JP7422498B2 - ペプチド、細胞遊走抑制剤、細胞浸潤抑制剤、がん細胞転移抑制剤、及び医薬 - Google Patents
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- Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
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Description
本発明は、ペプチド、前記ペプチドを含有する細胞遊走抑制剤、細胞浸潤抑制剤、又はがん細胞転移抑制剤、並びに前記細胞遊走抑制剤、前記細胞浸潤抑制剤、及び前記がん細胞転移抑制剤の少なくともいずれかを含有する医薬に関する。
創薬分野では、有用な活性を有する新たな素材の探索・開発が日々進められている。細胞遊走や細胞浸潤は、正常なプロセスだけではなく、病理的なプロセスの多くに関与していることが知られており、細胞遊走や細胞浸潤を抑制する（以下、「阻害する」と称することもある）ことができる素材は、がんなどの様々な疾患に対する医薬として期待される。
Ｇ蛋白質はシグナル伝達に関与する物質であり、その生体内での機能に異常が生じると、様々な疾患が引き起こされることが報告されている。前記Ｇ蛋白質の１つとして、三量体Ｇ蛋白質がある。前記三量体Ｇ蛋白質は、αサブユニット、βサブユニット、及びγサブユニットからなるヘテロ三量体であり、αサブユニットの相同性と機能をもとに、Ｇｓ、Ｇｉ、Ｇｑ、及びＧ１２の４つのグループに分類されている。
これまでに、受容体とのシグナル伝達には、前記αサブユニットのＣ末端のアミノ酸３残基が関与していることが示唆されている（例えば、非特許文献１参照）。具体的には、Ｇｑ蛋白質のαサブユニットのＣ末端のアミノ酸３残基をＧｉ蛋白質のαサブユニットのＣ末端のアミノ酸３残基に入れ替えたキメラＧ蛋白質では、受容体からの刺激を入れ替えたＧｉ蛋白質のαサブユニットのＣ末端のアミノ酸３残基で受け、シグナルのアウトプットはＧｑ蛋白質のものとなることが報告されている。
前記Ｇｓ、Ｇｉ、Ｇｑ、及びＧ１２の４つのグループのうち、Ｇｓ、Ｇｉ、及びＧｑについては、シグナルのアウトプットが判明しており、Ｇｓでは細胞内のｃＡＭＰ濃度が上がったか否か、Ｇｉでは細胞内のｃＡＭＰ濃度が下がったか否か、Ｇｑでは細胞内のカルシウムイオン濃度が上がったか否かにより、Ｇ蛋白質が活性化されたか否かがわかる。
一方、前記Ｇ１２のファミリーには、Ｇ１２及びＧ１３のみが存在するが、これらについては、固有のシグナル伝達経路が確定しておらず、共役する受容体も明らかになっていないのが現状である。
Ｃｏｎｋｌｉｎ ＢＲ， Ｆａｒｆｅｌ Ｚ， Ｌｕｓｔｉｇ ＫＤ， Ｊｕｌｉｕｓ Ｄ， Ｂｏｕｒｎｅ ＨＲ． Ｓｕｂｓｔｉｔｕｔｉｏｎ ｏｆ ｔｈｒｅｅ ａｍｉｎｏ ａｃｉｄｓ ｓｗｉｔｃｈｅｓ ｒｅｃｅｐｔｏｒ ｓｐｅｃｉｆｉｃｉｔｙ ｏｆ Ｇｑα ｔｏ ｔｈａｔ ｏｆ Ｇｉα． Ｎａｔｕｒｅ． １９９３ Ｍａｙ ２０；３６３（６４２６）：２７４－６．
本発明は、前記従来における諸問題を解決し、以下の目的を達成することを課題とする。即ち、本発明は、優れた細胞遊走抑制活性、優れた細胞浸潤抑制活性、及び優れたがん細胞転移抑制活性の少なくともいずれかの活性を有するペプチド、前記ペプチドを含有する細胞遊走抑制剤、細胞浸潤抑制剤、又はがん細胞転移抑制剤、並びに前記細胞遊走抑制剤、前記細胞浸潤抑制剤、及び前記がん細胞転移抑制剤の少なくともいずれかを含有する医薬を提供することを目的とする。
本発明者らは、前記目的を達成するべく鋭意検討を行った結果、ＤＩＭＬＱ（配列番号：１）及びＩＭＬＱ（配列番号：２）のいずれかで表されるアミノ酸配列を有するペプチドが、優れた細胞遊走抑制活性、優れた細胞浸潤抑制活性、及び優れたがん細胞転移抑制活性を有することを知見した。
前記課題を解決するための手段としては、以下の通りである。即ち、
＜１＞ 下記一般式（１）で表されることを特徴とするペプチドである。
ＸＮ－ＸＡ－ＸＣ ・・・ 一般式（１）
前記一般式（１）中、ＸＡは、下記配列番号：１から２のいずれかで表されるアミノ酸配列を表し、ＸＮは、細胞膜透過性分子及び下記配列番号：１から２のいずれかで表されるアミノ酸配列におけるＮ末端のアミノ酸のいずれかを表し、ＸＣは、細胞膜透過性分子及び下記配列番号：１から２のいずれかで表されるアミノ酸配列におけるＣ末端のアミノ酸のいずれかを表す。
ＤＩＭＬＱ（配列番号：１）
ＩＭＬＱ（配列番号：２）
＜２＞ 前記＜１＞に記載のペプチドを含有することを特徴とする細胞遊走抑制剤である。
＜３＞ 前記＜１＞に記載のペプチドを含有することを特徴とする細胞浸潤抑制剤である。
＜４＞ 前記＜１＞に記載のペプチドを含有することを特徴とするがん細胞転移抑制剤である。
＜５＞ 前記＜２＞に記載の細胞遊走抑制剤、前記＜３＞に記載の細胞浸潤抑制剤、及び前記＜４＞に記載のがん細胞転移抑制剤の少なくともいずれかを含有することを特徴とする医薬である。
＜１＞ 下記一般式（１）で表されることを特徴とするペプチドである。
ＸＮ－ＸＡ－ＸＣ ・・・ 一般式（１）
前記一般式（１）中、ＸＡは、下記配列番号：１から２のいずれかで表されるアミノ酸配列を表し、ＸＮは、細胞膜透過性分子及び下記配列番号：１から２のいずれかで表されるアミノ酸配列におけるＮ末端のアミノ酸のいずれかを表し、ＸＣは、細胞膜透過性分子及び下記配列番号：１から２のいずれかで表されるアミノ酸配列におけるＣ末端のアミノ酸のいずれかを表す。
ＤＩＭＬＱ（配列番号：１）
ＩＭＬＱ（配列番号：２）
＜２＞ 前記＜１＞に記載のペプチドを含有することを特徴とする細胞遊走抑制剤である。
＜３＞ 前記＜１＞に記載のペプチドを含有することを特徴とする細胞浸潤抑制剤である。
＜４＞ 前記＜１＞に記載のペプチドを含有することを特徴とするがん細胞転移抑制剤である。
＜５＞ 前記＜２＞に記載の細胞遊走抑制剤、前記＜３＞に記載の細胞浸潤抑制剤、及び前記＜４＞に記載のがん細胞転移抑制剤の少なくともいずれかを含有することを特徴とする医薬である。
本発明によると、従来における前記諸問題を解決することができ、優れた細胞遊走抑制活性、優れた細胞浸潤抑制活性、及び優れたがん細胞転移抑制活性の少なくともいずれかの活性を有するペプチド、前記ペプチドを含有する細胞遊走抑制剤、細胞浸潤抑制剤、又はがん細胞転移抑制剤、並びに前記細胞遊走抑制剤、前記細胞浸潤抑制剤、及び前記がん細胞転移抑制剤の少なくともいずれかを含有する医薬を提供することができる。
（ペプチド）
本発明のペプチドは、下記一般式（１）で表される。なお、前記ペプチドは、塩の態様であってもよい。
ＸＮ－ＸＡ－ＸＣ ・・・ 一般式（１）
本発明のペプチドは、下記一般式（１）で表される。なお、前記ペプチドは、塩の態様であってもよい。
ＸＮ－ＸＡ－ＸＣ ・・・ 一般式（１）
＜ＸＡ＞
前記一般式（１）中、ＸＡは、下記配列番号：１から２のいずれかで表されるアミノ酸配列を表す。なお、本明細書中、Ｄ体であるとの説明がないアミノ酸は、Ｌ体のアミノ酸のことをいう。
ＤＩＭＬＱ（配列番号：１）
ＩＭＬＱ（配列番号：２）
前記一般式（１）中、ＸＡは、下記配列番号：１から２のいずれかで表されるアミノ酸配列を表す。なお、本明細書中、Ｄ体であるとの説明がないアミノ酸は、Ｌ体のアミノ酸のことをいう。
ＤＩＭＬＱ（配列番号：１）
ＩＭＬＱ（配列番号：２）
＜ＸＮ、ＸＣ＞
－ＸＮ－
前記一般式（１）中、ＸＮは、細胞膜透過性分子及び前記配列番号：１から２のいずれかで表されるアミノ酸配列におけるＮ末端のアミノ酸のいずれかを表す。
－ＸＮ－
前記一般式（１）中、ＸＮは、細胞膜透過性分子及び前記配列番号：１から２のいずれかで表されるアミノ酸配列におけるＮ末端のアミノ酸のいずれかを表す。
－ＸＣ－
前記一般式（１）中、ＸＣは、細胞膜透過性分子及び前記配列番号：１から２のいずれかで表されるアミノ酸配列におけるＣ末端のアミノ酸のいずれかを表す。
前記一般式（１）中、ＸＣは、細胞膜透過性分子及び前記配列番号：１から２のいずれかで表されるアミノ酸配列におけるＣ末端のアミノ酸のいずれかを表す。
－－細胞膜透過性分子－－
前記細胞膜透過性分子としては、特に制限はなく、公知の細胞膜透過性分子の中から適宜選択することができ、例えば、アルギニンが連続したアミノ酸配列を含むペプチド、ＴＡＴペプチド、ＭＰＧペプチド、ＨＡ－２ペプチド、Ｐｅｎｅｔｒａｔｉｎペプチド、Ｔｒａｎｓｐｏｒｔａｎペプチド、ＶＰ－２２ペプチド、又はこれらのレトロ－インベルソ型等の細胞膜透過性ペプチドなどが挙げられる。これらは、１種単独で使用してもよいし、２種以上を併用してもよい。
前記細胞膜透過性分子としては、特に制限はなく、公知の細胞膜透過性分子の中から適宜選択することができ、例えば、アルギニンが連続したアミノ酸配列を含むペプチド、ＴＡＴペプチド、ＭＰＧペプチド、ＨＡ－２ペプチド、Ｐｅｎｅｔｒａｔｉｎペプチド、Ｔｒａｎｓｐｏｒｔａｎペプチド、ＶＰ－２２ペプチド、又はこれらのレトロ－インベルソ型等の細胞膜透過性ペプチドなどが挙げられる。これらは、１種単独で使用してもよいし、２種以上を併用してもよい。
前記細胞膜透過性分子の中でも、効率良くペプチドを細胞内に導入することができる点で、アルギニンが連続したアミノ酸配列を含むペプチドが好ましい。前記アルギニンが連続したアミノ酸配列を含むペプチドは、アルギニンのみからなるものであってもよいし、アルギニン以外のアミノ酸を含むものであってもよいが、アルギニンのみからなるものが好ましい。
前記アルギニンが連続したアミノ酸配列におけるアルギニンの数としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができるが、効率良くペプチドを細胞内に導入することができる点で、２残基～２０残基が好ましく、４残基～１６残基がより好ましく、８残基～１２残基が特に好ましい。
前記アルギニンが連続したアミノ酸配列は、Ｌ体のアルギニンのみからなるものであってもよいし、Ｄ体のアルギニンのみからなるものであってもよいし、Ｌ体とＤ体が混在するものであってもよいが、Ｄ体のアルギニンのみからなるものが好ましい。
前記アルギニンが連続したアミノ酸配列におけるアルギニンの数としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができるが、効率良くペプチドを細胞内に導入することができる点で、２残基～２０残基が好ましく、４残基～１６残基がより好ましく、８残基～１２残基が特に好ましい。
