DE4118770A1 - Verfahren zur herstellung von antikoerpern gegen instabile antigene, antikoerper gegen die aktive form der anaphylatoxine und diese herstellende zellinien und verwendung der antikoerper - Google Patents

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung von Antikörpern gegen instabile Antigene, insbesondere von Antikörpern gegen die aktive Form von Anaphylatoxinen, Zellinien, die diese Antikörper herstellen, Antikörper gegen die aktive Form von Anaphylatoxinen, deren Verwendung und eine pharmazeutische Zusammensetzung, enthaltend die Antikörper.

Die Herstellung von Antikörpern gegen Antigene durch Immunisierung eines Wirtsorganismus mit dem entsprechenden Antigen ist ein dem Fachmann geläufiges Verfahren. Nach der Immunisierung des Wirtsorganismus kann ein antigenspezifisches Antiserum, das eine Vielzahl verschiedener, gegen das zur Immunisierung verwendete Antigen gerichtete Antikörper enthält, aus dem Blut des immunisierten Tieres hergestellt werden, oder es können monoklonale Antikörper von Hybridomen, die durch Fusion von Milzzellen des immunisierten Tieres mit Myelomzellen nach gängigen Verfahren erhalten werden, isoliert werden.

Die herkömmlichen Verfahren zur Herstellung von Antikörpern bereiten jedoch große Schwierigkeiten, wenn das zur Immunisierung verwendete Antigen instabil ist. Unter instabilen Antigenen werden im folgenden solche Antigene verstanden, bei denen das Epitop, gegen das eine Antikörperantwort erwünscht ist, in dem zu immunisierenden Wirtsorganismus rasch verändert wird. Dies kann z. B. durch enzymatischen Umbau des Antigens erfolgen, so daß das entsprechende Epitop dem Immunsystem nicht für eine Zeitspanne präsentiert werden kann, die ausreicht, um eine Antikörperantwort dagegen zu induzieren.

Solche instabilen Antigene stellen beispielsweise die aktiven Formen der Anaphylatoxine dar. Diese Peptide, die im Rahmen der Komplementaktivierung durch proteolytische Spaltung der Komplementfaktoren C3, C4 bzw. C5 erhalten werden, tragen die Bezeichnung C3a, C4a bzw. C5a. Die unmittelbar nach der proteolytischen Spaltung erhaltenen aktiven Formen von C3a, C4a bzw. C5a werden in vivo unter dem Einfluß von Carboxypeptidasen rasch zu inaktiven Varianten umgewandelt.

Im Falle des Anaphylatoxins C3a erfolgt die Inaktivierung durch Abspaltung der N-terminalen Aminosäure Arginin, wodurch die inaktive Variante C3a-desArg entsteht.

Die aktiven Formen der Anaphylatoxine C3a, C4a und C5a können an Rezeptoren verschiedener Zelltypen, z. B. von Granulozyten, Thrombozyten oder Lymphozyten, binden und dadurch deren Funktionszustand ändern. Die durch die Anaphylatoxine ausgelösten Reaktionen können zu massiven Organschädigungen führen. Solche Schädigungen werden nicht durch die inaktiven, d. h. die am C-Terminus verkürzten Varianten der Anaphylatoxine hervorgerufen.

Somit ist es für die Diagnostik von durch Anaphylatoxinen hervorgerufenen Krankheitsbildern von besonderem Interesse, die aktiven Anaphylatoxine in Anwesenheit der inaktiven Formen und der nativen Komplementfaktoren selektiv nachzuweisen. Weiterhin ist es aus therapeutischen Überlegungen wünschenswert, ggf. eine übermäßige Anaphylatoxin-Aktivität, vermittelt durch die aktive Form von C3a, C4a bzw. C5a, selektiv durch den Einsatz geeigneter Antikörper zu hemmen oder auszuschalten.

