DE3854300T2

DE3854300T2 - Lymphocyteninhibierung durch hla-peptide.

Info

Publication number: DE3854300T2
Application number: DE3854300T
Authority: DE
Inventors: Carol Clayberger; Alan Krensky; Peter Parham
Original assignee: Leland Stanford Junior University
Current assignee: Leland Stanford Junior University
Priority date: 1987-01-30
Filing date: 1988-01-27
Publication date: 1996-01-11
Anticipated expiration: 2008-01-28
Also published as: CA1339185C; ATE126237T1; EP0365525B1; DE3854300D1; DK549188D0; AU619458B2; AU1342388A; EP0365525A4; DK549188A; WO1988005784A1; EP0365525A1

Description

GEBIET DER ERFINDUNG

HLA-Peptidzusammensetzungen beeinflussen T-Zellaktivität, die der MHC-Restriktion unterworfen sind. Es werden Verfahren und Zusammensetzungen zur Verfügung gestellt, welche die Modulation der Cytotoxiztät gegenüber allogenen Zellen betreffen

HINTERGRUND DER ERFINDUNG

Cytotoxische T-Zellen, insbesondere cytotoxische T-Lymphocyten (CTL bzw. CTLs), werden in ihrer Wirkung durch die Erkennung eines spezifischen "Major Histocompatibility" (MHC) - Antigens bzw. Haupthistokompatibilitäts-Antigens auf der Oberfläche der Zielzelle als auch einem zu dem Wirtsorganismus exogenen Antigen restringiert. Das Fremdantigen kann als Resultat von Transplantation, viraler Infektion, Mutation oder dergleichen vorliegen. Die Gegenwart der determinierenden oder restringierenden Stelle des MHC-Proteins scheint für die Attacke durch die CTLs gegen die das Fremdantigen tragende Zelle essentiell zu sein. Auf diesem Wege ist das Immunsystem in der Lage, Zellen im Körper zu zerstören, die sonst, wenn es ihnen erlaubt wäre, zu proliferieren, zur Vermehrung von Pathogenen oder neoplastischen Zellen führen würden.
Die CTLs sind ebenfalls wirksam bei der Zerstörung von Transplantanten verschiedener Organe oder Gewebe, welche von allogenen Wirten bzw. Spendern stammen. Die angewandten Verfahren oder Behandlungen zum Schutz der transplantierten Zellen resultieren häufig in der Außerkraftsetzung des Immunsystems, wodurch der Empfänger des Transplantates oppurtunistischer Infektion unterworfen wird.
Es ist deshalb von wesentlichem Interesse, in der Lage zu sein, das cytotoxische System in einem Wirt zu modulieren, um eine bestimmte Population von T-Zellen selektiv daran zu hindern, ihre normale physiologische Funktion auszuüben. Auf diese Weise bleibt das Immunsystem im wesentlichen intakt erhalten, während ein bestimmtes Ziel der T-Zellen geschützt werden kann.

BESCHREIBUNG DER RELEVANTEN LITERATUR

Clayberger et al, J. Exp. Med. (1985) 11:1709-1714, beschreiben das HLA-A2-Antigen in Vergleichen mit HLA-Aw68 und Aw69. Weitere Strukturinformation betreffend humane Histokompatibilitätsantigene ist ebenfal von Vega et al, Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1985) 82:7394-7398 erhältlich, die eine HLA-B27-Variante sequenziert haben, und von de Castro et al, Biochemistry (1983) 22:3969-3975, die die Primärstruktur von HLA-B40 (-Bw60) bestimmt haben und dessen allogenen Stellen aufgezeigt haben. Townsend et al, Cell (1986) 44:959-968 schlägt vor, daß CTLs segmentale Epitope von denaturierten oder degradierten Proteinen auf einem ähnlichen Wege wie T-Helferzellen erkennen. Holmes und Parham, EMBO J. (1985) 4:2849-2854 beschreiben die Beziehung von HLA-A2, Aw68 und Aw69. Die Zielspezifität der CTLs ist als extrem empfindlich gegen Veränderungen in der Struktur von humanen Klasse I-Molekülen befunden worden (Durna und Pease, Transplantation, (1986) 41:279-285; Biddison, et al, J. Immunol., (1980) 124:548-552; Spits et al, Immunogenetics, (1982) 16:503-512; Gaston, et al, J. Exp. Med., (1983) 158:280-293).
Mutanten, die die Erkennung durch CTLs beeinträchtigen, wurden in Mäusen (Nathenson et al, Ann. Rev. Immunol. (1986) 4:471-502; Schulz et al, Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1983), 80:207-2011) und Menschen studiert (Krangel, Biochemistry (1982) 21:6313-6321; Krangel et al, J. Immunol. (1983) 130:1856-1862; Cowan et al, J. Immunol. (1985)135:2835-2841; Taketani et al, ebenda (1984) 133:816-821; und Vega et al, Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1985) 82:7394-7398).
Diese Berichte richteten beträchtliche Aufmerksamkeit auf die Region zwischen den Resten 147 und 157, obwohl auch andere Regionen funktionale Unterschiede verursachen können (Ezquerra et al, J. Immunol. (1985) 134:2727-2733). Über Anhäufungen bzw. Cluster der Variabilität wurden am carboxyterminalen Ende der ersten extrazellulären Domäne und an dem aminoterminalen Ende der zweiten extrazellulären Domäne berichtet (Ways et al, J. Biol. Chem (1985) 26:11924-11933). Sequenzen zwischen den Resten 105-108 aller Klasse I-Moleküle sind mit denen des Fibronectin- Bindungs-Tetrapeptides verwandt (Auffray und Novotny, J. Human Immunology (1986) 15:381-390), wobei von diesem Tetrapeptid herausgefunden wurde, daß es in jedweder Orientierung Zellerankerungs-Eigenschaften aufweist (Pierschbacher und Ruoslahti, Nature (1984) 309:30-33; Yamada und Kennedy, J. Cell Biol.(1985) 28:99-104). Über eine Substitution an der Position 107, was ein einziges durch monoklonale Antikörper definiertes Epitop von HLA-A2 beeinträchtigt, wurde von Salter et al, J. Exp. Med. (1987) 166:283-288 berichtet.

