DE4118770A1 - Verfahren zur herstellung von antikoerpern gegen instabile antigene, antikoerper gegen die aktive form der anaphylatoxine und diese herstellende zellinien und verwendung der antikoerper - Google Patents
Verfahren zur herstellung von antikoerpern gegen instabile antigene, antikoerper gegen die aktive form der anaphylatoxine und diese herstellende zellinien und verwendung der antikoerperInfo
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Description
Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zur
Herstellung von Antikörpern gegen instabile Antigene,
insbesondere von Antikörpern gegen die aktive Form von
Anaphylatoxinen, Zellinien, die diese Antikörper
herstellen, Antikörper gegen die aktive Form von
Anaphylatoxinen, deren Verwendung und eine pharmazeutische
Zusammensetzung, enthaltend die Antikörper.
Die Herstellung von Antikörpern gegen Antigene durch
Immunisierung eines Wirtsorganismus mit dem entsprechenden
Antigen ist ein dem Fachmann geläufiges Verfahren. Nach
der Immunisierung des Wirtsorganismus kann ein
antigenspezifisches Antiserum, das eine Vielzahl
verschiedener, gegen das zur Immunisierung verwendete
Antigen gerichtete Antikörper enthält, aus dem Blut des
immunisierten Tieres hergestellt werden, oder es können
monoklonale Antikörper von Hybridomen, die durch Fusion
von Milzzellen des immunisierten Tieres mit Myelomzellen
nach gängigen Verfahren erhalten werden, isoliert werden.
Die herkömmlichen Verfahren zur Herstellung von
Antikörpern bereiten jedoch große Schwierigkeiten, wenn
das zur Immunisierung verwendete Antigen instabil ist.
Unter instabilen Antigenen werden im folgenden solche
Antigene verstanden, bei denen das Epitop, gegen das eine
Antikörperantwort erwünscht ist, in dem zu immunisierenden
Wirtsorganismus rasch verändert wird. Dies kann z. B. durch
enzymatischen Umbau des Antigens erfolgen, so daß das
entsprechende Epitop dem Immunsystem nicht für eine
Zeitspanne präsentiert werden kann, die ausreicht, um eine
Antikörperantwort dagegen zu induzieren.
Solche instabilen Antigene stellen beispielsweise die
aktiven Formen der Anaphylatoxine dar. Diese Peptide, die
im Rahmen der Komplementaktivierung durch proteolytische
Spaltung der Komplementfaktoren C3, C4 bzw. C5 erhalten
werden, tragen die Bezeichnung C3a, C4a bzw. C5a. Die
unmittelbar nach der proteolytischen Spaltung erhaltenen
aktiven Formen von C3a, C4a bzw. C5a werden in vivo unter
dem Einfluß von Carboxypeptidasen rasch zu inaktiven
Varianten umgewandelt.
Im Falle des Anaphylatoxins C3a erfolgt die Inaktivierung
durch Abspaltung der N-terminalen Aminosäure Arginin,
wodurch die inaktive Variante C3a-desArg entsteht.
Die aktiven Formen der Anaphylatoxine C3a, C4a und C5a
können an Rezeptoren verschiedener Zelltypen, z. B. von
Granulozyten, Thrombozyten oder Lymphozyten, binden und
dadurch deren Funktionszustand ändern. Die durch die
Anaphylatoxine ausgelösten Reaktionen können zu massiven
Organschädigungen führen. Solche Schädigungen werden nicht
durch die inaktiven, d. h. die am C-Terminus verkürzten
Varianten der Anaphylatoxine hervorgerufen.
Somit ist es für die Diagnostik von durch Anaphylatoxinen
hervorgerufenen Krankheitsbildern von besonderem
Interesse, die aktiven Anaphylatoxine in Anwesenheit der
inaktiven Formen und der nativen Komplementfaktoren
selektiv nachzuweisen. Weiterhin ist es aus
therapeutischen Überlegungen wünschenswert, ggf. eine
übermäßige Anaphylatoxin-Aktivität, vermittelt durch die
aktive Form von C3a, C4a bzw. C5a, selektiv durch den
Einsatz geeigneter Antikörper zu hemmen oder
auszuschalten.
