JPH10504306A

JPH10504306A - ラミニンγ１鎖の単一ＥＧＦ様モチーフへのニドゲン結合に寄与する２つの非隣接領域

Info

Publication number: JPH10504306A
Application number: JP8507386A
Authority: JP
Inventors: フォックス，ジェイ，ダブリュー．; ティンプル，ルパート
Original assignee: ザユニバーシティオブバージニアパテントファンデーション
Priority date: 1994-08-15
Filing date: 1995-08-11
Publication date: 1998-04-28
Also published as: AU712327B2; EP0771210A4; IL114947A0; AU3235895A; US5493008A; CA2196053A1; WO1996004926A1; EP0771210A1

Abstract

(57)【要約】ラミニンに対するニドゲンの高親和性結合が、マウス・ラミニンγ１鎖のＥＧＦ様リピートγ１ＩＩＩ４によって仲介され、またこの結合は、合成ペプチド及びリコンビナント突然変異体を利用して、その５６残基配列の２つの短い非隣接領域に制限される。リピートのジスルフィド・ループａ、ｂと修飾されたループａ、ｃとは、それぞれ、５０００分の１倍及び３００分の１倍に低下した親和性を示し、完全に結合を阻害しうる。合成ループｃ、ｄは阻害活性を欠く。しかしながら、突然変異と側鎖修飾によって、ループｃにおけるＴｒｙ８１９の結合寄与が示された。このことをループ・キメラの研究と考え合わせると、上記２つの結合部位の間には顕著な協働性があると考えられる。ループの主要な結合部位は、ヘプタペプチドＮＩＤＰＮＡＶ（位置：７９８−８０４）に局在してしていた。Ａｓｐ８００からＡｓｎへの変化及びＡｌａ８０３からＶａｌへの変化の結果、結合活性に強い減少が見られたか、一方、Ｐｒｏ８０１からＧｌｎへの変化及びＩｌｅ７９９からＶａｌへの変化では効果はわずかであった。後者の置換は、Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａラミニンγ１鎖の同一領域に見いだされる、単一の置換に対応する。しかし、Ａｓｎ８０２からＳｅｒへの変化あるいはＶａｌ８０４からＳｅｒへの変化（これらはラミニンγ２鎖に存在する事が知られている）は、有害な突然変異であった。このことから、遠く離れた関係にある種のラミニンにおいて結合構造が保存されており、ラミニン・イソフォームの相同鎖の間には保存されていないことが判明した。

Description

【発明の詳細な説明】ラミニンγ１鎖の単一ＥＧＦ様モチーフへのニドゲン結合に寄与する２つの非隣接領域本発明の一部は、米国立衛生研究所の基金を受けた研究（Ｒ５５ＧＭ４７４５１）に基づいたものである。発明の背景技術分野：本発明はラミニンとニドゲンの相互作用を特異的に阻止するペプチド拮抗剤に関する。背景技術：交差型ラミニンの種々のイソフォームが、基底膜およびその他細胞外構造の主要な細胞接着性および構造性蛋白質として同定されている（エンゲル[Engel],Ｊ．（１９９３），ＭｏｌｅｃｕｌａｒａｎｄＣｅｌｌｕｌａｒＡｓｐｅｃｔｓｏｆＢａｓｅｍｅｎｔＭｅｍｂｒａｎｅｓ，ロールバッハ[Rohrbach] ，Ｄ．Ｈ．およびティンプル[Timpl]，Ｒ．編、ＡｃａｄｅｍｉｃＰｒｅｓｓ，サンディエゴ，カリフォルニア，１４７−１７６頁；ティンプル[Timpl]，Ｒ．およびブラウン[Brown]，Ｊ．Ｃ．（１９９４），ＭａｔｒｉｘＢｉｏｌ．）。これらは大きなマルチドメイン蛋白質（６００−９００ｋＤａ）であり、ジスルフィドで結合されたα、βおよびγ鎖で構成されている（最近の命名例については、バージソン[Burgeson]，Ｒ．Ｅ．ら（１９９４）、ＭａｔｒｉｘＢｉｏｌ．，１４，２０９−２１１；ティンプル[Timpl]，Ｒ．およびブラウン[Brow n]，Ｊ．Ｃ．（１９９４）、ＭａｔｒｉｘＢｉｏｌ．を参照されたい）。鎖組成α１β１γ１を有するラミニン１についても多くの異種相互作用部位（例えば１５０ｋＤａ基底膜蛋白質ニドゲンに対する単一の高親和性結合部位（κ_D＝０．５ｎＭ））が示されている（フォックス[Fox]，Ｊ．Ｗ．ら（１９９１），ＥＭＢＯＪ．，１０，３１３７−３１４６）。ニドゲンはＩＶ型コラーゲン、プロテオグリカン・パーレカン(perlecan)およびその他の細胞外リガンドにも結合し、これによってラミニン１とその他の成分の間の三元複合体の形成を仲介する（メイヤー[Mayer]，Ｕ．およびティンプル[Timpl]，Ｒ．（１９９４）ＥｘｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒＭａｔｒｉｘＡｓｓｅｍｂｌｙａｎｄＳｔｒｕｃｔｕｒｅ，ユルチェンコ[Yurchenco]，Ｐ．Ｄ．，バーク[Birk ]，Ｄ．およびメチャム[Mecham]，Ｒ．Ｐ．編、ＡｃａｄｅｍｉｃＰｒｅｓｓ，オーランド，フロリダ，３８９−４１６頁；ブラウン[Brown]，Ｊ．Ｃ．ら，（１９９４），Ｊ．ＣｅｌｌＳｃｉ．，１０７，３２９−３３８）。したがって、ニドゲンのラミニンへの結合は、基底膜の表層分子構成における決定的に重要なステップであると考えられる。この解釈は、ラミニン１のニドゲン結合部位を遮断する抗体に関する研究（メイヤー[Mayer]，Ｕ．ら（１９９３）、ＥＭＢＯＪ．，１２，１８７９−１８８５）および胎性器官培養における腎細管形成ならびに肺分枝形成を阻止する抗体の研究（エクブロム[Ekblom]，Ｐ．ら，（１９９４）Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ，１２０，２００３−２０１４）により最近裏付けられた。高親和性ニドゲン結合部位は、マウス・ラミニンγ１鎖の短アームドメインＩＩＩに存在する上皮細胞成長因子（ＥＧＦ）の単一モチーフに局在することが突きとめられている（ゲール[Gerl]，Ｍ．ら（１９９１），Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，２９２，１６７−１７４；メイヤー[Mayer]，Ｕ．ら（１９９３）ＥＭＢＯＪ．，１２，１８７９−１８８５）。