ZUSAMMENFASSUNG DER ERFINDUNG

Es werden Verfahren und Zusammensetzungen zur Modulierung der Aktivität der cytotoxischen T-Lymphocyten (CTL) gegen Zielzellen zur Verfügung gestellt. Die Verfahren beinhalten die Verwendung von Peptidfragmenten, die mit der Region, welche die α1- und α2-Domänen von Haupthistokompatibilitäts-Klasse I-Antigenen überspannt, kreuzreaktiv sind. Insbesondere werden Fragmente, die mindestens einen Teil der Aminosäuren zwischen den Positionen 55 und 120 des Klasse I-Antigens enthalten, angewandt.
Folglich besteht ein Aspekt der Erfindung in einem Peptid, das an eine funktionelle Gruppe geknüpft ist, welche unter einer Markierungsgruppe, einem Immunogen, einem Polypeptidantigen, einem Linker und einem cytotoxischen Mittel ausgewählt wird;
worin das Peptid die Aktivität des CTL (cytotoxischer T-Lymphocyt) moduliert, und aus einer Sequenz von mindestens 8 Aminosäuren besteht, die vorkommen innerhalb der erweiterten Sequenz:
worin:
aa&sup5;&sup5; E oder K ist;
aa&sup6;² G, Q, E oder R ist;
aa&sup6;³ eine saure Aminosäure oder ein Amid davon ist;
aa&sup6;&sup5; Q, R oder G ist;
aa&sup6;&sup6; I, N oder K ist;
aa&sup6;&sup7; eine aliphatische neutrale Aminosäure ist;
aa&sup6;&sup9; eine aliphatische neutrale Aminosäure ist;
aa&sup7;&sup0; Q, H, S, N oder K ist;
aa&sup7;¹ eine aliphatische neutrale Aminosäure ist;
aa&sup7;&sup4; D, Y oder H ist;
aa&sup7;&sup6; E oder V ist
aa&sup7;&sup7; D, S oder N ist;
aa&sup7;&sup9; R oder Gist;
aa&sup8;&sup0; T, I oder N ist;
aa&sup8;¹ eine aliphatische nicht-polare Aminosäure ist;
aa&sup8;² R oder L ist;
aa&sup8;³ G oder R ist;
aa&sup9;&sup4; T oder I ist;
aa&sup9;&sup5; eine nicht-polare aliphatische Aminosäure mit 5 bis 6 Kohlenstoffätomen ist;
aa&sup9;&sup7; eine aliphatische Aminosäure oder W ist;
aa&sup9;&sup9; eine aromatische Aminosäure ist;
aa¹&sup0;³ eine nicht-polare aliphatische Aminosäure mit 5 bis 6 Kohlenstoffätomen ist;
aa¹&sup0;&sup5; P oder S ist;
aa¹&sup0;&sup7; G oder W ist;
aa¹&sup0;&sup9; L oder F ist;
aa¹¹³ Y oder H ist;
aa¹¹&sup4; H, Q, D, N oder R ist;
aa¹¹&sup6; Y, D, S, F oder H ist;
mit der Maßgabe, daß das Peptid nicht ein markiertes Peptid folgender Formel ist:
(i) R E T Q I C K A K
(ii) A Q T D R E aa&sup7;&sup7; L R, worin aa&sup7;&sup7; D, S oder N ist;
(iii) G Y Y N Q S E A G S H T L Q aa&sup9;&sup7;, worin aa&sup9;&sup7; S oder R ist;
(iv) Y G C D V G P D G R.
Bevorzugte Beispiele solcher Peptide sind solche, welche aus mindestens 8 innerhalb folgender erweiterten Sequenz vorliegenden Aminosäuren besteht:
G S H T [V, I oder L] Q R M Y G C D V G S D [W oder G] R F L R G Y H Q Y A Y D G;
oder
Q E G P E Y W D (G oder R)(E oder N) T (R oder Q) (K oder N) V K A (H oder Q) S Q T (H oder D) R (V oder E) (D, S oder N) L (G oder R) (T oder I) (L oder A) (R oder L) (G oder R) Y Y N Q S E A.
worin die Aminosäuren in den Klammern anzeigen, daß eine beliebige der Aminosäuren in den Klammern vorliegt.
Solche Peptide können entweder an dem N- oder C-Terminus durch eine Aminosäuresequenz erweitert sein, die eine andere als die Sequenz vom Wild-Typ des Proteins ist, von dem das Peptid abgeleitet ist.
Ein anderer Aspekt der Erfindung ist eine Pharmazeutische Zusammensetzung, welche ein Peptid enthält, wie es in mindestens einem der vorhergehenden Ansprüche definiert ist, vorliegend in einer pharmakologisch wirksamen Dosis in einem pharmazeutisch zulässigen Medium.
Bevorzugte solcher pharmazeutischer Zusammensetzungen umfässen ein Peptid oder Peptide, gewählt aus:
T L Q R M Y G C D V G S D W R F L R G,
M Y G C D V G S D W R F L R G Y,
M Y G C D V G S D G R F L R G Y,
G P E Y W D G E T R K V K A und
G P E Y W D R N T R N V K A.
Noch ein anderer Aspekt der Erfindung ist ein ex vivo-Verfahren zur Bestimmung des Vorhandenseins von MHC-restringierten cytotoxischen T-Lymphocyten (CTLs), das das Kontaktieren cytotoxischer T-Lymphocyten mit einem wie in einem der obengenannten Punkte definierten Peptid, wobei das Peptid kovalent an eine Verbindung geknüpft ist, die fahig ist, ein nachweisbares Signal zur Verfügung zu stellen; und das Bestimmen des Vorhandenseins von Zellen, an die besagte nachweisbare Signalverbindung spezifisch gebunden ist, umfaßt.
Noch ein weiterer Aspekt der Erfindung ist eine Peptidverbindung von mindestens 8 Aminosäuren und nicht mehr als etwa 30 Aminosäuren, welches Peptid CTL-Aktivität moduliert, und aus einer Sequenz von mindestens 8 Aminosäuren besteht, die innerhalb der obenstehend definierten erweiterten Sequenz vorkommen, zur Verwendung in einem Verfahren für die Behandlung des Menschen- oder Tierkörpers.
Bevorzugte Peptide zum Einsatz in einem solchen Behandlungsverfahren des Menschen- oder Tierkörpers sind:
(A) (a) Peptide, die CTL-Aktivität modulieren und aus mindestens 8 innerhalb folgender erweiterten Sequenz vorliegenden Aminosäuren bestehen:
aa&sup5;&sup5; E oder K ist;