前記アルギニンが連続したアミノ酸配列は、Ｌ体のアルギニンのみからなるものであってもよいし、Ｄ体のアルギニンのみからなるものであってもよいし、Ｌ体とＤ体が混在するものであってもよいが、Ｄ体のアルギニンのみからなるものが好ましい。
前記細胞膜透過性分子は、前記配列番号：１から２のいずれかで表されるアミノ酸配列のＮ末端側に連結してもよいし、Ｃ末端側に連結してもよいし、両末端に連結してもよいが、Ｎ末端側に連結することが好ましい。なお、前記細胞膜透過性分子が前記配列番号：１から２のいずれかで表されるアミノ酸配列の両末端に連結している場合、Ｎ末端側の細胞膜透過性分子と、Ｃ末端側の細胞膜透過性分子とは、同一であってもよいし、異なっていてもよい。
前記細胞膜透過性分子は、前記配列番号：１から２のいずれかで表されるアミノ酸配列の末端のアミノ酸残基と、ペプチド結合により連結してもよいし、リンカーを介して連結してもよい。前記リンカーとしては、本発明の効果を損なわない限り、特に制限はなく、公知のリンカーの中から適宜選択することができる。
前記細胞膜透過性分子は、前記配列番号：１から２のいずれかで表されるアミノ酸配列の末端のアミノ酸残基と、ペプチド結合により連結してもよいし、リンカーを介して連結してもよい。前記リンカーとしては、本発明の効果を損なわない限り、特に制限はなく、公知のリンカーの中から適宜選択することができる。
前記ペプチドは、前記一般式（１）における前記ＸＮが細胞膜透過性分子であり、前記ＸＣが前記配列番号：１から２のいずれかで表されるアミノ酸配列におけるＣ末端のアミノ酸である態様が好ましい。
＜製造方法＞
前記ペプチドの製造方法としては、特に制限はなく、公知の方法を適宜選択することができ、例えば、化学合成などにより製造することができる。
前記ペプチドの製造方法としては、特に制限はなく、公知の方法を適宜選択することができ、例えば、化学合成などにより製造することができる。
（細胞遊走抑制剤）
本発明の細胞遊走抑制剤は、細胞の遊走を抑制するためのものであり、上記した本発明のペプチドを少なくとも含み、必要に応じて更にその他の成分を含む。
本発明の細胞遊走抑制剤は、細胞の遊走を抑制するためのものであり、上記した本発明のペプチドを少なくとも含み、必要に応じて更にその他の成分を含む。
＜ペプチド＞
前記ペプチドの詳細としては、上記した本発明の（ペプチド）の項目に記載した通りである。前記ペプチドは、細胞の遊走を効果的に抑制することができるので、細胞の遊走を抑制するための前記細胞遊走抑制剤の有効成分として好適である。
前記細胞遊走抑制剤中の前記ペプチドの含有量としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができる。また、前記細胞遊走抑制剤は、前記ペプチドそのものであってもよい。
前記ペプチドの詳細としては、上記した本発明の（ペプチド）の項目に記載した通りである。前記ペプチドは、細胞の遊走を効果的に抑制することができるので、細胞の遊走を抑制するための前記細胞遊走抑制剤の有効成分として好適である。
前記細胞遊走抑制剤中の前記ペプチドの含有量としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができる。また、前記細胞遊走抑制剤は、前記ペプチドそのものであってもよい。
＜その他の成分＞
前記その他の成分としては、本発明の効果を損なわない限り、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、前記ペプチドを所望の濃度に希釈するための生理食塩水、培養液等の希釈用剤、医薬的に許容され得る担体などが挙げられる。
前記細胞遊走抑制剤中の前記その他の成分の含有量としても、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができる。
前記その他の成分としては、本発明の効果を損なわない限り、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、前記ペプチドを所望の濃度に希釈するための生理食塩水、培養液等の希釈用剤、医薬的に許容され得る担体などが挙げられる。
前記細胞遊走抑制剤中の前記その他の成分の含有量としても、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができる。
＜細胞＞
前記細胞遊走抑制剤の適用対象となる細胞としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、小細胞肺がんなどのＧＲＰ（ｇａｓｔｒｉｎ－ｒｅｌｅａｓｉｎｇ ｐｅｐｔｉｄｅ）受容体を発現する細胞、好中球、ＧＲＰ受容体を発現しないがん細胞、骨髄由来抑制細胞（ｍｙｅｌｏｉｄ－ｄｅｒｉｖｅｄ ｓｕｐｐｒｅｓｓｏｒ ｃｅｌｌｓ）、リンパ球、樹状細胞、マスト細胞、マクロファージなどが挙げられる。
後述する試験例に示すように、前記細胞遊走抑制剤は、例えば、ＧＲＰによるＧＲＰ受容体発現細胞（以下、「ＧＲＰＲ発現細胞」と称することがある）の遊走やＩＬ－８による好中球の遊走を抑制することができる。
前記細胞は、体外で培養されている細胞であってもよいし、また、個体の体内に存在する細胞であってもよい。
前記細胞遊走抑制剤の適用対象となる細胞としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、小細胞肺がんなどのＧＲＰ（ｇａｓｔｒｉｎ－ｒｅｌｅａｓｉｎｇ ｐｅｐｔｉｄｅ）受容体を発現する細胞、好中球、ＧＲＰ受容体を発現しないがん細胞、骨髄由来抑制細胞（ｍｙｅｌｏｉｄ－ｄｅｒｉｖｅｄ ｓｕｐｐｒｅｓｓｏｒ ｃｅｌｌｓ）、リンパ球、樹状細胞、マスト細胞、マクロファージなどが挙げられる。
後述する試験例に示すように、前記細胞遊走抑制剤は、例えば、ＧＲＰによるＧＲＰ受容体発現細胞（以下、「ＧＲＰＲ発現細胞」と称することがある）の遊走やＩＬ－８による好中球の遊走を抑制することができる。
前記細胞は、体外で培養されている細胞であってもよいし、また、個体の体内に存在する細胞であってもよい。
＜作用＞
前記細胞遊走抑制剤は、例えば、細胞に導入することによって、前記細胞に作用させることができる。前記導入の方法としては、特に制限はなく、従来公知の手法の中から目的に応じて適宜選択することができる。
細胞に対して作用させる前記細胞遊走抑制剤の量としては、特に制限はなく、細胞の種類や所望の効果の程度等に応じて適宜選択することができるが、例えば、４００万個の細胞数に対し、前記ペプチドの量として、４０μｇ～６０μｇなどが挙げられる。
前記細胞遊走抑制剤は、例えば、細胞に導入することによって、前記細胞に作用させることができる。前記導入の方法としては、特に制限はなく、従来公知の手法の中から目的に応じて適宜選択することができる。
細胞に対して作用させる前記細胞遊走抑制剤の量としては、特に制限はなく、細胞の種類や所望の効果の程度等に応じて適宜選択することができるが、例えば、４００万個の細胞数に対し、前記ペプチドの量として、４０μｇ～６０μｇなどが挙げられる。
＜併用＞
後述する試験例で示すように、本発明の細胞遊走抑制剤の有効成分であるペプチドを細胞に作用させることにより、細胞の遊走を低減することができる。本発明の細胞遊走抑制剤は、他の医薬と組み合わせて使用してもよい。
後述する試験例で示すように、本発明の細胞遊走抑制剤の有効成分であるペプチドを細胞に作用させることにより、細胞の遊走を低減することができる。本発明の細胞遊走抑制剤は、他の医薬と組み合わせて使用してもよい。
（細胞の遊走抑制方法）
前記細胞遊走抑制剤は、前記ペプチドを含むので、細胞に作用させることにより、受容体がＧα１２に共役することを抑制することで、細胞の遊走を効果的に抑制することができると考えられる。したがって、本発明は、細胞に、前記細胞遊走抑制剤を作用させることを特徴とする細胞の遊走抑制方法にも関する。
前記細胞としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、上記した（細胞遊走抑制剤）の＜細胞＞の項目に記載したものと同様のものが挙げられる。
また、前記細胞の遊走抑制方法では、上記した（細胞遊走抑制剤）の＜併用＞の項目に記載したのと同様に、他の医薬を更に作用させてもよい。
前記細胞遊走抑制剤は、前記ペプチドを含むので、細胞に作用させることにより、受容体がＧα１２に共役することを抑制することで、細胞の遊走を効果的に抑制することができると考えられる。したがって、本発明は、細胞に、前記細胞遊走抑制剤を作用させることを特徴とする細胞の遊走抑制方法にも関する。
前記細胞としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、上記した（細胞遊走抑制剤）の＜細胞＞の項目に記載したものと同様のものが挙げられる。
また、前記細胞の遊走抑制方法では、上記した（細胞遊走抑制剤）の＜併用＞の項目に記載したのと同様に、他の医薬を更に作用させてもよい。
（細胞浸潤抑制剤）
本発明の細胞浸潤抑制剤は、細胞の浸潤を抑制するためのものであり、上記した本発明のペプチドを少なくとも含み、必要に応じて更にその他の成分を含む。
本発明の細胞浸潤抑制剤は、細胞の浸潤を抑制するためのものであり、上記した本発明のペプチドを少なくとも含み、必要に応じて更にその他の成分を含む。
＜ペプチド＞
前記ペプチドの詳細としては、上記した本発明の（ペプチド）の項目に記載した通りである。前記ペプチドは、細胞の浸潤を効果的に抑制することができるので、細胞の浸潤を抑制するための前記細胞浸潤抑制剤の有効成分として好適である。
前記細胞浸潤抑制剤中の前記ペプチドの含有量としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができる。また、前記細胞浸潤抑制剤は、前記ペプチドそのものであってもよい。
前記ペプチドの詳細としては、上記した本発明の（ペプチド）の項目に記載した通りである。前記ペプチドは、細胞の浸潤を効果的に抑制することができるので、細胞の浸潤を抑制するための前記細胞浸潤抑制剤の有効成分として好適である。
前記細胞浸潤抑制剤中の前記ペプチドの含有量としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができる。また、前記細胞浸潤抑制剤は、前記ペプチドそのものであってもよい。
＜その他の成分＞
