイ法により測定された細胞生存率は有意に低下した（代表的なデータ、図７Ｃ、上部パネル）。
１１Ｒ−ＣＤＣＡ８２６１〜２８０ペプチドによる腫瘍抑制の機構を明らかにするために、これらのペプチドで処理した腫瘍細胞のフローサイトメトリー解析を行ったところ、１１Ｒ−ＣＤＣＡ８２６１〜２８０による処理の４８時間後のｓｕｂＧ１画分が有意に増加したことが見出された（図７Ｃ、下部パネル）。１１Ｒ−ＣＤＣＡ８２６１〜２８０は、ＣＤＣＡ８およびＡＵＲＫＢ発現がほとんど検出不可能であった正常ヒト肺線維芽細胞由来のＭＲＣ５細胞、ＣＣＤ１９−Ｌｕ細胞、またはヒト気管支上皮由来ＢＥＡＳ−２Ｂ細胞の細胞生存率に影響を及ぼさなかった（ＭＲＣ５細胞およびＢＥＡＳ−２Ｂ細胞の代表的なデータを図７Ｄおよび図７Ｅに示した）。このデータから、１１Ｒ−ＣＤＣＡ８２６１〜２８０は、ＣＤＣＡ８リン酸化に関するＡＵＲＫＢの酵素反応を特異的に阻害し得るが、これらのタンパク質を発現しない正常ヒト細胞には毒性作用を及ぼさないかまたは毒性作用は最小限であることが示される。
考察：
有害反応のリスクを最小限に抑えた新規の治療用抗癌剤を開発することを目的として、肺癌細胞において特異的に活性化されるタンパク質およびそれらの相互作用タンパク質を同定するための強力なスクリーニング系を確立した。戦略は以下の通りであった：
（１）レーザーマイクロダイセクションと共にゲノム全域にわたるｃＤＮＡマイクロアレイシステムを通して、１０１例の肺癌試料中の上方制御遺伝子を同定する（Kikuchi T, et al. Oncogene. 2003 Apr 10;22(14):2192-205; Kakiuchi S, et al., Mol Cancer Res. 2003 May;1(7):485-99; Kakiuchi S, et al., Hum Mol Genet. 2004 Dec 15;13(24):3029-43 Epub 2004 Oct 20; Kikuchi T, et al., Int J Oncol. 2006 Apr;28(4):799-805; Taniwaki M, et al., Int J Oncol. 2006 Sep;29(3):567-75）、
（２）ｃＤＮＡマイクロアレイ解析および多組織ノーザンブロット解析により、正常器官においてそれらの遺伝子の発現が非常に低いかまたは発現がないことを検証する（Ochi K, et al., J Hum Genet. 2003;48(4):177-82 Epub 2003 Feb 21.;Adams RR, et al., Trends Cell Biol. 2001 Feb;11(2):49-54）、
（３）数百のＮＳＣＬＣ組織試料からなる組織マイクロアレイを用いて、それらの過剰発現の臨床病理学的有意性を確認する（Taniwaki M, et al., Int J Oncol. 2006 Sep;29(3):567-75; Ishikawa N, et al. Clin Cancer Res. 2004 Dec 15;10(24):8363-70; Kato T, et al., Cancer Res. 2005 Jul 1;65(13):5638-46; Furukawa C, et al., Cancer Res. 2005 Aug 15;65(16):7102-10; Ishikawa N, et al., Cancer Res. 2005 Oct 15;65(20):9176-84; Suzuki C, et al., Cancer Res. 2005 Dec 15;65(24):11314-25; Ishikawa N, et al., Cancer Sci. 2006 Aug;97(8):737-45; Takahashi K, et al., Cancer Res. 2006 Oct 1;66(19):9408-19; Hayama S, et al., Cancer Res. 2006 Nov 1;66(21):10339-48）、かつ
（４）標的遺伝子が肺癌細胞の生存または増殖に必須であるかどうかをｓｉＲＮＡによって検証する（Suzuki C, et al., Cancer Res. 2003 Nov 1;63(21):7038-41; Kato T, et al., Cancer Res. 2005 Jul 1;65(13):5638-46; Furukawa C, et al., Cancer Res. 2005 Aug 15;65(16):7102-10; Suzuki C, et al., Cancer Res. 2005 Dec 15;65(24):11314-25; Ishikawa N, et al., Cancer Sci. 2006 Aug;97(8):737-45; Takahashi K, et al., Cancer Res. 2006 Oct 1;66(19):9408-19; Hayama S, et al., Cancer Res. 2006 Nov 1;66(21):10339-48）。
この体系的なアプローチにより、ＣＤＣＡ８およびＡＵＲＫＢが、大多数の臨床肺癌試料および肺癌細胞株において同時に過剰発現されると同定された。さらに、これら２つのタンパク質は、肺癌細胞の増殖および進行に不可欠であることが判明した。