aa&sup6;² G, Q, E oder R ist;
aa&sup6;³ eine saure Aminosäure oder ein Amid davon ist;
aa&sup6;&sup5; Q, R oder G ist;
aa&sup6;&sup6; I, N oder K ist;
aa&sup6;&sup7; eine aliphatische neutrale Aminosäure ist;
aa&sup6;&sup9; eine aliphatische neutrale Aminosäure ist;
aa&sup7;&sup0; Q, H, S, N oder K ist;
aa&sup7;¹ eine aliphatische neutrale Aminosäure ist;
aa&sup7;&sup4; D, Y oder H ist;
aa&sup7;&sup6; E oder V ist;
aa&sup7;&sup7; D, S oder N ist;
aa&sup7;&sup9; R oder Gist;
aa&sup8;&sup0; T, I oder N ist;
aa&sup8;¹ eine aliphatische nicht-polare Aminosäure ist;
aa&sup8;² R oder L ist;
aa&sup8;³ G oder R ist;
aa&sup9;&sup4; T oder I ist;
aa&sup9;&sup5; eine nicht-polare aliphatische Aminosäure mit 5 bis 6 Kohlenstoffätomen ist;
aa&sup9;&sup7; eine aliphatische Aminosäure oder W ist;
aa&sup9;&sup9; eine aromatische Aminosäure ist;
aa¹&sup0;³ eine nicht-polare aliphatische Aminosäure mit 5 bis 6 Kohlenstoffatomen ist;
aa¹&sup0;&sup5; P oder S ist;
aa¹&sup0;&sup7; G oder W ist;
aa¹&sup0;&sup9; L oder F ist;
aa¹¹³ Y oder H ist;
aa¹¹&sup4; H, Q, D, N oder R ist;
aa¹¹&sup6; Y, D, S, F oder H ist;
mit der Maßgabe, daß das Peptid nicht ein markiertes Peptid folgender Formel ist:
(i) R E T Q I C K A K
(ii) A Q T D R E aa&sup7;&sup7; L R,worin aa&sup7;&sup7; N, S oder N ist;
(iii) G Y Y N Q S E A G S H T L Q aa&sup9;&sup7;, worin aa&sup9;&sup7; S oder R ist;
(iv) Y G C D V G P D G R.
(b) Peptide, wie sie in (A) (a) definiert sind, welche aus mindestens 8 innerhalb folgender erweiterten Sequenz vorliegenden Aminosäuren bestehen:
G S H T [V, I oder L] Q R M Y G C D V G S D [W oder G] R F L R G Y H Q Y A Y D G;
oder
Q E G P E Y W D (G oder R) (E oder N) T (R oder Q) (K oder N) V K A (H oder Q) S Q T (H oder d) R (V oder E) (D, S oder N) L (G oder R) (T oder 1) (L oder A) (R oder L) (G oder R) Y Y N Q S E A
worin die Aminosäuren in den Klammern anzeigen, daß eine beliebige der Aminosäuren in den Klammern vorliegt.
(B) G S H aa&sup9;&sup4; aa&sup9;&sup5; Q aa&sup9;&sup7; M aa&sup9;&sup9; G C D aa¹&sup0;³ Gaa¹&sup0;&sup5; D aa¹&sup0;&sup7; R aa¹&sup0;&sup9; LRG aa¹¹³ aa¹¹&sup4; Q aa¹¹&sup6; A Y D G;
worin
aa&sup9;&sup4; T oder I ist;
aa&sup9;&sup5; eine nicht-polare aliphatische Aminosäure mit 5 bis 6 Kohlenstoffatomen ist;
aa&sup9;&sup7; eine aliphatische Aminosäure oder W ist;
aa&sup9;&sup9; eine aromatische Aminosäure ist;
aa¹&sup0;³ eine nicht-polare aliphatische Aminosäure mit 5 bis 6 Kohlenstoffatomen ist;
aa¹&sup0;&sup5; P oder S ist;
aa¹&sup0;&sup7; G oder W ist;
aa¹&sup0;&sup9; L oder F ist;
aa¹¹³ Y oder H ist;
aa¹¹&sup4; H, Q, D, N oder R ist;
aa¹¹&sup6; Y, D, S, F oder H ist; oder
(C) aa&sup5;&sup5; G P E Y W D aa&sup6;² aa&sup6;³ T aa&sup6;&sup5; aa&sup6;&sup6; aa&sup6;&sup7; K aa&sup6;&sup9; aa&sup7;&sup0; aa&sup7;¹ Q T aa&sup7;&sup4; R aa&sup7;&sup6; aa&sup7;&sup7; aa&sup7;&sup9; aa&sup8;&sup0; aa&sup8;¹ aa&sup8;² aa&sup8;³ Y Y N Q S E A
worin
aa&sup5;&sup5; E oder K, insbesondere E ist;
aa&sup6;² G, Q, E oder R, insbesondere R oder G ist;
aa&sup6;³ eine saure Aminosäure oder ein Amid davon ist; einschließend E und
N, insbesondere E;
aa&sup6;&sup5; Q, R oder G, insbesondere Q oder R ist;
aa&sup6;&sup6; I, N oder K, insbesondere N oder K ist;
aa&sup6;&sup7; eine aliphatische neutrale Aminosäure ist, einschließend V, M, S, C und Y, insbesondere V;
aa&sup6;&sup9; eine aliphatische neutrale Aminosäure ist, einschließend A, T und P, insbesondere A;
aa&sup7;&sup0; Q, H, S, N oder K, insbesondere Q oder H ist;
aa&sup7;¹ eine aliphatische neutrale Aminosäure ist, einschließend S, A und T, insbesondere S;
aa&sup7;&sup4; D, Y oder H, insbesondere D oder H ist;
aa&sup7;&sup6; E oder V ist;
aa&sup7;&sup7; D, S oder N, insbesondere D ist;
aa&sup7;&sup9; R oder G, insbesondere G ist;
aa&sup8;&sup0; T, I oder N, insbesondere T oder I ist;
aa&sup8;¹ eine aliphatische nicht-polare Aminosäure ist, einschließend L oder A, insbesondere L;
aa&sup8;² R oder L, insbesondere R ist;
aa&sup8;³ G oder R, insbesondere G ist;
Ein bevorzugtes Verfahren zur Behandlung, in dem solche Peptide verwendet werden können, ist ein Behandlungsverfahren, das das Inhibieren der cytolytischen Aktivität eines cytotoxischen T-Lymphocyten umfaßt.
Ein anderes bevorzugtes Verfahren für die Behandlung, in welchem solche Peptide verwendet werden können, ist ein Behandlungsverfahren, das das Sensitivieren MHCrestringierter Zellen gegenüber einem cytotoxischen T-Lymphocyten umfaßt. Zur Verwendung in einem Behandlungsverfahren besonders bevorzugte Peptide sind diejenigen der obenstehenden Formel (C).
Ein weiterer Aspekt der Erfindung ist ein Peptid, wie es obenstehend definiert ist, das an ein Mittel konjugiert ist, welches Cytotoxizität verursacht, zum Einsatz in einem Verfahren zur Inhibierung der cytolytischen Aktivität eines CTL (cytoxischen T- Lymphocyten) durch irreversibles Binden des CTL.