Die Erzeugung von Antikörpern, die spezifisch die aktive Form, beispielsweise von C3a, binden, wird jedoch dadurch erschwert, daß sich zum einen das aktive C3a, das den Aminosäuren 1 bis 77 der α-Kette des Komplementfaktors C3 entspricht, von der inaktiven Form nur durch die der inaktiven Form fehlende Aminosäure Arginin an Position 77 unterscheidet. Zum anderen wird aktives C3a in vivo rasch unter dem Einfluß der ubiquitären Carboxypeptidase N in die inaktive Form C3a-desArg umgewandelt, so daß die Erzeugung von Antikörpern gegen den Carboxyterminus von C3a, enthaltend den Arginin-Rest an Position 77, mit Hilfe herkömmlicher Immunisierungsverfahren nur schwer oder überhaupt nicht möglich ist.

Aufgabe der vorliegenden Erfindung ist es, ein Verfahren zur Verfügung zu stellen, mit dem Antikörper gegen instabile Antigene erhalten werden können.

Weitere Aufgaben bestehen in der Bereitstellung von Anti-Anaphylatoxin-Antikörpern, die spezifisch für die aktive Form des Anaphylatoxins C3a, C4a bzw. C5a sind, von Zellinien, die diese Antikörper herstellen und von einer pharmazeutischen Zusammensetzung zur Verwendung bei gesteigerter Komplementaktivierung.

Die erste Aufgabe wird erfindungsgemäß gelöst durch ein Verfahren zur Herstellung von Antikörpern, bei dem mindestens ein instabiles Antigen zur Immunisierung direkt mit Milzzellen in Kontakt gebracht wird.

Als instabile Antigene werden, wie oben beschrieben, solche Antigene bezeichnet, die in dem Wirtsorganismus nach herkömmlicher Immunisierung nicht ausreichend stabil sind, damit der verwendete Wirtsorganismus eine Immunantwort gegen diese aufbauen kann. Unter herkömmlicher Immunisierung werden dabei Immunisierungen verstanden, bei denen das Antigen nach Applikation in den Wirtsorganismus zunächst systemisch verteilt wird, bevor es zu den immunkompetenten Organen des Empfängerorganismus gelangt. Während dieses Verteilungsvorgangs können beispielsweise Enzyme das eingebrachte Antigen metabolisieren, so daß dessen Struktur verändert ist, bevor es zu dem immunkompetenten Organ gelangt. Als instabile Antigene werden neben der oben beschriebenen aktiven Form der Anaphylatoxine sämtliche antigene Verbindungen angesehen, die einem raschen Umbau, beispielsweise durch Enzyme, nach Einbringen in einen Organismus unterliegen.

Die Erzeugung von Antikörpern gegen instabile Antigene läßt sich dennoch bewerkstelligen, wenn, wie gemäß der vorliegenden Erfindung, das Antigen direkt mit Milzzellen in Kontakt gebracht wird. Dieser direkte Kontakt mit den immunkompetenten Zellen umgeht die Notwendigkeit einer systemischen Verteilung des Antigens, die bei herkömmlichen Immunisierungen durch Injektion des Antigens in die Blutbahn des zu immunisierenden Tieres zwangsläufig erfolgt und die das Antigen anfällig macht gegenüber Umbauprozessen.

In dem erfindungsgemäßen Verfahren stellen Proteine und Peptide vorzugsweise verwendete Antigene dar. Besonders bevorzugte Peptide sind die Komplementärfaktoren C3a, C4a und C5a in ihrer aktiven Form.

Bei der Herstellung von spezifischen Antikörpern für C3a ist es bevorzugt, die Aminosäuren der Positionen 70 bis 77 von C3a zu verwenden, wobei diese Sequenz von 8 Aminosäuren zu Immunisierung an einen Träger gekoppelt wird. Als Träger kommen übliche hochmolekulare Verbindungen, wie beispielsweise KLH, in Frage.

Vorzugsweise wird ein synthetisches Oktapeptid mit der obigen Aminosäuresequenz verwendet. Das synthetische Oktapeptid besitzt, wenn es die menschliche C3a-Sequenz von Position 70 bis 77 darstellt, die folgende Sequenz:

NH₂-Ala-Ser-His-Leu-Gly-Leu-Ala-Arg-COOH.

Das vollständige Peptid oder Teile des Peptids können in dem erfindungsgemäßen Verfahren verwendet werden, jedoch sollten die 3 C-terminalen Aminosäuren mindestens Bestandteil des zur Immunisierung verwendeten Antigens sein.

