DE19701607A1 - Anitkörper, die an die Nidogen-Bindungsdomäne des Laminins binden, deren Herstellung und Verwendung - Google Patents
Anitkörper, die an die Nidogen-Bindungsdomäne des Laminins binden, deren Herstellung und VerwendungInfo
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Description
Die Erfindung betrifft monoklonale und polyklonale Antikörper sowie deren Teile, die
spezifisch an die Nidogen-Bindungsdomäne des Laminins binden, Verfahren zu
deren Herstellung sowie deren Verwendung als Arzneimittel, als Diagnostikum zum
Nachweis von Laminin-Isoformen und als Modellsubstanz zur Entwicklung und
Bewertung von die Nidogen/Laminin-Interaktion beeinflussenden Stoffen. Die
erfindungsgemäßen Antikörper oder deren Teile binden bevorzugt an der γ1
III 4-Domäne des Laminins, insbesondere an wesentliche Nidogen-Bindungsstellen im
hochkonservierten Bereich des Loops a bzw. der Loops a und c, und können die
Assoziation von Laminin und Nidogen inhibieren.
Die Assoziation von Laminin (ein 800 kDa Glycoprotein) und Nidogen (ein 160 kDa
Glycoprotein) wird als ein entscheidender biomolekularer Mechanismus bei der
Synthese und Stabilisierung von Basalmembranen betrachtet (Mayer, U. & Timpl, R.
(1994) in: Extracellular Matrix Assembly and Structure (Ed.: P. D. Yurchenco et al.)
S. 389-416, Academic Press, Orlando, FL). Durch die Fähigkeit des Nidogens mit
allen Hauptbestandteilen der Basalmembran wie z. B. γ1 enthaltenden
Laminin-Isoformen (zur Nomenklatur siehe: Burgeson, R. E. et al. (1994) Matrix Biology
14: 209-211), Kollagen IV, Perlecan und Fibulin sowie deren jeweiligen
Assoziationsstrukturen ternäre Komplexe auszubilden, übernimmt es die Funktion
eines Bindegliedes, welches die voneinander unterschiedlichen Makrostrukturen
miteinander verbindet, räumlich organisiert und stabilisiert (Fox, J. W. et al. (1991)
EMBO J. 10: 3137-3146; Aumailley, M. et al. (1993) Kidney Int. 43: 7-12).
Einen deutlichen Hinweis auf die zentrale Funktion der Laminin/Nidogen-Interaktion
bei der Synthese einer funktionalen Basalmembran konnten Experimente mit
polyklonalen Anti-Laminin-Antikörpern liefern. Die beschriebenen Antikörper wurden
durch Immunisierung von Kaninchen mit Laminin P1 oder dem rekombinant
erzeugten Lamininfragment γ1 III 3-5 gewonnen und über eine
Affinitätschromatographie an Laminin P1 oder Laminin γ1 III 3-5-Matrices
angereichert. Sie zeigten in Inhibitionstests eine komplette Hemmung der
Laminin/Nidogen-Assoziation. Diese basiert aber auf einer sterischen Blockade des
Nidogenzugangs zum Laminin durch die Antikörper, deren Bindungsregionen nur in
der Nähe der nidogenbindenden Sequenzen des Laminins liegen (Mayer, U. et al.
(1993) EMBO J. 12: 1879-1885). In embryonalen Organkulturen konnten die
beschriebenen Antikörper sowohl die Genese von Nierentubuli, als auch die
Ausbildung von Lungenbläschen inhibieren. Beides sind Ontogeneseprogramme die
von einer ungehinderten Neusynthese einer Basalmembran abhängen (Ekblom, P.
et al. (1994) Development 120: 2003-2014; Ekblom, P. (1993) in: Molecular and
Cellular Aspects of Basement Membranes (Ed.: Rohrbach, D. H. & Timpl, R.) S. 359-383;
Academic Press, San Diego, CA.).
Die Nidogen-Bindungsdomäne des Laminins konnte in ihrer Lokalisation, Sequenz
und in ihrer räumlichen Struktur (Röntgenkristallstruktur und NMR-Struktur)
eindeutig identifiziert und charakterisiert werden (Mayer, U. et al. (1993) EMBO J.
12: 1879-1885; Baumgartner, R. et al. (1996) J. Mol. Biol. 257: 658-668; Stetefeld,
J. et al. (1996) J. Mol. Biol. 257: 644-657). Sie befindet sich in einem "LE Modul"
(laminin-type epidermal growth factor-like) des kurzen Arms der γ1-Kette des
Laminins, in der Domäne γ1 III 4. "LE Module" sind Strukturmotive aus 50-60
Aminosäuren die ein komplexes, zum "epidermal growth factor" analoges
Faltungsmuster mit 4 Disulfidbrücken aufweisen (Bairoch, A. (1995) Nomenclature
of extracellular domains. The SWISS-PROT Protein sequence data bank. release
310; Engel, J. (1989) FEBS Letters 251: 1-7).
Eine hochaffine Bindung des Nidogens zur komplementären Laminin-Domäne
konnte für Laminin P1 aus dem EHS Tumor der Maus, Laminin-2 und Laminin-4 aus
humaner Plazenta und Laminin aus Drosophila nachgewiesen werden. Ursache für
diese speziesübergreifende Bindungsspezifität ist die außerordentlich hohe
Aminosäuresequenzidentität, die in der Laminin γ1 III 4-Domäne bei den
untersuchten Spezies vorliegt. Sie beträgt 97% zwischen Mensch und Maus und
erstaunliche 61% zwischen Mensch und Drosophila, wenn das ganze Modul
berücksichtigt wird. Beschränkt man den Vergleich auf den Bereich der Loops a bis
c, die wesentliche Nidogen-Bindungsstellen enthalten, dann erhöhen sich die Werte
auf 100% bzw. 75% (Pikkarinen, T. et al. (1987) J. Biol. Chem. 263: 6751-6758;
Chi, H.-C. & Hui, C.-F. (1989) J. Biol. Chem. 264: 1543-1550).
Neben der Abhängigkeit der Nidogen-Bindung von einer intakten dreidimensionalen
Struktur, konnten eindeutige Sequenzbereiche identifiziert werden, die sich in den
S-S stabilisierten Loops a und c der Laminin-Domäne γ1 III 4 befinden. Fünf
essentielle Aminosäuren wurden identifiziert: Vier befinden sich innerhalb eines
Abschnitts aus 7 Aminosäuren im Loop a und eine Tyrosinseitenkette im Loop c
(Pöschl, E. et al. (1994) EMBO J. 13: 3741-3747; Mayer, U. et al. (1993) EMBO J.
12: 1879-1885; Pöschl, E. et al. (1996) EMBO J. 15: 5154-5159).
Synthetische Peptide, die aus den entsprechenden Bereichen der Laminin-Domäne
γ1 III 4 abgeleitet werden können, sind in der Lage die Laminin/Nidogen-Bindung in
speziellen Bindungsassays komplett zu inhibieren (US 5,493,008). Allerdings zeigen
derartige synthetische Peptide in Inhibitionsassays eine Aktivität, die etwa 400- bzw.
10000-fach schwächer ist als die des intakten Laminin P1 oder Laminin γ1 III 3-5
(Pöschl, E. et al. (1994) EMBO J. 13: 3741-3747; US 5,493,008). Die
Laminin/Nidogen-Interaktion ist durch eine starke konformationelle Komponente
beeinflußt (Mayer, U. et al. (1993) EMBO J. 12: 1879-1885). Die schwächere
inhibitorische Wirkung der synthetischen Peptide ist erklärbar, da Peptide in
wäßriger Lösung eine Myriade von unterschiedlichen Konformationen einnehmen
können und deshalb nur ein gewisser Prozentsatz der Peptide in der biologisch
aktiven Konformation anzutreffen ist.