ＣＤＣＡ８は、以前に、ＡＵＲＫＢによってインビトロでリン酸化されることが示されたが（Gassmann R, et al., J Cell Biol. 2004 Jul 19;166(2):179-91 Epub 2004 Jul 12）、ヒト癌の発生および／または進行におけるその重要性はこれまで記載されていない。ＣＤＣＡ８は最近、「探索および捕獲（ｓｅａｒｃｈ−ａｎｄ−ｃａｐｔｕｒｅ）」機構において必然的に起こる双極結合における誤りの訂正に関与する有糸分裂事象の重要な調節因子であるとみなされる、ＡＵＲＫＢ、ＩＮＣＥＮＰ、およびＢＩＲＣ５など（Sampath SC, et al., Cell. 2004 Jul 23; 118(2):187-202）の、脊椎動物染色体パッセンジャーの新たな構成要素の１つであることが示された（Adams RR, et al., J Cell Biol. 2001 May 14;153(4):865-80; Wheatley SP, et al., Curr Biol. 2001 Jun 5;11(11):886-90; Walker MG. Curr Cancer Drug Targets. 2001 May;1(l):73-83）。
本明細書において、ＣＤＣＡ８タンパク質が、Ｓｅｒ−１５４、Ｓｅｒ−２１９、Ｓｅｒ−２７５、および／またはＴｈｒ−２７８におけるそのＡＵＲＫＢ依存性リン酸化によって安定化される可能性が高いことが実証された。ＲＮＡ干渉、またはＣＤＣＡ８のリン酸化を阻害し得る１１Ｒ−ＣＤＣＡ８２６１〜２８０によりＡＵＲＫＢ機能を喪失させると、内因性ＣＤＣＡ８タンパク質のレベルは有意に減少した。リン酸化は、タンパク質の安定性、機能、局在性、および標的タンパク質に対する結合特異性を調節する重要な翻訳後修飾である。例えば、Ｓｅｒ−４４６でリン酸化されたＭＫＰ−７またはＳｅｒ−１０でリン酸化されたｐ２７は、非リン酸化型よりも半減期が長く、その部位が脱リン酸化された場合、これらのタンパク質の量は細胞中で迅速に減少した（Katagiri C, et al. J Biol Chem 2005;280:14716-22; Deng X, et al. J Biol Chem 2004;279:22498-504）。
本明細書における証拠から、癌細胞において、ＣＤＣＡ８タンパク質の安定性がＡＵＲＫＢシグナル伝達によって厳重に調節され得ることが示唆される。ＡＵＲＫＢは多くの腫瘍細胞株において過剰発現されることが示され、その過剰発現は染色体数の不安定性および腫瘍の浸潤性に関与することが記述されている（Bischoff JR, et al., EMBO J. 1998 Jun 1;17(11):3052-65; Branca M, et al., Am J Clin Pathol. 2005 Jul;124(1):113-21）。ＡＵＲＫＢは癌関連キナーゼの１つであり、したがって抗癌剤の有望な標的であると考えられた。実際に、最近になって２つのＡＵＲＫＢ阻害剤が記載された：ＺＭ４４７４３９およびヘスペラジン（Keen N & Taylor S. Nat Rev Cancer. 2004 Dec;4(12):927-36）。本明細書における結果から、ＣＤＣＡ８が、ＡＵＲＫＢと共に肺癌細胞において異常に発現される推定癌遺伝子であることが示される。
上記の組織マイクロアレイ解析の結果が示す通り、ＣＤＣＡ８およびＡＵＲＫＢは同時に過剰発現され、これらのタンパク質の高発現を示すＮＳＣＬＣ患者はより短い腫瘍特異的生存期間を示し、これらの両方から、ＡＵＲＫＢと共にＣＤＣＡ８が肺癌の進行に重要な役割を果たすことが疑いなく示唆される。
また、本明細書において、ＣＤＣＡ８およびＡＵＲＫＢを過剰発現する肺癌細胞の増殖は、ＣＤＣＡ８タンパク質の一部に対応しかつＡＵＲＫＢによる２つのリン酸化部位、Ｓｅｒ−１５４、Ｓｅｒ−２１９、Ｓｅｒ−２７５、およびＴｈｒ−２７８を含む２０アミノ酸細胞透過性ペプチドを用いてＡＵＲＫＢ依存性ＣＤＣＡ８リン酸化を阻止することにより、有効に抑制され得るという事実が初めて実証された。１１Ｒ−ＣＤＣＡ８２６１〜２８０ペプチドによる処理後に、ｓｕｂＧ１画分の有意な増加が検出され、細胞透過性ポリペプチドが癌細胞のアポトーシスを誘導したことが示唆された。これらの部位におけるＣＤＣＡ８のリン酸化は、肺癌細胞の増殖／生存に不可欠である可能性が高く、かつＣＤＣＡ８は癌−精巣抗原に属し得るため、ＣＤＣＡ８−ＡＵＲＫＢ酵素活性の選択的標的化は、癌に対して強力な生物活性を有し、かつ有害事象のリスクが最小であると予測される有望な治療戦略を構成する。ＡＵＲＫＢによるＣＤＣＡ８リン酸化の特異的阻害による増殖抑制の機構をさらに解析することは、新たな種類の抗癌剤の開発に向けて非常に有益であると考えられる。
要約すると、本発明は、肺癌細胞においてＣＤＣＡ８がＡＵＲＫＢと同時に活性化され、ＡＵＲＫＢによってリン酸化／安定化されるという発見、ならびにリン酸化ＣＤＣＡ８が癌細胞の増殖および／または生存において重要な役割を果たすという発見に関する。本明細書におけるデータから、ＣＤＣＡ８−ＡＵＲＫＢ会合を標的とするように設計された新規抗癌剤が、肺癌の有望な治療戦略を構成することが強く示唆される。
産業上の利用可能性
本明細書において実証される通り、ＣＤＣＡ８およびＡＵＲＫＢの同時活性化ならびにそれらの直接接触相互作用は、肺癌の進行において重要な役割を果たす。したがって、この複合体の形成を直接または間接的に阻害する薬剤は、肺癌、より詳細にはＮＳＣＬＣの治療用抗癌剤としての治療有用性を見出す。
加えて、本発明は、例えば、ＣＤＣＡ８とＡＵＲＫＢとの間の結合を阻害することによって、ＡＵＲＫＢによるＣＤＣＡ８のリン酸化を阻害するかもしくは減少させることによって、またはＣＤＣＡ８、ＡＵＲＫＢ、もしくは両者の発現を阻害するかもしくは抑制することによって、ＣＤＣＡ８−ＡＵＲＫＢ複合体の形成を直接または間接的に阻害する抗癌剤のスクリーニング方法を提供する。ＣＤＣＡ８は、非小細胞肺癌において上方制御されることが示された。さらに、本明細書において、ＣＤＣＡ８アンチセンスヌクレオチドが、細胞増殖を阻害すること、より詳細にはＮＳＣＬＣ細胞の増殖を阻害することが示されたため、ＣＤＣＡ８−ＡＵＲＫＢ複合体の形成を阻害する候補化合物もまた、ＮＳＣＬＣ細胞増殖を阻害するのに役立つことが予測される。本発明はさらに、ＣＤＣＡ８および／またはＡＵＲＫＢの発現レベルを判定指標として使用する診断法および予後診断法を提供する。