KURZE BESCHREIBUNG DER ZEICHNUNGEN

Fig. 1 zeigt die Peptidsequenz von minimaler Größe, die für die Inhibierung der Cytolyse durch einen für HLA-A2 spezifischen CTL erforderlich ist.
Fig. 2 zeigt den Effekt von einer Vorbehandlung der CTLs und der Zielzellen auf die Inhibition der Cytolyse durch für HLA-A2 spezifische CTLs.
Fig. 3 zeigt den Effekt des Peptids A2.98-113 auf die Freisetzung von Granulae bzw. Vesikeln, die Serinesterase enthalten, während der Cytolyse von Zielzellen durch CTLs.
Fig. 4 zeigt die Konsensussequenz von Peptiden, welche die α1-, α2- und α3-Regionen eines Klasse I-HLA-Moleküls ausmachen, als auch Veränderungen in diesen Sequenzen in verschiedenen spezifischen HLA-Molekülen.
Fig. 5 zeigt den Effekt von Peptiden aus verschiedenen HLA-A2-Epitopen auf die Cytolyse von Zielzellen durch CTLs verschiedener Spezifitäten.
Fig. 6 zeigt die Sensitivierung einer HLA-Aw69-Zielzelle gegen Cytolyse durch Zellen des Klons A2/B17, die durch das Peptid A2.56-69 verursacht wird.
Fig. 7 zeigt den Effekt des Inkubierens von Zielzellen oder Klon A2/B17-Zellen mit dem Peptid A2.56-69 auf die Sensitivierung.