このラミニンのＥＧＦ様リピート γ１ＩＩＩ４は、ＥＧＦとの相同関係（クーク[Cooke]，Ｒ．Ｍ．ら（１９８７）Ｎａｔｕｒｅ，３２７，３３９−３４１；モンテリオン[Montelione]，Ｇ．Ｔ．ら（１９８７）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８４，５２２６−５２３０）、並びにその他の代表的な配列の特徴（ササキ[SasaKi]，Ｍ．およびヤマダ[Yamada]，Ｙ．（１９８７），Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２６２，１７１１１−１７１１７；エンゲル[Engel]，Ｊ．（１９８９），ＦＥＢＳＬｅｔｔ．，２５１，１−７）に示されているように、５６の残基とジスルフィド結合の４つのループ（ａ−ｄ）で構成されている。ニドゲン結合に対するこれと同じ親和性はまた、鎖組成α２β１γ１および α２β２γ１のヒト・ラミニン２および４にも認められており（ブラウン[Brown ]，Ｊ．Ｃ．ら（１９９４），Ｊ．ＣｅｌｌＳｃｉ．，１０７，３２９−３３８）、マウスとヒトγ１ＩＩＩ４の配列同一性が９７％ということでも説明されている（ピカライネン[Pikkarainen]，Ｔ．ら（１９８７），Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ.,２６３，６７５１−６７５８）。さらにこのリピートの低い配列同一性（６１％）か、ショウジョウバエ・ラミニンγ１鎖（チャイ[Chi]，Ｈ．Ｃ．およびフイ[Hui]，Ｃ．Ｆ．（１９８９），Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２６４，１５４３−１５５０）、およびヒト・ラミニンγ２鎖イソフォーム（７７％；カルンキ[Kallunki]，Ｐ．ら（１９９２），Ｊ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．，１１９，６７９−６９３）でも示されている。このことから、これらのラミニン類がニドゲンに対しても親和性を有するか否かという疑問が浮上し、また分子解釈論上、マウス・リピートγ１ＩＩＩ４の結合構造の正確なマッピングの必要性が出てきている。多くの細胞外および膜結合蛋白質中にＥＧＦ様のリピートが数多く同定されているが（ローズ[Roes]，Ｄ．Ｊ．Ｇ．ら（１９８８），ＥＭＢＯＪ．，７，２０５３−２０６１；セランダー-スネルハーゲン[Selander-Sunnerhagen]，Ｍ．ら（１９９２），Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２６７，１９６４２−１９６４９参照）、それらの結合特性ならびにそれらに関連する構造に関しては殆ど知られていない。これらリピートが重要であることの生物学的証左は、マルファン症候群を起こすと考えられているフィブリリン（細繊維）変異（ディエッツ[Dietz] ，Ｈ．Ｃ．ら（１９９１）Ｎａｔｕｒｅ，３５２，３３７−３３９；リー[Lee] ，Ｂ．ら（１９９１）Ｎａｔｕｒｅ，３５２，３３０−３３４）およびショウジョウバエ神経性蛋白質ノッチにおける致命的突然変異（ケリー[Kelley]，Ｍ．Ｒ．ら（１９８７）Ｃｅｌｌ，５１，５３９−５４８）の研究で明らかであるが、それらの機能的な基礎はまだ解明されていない。しかしながら、ＥＧＦ様リピーのループａとループ間領域中に存在するカルシウム結合配列の正確な同定は、いくつかの凝固因子から行なわれている（ハンドフォード[Handford]，Ｐ．Ａ．ら（１９９１），Ｎａｔｕｒｅ，３５１，１６４−１６７；セランダー−スネルハーゲン[Selander-Sunnerhagen]，Ｍら（１９９２），Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２６７，１９６４２−１９６４９）。ＥＧＦのレセプター結合部位のマップを作るために部位指向変異誘発手法も使用されており、ループｃを超えたＣ末端、およびループｂとｃの間のヒンジ領域に決定的な残基かあることが示されている（モイ[Moy]，Ｆ．Ｊ．ら（１９８９），Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ，ＵＳＡ．，８６，９８３６−９８４０；カンピオン[Campion]，Ｓ．Ｒ．ら（１９９２）Ｊ．ＣｅｌｌＢｉｏｃｈｅｍ．，５０，３５−４２；カンピオン，Ｓ．Ｒ．ら（１９９３）ＰｒｏｔｅｉｎＥｎｇｎｇ．，６，６５１−６５９）。ラミニンに対するニドゲン結合の潜在的な重要性を考えた場合、ラミニンとニドゲンの相互作用を阻止するペプチド拮抗剤を提供することか望まれるところである。発明の開示したがって、本発明の目的の１つはラミニンへのニドゲンの結合を阻止する新規なペプチド拮抗剤を提供することにある。本発明の第２の目的は、結合に必須な個々の残基がジスルフィド・ループ内の非隣接領域内に限定される新規なペプチド拮抗剤を提供することにある。本発明者らはこれらの目的を、式（Ｉ）のペプチジル化合物（配列番号１）により達成した：ここで、Ｒ¹は水素またはＮ末端保護基であり；Ｒ²は水素、ＮＨ₂または配列（ＩＩ）（配列番号２）のＮ末端Ｌｅｕで始まる１−１４のアミノ酸残基を含むペプチジル基であり；Ｗは原子価結合またはアミノ酸残基であり；Ｘは原子価結合またはアミノ酸残基であり；Ｙはアミノ酸残基であり；ＺはＧｌｙまたは配列ＩＩＩ（配列番号３）の１から１１アミノ酸残基を含むペプチジル基である。ただし、Ｒ³は水素または、ＮＨ₂あるいはＮＨＭｅのようなアミンであり；本発明のその他さまざまな目的、特徴および付随する利点は、添付の図面を参照しながら以下の詳細な説明を理解することにより、さらに明らかになるであろう。図面の簡単な説明図１は、ラミニンγ１鎖のドメインＩＩＩ中のＥＧＦ様リピート３および４の矢）の境界を示し；図２は、合成γ１ＩＩＩペプチドと修飾フラグメントによるニドゲンとラミニン・フラグメントＰ１の間の放射性リガンド結合の阻止を示すグラフである。使用されたインヒビターは、ラミニンフラグメントｐ１（●）、リコンビナントフラグメントγ１ＩＩＩ３−５（○）、ナイトレート化γ１ＩＩＩ３−５（◇）および合成酸化ループａ，ｂ（▲）、非酸化ループａ，ｂ（△）、酸化ループｃ（ ▼）、酸化ループｄ（▽）、酸化ループａ，ｃ（■）、並びに合成ＮＩＤＰＮＡＶ（□）（配列番号５）であり；図３は、ラミニンのＥＧＦ様リピートγ１ＩＩＩ４中のニドゲン結合部位のマップである。