本明細書において引用した特許、特許出願、および出版物はすべて、その全体が参照により組み入れられる。しかしながら、本明細書中のいかなるものも、本発明が先行発明のせいでそのような開示を先行できないことを認めると解釈されるべきではない。
本発明をその特定の態様に関して詳細に説明してきたが、上記の説明は事実上、例示的かつ説明的なものであって、本発明およびその好ましい態様を説明することを意図していることが理解されるべきである。当業者は、日常的な実験を通して、本発明の精神および範囲から逸脱することなく様々な変更および修正がなされ得ることを容易に理解するであろう。さらなる利点および特徴は添付の特許請求の範囲から明らかになると考えられ、そのような特許請求の範囲は、当業者によって理解されるように、それらの妥当な同等物によって決定される。したがって、本発明は上記の説明によって規定されるのではなく、添付の特許請求の範囲およびそれらの同等物によって規定されることが意図される。

Claims (53)

  1. 以下の段階を含む、非小細胞肺癌（ＮＳＣＬＣ）を治療または予防するための化合物をスクリーニングする方法：
    （ａ）試験化合物の存在下で、ＡＵＲＫＢポリペプチドまたはその機能的同等物をＣＤＣＡ８ポリペプチドまたはその機能的同等物と接触させる段階；
    （ｂ）段階（１）のポリペプチド間の結合を試験する段階；および
    （ｃ）ＡＵＲＫＢポリペプチドとＣＤＣＡ８ポリペプチドとの間の結合を阻害する試験化合物を選択する段階。
  2. ＣＤＣＡ８ポリペプチドの機能的同等物がＡＵＲＫＢ結合ドメインのアミノ酸配列を含む、請求項１記載の方法。
  3. ＣＤＣＡ８ポリペプチドの機能的同等物がＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５のアミノ酸配列（ＮＩＫＫＬＳＮＲＬＡＱＩＣＳＳＩＲＴＨＫ）を含む、請求項２記載の方法。
  4. ＡＵＲＫＢポリペプチドの機能的同等物がＣＤＣＡ８結合ドメインのアミノ酸配列を含む、請求項１記載の方法。
  5. 以下の構成要素を含む、ＮＳＣＬＣを治療または予防するための化合物をスクリーニングするためのキット：
    （ａ）ＡＵＲＫＢポリペプチドまたはその機能的同等物、および
    （ｂ）ＣＤＣＡ８ポリペプチドまたはその機能的同等物。
  6. 以下の段階を含む、ＮＳＣＬＣを治療または予防するための化合物をスクリーニングする方法：
    （ａ）ＡＵＲＫＢによるＣＤＣＡ８のリン酸化に適した条件下において、試験化合物の存在下でＣＤＣＡ８とＡＵＲＫＢをインキュベートする段階であって、
    ＣＤＣＡ８が、
    ｉ．ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２（ＣＤＣＡ８）のアミノ酸配列を含むポリペプチド、
    ｉｉ．ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２のアミノ酸配列からなるポリペプチドと同等な生物活性を有するという条件で、１つまたは複数のアミノ酸が置換、欠失、または挿入されたＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２のアミノ酸配列を含む、ポリペプチド、
    ｉｉｉ．ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２のアミノ酸配列からなるポリペプチドと同等な生物活性を有するという条件で、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１のヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチドにストリンジェントな条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチドによってコードされる、ポリペプチド
    からなる群より選択されるポリペプチドであり；かつ
    ＡＵＲＫＢが、
    ｉ．ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４（ＡＵＲＫＢ）のアミノ酸配列を有するポリペプチド、
    ｉｉ．ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４のアミノ酸配列からなるポリペプチドと同等な生物活性を有するという条件で、１つまたは複数のアミノ酸が置換、欠失、または挿入されたＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４のアミノ酸配列を有する、ポリペプチド、
    ｉｉｉ．ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４のアミノ酸配列からなるポリペプチドと同等な生物活性を有するという条件で、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３のヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチドにストリンジェントな条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチドによってコードされる、ポリペプチド
    からなる群より選択されるポリペプチドである、段階；
    （ｂ）ＣＤＣＡ８のリン酸化レベルを検出する段階；
    （ｃ）段階（ｂ）で測定されたＣＤＣＡ８のリン酸化レベルを対照レベルと比較する段階；および