Bei einer bevorzugen Ausführungsform erfolgt die Injektion des Antigens, das gekoppelt an den Träger auch als Immunogen bezeichnet wird, direkt in die Milz des verwendeten narkotisierten Tieres, wobei Immunogenmengen verwendet werden, wie sie bei der herkömmlichen Immunisierung eingesetzt werden. Die Entnahme der Milz erfolgt vorzugsweise drei bis vier Tage nach erfolgter Immunogeninjektion, und die Fusion der Milzzellen mit Myelomzellen zur Herstellung von monoklonale Antikörper erzeugenden Hybridomen erfolgt auf herkömmliche Weise.

Die zur Immunisierung verwendeten Tiere können zu üblichen, zur Antikörperherstellung verwendeten Tierarten gehören, bevorzugt sind Mäuse.

Alternativ zu der direkten Injektion des Antigens in die Milz des lebenden Tieres ist es möglich, das Antigen in vitro mit Milzzellen in Kontakt zu bringen. Dabei wird das Antigen mit Milzzellen in Gewebekultur zusammengebracht, und anschließend werden die Milzzellen auf herkömmliche Weise mit Myelomzellen zu Hybridomen fusioniert. Jedoch ist wegen der erhöhten Kontaminationsanfälligkeit der in-vitro-Immunisierung die Immunisierung durch Injektion in die Milz zu bevorzugen.

Die weitere Aufgabe der Bereitstellung von Anti-Anaphylatoxin-Antikörpern wird erfindungsgemäß gelöst durch Antikörper, die spezifisch sind für die aktive Form von Anaphylatoxinen und die erhältlich sind nach dem oben beschriebenen Verfahren. Bevorzugte Antikörper sind spezifisch für die aktive Form von C3a, d. h. sie reagieren nicht mit der C-terminal verkürzten, inaktiven Form C3a- desArg, und weiterhin reagieren sie nicht mit dem nativen Komplementfaktor C3 bzw. mit der nativen α- bzw. β-Kette von C3. Diese Antikörper binden an den C-terminalen Bereich des C3a, insbesondere an den Bereich der Aminosäurepositionen 70 bis 77. Besonders bevorzugt sind monoklonale, C3a-spezifische Antikörper.

Weiterhin stellt die vorliegende Erfindung Zellinien bereit, die für die aktive Form der Anaphylatoxine C3a, C4a bzw. C5a spezifische Antikörper herstellen. Eine bevorzugte Ausführungsform stellt die Zellinie dar, die einen Antikörper herstellt, der spezifisch ist für die aktive Form von C3a und der an den Bereich von Aminosäureposition 70 bis 77 des C3a bindet.

Weiterhin stellt die vorliegende Erfindung eine pharmazeutische Zusammensetzung bereit, die einen der obigen erfindungsgemäßen Antikörper und weiterhin übliche Hilfs- und Trägerstoffe enthält. Eine bevorzugte Zusammensetzung liegt in flüssiger Form vor, die für die intravenöse Injektion geeignet ist.

Die erfindungsgemäßen Antikörper finden als Therapeutikum bei gesteigerter Komplementaktivierung Anwendung. Die Antikörper können selektiv die Bindung von aktiven Anaphylatoxinen an ihre Rezeptoren auf Gewebezellen blockieren. Im Falle von C3a ist der Argininrest an Position 77 notwendig, damit eine Bindung von C3a an seine Rezeptoren erfolgt. Die erfindungsgemäßen C3a-spezifischen Antikörper binden an den gleichen Abschnitt von C3a, der auch für die Rezeptorbindung verantwortlich ist, d. h. an die Aminosäuren der Positionen 70 bis 77. Somit können diese Antikörper die C3a-Rezeptorbindung spezifisch blockieren und somit die Folgereaktionen aus der C3a-Bindung an seine Rezeptoren blockieren bzw. teilweise hemmen.