前記その他の成分としては、本発明の効果を損なわない限り、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、上記した（細胞遊走抑制剤）の＜その他の成分＞の項目に記載したものと同様のものが挙げられる。
前記細胞浸潤抑制剤中の前記その他の成分の含有量としても、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができる。
前記その他の成分としては、本発明の効果を損なわない限り、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、上記した（細胞遊走抑制剤）の＜その他の成分＞の項目に記載したものと同様のものが挙げられる。
前記細胞浸潤抑制剤中の前記その他の成分の含有量としても、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができる。
＜細胞＞
前記細胞浸潤抑制剤の適用対象となる細胞としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、小細胞肺がんなどのＧＲＰＲ発現細胞、ＧＲＰ受容体を発現しないがん細胞、骨髄由来抑制細胞（ｍｙｅｌｏｉｄ－ｄｅｒｉｖｅｄ ｓｕｐｐｒｅｓｓｏｒ ｃｅｌｌｓ）、リンパ球、樹状細胞、マスト細胞、マクロファージなどが挙げられる。
後述する試験例に示すように、前記細胞浸潤抑制剤は、例えば、ＧＲＰによるＧＲＰＲ発現細胞の浸潤を抑制することができる。
前記細胞は、体外で培養されている細胞であってもよいし、また、個体の体内に存在する細胞であってもよい。
前記細胞浸潤抑制剤の適用対象となる細胞としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、小細胞肺がんなどのＧＲＰＲ発現細胞、ＧＲＰ受容体を発現しないがん細胞、骨髄由来抑制細胞（ｍｙｅｌｏｉｄ－ｄｅｒｉｖｅｄ ｓｕｐｐｒｅｓｓｏｒ ｃｅｌｌｓ）、リンパ球、樹状細胞、マスト細胞、マクロファージなどが挙げられる。
後述する試験例に示すように、前記細胞浸潤抑制剤は、例えば、ＧＲＰによるＧＲＰＲ発現細胞の浸潤を抑制することができる。
前記細胞は、体外で培養されている細胞であってもよいし、また、個体の体内に存在する細胞であってもよい。
＜作用＞
前記細胞浸潤抑制剤は、例えば、細胞に導入することによって、前記細胞に作用させることができる。前記導入の方法としては、特に制限はなく、従来公知の手法の中から目的に応じて適宜選択することができる。
細胞に対して作用させる前記細胞浸潤抑制剤の量としては、特に制限はなく、細胞の種類や所望の効果の程度等に応じて適宜選択することができるが、例えば、４００万個の細胞数に対し、前記ペプチドの量として、４０μｇ～６０μｇなどが挙げられる。
前記細胞浸潤抑制剤は、例えば、細胞に導入することによって、前記細胞に作用させることができる。前記導入の方法としては、特に制限はなく、従来公知の手法の中から目的に応じて適宜選択することができる。
細胞に対して作用させる前記細胞浸潤抑制剤の量としては、特に制限はなく、細胞の種類や所望の効果の程度等に応じて適宜選択することができるが、例えば、４００万個の細胞数に対し、前記ペプチドの量として、４０μｇ～６０μｇなどが挙げられる。
＜併用＞
後述する試験例で示すように、本発明の細胞浸潤抑制剤の有効成分であるペプチドを作用させることにより、細胞の浸潤を低減することができる。本発明の細胞浸潤抑制剤は、他の医薬と組み合わせて使用してもよい。
後述する試験例で示すように、本発明の細胞浸潤抑制剤の有効成分であるペプチドを作用させることにより、細胞の浸潤を低減することができる。本発明の細胞浸潤抑制剤は、他の医薬と組み合わせて使用してもよい。
（細胞の浸潤抑制方法）
前記細胞浸潤抑制剤は、前記ペプチドを含むので、細胞に作用させることにより、受容体がＧα１２に共役することを抑制することで、細胞の浸潤を効果的に抑制することができると考えられる。したがって、本発明は、細胞に、前記細胞浸潤抑制剤を作用させることを特徴とする細胞の浸潤抑制方法にも関する。
前記細胞としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、上記した（細胞浸潤抑制剤）の＜細胞＞の項目に記載したものと同様のものが挙げられる。
また、前記細胞の浸潤抑制方法では、上記した（細胞浸潤抑制剤）の＜併用＞の項目に記載したのと同様に、他の医薬を更に作用させてもよい。
前記細胞浸潤抑制剤は、前記ペプチドを含むので、細胞に作用させることにより、受容体がＧα１２に共役することを抑制することで、細胞の浸潤を効果的に抑制することができると考えられる。したがって、本発明は、細胞に、前記細胞浸潤抑制剤を作用させることを特徴とする細胞の浸潤抑制方法にも関する。
前記細胞としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、上記した（細胞浸潤抑制剤）の＜細胞＞の項目に記載したものと同様のものが挙げられる。
また、前記細胞の浸潤抑制方法では、上記した（細胞浸潤抑制剤）の＜併用＞の項目に記載したのと同様に、他の医薬を更に作用させてもよい。
（がん細胞転移抑制剤）
本発明のがん細胞転移抑制剤は、がん細胞の転移を抑制するためのものであり、前記した本発明のペプチドを少なくとも含み、必要に応じて更にその他の成分を含む。
本発明のがん細胞転移抑制剤は、がん細胞の転移を抑制するためのものであり、前記した本発明のペプチドを少なくとも含み、必要に応じて更にその他の成分を含む。
＜ペプチド＞
前記ペプチドの詳細としては、上記した本発明の（ペプチド）の項目に記載した通りである。前記ペプチドは、がん細胞の転移を効果的に抑制することができるので、がん細胞の転移を抑制するための前記がん細胞転移抑制剤の有効成分として好適である。
前記がん細胞転移抑制剤中の前記ペプチドの含有量としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができる。また、前記がん細胞転移抑制剤は、前記ペプチドそのものであってもよい。
前記ペプチドの詳細としては、上記した本発明の（ペプチド）の項目に記載した通りである。前記ペプチドは、がん細胞の転移を効果的に抑制することができるので、がん細胞の転移を抑制するための前記がん細胞転移抑制剤の有効成分として好適である。
前記がん細胞転移抑制剤中の前記ペプチドの含有量としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができる。また、前記がん細胞転移抑制剤は、前記ペプチドそのものであってもよい。
＜その他の成分＞
前記その他の成分としては、本発明の効果を損なわない限り、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、上記した（細胞遊走抑制剤）の＜その他の成分＞の項目に記載したものと同様のものが挙げられる。
前記がん細胞転移抑制剤中の前記その他の成分の含有量としても、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができる。
前記その他の成分としては、本発明の効果を損なわない限り、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、上記した（細胞遊走抑制剤）の＜その他の成分＞の項目に記載したものと同様のものが挙げられる。
前記がん細胞転移抑制剤中の前記その他の成分の含有量としても、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができる。
＜がん細胞＞
前記がん細胞転移抑制剤の適用対象となるがん細胞としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、メラノーマ細胞、小細胞肺がんなどのＧＲＰＲ発現細胞、ＧＲＰ受容体を発現しないがん細胞、肉腫細胞、白血病細胞などが挙げられる。
後述する試験例に示すように、前記がん細胞転移抑制剤は、例えば、メラノーマ細胞の肺への転移を抑制することができる。
前記細胞は、体外で培養されている細胞であってもよいし、また、個体の体内に存在する細胞であってもよい。
前記がん細胞転移抑制剤の適用対象となるがん細胞としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、メラノーマ細胞、小細胞肺がんなどのＧＲＰＲ発現細胞、ＧＲＰ受容体を発現しないがん細胞、肉腫細胞、白血病細胞などが挙げられる。
後述する試験例に示すように、前記がん細胞転移抑制剤は、例えば、メラノーマ細胞の肺への転移を抑制することができる。
前記細胞は、体外で培養されている細胞であってもよいし、また、個体の体内に存在する細胞であってもよい。
＜作用＞
前記がん細胞転移抑制剤は、例えば、がん細胞に導入することによって、前記細胞に作用させることができる。前記導入の方法としては、特に制限はなく、従来公知の手法の中から目的に応じて適宜選択することができる。
がん細胞に対して作用させる前記がん細胞転移抑制剤の量としては、特に制限はなく、細胞の種類や所望の効果の程度等に応じて適宜選択することができるが、例えば、４００万個の細胞数に対し、前記ペプチドの量として、４０μｇ～６０μｇなどが挙げられる。
前記がん細胞転移抑制剤は、例えば、がん細胞に導入することによって、前記細胞に作用させることができる。前記導入の方法としては、特に制限はなく、従来公知の手法の中から目的に応じて適宜選択することができる。
がん細胞に対して作用させる前記がん細胞転移抑制剤の量としては、特に制限はなく、細胞の種類や所望の効果の程度等に応じて適宜選択することができるが、例えば、４００万個の細胞数に対し、前記ペプチドの量として、４０μｇ～６０μｇなどが挙げられる。
＜併用＞
後述する試験例で示すように、本発明のがん細胞転移抑制剤の有効成分であるペプチドを作用させることにより、がん細胞の転移を低減することができる。本発明のがん細胞転移抑制剤は、他の医薬と組み合わせて使用してもよい。
後述する試験例で示すように、本発明のがん細胞転移抑制剤の有効成分であるペプチドを作用させることにより、がん細胞の転移を低減することができる。本発明のがん細胞転移抑制剤は、他の医薬と組み合わせて使用してもよい。
（がん細胞の転移抑制方法）
前記がん細胞転移抑制剤は、前記ペプチドを含むので、がん細胞に作用させることにより、受容体がＧα１２に共役することを抑制することで、がん細胞の転移を効果的に抑制することができると考えられる。したがって、本発明は、がん細胞に、前記がん細胞転移抑制剤を作用させることを特徴とするがん細胞の転移抑制方法にも関する。