Die Verwendung solcher Peptide als Medikament ist daher aufgrund ihrer
konformationellen Flexibilität, aber auch wegen ihrer Instabilität gegenüber
Proteasen sowie ihrer schlechten Bioverfügbarkeit und Pharmakodynamik erheblich
limitiert (Milner-White, E. J. (1989) Trends Pharmacol. Sci. 10: 70-74; Hruby, V. J.
(1994) in: Peptides, Proc. Thirteenth American Peptide Symposium; (Ed.: Hodges,
R. S. & Smith, J. A.) S. 3-17; ESCOM: Leiden, Netherlands).
Antikörper, die spezifisch an die Nidogen-Bindungsdomäne des Laminins binden
und die Assoziation zwischen Laminin und Nidogen bei geringer Konzentration
kompetitiv zu inhibieren vermögen, sind aufgrund ihrer höheren Affinität und
Avidität, ihrer hohen Stabilität sowie ihrer guten Pharmakokinetik besser als
Therapeutikum zur Behandlung von Krankheiten geeignet. Weiterhin können sie als
Diagnostikum oder als Hilfsmittel in biologischen und pharmakologischen Modellen
zur Entwicklung und Bewertung von die Laminin/Nidogen-Interaktion
beeinflussenden Stoffen eingesetzt werden.
Die bisher erzeugten Anti-Laminin P1- oder Anti-Laminin γ1 III 3-5-Antikörper
können zwar zum Teil die Nidogen/Laminin-Bindung inhibieren. Sie erkennen
jedoch die Nidogen-Bindungsstellen der Laminin γ1-Kette nicht direkt, sondern die
Inhibition der Nidogen/Laminin-Bindung erfolgt über sterische Wechselwirkung
(Mayer, U. et al. (1993) EMBO J. 12: 1879-1885). Die Nidogen-Bindungsdomäne
der Laminin γ1-Kette ist speziesübergreifend außerordentlich stark konserviert.
Darüber hinaus ist Laminin ein extrazelluläres Protein, das sowohl als integrierter
Bestandteil von Basalmembranen, als auch in Form einer zirkulierenden
Serumkomponente (EP 0 696 597 A2) ständig mit dem Immunsystem in Kontakt
steht. Aufgrund der Fähigkeit des Immunsystems "selbst" von "nicht-selbst" zu
unterscheiden muß gefolgert werden, daß jede immunisierte Spezies das hoch
konservierte Immunisierungsantigen als eigenen Körperbestandteil erkennt und
daher keine Antikörper gegen diesen entwickelt. Die Erzeugung eines spezifischen
Antikörpertiters konnte deshalb nicht erwartet werden. Bestätigung fand diese
allgemein anerkannte Lehrmeinung durch die Tatsache, daß durch Immunisierung
von Kaninchen mit Laminin P1 und Laminin γ1 III 3-5 bisher keine Antikörper gegen
die Nidogen-Bindungsdomäne des Laminins erzeugt werden konnten (Mayer, U. et
al. (1993) EMBO J. 12: 1879-1885). Die oben beschriebenen polyklonalen
Antikörper, die an nicht genau definierte Epitope außerhalb der Nidogen-Bin
dungsdomäne des Laminins binden, sind jedoch als Therapeutikum, als
Diagnostikum bzw. als Modellsubstanz zur Entwicklung und Bewertung von die
Nidogen/Laminin-Interaktion beeinflussenden Stoffen nur sehr eingeschränkt bzw.
überhaupt nicht geeignet: Die sterische Inhibition ist abhängig von der räumlichen
Ausdehnung des Hemmstoffs, so daß der aus pharmakologischen Gründen
bevorzugte Einsatz von Teilen dieser Antikörper als Therapeutikum kaum möglich
ist. Des weiteren schränken mögliche Kreuzreaktionen mit nicht-nachzuweisenden
Analyten die Verwendung dieser Antiköper in diagnostischen Testen ein.
Aufgabe der vorliegenden Erfindung ist es, Antikörper zu erzeugen, die spezifisch
an die Nidogen-Bindungsdomäne des Laminins binden, also die Nidogen-Bin
dungsdomäne der Laminin-γ1-Kette direkt erkennen, und die als Arzneimittel, als
Diagnostikum zum Nachweis von Laminin-Isoformen sowie als Modellsubstanz zur
Entwicklung und Bewertung von die Nidogen/Laminin-Interaktion beeinflussenden
Stoffen geeignet sind.
Die Aufgabe wird erfindungsgemäß gelöst, durch die im folgenden beschriebenen
Antikörper sowie die Verfahren zu deren Herstellung und Verwendung.
Die erfindungsgemäßen Antikörper oder Teile davon sind dadurch gekennzeichnet,
daß sie an die Nidogen-Bindungsdomäne des Laminins, bevorzugt die Laminin γ1
III 4-Domäne, besonders bevorzugt an den hochkonservierten Bereich des Loops a
bzw. der Loops a und c der Laminin γ1 III 4-Domäne binden. Insbesondere werden
von der Erfindung Antikörper oder Teile davon miteingeschlossen, die mindestens
an ein Peptid gemäß Tabelle 1 binden.
Die erfindungsgemäßen Antikörper sind erhältlich durch die Immunisierung
immunkompetenter Wirbeltiere, wie z. B. Kaninchen, Mäuse, Schafe, Ziegen,
Meerschweinchen, Ratten u. Hühner, bevorzugt mit Laminin γ1 III 4 sowie
insbesondere mit Peptiden, die wesentliche Nidogen-Bindungsstellen enthalten
aber nicht die vollständige Aminosäuresequenz der γ1 III 4-Domäne des Laminins,
ganz besonders bevorzugt eines der oder beide Peptide gemäß Tabelle 1, als
Immunisierungsantigen. Neben polyklonalen Antikörpern sind auch monoklonale
Antikörper (MAK) erhältlich, wobei bei letzteren zunächst MAK-produzierende
Hybridoma-Zellen erzeugt werden. Die Antikörper sind auch in gereinigter Form
erhältlich, indem die erfindungsgemäßen Antikörper aus Antikörper-enthaltendem
Material, wie z. B. Antiserum des immunisierten Tieres, Hybridoma-Zell
kulturüberstand, Aszites oder Zellen, beispielsweise per
Affinitätschromatographie gereinigt werden.
Die erfindungsgemäßen Antikörper oder Teile davon können die Laminin/Nidogen-Inter
aktion inhibieren und umfassen als Überbegriff auch die an anderer Stelle
näher beschriebenen entsprechenden chimären, humanisierten, bi- oder
oligospezifischen Antikörper sowie Antikörperanaloga.
Die Erfindung beinhaltet auch tierische, pflanzliche und prokaryontische Zellen
sowie Zellinien, die die erfindungsgemäßen Antikörper und Antiköperteile
produzieren.
Ferner umfaßt die Erfindung ein Verfahren zur Herstellung der oben beschriebenen
Antikörper, wobei, immunkompetente Wirbeltiere, wie z. B. Kaninchen, Mäuse,
Schafe, Ziegen, Meerschweinchen, Ratten u. Hühner, immunisiert werden mit
wesentliche Nidogen-Bindungsstellen des Laminins enthaltenen Peptiden,
bevorzugt Laminin P1, Laminin γ1 III 3-5 sowie Laminin γ1 III 4, besonders
bevorzugt Peptide, die nicht die vollständige Aminosäuresequenz der γ1 III 4-Domäne
des Laminins enthalten, ganz besonders bevorzugt eines der oder beide
Peptide gemäß Tabelle 1. Unter dem Begriff Peptide sind Oligopeptide,
Polypeptide sowie Proteine und Proteinfragmente zu verstehen. Die als
Immunisierungsantigen verwendeten Peptide werden bevorzugt gekoppelt an
Träger wie beispielsweise Proteine, z. B. Ovalbumin, Albumin oder Hämocyanin,
oder Polymere, z. B. Polyethylenglykol, Polyacrylamid oder Poly-d-Glutamin-d-Lysin,
eingesetzt. Optional beinhaltet das Verfahren auch die Erzeugung von
MAK-produzierenden Hybridoma-Zellen. Es hat sich als vorteilhaft erwiesen, die
erfindungsgemäßen Antikörper oder deren Teile aus Antikörper-enthaltenden
Material, wie z. B. Antiserum des immunisierten Tieres, Hybridoma-Zell
kulturüberstand, Aszites oder Zellen beispielsweise mit Hilfe der
Affinitätschromatographie zu reinigen, wobei bevorzugt eine Laminin
P1-Affinitätsmatrix verwendet wird.