Die Erzeugung von Antikörpern, die spezifisch die aktive
Form, beispielsweise von C3a, binden, wird jedoch dadurch
erschwert, daß sich zum einen das aktive C3a, das den
Aminosäuren 1 bis 77 der α-Kette des Komplementfaktors
C3 entspricht, von der inaktiven Form nur durch die der
inaktiven Form fehlende Aminosäure Arginin an Position 77
unterscheidet. Zum anderen wird aktives C3a in vivo rasch
unter dem Einfluß der ubiquitären Carboxypeptidase N in
die inaktive Form C3a-desArg umgewandelt, so daß die
Erzeugung von Antikörpern gegen den Carboxyterminus von
C3a, enthaltend den Arginin-Rest an Position 77, mit Hilfe
herkömmlicher Immunisierungsverfahren nur schwer oder
überhaupt nicht möglich ist.
Aufgabe der vorliegenden Erfindung ist es, ein Verfahren
zur Verfügung zu stellen, mit dem Antikörper gegen
instabile Antigene erhalten werden können.
Weitere Aufgaben bestehen in der Bereitstellung von
Anti-Anaphylatoxin-Antikörpern, die spezifisch für die
aktive Form des Anaphylatoxins C3a, C4a bzw. C5a sind, von
Zellinien, die diese Antikörper herstellen und von einer
pharmazeutischen Zusammensetzung zur Verwendung bei
gesteigerter Komplementaktivierung.
Die erste Aufgabe wird erfindungsgemäß gelöst durch ein
Verfahren zur Herstellung von Antikörpern, bei dem
mindestens ein instabiles Antigen zur Immunisierung direkt
mit Milzzellen in Kontakt gebracht wird.
Als instabile Antigene werden, wie oben beschrieben,
solche Antigene bezeichnet, die in dem Wirtsorganismus
nach herkömmlicher Immunisierung nicht ausreichend stabil
sind, damit der verwendete Wirtsorganismus eine
Immunantwort gegen diese aufbauen kann. Unter
herkömmlicher Immunisierung werden dabei Immunisierungen
verstanden, bei denen das Antigen nach Applikation in den
Wirtsorganismus zunächst systemisch verteilt wird, bevor
es zu den immunkompetenten Organen des Empfängerorganismus
gelangt. Während dieses Verteilungsvorgangs können
beispielsweise Enzyme das eingebrachte Antigen
metabolisieren, so daß dessen Struktur verändert ist,
bevor es zu dem immunkompetenten Organ gelangt. Als
instabile Antigene werden neben der oben beschriebenen
aktiven Form der Anaphylatoxine sämtliche antigene
Verbindungen angesehen, die einem raschen Umbau,
beispielsweise durch Enzyme, nach Einbringen in einen
Organismus unterliegen.
Die Erzeugung von Antikörpern gegen instabile Antigene
läßt sich dennoch bewerkstelligen, wenn, wie gemäß der
vorliegenden Erfindung, das Antigen direkt mit Milzzellen
in Kontakt gebracht wird. Dieser direkte Kontakt mit den
immunkompetenten Zellen umgeht die Notwendigkeit einer
systemischen Verteilung des Antigens, die bei
herkömmlichen Immunisierungen durch Injektion des Antigens
in die Blutbahn des zu immunisierenden Tieres zwangsläufig
erfolgt und die das Antigen anfällig macht gegenüber
Umbauprozessen.
In dem erfindungsgemäßen Verfahren stellen Proteine und
Peptide vorzugsweise verwendete Antigene dar. Besonders
bevorzugte Peptide sind die Komplementärfaktoren C3a, C4a
und C5a in ihrer aktiven Form.