前記がん細胞としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、上記した（がん細胞転移抑制剤）の（がん細胞）の項目に記載したものと同様のものが挙げられる。
また、前記がん細胞の転移抑制方法では、上記した（がん細胞転移抑制剤）の＜併用＞の項目に記載したのと同様に、他の医薬を更に作用させてもよい。
前記がん細胞転移抑制剤は、前記ペプチドを含むので、がん細胞に作用させることにより、受容体がＧα１２に共役することを抑制することで、がん細胞の転移を効果的に抑制することができると考えられる。したがって、本発明は、がん細胞に、前記がん細胞転移抑制剤を作用させることを特徴とするがん細胞の転移抑制方法にも関する。
前記がん細胞としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、上記した（がん細胞転移抑制剤）の（がん細胞）の項目に記載したものと同様のものが挙げられる。
また、前記がん細胞の転移抑制方法では、上記した（がん細胞転移抑制剤）の＜併用＞の項目に記載したのと同様に、他の医薬を更に作用させてもよい。
（医薬）
本発明の医薬は、前記した本発明の細胞遊走抑制剤、細胞浸潤抑制剤、及びがん細胞転移抑制剤の少なくともいずれかを含み、更に必要に応じてその他の成分を含む。
前記医薬は、疾患の予防乃至治療のために用いることができる。本発明において、予防とは、疾患（例えば、がん）の発生や再発を防止することをいい、治療とは、疾患の症状を治したり、和らげたり、進行や転移を防いだりすることをいう。
本発明の医薬は、前記した本発明の細胞遊走抑制剤、細胞浸潤抑制剤、及びがん細胞転移抑制剤の少なくともいずれかを含み、更に必要に応じてその他の成分を含む。
前記医薬は、疾患の予防乃至治療のために用いることができる。本発明において、予防とは、疾患（例えば、がん）の発生や再発を防止することをいい、治療とは、疾患の症状を治したり、和らげたり、進行や転移を防いだりすることをいう。
＜細胞遊走抑制剤、細胞浸潤抑制剤、及びがん細胞転移抑制剤＞
前記細胞遊走抑制剤、細胞浸潤抑制剤、及びがん細胞転移抑制剤の詳細としては、上記した本発明の（細胞遊走抑制剤）、（細胞浸潤抑制剤）、及び（がん細胞転移抑制剤）の項目に記載した通りである。
前記細胞遊走抑制剤、細胞浸潤抑制剤、及びがん細胞転移抑制剤の詳細としては、上記した本発明の（細胞遊走抑制剤）、（細胞浸潤抑制剤）、及び（がん細胞転移抑制剤）の項目に記載した通りである。
前記細胞遊走抑制剤は、上記した本発明のペプチドを含むので、細胞の遊走を効果的に抑制することができ、前記細胞浸潤抑制剤は、上記した本発明のペプチドを含むので、細胞の浸潤を効果的に抑制することができ、前記がん細胞転移抑制剤は、上記した本発明のペプチドを含むので、がん細胞の転移を効果的に抑制することができる。即ち、前記細胞遊走抑制剤、前記細胞浸潤抑制剤、及び前記がん細胞転移抑制剤は、医薬として好適に利用可能である。
前記医薬中の前記細胞遊走抑制剤、細胞浸潤抑制剤、及びがん細胞転移抑制剤の少なくともいずれかの合計含有量としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができる。また、前記医薬は、前記細胞遊走抑制剤、細胞浸潤抑制剤、及びがん細胞転移抑制剤の少なくともいずれかそのものであってもよい。
＜その他の成分＞
前記その他の成分としては、本発明の効果を損なわない限り、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、医薬的に許容され得る担体などが挙げられる。前記担体としても、特に制限はなく、例えば、剤型等に応じて適宜選択することができる。また、前記医薬中の前記その他の成分の含有量としても、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができる。
前記その他の成分としては、本発明の効果を損なわない限り、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、医薬的に許容され得る担体などが挙げられる。前記担体としても、特に制限はなく、例えば、剤型等に応じて適宜選択することができる。また、前記医薬中の前記その他の成分の含有量としても、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができる。
＜剤型＞
前記医薬の剤型としては、特に制限はなく、例えば、後述するような所望の投与方法に応じて適宜選択することができ、例えば、経口固形剤（錠剤、被覆錠剤、顆粒剤、散剤、カプセル剤等）、経口液剤（内服液剤、シロップ剤、エリキシル剤等）、注射剤（溶液、懸濁液、用事溶解用固形剤等）、軟膏剤、貼付剤、ゲル剤、クリーム剤、外用散剤、スプレー剤、吸入散剤などが挙げられる。
前記医薬の剤型としては、特に制限はなく、例えば、後述するような所望の投与方法に応じて適宜選択することができ、例えば、経口固形剤（錠剤、被覆錠剤、顆粒剤、散剤、カプセル剤等）、経口液剤（内服液剤、シロップ剤、エリキシル剤等）、注射剤（溶液、懸濁液、用事溶解用固形剤等）、軟膏剤、貼付剤、ゲル剤、クリーム剤、外用散剤、スプレー剤、吸入散剤などが挙げられる。
前記経口固形剤としては、例えば、前記有効成分（ペプチド）に、賦形剤、更には必要に応じて結合剤、崩壊剤、滑沢剤、着色剤、矯味・矯臭剤等の添加剤を加え、常法により製造することができる。
前記賦形剤としては、例えば、乳糖、白糖、塩化ナトリウム、ブドウ糖、デンプン、炭酸カルシウム、カオリン、微結晶セルロース、珪酸などが挙げられる。前記結合剤としては、例えば、水、エタノール、プロパノール、単シロップ、ブドウ糖液、デンプン液、ゼラチン液、カルボキシメチルセルロース、ヒドロキシプロピルセルロース、ヒドロキシプロピルスターチ、メチルセルロース、エチルセルロース、シェラック、リン酸カルシウム、ポリビニルピロリドンなどが挙げられる。前記崩壊剤としては、例えば、乾燥デンプン、アルギン酸ナトリウム、カンテン末、炭酸水素ナトリウム、炭酸カルシウム、ラウリル硫酸ナトリウム、ステアリン酸モノグリセリド、乳糖などが挙げられる。前記滑沢剤としては、例えば、精製タルク、ステアリン酸塩、ホウ砂、ポリエチレングリコールなどが挙げられる。前記着色剤としては、例えば、酸化チタン、酸化鉄などが挙げられる。前記矯味・矯臭剤としては、例えば、白糖、橙皮、クエン酸、酒石酸などが挙げられる。
前記賦形剤としては、例えば、乳糖、白糖、塩化ナトリウム、ブドウ糖、デンプン、炭酸カルシウム、カオリン、微結晶セルロース、珪酸などが挙げられる。前記結合剤としては、例えば、水、エタノール、プロパノール、単シロップ、ブドウ糖液、デンプン液、ゼラチン液、カルボキシメチルセルロース、ヒドロキシプロピルセルロース、ヒドロキシプロピルスターチ、メチルセルロース、エチルセルロース、シェラック、リン酸カルシウム、ポリビニルピロリドンなどが挙げられる。前記崩壊剤としては、例えば、乾燥デンプン、アルギン酸ナトリウム、カンテン末、炭酸水素ナトリウム、炭酸カルシウム、ラウリル硫酸ナトリウム、ステアリン酸モノグリセリド、乳糖などが挙げられる。前記滑沢剤としては、例えば、精製タルク、ステアリン酸塩、ホウ砂、ポリエチレングリコールなどが挙げられる。前記着色剤としては、例えば、酸化チタン、酸化鉄などが挙げられる。前記矯味・矯臭剤としては、例えば、白糖、橙皮、クエン酸、酒石酸などが挙げられる。
前記経口液剤としては、例えば、前記有効成分に、矯味・矯臭剤、緩衝剤、安定化剤等の添加剤を加え、常法により製造することができる。
前記矯味・矯臭剤としては、例えば、白糖、橙皮、クエン酸、酒石酸などが挙げられる。前記緩衝剤としては、例えば、クエン酸ナトリウムなどが挙げられる。前記安定化剤としては、例えば、トラガント、アラビアゴム、ゼラチンなどが挙げられる。
前記矯味・矯臭剤としては、例えば、白糖、橙皮、クエン酸、酒石酸などが挙げられる。前記緩衝剤としては、例えば、クエン酸ナトリウムなどが挙げられる。前記安定化剤としては、例えば、トラガント、アラビアゴム、ゼラチンなどが挙げられる。
前記注射剤としては、例えば、前記有効成分に、ｐＨ調節剤、緩衝剤、安定化剤、等張化剤、局所麻酔剤等を添加し、常法により皮下用、筋肉内用、静脈内用等の注射剤を製造することができる。
前記ｐＨ調節剤及び前記緩衝剤としては、例えば、クエン酸ナトリウム、酢酸ナトリウム、リン酸ナトリウムなどが挙げられる。前記安定化剤としては、例えば、ピロ亜硫酸ナトリウム、ＥＤＴＡ、チオグリコール酸、チオ乳酸などが挙げられる。前記等張化剤としては、例えば、塩化ナトリウム、ブドウ糖などが挙げられる。前記局所麻酔剤としては、例えば、塩酸プロカイン、塩酸リドカインなどが挙げられる。
前記ｐＨ調節剤及び前記緩衝剤としては、例えば、クエン酸ナトリウム、酢酸ナトリウム、リン酸ナトリウムなどが挙げられる。前記安定化剤としては、例えば、ピロ亜硫酸ナトリウム、ＥＤＴＡ、チオグリコール酸、チオ乳酸などが挙げられる。前記等張化剤としては、例えば、塩化ナトリウム、ブドウ糖などが挙げられる。前記局所麻酔剤としては、例えば、塩酸プロカイン、塩酸リドカインなどが挙げられる。
前記軟膏剤としては、例えば、前記有効成分に、公知の基剤、安定剤、湿潤剤、保存剤等を配合し、常法により混合し、製造することができる。
前記基剤としては、例えば、流動パラフィン、白色ワセリン、サラシミツロウ、オクチルドデシルアルコール、パラフィンなどが挙げられる。前記保存剤としては、例えば、パラオキシ安息香酸メチル、パラオキシ安息香酸エチル、パラオキシ安息香酸プロピルなどが挙げられる。
前記基剤としては、例えば、流動パラフィン、白色ワセリン、サラシミツロウ、オクチルドデシルアルコール、パラフィンなどが挙げられる。前記保存剤としては、例えば、パラオキシ安息香酸メチル、パラオキシ安息香酸エチル、パラオキシ安息香酸プロピルなどが挙げられる。
前記貼付剤としては、例えば、公知の支持体に前記軟膏剤としてのクリーム剤、ゲル剤、ペースト剤等を、常法により塗布し、製造することができる。前記支持体としては、例えば、綿、スフ、化学繊維からなる織布、不織布、軟質塩化ビニル、ポリエチレン、ポリウレタン等のフィルム、発泡体シートなどが挙げられる。
＜疾患＞