個々の残基の相対的な結合寄与度を円（○）の中に示しており、本文中に記述するように残基が変化した場合の親和力の消失を、＜１０倍（白丸のまま）、１０倍から１００倍（半黒）、および＞１００倍（黒）で表示している。（−）はγ１ＩＩＩ４（配列番号６）の部位指向変異誘発の結果から判断して寄与がないことを示す。発明を実施するための最良の形態ラミニンγ１鎮ドメインＩＩＩ（γ１ＩＩＩ４）のニドゲン結合ＥＧＦ様リピート４は５６のアミノ酸残基で構成され、ジスルフィド結合で４つのループ（ａ −ｄ）に折畳まれている（図１）。この配列はγ１鎖内で特異的なものであり（エンゲル[Engel]，Ｊ．（１９９３），ＭｏｌｅｃｕｌａｒａｎｄＣｅｌｌｕｌａｒＡｓｐｅｃｔｓｏｆＢａｓｅｍｅｎｔＭｅｍｂｒａｎｅｓ，ロールバッハ[Rohrbach]，Ｄ．Ｈ．およびティンプル[Timpl]，Ｒ．編，ＡｃａｄｅｍｉｃＰｒｅｓｓ，サンディエゴ，カリフォルニア，１４７−１７６頁）、ニドゲン結合に認められる高度な特異性を説明するものである（ゲール[Gerl]，Ｍ．ら（１９９１），Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ.,２９２，１６７−１７４；メイヤー[Mayer]，Ｕ．ら（１９９３）ＥＭＢＯＪ．，１２，１８７９−１８８５）。これを図１に、キメラ体構築に使用されたリピート３配列との比較で示す。リピートγ１ＩＩＩ４のすべての領域が親和性に一様に重要ではないと考えられるため、本発明者らはペプチド合成またはリコンビナント法により作られたフラグメントまたは変異の種々の結合部位のマップをさらに詳細に作成した。それらの結合活性は、参照用インヒビターとして標準ラミニンフラグメントＰ１または関連するリコンビナントフラグメントを使用した高感度放射リガンド競合アッセイで測定した（図２）。結合構造体は、ラミニンの単一ＥＧＦ様モチーフγ１ＩＩＩ４に局在することが突きとめられている（メイヤー[Mayer]，Ｕ．ら（１９９３）ＥＭＢＯＪ．，１２，１８７９−１８８５）。このモチーフは、リコンビナントおよび化学法の組合わせにより結合部位をより正確に同定するためには小さすぎるものである。 γ１ＩＩＩ４のジスルフィドループａおよびｃは、高親和性結合には不可欠のものである。各セグメント単体では、１／５，０００の親和力（ループａ）または測定できないほど低い親和力（ループｃ）のいずれかしか持たない。キメラ構築体の場合にも同様の差異が認められ、ループａはループＣよりも結合に大きな寄与を示している。さらに、人工ペプチドリンクによるループａとｃの結合は、親和力を２０倍に増加させた。これは、高結合活性の発現のためにはこの両方のループが空間的に密接な関係にあることが必要であることを強調するものである。ループａの低い結合活性が、ヘプタペプチド配列ＮＩＤＰＮＡＶ（配列番号５）のマップ上に示されている（図３）。ヘプタペプチドの合成変種並びに化学修飾は、Ａｓｐのβ-カルボキシル基の結合に対して大きな寄与を示した。中央のＡｓｎおよびＣ末端ＶａｌをＳｅｒに変更した場合もまた、活性を顕著に消失させた。ＡｌａをＶａｌによってより保存的に置換した場合も活性を１６分の１に減少させた。このことは、これら４つの残基がニドゲン結合に対する基本的な接触部位を提供していることを示している。Ｎ末端Ａｓｎ−Ｉｌｅおよび中央Ｐｒｏを含む他の３つの残基は、フラグメント化または置換で示されているように、あまり重要でないようであり、結合に対するＰｒｏの低い寄与は、Ｐｒｏがループ構造中のβ折り返しに不可欠のものであるという多くの証拠を考えると意外なことである。それでもなお、合成ループａの結合活性がジスルフィド結合によるものではなく、このループはより融通性に富んだコンホメーションを有していることを示唆している。ループｃもまた高親和性結合に重要であるということのさらなる証拠は、合成品を分析した場合には活性が認められなかったものの、化学修飾およびリコンビナント研究から導き出すことができた。これらの研究においては、Ｔｙｒ８１９（ただしＴｙｒ８２５は違う）が結合に寄与し、これを修飾した場合は親和力を１／６０程度に減少させた。γ１ＩＩＩ４ループｃを非結合性ＥＧＦ様リピートからの別のループｃ（フラグメントγ１ＩＩＩ４ａｂ３ｃｄ；表ＩＶ参照）に置き換えると、さらに親和力を１／３０に減少させた。これはＴｙｒ８１９以外のループｃ残基の高親和性結合への関与をさらに突きとめなければならないことを示している。われわれのフラグメント化データではまた、ループｂは結合に不可欠ではないことも示している。上記に基づいて、本発明者らは下記の最小配列（Ｉ）（配列番号１）を有するペプチド拮抗剤が、ラミニンのニドゲン結合を阻止することを確認した：ここで、Ｒ¹は水素またはＮ末端保護基であり；Ｒ²は水素、ＮＨ₂または配列（ＩＩ）（配列番号２）のＮ末端Ｌｅｕで始まる１−１４のアミノ酸残基を含むペプチジル基であり；Ｗは原子価結合またはアミノ酸残基であり；Ｘは原子価結合またはアミノ酸残基であり；Ｙはアミノ酸残基であり；ＺはＧｌｙまたは配列ＩＩＩ（配列番号３）の１から１１アミノ酸残基を含むペプチジル基：ただし、Ｒ³は水素または、ＮＨ₂あるいはＮＨＭｅのようなアミンであり；本発明のＲ¹として有用なＮ末端保護基として好適なものにはアセチル、ベンジルおよびベンゾイル基が含まれる。本発明に有用なアミノ酸残基として好適なものとしては、Ａｌａ、Ａｓｎ、Ａｓｐ、Ｇｌｙ、Ｖａｌ、Ｌｅｕ、Ｉｌｅ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ｔｙｒ、Ｃｙｓ、Ｍｅｔ、Ｇｌｕ、Ｇｌｎ、Ａｒｇ、Ｌｙｓ、Ｈｉｓ、Ｐｈｅ、Ｔｙｒ、Ｔｒｐ、Ｐｒｏ、Ｈｙｐ（ヒドロキシプロリン）、Ｈｙｌ（ヒドロキシリジン）、Ｏｒｎ（オルニチン）、シトルリン、ホモセリン、ホモシステイン、などが含まれる。Ｗは原子価結合または上記アミノ酸残基のいずれでもよいが、好ましくはＡｓｎ、Ａｓｐ、ＧｌｎおよびＧｌｕであり、特に好ましくはＡｓｎである。Ｘは上記アミノ酸残基のいずれでもよいが、好ましくはＩｌｅ、Ｌｅｕ、ＡｌａおよびＶａｌであり、特に好ましくはＩｌｅである。Ｙは原子価結合または上記アミノ酸残基のいずれでもよいが、好ましくはＰｒｏ、ＨｙｐおよびＧｌｎであり、特に好ましくはＰｒｏである。