    （ｄ）対照レベルと比較してＣＤＣＡ８のリン酸化レベルを減少させる化合物を選択する段階。
  7. ＣＤＣＡ８のリン酸化レベルが、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２のアミノ酸配列のＳｅｒ−１５４、Ｓｅｒ−２１９、Ｓｅｒ−２７５、およびＴｈｒ−２７８、またはそのポリペプチドの相同位置からなる群より選択される１つまたは複数のリン酸化部位において検出される、請求項６記載の方法。
  8. 以下の構成要素を含む、ＮＳＣＬＣを治療または予防するための化合物をスクリーニングするためのキット：
    （ａ）
    ｉ．ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２（ＣＤＣＡ８）のアミノ酸配列を含むポリペプチド、
    ｉｉ．ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２のアミノ酸配列からなるポリペプチドと同等な生物活性を有するという条件で、１つまたは複数のアミノ酸が置換、欠失、または挿入されたＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２のアミノ酸配列を含む、ポリペプチド、および
    ｉｉｉ．ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２のアミノ酸配列からなるポリペプチドと同等な生物活性を有するという条件で、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１のヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチドにストリンジェントな条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチドによってコードされる、ポリペプチド
    からなる群より選択されるポリペプチド；
    （ｂ）
    ｉ．ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４（ＡＵＲＫＢ）のアミノ酸配列を含むポリペプチド、
    ｉｉ．ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４のアミノ酸配列からなるポリペプチドと同等な生物活性を有するという条件で、１つまたは複数のアミノ酸が置換、欠失、または挿入されたＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４のアミノ酸配列を含む、ポリペプチド、および
    ｉｉｉ．ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４のアミノ酸配列からなるポリペプチドと同等な生物活性を有するという条件で、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３のヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチドにストリンジェントな条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチドによってコードされる、ポリペプチド
    からなる群より選択されるポリペプチド；ならびに
    （ｃ）ＣＤＣＡ８のリン酸化レベルを検出するための試薬。
  9. 以下の構成要素を含む、ＮＳＣＬＣを治療または予防するための化合物をスクリーニングするためのキット：
    （ａ）
    ｉ．ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２（ＣＤＣＡ８）のアミノ酸配列を含むポリペプチド、
    ｉｉ．ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２のアミノ酸配列からなるポリペプチドと同等な生物活性を有するという条件で、１つまたは複数のアミノ酸が置換、欠失、または挿入されたＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２のアミノ酸配列を含む、ポリペプチド、
    ｉｉｉ．ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２のアミノ酸配列からなるポリペプチドと同等な生物活性を有するという条件で、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１のヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチドにストリンジェントな条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチドによってコードされる、ポリペプチド
    からなる群より選択されるポリペプチドを発現する細胞；および
    （ｂ）ＣＤＣＡ８のリン酸化レベルを検出するための試薬。
  10. 細胞が、以下からなる群より選択されるポリペプチドをさらに発現する、請求項９記載のキット：
    ｉ．ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４（ＡＵＲＫＢ）のアミノ酸配列を含むポリペプチド；
    ｉｉ．ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４のアミノ酸配列からなるポリペプチドと同等な生物活性を有するという条件で、１つまたは複数のアミノ酸が置換、欠失、または挿入されたＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４のアミノ酸配列を含む、ポリペプチド；および