前記医薬の適用対象となる疾患としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、小細胞肺がん等の肺がん、胃がん、大腸がん、すい臓がん、腎臓がん、肝臓がん、乳がん、皮膚がん等のがん；横紋筋肉腫等の肉腫；急性骨髄性白血病等の白血病；重症喘息等の喘息などが挙げられる。
前記医薬の適用対象となる疾患としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、小細胞肺がん等の肺がん、胃がん、大腸がん、すい臓がん、腎臓がん、肝臓がん、乳がん、皮膚がん等のがん；横紋筋肉腫等の肉腫；急性骨髄性白血病等の白血病；重症喘息等の喘息などが挙げられる。
＜投与＞
前記医薬の投与対象個体としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、ヒト、マウス、ラット、ウシ、ブタ、サル、イヌ、ネコなどが挙げられるが、これらの中でも、ヒトが特に好ましい。
前記医薬の投与対象個体としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、ヒト、マウス、ラット、ウシ、ブタ、サル、イヌ、ネコなどが挙げられるが、これらの中でも、ヒトが特に好ましい。
前記医薬の投与方法としては、特に制限はなく、例えば、前記医薬の剤型、疾患の種類、患者の状態等に応じて、局所投与、全身投与のいずれかを選択することができる。例えば、局所投与においては、前記医薬の有効成分を、所望の部位（例えば、腫瘍部位）に直接注入することにより投与することができる。前記注入には、注射等の従来公知の手法を適宜利用することができる。また、全身投与（例えば、経口投与、腹腔内投与、血液中への投与等）においては、前記医薬の有効成分が所望の部位（例えば、腫瘍部位）まで安定に、かつ効率良く送達されるよう、従来公知の薬剤送達技術を適宜応用することが好ましい。
前記医薬の投与量としては、特に制限はなく、投与対象である患者の年齢、体重、所望の効果の程度等に応じて適宜選択することができるが、例えば、成人への１日の投与あたり、前記ペプチドの量として、４０ｍｇ～８０ｍｇが好ましい。
また、前記医薬の投与回数としても、特に制限はなく、投与対象である患者の年齢、体重、所望の効果の程度等に応じて、適宜選択することができる。
また、前記医薬の投与回数としても、特に制限はなく、投与対象である患者の年齢、体重、所望の効果の程度等に応じて、適宜選択することができる。
前記医薬の投与時期としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、前記疾患に対して、予防的に投与されてもよいし、治療的に投与されてもよい。
本発明の医薬は、他の医薬と組み合わせて使用してもよい。
（疾患の予防乃至治療方法）
前記医薬は、前記細胞遊走抑制剤、細胞浸潤抑制剤、及びがん細胞転移抑制剤の少なくともいずれかを含むので、個体に投与することにより、受容体がＧα１２に共役することを抑制することで、細胞の遊走、細胞の浸潤、及びがん細胞の転移の少なくともいずれかを効果的に抑制し、疾患を予防乃至治療することができると考えられる。したがって、本発明は、個体に前記医薬を投与することを特徴とする疾患の予防乃至治療方法にも関する。
前記疾患としては、特に制限はなく、上記した（医薬）の＜疾患＞項目に記載したものと同様のものが挙げられる。
また、前記予防乃至治療方法では、他の医薬と組み合わせて使用してもよい。
前記医薬は、前記細胞遊走抑制剤、細胞浸潤抑制剤、及びがん細胞転移抑制剤の少なくともいずれかを含むので、個体に投与することにより、受容体がＧα１２に共役することを抑制することで、細胞の遊走、細胞の浸潤、及びがん細胞の転移の少なくともいずれかを効果的に抑制し、疾患を予防乃至治療することができると考えられる。したがって、本発明は、個体に前記医薬を投与することを特徴とする疾患の予防乃至治療方法にも関する。
前記疾患としては、特に制限はなく、上記した（医薬）の＜疾患＞項目に記載したものと同様のものが挙げられる。
また、前記予防乃至治療方法では、他の医薬と組み合わせて使用してもよい。
以下に本発明の試験例を説明するが、本発明は、これらの試験例に何ら限定されるものではない。
（試験例１：細胞遊走抑制試験－１）
各種ペプチドの細胞遊走抑制能を以下のようにして試験した。
各種ペプチドの細胞遊走抑制能を以下のようにして試験した。
＜ペプチド＞
以下の３種のペプチドを化学合成により調製した。
・ ＲＲＲＲＲＲＲＲＱＹＥＬＬ
ＱＹＥＬＬ（配列番号：３）のＮ末端側に、細胞膜透過性分子としてＬ体のアルギニン８残基を有するペプチド（以下、「Ｒ８－ｓ」と称することがある）である。なお、ＱＹＥＬＬは、三量体Ｇ蛋白質のＧｓファミリーのＧｓのＧαサブユニットのアミノ酸配列のＣ末端の５残基である。「Ｒ８－ｓ」は、対照として使用した。
・ ＲＲＲＲＲＲＲＲＥＹＮＬＶ
ＥＹＮＬＶ（配列番号：４）のＮ末端側に、細胞膜透過性分子としてＬ体のアルギニン８残基を有するペプチド（以下、「Ｒ８－ｑ」と称することがある）である。なお、ＥＹＮＬＶは、三量体Ｇ蛋白質のＧｑファミリーのＧｑのＧαサブユニットのアミノ酸配列のＣ末端の５残基である。
・ ＲＲＲＲＲＲＲＲＤＩＭＬＱ
ＤＩＭＬＱ（配列番号：１）のＮ末端側に、細胞膜透過性分子としてＬ体のアルギニン８残基を有するペプチド（以下、「Ｒ８－１２」と称することがある）。なお、ＤＩＭＬＱは、三量体Ｇ蛋白質のＧ１２ファミリーのＧ１２のＧαサブユニットのアミノ酸配列のＣ末端の５残基である。
以下の３種のペプチドを化学合成により調製した。
・ ＲＲＲＲＲＲＲＲＱＹＥＬＬ
ＱＹＥＬＬ（配列番号：３）のＮ末端側に、細胞膜透過性分子としてＬ体のアルギニン８残基を有するペプチド（以下、「Ｒ８－ｓ」と称することがある）である。なお、ＱＹＥＬＬは、三量体Ｇ蛋白質のＧｓファミリーのＧｓのＧαサブユニットのアミノ酸配列のＣ末端の５残基である。「Ｒ８－ｓ」は、対照として使用した。
・ ＲＲＲＲＲＲＲＲＥＹＮＬＶ
ＥＹＮＬＶ（配列番号：４）のＮ末端側に、細胞膜透過性分子としてＬ体のアルギニン８残基を有するペプチド（以下、「Ｒ８－ｑ」と称することがある）である。なお、ＥＹＮＬＶは、三量体Ｇ蛋白質のＧｑファミリーのＧｑのＧαサブユニットのアミノ酸配列のＣ末端の５残基である。
・ ＲＲＲＲＲＲＲＲＤＩＭＬＱ
ＤＩＭＬＱ（配列番号：１）のＮ末端側に、細胞膜透過性分子としてＬ体のアルギニン８残基を有するペプチド（以下、「Ｒ８－１２」と称することがある）。なお、ＤＩＭＬＱは、三量体Ｇ蛋白質のＧ１２ファミリーのＧ１２のＧαサブユニットのアミノ酸配列のＣ末端の５残基である。
＜細胞＞
試験に用いる細胞として、以下のようにして調製したヒトＧＲＰ（ｇａｓｔｒｉｎ－ｒｅｌｅａｓｉｎｇ ｐｅｐｔｉｄｅ）受容体安定発現ＣＨＯ細胞を用いた。
試験に用いる細胞として、以下のようにして調製したヒトＧＲＰ（ｇａｓｔｒｉｎ－ｒｅｌｅａｓｉｎｇ ｐｅｐｔｉｄｅ）受容体安定発現ＣＨＯ細胞を用いた。
－ヒトＧＲＰ受容体安定発現ＣＨＯ細胞の調製－
（１）ヒトＧＲＰ受容体のクローニング
まずヒトＧＲＰ受容体を発現していることが知られている小細胞肺癌細胞株Ｈ３４５細胞からトータルＲＮＡを採取し、逆転写酵素を処理してｃＤＮＡとした。前記ｃＤＮＡをテンプレートにして、以下のプライマーを用い、ＰＣＲ法で２つのフラグメントを作製した。ＰＣＲは９４℃を５分間の後、９４℃を１分間→５２℃を１分間→７２℃を２分間のサイクルを４０サイクル、その後７２℃を１０分間で行なった。フラグメント１は、制限酵素ＨｉｎｄＩＩＩとＫｐｎＩで処理した後、ベクターｐＵＣ１９に導入してシークエンスを確認した。フラグメント２は、制限酵素ＫｐｎＩとＥｃｏＲＩで処理した後、ベクターｐＵＣ１９に導入してシークエンスを確認した。その後、ベクターｐｃＤＮＡ３を制限酵素ＨｉｎｄＩＩＩとＥｃｏＲＩで処理して、フラグメント１とフラグメント２をライゲーションした。
［フラグメント１］
・ ５’プライマー ： ＧＧＧＡＡＧＣＴＴＴＧＧＧＡＡＡＡＡＡＡＡＴＣＴ（配列番号：６）
・ ３’プライマー ： ＡＡＴＣＣＴＧＣＣＡＡＡＴＡＧＣＣＡＴＣ（配列番号：７）
［フラグメント２］
・ ５’プライマー ： ＴＣＣＴＡＡＴＡＡＴＡＡＣＧＴＧＴＧＣＣＡ（配列番号：８）
・ ３’プライマー ： ＣＧＧＡＡＴＴＣＡＡＡＴＣＡＡＧＧＧＴＣＡＡＴ（配列番号：９）
（１）ヒトＧＲＰ受容体のクローニング
まずヒトＧＲＰ受容体を発現していることが知られている小細胞肺癌細胞株Ｈ３４５細胞からトータルＲＮＡを採取し、逆転写酵素を処理してｃＤＮＡとした。前記ｃＤＮＡをテンプレートにして、以下のプライマーを用い、ＰＣＲ法で２つのフラグメントを作製した。ＰＣＲは９４℃を５分間の後、９４℃を１分間→５２℃を１分間→７２℃を２分間のサイクルを４０サイクル、その後７２℃を１０分間で行なった。フラグメント１は、制限酵素ＨｉｎｄＩＩＩとＫｐｎＩで処理した後、ベクターｐＵＣ１９に導入してシークエンスを確認した。フラグメント２は、制限酵素ＫｐｎＩとＥｃｏＲＩで処理した後、ベクターｐＵＣ１９に導入してシークエンスを確認した。その後、ベクターｐｃＤＮＡ３を制限酵素ＨｉｎｄＩＩＩとＥｃｏＲＩで処理して、フラグメント１とフラグメント２をライゲーションした。
［フラグメント１］
・ ５’プライマー ： ＧＧＧＡＡＧＣＴＴＴＧＧＧＡＡＡＡＡＡＡＡＴＣＴ（配列番号：６）
・ ３’プライマー ： ＡＡＴＣＣＴＧＣＣＡＡＡＴＡＧＣＣＡＴＣ（配列番号：７）
［フラグメント２］
・ ５’プライマー ： ＴＣＣＴＡＡＴＡＡＴＡＡＣＧＴＧＴＧＣＣＡ（配列番号：８）
・ ３’プライマー ： ＣＧＧＡＡＴＴＣＡＡＡＴＣＡＡＧＧＧＴＣＡＡＴ（配列番号：９）
（２）ＣＨＯ細胞へのヒトＧＲＰ受容体の導入
前記（１）で得られた、ヒトＧＲＰ受容体ｃＤＮＡをｐｃＤＮＡ３に導入したプラスミドを、Ｌｉｐｏ ｆｅｃｔａｍｉｎｅ ２０００（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｅｒ ＳＣＩＥＮＴＩＦＩＣ）を用いてＣＨＯ細胞にトランスフェクションした。トランスフェクションの翌日にＧ４１８（ジェネティシン）を加えた。Ｇ４１８の量を増やしてＧ４１８耐性クローンをいくつか選択した。その中で、ＧＲＰアナログであるボンベシン結合能が最も高いクローンを選択した。
選択したクローンを、限界希釈（Ｌｉｍｉｔｉｎｇ Ｄｉｌｕｔｉｏｎ）法を用いて単クローン化した。すなわち、さらに９６ウェルプレートの各ウェルに１個以下になるように細胞をまき、増えてきた細胞を選択した。
最終的にボンベシン結合能が十分であること、Ｋｄ値が数ｎＭであることを確認した。この細胞株をヒトＧＲＰ受容体安定発現ＣＨＯ細胞とした。