本発明の第１実施態様においては、このペプチド拮抗剤はフレキシブルなものであり、Ｒ²は配列（ＩＩ）のＮ末端Ｌｅｕで始まる１−１４のアミノ酸残基を含むペプチジル基であり：ただし、Ｒ³は水素または、ＮＨ₂あるいはＮＨＭｅのようなアミンであり；本発明の第２実施態様においては、このペプチド拮抗剤は限定されたものであ原子価結合を表わす。Ｚは原子価結合、Ｇｌｙまたは配列（ＩＩＩ）のＮ末端Ｇｌｙからの１−９アミノ酸残基を含むペプチジルフラグメントである（配列番号３）。本発明の１実施態様においては、Ｚは原子価結合である。本発明の別の実施態様において、Ｚはグリシンまたは配列（ＩＩＩ）のＮ末端Ｇｌｙから１−９のアミノ酸残基を含むペプチジルフラグメントである（配列番号３）。本発明のペプチド拮抗剤は化学合成またはリコンビナント技術により得ることができる。ポリペプチドは、単一のアミノ酸および／または２つあるいはそれ以上のアミノ酸を望ましいポリペプチドの配列順に事前に形成したペプチドから、化学的に合成することができる。固相または液相法を使用することができる。得られたポリペプチドは、必要ならば薬学的に許容できる塩に変換することができる。固相合成において、望ましいポリペプチドのアミノ酸配列は、不溶性樹脂に結合されたＣ末端アミノ酸から順次構築される。望ましいポリペプチドが作られると、ポリペプチドは樹脂から開裂される。液相合成を採用する場合もやはり、望ましいポリペプチドはＣ末端アミノ酸から構築される。この酸のカルボキシ基は適当な保護基によってその間ずっと遮断されており、合成が終わった時点で外される。固相または液相いずれの技法を採用する場合も、反応系に加えられるアミノ酸は通常、保護されたアミノ基と活性化されたカルボキシ基を有する。機能性の側鎖基もまた保護される。合成の各ステップ終了後に、アミノ保護基は除去される。側鎖機能基は通常、合成が終わった時点で除去される。本発明のペプチド拮抗剤は薬学的に許容できる塩類に変換することができる。有機酸または無機酸により酸加塩にすることもできる。適当な酸としては、酢酸、コハク酸および塩酸などがある。あるいは、ペプチドをアンモニウム塩、ナトリウムやカリウムのようなアルカリ金属塩などのカルボン酸塩にすることもできる。本発明のペプチド拮抗剤をリコンビナントＤＮＡ技術で作るためには、当該ペプチド拮抗剤をコードする遺伝子を化学的に合成する。ＤＮＡを単離し、精製して発現ベクターに挿入する。ポリペプチドを発現させるためには、ポリペプチドをコードするＤＮＡ配列を包含し、かつ適当な宿主に組み入れた時にそのポリペプチドを発現する能力のある発現ベクターを構築する。ＤＮＡ配列のプロモーター、転写終結部位、および翻訳開始および停止コドンなど、適当な転写および翻訳調節要素が組込まれる。このＤＮＡ配列は、ベクターと適合性のある宿主中でペプチド拮抗剤を発現できるような適切なフレームに入れられる。発現ベクターは、典型的には複製のオリジンと、必要であれば抗生物質耐性遺伝子のような選択可能なマーカー遺伝子を包含する。プロモーターはポリペプチドをコードするＤＮＡ配列に操作可能となるように結合される。発現ベクターはプラスミドでもよい。ペプチド拮抗剤を発現する能力のある発現ベクターはどのような方法で調製してもよい。ポリペプチドをコードするＤＮＡフラグメントは、例えばプラスミドベクターのような発現ベクターの適当な制限部位に挿入することができる。ペプチド拮抗剤をコードする発現ベクターは適当な宿主中に組み入れられる。細胞はペプチド拮抗剤をコードする遺伝子で形質転換される。形質転換宿主は、ペプチド拮抗剤が発現するような条件下におかれる。例えば、形質転換細胞を発現が可能なように培養する。適合性のあるものであれば、いかなる宿主−ベクターシステムを使用してもよい。形質転換宿主は、原核または真核宿主いずれでもよい。バクテリアまたは酵母宿主、例えば大腸菌やＳ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅを使用できる。グラム陽性バクテリアを使用してもよい。発現したペプチド拮抗剤は単離し、精製することができる。本発明のペプチド拮抗剤は２つの主要用途、即ち１つは器官発達のｉｎｖｉｔｒｏ研究用の研究試薬として、２つ目は臨床用の治療薬としての用途を有する。研究用試薬としては、本発明のペプチド拮抗剤を器官発達のモデルを得るために使用することができる。例えば、予備的研究において腎臓、肺、唾液その他の腺のモデルが作られた。それらのモデルは、本発明のペプチド拮抗剤の存在下で細胞を培養することにより得られた。本発明のペプチド拮抗剤を腫瘍細胞系統と組み合わせて細胞培養することにより、さらに別のモデルを得ることもできる。本発明のペプチド拮抗剤は、基底膜の肥厚化が遅く、かつ慢性腎疾患や盲目（網膜症）に至ることの多い致命的合併症の糖尿病患者の治療薬としても有用である。その他いくつかの脈管性損傷（脈管炎、硬皮症、全身性ループスを含む）もまた、本発明のペプチド拮抗剤を使用して治療することができる。腫瘍はしばしば腫瘍細胞のまわりに基底膜を形成し、この基底膜が免疫細胞がこれらの細胞を排除する抗体を産生するのを阻止する。本発明のペプチド拮抗剤の静脈注射はこれらの組織を破壊し、免疫細胞や抗体による攻撃を可能にする。本発明のペプチド拮抗剤は、治療薬として有効量を静脈注射など適当な方法により投与することができる。投与するペプチド拮抗剤の用量は、もちろん、患者の体格、治療しようとする疾患の種類、ならびにその程度に応じたものとする。正確な投与量および投与頻度は、臨床の応答性とその他の臨床パラメータに応じて変わることになる。本発明を全般的に説明してきたが、以下に示す特定の実施例を参照すればさらに理解を深めることができよう。ただし、これら実施例は説明の目的で提示したものであって、特に断らない限り本発明を限定するものではない。実施例リコンビナントＥＧＦ様リピートの発現個別またはタンデム配列のリピートγ１ＩＩＩ３−５、γ１ＩＩＩ３−４、γ １ＩＩＩ３およびγ１ＩＩＩ４（以前使用した用語Ｂ２ＩＩＩはγ１ＩＩＩに置き換える；バージソン[Burgeson]，Ｒ．Ｅ．ら（１９９４），ＭａｔｒｉｘＢｉｏｌ．，１４，２０９−２１１参照）を得るために使用したベクターについては、メイヤー[Mayer]，Ｕ．ら（１９９３），ＥＭＢＯＪ．，１２，１８７９− １８８５に記述されている。