Neben dieser therapeutischen Anwendungsmöglichkeit sind die erfindungsgemäßen Antikörper ebenfalls für diagnostische Zwecke ausgezeichnet geeignet. Die für die aktive Form der Anaphylatoxine spezifischen Antikörper erlauben deren qualitative und quantitative Bestimmung in biologischem Material, das neben den aktiven Formen auch die inaktiven Formen und die nativen Komplementfaktoren enthält. Die selektive Erfassung der aktiven Form der Anaphylatoxine erlaubt eine genauere Ermittlung bestehender Krankheitsbilder, an deren Entstehung aktive Anaphylatoxine beteiligt sind. Insbesondere im Falle von C3a erlaubt die spezifische Detektion von aktivem C3a, ohne das inaktive C3a-desArg mitzuerfassen, eine genauere Diagnose, als es mit den bisher vorhandenen Antikörpern möglich war.

Die folgenden Beispiele erläutern die Erfindung.

Beispiel 1 1) Herstellung eines C3a-spezifischen Antikörpers a) Herstellung des Immunogens

Zunächst wurde das synthetische Oktapeptid mit der Sequenz NH₂-Ala-Ser-His-Leu-Gly-Leu-Ala-Arg-COOH nach der Methode von R. B. Merrifield (J. Amer. Chem. 85, Seiten 2148 bis 2155, 1963) hergestellt. An das C3a-spezifische Oktapeptid wurde ein zusätzlicher Cystein-Rest angefügt, über den nach den üblichen Methoden mit Hilfe des heterobifunktionellen Reagens MBS (m-Maleimidobenzoyl-N-hydroxysuccinimidester) das Peptid nach üblichen Methoden an das Trägerprotein KLH (Keyhole Limpet Haemocyanine) gekoppelt wurde.

b) Immunisierung

Das unter a) hergestellte Peptid-Trägerkonjugat wurde zur Immunisierung wie folgt verwendet: Eine Maus wurde auf übliche Weise subkutan narkotisiert mit 0,31 mg Ketanest-Base pro g Körpergewicht. Anschließend wurden 1,2 mg/g Körpergewicht Atropin subkutan injiziert. Nach Entfernung der Haare und Desinfektion der Hautoberfläche erfolgte eine Inzision mit einer Länge von etwa 10 mm im Bereich der Milzposition. Anschließend erfolgte eine Inzision des Peritoneums von etwa der gleichen Länge. Dann wurde die Milz einschließlich des Fett- und Bindegewebes vorsichtig an die Körperoberfläche mit Hilfe stumpfer Pinzetten bewegt, ohne dabei Gefäße zu verletzen. Nach einmaliger Injektion des Immunogens (100 µg Konjugat, gelöst in 70 µl Hanks-Salzlösung) in die Milz einer 20-24 g schweren Maus wurde die Milz in die vorherige Lage gebracht, und Abdomen und Haut jeweils separat vernäht.

c) Fusion und Selektion

Zum Herstellen antikörperproduzierender Hybridome wurde die Milz, der, wie unter b) beschrieben, immunisierten Maus drei bis vier Tage nach der Injektion des Immunogens dem getöteten Tier entnommen, und die Fusion der Milzzellen mit Myelomzellen erfolgte nach üblichen Methoden.

Die im Selektivmedium wachsenden Hybridome wurden auf Antikörper getestet, die spezifisch mit gereinigtem C3a reagieren, und die nicht mit C3a-desArg bzw. dem nativen Komplementfaktor C3 reagierten. Die einzelnen Stufen der Selektion erfolgten nach üblichen Methoden. Dieses Selektionsschema lieferte ein Hybridom, das einen C3a-spezifischen Antikörper herstellt.

2) Charakterisierung des C3a-spezifischen Antikörpers

Die Überprüfung der Antikörperspezifität erfolgte anhand eines bekannten ELISA-Systems. Der erfindungsgemäße Antikörper der Klasse IgM reagierte selektiv mit C3a, aber nicht mit C3a-desArg. Weiterhin reagierte er nicht mit nativem C3. Ferner zeichnete sich der Antikörper dadurch aus, daß er mit dem zur Immunisierung verwendeten Konjugat aus KLH und dem Oktapeptid aus den Aminosäuren 70 bis 77 des C3a reagierte, aber nicht mit einem Konjugat aus KLH und dem Oktapeptid der Aminosäuren 69 bis 76 des C3a. Ferner reagierte der erfindungsgemäße Antikörper nicht mit KLH alleine. Der Antikörper hemmte wirksam die C3a-Funktion in einem funktionellen In-vitro-Assay, dem ATP-Freisetzungstest an Thrombozyten. Der erfindungsgemäße Antikörper bewirkt eine 90%ige Hemmung der C3a-Aktivität.