前記（１）で得られた、ヒトＧＲＰ受容体ｃＤＮＡをｐｃＤＮＡ３に導入したプラスミドを、Ｌｉｐｏ ｆｅｃｔａｍｉｎｅ ２０００（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｅｒ ＳＣＩＥＮＴＩＦＩＣ）を用いてＣＨＯ細胞にトランスフェクションした。トランスフェクションの翌日にＧ４１８（ジェネティシン）を加えた。Ｇ４１８の量を増やしてＧ４１８耐性クローンをいくつか選択した。その中で、ＧＲＰアナログであるボンベシン結合能が最も高いクローンを選択した。
選択したクローンを、限界希釈（Ｌｉｍｉｔｉｎｇ Ｄｉｌｕｔｉｏｎ）法を用いて単クローン化した。すなわち、さらに９６ウェルプレートの各ウェルに１個以下になるように細胞をまき、増えてきた細胞を選択した。
最終的にボンベシン結合能が十分であること、Ｋｄ値が数ｎＭであることを確認した。この細胞株をヒトＧＲＰ受容体安定発現ＣＨＯ細胞とした。
（３）ボンベシン結合実験による確認
２４ウェルプレートを用いた。２０ｍＭ ＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．４）、０．１％ＢＳＡを加えた培地αＭＥＭに、Ｉ―１２５ラベルボンベシンと非ラベルボンベシンを加え、各ウェル当たり５０，０００個の細胞を入れて４℃で１昼夜インキュベーションした。各ウェルの溶液を除去した後、０．５ｍＬのＰＢＳで３回細胞を洗浄し、０．５ｍＬの０．２Ｎ ＮａＯＨを加えて細胞を溶解させた後、各ウェルの液体をチューブに移してからγカウンターで測定した（ｎ＝３）。１ウェルに入れたＩ―１２５ラベルボンベシンの平均は１３１，６８３ｃｐｍだった。
ヒトＧＲＰ受容体安定発現ＣＨＯ細胞株のＫｄ値は７．０ｎＭであった。コントロールとして用いた野生株ＣＨＯ細胞ではボンベシン結合能は認めなかった。
２４ウェルプレートを用いた。２０ｍＭ ＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．４）、０．１％ＢＳＡを加えた培地αＭＥＭに、Ｉ―１２５ラベルボンベシンと非ラベルボンベシンを加え、各ウェル当たり５０，０００個の細胞を入れて４℃で１昼夜インキュベーションした。各ウェルの溶液を除去した後、０．５ｍＬのＰＢＳで３回細胞を洗浄し、０．５ｍＬの０．２Ｎ ＮａＯＨを加えて細胞を溶解させた後、各ウェルの液体をチューブに移してからγカウンターで測定した（ｎ＝３）。１ウェルに入れたＩ―１２５ラベルボンベシンの平均は１３１，６８３ｃｐｍだった。
ヒトＧＲＰ受容体安定発現ＣＨＯ細胞株のＫｄ値は７．０ｎＭであった。コントロールとして用いた野生株ＣＨＯ細胞ではボンベシン結合能は認めなかった。
＜細胞遊走実験：ボイデンチャンバー法＞
Ｃｙｔｏ Ｓｅｌｅｃｔ ２４―ｗｅｌｌ Ｃｅｌｌ Ｍｉｇｒａｔｉｏｎ Ａｓｓａｙ（８μｍ）Ｃｏｌｏｒｉｍｅｔｒｉｃキット（セルバイオラボ社）を用い、以下のようにして細胞遊走実験を行った。
前記ヒトＧＲＰ受容体安定発現ＣＨＯ細胞に、前記各ペプチド１０μＭと０．１％ＢＳＡを共に加えて３７℃で２時間処理した後、前記細胞２０，０００個をインサートに加えた（ｎ＝３）。
次いで、インサートに、ＧＲＰアナログであるボンベシンを１０ｎＭで加えた。
ウェルに、１０％ ＦＢＳ（牛胎児血清）を加え、３７℃で２２時間インキュベーションした。
インキュベーション後、ウェルの底面に付着した細胞をＣｅｌｌ ｃｏｕｎｔｉｎｇ ｋｉｔ―８（富士フイルム和光純薬株式会社）を用いて染色し、全細胞数をカウントした。
Ｃｙｔｏ Ｓｅｌｅｃｔ ２４―ｗｅｌｌ Ｃｅｌｌ Ｍｉｇｒａｔｉｏｎ Ａｓｓａｙ（８μｍ）Ｃｏｌｏｒｉｍｅｔｒｉｃキット（セルバイオラボ社）を用い、以下のようにして細胞遊走実験を行った。
前記ヒトＧＲＰ受容体安定発現ＣＨＯ細胞に、前記各ペプチド１０μＭと０．１％ＢＳＡを共に加えて３７℃で２時間処理した後、前記細胞２０，０００個をインサートに加えた（ｎ＝３）。
次いで、インサートに、ＧＲＰアナログであるボンベシンを１０ｎＭで加えた。
ウェルに、１０％ ＦＢＳ（牛胎児血清）を加え、３７℃で２２時間インキュベーションした。
インキュベーション後、ウェルの底面に付着した細胞をＣｅｌｌ ｃｏｕｎｔｉｎｇ ｋｉｔ―８（富士フイルム和光純薬株式会社）を用いて染色し、全細胞数をカウントした。
結果を図１に示す。図１の結果から、本発明のペプチドの一例である「Ｒ８－１２」が、細胞遊走抑制効果を有することが確認された。
（試験例２：細胞浸潤抑制試験）
各種ペプチドの細胞浸潤抑制能を以下のようにして試験した。
各種ペプチドの細胞浸潤抑制能を以下のようにして試験した。
＜ペプチド＞
試験例１と同様の以下の３種のペプチドを用いた。
・ ＲＲＲＲＲＲＲＲＱＹＥＬＬ（Ｒ８－ｓ）
・ ＲＲＲＲＲＲＲＲＥＹＮＬＶ（Ｒ８－ｑ）
・ ＲＲＲＲＲＲＲＲＤＩＭＬＱ（Ｒ８－１２）
試験例１と同様の以下の３種のペプチドを用いた。
・ ＲＲＲＲＲＲＲＲＱＹＥＬＬ（Ｒ８－ｓ）
・ ＲＲＲＲＲＲＲＲＥＹＮＬＶ（Ｒ８－ｑ）
・ ＲＲＲＲＲＲＲＲＤＩＭＬＱ（Ｒ８－１２）
＜細胞＞
試験例１と同様のヒトＧＲＰ受容体安定発現ＣＨＯ細胞を用いた。
試験例１と同様のヒトＧＲＰ受容体安定発現ＣＨＯ細胞を用いた。
＜細胞浸潤実験：ボイデンチャンバー法＞
Ｃｙｔｏ Ｓｅｌｅｃｔ ２４―ｗｅｌｌ Ｃｅｌｌ Ｉｎｖａｔｉｏｎ Ａｓｓａｙ Ｃｏｌｏｒｉｍｅｔｒｉｃキット（セルバイオラボ社）を用い、以下のようにして細胞浸潤実験を行った。
前記ヒトＧＲＰ受容体安定発現ＣＨＯ細胞に、前記各ペプチド１０μＭと０．１％ＢＳＡを共に加えて３７℃で２時間処理した後、前記細胞３０，０００個をＭａｔｒｉｇｅｌでコートしたインサートに加えた（ｎ＝３）。
次いで、インサートに、ＧＲＰアナログであるボンベシンを１０ｎＭで加えた。
ウェルに、１０％ ＦＢＳ（牛胎児血清）を加え、３７℃で２２時間インキュベーションした。
インキュベーション後、ウェルの底面に付着した細胞をＣｅｌｌ ｃｏｕｎｔｉｎｇ ｋｉｔ―８（富士フイルム和光純薬株式会社）を用いて染色し、全細胞数をカウントした。
Ｃｙｔｏ Ｓｅｌｅｃｔ ２４―ｗｅｌｌ Ｃｅｌｌ Ｉｎｖａｔｉｏｎ Ａｓｓａｙ Ｃｏｌｏｒｉｍｅｔｒｉｃキット（セルバイオラボ社）を用い、以下のようにして細胞浸潤実験を行った。
前記ヒトＧＲＰ受容体安定発現ＣＨＯ細胞に、前記各ペプチド１０μＭと０．１％ＢＳＡを共に加えて３７℃で２時間処理した後、前記細胞３０，０００個をＭａｔｒｉｇｅｌでコートしたインサートに加えた（ｎ＝３）。
次いで、インサートに、ＧＲＰアナログであるボンベシンを１０ｎＭで加えた。
ウェルに、１０％ ＦＢＳ（牛胎児血清）を加え、３７℃で２２時間インキュベーションした。
インキュベーション後、ウェルの底面に付着した細胞をＣｅｌｌ ｃｏｕｎｔｉｎｇ ｋｉｔ―８（富士フイルム和光純薬株式会社）を用いて染色し、全細胞数をカウントした。
結果を図２に示す。図２の結果から、本発明のペプチドの一例である「Ｒ８－１２」が、細胞浸潤抑制効果を有することが確認された。
試験例１及び２で示されたように、本発明のペプチドは、ＧＲＰ受容体を発現する細胞の遊走や浸潤を抑制することができることから、ＧＲＰ受容体を発現する細胞、例えば、小細胞肺がんなどの細胞遊走や細胞浸潤の抑制に好適に用いることができると考えられる。
（試験例３：細胞遊走抑制試験－２）
各種ペプチドの細胞遊走抑制能を以下のようにして試験した。
各種ペプチドの細胞遊走抑制能を以下のようにして試験した。
＜ペプチド＞
以下の２種のペプチドを化学合成により調製した。
・ ｒｒｒｒｒｒｒｒＱＹＥＬＬ
ＱＹＥＬＬ（配列番号：３）のＮ末端側に、細胞膜透過性分子としてＤ体のアルギニン８残基を有するペプチド（以下、「ｒ８－ｓ」と称することがある）である。「ｒ８－ｓ」は、対照として使用した。
・ ｒｒｒｒｒｒｒｒＤＩＭＬＱ
ＤＩＭＬＱ（配列番号：１）のＮ末端側に、細胞膜透過性分子としてＤ体のアルギニン８残基を有するペプチド（以下、「ｒ８－１２」と称することがある）である。
以下の２種のペプチドを化学合成により調製した。
・ ｒｒｒｒｒｒｒｒＱＹＥＬＬ
ＱＹＥＬＬ（配列番号：３）のＮ末端側に、細胞膜透過性分子としてＤ体のアルギニン８残基を有するペプチド（以下、「ｒ８－ｓ」と称することがある）である。「ｒ８－ｓ」は、対照として使用した。
・ ｒｒｒｒｒｒｒｒＤＩＭＬＱ
ＤＩＭＬＱ（配列番号：１）のＮ末端側に、細胞膜透過性分子としてＤ体のアルギニン８残基を有するペプチド（以下、「ｒ８－１２」と称することがある）である。
＜細胞＞
試験に用いる細胞として、以下のようにして調製した好中球を用いた。
－好中球の調製－
ヘパリン採血した血液１２ｍＬを５０ｍＬチューブに入れた。
４．５％デキストラン３ｍＬを前記チューブに加え、トランスファーピペットで数回ピペッティングを行った後、室温で３０分間静置した。
境界線が全体の半分以下になっていることを確認した後、上清（白血球）を別の５０ｍＬチューブにトランスファーピペットで移し、その底にヒストパークを５ｍＬ入れた。ピペットの先を底に入れておき、そのままピペットを立てて、重力で落とした。なお、全部落ちきる前にピペットの上を押さえてそっと抜いた。
１，２００ｒ．ｐ．ｍ．、２０分間、室温（２０℃）で遠心分離を行った。
上清を吸引して除去し、線の部分をキムワイプで拭き取った。次いで、滅菌蒸留水２ｍＬを加えて、トランスファーピペットで２０秒間撹拌し、溶血させた後、速やかに２倍食塩水（１．８％ ＮａＣｌ）２ｍＬを加えてよく混ぜ、更にＰＢＳ ２０ｍＬを加えてよく混ぜた。
１，５００ｒ．ｐ．ｍ．、１０分間、４℃で遠心分離を行った。
上清を吸引して除去した。次いで、５％ ＦＣＳを含有するＰＢＳ ５ｍＬを加えて、トランスファーピペットで撹拌し。更に、５％ ＦＣＳを含有するＰＢＳ １０ｍＬを加えた。
１，５００ｒ．ｐ．ｍ．、１０分間、４℃で遠心分離を行った。
上清を除去し、０．２％ ＢＳＡ含有ＨＢＳＳ ４ｍＬに懸濁し、細胞数をカウントした。
試験に用いる細胞として、以下のようにして調製した好中球を用いた。
－好中球の調製－
ヘパリン採血した血液１２ｍＬを５０ｍＬチューブに入れた。
４．５％デキストラン３ｍＬを前記チューブに加え、トランスファーピペットで数回ピペッティングを行った後、室温で３０分間静置した。
境界線が全体の半分以下になっていることを確認した後、上清（白血球）を別の５０ｍＬチューブにトランスファーピペットで移し、その底にヒストパークを５ｍＬ入れた。ピペットの先を底に入れておき、そのままピペットを立てて、重力で落とした。なお、全部落ちきる前にピペットの上を押さえてそっと抜いた。