Bei der Herstellung von spezifischen Antikörpern für C3a
ist es bevorzugt, die Aminosäuren der Positionen 70 bis 77
von C3a zu verwenden, wobei diese Sequenz von
8 Aminosäuren zu Immunisierung an einen Träger gekoppelt
wird. Als Träger kommen übliche hochmolekulare
Verbindungen, wie beispielsweise KLH, in Frage.
Vorzugsweise wird ein synthetisches Oktapeptid mit der
obigen Aminosäuresequenz verwendet. Das synthetische
Oktapeptid besitzt, wenn es die menschliche
C3a-Sequenz von Position 70 bis 77 darstellt, die
folgende Sequenz:
NH₂-Ala-Ser-His-Leu-Gly-Leu-Ala-Arg-COOH.
Das vollständige Peptid oder Teile des Peptids können in
dem erfindungsgemäßen Verfahren verwendet werden, jedoch
sollten die 3 C-terminalen Aminosäuren mindestens
Bestandteil des zur Immunisierung verwendeten Antigens
sein.
Bei einer bevorzugen Ausführungsform erfolgt die
Injektion des Antigens, das gekoppelt an den Träger auch
als Immunogen bezeichnet wird, direkt in die Milz des
verwendeten narkotisierten Tieres, wobei Immunogenmengen
verwendet werden, wie sie bei der herkömmlichen
Immunisierung eingesetzt werden. Die Entnahme der Milz
erfolgt vorzugsweise drei bis vier Tage nach erfolgter
Immunogeninjektion, und die Fusion der Milzzellen mit
Myelomzellen zur Herstellung von monoklonale Antikörper
erzeugenden Hybridomen erfolgt auf herkömmliche Weise.
Die zur Immunisierung verwendeten Tiere können zu
üblichen, zur Antikörperherstellung verwendeten Tierarten
gehören, bevorzugt sind Mäuse.
Alternativ zu der direkten Injektion des Antigens in die
Milz des lebenden Tieres ist es möglich, das Antigen in
vitro mit Milzzellen in Kontakt zu bringen. Dabei wird
das Antigen mit Milzzellen in Gewebekultur
zusammengebracht, und anschließend werden die Milzzellen
auf herkömmliche Weise mit Myelomzellen zu Hybridomen
fusioniert. Jedoch ist wegen der erhöhten
Kontaminationsanfälligkeit der in-vitro-Immunisierung
die Immunisierung durch Injektion in die Milz zu
bevorzugen.
Die weitere Aufgabe der Bereitstellung von
Anti-Anaphylatoxin-Antikörpern wird erfindungsgemäß gelöst
durch Antikörper, die spezifisch sind für die aktive Form
von Anaphylatoxinen und die erhältlich sind nach dem oben
beschriebenen Verfahren. Bevorzugte Antikörper sind
spezifisch für die aktive Form von C3a, d. h. sie reagieren
nicht mit der C-terminal verkürzten, inaktiven Form C3a-
desArg, und weiterhin reagieren sie nicht mit dem nativen
Komplementfaktor C3 bzw. mit der nativen α- bzw.
β-Kette von C3. Diese Antikörper binden an den
C-terminalen Bereich des C3a, insbesondere an den Bereich
der Aminosäurepositionen 70 bis 77. Besonders bevorzugt
sind monoklonale, C3a-spezifische Antikörper.
Weiterhin stellt die vorliegende Erfindung Zellinien
bereit, die für die aktive Form der Anaphylatoxine C3a,
C4a bzw. C5a spezifische Antikörper herstellen. Eine
bevorzugte Ausführungsform stellt die Zellinie dar, die
einen Antikörper herstellt, der spezifisch ist für die
aktive Form von C3a und der an den Bereich von
Aminosäureposition 70 bis 77 des C3a bindet.