BESCHREIBUNG DER BEVORZUGTEN AUSFÜHRUNGSFORMEN

Es werden Verfahren und Zusammensetzungen zur Modulierung der Wirkung voll cytotoxischen T-Lymphocyten oder zur Diagnose des Vorhandenseins von CTLs von einer vorherbestimmten Spezifität zur Verfügung gestellt. Die Zusammensetzungen sind Peptidsequenzen, die mit einem polymorphen Teil der α1- oder α2-Domänen von Klasse I-Haupthistokompatibilitätsantigenen bzw. "Major Histocompatibility"-Antigenen, insbesondere mit dem C-terminalen Abschnitt der α1-Domäne und dem N-terminalen Abschnitt der α2-Domäne, kreuzreaktiv sind. Diese Haupthistokompatibilitätsantigene werden als Gruppen A, B und C mit einer beträchtlichen Anzahl von Unterklassen innerhalb dieser Gruppen klassifiziert, wobei die verschiedenen Klasse I-Antigene fähig sind, spezifisch an komplementäre CTLs zu binden, die durch solche Antigene restringiert sind. Von besonderem Interesse für die α1-Domäne ist die Aminosäuressequenz von den Positionen 55 bis 85, genauer gesagt 55 bis 80, gewöhnlich 55 bis 70, die innerhalb der Sequenz erwünschterweise ein Tetrapeptid DGET, GETR, DRET oder YWDG enthält. Von besonderem Interesse für die α2- Domäne ist die Aminosäuresequenz von den Positionen 90 bis 120, genauer gesagt 94 bis 116, die innerhalb der Sequenz erwünschterweise ein Tetrapeptid SDWR oder SDGR enthält.
Die Peptide von Interesse, die als das Rezeptor-bindendes Peptid dienen werden, werden mindestens 8 Aminosäuren, gewöhnlich mindestens 10 Aminosäuren, und für gewöhnlich nicht mehr als etwa 30 Aminosäuren, noch üblicher nicht mehr als etwa 24 Aminosäuren besitzen, und besitzen erwünschterweise etwa 12 bis 21 Aminosäuren. Die Aminosäuresequenz wird für gewöhnlich um nicht mehr als 2 Aminosäuren oder Mutationen, z.B. Deletionen oder Insertionen, gewöhnlicher um nicht mehr als etwa Aminosäure, von einer natürlich vorkommenden Sequenz abweichen. Die verwendete Sequenz wird gewöhnlich aus den polymorphen Regionen der C-terminalen Hälfte der α1-Domäne oder der N-terminalen Hälfte der α2-Domäne des MHC-Antigens des Wirts der MHC-restringierten T-Zellen, insbesondere eines Antigens der Gruppe HLA-A, sein.
Für den Großteil werden die Aminosäuresequenzen für die α1-Region innerhalb der folgenden Formel vorkommen:
aa&sup5;&sup5; ist E oder K, insbesondere E;
aa&sup6;² ist G, Q, E oder R, insbesondere R oder G;
aa&sup6;³ ist eine saure Aminosäure oder ein Amid davon; einschließlich E und N, insbesondere E;
aa&sup6;&sup5; ist Q, R oder G, insbesondere Q oder R;
aa&sup6;&sup6; ist I, N oder K, insbesondere N oder K;
aa&sup6;&sup7; ist eine aliphatische, neutrale Aminosäure einschließlich V, M, S, C und Y, insbesondere V,
aa&sup6;&sup9; ist eine aliphatische, neutrale Aminosäure einschließlich A, T und P, insbesondere A;
aa&sup7;&sup0; ist Q, H, S, N oder K, insbesondere Q oder H;
aa&sup7;¹ ist eine aliphatische, neutrale Aminosäure einschließlich S, A, und T, insbesondere S;
aa&sup7;&sup4; ist D, Y oder H, insbesondere D oder H;
aa&sup7;&sup6; ist E oder V;
aa&sup7;&sup7; ist D, S oder N insbesondere D;
aa&sup7;&sup9; ist R oder G, insbesondere G;
aa&sup8;&sup0; ist T, 1 oder N, insbesondere T oder I;
aa&sup8;¹ ist eine aliphatische, nicht-polare Aminosäure einschließlich L oder A, insbesondere L;
aa&sup8;² ist R oder L, insbesondere R;
aa&sup8;³ ist G oder R, insbesondere G.
Das Peptid kann durch Anknüpfen an einem oder beiden Enden mit einer anderen als der Wildtyp-Sequenz für das HLA-A2-Antigen erweitert werden.
Von besonderem Interesse ist eine Sequenz oder ein Sequenzfragment von mindestens 8 Aminosäuren der Sequenz:
Q E G P E Y W D (G oder R) (E oder N) T (R oder Q) (K oder N) V K A (H oder Q) S Q T (H oder D) R (V oder E) (D, S oder N) L (G oder R) (T oder I) (L oder A) (R oder L) (G oder R) Y Y N Q S E A
Für den Großteil werden die Aminosäuresequenzen für die α2-Domäne innerhalb der folgenden Formel vorkommen:
aa&sup9;&sup4; ist T oder I, insbesondere T;
aa&sup9;&sup5; ist eine nicht-polare aliphatische Aminosäure von 5 bis 6 Kohlenstoffatomen, insbesondere I, L oder V;
aa&sup9;&sup7; ist eine aliphatische Aminosäure, entweder polar oder nicht-polar, oder W, einschließlich R, M, N, S, I und W, insbesondere R;
aa&sup9;&sup9; ist eine aromatische Aminosäure, Y oder F, insbesondere Y;
aa¹&sup0;³ ist eine nicht-polare aliphatische Aminosäure von 5 bis 6 Kohlenstoffätomen, insbesondere I, V oder L, genauer gesagt V;
aa¹&sup0;&sup5; ist P oder S, insbesondere S;
aa¹&sup0;&sup7; ist G oder W, insbesondere W;
aa¹&sup0;&sup9; ist L oder F, insbesondere F;
aa¹¹³ ist Y oder H, insbesondere Y;
aa¹¹&sup4; ist H, Q, D, N oder R, insbesondere H;
aa¹¹&sup6; ist Y, D, S, F oder H, insbesondere Y oder D;
Das Peptid kann durch Anknüpfen an einem oder beiden Enden mit einer anderen als der Wildtyp-Sequenz für das A2-Antigen erweitert werden.
Von besonderem Interesse ist eine Sequenz oder ein Sequenzfragment, welches aufgebaut ist aus mindestens 8 Aminosäuren aus der Sequenz:
G S H T [V, I oder L] Q R M Y G C D V G S D [W oder G] R F L R G Y H Q Y A Y D G.
Wo zwei oder mehr Aminosäuren an der selben Stelle angezeigt sind, kann jede der aufgeführten Aminosäuren vorhanden sein.
Die Region von besonderem Interesse wird die Region von Aminosäureposition 100 bis 116 sein.
Die Klassen von Aminosäuren werden wie folgt bezeichnet:
aliphatisch
nicht-polar G, A, P, L, I, V
polar
neutral C, S, T, M, N, Q
sauer D, E
basisch K, R
aromatisch F, H,W, Y
Die Peptide können auf vielen verschiedenen Wegen hergestellt werden. Sie können bequem mittels herkömmlichen Techniken synthetisiert werden, welche automatische Synthesizer, wie etwa den Beckman, Applied Biosystems Inc. oder eine andere nutzvolle Peptid-Synthesizer-Vorrichtung, verwenden, oder sie können manuell synthetisiert werden. Alternativ dazu können DNA-Sequenzen, die für das jeweilige Peptid codieren, hergestellt werden, und können kloniert und exprimiert werden, um das gewünschte Peptid zur Verfiigung zu stellen. In diesem Fall kann ein Methionin die erste Aminosäure sein.