Die erfindungsgemäßen Antikörper oder Teile davon können vielfältig verwendet
werden, z. B. als Arzneimittel, als Diagnostikum, als Hilfsmittel in biologischen und
pharmakologischen Modellen zur Entwicklung und Bewertung von die
Laminin/Nidogen-Interaktion beeinflussenden Stoffen, z. B. als Modellsubstanz zur
Evaluierung der räumlichen Struktur der zur Nidogen-Bindungsstelle des Laminins
komplementären Kontaktzone und deren potentieller Bindungsvalenzen, sowie zur
Untersuchung der Biosynthese von Basalmembranen und des Einflusses von
Basalmembranen bei unterschiedlichen physiologischen Prozessen, wie z. B. der
Organentwicklung Angiogenese oder Embryogenese. Die Erfindung schließt auch
Arzneimittel und Diagnostika mit ein, die einen oder mehrere der
erfindungsgemäßen Antikörper oder Antikörperteile enthalten.
Ferner umfaßt ist die Verwendung von einem oder mehreren erfindungsgemäßen
Antikörpern oder Antikörperteilen
- - zur Herstellung eines Arzneimittels zur Behandlung von Krankheiten, die durch eine vermehrte oder unerwünschte Synthese von Basalmembranen charakterisiert sind, insbesondere von Fibrosen, vor allem die alkoholische Leberfibrose sowie die Lungenfibrose, sowie alle Formen von diabetischen Spätkomplikationen, die von Verdickungen der Basalmembran begleitet sind - vor allem in Niere, Auge und Gefäßsystem -, sowie die Arteriosklerose und alle Krankheiten, bei denen eine Angiogenese zur Verschlechterung des klinischen Bildes beiträgt, z. B. Krebserkrankungen, diabetische Retinopathie und Erkrankungen mit einer starken entzündlichen Komponente wie z. B. rheumatoide Arthritis, Osteoarthritis, Vaskulitis, Haemangiome und Psoriasis;
- - zur Herstellung eines Diagnostikums zum Nachweis von γ1-enthaltenen Lamininisoformen in biologischen Proben, z. B. in Körperflüssigkeiten wie Blut, Serum, Plasma, Urin, Speichel oder Liquor, sowie in Geweben. Unter den Begriff Diagnostikum fallen z. B. die verschiedenen Ausführungsformen heterogener und homogener Immunoassays, Testsysteme in der Immunhistochemie sowie auch Reagenzien für in vivo Nachweisverfahren wie z. B. der Immunszintigraphie. Die die erfindungsgemäßen Antikörper oder Antikörperteile enthaltenden Zubereitungen können auch alleine oder zusammen mit weiteren Hilfsreagenzien, wie z. B. Puffer, Waschlösungen, Meßsignal-auslösenden Lösungen, und/oder anderen Hilfsmitteln, wie z. B. Küvetten, in Form von Diagnostika-Kits zusammengefaßt werden.
Im folgenden wird die Erfindung näher beschrieben und anhand diverser Beispiele
im Detail erläutert:
Überraschenderweise konnte mit den in Tabelle 1 aufgeführten Peptiden, die kein Faltungsmuster auszubilden vermögen wie es in LE-Modulen vorliegt, Antikörper gegen die hochkonservierte Aminosäuresequenz der Nidogen-Bindungsdomäne des Laminins erzeugt werden. Hierzu wurden die Peptide gemäß Tabelle 1 mit Hilfe von Carbodiimid an Ovalbumin gekoppelt und diese Konjugate zur Immunisierung von Kaninchen eingesetzt. Die Entwicklung eines spezifischen Antikörper-Titers gegen Laminin P1 und Laminin γ1 III 3-5 wurde mit Hilfe eines Enzymimmunoassays analysiert.
Überraschenderweise konnte mit den in Tabelle 1 aufgeführten Peptiden, die kein Faltungsmuster auszubilden vermögen wie es in LE-Modulen vorliegt, Antikörper gegen die hochkonservierte Aminosäuresequenz der Nidogen-Bindungsdomäne des Laminins erzeugt werden. Hierzu wurden die Peptide gemäß Tabelle 1 mit Hilfe von Carbodiimid an Ovalbumin gekoppelt und diese Konjugate zur Immunisierung von Kaninchen eingesetzt. Die Entwicklung eines spezifischen Antikörper-Titers gegen Laminin P1 und Laminin γ1 III 3-5 wurde mit Hilfe eines Enzymimmunoassays analysiert.
Die polyklonalen Antikörper gewünschter Spezifität wurden dann per
Affinitätschromatographie über eine Matrix, an die Laminin P1 aus humaner
Plazenta gebunden war, und anschließender Siebgelchromatographie angereichert.
Die Methoden zur Reinigung und Charakterisierung von Laminin aus humaner
Plazenta sowie dessen Verwendung zur Immunisierung von Mäusen und zur
Gewinnung von Anti-Laminin P1-Antikörper synthetisierenden Hybridomen sind in
EP 0 696 597 A2 beschrieben.
Die nach Laminin P1-Affinitätschromatographie des Antiserums angereicherten
Antikörper zeigen eine Bindungsspezifität gegenüber Laminin P1 aus der
Humanplazenta, Laminin P1 aus der Maus (EHS Tumor) und Laminin aus der Ratte
(Dottersack). Die Antikörper erkennen nicht nur die spezifische Sequenz sondern
auch die biologisch aktive Konformation der Nidogen-Bindungsdomäne des
Laminins. Sie sind in der Lage, die Laminin/Nidogen-Bindung komplett zu inhibieren.
Die erfindungsgemäßen Antikörper sind aber auch erhältlich durch die
Immunisierung anderer immunkompetenter Wirbeltiere, wie z. B. Mäuse, Schafe,
Ziegen, Meerschweinchen, Ratten u. Hühner, bevorzugt mit Laminin γ1 III 4 sowie
insbesondere mit Peptiden, die wesentliche Nidogen-Bindungsstellen enthalten aber
nicht die vollständige Aminosäuresequenz der γ1 III 4-Domäne des Laminins, ganz
besonders bevorzugt die Peptide gemäß Tabelle 1. Erfindungsgemäße polyklonale
Antikörper können aus dem Antiserum der immunisierten Tiere gereinigt werden.
Um entsprechende monoklonale Antikörper zu erzeugen, werden nach allgemein
bekannten Verfahren (siehe z. B. Harlow, E. & Lane, D. (1988) Antibodies: A
Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor) die
Immunzellen immunisierter Tiere, wie z. B. Mäuse, mit Myelomzellen zum Erzeugen
von MAK-produzierenden Hybridoma-Zellen verschmolzen und anschließend
geeignete Klone isoliert. Die Auswahl der die gewünschten MAK-produzierenden
Klone wird mit Hilfe spezifischer Screeningverfahren durchgeführt. Hierbei wird die
Bindungsspezifität der in den Kulturüberstand abgegebenen Antikörper z. B. an das
Immunisierungsantigen an den Träger des Immunisierungsantigens, an natives wie
rekombinantes Laminin bzw. an dessen Fragmente bevorzugt mittels Enzym- oder
Radioimmunoassays sowie Western Blots überprüft. Ein weiteres mögliches
Selektionskriterium ist die die Fähigkeit der Antikörper, die Nidogen/Laminin-Bin
dung zu verhindern. Diese kann z. B. mittels der in den Beispielen näher
beschriebenen Inhibitionsassays bewertet werden. Hybridome die spezifisch an die
Nidogen-Bindungsdomäne des Laminins bindende MAK herstellen, werden kloniert.