１，２００ｒ．ｐ．ｍ．、２０分間、室温（２０℃）で遠心分離を行った。
上清を吸引して除去し、線の部分をキムワイプで拭き取った。次いで、滅菌蒸留水２ｍＬを加えて、トランスファーピペットで２０秒間撹拌し、溶血させた後、速やかに２倍食塩水（１．８％ ＮａＣｌ）２ｍＬを加えてよく混ぜ、更にＰＢＳ ２０ｍＬを加えてよく混ぜた。
１，５００ｒ．ｐ．ｍ．、１０分間、４℃で遠心分離を行った。
上清を吸引して除去した。次いで、５％ ＦＣＳを含有するＰＢＳ ５ｍＬを加えて、トランスファーピペットで撹拌し。更に、５％ ＦＣＳを含有するＰＢＳ １０ｍＬを加えた。
１，５００ｒ．ｐ．ｍ．、１０分間、４℃で遠心分離を行った。
上清を除去し、０．２％ ＢＳＡ含有ＨＢＳＳ ４ｍＬに懸濁し、細胞数をカウントした。
＜好中球遊走実験＞
－好中球の準備－
前記各ペプチド１０μＭ、１０％ ＦＢＳを含む０．２％ ＢＳＡ含有ＨＢＳＳ ４．４ｍＬ（細胞数 ４４０×１０４個）を５０ｍＬチューブに入れ、３７℃で６０分間、ＣＯ２インキュベーターでインキュベーションした。
次いで、１，５００ｒ．ｐ．ｍ．、１０分間、４℃で遠心分離を行い、上清を除いた後、０．２％ ＢＳＡ含有ＨＢＳＳ ４．４ｍＬに懸濁した。
ピペッティングし、細胞が凝集していないことをｐｏｌｙ－ＨＥＭＡコートしたプレートで確認し、以下の実験に用いた。
－好中球の準備－
前記各ペプチド１０μＭ、１０％ ＦＢＳを含む０．２％ ＢＳＡ含有ＨＢＳＳ ４．４ｍＬ（細胞数 ４４０×１０４個）を５０ｍＬチューブに入れ、３７℃で６０分間、ＣＯ２インキュベーターでインキュベーションした。
次いで、１，５００ｒ．ｐ．ｍ．、１０分間、４℃で遠心分離を行い、上清を除いた後、０．２％ ＢＳＡ含有ＨＢＳＳ ４．４ｍＬに懸濁した。
ピペッティングし、細胞が凝集していないことをｐｏｌｙ－ＨＥＭＡコートしたプレートで確認し、以下の実験に用いた。
－遊走実験－
以下のようにして調製したｐｏｌｙ－ＨＥＭＡコートした２４ウェルプレートを用い、インサートにはＣｅｌｌ Ｃｕｌｌｔｕｒｅ Ｉｎｃｅｒｔ（２４ウェル ３．０μｍポアサイズ、ＦＡＬＣＯＮ社製）を用いて、以下のようにして試験した。
［ｐｏｌｙ－ＨＥＭＡコートした２４ウェルプレート］
５ｍｇ／ｍＬの濃度のｐｏｌｙ－ＨＥＭＡを含有する９５％エタノール溶液を１ウェルあたり４００μＬ加え、ファンのないインキュベーターに２～３日間蓋をした状態で放置し、ｐｏｌｙ－ＨＥＭＡコートした２４ウェルプレートを調製した。
以下のようにして調製したｐｏｌｙ－ＨＥＭＡコートした２４ウェルプレートを用い、インサートにはＣｅｌｌ Ｃｕｌｌｔｕｒｅ Ｉｎｃｅｒｔ（２４ウェル ３．０μｍポアサイズ、ＦＡＬＣＯＮ社製）を用いて、以下のようにして試験した。
［ｐｏｌｙ－ＨＥＭＡコートした２４ウェルプレート］
５ｍｇ／ｍＬの濃度のｐｏｌｙ－ＨＥＭＡを含有する９５％エタノール溶液を１ウェルあたり４００μＬ加え、ファンのないインキュベーターに２～３日間蓋をした状態で放置し、ｐｏｌｙ－ＨＥＭＡコートした２４ウェルプレートを調製した。
１０×１０４個の細胞を含む懸濁液２００μＬをインサートに加えた。ウェルに、０．２％ ＢＳＡ含有ＨＢＳＳを５００μＬ（５ｎｇ／ｍＬのＩＬ－８有り又は無し）加え、３７℃で１時間、ＣＯ２インキュベーターでインキュベーションした。
インサートを取り除き、顕微鏡で確認した後、各ウェルの液を１．５ｍＬチューブに移し、１，５００ｒ．ｐ．ｍ．、５分間、室温（２０℃）で遠心分離を行った。
各チューブの細胞を０．２％ ＢＳＡ含有ＨＢＳＳ １００μＬに懸濁し、９６ウェルプレートに入れた。なお、スタンダードとして、各細胞１０，０００個、２０，０００個、５０，０００個（それぞれｎ＝３）、コントロールとして培地のみ（細胞無し）のウェルも用意した。
Ｐｒｅｍｉｘ ＷＳＴ－１ Ｃｅｌｌ Ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ Ａｓｓａｙ ＳｙｓｔｅｍのＰｒｅｍｉｘ ＷＳＴ－１（タカラバイオ社製）を各ウェルに１０μＬ加えて、ＣＯ２インキュベーターで、２時間インキュベーションした後、波長４５０ｎｍの吸光度を測定し、細胞数を算出した。
インサートを取り除き、顕微鏡で確認した後、各ウェルの液を１．５ｍＬチューブに移し、１，５００ｒ．ｐ．ｍ．、５分間、室温（２０℃）で遠心分離を行った。
各チューブの細胞を０．２％ ＢＳＡ含有ＨＢＳＳ １００μＬに懸濁し、９６ウェルプレートに入れた。なお、スタンダードとして、各細胞１０，０００個、２０，０００個、５０，０００個（それぞれｎ＝３）、コントロールとして培地のみ（細胞無し）のウェルも用意した。
Ｐｒｅｍｉｘ ＷＳＴ－１ Ｃｅｌｌ Ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ Ａｓｓａｙ ＳｙｓｔｅｍのＰｒｅｍｉｘ ＷＳＴ－１（タカラバイオ社製）を各ウェルに１０μＬ加えて、ＣＯ２インキュベーターで、２時間インキュベーションした後、波長４５０ｎｍの吸光度を測定し、細胞数を算出した。
結果を図３に示す。図３中、白のグラフ（左側）はＩＬ－８無しの場合、灰色のグラフ（右側）はＩＬ－８有りの場合の結果を示す。図３の結果から、本発明のペプチドの一例である「ｒ８－１２」が、細胞遊走抑制効果を有することが確認された。
試験例３で示されたように、本発明のペプチドは、好中球の遊走を抑制することができることから、好中球の遊走が関連する疾患、例えば、ＩＬ－８による好中球の遊走が重要な役割を演じているという報告がある重症喘息などの治療薬の有効成分として好適に用いることができると考えられる。
（試験例４：がん細胞転移抑制試験－１）
各種ペプチドのがん細胞転移抑制能を以下のようにして試験した。
各種ペプチドのがん細胞転移抑制能を以下のようにして試験した。
＜ペプチド＞
以下の２種のペプチドを化学合成により調製した。
・ ｒｒｒｒｒｒｒｒＤＩＭＬＱ
ＤＩＭＬＱ（配列番号：１）のＮ末端側に、細胞膜透過性分子としてＤ体のアルギニン８残基を有するペプチド（以下、「ｒ８－１２」と称することがある）である。
・ ｒｒｒｒｒｒｒｒＱＹＥＬＬ
ＱＹＥＬＬ（配列番号：３）のＮ末端側に、細胞膜透過性分子としてＤ体のアルギニン８残基を有するペプチド（以下、「ｒ８－ｓ」と称することがある）である。
以下の２種のペプチドを化学合成により調製した。
・ ｒｒｒｒｒｒｒｒＤＩＭＬＱ
ＤＩＭＬＱ（配列番号：１）のＮ末端側に、細胞膜透過性分子としてＤ体のアルギニン８残基を有するペプチド（以下、「ｒ８－１２」と称することがある）である。
・ ｒｒｒｒｒｒｒｒＱＹＥＬＬ
ＱＹＥＬＬ（配列番号：３）のＮ末端側に、細胞膜透過性分子としてＤ体のアルギニン８残基を有するペプチド（以下、「ｒ８－ｓ」と称することがある）である。
＜細胞＞
細胞として、マウス黒色腫Ｂ１６／ＢＬ６細胞株（供給源：ＲＩＫＥＮ Ｃｅｌｌ Ｂａｎｋ）を用いた。
細胞として、マウス黒色腫Ｂ１６／ＢＬ６細胞株（供給源：ＲＩＫＥＮ Ｃｅｌｌ Ｂａｎｋ）を用いた。
＜マウス＞
マウスとして、メスの７週齢マウス（Ｃ５７ＢＬ／６ＮＣｒ）（供給源：日本エスエルシー株式会社）を用いた。
マウスとして、メスの７週齢マウス（Ｃ５７ＢＬ／６ＮＣｒ）（供給源：日本エスエルシー株式会社）を用いた。
＜マウスがん細胞の移植＞
前記Ｂ１６／ＢＬ６細胞株の細胞数が１×１０６個／ｍＬとなるように、１０％ＦＢＳ含有ＲＰＭＩ１６４０培地で調製し、前記マウスの尾静脈より１００μＬ注入し、前記細胞を移植した（細胞数は、１頭当たり１×１０５個）。
前記Ｂ１６／ＢＬ６細胞株の細胞数が１×１０６個／ｍＬとなるように、１０％ＦＢＳ含有ＲＰＭＩ１６４０培地で調製し、前記マウスの尾静脈より１００μＬ注入し、前記細胞を移植した（細胞数は、１頭当たり１×１０５個）。
＜ペプチド等の投与＞
以下のようにして、ペプチド又はアドリアマイシン（比較）をマウスに投与した。また、無処理のものをコントロール（ｎ＝５）とした。
－ペプチド－
マウスへのがん細胞の移植１時間前に、ＰＢＳにて調製した各ペプチド含有溶液０．１ｍＬを前記マウスに尾静脈より投与した（ペプチドの量は、１頭あたりｒ８－１２は３１．２μｇ、ｒ８－ｓは３２．０μｇ）。
また、マウスへがん細胞を移植した２４時間後に、ＰＢＳにて調製した各ペプチド含有溶液０．１ｍＬを前記マウスに尾静脈より投与した（ペプチドの量は、１頭あたりｒ８－１２は３１．２μｇ、ｒ８－ｓは３２．０μｇ）。なお、ｒ８－１２投与群はｎ＝５、ｒ８－ｓ投与群はｎ＝４とした。
－アドリアマイシン－
マウスへがん細胞を移植した１時間後に、２．０ｍｇ／ｍＬに調製したアドリアマイシン（以下、「ＡＤＭ」と称することがある）０．１ｍＬを前記マウスに尾静脈より投与した（ＡＤＭの量は、１頭あたり０．２ｍｇ。ｎ＝３）。
以下のようにして、ペプチド又はアドリアマイシン（比較）をマウスに投与した。また、無処理のものをコントロール（ｎ＝５）とした。
－ペプチド－
マウスへのがん細胞の移植１時間前に、ＰＢＳにて調製した各ペプチド含有溶液０．１ｍＬを前記マウスに尾静脈より投与した（ペプチドの量は、１頭あたりｒ８－１２は３１．２μｇ、ｒ８－ｓは３２．０μｇ）。
また、マウスへがん細胞を移植した２４時間後に、ＰＢＳにて調製した各ペプチド含有溶液０．１ｍＬを前記マウスに尾静脈より投与した（ペプチドの量は、１頭あたりｒ８－１２は３１．２μｇ、ｒ８－ｓは３２．０μｇ）。なお、ｒ８－１２投与群はｎ＝５、ｒ８－ｓ投与群はｎ＝４とした。
－アドリアマイシン－
マウスへがん細胞を移植した１時間後に、２．０ｍｇ／ｍＬに調製したアドリアマイシン（以下、「ＡＤＭ」と称することがある）０．１ｍＬを前記マウスに尾静脈より投与した（ＡＤＭの量は、１頭あたり０．２ｍｇ。ｎ＝３）。
＜評価＞
マウスへのがん細胞の移植から１６日目に摘出した肺のＢ１６／ＢＬ６メラノーマ細胞の転移巣についてカウントし、評価した。結果を表１及び図４に示す。
マウスへのがん細胞の移植から１６日目に摘出した肺のＢ１６／ＢＬ６メラノーマ細胞の転移巣についてカウントし、評価した。結果を表１及び図４に示す。
表１及び図４の結果から、本発明のペプチドの一例である「ｒ８－１２」が、がん細胞転移抑制効果を有することが確認された。なお、図４中、「＊」はｔ検定においてｐ＜０．０５で有意差があることを表す。
（試験例５：がん細胞転移抑制試験－２）
各種ペプチドのがん細胞転移抑制能を以下のようにして試験した。
各種ペプチドのがん細胞転移抑制能を以下のようにして試験した。