Die Peptide können auch aus natürlichen Quellen isoliert und durch bekannte Techniken gereinigt werden, einschließlich zum Beispiel der Chromatographie auf Ionenaustauschermaterialien, der Größenauftreunung, der Immunoaffinitäts-Chromatographie und der Elektrophorese. Wie hier verwendet, bezeichnet der Begriff "eine im wesentlichen reine Präparation der Peptidverbindung" eine Präparation bzw. Zubereitung des Peptides, welche gewöhnlich zu mehr als etwa 70% frei von Materialien ist, mit denen das Polypeptid natürlicherweise assoziiert ist, und welche vorzugsweise zu mehr als etwa 80% frei von diesen Materialien ist; Diese Materialien schließen jedoch Materialien aus, mit denen das Peptid bei der Herstellung pharmazeutischer Zusammensetzungen gemischt werden kann.
Die Sequenzen können in einer Vielzahl von Weisen in Abhängigkeit von ihrem letztendlichen Verwendungszweck modifiziert werden. Verschiedene N- oder C- terminale Gruppen können eingeführt werden, welche das Verknüpfen des Peptides an feste Substrate oder andere Moleküle ermöglichen. In einem synthetischen Verfahren kann in Abhängigkeit von dem Zweck, für den das Peptid hergestellt wird, jegliches Molekül an den N- oder C-Terminus eingeführt werden, das eine anschließende Reaktion ermöglichen würde.
Für diagnostische Zwecke kann eine Vielzhl von Markierungen an den Terminus bzw. das Ende geknüpft werden, welche dlrekt oder indlrekt ein detektierbares Signal zur Verfügung stellen können. Zum Beispiel können Fluoreszenzstoffe an dem Terminus eingeführt werden, oder andere Moleküle, die eine Verbindung zu Markierungen ermöglichen, wie etwa zu Fluoreszenzstoffen, Enzymen, Partikeln oder dergleichen. Zum Beispiel kann eine Verknüpfung an dem Terminus eingeführt werden, z.B. Biotin, welches an ein Avidin-Konjugat mit Enzymen oder Fluoreszenzstoffen binden wird. Alternativ dazu können verschiedene reaktive Stellen zur Verknüpfung mit Partikeln, festen Substraten, Makromolekülen oder dergleichen an dem Terminus eingeführt werden. Zum Beispiel kann eine interne Aminogruppe von einer an ein festes Substrat gebundenen wachsenden Kette, wobei die intermediären Seitengruppen geschützt sind, mit Methyldithiobenzoesäure (MDTB) konjugiert werden. Die freie Mercaptangruppe kann dann zur Konjugation bzw. Bindung mit aktivierten Olefinen verwendet werden. Somit können Proteine wie etwa Serumalbumin, Schlüßellochnapfschnecken- Hämocyanin bzw. "Keyhole Limpet"-Hämocyanin, Rinder-β-Globulin oder dergleichen an das Peptid konjugiert werden, wodurch ein Immunogen zur Verfügung gestellt wird, um Antikörper gegen das Peptid zur Verwendung in Immunoassays, zur Aüinitätschromatographie, oder dergleichen, herzustellen. Alternativ kann das Peptid an ein anderes Polypeptid durch Herstellen einer DNA-Sequenz, welche das Peptid am N- Terminus, C-Terminus oder intern im Protein aufweist, gebunden werden, so daß ein fusioniertes Protein bzw. Fusionsprotein geliefert wird, das das Bindungs-Peptid von Interesse beinhaltet. Auf diese Weise können Fusionsproteine hergestellt werden, welche enzymatische Aktivität besitzen, wobei diese enyzmatische Aktivität durch Makromoleküle, z.B. Antikörper, die an das Peptid von Interesse binden, moduliert werden kann. Somit können die Peptide der vorliegenden Erfindung auf vielen verschiedenen Wegen für eine Vielzahl von Endverwendungszwecken modifiziert werden, während sie dennoch ihre biologische Aktivität beibehalten.
Die vorliegenden Peptide können auch in Kombination mit antigenen Peptiden oder Proteinen von Interesse verwendet werden, um CTLs zu aktivieren. So können die vorliegenden Peptide entweder direkt oder indirekt derartig an ein Protein gebunden werden, daß sie in der Lage sind, den CTLs zwei Epitope zu präsentieren, an welchen die CTLs binden und aktiviert werden können. Von besonderem Interesse ist, wo die vorliegenden Peptide in Verbindung mit einem Peptid oder Protein, das die andere determinante Stelle zur Verfügung stellt, an ein Liposom oder eine Doppel- Lipidschichtmembran gebunden werden können.
Verschiedene Techniken sind zur Verknüpfung eines Peptids oder Proteins an ein Lipid, insbesondere ein Phospholipid, verfügbar, um die Gegenwart des Peptids oder Proteins an der Liposomenoberfläche zu ermöglichen. Phosphatidylcholin, Phosphatidylethanolamin oder andere Lipide können mit einem bifunktionellen Verknüpfungsmittel wie MBSE, Glutaraldehyd, Methyldithiobenzoesäure oder dergleichen verwendet werden. Die Bildung von Liposomen mit konjugierten Proteinen findet breiten Rückhalt in der Literatur, siehe zum Beispiel die U.S.-Patente Nr. 3 887 698, 4 261 975 und 4 193 983. Das modifizierte Peptid oder Protein wird in einem wäßrigen Medium mit den Lipiden kombiniert und ultraschallbehandelt, um die gewünschten Liposomen zur Verfügung zu stellen. Die Liposomen können dann geerntet und in den aufgeführten Wegen angewandt werden.
Die vorliegenden Peptide als solche oder in Kombination mit anderen Peptiden oder Proteinen können zur Diagnose des Vorhandenseins von CTLs verwendet werden, welche an ein vorliegendes Peptid oder an die Kombination des vorliegenden Peptids und einem anderem Peptid oder Protein binden. Auf diese Weise können Konjugate aus dem vorliegenden Peptid und dem antigenen Peptid oder Protein durch Anwendung von wie zuvor beschriebenen Verknüpfungsmitteln hergestellt werden. Alternativ dazu können das vorliegende Peptid und das antigene Peptid an eine feste Oberfläche gebunden werden, wie etwa einen Partikel, eine Behälteroberfläche, oder dergleichen. Falls gewünscht können das vorliegende Peptid und das antigene Peptid an einen Partikel oder an ein Protein konjugiert werden, das fluoreszent ist. Die Bindung des Partikels oder Proteins wird das Auftrennung bzw. Sortieren und das Auszählen in einem Fluoreszenzaktivierten Zell-Sorter ermöglichen.