Sie stehen sodann für die MAK-Produktion auf Dauer zur Verfügung. Je nach
gewünschtem Verwendungszweck ist es vorteilhaft nur Teile der Antikörper, wie z. B.
F(ab)2, Fab' oder Fab-Fragmente, einzusetzen. Diese können beispielsweise mit
dem Fachmann bekannten enzymatischen Spaltverfahren (siehe z. B. Harlow, E. &
Lane, D. (1988) Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory,
Cold Spring Harbor) erzeugt werden.
Die Antigenbindungsstellen eines Antikörpers befinden sich in den sogenannten
variablen Domänen, die durch die entsprechenden V-Gene kodiert sind. Mit den
bekannten gentechnischen Methoden (siehe z. B. Sambrook, J. et al. (1989)
Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold
Spring Harbor, 2nd. edition; McCafferty, J. et al. (1990) Nature 348: 552-554) kann
auch die entsprechende Nukleinsäuresequenz eines an die Nidogen-Bin
dungsdomäne des Laminins bindenden Antikörpers ermittelt werden sowie
dadurch auch die entsprechende Aminosäuresequenz, sofern diese noch nicht per
Aminosäuresequenzierung bereits bekannt war. Als Ausgangsmaterial für die
Analysen werden Hybridoma-Zellen bzw. die Antikörper-produzierenden
Immunzellen immunisierter Säugetiere eingesetzt.
In Kenntnis der Nuklein- und Aminosäuresequenz können mit Hilfe üblicher
gentechnischer und molekularbiologischer Methoden (siehe auch Johnson, K. S. &
Chiswell, D. J. (1993) Current Opinion in Structural Biology 3: 564-571) dann
humanisierte oder chimäre, bi- oder oligospezifische Antikörper sowie
Antikörperanaloga, wie z. B. von der "complementarity determining region"
abgeleiteten Polypeptide ("minimal recognition units"), "single chain"-Fragmente
oder funktionelle Fusionsprodukte - wie insbesondere rekombinant hergestellte
Antikörper-Enzym oder -Komplement-Konstrukte - hergestellt werden, die spezifisch
an die Nidogen-Bindungsdomäne des Laminins binden. Diese vom
erfindungsgemäßen Antikörper bzw. Antikörpergen abgeleiteten Moleküle werden
von dem in dieser Schrift verwendeten Überbegriff "Antikörper oder ein Teil
desselben" mitumfaßt. Mit diesen Molekülen kann z. B. eine Verringerung der
Immunogenität und/oder eine verstärkte Wirksamkeit bei Verabreichung als
Arzneimittel erzielt werden und/oder es ergeben sich Vorteile für den Einsatz als
Diagnostikum bzw. als Hilfsmittel für die Entwicklung und Bewertung von die
Laminin/Nidogen-Interaktion beeinflussenden Stoffen. Die Antikörper oder Teile
derselben sind herstellbar in pflanzlichen (z. B. Hefe), tierischen und
prokaryontischen Zellen.
Die erfindungsgemäßen Antikörper sowie Teile derselben können modifiziert
werden, z. B. durch die Markierung mit radioaktiven Isotopen oder paramagnetischen
Verbindungen zum Einsatz für die in vivo-Diagnostik oder durch die Anbindung von
pharmakologisch wirksamen Substanzen zur Erzeugung eines noch wirksameren
Arzneimittels.
Die im folgenden aufgeführten Beispiele dienen zur exemplarischen Beleuchtung
einzelner Aspekte der Erfindung.
SDS-Gelelektrophorese, Western Blotting, BCA Proteinbestimmung wurden nach
Standardprotokollen oder nach den Anweisungen der Hersteller durchgeführt.
Wenn nicht ausdrücklich angegeben, wurden die verwendeten Chemikalien von den
Firmen Merck (Darmstadt), Sigma (München) oder Riedel de Haen (Seelze)
bezogen.
148 mg (0,1 mmol) eines FMOC-Amidanker-PAM Harzes wurden zur
Festphasensynthese - ABI 433 Peptidsynthesizer - des Peptides eingesetzt. Nach
Beendigung der Synthese beobachtete man eine Gewichtszunahme des Harzes auf
513 mg. Das Harz wurde mit einer Lösung aus 10 ml Trifluoressigsäure und 365 µl
Triethylsilan für 2 Stunden bei Raumtemperatur behandelt. Nach Abfiltration des
Harzes wurde die Lösung im Vakuum einrotiert und mit 50 ml 10% Essigsäure
(AcOH) aufgenommen und gefriergetrocknet. Man erhielt 145 mg (54% Ausbeute)
an Rohpeptid. Das Rohpeptid wurde anschließend in 3 ml 80% AcOH gelöst und
diese Lösung zu einer schnell gerührten Lösung (0,006 mmol Jod, 0,006 mmol
Natriumacetat in 55 ml 80% AcOH) zugetropft. Nach 5 min wurde die Reaktion durch
Zugabe von 0,1 N Ascorbinsäurelösung beendet. Die Lösung wurde auf ein
Volumen von 2 ml eingeengt und auf eine Sephadex® G25 Säule, die mit 0,1 M
AcOH entwickelt wurde, aufgetragen. Das isolierte Peptid wurde durch Reversed
Phase HPLC-Chromatographie hochgereinigt.
Ausbeute: 36 mg von DNIDPNAVGNLKCIYNTAGFYCDR-NH2 (13,5% der Theorie).
Ausbeute: 36 mg von DNIDPNAVGNLKCIYNTAGFYCDR-NH2 (13,5% der Theorie).
Die Struktur wurde durch Massenspektroskopie (Molmasse: 2673 Da) und
Aminosäureanalyse bestätigt.
Analog wurde das Peptid DNIDPNAVGNL-NH2 hergestellt.
Ausbeute: 268 mg (67% der Theorie); Molmasse: 1140 Da.
Analog wurde das Peptid DNIDPNAVGNL-NH2 hergestellt.
Ausbeute: 268 mg (67% der Theorie); Molmasse: 1140 Da.
30 mg Ovalbumin (Sigma A-2512) wurden in 1 ml Na-Phosphat Puffer, pH 7,4 gelöst
und mit 200 µl einer wäßrigen Lösung aus 7 mg N-Hydroxysulfosuccinimid Na-Salz
(Fluka 56485) sowie 300 µl einer wäßrigen Lösung aus 100 mg 1-Ethyl-3-(3-Dia
minaminopropyl)-carbodiimid, HCI (Sigma E-6383) versetzt. Nach 5 Minuten
wurde die Peptidlösung (30 mg des entsprechenden Peptids in 1 ml 10 mM
Na-Phosphat Puffer, pH 7,4) zugegeben. Die Kopplungsreaktion verlief 16 Stunden bei
Raumtemperatur im Dunkeln. Nach der Reaktionszeit wurde die Lösung
zentrifugiert, um eventuell auftretende Trübungen zu entfernen. Unreagierte
Chemikalien und Salze wurden anschließend durch Chromatographie über eine
NAP-25 Säule (Pharmacia) entfernt. Das Ovalbumin/Peptid Konjugat wurde dadurch
in PBS +0,04% Tween-20 überführt. Die Ausbeute betrug 50-55 mg Konjugat.