＜ペプチド＞
以下の２種のペプチドを化学合成により調製した。
・ ｒｒｒｒｒｒｒｒＤＩＭＬＱ
ＤＩＭＬＱ（配列番号：１）のＮ末端側に、細胞膜透過性分子としてＤ体のアルギニン８残基を有するペプチド（以下、「ｒ８－１２」と称することがある）である。
・ ｒｒｒｒｒｒｒｒＩＭＬＱ
ＩＭＬＱ（配列番号：２）のＮ末端側に、細胞膜透過性分子としてＤ体のアルギニン８残基を有するペプチド（以下、「ｒ８－１２－１」と称することがある）である。
・ ｒｒｒｒｒｒｒｒＭＬＱ
ＭＬＱ（配列番号：５）のＮ末端側に、細胞膜透過性分子としてＤ体のアルギニン８残基を有するペプチド（以下、「ｒ８－１２－２」と称することがある）。
以下の２種のペプチドを化学合成により調製した。
・ ｒｒｒｒｒｒｒｒＤＩＭＬＱ
ＤＩＭＬＱ（配列番号：１）のＮ末端側に、細胞膜透過性分子としてＤ体のアルギニン８残基を有するペプチド（以下、「ｒ８－１２」と称することがある）である。
・ ｒｒｒｒｒｒｒｒＩＭＬＱ
ＩＭＬＱ（配列番号：２）のＮ末端側に、細胞膜透過性分子としてＤ体のアルギニン８残基を有するペプチド（以下、「ｒ８－１２－１」と称することがある）である。
・ ｒｒｒｒｒｒｒｒＭＬＱ
ＭＬＱ（配列番号：５）のＮ末端側に、細胞膜透過性分子としてＤ体のアルギニン８残基を有するペプチド（以下、「ｒ８－１２－２」と称することがある）。
＜細胞＞
細胞として、マウス黒色腫Ｂ１６／ＢＬ６細胞株（供給源：ＲＩＫＥＮ Ｃｅｌｌ Ｂａｎｋ）を用いた。
細胞として、マウス黒色腫Ｂ１６／ＢＬ６細胞株（供給源：ＲＩＫＥＮ Ｃｅｌｌ Ｂａｎｋ）を用いた。
＜マウス＞
マウスとして、メスの７週齢マウス（Ｃ５７ＢＬ／６ＮＣｒ）（供給源：日本エスエルシー株式会社）を用いた。
マウスとして、メスの７週齢マウス（Ｃ５７ＢＬ／６ＮＣｒ）（供給源：日本エスエルシー株式会社）を用いた。
＜マウスがん細胞の移植＞
前記Ｂ１６／ＢＬ６細胞株の細胞数が１×１０６個／ｍＬとなるように、１０％ＦＢＳ含有ＲＰＭＩ１６４０培地で調製し、前記マウスの尾静脈より１００μＬ注入し、前記細胞を移植した（細胞数は、１頭当たり１×１０５個）。
前記Ｂ１６／ＢＬ６細胞株の細胞数が１×１０６個／ｍＬとなるように、１０％ＦＢＳ含有ＲＰＭＩ１６４０培地で調製し、前記マウスの尾静脈より１００μＬ注入し、前記細胞を移植した（細胞数は、１頭当たり１×１０５個）。
＜ペプチド等の投与＞
以下のようにして、ペプチド又はアドリアマイシン（比較）をマウスに投与した。また、無処理のものをコントロール（ｎ＝５）とした。
－ペプチド－
マウスへのがん細胞の移植１時間前に、滅菌水にて調製した各ペプチド含有溶液０．１ｍＬを前記マウスに尾静脈より投与した（ペプチドの量は、１頭あたりｒ８－１２は３７．４μｇ、ｒ８－１２－１は３４．７μｇ、ｒ８－１２－２は３２．１μｇ）。
また、マウスへがん細胞を移植した２４時間後に、滅菌水にて調製した各ペプチド含有溶液０．１ｍＬを前記マウスに尾静脈より投与した（ペプチドの量は、１頭あたりｒ８－１２は３７．４μｇ、ｒ８－１２－１は３４．７μｇ、ｒ８－１２－２は３２．１μｇ）。なお、各ペプチド投与群はｎ＝５とした。
－アドリアマイシン－
マウスへがん細胞を移植した１時間後に、２．０ｍｇ／ｍＬに調製したアドリアマイシン（以下、「ＡＤＭ」と称することがある）０．１ｍＬを前記マウスに尾静脈より投与した（ＡＤＭの量は、１頭あたり０．２ｍｇ。ｎ＝５）。
以下のようにして、ペプチド又はアドリアマイシン（比較）をマウスに投与した。また、無処理のものをコントロール（ｎ＝５）とした。
－ペプチド－
マウスへのがん細胞の移植１時間前に、滅菌水にて調製した各ペプチド含有溶液０．１ｍＬを前記マウスに尾静脈より投与した（ペプチドの量は、１頭あたりｒ８－１２は３７．４μｇ、ｒ８－１２－１は３４．７μｇ、ｒ８－１２－２は３２．１μｇ）。
また、マウスへがん細胞を移植した２４時間後に、滅菌水にて調製した各ペプチド含有溶液０．１ｍＬを前記マウスに尾静脈より投与した（ペプチドの量は、１頭あたりｒ８－１２は３７．４μｇ、ｒ８－１２－１は３４．７μｇ、ｒ８－１２－２は３２．１μｇ）。なお、各ペプチド投与群はｎ＝５とした。
－アドリアマイシン－
マウスへがん細胞を移植した１時間後に、２．０ｍｇ／ｍＬに調製したアドリアマイシン（以下、「ＡＤＭ」と称することがある）０．１ｍＬを前記マウスに尾静脈より投与した（ＡＤＭの量は、１頭あたり０．２ｍｇ。ｎ＝５）。
＜評価＞
マウスへのがん細胞の移植から１５日目に摘出した肺のＢ１６／ＢＬ６メラノーマ細胞の転移巣についてカウントし、評価した。結果を表２及び図５に示す。
マウスへのがん細胞の移植から１５日目に摘出した肺のＢ１６／ＢＬ６メラノーマ細胞の転移巣についてカウントし、評価した。結果を表２及び図５に示す。
表２及び図５の結果から、本発明のペプチドの一例である「ｒ８－１２」及び「ｒ８－１２－１」が、がん細胞転移抑制効果を有することが確認された。なお、図５中、「＊」はｔ検定においてｐ＜０．０５で有意差があることを表す。
なお、メラノーマ細胞が肺転移する場合、好中球がないと転移できないとの報告がある。この報告では、まず好中球が毛細血管内皮細胞間に入り込み、そこをアンカーにしてメラノーマ細胞が入ってくるとされている。また、好中球遊走のために、メラノーマ細胞がＩＬ－８を放出していることも判明している。マウスではＩＬ－８が存在しないことが知られているので、マウスメラノーマ細胞がＩＬ－８以外の走化因子を放出し、その因子がＩＬ－８受容体であるＣＸＣＲ１またはＣＸＣＲ２に結合して同様のメカニズムで肺転移を起こしている可能性が考えられる。
本発明の態様としては、例えば、以下のものなどが挙げられる。
＜１＞ 下記一般式（１）で表されることを特徴とするペプチドである。
ＸＮ－ＸＡ－ＸＣ ・・・ 一般式（１）
前記一般式（１）中、ＸＡは、下記配列番号：１から２のいずれかで表されるアミノ酸配列を表し、ＸＮは、細胞膜透過性分子及び下記配列番号：１から２のいずれかで表されるアミノ酸配列におけるＮ末端のアミノ酸のいずれかを表し、ＸＣは、細胞膜透過性分子及び下記配列番号：１から２のいずれかで表されるアミノ酸配列におけるＣ末端のアミノ酸のいずれかを表す。
ＤＩＭＬＱ（配列番号：１）
ＩＭＬＱ（配列番号：２）
＜２＞ 前記ＸＮが細胞膜透過性分子であり、前記ＸＣが前記配列番号：１から２のいずれかで表されるアミノ酸配列におけるＣ末端のアミノ酸である前記＜１＞に記載のペプチドである。
＜３＞ 前記細胞膜透過性分子が、アルギニンが連続したアミノ酸配列を含むペプチドである前記＜１＞から＜２＞のいずれかに記載のペプチドである。
＜４＞ 前記＜１＞から＜３＞のいずれかに記載のペプチドを含有することを特徴とする細胞遊走抑制剤である。
＜５＞ 前記＜１＞から＜３＞のいずれかに記載のペプチドを含有することを特徴とする細胞浸潤抑制剤である。
＜６＞ 前記＜１＞から＜３＞のいずれかに記載のペプチドを含有することを特徴とするがん細胞転移抑制剤である。
＜７＞ 前記＜４＞に記載の細胞遊走抑制剤、前記＜５＞に記載の細胞浸潤抑制剤、及び前記＜６＞に記載のがん細胞転移抑制剤の少なくともいずれかを含有することを特徴とする医薬である。
＜８＞ 細胞に、前記＜４＞に記載の細胞遊走抑制剤を作用させることを特徴とする細胞の遊走抑制方法である。
＜９＞ 細胞に、前記＜５＞に記載の細胞浸潤抑制剤を作用させることを特徴とする細胞の浸潤抑制方法である。
＜１０＞ がん細胞に、前記＜６＞に記載のがん細胞転移抑制剤を作用させることを特徴とするがん細胞の転移抑制方法である。
＜１１＞ 個体に、前記＜７＞に記載の医薬を投与することを特徴とする疾患の予防乃至治療方法である。
＜１＞ 下記一般式（１）で表されることを特徴とするペプチドである。
ＸＮ－ＸＡ－ＸＣ ・・・ 一般式（１）
前記一般式（１）中、ＸＡは、下記配列番号：１から２のいずれかで表されるアミノ酸配列を表し、ＸＮは、細胞膜透過性分子及び下記配列番号：１から２のいずれかで表されるアミノ酸配列におけるＮ末端のアミノ酸のいずれかを表し、ＸＣは、細胞膜透過性分子及び下記配列番号：１から２のいずれかで表されるアミノ酸配列におけるＣ末端のアミノ酸のいずれかを表す。
ＤＩＭＬＱ（配列番号：１）
ＩＭＬＱ（配列番号：２）
＜２＞ 前記ＸＮが細胞膜透過性分子であり、前記ＸＣが前記配列番号：１から２のいずれかで表されるアミノ酸配列におけるＣ末端のアミノ酸である前記＜１＞に記載のペプチドである。
＜３＞ 前記細胞膜透過性分子が、アルギニンが連続したアミノ酸配列を含むペプチドである前記＜１＞から＜２＞のいずれかに記載のペプチドである。
＜４＞ 前記＜１＞から＜３＞のいずれかに記載のペプチドを含有することを特徴とする細胞遊走抑制剤である。
＜５＞ 前記＜１＞から＜３＞のいずれかに記載のペプチドを含有することを特徴とする細胞浸潤抑制剤である。
＜６＞ 前記＜１＞から＜３＞のいずれかに記載のペプチドを含有することを特徴とするがん細胞転移抑制剤である。
＜７＞ 前記＜４＞に記載の細胞遊走抑制剤、前記＜５＞に記載の細胞浸潤抑制剤、及び前記＜６＞に記載のがん細胞転移抑制剤の少なくともいずれかを含有することを特徴とする医薬である。
＜８＞ 細胞に、前記＜４＞に記載の細胞遊走抑制剤を作用させることを特徴とする細胞の遊走抑制方法である。
＜９＞ 細胞に、前記＜５＞に記載の細胞浸潤抑制剤を作用させることを特徴とする細胞の浸潤抑制方法である。
＜１０＞ がん細胞に、前記＜６＞に記載のがん細胞転移抑制剤を作用させることを特徴とするがん細胞の転移抑制方法である。
＜１１＞ 個体に、前記＜７＞に記載の医薬を投与することを特徴とする疾患の予防乃至治療方法である。
Claims (5)
- 下記一般式（１）で表されることを特徴とするペプチド：
ＸＮ－ＸＡ ・・・ 一般式（１）
前記一般式（１）中、ＸＡは、下記配列番号：１から２のいずれかで表されるアミノ酸配列を表し、ＸＮは、アルギニン８残基からなる細胞膜透過性分子を表す：
ＤＩＭＬＱ（配列番号：１）
ＩＭＬＱ（配列番号：２）。 - 請求項１に記載のペプチドを含有することを特徴とする細胞遊走抑制剤。
- 請求項１に記載のペプチドを含有することを特徴とする細胞浸潤抑制剤。
- 請求項１に記載のペプチドを含有することを特徴とするがん細胞転移抑制剤。
- 請求項２に記載の細胞遊走抑制剤、請求項３に記載の細胞浸潤抑制剤、及び請求項４に記載のがん細胞転移抑制剤の少なくともいずれかを含有することを特徴とする医薬。
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