Weiterhin stellt die vorliegende Erfindung eine
pharmazeutische Zusammensetzung bereit, die einen der
obigen erfindungsgemäßen Antikörper und weiterhin übliche
Hilfs- und Trägerstoffe enthält. Eine bevorzugte
Zusammensetzung liegt in flüssiger Form vor, die für die
intravenöse Injektion geeignet ist.
Die erfindungsgemäßen Antikörper finden als Therapeutikum
bei gesteigerter Komplementaktivierung Anwendung. Die
Antikörper können selektiv die Bindung von aktiven
Anaphylatoxinen an ihre Rezeptoren auf Gewebezellen
blockieren. Im Falle von C3a ist der Argininrest an
Position 77 notwendig, damit eine Bindung von C3a an seine
Rezeptoren erfolgt. Die erfindungsgemäßen C3a-spezifischen
Antikörper binden an den gleichen Abschnitt von C3a, der
auch für die Rezeptorbindung verantwortlich ist, d. h. an
die Aminosäuren der Positionen 70 bis 77. Somit können
diese Antikörper die C3a-Rezeptorbindung spezifisch
blockieren und somit die Folgereaktionen aus der
C3a-Bindung an seine Rezeptoren blockieren bzw. teilweise
hemmen.
Neben dieser therapeutischen Anwendungsmöglichkeit sind
die erfindungsgemäßen Antikörper ebenfalls für
diagnostische Zwecke ausgezeichnet geeignet. Die für die
aktive Form der Anaphylatoxine spezifischen Antikörper
erlauben deren qualitative und quantitative Bestimmung in
biologischem Material, das neben den aktiven Formen auch
die inaktiven Formen und die nativen Komplementfaktoren
enthält. Die selektive Erfassung der aktiven Form der
Anaphylatoxine erlaubt eine genauere Ermittlung
bestehender Krankheitsbilder, an deren Entstehung aktive
Anaphylatoxine beteiligt sind. Insbesondere im Falle von
C3a erlaubt die spezifische Detektion von aktivem C3a,
ohne das inaktive C3a-desArg mitzuerfassen, eine genauere
Diagnose, als es mit den bisher vorhandenen Antikörpern
möglich war.
Die folgenden Beispiele erläutern die Erfindung.
Zunächst wurde das synthetische Oktapeptid mit der Sequenz
NH₂-Ala-Ser-His-Leu-Gly-Leu-Ala-Arg-COOH nach der Methode
von R. B. Merrifield (J. Amer. Chem. 85, Seiten 2148 bis
2155, 1963) hergestellt. An das C3a-spezifische Oktapeptid
wurde ein zusätzlicher Cystein-Rest angefügt, über den
nach den üblichen Methoden mit Hilfe des
heterobifunktionellen Reagens MBS
(m-Maleimidobenzoyl-N-hydroxysuccinimidester) das Peptid
nach üblichen Methoden an das Trägerprotein KLH (Keyhole
Limpet Haemocyanine) gekoppelt wurde.
Das unter a) hergestellte Peptid-Trägerkonjugat wurde zur
Immunisierung wie folgt verwendet: Eine Maus wurde auf
übliche Weise subkutan narkotisiert mit 0,31 mg
Ketanest-Base pro g Körpergewicht. Anschließend wurden
1,2 mg/g Körpergewicht Atropin subkutan injiziert. Nach
Entfernung der Haare und Desinfektion der Hautoberfläche
erfolgte eine Inzision mit einer Länge von etwa 10 mm im
Bereich der Milzposition. Anschließend erfolgte eine
Inzision des Peritoneums von etwa der gleichen Länge. Dann
wurde die Milz einschließlich des Fett- und Bindegewebes
vorsichtig an die Körperoberfläche mit Hilfe stumpfer
Pinzetten bewegt, ohne dabei Gefäße zu verletzen. Nach
einmaliger Injektion des Immunogens (100 µg Konjugat,
gelöst in 70 µl Hanks-Salzlösung) in die Milz einer
20-24 g schweren Maus wurde die Milz in die vorherige Lage
gebracht, und Abdomen und Haut jeweils separat vernäht.