Gemischtrassige Kaninchen mit einem Körpergewicht von ca. 3 kg wurden mit den
Ovalbumin/Peptid Konjugaten immunisiert. Hierfür wurden 1 mg der entsprechenden
Konjugate in 0,5 ml Phosphat-gepufferte Saline (PBS) gelöst und dann mit
demselben Volumen komplettes Freund'sches Adjuvans gemischt und sorgfältig
emulgiert. 1 ml der so erhaltenen Emulsion wurde einem Kaninchen intradermal
injiziert; dabei wurde jeweils ein Fünftel des Volumens in fünf unterschiedliche
Stellen, nahe der regionalen Lymphknoten, appliziert. Booster-Injektionen (das
Antigen wurde hierfür mit unkompletten Freund'schem Adjuvans emulgiert) wurden
mit halbkonzentrierter Antigenemulsion nach 21 Tagen und 53 Tagen durchgeführt.
Die spezifische Antikörper-Titerentwicklung wurde bei vier Tieren mit einem
Enzymimmunoassay unter Verwendung von Laminin P1 bzw. Laminin γ1 III 3-5
beschichteten Kunststoffgefäßen näher untersucht. Die entsprechenden Tierseren
sind mit den Bezeichnungen K2, K3, K4 und K905 spezifiziert. Die Seren K3 und K4
wurden durch Immunisierung mit Konjugat-1 erhalten, die Seren K2 und K905 durch
Immunisierung mit Konjugat-2. In allen Kaninchen wurde sehr schnell eine
Immunreaktion angeregt, die dann nach 21 Tagen (1. Booster) konstant blieb, bzw.
langsam aber kontinuierlich abklang. Eine erneute Stimulierung der Immunantwort
durch eine zweite Boosterinjektion wurde nicht beobachtet. Die gebildeten Antiköper
reagierten sowohl mit Laminin P1 als auch mit der Laminin-Domäne γ1 III 3-5. Die
Bindung zum Laminin P1 war allerdings etwas weniger ausgeprägt als die zum
Laminin γ1 III 3-5 und schien im Prozeß der Immunreaktion stärkeren
Schwankungen unterworfen zu sein. Dies kann ein Hinweis sein auf mehrere
Antikörperpopulationen im polyklonalen Serum, die mit verschiedenen Affinitäten die
Nidogen-bindenden Motive, bzw. deren Konformationen im Laminin P1 und im
Laminin γ1 III 3-5 binden.
Zur weiteren Charakterisierung wurden die spezifischen Antikörper von den übrigen
Immunglobulinen im Tierserum, weiteren Serumbestandteilen und den gegen
Ovalbumin gerichteten Antikörpern abgetrennt. Hierfür wurde eine
Affinitätschromatographie an einer Laminin P1-Affinitätsmatrix durchgeführt.
Als Träger (Gelmatrix) wurde Fractogel® EMD Azlacton 650(S) (Merck, Darmstadt)
verwendet. 0,3 g des Materials wurden vor der Kopplung 15 Minuten in 6 ml PBS, 1
M Na2SO3, pH 7,4 inkubiert, anschließend wurde der flüssige Überstand
abgegossen. Während der Inkubation quoll das Material auf ein Volumen von 1 ml
und die Matrix konnte direkt zur kovalenten Kopplung des gewünschten Liganden
eingesetzt werden.
3,4 mg humanes Laminin P1 wurden in 2 ml 0,2 M Ammoniumbicarbonat, pH 8,0
gelöst und mit 1 ml aktiviertem (s. o.) Trägermaterial bei 4°C über Nacht (< 16 h)
inkubiert. Anschließend wurde das Gelmaterial mit 0,2 M Ammoniumbicarbonat, pH
8,0 gewaschen. Die verbliebenen aktiven Gruppen des Trägermaterials wurden
durch eine 24-stündige Inkubation in 5 ml 0,2 M Glyzin, pH 8,0 bei 4°C blockiert.
Schließlich wurde die Gelmatrix mit drei Waschzyklen, bestehend aus
alternierenden Inkubationen in PBS, 1 M Na2SO3, pH 7,4, 0,1 M Na-Azetat, pH 4,0
und 0,2 M Glyzin, pH 8,0 für die Affinitätsbindung vorbereitet. Die Matrix wurde in
eine HR 5/5 Säule von Pharmacia gefüllt und mit PBS/0,04% Tween-20 equilibriert.
Zur Reinigung Laminin P1-bindender Antikörper aus den Tierseren wurde das
jeweilige Serum 1: 2 mit PBS/0,04% Tween-20 verdünnt und bei einer Flußrate von
2 ml/min über die Säule geleitet. Anschließend wurde mit Puffer nachgewaschen bis
im UV-Signal (220 nm) des Durchflußmonitors die Grundlinie wieder erreicht wurde.
Die Elution der gebundenen Antikörper erfolgte schließlich durch den Wechsel des
Laufpuffers zu 0,1 M Glycin/HCl, pH 2,7.
Die Analyse der Säulendurchläufe und Säuleneluate erfolgte mit Hilfe eines
Enzymimmunoassays unter Verwendung von immobilisiertem Laminin γ1 III 3-5.
Aus den vier Tierseren konnten durch die beschriebene Affinitätsreinigung
Antikörper gereinigt werden. Die Ausbeute betrug durchschnittlich 0,3 mg pro 50 ml
Serum (im Falle des Serums K2 betrug die Ausbeute lediglich 0,1 mg). Ein Großteil
der Antikörper in allen Seren (<80%) band allerdings nicht an Laminin P1,
vermutlich aufgrund einer zu langsamen Bindungskinetik oder aufgrund einer
ausschließlichen Affinität zur Sequenz des zur Immunisierung verwendeten Peptids.
Die Affinitätschromatographie an Laminin P1-Säulen führt folglich zu einer
selektiven Anreicherung der schnell und stabil bindenden Antikörpervarianten (der
gesuchten Antikörper) aus dem Serum.
Mittels Western Blot wurde nachgewiesen, daß die affinitätsgereinigten Antikörper
ihre Bindungsspezifität zum Laminin P1 bewahrt haben und daß die verschiedenen
Präparationen stärker mit dem nicht reduzierten Laminin P1 reagierten als mit den
durch Reduktion der Disulfide separierbaren linearen Laminin P1-Fragmenten
(Gerl, M. et al. (1991) Eur. J. Biochem. 202: 167-174). Dies ist ein Indiz für eine
konformationsabhängige Komponente in der Bindungsspezifität der Antikörper.
Weiterhin zeigte sich, daß sich die vier Antikörperpräparationen in ihren
Bindungspräferenzen voneinander unterschieden. Die beiden durch Immunisierung
mit Konjugat-1 gewonnenen Antikörperpräparationen K3 und K4 erkannten
identische Laminin P1-Banden nach SDS (Sodiumdodecylsulfat) Gelelektrophorese
der nicht reduzierten Probe. Die beiden Antikörperpräparationen K2 und K905
(Anti-Konjugat-2) zeigten ebenfalls ein zueinander identisches Reaktionsmuster,
allerdings wurden weniger Laminin P1-Banden erkannt als bei den beiden
Anti-Konjugat-1-Antikörperpräparationen.
Beim immunchemischen Nachweis der durch Reduktion und SDS-Gelelektrophorese
separierten Laminin P1-Banden fällt auf daß alle vier Antikörperpräparationen
unterschiedliche Bindungspräferenzen zu Laminin γ1 III 4 enthaltenden Fragmenten
aufwiesen.
Die inhibitorische Aktivität der affinitätsgereinigten Antikörper kann mit einem
"coated tube assay" identifiziert werden, in dem die Bindung von radioaktiv
markiertem Nidogen an Laminin P1 (aus humaner Plazenta) beschichtete Röhrchen
in Anwesenheit der Antikörper gemessen wird.