Die vorliegenden Peptide können auch zur Modulierung der CTL-Aktivität in dem Wirtssäuger verwendet werden. Die Modulation kann durch Inhibition der CTL-Aktivität oder durch Sensitivieren der Zielzellen erfolgen. Dies kann durch Anwenden von Apherese, wobei das Blut des Patienten aus dem Patienten entzogen und kreislaufärtig durch eine Vorrichtung geführt wird, in der das Peptid entweder gebunden an der Oberftäche, um die mit dem vorliegenden Peptid aktiven CTLs zu entfernen, oder in einem physiologisch annehmbaren Medium vorhanden ist, um an die CTLs zu binden und ihre Aktivität zu inhibieren, erreicht werden. Alternativ dazu können die vorliegenden Peptide intravaskulär an einen Wirt entweder in eine Arterie oder eine Vene verabreicht werden, um Inhibition oder Stimulation der CTLs zu ermöglichen.
Beispiele für inhibitorische Peptide, welche sowohl von der α1- als auch der α2-Domäne von HLA-A2 abgeleitet sind, werden nachfolgend präsentiert (siehe Beispiele 2 und 9). In jedem Fall korreliert die Sequenz des inhibitorischen Peptids mit der Epitopspezifität der CTL. Darüberhinaus wird, wie in Beispiel 4 gezeigt, die Inhibition durch ein Oktapeptid vermittelt, und geht durch Binden des Peptides an die CTL und nicht an die Zielzelle (siehe Beispiel 5) vor sich. Da das Inhibitionsvermögen der einzelnen Peptide mit der CTL-Spezifität korreliert, scheint es wahrscheinlich zu sein, daß diese Peptide durch Bindung an den variablen T-Zellrezeptor inhibieren.
Ein Beispiel eines Peptides, das die Cytolyse von HLA-Klasse I-tragenden Zielzellen durch alloreaktive CTLs stimuliert, wird in Beispiel 10 untenstehend präsentiert. Die einfachste Interpretation der Ergebnisse in Beispiel 10-12 ist, daß die HLA-A2/B 17- spezifischen CTLs das A2.56-69-Peptid im Zusammenhang mit bzw. der Umgebung von HLA-Aw69 als ein Restriktions-Element erkennen. Dies impliziert, daß das Peptid an das HLA-Aw69-Molekül bindet. Die Daten und die Interpretation sind ähnlich zu denjenigen, welche in den Inlluenza- (Bastin et al, J. Exp. Med., 165:1508 (1987); Gotch et al, Nature 326:881 (1987)) und xenogeneischen Systemen (Maryanski et al., Nature 324:578 (1986)) erhalten wurden, und zeigen, daß alloreaktive CTLs Klasse I- abgeleitete Peptide in einer Klasse I-restringierten Weise erkennen können. Jedoch sind die zur Verursachung von Sensitmerung erforderlichen Mengen von Peptid bedeutend größer als die in anderen Studien berichteten. Obwohl die molekulare Basis für dies bislang unbekannt ist, beinhaltet eine mögliche Erklärung die verwandte Behandlung von exogenen Im Vergleich zu endogenen Molekülen. Zum Beispiel ist HLA ein endogenes Molekül, und die exogenen HLA-Peptide könnten mit den endogenen HLA-Peptiden kompetitieren müssen. Eine andere Alternative ist, daß das A2.56-69-Peptid nicht alle der Reste enthalten könnte, welche für eine Bindung mit hoher Affinität an die Zielzelle benötigt werden.
Zwei der CTL-Epitope, von denen die in den nachfolgenden Beispielen beschriebenen Peptide abgeleitet werden, sind in sehr verschiedenen Teilen des HLA-A2-Moleküls gelegen. Die Reste 62-65 liegen in einer Alpha-Helix, welche einen Teil der Peptid- Bindungsstelle bildet (Bjorkman et al, Nature 329:506 (1987)), von der ihrerseits angenommen wird, daß sie fähig ist, alpha-helikale Peptide zu binden. Wie in den Beispielen gezeigt, können Peptide in dieser Region Cytolyse entweder inhibieren oder induzieren. Bei der Induktion der Cytolyse ist es möglich, daß das Peptid an ein Zielzell- HLA-Klasse I-Antigen binden kann, und dadurch eine Struktur erzeugen kann, welche durch die CTL erkannt wird. In dem Fall zum Beispiel, bei dem das A2.56-69-Peptid Sensitivität gegenüber Zellen des Klons A2/B17 auf HLA-Aw69-Zellen überträgt, ersetzt das gebundene Peptid vermutlich die α-Helix der α1-Domäne, zumal HLA-Aw69 und HLA-A2 identische α2-Domänen besitzen.
Im Gegensatz dazu ist Rest 107 Teil einer Krümmung (turn) zwischen zwei Strängen einer β-Struktur in einiger Entfernung von den Alpha-Helices und der Peptid-Bindungs- Region (Bjorkman et al., siehe oben). Das A2.98-113-Peptid könnte Elemente aus dieser Struktur in Lösung beibehalten, und könnte eine kleine Affinität für die Peptid- Bindungs-Stelle von Klasse I-Molekülen besitzen. Diese Interpretation würde die Beobachtung in den Beispielen erklären, daß dieser Region entsprechende Peptide Inhibitoren von HLA-A2-gesteuerter Cytolyse sind, aber Cytolyse nicht induzieren können.
Wie bereits angesprochen, kann das Peptid als solches oder in Kombination mit einem Antigen vorhanden sein, wodurch eine andere determinante Stelle von Interesse zur Verfflgung gestellt wird. Abhängig davon, ob nur das vorliegende Peptid, oder das Peptid in Kombination mit anderen Peptiden enthalten ist, kann Aktivierung oder inhibition erzielt werden.
Wenn irreversible Inhibition gewünscht wird, kann das Konjugat des vorliegenden Peptides mit dem Antigen an ein cytotoxisches Agens gekoppelt werden, an Liposomen, die cytotoxische Agentien enthalten, gekoppelt werden, oder an einen spezifischen monoklonalen Antikörper oder ein spezifisches Immunoglobulin gekoppelt werden, wodurch die Bindung des Konjugates an die CTL in der Komplement-vermittelten Lyse der CTL resultieren wird.
Die vorliegenden Peptide, als solche oder als Konjugate, können hergestellt werden als Zubereitungen in pharmazeutisch annehmbaren Medien, zum Beispiel Salzlösung, PBS und Glucose, im allgemeinen bei einer pharmakologisch wirksamen Dosis, deren Konzentrationen empirisch gemäß herkömmlichen Verfahren für den jeweiligen Verwendungszweck bestimmt werden. Die Zusatzstoffe können bakterizide Mittel, Stabilisatoren, Puffer oder dergleichen beinhalten. Die an den Wirt verabreichte Menge wird abhängig davon, was verabreicht wird, abhängig von dem Zweck der Verabreichung, wie etwa Prophylaxe oder Therapie, ob Inhibition oder Aktivierung gewünscht wird, dem Zustand des Wirts, der Art der Verabreichung und dergleichen, variieren. Um die Halbwertszeit des vorliegenden Peptids oder der vorliegenden Peptid- Konjugate zu steigern, können die Peptide eingekapselt, in das Lumen von Liposomen eingeführt, als Kolloid hergestellt werden, oder es kann eine andere herkömmliche Technik angewandt werden, welche eine verlängerte Lebensdauer der Peptide zur Verfügung stellt bzw. ermöglicht.
Die folgenden Beispiele werden zur Verdeutlichung und nicht als Beschränkung dargeboten.