ヒト胎性腎細胞２９３をトランスフェクトするために、これらのベクターおよび変異ベクター類（下記参照）を使用し、安定な形質転換体をピューロマイシン（ｐｕｒｏｍｙｃｉｎ）またはＧ４１８処理（ニシュト[Nischt]，Ｒ．ら（１９９１），Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，２００，５２９−５３６）により選択した。安定的にトランスフェクトされたクローンは、ノーザンハイブリダイゼーションによるｍＲＮＡ発現と、無血清培養液のＳＤＳ −ＰＡＧＥにより、処理蛋白質を効率的に産生し分泌するクローンを同定することにより特徴付けした（ニシュト[Nischt]，Ｒ．ら（１９９１），Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，２００，５２９−５３６）。ＤＥＡＥセルロースおよびモレキュラーシーブ・クロマトグラフィによるリコンビナントフラグメントの精製は、従来使用されているプロトコルにより行なった（メイヤー[Mayer]，Ｕ．ら（１９９３），ＥＭＢＯＪ．，１２，１８７９−１８８５）。 γ１ＩＩＩ４突然変異用発現ベクターの構築リコンビナント産物の生成および分泌をさせるために、望ましいフラグメントをＮｈｅＩ部位を介してヒトＢＭ−４０のシグナルペプチドに融合させた（メイヤー[Mayer]，Ｕ．ら（１９９３），ＥＭＢＯＪ．，１２，１８７９−１８８５）。変異、追加の制限部位および停止コドンは、試薬供給者の指示に従ってＶｅｎｔポリメラーゼ（Ｂｉｏｌａｂｓ社）によるＰＣＲ増幅を使用して、プライマーにより導入した。プライマーＫ２４、Ｋ２５、Ｋ２７およびＴｉｌはメイヤー[Mayer]，Ｕ．ら（１９９３），ＥＭＢＯＪ．，１２，１８７９−１８８５に記述されており、またこの研究には下記の追加オリゴヌクレオチド類を使用した（突然変異配列には下線を付した）：構築物γ１ＩＩＩ３−５ Δ４は、γ１ＩＩＩ３−５ベクターからのサブフラグメントをプライマーＴｉｌｘΔＲまたはΔＳｘＫ２４を使用して増幅し、ターミナル・プライマーＴｉｌｘＫ２４によりフラグメントの融合および増幅をさせて作り出した。構築物γ１ＩＩＩ３ａｂ４ｃｄは、γ１ＩＩＩ３−４からのフラグメントをプライマーＴｉｌｘ３ａｂ４Ｒおよび３ａｂ４ＳｘＫ２７を使用して増幅し、ＴｉｌｘＫ２７によりフラグメント融合と増幅をさせて作り出した。構築物γ１ＩＩＩ４ａｂ３ｃｄは、γ１ＩＩＩ４からのフラグメントをプライマーＴｉｌｘ４ａｂ３Ｒにより、またγ１ＩＩＩ３からのフラグメントをプライマー４ａｂ３ＳｘＫ２４を使用して増幅し、ＴｉｌｘＫ２５によりフラグメント融合と増幅をさせて作り出した。すべてのフラグメントは、ＸｂａＩおよびＸｈｏＩにより制限し、発現ベクターｐＲＣ／ＣＭＶ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）の対応部位にクローン化した。Ｔｙｒ８１９（ＴＡＴ）およびＴｙｒ８２５（ＴＡＣ）のＡｌａ（ＧＣＴまたはＧＣＣ）への変異は、プライマーＴｉｌｘＲＹｍｕｔ（産生物としてＥ１）、ＴｉｌｘＲＹｗｔ（産生物Ｅ２）、ＳＹｍｕｔｘＫ２７（産生物Ｅ３）およびＳｙｗｔｘＫ２７（産生物Ｅ４）を使用して、フラグメントをＰＣＲ増幅して導入した。フラグメントＥ１およびＥ２を融合させて構築物γ１ＩＩＩ４８１９−Ａとし、Ｅ２およびＥ３を融合させてγ１ＩＩＩ４Ｙ８２５−Ａとし、両方の変異はＥ１およびＥ３を融合させて、構築物γ１ＩＩＩ４Ｙ８１９／８２５−Ａを得た。すべての融合フラグメントはプライマーＴｉｌｘＫ２７を使用して増幅させ、ＸｂａＩおよびＸｈｏＩにより制限してｐＲＣ／ＣＭＶにクローン化した。構築物ｐＲＣ／Ｄ４は、γ１ＩＩＩ４のＨｉｎｄＩＩＩ−ＮｏｒＩ挿入断片をベクターｐＲＣ／ＣＭＶ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）に挿入して作り、このサブドメインの発現の代わりに使用した。構築物γ１ＩＩＩ４Ｄ８００−Ｎは、Ａｓｐ８００（ＧＡＣ）からＡｓｎ（ＡＡＣ）への変異を含むが、これはトランスフォーマー変異誘発システム（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ社）に基づいてｐＲＣ／Ｄ４に導入した。変異はオリゴヌクレオチドＭｕｔ−ＤおよびＭｕｔ−Ｘｂａにより導入し、変異プラスミドの選択は試薬供給者の指示どおり、ＸｂａＩによる消化により行なった。正しいクローンは対応する領域をシークエンスした後で選定した。Ａｓｎ８０２（ＡＡＣ）からＳｅｒ（ＡＧＣ）への変異を含む構築物γ１ＩＩＩ４Ｎ８０２−Ｓは、ｐＲＣ／Ｄ４からＴｙ（Ｂｉｏｌａｂｓ社）ＸＮ−Ｍｕｔ／ＲおよびＭｕｔ−ＮｘＫ２７を使用した増幅により作り出した。フラグメントを融合させ、Ｔ７ｘＫ２７により増幅し、精製し、ＮｈｅＩおよびＸｈｏＩにより制限して、ｐＣｉｓ由来γ１ＩＩＩ４に挿入し、ＮｈｅＩおよびＸｈｏＩにより開裂した。すべての構築物は暫定挿入のＤＮＡ配列により確認を行なった。ペプチドの合成と特徴付けペプチドの合成は、バイオサーチ９６００自動ペプチド合成システムを使用し、ポリスチレン固相支持体上で行なった。９−フルオロニルメチルオキシカルボニルで保護されたアミノ酸を予備活性化してＮ−ヒドロキシベンゾトリアゾール（ＨｏＢｔ）エステルとした。これは等モルの２−（１Ｈ−ベンゾトリアゾール −１−イル）−１．１，３．３−テトラメチルウロニウムテトラフルオロボレートと１．５相当量のジイソプロピルエチルアミンを、Ｎ−メチルアミノピロリジノン：ジメチルスルホキシド（３：１）溶液中に含むものである。カップリングは通常、３倍モル過剰濃度で２時間行なった（グラント[Grant]，Ｇ．Ａ．（１９９２），ＳｙｎｔｈｅｔｉｃＰｅｐｔｉｄｅｓ，ＡＵｓｅｒ’ｓＧｕｉｄｅ，ＦｒｅｅｍａｎａｎｄＣｏ．，ニューヨーク，３６−３８頁）。各カップリングの後にカップリング効率をモニタするために、定性カイザーテスト（Ｋａｉｓｅｒｔｅｓｔ）（スチュワート[Stewart]，Ｊ．Ｍ．およびヤング[Young]，Ｊ．Ｄ．（１９８４），ＳｏｌｉｄＰｈａｓｅＰｅｐｔｉｄｅＳｙｎｔｈｅｓｉｓ，第２版，ＰｉｅｒｃｅＣｈｅｍｉｃａｌＣｏｍｐａｎｙ，ロックフォード，イリノイ，１０５−１１７頁）を実施した。