    ｉｉｉ．ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４のアミノ酸配列からなるポリペプチドと同等な生物活性を有するという条件で、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３のヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチドにストリンジェントな条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチドによってコードされる、ポリペプチド。
  11. 細胞がＮＳＣＬＣ細胞である、請求項９記載のキット。
  12. ＣＤＣＡ８のリン酸化レベルを検出するための試薬が、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２のアミノ酸配列のＳｅｒ−１５４、Ｓｅｒ−２１９、Ｓｅｒ−２７５、およびＴｈｒ−２７８からなる群より選択されるリン酸化部位のいずれか１つにおけるリン酸化を認識する抗体である、請求項８または９記載のキット。
  13. ＡＵＲＫＢ遺伝子の発現を減少させるｓｉＲＮＡを含むｓｉＲＮＡ組成物を対象に投与する段階を含む、それを必要とする対象においてＮＳＣＬＣを治療および／または予防する方法。
  14. ｓｉＲＮＡが、標的配列として、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３３、５９、および６０からなる群より選択されるヌクレオチド配列を含む、請求項１３記載の方法。
  15. ｓｉＲＮＡが下記の一般式を有する、請求項１４記載の方法：
    ５’−［Ａ］−［Ｂ］−［Ａ’］−３’
    式中、［Ａ］はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３３、５９、および６０からなる群より選択される配列に相当するリボヌクレオチド配列であり；［Ｂ］は３〜２３ヌクレオチドからなるリボヌクレオチド配列であり；かつ［Ａ’］は［Ａ］と相補的なリボヌクレオチド配列である。
  16. ドミナントネガティブ効果を有するＣＤＣＡ８変異体または該変異体をコードするポリヌクレオチドを投与する段階を含む、対象においてＮＳＣＬＣを治療もしくは予防する、または治療しかつ予防する方法。
  17. ＣＤＣＡ８変異体がＡＵＲＫＢ結合領域を含むアミノ酸配列を含む、請求項１６記載の方法。
  18. ＣＤＣＡ８変異体がＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５のアミノ酸配列を含む、請求項１６記載の方法。
  19. ＣＤＣＡ８変異体が下記の一般式を有する、請求項１８記載の方法：
    ［Ｒ］−［Ｄ］
    式中、［Ｒ］は膜導入物質であり、かつ［Ｄ］はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５のアミノ酸配列を含むポリペプチドである。
  20. 膜導入物質が以下からなる群より選択される、請求項１９記載の方法：
    ポリアルギニン；
    Ｔａｔ／ＲＫＫＲＲＱＲＲＲ／ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６；
    ペネトラチン／ＲＱＩＫＩＷＦＱＮＲＲＭＫＷＫＫ／ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：７；
    ブホリンＩＩ／ＴＲＳＳＲＡＧＬＱＦＰＶＧＲＶＨＲＬＬＲＫ／ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：８；
    トランスポータン／ＧＷＴＬＮＳＡＧＹＬＬＧＫＩＮＬＫＡＬＡＡＬＡＫＫＩＬ／ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：９；
    ＭＡＰ（両親媒性ペプチドモデル）／ＫＬＡＬＫＬＡＬＫＡＬＫＡＡＬＫＬＡ／ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１０；
    Ｋ−ＦＧＦ／ＡＡＶＡＬＬＰＡＶＬＬＡＬＬＡＰ／ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１１；
    Ｋｕ７０／ＶＰＭＬＫ／ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１２；
    Ｋｕ７０／ＰＭＬＫＥ／ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１３；
    プリオン／ＭＡＮＬＧＹＷＬＬＡＬＦＶＴＭＷＴＤＶＧＬＣＫＫＲＰＫＰ／ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１４；
    ｐＶＥＣ／ＬＬＩＩＬＲＲＲＩＲＫＱＡＨＡＨＳＫ／ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１５；
    Ｐｅｐ−１／ＫＥＴＷＷＥＴＷＷＴＥＷＳＱＰＫＫＫＲＫＶ／ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１６；
    ＳｙｎＢ１／ＲＧＧＲＬＳＹＳＲＲＲＦＳＴＳＴＧＲ／ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１７；
    Ｐｅｐ−７／ＳＤＬＷＥＭＭＭＶＳＬＡＣＱＹ／ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１８；および