Rekombinant produziertes humanes Nidogen (35 µg, Beschreibung des Klons,
Kultur- und Reinigungsbedingungen, siehe Mayer, U. et al. (1995) Eur. J. Biochem.
227: 681-686) wurde in 250 µl PBS gelöst und mit 0,405 mCi (= 15 MBq) Na-Jodid
(125I)Lösung (= 1,55 µl, Nordion Europe), 10 µl 0,5 M Na-Phosphat, pH 7,4 sowie 40
µg Chloramin T (N-Chlor-t-Toluolsulfonsäureamid Natriumsalz, Merck) in 100 µl
0,05 M Na-Phosphat, pH 7,4 versetzt. Die Reaktion erfolgte 60 Sekunden bei
Raumtemperatur und wurde durch Zugabe einer Lösung von 40 µg Na-Meta-Bisulfit
(Riedel-de-Haën) in 100 µl 0,05 M Na-Phosphat, pH 7,4 gestoppt. Dies erfolgte in
maximal 30 Sekunden, dann wurde der Ansatz mit 900 µl 1% BSA (Sigma) in PBS
versetzt. Die Abtrennung freier Radioaktivität und überschüssiger Salze erfolgte
durch Siebgelchromatographie mit Hilfe einer PD 10 Säule (Pharmacia). Das in PBS
eluierte jodierte Nidogen wurde gepoolt und so mit 1% BSA/0,05 M
Na-Phosphat/0,01% Na-Azid, pH 7,4 verdünnt, daß eine Konzentration von 50 ng/ml
resultierte.
Reaktionsröhrchen (Greiner, 75×12, No. 115 061) werden mit einer Laminin P1
Lösung, 4 µg/ml in Carbonat Puffer (0,159 g Na2CO3; 0,293 g NaHCO3; 0,02 g NaN3 in
1 Liter destilliertem Wasser), 20 µg/ml BSA (Rinderserumalbumin, Serva) pH 9,2
über Nacht bei 4°C beschichtet. Freie Bindungsstellen werden anschließend durch
2-stündige Inkubation mit 0,5 ml 0,5% BSA in PBS/0,04% Tween-20 blockiert.
In einem Reaktionsgefäß wurden 200 µl jodiertes Nidogen (ca. 10 ng, ca. 40000
counts per min) und 200 µl des Inhibitors (z. B. Peptide, die aus der Domäne γ1 III 4
des Laminins abgeleitet werden können) oder Standards (Laminin γ1 III 3-5) bei
Raumtemperatur geschüttelt. Sowohl der Inhibitor als auch der Standard waren in
PBS/0,04% Tween-20 gelöst. Nach einer Inkubationszeit von 3 Stunden wurden 150
µl aus diesem Ansatz in die gecoateten Röhrchen überführt und weitere 2 Stunden
bei Raumtemperatur inkubiert. Schließlich wurde die Lösung abgekippt, zweimal mit
1 ml PBS/0,04% Tween-20 gewaschen und die gebundene Radioaktivität (Nidogen)
im Gamma-Counter gemessen. Die Menge an gebundenem Nidogen in den
Lösungen mit Inhibitor wurde mit der des Nidogens ohne Inhibitorzusatz in
Beziehung gesetzt.
In den mit Laminin P1 beschichteten Reaktionsgefäßen wurden 150 µl des Inhibitors
(z. B. ein an die Domäne γ1 III 4 des Laminins bindender Antikörper oder ein Peptid,
welches aus der Sequenz des Nidogens abgeleitet werden kann) oder Standards
(rekombinantes Nidogen) für 3 Stunden geschüttelt. Sowohl Inhibitor als auch
Standard waren in PBS/0,04% Tween-20 gelöst. Nach dem Absaugen der Probe
wurde für 2 Stunden 150 µl jodiertes Nidogen (ca. 10 ng, ca. 40000 counts per min)
zugegeben, um den gebundenen Inhibitor zu verdrängen. Schließlich wurde die
Lösung abgekippt, zweimal mit 1 ml PBS/0,04% Tween-20 gewaschen und die
gebundene Radioaktivität (Nidogen) im Gamma-Counter gemessen. Die Menge an
gebundenem radioaktiven Nidogen wurde mit der Inhibitor- bzw.
Standardkonzentration in Beziehung gesetzt.
Bei dieser Assayvariante erfolgte keine Vorinkubation. Es wurden vielmehr 75 P1
jodiertes Nidogen (10 ng) mit 75 µl Inhibitor oder Standard direkt in die gecoateten
Röhrchen pipettiert und 2 Stunden bei Raumtemperatur inkubiert, ansonsten wurde
analog zu den sequentiellen Assayvarianten verfahren.
Für den Standard Laminin γ1 III 3-5 wurde aus zehn unabhängig durchgeführten
Assays eine IC50% von 0,22 nM mit einer Standardabweichung von ±15%
ermittelt. Die IC50% ist als die Stoffkonzentration definiert, die für eine 50%ige
Hemmung der Nidogen-Bindung an Laminin P1 benötigt wird. Mit dem in US
5,493,008 beschriebenen (Equilibrium-)Inhibitionsassay wurde vergleichsweise ein
IC50% von 0,05 nM mit einer Standardabweichung von ±52% erhalten.
Der Tabelle 2 sind die IC50%-Werte der Antikörperpräparationen K3, K905, K1.2,
K2.2 und K3.2 sowie verschiedener freier Peptide zu entnehmen. Die
Antikörperpräparationen K1.2, K2.2 und K3.2 stammen aus einer zweiten
Immunisierungskampagne von Kaninchen mit neuem Konjugat-2 und vergleichbarer
Aufreinigung. Die Ergebnisse belegen die Reproduzierbarkeit des Verfahrens.
Tabelle 2: Inhibition der Laminin/Nidogen-Bindung durch die erfindungsgemäßen
Antikörper
In US 5,493,008 werden für inhibitorische Peptide, die aus der
Nidogen-Bindungsdomäne abgeleitet werden können, IC50%-Werte zwischen 22
nM und 1000 nM angegeben. Diese Werte konnten mit dem gewählten Assay - auf
grund der drastisch verkürzten Inkubationszeiten - nicht erreicht werden; Das
Peptid DNIDPNAVGNL erreichte im hier beschriebenen Assay z. B. nur einen
IC50% = 60000 nM.
Mit dem BIAcore® System der Firma Pharmacia Biosensor können biospezifische
Interaktionen on-line verfolgt werden. Das Prinzip der Messung beruht auf einem
optischen Phänomen (surface plasmon resonance), das durch die auf einem
Goldfilm gebundene Masse beeinflußt wird. Vereinfacht ausgedrückt handelt es sich
um eine miniaturisierte Affinitätschromatographie auf einer Gold-Sensoroberfläche.
Die Menge des spezifisch gebundenen Liganden kann in Form eines
Resonanzsignals bildlich dargestellt werden (Chaiken, I. et al. (1992) Anal. Biochem.
201: 197-201; Karlsson, R. et al. (1992) in: Structure of Antigens; (Ed.: van
Regenmortel). S. 127-148; CRC Press, Boca Raton, Fl.)
Laminin P1 wurde gemäß den Instruktionen des User-Manuals bei einer Konzentration von 200 µg/ml in 10 mnM Na-Acetat, pH 4,0 auf dem Sensorchip immobilisiert. Es resultiert eine Matrix mit 4000 RU gebundenem Laminin P1. Zur Regeneration der Affinitätsmatrix kann ein Doppelimpuls à 4 µl 100 mM HCl durchgeführt werden.
Laminin P1 wurde gemäß den Instruktionen des User-Manuals bei einer Konzentration von 200 µg/ml in 10 mnM Na-Acetat, pH 4,0 auf dem Sensorchip immobilisiert. Es resultiert eine Matrix mit 4000 RU gebundenem Laminin P1. Zur Regeneration der Affinitätsmatrix kann ein Doppelimpuls à 4 µl 100 mM HCl durchgeführt werden.