カップリングが不完全な場合、６倍モル過剰量の予め生成したジイソプロピレンボジイミド対称無水物の塩化メチレン溶液を使用して再カップリングさせた（ボダンスキー[Bodanszky]，Ｍ．（１９８４），ＰｒｉｎｃｉｐｌｅｓｏｆＰｅｐｔｉｄｅＳｙｎｔｈｅｓｉｓ，スプリンガー，ベルリン，３６−３９頁）。２０分後に、３倍モル過剰量のＨＯＢとジイソプロピルエチルアミンを添加して活性エステルを形成させた。カップリングをさらに９０分続け、反応が完全かどうかを再び検査した。各カップリング後に、遊離アミノ基をＮ−メチルピロリジノンの１０パーセント無水酢酸溶液を使用してアセチル化した。ペプチドは、９０％トリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）、５％チオアニソール、３％エタンジチオールおよび２％アニソールの混合物で２時間処理して脱保護し、樹脂から開裂した。エーテル（３Ｘ）による抽出の後、ペプチドを２５％酢酸中に溶解させ、セファデックス（Ｓｅｐｈａｄｅｘ）Ｇ−１０でゲルろ過により５０％酢酸中で脱塩した。集めたアリコートを蒸発乾燥させ、次いで凍結乾燥するために水または酢酸中に再希釈した。乾燥した生成物を、Ｃ１８カラム上で０．１％ＴＦＡ水溶液およびアセトニトリル勾配液を使用した逆相ＨＰＬＣで精製した。単一ジスルフィドの酸化を必要とするペプチドは、酢酸水溶液に濃度＜０．１ mg／mlになるように溶解させた。ｐＨは水酸化アンモニウムを使用して８．５に調節した。この溶液にゆるく覆いをかけ、空気で泡立たせ、酸化が完了するまで攪拌した。酸化が完全かどうかはエルマンのアッセイ（Ｅｌｌｍａｎ’ｓａｓｓａｙ）（スチュワート[Stewart]，Ｊ．Ｍ．およびヤング[Young]，Ｊ．Ｄ．（１９８４），ＳｏｌｉｄＰｈａｓｅＰｅｐｔｉｄｅＳｙｎｔｈｅｓｉｓ，第２版，ＰｉｅｒｃｅＣｈｅｍｉｃａｌＣｏｍｐａｎｙ，ロックフォード，イリノイ，１０５−１１７頁）およびＨＰＬＣにより確認した。酸化した材料は濃縮し、ゲルろ過により脱塩して凍結乾燥した。２番目のジスルフィドを必要とするペプチドは、アセトアミドメチル（ＡＣＭ）基により保護した２番目のシステイン対を用いて合成した。最初の酸化は前述のように行なった。１回酸化したペプチドを凍結乾燥した後、３５０Ｌのメタノール：水（１：６）溶液にペプチドを溶解（０．０５ｎモル）してＡＣＭを取り除いた。この溶液を室温に維持し、１ｍＭヨードを含むメタノール溶液５０ｍＬを滴下しながら１時間攪拌した。この溶液を冷却および濃縮して、メタノールを除去した。残った溶液をクロロフォルムで抽出してヨードを除去した。反応の完全性を確認するためにエルマンのアッセイを行なった。マトリックス割当てレーザー式脱着イオン化迅速質量分光分析(matrix-assigned laser-desorpt ion ionization time-of-flight mass spectrometry)を行い、正しい生成物を確認した。純度はいくつかの緩衝系中で逆相高速液クロにより分析した。化学的修飾と蛋白分解修飾ジスルフィド結合の完全な還元を、６Ｍのグアニジン−ＨＣｌ、０．０５Ｍの燐酸緩衝液、ｐＨδ．０と０．０２Ｍのジチオスレイトール中で３７℃で４時間、続けて０．０８ＭＮ−エチルマレイミドで２時間、室温でブロックすることにより行なった。チロシンのナイトレートは、０．０５Ｍトリス−ＨＣｌ、ｐＨ８．０中で、２倍モル過剰のテトラニトロメタンを１時間室温で加えて行なった（リォーダン[Riordan]，Ｊ．Ｆ．およびバリー[Vallee]，Ｂ．Ｌ．（１９７２），ＭｅｔｈｏｄｓＥｎｚｙｍｏｌ．，２５，５１５−５２１）。チロシン水酸基の選択的アセチル化は、１Ｍの酢酸ナトリウム、ｐＨ５．８、に大過剰の無水酢酸を３０分間室温で加えて行なった（オーニシ[Onishi],Ｍ．ら（１９７４），Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，７６，７−１３）。リジンアミノ基の選択的アセチル化は、半飽和酢酸ナトリウム溶液中で、５×２ μＬ無水酢酸を４０mgのプロテインＶδ０mlに加え、氷浴中で１時間インキュベートして行なった（フランケル−コンラット[Fraenkel-Conrat],Ｈ．（１９５７），ＭｅｔｈｏｄｓＥｎｚｙｍｏｌ．４，２４７−２６９）。カルボキシ基（Ａｓｐ、Ｇｌｕ）は、１−エチル−３−ジメチルアミノプロピルカルボジイミドで活性化し、次いでノルロイシンメチルエステルでブロックした（ホア[Hoare]，Ｄ．Ｇ．およびコシュランド[Koshland]，Ｄ．Ｅ．（１９６７），Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２４２，２４４７−２４５３）。０．０２ＭＮＨ₄ＨＣＯ₃中での蛋白質開裂（２４時間、３７℃）には、トリプシン（ウォーシントン社）とサーモリジン（メルク社）を基質：酵素比＝１：２５、並びにエンドプロテイナーゼＡｓｐ−Ｎ（配列グルード、ボシュリンガー社）を１：２００で使用した。次いで蛋白質分解フラグメントおよび修飾蛋白質を逆相ＨＰＬＣで精製し、アミノ酸分析により同定した（メイヤー[Mayer]，Ｕ．ら（１９９１），Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，１９８，１４１−１５０）。結合アッセイ相対的な結合親和性の測定には放射リガンド競合検定（マン[Mann]，Ｋら，１９８８，Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，１７８，７１−８０；フォックス[Fox ]，Ｊ．Ｗ．ら（１９９１），ＥＭＢＯＪ．，１０，３１３７−３１４６）を使用した。一定濃度のリコンビナント・ニドゲン（０．２ｎＭ）を種々の濃度のインヒビターとともに１晩、４℃でインキュベートし、¹²⁵Ｉ−標識ラミニン・フラグメントＰ１（０．０１ｎＭ；１０，０００−２０，０００ｃ．ｐ．ｍ．）を加えて同一時間インキュベートした。次に結合および非結合フラグメントＰ１を、ニドゲンに対する抗体で分離した。５０％阻害を起こす競合濃度（ＩＣ₅₀）を、用量−応答曲線により確定した。すべてのアッセイは、非標識フラグメントＰ１により較正したが、その結果１４件の検定で平均ＩＣ₅₀値（＝ＳＤ）は０．０５％＝０．０２６ｎＭであった。別の検定のＩＣ₅₀値との比較で単一のフラグメントＰ１値を標準化した。