Zum Herstellen antikörperproduzierender Hybridome wurde
die Milz, der, wie unter b) beschrieben, immunisierten
Maus drei bis vier Tage nach der Injektion des Immunogens
dem getöteten Tier entnommen, und die Fusion der
Milzzellen mit Myelomzellen erfolgte nach üblichen
Methoden.
Die im Selektivmedium wachsenden Hybridome wurden auf
Antikörper getestet, die spezifisch mit gereinigtem C3a
reagieren, und die nicht mit C3a-desArg bzw. dem nativen
Komplementfaktor C3 reagierten. Die einzelnen Stufen der
Selektion erfolgten nach üblichen Methoden. Dieses
Selektionsschema lieferte ein Hybridom, das einen
C3a-spezifischen Antikörper herstellt.
Die Überprüfung der Antikörperspezifität erfolgte anhand
eines bekannten ELISA-Systems. Der erfindungsgemäße
Antikörper der Klasse IgM reagierte selektiv mit C3a, aber
nicht mit C3a-desArg. Weiterhin reagierte er nicht mit
nativem C3. Ferner zeichnete sich der Antikörper dadurch
aus, daß er mit dem zur Immunisierung verwendeten Konjugat
aus KLH und dem Oktapeptid aus den Aminosäuren 70 bis 77
des C3a reagierte, aber nicht mit einem Konjugat aus KLH
und dem Oktapeptid der Aminosäuren 69 bis 76 des C3a.
Ferner reagierte der erfindungsgemäße Antikörper nicht mit
KLH alleine. Der Antikörper hemmte wirksam die
C3a-Funktion in einem funktionellen In-vitro-Assay, dem
ATP-Freisetzungstest an Thrombozyten. Der erfindungsgemäße
Antikörper bewirkt eine 90%ige Hemmung der
C3a-Aktivität.
Diese Tests zeigen, daß der erfindungsgemäße Antikörper
spezifisch mit dem Arginin-haltigen C-Terminus des aktiven
C3a reagiert. Da fast sämtliche C3a-Funktionen abhängig
sind von dem Vorhandensein dieses C-terminalen Arginins,
bietet der erfindungsgemäße Antikörper eine ausgezeichnete
Möglichkeit, die C3a-Funktion in-vivo zu beeinflussen, wie
auch die C3a-Anwesenheit in vitro qualitativ und
quantitativ, ohne vorherige spezielle
Probenaufbereitungsmaßnahmen zur Entfernung von inaktivem
C3a bzw. nativem C3, zu bestimmen.
Claims (19)
1. Verfahren zur Herstellung von Antikörpern, dadurch
gekennzeichnet, daß mindestens ein instabiles Antigen zur
Immunisierung direkt mit Milzzellen in Kontakt gebracht
wird.
2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet,
daß Antigene eingesetzt werden, die im Organismus des zur
Antikörperherstellung verwendeten Tieres einer raschen
enzymatischen Metabolisierung unterliegen.
3. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 oder 2, dadurch
gekennzeichnet, daß als Antigene Proteine
und/oder Peptide verwendet werden.
4. Verfahren nach Anspruch 3, dadurch gekennzeichnet,
daß die aktive Form der Anaphylatoxine C3a, C4a und/
oder C5a verwendet wird.
5. Verfahren nach Anspruch 4, dadurch gekennzeichnet,
daß das Fragment von Aminosäureposition 70 bis 77 von
menschlichem C3a ganz oder teilweise, gekoppelt an einen
Träger, verwendet wird.
6. Verfahren nach Anspruch 5, dadurch gekennzeichnet,
daß ein synthetisches Oktapeptid mit den
Aminosäuren entsprechend den Aminosäuren 70 bis
77 des menschlichen C3a verwendet wird.
7. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 6, dadurch
gekennzeichnet, daß das Antigen mit den Milzzellen
dadurch in Kontakt gebracht wird, daß es in die Milz
des zur Antikörperherstellung verwendeten Tieres
injiziert wird.
8. Verfahren nach Anspruch 7, dadurch gekennzeichnet, daß
die Milz 3 bis 4 Tage nach der Injektion mit dem Antigen
entnommen wird, und die Milzzellen auf herkömmliche Weise
mit Myelomzellen zur Herstellung von Hybridomen fusioniert
werden.
9. Anti-Anaphylatoxin-Antikörper, dadurch gekennzeichnet,
daß sie spezifisch für die aktive Form des Anaphylatoxins
und erhältlich nach einem Verfahren nach einem der
Ansprüche 1 bis 8 sind.
10. Antikörper nach Anspruch 9, dadurch gekennzeichnet,
daß sie spezifisch sind für die aktive Form von C3a.
11. Antikörper nach Anspruch 10, dadurch gekennzeichnet,
daß sie an den C-terminalen Bereich des C3a binden.
12. Antikörper nach Anspruch 11, dadurch gekennzeichnet,
daß sie an den Bereich von Aminosäureposition 70 bis 77
des C3a binden.
13. Antikörper nach Anspruch 12, dadurch gekennzeichnet,
daß sie monoklonal sind.
14. Zellinie, dadurch gekennzeichnet, daß sie Antikörper
nach Anspruch 9 herstellt.
15. Zellinie nach Anspruch 14, dadurch gekennzeichnet, daß
sie einen Antikörper herstellt, der spezifisch ist für die
aktive Form von C3a und der an den Bereich von
Aminosäureposition 70 bis 77 des C3a bindet.
16. Pharmazeutische Zusammensetzung, dadurch
gekennzeichnet, daß sie Antikörper nach einem der
Ansprüche 9 bis 13 und übliche Hilfs- und Trägerstoffe
enthält.
17. Pharmazeutische Zusammensetzung nach Anspruch 18,
dadurch gekennzeichnet, daß sie in flüssiger Form
vorliegt.
18. Verwendung der Antikörper nach einem der Ansprüche 9
bis 13 zur Herstellung eines Medikaments bei gesteigerter
Komplementaktivierung.
19. Verwendung der Antikörper nach einem der Ansprüche 9
bis 13 zur quantitativen Bestimmung der aktiven Form der
Anaphylatoxine.
Priority Applications (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
DE19914118770 DE4118770A1 (de) | 1991-06-07 | 1991-06-07 | Verfahren zur herstellung von antikoerpern gegen instabile antigene, antikoerper gegen die aktive form der anaphylatoxine und diese herstellende zellinien und verwendung der antikoerper |
Applications Claiming Priority (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
DE19914118770 DE4118770A1 (de) | 1991-06-07 | 1991-06-07 | Verfahren zur herstellung von antikoerpern gegen instabile antigene, antikoerper gegen die aktive form der anaphylatoxine und diese herstellende zellinien und verwendung der antikoerper |
Publications (1)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
DE4118770A1 true DE4118770A1 (de) | 1992-12-10 |
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ID=6433428
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
DE19914118770 Withdrawn DE4118770A1 (de) | 1991-06-07 | 1991-06-07 | Verfahren zur herstellung von antikoerpern gegen instabile antigene, antikoerper gegen die aktive form der anaphylatoxine und diese herstellende zellinien und verwendung der antikoerper |
Country Status (1)
Country | Link |
---|---|
DE (1) | DE4118770A1 (de) |
Cited By (1)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
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EP0300740A2 (de) * | 1987-07-20 | 1989-01-25 | Cefem A/S | Monoklonale Antikörper gegen das Komplement C5A |
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1991
- 1991-06-07 DE DE19914118770 patent/DE4118770A1/de not_active Withdrawn
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Legal Events
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---|---|---|---|
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8130 | Withdrawal |