Bei einer Flußrate von 2 µl/min in HBS Puffer (10 mM HEPES, 3,4 mM EDTA, 150
mM NaCl, 0,005% BIAsurfactant P20; pH = 7,4) band Nidogen (20 µg/ml) mit einer
parabolischen Sättigungskinetik an Laminin P1, die affinitätsgereinigten
Antikörperpräparationen K905 und K3 in einer linearen Abhängigkeit zum Antigen.
Die Tatsache, daß nach 1400 Sekunden noch kein Übergang zur
Gleichgewichtseinstellung zu beobachten war, kann Ausdruck dafür sein, daß die
spezifische Peptidsequenz des Laminin P1, welche für die Nidogen-Bindung
verantwortlich ist, für die Antikörper gut zugänglich war. Die Antikörper banden an
diese Sequenz unabhängig davon, ob sie in der biologisch aktiven oder in einer
davon unterschiedlichen Konformation vorlag. Beleg dafür ist die Beobachtung, daß
das Nidogen bereits nach einer Bindung von 600 RU einen deutlichen Übergang in
die Sättigungsphase aufwies. Es lagen also offensichtlich nicht alle immobilisierten
Laminin P1 Moleküle in einer für das Nidogen erkennbaren Struktur vor, da die
theoretische Maximalsättigung der Schicht von 2500 RU nicht erreicht wurde. Diese
wäre aber von den beiden Antikörpern nach langer Kontaktzeit erreicht worden.
Auffallend ist, daß die Probe K905 zehnfach höher konzentriert eingesetzt werden
(320 µg/ml) mußte, um eine mit K3 (33 µg/ml) vergleichbare Bindungsrate zu
erreichen. Die Bindung von K905 zum Laminin P1 war hingegen stabiler als die von
K3, denn die Dissoziationsrate von K905 (erkennbar ab dem Zeitpunkt des
Wechsels zum HBS Puffer: 1500 Sekunden) war erheblich langsamer als die der
Präparation K3.
Diese Befunde erklären die in den Inhibitionsassays festgestellten Unterschiede
zwischen K3 und K905:
- - Die Antikörperpräparation K3 inhibiert die Laminin-Nidogen-Bindung besser als K905, weil sie durch eine schnellere Assoziationskinetik charakterisiert ist.
- - Die Antikörperpräparation K3 inhibiert auch dann, wenn sie simultan mit dem Nidogen in den mit Laminin P1 beschichteten Röhrchen inkubiert wird, weil sie bei einer zum Nidogen vergleichbaren Konzentration eine gute Assoziationskinetik hat.
- - Die Antikörperpräparation K905 kann nur in der Assayvariante "sequentielle Inhibition" inhibieren, weil sie durch eine langsame Dissoziationsrate charakterisiert ist und deshalb von dem später zugesetzten Nidogen nicht mehr so gut vom Antigen verdrängt werden kann. Bei einer gleichzeitigen Konkurrenz um die Bindungsstelle ist K905 aufgrund der sehr langsamen Assoziationskinetik dem Nidogen unterlegen.
In Westen Blot-Analysen wurde die Interaktion der Antikörperpräparationen K3 und
K905 mit dem Konjugat-2 und dem Ovalbumin untersucht. Hierzu wurden die
Antigene mit Hilfe von 4-12%NuPAGE™ Gelen (NOVEX™, San Diego, CA) unter
Zuhilfenahme eines MOPS-Puffers gemäß Instruktionsanleitung von NOVEX™
aufgetrennt und anschließend unter Verwendung von NuPAGE™ Transferpuffer
(NOVEX™) auf Nitrozellulose-Membranen übertragen. Nach Blockierung der freien
Bindungsstellen auf der Membran mit 1 µg/ml Polyvinylalkohol (1 min) wurden die
Antigene mit den Testantikörpern inkubiert. Der Nachweis von gebundenen
Antikörpern erfolgte dann mit Hilfe von Anti-Kaninchen IgG-Antikörpern, an die das
Enzym alkalische Phosphatase kovalent gebunden war.
Es zeigte sich, daß die affinitätsgereinigten Antikörper ausschließlich an das Peptid
binden, denn eine Interaktion mit dem Trägerprotein Ovalbumin ist nicht
nachweisbar. Eine Reaktion mit den blaugefärbten Markern des "See Blue"
Standards (NOVEX™) konnte ebenfalls nicht beobachtet werden.
Weiterhin wurde nachgewiesen, daß sowohl K3 als auch K905 mit Laminin und
Lamininderivaten unterschiedlicher Spezies (Laminin aus der humanen Plazenta
sowie aus dem Dottersack der Ratte (Calbiochem), Laminin P1 aus der humanen
Plazenta sowie dem EHS Tumor der Maus, rekombinant hergestelltes Maus-Laminin
γ1 III 3-5) reagieren. Dies belegt die Bindung der Antikörper an die konservierte
Sequenz innerhalb der Nidogen-Bindungsdomäne. Beide Antikörperpräparationen
zeigten keine Kreuzreaktivität zum humanen Nidogen und zum humanen Kollagen
Typ IV. Dies ist die Voraussetzung für die eindeutige Verwendung der
beschriebenen Antikörper als Nidogen-Antagonisten.
Zur Gewinnung monoklonaler Antikörper werden geeignete Wirbeltiere, bevorzugt
Mäuse oder Ratten, nach Standardverfahren z. B. mit Laminin, Laminin P1, Laminin
γ1 III 3-5, Laminin γ1 III 4 oder mit den im Beispiel 2 aufgeführten Konjugaten
immunisiert. Im Falle einer spezifischen Immunreaktion des Antiserums werden
gemäß Standardverfahren MAK-produzierende Hybridome gewonnen.
Das Screening nach den gewünschten Antikörpern bzw. den entsprechenden
Hybridoma-Klonen ermöglichen u. a. Bindungsassays (z. B. Dot Blot oder Western
Blot mit Laminin γ1 III 3-5 und/oder Laminin γ1 III 4) sowie vor allem auch die im
Beispiel 7 beschriebenen Inhibitionsassays. Die selektierten Klone stellen eine
Quelle für die Synthese großer Mengen der erfindungsgemäßen Antikörper dar.
Zur Reinigung der gewünschten Antikörper können übliche Verfahren eingesetzt
werden, wie z. B. die Bindung an Protein G oder A. Bevorzugt erfolgt jedoch eine
Affinitätschromatographie an Laminin P1-Säulen. Dieser Reinigungsschritt erlaubt,
wie im Falle der weiter oben beschriebenen polyklonalen Antikörper, die Auswahl
und selektive Anreicherung der monoklonalen Antikörper mit den besten
Bindungskonstanten.
Claims (29)
1. Antikörper oder Teil desselben, dadurch gekennzeichnet, daß er an die Nidogen-Bindungsdomäne
des Laminins bindet.
2. Antikörper oder Teil desselben nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß
er an die Laminin γ1 III 4-Domäne bindet.
3. Antikörper oder Teil desselben nach Anspruch 1 oder 2, dadurch
gekennzeichnet, daß er an den hochkonservierten Bereich des Loops a bzw. der
Loops a und c der Laminin γ1 III 4-Domäne bindet.
4. Antikörper oder Teil desselben nach mindestens einem der Ansprüche 1-3,
dadurch gekennzeichnet, daß er mindestens an ein Peptid gemäß Tabelle 1
bindet.
5. Antikörper nach einem der Ansprüche 1-4 erhältlich durch die Immunisierung
immunkompetenter Wirbeltiere, wie z. B. Kaninchen, Mäuse, Schafe, Ziegen,
Meerschweinchen, Ratten u. Hühner, mit Laminin γ1 III 4 und/oder mit Peptiden,
die wesentliche Nidogen-Bindungsstellen enthalten aber nicht die vollständige
Aminosäuresequenz der γ1 III 4-Domäne des Laminins, als Immunisierungs
antigen.