    ＨＮ−１／ＴＳＰＬＮＩＨＮＧＱＫＬ／ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１９。
  21. ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５のアミノ酸配列からなるポリペプチド。
  22. 下記の一般式を有するポリペプチド：
    ［Ｒ］−［Ｄ］
    式中、［Ｒ］は膜導入物質であり、かつ［Ｄ］はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５のアミノ酸配列である。
  23. センス鎖がＡＵＲＫＢ標的配列に相当するヌクレオチド配列を含み、アンチセンス鎖が該センス鎖と相補的なヌクレオチド配列を含み、さらに該センス鎖と該アンチセンス鎖が互いにハイブリダイズして二本鎖分子を形成する、センス鎖およびアンチセンス鎖を含む二本鎖分子であって、ＡＵＲＫＢ遺伝子を発現する細胞内に導入された場合に該遺伝子の発現を阻害する、二本鎖分子。
  24. ＡＵＲＫＢ標的配列が、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３３、５９、および６０からなる群より選択される配列からなる、請求項２３記載の二本鎖分子。
  25. 介在一本鎖によって連結されたセンス鎖およびアンチセンス鎖を含む単一ヌクレオチドである、請求項２３記載の二本鎖分子。
  26. 下記の一般式を有する、請求項２３記載の二本鎖分子：
    ５’−［Ａ］−［Ｂ］−［Ａ’］−３’
    式中、［Ａ］はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３３、５９、および６０からなる群より選択される配列に相当するオリゴヌクレオチドを含むセンス鎖であり；
    ［Ｂ］は介在一本鎖であり；かつ
    ［Ａ’］は［Ａ］で選択される配列と相補的な配列に相当するオリゴヌクレオチドを含むアンチセンス鎖である。
  27. ３’オーバーハングを含む、請求項２３記載の二本鎖分子。
  28. 請求項２３記載の二本鎖分子をコードするベクター。
  29. センス鎖およびアンチセンス鎖を含む二次構造を有する転写産物をコードする、請求項２８記載のベクター。
  30. 転写産物が、センス鎖とアンチセンス鎖を連結する一本鎖リボヌクレオチド配列をさらに含む、請求項２９記載のベクター。
  31. センス鎖核酸がＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３３、５９、および６０からなる群より選択されるヌクレオチド配列を含み、アンチセンス鎖核酸が該センス鎖と相補的な配列からなり、該センス鎖および該アンチセンス鎖の転写産物が互いにハイブリダイズして二本鎖分子を形成する、センス鎖核酸およびアンチセンス鎖核酸の組み合わせを含むポリヌクレオチドを含むベクターであって、ＡＵＲＫＢ遺伝子を発現する細胞内に導入された場合に細胞増殖を阻害する、ベクター。
  32. センス鎖核酸がＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３３、５９、および６０からなる群より選択されるヌクレオチド配列を含み、アンチセンス鎖核酸が該センス鎖と相補的な配列からなり、該センス鎖および該アンチセンス鎖の転写産物が互いにハイブリダイズして二本鎖分子を形成する、センス鎖核酸およびアンチセンス鎖核酸を含むポリヌクレオチドの組み合わせのそれぞれを含むベクターであって、ＡＵＲＫＢ遺伝子を発現する細胞内に導入された場合に細胞増殖を阻害する、ベクター。
  33. ポリヌクレオチドが下記の一般式を有する、請求３１記載のベクター：
    ５’−［Ａ］−［Ｂ］−［Ａ’］−３’
    式中、［Ａ］はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３３、５９、および６０からなる群より選択されるヌクレオチド配列であり；
    ［Ｂ］は３〜２３ヌクレオチドからなるヌクレオチド配列であり；かつ
    ［Ａ’］は［Ａ］と相補的なヌクレオチド配列である。
  34. ＡＵＲＫＢ遺伝子に対するｓｉＲＮＡの薬学的有効量を含む、ＮＳＣＬＣを治療または予防するための組成物。
  35. ｓｉＲＮＡが、標的配列として、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３３、５９、および６０からなる群より選択されるヌクレオチド配列を含むセンス鎖を含む、請求項３４記載の組成物。
  36. 有効成分としての、ドミナントネガティブ効果を有するＣＤＣＡ８変異体または該変異体をコードするポリヌクレオチドの薬学的有効量、および薬学的に許容される担体を含む、ＮＳＣＬＣを治療または予防するための組成物。
  37. ＣＤＣＡ８変異体がＡＵＲＫＢ結合領域を含むアミノ酸配列を含む、請求項３６記載の組成物。
  38. ＣＤＣＡ８変異体がＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５のアミノ酸配列を含む、請求項３７記載の組成物。
  39. ＣＤＣＡ８変異体が下記の一般式を有する、請求項３８記載の組成物：
    ［Ｒ］−［Ｄ］
    式中、［Ｒ］は膜導入物質であり、かつ［Ｂ］はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５のアミノ酸配列を含むポリペプチドである。
  40. 膜導入物質が以下からなる群より選択される、請求項３９記載の組成物：
    ポリアルギニン；
    Ｔａｔ／ＲＫＫＲＲＱＲＲＲ／ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６；