側鎖修飾の効果放射リガンド検定による前記の情況的証拠は、リピートγ１ＩＩＩ４のループｃ中の２つのチロシンのうちの１つが結合に寄与することを示している（メイヤー[Mayer]，Ｕ．ら（１９９３），ＥＭＢＯＪ．，１２，１８７９−１８８５）。そのような観察結果を確認し、拡張することは変異の設計にとって貴重なことであると考えられるので、いくつかの側鎖修飾手法を試みた。この側鎖修飾の検討は、リピート３、４、５で構成され、かつ大量に得ることができるリコンビナントフラグメントγ１ＩＩＩ３−５を用いて実施した。２つの異なる手法でチロシンを修飾した場合、結合活性の７５倍の減少を起こした（表Ｉ）。同様の減少はＡｓｐおよびＧｌｕの修飾後にも認められたが、Ｌｙｓのアセチル化後では低い効果（７倍）しか認められなかった。合成ジスルフィドループ構造物および小ペプチド類の結合活性リピートγ１ＩＩＩ４の異なるジスルフィドループに対応する３つの大フラグメントをペプチド合成により作り（図１）、これら生成物の２つのループ（ａ，ｂ）または１つのループ（ｃまたはｄ）を酸化により正しく結合させた。適切なジスルフィド結合の形成および精製ペプチドの保護基の脱離は、質量分光分析により確認した。ループａ，ｂの酸化状態または非酸化状態での競合アッセイでは、両方とも同様にラミニン−ニドゲン結合を完全に阻害したことが示された。しかしながらそれらのＩＣ₅₀値（４００ｎＭ）は、フラグメントＰ１で得られたものより５，０００倍大きかった（表ＩＩ）。酸化ループｃおよび酸化ループｄペプチドについては阻害効果は全く認められなかった（ＩＣ₅₀＞９０−２００μＭ）。ループａ，ｂのアミド化は活性の顕著な低下をもたらし、これはより大きくて活性なフラグメントで認められる同様の結果と符合した（表Ｉ）。ループａ，ｃに対応する修飾ペプチドもまた、ループｂから第１および第３システインと７つの残基を欠失させることにより合成した。次いで、残りの第１および第２対のシステインを酸化し、構造ＱＣＮＤＮＩＤＰＮＡＶＧＣＬＫＣＩＹＮＴＡＧＦＹＣＤ（配列番号３０）を得た。このペプチドはループａ，ｂに比べて２０倍高い阻害効果（ＩＣ₅₀＝２２ｎＭ）を有し、フラグメントＰ１に比べて活性は３００分の１であった（表ＩＩ）。これは、チロシン修飾の実験ですでに示唆されているように、ニドゲンに対する高親和性会合に対して、ループａおよびｃの中にある結合部位が協働していることを示している。ループａおよびｃの協働には共有結合が必要である。なぜならばループａ、ｂの活性は等量のループｃペプチドを添加しても増加しなかったからである（表ＩＩ）。非酸化ループａ、ｂペプチド（２４残基）を蛋白質分解実験に使用し、その結合部位を調べた（表ＩＩ）。トリプシンによるアルギニンでの開裂により、低活性のＣ末端ヘキサペプチドＴ２と、活性低下のない大きなＴ１ペプチドが得られた。Ｔ１のサーモリジン消化により不活性なＣ末端ペプチドＴｈ１が放出され、ループａが結合に関与していることが示された。エンドプロテイナーゼＡｓｐ−ＮによりＡｓｐ残基で開裂すると、不活性Ｎ末端ペンタペプチドＥ３および１９残基ペプチドＥ１が放出されたが、殆ど活性は変化しなかった（ＩＣ₅₀＝５３０ｎＭ）。しかしながら、Ｅ１のＮ末端配列Ａｓｐ−Ａｓｎ−Ｉｌｅが欠失した開裂産生物Ｅ２は、顕著な活性消失（ＩＣ₅₀＝３ μＭ）を示した。これらのデータを考え合わせると、ＮＩＤＰＮＡＶＧＮ（配列番号２７）は最小の結合配列であると考えられ、これは合成ペプチドがループａ、ｂと比較した場合に極く僅かな活性の消失（ＩＣ₅₀＝６００ｎＭ）しか示さないことでも確認された（表ＩＩ）。さらに合成ヘプタペプチドＮＩＤＰＮＡＶ（配列番号５）はほぼ同じ活性であった（ＩＣ₅₀＝８００ｎＭ）。しかし、産生されたＮ末端Ａｓｎを取り除くと、活性の低下は２倍となった（ＩＣ₅₀＝１．６μＭ）。阻害活性は大きなＮ末端の欠失（ＮＩＤ）で消滅し、またＣ末端Ｖａｌを取り除いても同様に消滅した。これは、ヘプタペプチドＮＩＤＰＮＡＶ（配列番号５）（γ １鎖の中の位置７９８−８０４）全体がループａの結合部位であることを示すものである。ループａヘプタペプチドの合成変種の検討単一残基の組合わせがヘプタペプチドの阻害活性にどのように影響するかを、１ないし３個の置換を含む合成相同体により調べた（表ＩＩＩ）。Ｄ８００をＮに変えた場合、活性は１００倍低下し、これはカルボキシ基の修飾後に観察された消失と同程度で符合した（表ＩおよびＩＩ）。驚くべきことに、Ｐ８０１をＱに変えた場合の低下は３倍だけであった。保存Ａ８０３をＶに置換した場合は中程度の１６倍の低下が観察された。相同ラミニン配列との比較からさらに置換物を設計した。ショウジョウバエγ １鎖（チャイ[Chi]，Ｈ．Ｃ．およびフイ[Hui]，Ｃ．Ｆ．（１９８９），Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２６４，１５４３−１５５０）は、そのヘプタペプチド領域において単一保存１７９９のみがＶに置換されたものである。この置換を合成ペプチドで調べると、親和性には極く僅かな影響しか持っていない（表ＩＩＩ）。ヒトラミニンγ２鎖イソフォーム（カルンキ[Kallunki]，Ｐ．ら（１９９２），Ｊ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．，１１９，６７９−６９３）は、ショウジョウバエラミニンに見られた変化に加えて、Ｎ８０２がＳに、またＶ８０４がＳに変化している。ヘプタペプチド配列へそれぞれの置換を別々または同時に追加すると、それぞれのケースで不活性化を起こした（表ＩＩＩ）。キメラ蛋白質モチーフおよび部位指向変異の産生と活性従来の研究においては、リピートがシグナルペプチド配列に連結されている限り、ラミニンγ１鎖の単独またはタンデム構成のＥＧＦ様リピートを、トランスフェクトしたヒト細胞クローンから十分な量を得ることができることが示されている（メイヤー[Mayer]，Ｕ．ら（１９９３），ＥＭＢＯＪ．，１２，１８７９−１８８５）。しかしながら、同一手法をループｄまたはループａ、ｂのいずれかが欠失したニドゲン結合ＥＧＦ様リピートの欠失変異（図１）に対して適用した場合には、培養液中に対応蛋白質を産生しなかった。ループｄが欠失したいくつかのクローン類に関しては、ノーザンハイブリダイゼーションによって相当多量の特異性ｍＲＮＡが存在することを証明できたが、これはそれらの蛋白質産生物中に細胞内変質があることが示唆するものである。