Diese Tests zeigen, daß der erfindungsgemäße Antikörper spezifisch mit dem Arginin-haltigen C-Terminus des aktiven C3a reagiert. Da fast sämtliche C3a-Funktionen abhängig sind von dem Vorhandensein dieses C-terminalen Arginins, bietet der erfindungsgemäße Antikörper eine ausgezeichnete Möglichkeit, die C3a-Funktion in-vivo zu beeinflussen, wie auch die C3a-Anwesenheit in vitro qualitativ und quantitativ, ohne vorherige spezielle Probenaufbereitungsmaßnahmen zur Entfernung von inaktivem C3a bzw. nativem C3, zu bestimmen.

Claims (19)

1. Verfahren zur Herstellung von Antikörpern, dadurch gekennzeichnet, daß mindestens ein instabiles Antigen zur Immunisierung direkt mit Milzzellen in Kontakt gebracht wird.

2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß Antigene eingesetzt werden, die im Organismus des zur Antikörperherstellung verwendeten Tieres einer raschen enzymatischen Metabolisierung unterliegen.

3. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, daß als Antigene Proteine und/oder Peptide verwendet werden.

4. Verfahren nach Anspruch 3, dadurch gekennzeichnet, daß die aktive Form der Anaphylatoxine C3a, C4a und/ oder C5a verwendet wird.

5. Verfahren nach Anspruch 4, dadurch gekennzeichnet, daß das Fragment von Aminosäureposition 70 bis 77 von menschlichem C3a ganz oder teilweise, gekoppelt an einen Träger, verwendet wird.

6. Verfahren nach Anspruch 5, dadurch gekennzeichnet, daß ein synthetisches Oktapeptid mit den Aminosäuren entsprechend den Aminosäuren 70 bis 77 des menschlichen C3a verwendet wird.

7. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 6, dadurch gekennzeichnet, daß das Antigen mit den Milzzellen dadurch in Kontakt gebracht wird, daß es in die Milz des zur Antikörperherstellung verwendeten Tieres injiziert wird.

8. Verfahren nach Anspruch 7, dadurch gekennzeichnet, daß die Milz 3 bis 4 Tage nach der Injektion mit dem Antigen entnommen wird, und die Milzzellen auf herkömmliche Weise mit Myelomzellen zur Herstellung von Hybridomen fusioniert werden.

9. Anti-Anaphylatoxin-Antikörper, dadurch gekennzeichnet, daß sie spezifisch für die aktive Form des Anaphylatoxins und erhältlich nach einem Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 8 sind.

10. Antikörper nach Anspruch 9, dadurch gekennzeichnet, daß sie spezifisch sind für die aktive Form von C3a.

11. Antikörper nach Anspruch 10, dadurch gekennzeichnet, daß sie an den C-terminalen Bereich des C3a binden.

12. Antikörper nach Anspruch 11, dadurch gekennzeichnet, daß sie an den Bereich von Aminosäureposition 70 bis 77 des C3a binden.

13. Antikörper nach Anspruch 12, dadurch gekennzeichnet, daß sie monoklonal sind.

14. Zellinie, dadurch gekennzeichnet, daß sie Antikörper nach Anspruch 9 herstellt.

15. Zellinie nach Anspruch 14, dadurch gekennzeichnet, daß sie einen Antikörper herstellt, der spezifisch ist für die aktive Form von C3a und der an den Bereich von Aminosäureposition 70 bis 77 des C3a bindet.

16. Pharmazeutische Zusammensetzung, dadurch gekennzeichnet, daß sie Antikörper nach einem der Ansprüche 9 bis 13 und übliche Hilfs- und Trägerstoffe enthält.

17. Pharmazeutische Zusammensetzung nach Anspruch 18, dadurch gekennzeichnet, daß sie in flüssiger Form vorliegt.

18. Verwendung der Antikörper nach einem der Ansprüche 9 bis 13 zur Herstellung eines Medikaments bei gesteigerter Komplementaktivierung.

19. Verwendung der Antikörper nach einem der Ansprüche 9 bis 13 zur quantitativen Bestimmung der aktiven Form der Anaphylatoxine.