    ペネトラチン／ＲＱＩＫＩＷＦＱＮＲＲＭＫＷＫＫ／ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：７；
    ブホリンＩＩ／ＴＲＳＳＲＡＧＬＱＦＰＶＧＲＶＨＲＬＬＲＫ／ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：８；
    トランスポータン／ＧＷＴＬＮＳＡＧＹＬＬＧＫＩＮＬＫＡＬＡＡＬＡＫＫＩＬ／ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：９；
    ＭＡＰ（両親媒性ペプチドモデル）／ＫＬＡＬＫＬＡＬＫＡＬＫＡＡＬＫＬＡ／ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１０；
    Ｋ−ＦＧＦ／ＡＡＶＡＬＬＰＡＶＬＬＡＬＬＡＰ／ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１１；
    Ｋｕ７０／ＶＰＭＬＫ／ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１２；
    Ｋｕ７０／ＰＭＬＫＥ／ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１３；
    プリオン／ＭＡＮＬＧＹＷＬＬＡＬＦＶＴＭＷＴＤＶＧＬＣＫＫＲＰＫＰ／ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１４；
    ｐＶＥＣ／ＬＬＩＩＬＲＲＲＩＲＫＱＡＨＡＨＳＫ／ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１５；
    Ｐｅｐ−１／ＫＥＴＷＷＥＴＷＷＴＥＷＳＱＰＫＫＫＲＫＶ／ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１６；
    ＳｙｎＢ１／ＲＧＧＲＬＳＹＳＲＲＲＦＳＴＳＴＧＲ／ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１７；
    Ｐｅｐ−７／ＳＤＬＷＥＭＭＭＶＳＬＡＣＱＹ／ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１８；および
    ＨＮ−１／ＴＳＰＬＮＩＨＮＧＱＫＬ／ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１９。
  41. 以下の段階を含む、ＮＳＣＬＣの予後を評価する方法：
    （ａ）ＮＳＣＬＣの予後を評価しようとする対象から採取した試料において、ＣＤＣＡ８およびＡＵＲＫＢのいずれか一方またはその両方の発現レベルを検出する段階、ならびに
    （ｂ）ＣＤＣＡ８およびＡＵＲＫＢのいずれか一方またはその両方の発現レベルの上昇が検出された場合に、予後不良が示される段階。
  42. 発現レベルが、以下からなる群より選択される方法のいずれか１つによって検出される、請求項４１記載の方法：
    （ａ）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２（ＣＤＣＡ８）またはＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４（ＡＵＲＫＢ）のアミノ酸配列をコードするｍＲＮＡの存在を検出する方法、
    （ｂ）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２（ＣＤＣＡ８）またはＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４（ＡＵＲＫＢ）のアミノ酸配列を含むタンパク質の存在を検出する方法、および
    （ｃ）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２（ＣＤＣＡ８）またはＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４（ＡＵＲＫＢ）のアミノ酸配列を含むタンパク質の生物活性を検出する方法。
  43. 以下からなる群より選択されるいずれか１つの構成要素を含む、ＮＳＣＬＣの予後を評価するためのキット：
    （ａ）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２（ＣＤＣＡ８）またはＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４（ＡＵＲＫＢ）のアミノ酸配列をコードするｍＲＮＡの存在を検出するための試薬、
    （ｂ）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２（ＣＤＣＡ８）またはＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４（ＡＵＲＫＢ）のアミノ酸配列を含むタンパク質の存在を検出するための試薬、および
    （ｃ）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２（ＣＤＣＡ８）またはＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４（ＡＵＲＫＢ）のアミノ酸配列を含むタンパク質の生物活性を検出するための試薬。
  44. 以下の段階を含む、非小細胞肺癌を治療または予防するための化合物をスクリーニングする方法：
    （ａ）ＣＤＣＡ８遺伝子またはＡＵＲＫＢ遺伝子の転写調節領域と該転写調節領域の制御下で発現されるレポーター遺伝子とを含むベクターが導入された細胞を、試験化合物と接触させる段階、