6. Antikörper nach Anspruch 5, dadurch gekennzeichnet, daß eines der oder beide
Peptide gemäß Tabelle 1 als Immunisierungsantigen verwendet werden.
7. Antikörper nach Anspruch 5 oder 6, dadurch gekennzeichnet, daß monoklonale
Antikörper produzierende Hybridoma-Zellen erzeugt werden.
8. Antikörper nach mindestens einem der Ansprüche 5-7, dadurch gekennzeichnet,
daß er aus Antikörper-enthaltendem Material, wie z. B. Antiserum des
immunisierten Tieres, Hybridoma-Zellkulturüberstand, Aszites oder Zellen,
gereinigt wird, z. B. per Affinitätschromatographie.
9. Antikörper oder Teil desselben nach mindestens einem der Ansprüche 1-8,
dadurch gekennzeichnet, daß er die Laminin/Nidogen-Interaktion inhibiert.
10. Antikörper oder Teil desselben nach einem der Ansprüche 1-9, dadurch
gekennzeichnet, daß es sich hierbei um einen chimären, humanisierten, bi- oder
oligospezifischen Antikörper bzw. um ein Antikörperanalogon handelt.
11. Zelle oder Zellinie, dadurch gekennzeichnet, daß diese Antikörper oder
Antikörperteile gemäß einem der Ansprüche 1-10 produziert.
12. Verfahren zur Herstellung von Antikörpern gemäß einem der Ansprüche 1-10,
dadurch gekennzeichnet, daß immunkompetente Wirbeltiere, wie z. B. Kaninchen,
Mäuse, Schafe, Ziegen, Meerschweinchen, Ratten u. Hühner, mit Peptiden,
die wesentliche Nidogen-Bindungsstellen des Laminins enthalten, als
Immunisierungsantigen immunisiert werden.
13. Verfahren nach Anspruch 12, dadurch gekennzeichnet, daß Laminin P1 und/oder
Laminin γ1 III 3-5 und/oder Laminin γ1 III 4 als Immunisierungsantigen benutzt
werden.
14. Verfahren nach Anspruch 12, dadurch gekennzeichnet, daß Peptide, die
wesentliche Nidogen-Bindungsstellen enthalten aber nicht die vollständige
Aminosäuresequenz der γ1 III 4-Domäne des Laminins, als Immunisierungs
antigen benutzt werden.
15. Verfahren nach Anspruch 12 oder 14, dadurch gekennzeichnet, daß eines der
oder beide Peptide gemäß Tabelle 1 als Immunisierungsantigen verwendet
werden.
16. Verfahren nach einem der Ansprüche 12-15, dadurch gekennzeichnet, daß das
Immunisierungsantigen an Träger wie z. B. Proteine oder Polymere gekoppelt ist.
17. Verfahren nach einem der Ansprüche 12-16, dadurch gekennzeichnet, daß
monoklonale Antikörper produzierende Hybridoma-Zellen erzeugt werden.
18. Verfahren nach einem der Ansprüche 12-17, dadurch gekennzeichnet, daß der
Antikörper aus Antikörner-enthaltendem Material, wie z. B. Antiserum des
immunisierten Tieres, Hybridoma-Zellkulturüberstand, Aszites oder Zellen,
gereinigt wird, z. B. per Affinitätschromatographie.
19. Verfahren nach Anspruch 18, dadurch gekennzeichnet, daß eine Laminin
P1-Affinitätsmatrix eingesetzt wird.
20. Antikörper oder Teil desselben gemäß einem der Ansprüche 1-10 zur
Verwendung als Arzneimittel.
21. Arzneimittel enthaltend einen oder mehrere Antikörper oder Antikörperteile
gemäß mindestens einem der Ansprüche 1-10.
22. Verwendung von einem oder mehrerer Antikörper oder Antikörperteile nach
mindestens einem der Ansprüche 1-10 zur Herstellung eines Arzneimittels zur
Behandlung von Krankheiten, die durch eine vermehrte oder unerwünschte
Synthese von Basalmembranen charakterisiert sind.
23. Verwendung von einem oder mehrerer Antikörper oder Antikörperteile nach
Anspruch 22 zur Herstellung eines Arzneimittels zur Behandlung von Fibrosen,
allen Formen von diabetischen Spätkomplikationen, die von Verdickungen der
Basalmembran begleitet sind, der Arteriosklerose sowie alle Krankheiten, bei
denen eine Angiogenese zur Verschlechterung des klinischen Bildes beiträgt.
24. Verwendung von einem oder mehrerer Antikörper oder Antikörperteile nach
Anspruch 22 oder 23 zur Herstellung eines Arzneimittels zur Behandlung der
alkoholischen Leberfibrose, der Lungenfibrose, von Krebserkrankungen, der
diabetischen Retinopathie sowie Erkrankungen mit einer starken entzündlichen
Komponente wie z. B. rheumatoide Arthritis, Osteoarthritis, Vaskulitis,
Haemangiome und Psoriasis.
25. Antikörper oder Teil desselben gemäß einem der Ansprüche 1-10 zur
Verwendung als Diagnostikum.
26. Diagnostikum enthaltend einen oder mehrere Antikörper oder Antikörperteile
gemäß mindestens einem der Ansprüche 1-10.
27. Verwendung von einem oder mehrerer Antikörper oder Antikörperteile nach
mindestens einem der Ansprüche 1-10 zur Herstellung eines Diagnostikums
zum Nachweis von γ1-enthaltenen Lamininisoformen in biologischen Proben,
z. B. in Körperflüssigkeiten wie Blut, Serum, Plasma, Urin, Speichel oder
Liquor, sowie in Geweben.
28. Antikörper oder Teil desselben gemäß einem der Ansprüche 1-10 zur
Verwendung als Hilfsmittel in biologischen und pharmakologischen Modellen
zur Entwicklung und Bewertung von die Laminin/Nidogen-Interaktion
beeinflussenden Stoffen.
29. Verwendung von einem oder mehrerer Antikörper oder Antikörperteile nach
mindestens einem der Ansprüche 1-10 in biologischen und
pharmakologischen Modellen zur Entwicklung und Bewertung von die
Laminin/Nidogen-Interaktion beeinflussenden Stoffen.
Priority Applications (18)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
DE19701607A DE19701607A1 (de) | 1997-01-17 | 1997-01-17 | Anitkörper, die an die Nidogen-Bindungsdomäne des Laminins binden, deren Herstellung und Verwendung |
AU59853/98A AU5985398A (en) | 1997-01-17 | 1997-12-22 | Antibodies that bind to the nidogen-binding domain of laminin, their production and use |
HU0001808A HUP0001808A3 (en) | 1997-01-17 | 1997-12-22 | Antibodies that bind to the nidogen-binding domain of laminin, their production and use |
EP97954750A EP0954535A1 (de) | 1997-01-17 | 1997-12-22 | Antikörper, die an die nidogen-bindungsdomäne des laminins binden, deren herstellung und verwendung |
TR1999/01648T TR199901648T2 (xx) | 1997-01-17 | 1997-12-22 | Laminin'in nidojen domenine ba�lanan antikorlar�n �retilmesi ve kullan�m�. |
PL97334956A PL334956A1 (en) | 1997-01-17 | 1997-12-22 | Antibodies being bound to a nitrogen bonding laminine domain, method of obtaining them and their application |
JP53230298A JP2001509020A (ja) | 1997-01-17 | 1997-12-22 | ラミニンのニドゲン結合ドメインに結合する抗体、その調製および使用 |
IL13080897A IL130808A0 (en) | 1997-01-17 | 1997-12-22 | Antibodies that bind to the nidogen-binding domain of laminin their production and use |
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