このことは、適切な折畳みと分泌のためには４つのループ構造が完全であることが必要であることを示唆している。また、不活性リピート３と活性リピート４の間でループａ、ｂとループｃ、ｄを相互に交換することによりキメラ体を得たが、対応するフラグメントγ１ＩＩＩ３ａｂ４ｃｄおよびγ１ＩＩＩ４ａｂ３ｃｄも何ら問題なく得られた。部位指向変異誘発によりさらなる変異を、ループｃの１つまたは両方のチロシン中（γ １ＩＩＩ４Ｙ８１９−Ａ、γ１ＩＩＩ４Ｙ８２５−Ａ、γ１ＩＩＩ４Ｙ８１９／８２５−Ａ、）またはループａの残基（フラグメントγ１ＩＩＩ４Ｄ８００−Ｎおよびγ１ＩＩＩ４Ｎ８０２−Ｓ）中に、ヘプタペプチド実験で示したようにして作り出した。さらに、リピート３と５を結合させることによりＥＧＦ様リピートの欠失物全体を調製した（フラグメントγ１ＩＩＩ５−５Δ４）。これらすべての発現構築物において、対応する蛋白質産生物を得ることができ、これらを精製したが、ＳＤＳ−ゲル電気泳動により他のリコンビナントＥＧＦ様リピートで記述されているもの（メイヤー[Mayer]，Ｕ．ら（１９９３），ＥＭＢＯＪ．，１２，１８７９−１８８５）と同様の単一バンドが示された。それらは、非還元条件で測定した場合の電気泳動度の低下、並びにペプシンに対する抵抗性（データは提示していない）から、すべてジスルフィド結合のものであった。キメラ・フラグメントでの阻害性検討（表ＩＶ）では、フラグメントγ１ＩＩＩ４ａｂ３ｃｄ（ＩＣ₅₀＝８０ｎＭ）は野生型γ１ＩＩＩ４（０．０５ｎＭ）と比較して顕著な活性の低下が認められ、その活性度は合成酸化ループａ、ｂと比較して僅か３倍高いだけであった。キメラ・フラグメントγ１ＩＩＩ３ａｂ４ｃｄではさらに強い減少が認められ、これは結合におけるループａとｃの２つの役割に関する前記の観察結果を裏付けるものである。キメラの活性は、欠失変異γ １ＩＩＩ３−５Δ４が測定できるほどの活性を持たないことから、ＥＧＦ様リピート４によるものである。検討した３つのチロシン変異では、Ｙ８１９を含むものだけが３０から６０倍の活性の減少を示した（表ＩＶ）。この消失は化学修飾後に観察されたものと同程度の大きさである（表Ｉ）。しかしながら、単一残基の変異γ１ＩＩＩ４Ｙ８２５−Ａは阻害活性に顕著な影響は生じていない。劇的な活性減少（〜１００，０００倍）は、ヘプタペプチド結合領域に影響をもたらした突然変異γ１ＩＩＩ４Ｎ８０２−Ｓに認められた。興味深いことに、このフラグメントはループａ、ｂ全体が他の小さなループ構造で置換されている（図Ｉ参照）キメラγ１ＩＩＩ３ａｂ４ｃｄより活性が５倍も小さい。ヘプタペプチド領域内でのさらなる突然変異（フラグメントγ１ＩＩＩ４Ｄ８００−Ｎ）は、γ１ＩＩＩ３ａｂ４ｃｄと比べた場合に同様の活性減少を示している（表ＩＶ）。これらの変化はヘプタペプチドの合成変種で観察されたものと対応している（表ＩＩＩ）。結合活性に対するジスルフィド結合の貢献度を調べるために、いくつかの選択された変異体を変性条件下で還元し、アルキル化した（表ＩＶ）。ループａ、ｂペプチドレベルまでの相対的に最も大きな活性低下（〜３００倍）は、γ１ＩＩＩ４Ｙ８１９／８２５−Ａで認められた。還元されたγ１ＩＩＩ４ａｂ３ｃｄはほぼ同程度の活性を有し、ループａ、ｂはＥＧＦ様モチーフ全体がある場合には、ジスルフィド結合型の方が幾分活性であることを示した。γ１ＩＩＩ３ａｂ４ｃｄの還元は、すでに低い活性をさらに６倍減少させた。従ってこのデータは、適当なリコンビナント蛋白質で個別に調べた場合に、ループａおよびｃ結合領域が僅かにジスルフィド依存性を示すことを示している。この両部位の間の高親和性の協働は、γ１ＩＩＩ４Ｙ８１９／８２５−Ａの場合に示されているように、より依存性が高いようである。以上本発明を説明してきたが、本明細書で規定した本発明の精神および範囲から逸脱することなく、多くの変更と修正ができることは当分野の普通の技術者には明らかなことである。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号ＦＩＡ６１Ｋ 38/00 ＡＥＤＣ１２Ｐ 21/02 ＣＣ０７Ｋ 14/485 Ａ６１Ｋ 37/02 ＡＥＤＣ１２Ｎ 15/09 ＺＮＡＡＤＵＣ１２Ｐ 21/02 Ｃ１２Ｎ 15/00 ＺＮＡＡ (72)発明者ティンプル，ルパートドイツ連邦共和国Ｄ−82152 マルティンスライド，マックスプランクインスティトゥツフォーバイオケミストリー

Claims

【特許請求の範囲】１．式（Ｉ）で表されるペプチジル化合物（配列番号１）：［式中、Ｒ¹は水素またはＮ末端保護基であり；Ｒ²は水素、ＮＨ₂または配列（ＩＩ）（配列番号２）のＮ末端Ｌｅｕで始まる１−１４のアミノ酸残基を含むペプチジル基であり；ここでＷは原子価結合またはアミノ酸残基であり；Ｘは原子価結合またはアミノ酸残基であり；Ｙはアミノ酸残基であり；ＺはＧｌｙまたは配列ＩＩＩ（配列番号３）の１から１１アミノ酸残基を含むペプチジル基：ただし、Ｒ²は水素または、ＮＨ₂あるいはＮＨＭｅのようなアミンであり；２．Ｒ²が水素でＺがＧｌｙである、請求項１に記載のペプチジル化合物。３．ＷがＡｓｎ、Ａｓｐ、Ｇｌｕ、及びＧｌｎからなる群から選択されるアミノ酸である、請求項１に記載のペプチジル化合物。４．ＸがＩｌｅ、Ｌｅｕ、及びＡｌａからなる群から選択されるアミノ酸である、請求項１に記載のペプチジル化合物。５．ＹがＰｒｏ及びＨｙｐからなる群から選択されるアミノ酸である、請求項１に記載のペプチジル化合物。６．Ｒ²が配列（ＩＩ）（配列番号２）のＮ末端Ｌｅｕで始まる１−１４のアミノ酸残基を含むペプチジル基である、請求項１に記載のペプチジル化合物：７．Ｒ²が配列（ＩＩ）（配列番号２）のペプチジル基である、請求項６に記載のペプチジル化合物：８．Ｚが配列（ＩＩＩ）（配列番号３）のＮ末端Ｇｌｙで始まる１−９のアミノ酸を含むペプチジル・フラグメントである、請求項７に記載のペプチジル化合物：［式中、Ｒ³は水素、ＮＨ₂あるいはＮＨＭｅである］。９．ＺがＧｌｙである、請求項８に記載のペプチジル化合物。１０．Ｒ¹−Ａｓｎ−Ｉｌｅ−Ａｓｐ−Ｐｒｏ−Ａｓｎ−Ａｌａ−Ｖａｌ−Ｒ³である、請求項１に記載のペプチジル化合物。１１．Ｒ¹−Ａｓｐ−Ｐｒｏ−Ａｓｎ−Ａｌａ−Ｖａｌ−Ｒ³である、請求項１に記載のペプチジル化合物。１２．次式で表される（配列番号３８）、請求項１に記載のペプチジル化合物：