    （ｂ）該レポーター遺伝子の発現レベルまたは活性を測定する段階；ならびに
    （ｃ）対照と比較して、該レポーター遺伝子の発現レベルまたは活性を減少させる化合物を選択する段階。
  45. 転写調節領域がＥ２Ｆ−１モチーフを含む、請求項４４記載の方法。
  46. ＣＤＣＡ８遺伝子またはＡＵＲＫＢ遺伝子の転写調節領域が、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５６または５７のヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチドである、請求項４５記載の方法。
  47. 以下の構成要素を含む、ＮＳＣＬＣを治療または予防するための化合物をスクリーニングするためのキット：
    （ａ）ＣＤＣＡ８遺伝子またはＡＵＲＫＢ遺伝子の転写調節領域と該転写調節領域の制御下で発現されるレポーター遺伝子とを含むベクターが導入された細胞、ならびに
    （ｂ）該レポーター遺伝子の発現レベルまたは活性を測定するための試薬。
  48. ＣＤＣＡ８遺伝子またはＡＵＲＫＢ遺伝子の転写調節領域が、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５６または５７のヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチドである、請求項４７記載のキット。
  49. 以下の段階を含む、ＮＳＣＬＣを治療または予防するための化合物をスクリーニングする方法：
    （ａ）ＣＤＣＡ８の分解に適した条件下において、試験化合物の存在下で、ＡＵＲＫＢポリペプチドまたはその機能的同等物をＣＤＣＡ８ポリペプチドまたはその機能的同等物と接触させる段階；
    （ｂ）段階（ａ）のＣＤＣＡ８ポリペプチドまたはその機能的同等物の量を検出する段階；および
    （ｃ）試験化合物の非存在下における量と比較して、ＣＤＣＡ８ポリペプチドまたはその機能的同等物を減少させる試験化合物を選択する段階。
  50. ＡＵＲＫＢポリペプチドまたはその機能的同等物およびＣＤＣＡ８ポリペプチドまたはその機能的同等物が細胞内で発現され、該細胞またはその溶解物を試験化合物と接触させることによって、ＡＵＲＫＢポリペプチドまたはその機能的同等物およびＣＤＣＡ８ポリペプチドまたはその機能的同等物を試験化合物の存在下でインキュベートする、請求項４９記載の方法。
  51. 以下の構成要素を含む、ＮＳＣＬＣを治療または予防するための化合物をスクリーニングするためのキット：
    （ａ）
    ｉ．ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２（ＣＤＣＡ８）のアミノ酸配列を含むポリペプチド、
    ｉｉ．ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２のアミノ酸配列からなるポリペプチドと同等な生物活性を有するという条件で、１つまたは複数のアミノ酸が置換、欠失、または挿入されたＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２のアミノ酸配列を含む、ポリペプチド、
    ｉｉｉ．ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２のアミノ酸配列からなるポリペプチドと同等な生物活性を有するという条件で、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１のヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチドにストリンジェントな条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチドによってコードされる、ポリペプチド
    からなる群より選択されるポリペプチドを発現する細胞；および
    （ｂ）ＣＤＣＡ８のレベルを検出するための試薬。
  52. 細胞が、以下からなる群より選択されるポリペプチドをさらに発現する、請求項５１記載のキット：
    ｉ．ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４（ＡＵＲＫＢ）のアミノ酸配列を含むポリペプチド；
    ｉｉ．ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４のアミノ酸配列からなるポリペプチドと同等な生物活性を有するという条件で、１つまたは複数のアミノ酸が置換、欠失、または挿入されたＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４のアミノ酸配列を含む、ポリペプチド；および
    ｉｉｉ．ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４のアミノ酸配列からなるポリペプチドと同等な生物活性を有するという条件で、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３のヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチドにストリンジェントな条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチドによってコードされる、ポリペプチド。
  53. 細胞がＮＳＣＬＣ細胞である、請求項５１記載のキット。
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