BEISPIELE

Beispiel 1

Herstellung von Peptiden, die von HLA-A2 abgeleitet sind

Vier Peptide wurden mittels herkömmlichen Syntheseverfahren unter Verwendung von Standard-Festphasenverfahren hergestellt. Siehe Erickson & Merrifield in: The Proteins Band 2, 3. Auflage (Hrsg.: Neurath, H. & Hill, R. L.) S. 255-527 (Academic Press, N.Y. 1970), was hierdurch durch den Hinweis hier inbegriffen ist. Drei der Peptide hatten Aminosäuren aus der α2-Domäne und eines der Peptide hatte Aminosäuren aus der α2- Domäne eines HLA-A2-Antigens. Die vier Peptide besaßen die folgenden Zusammensetzungen und Bezeichnungen:
Die Bezeichnugnen verweisen auf das Haupthistokompatibilitätsantigen, von dem das Peptid abgeleitet ist, und die Position der Aminosäuren in dem Antigen.

Beispiel 2

Inhibition von HLA-A2-spezifischen CTLs durch von HLA-A2.98-113 und HLA-A2.94-112 abgeleiteten Peptiden

Wie in Beispiel 1 hergestellte Peptide, d.h. diejenigen, die H1-A-A2.56-69, HA-A2.94-112, HLA-A2.98-113 und HLA-Aw 68.98-113 entsprechen, wurden 30 min lang mit 1-3 x 10³ CTLs vor Zugabe von 10³ CPM &sup5;¹Cr-markierten B-lymphoblastoiden Zielzellen vorinkubiert. Der Cytotoxizitäts-Assay wurde dann wie von Clayberger et al, J. Exp. Med. (1984) 162:1709-1714; und Reiss et al, Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1980) 77:5432-5436, was hier durch den Bezug darauf einbezogen ist, beschrieben, durchgeführt.
In der ersten Studie war die CTL-Zellinie AJY, eine langlebige CD8&spplus;-CTL-Linie, die für HLA-A2 spezifisch ist, und die Zielzelle war die B-lymphoblastoide Zellinie JY (HLA- A2, B7). In der zweiten Studie war die CTL PWSB, eine Massenu:ultur mit einer Reaktmtät gegen HL-A-B17, und das Ziel war FMB, welches HLA-A1, A32, B17 exprimiert. In jedem Fall wurde der in Abwesenheit des Peptids erhaltene Prozentsatz an spezifischer Freisetzung bestimmt. Das geringere Ausmaß der spezifischen Freisetzung in der zweiten Studie machte die Cytolyse potentiell anfalliger gegen Inhibition. Stammlösungen von Peptiden bei 1 mg/ml in PBS wurden verdünnt, um die Endkonzentrationen im Assay, wie in Tabelle 1 aufgezeigt, zu ergeben. Als ein Kontrollinhibitor wurde der monoklonale Antikörper PA2.6 verwendet, welcher gegen die monomorphe Determinante von HLA-A-, B-, C-Molekülen gerichtet ist (Reiss et al, siehe oben; McMichael, J. Exp. Med. (1980) 152: 195s-203s). Die eingesetzten Peptide waren A2.98-113, A2.94-112, Aw68.94-112 und A2.56-69. Die nachfolgende Tabelle führt die Ergebnisse auf. Tabelle 1 % Spezifische Lyse Konzentration ug/ml Versuch Ziel
Im ersten Fall war der in Abwesenheit des Peptides erhaltene Prozentsatz spezifischer Freisetzung etwa 54, wohingegen er im zweiten Fall etwa 28 betrug.
Die obenstehenden Ergebnisse mit CTLs, die durch das HLA-A2-Antigen restringiert werden, zeigen Inhibition der spezifischen Cytotoxizität. Mit nicht durch A2 restringierten CTLs findet Lyse von zufälligen Zielzellen mit Resultaten statt, die der in Abwesenheit des Peptids erhaltenen Standard-Freisetzung nahekommen. Diese Ergebnisse legen nahe, daß das Tryptophan an Position 107 kritisch bzw. entscheidend sein könnte. Das Peptid A2.98-113 und das Peptid Aw68.98-113 sind homolog bis auf den Austausch von Glycin gegen Tryptophan an dieser Position; dieser Austausch resultierte in einem Verlust der Inhibition der Cytolyse durch HLA-A2-spezifische CTLs.
Die Ergebnisse der Behandlung des Peptids A2.98-113 mit verschiedenen Proteasen, d.h. Trypsin oder Chymotrypsin, erlauben die Annahme, daß Arginin 108 von Bedeutung ist, aber das die Peptide 109-113 nicht kritisch sind. Die Hauptstellen der Einwirkung von Trypsin und Chymotrypsin sind Arg, Lys bzw. Trp, Phe, Tyr. Chymotryptische aber nicht tryptische Spaltung des Peptides verminderte die inhibitorische Aktmtät (Ergebnisse sind nicht gezeigt).

Beispiel 3

Effekt der Spezifität von CTL und Zielzelle auf die durch HLA-abgeleitete Peptide verursachte Ihhibition der Cytolyse

Eine Anzahl von verschiedenen CTL-Zellinien wurden untersucht, wobei die Spezifltät der Zellinien variiert wurde. Die in Tabelle 2 gezeigten Ergebnisse zeigen, daß nur da, wo die CTLs und die Zielzellen A2-Spezifltät gemeinsam haben, die A2-abgeleiteten Peptide eine Inhibition liefern bzw. bewirken. Tabelle 2 CTL-Spezifität, getestet hinsichtlich der Inhibition durch Peptide Inhibition der Lyse durch das Peptid Spezifität der CTLs Zielzelle Zielmolekül Linie Klon
Die Spezifität der CTLs beruht auf der Analyse des Abtötungsmusters auf einer Palette von B-lymphoblastoiden Zellinien und auf Inhibitions- Mustern mit monoklonalen Antikörpern. ND steht für "nicht durchgeführt". Die verwendeten CTLs stammten aus vier verschiedenen Spendern.

Beispiel 4

Für die Inhibition von HLA-A2-spezifischen CTLs erforderliche Minimal-Peptidsequenz

Die für Inhibition der Cytolyse durch HA-A2-spezifische CTLs benötigte Minimal- Peptidsequenz wurde durch Untersuchung der Auswirkung der Größe auf die Inhibition bestimmt.
Eine Reihe von Peptiden, welche an den Positionen 98-104 begannen und an der Position 108 von HLA-A2 oder HLA-Aw68 endeten, wurden synthetisiert. Der Effekt dieser Peptide auf die Cytolyse von JY-Zellen (HLA-A2, B7, DR4, 6) durch siebzehn verschiedene HLA-A-spezifische Linien oder KIone wurde getestet. Die HLA-A2- spezifischen Linien oder Klone wurden wie in Clayberger et al, siehe oben, beschrieben erzeugt. Die Peptide (200 mg/ml) wurden mit 1-3 x 10³ CTLs 30 Minuten lang vor Zugabe von 10³ CPM &sup5;¹Cr-markierten Zielzellen vorinkubiert. Die Peptide waren während des gesamten Cytotoxizitäts-Assays gegenwärtig, der wie in Clayberger et al., siehe oben, und in Krensky et al, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 79:2365 (1982), welche hiermit als Referenz hier inbegriffen sind, beschrieben durchgeführt wurde. Die Peptide wurden als Stammlösungen bei 1 mg/ml in Phosphat-gepufferter Salzlösung hergestellt und in Komplett-Medium (MEM, supplementiert mit 10% Kälberserum) verdünnt, um die verwendeten Endkonzeutrationen zu ergeben.
Die Ergebnisse auf die Inhibition der Cytolyse durch CTL-A2 sind in Fig. 1A gezeigt, worin Inhibition ausgedrückt wird als (1-[spezifische Cytolyse in der Gegenwart des Peptids/spezifische Cytolyse in der Abwesenheit des Peptids]) x 100.
Wie in der Figur ersichtlich, inhibierte das Peptid 104-108 nicht, die Peptide 102-108 und 103-108 verursachten schwache Inhibition, und die übrigen Peptide verursachten eine gute Inhibition der Cytolyse. So war ein Oktapeptid, das die Reste 101-108 umfaßte, ausreichend, um den inhibitorischen Effekt zu verursachen.
Eine größere Einbuße in dem inhibitorischen Effekt fmdet mit dem Verlust des Cysteins an Position 101 statt. Diese Abnahme kann auf dem Verlust von einer Disulfid- Querverknüpfung zweier Peptidmoleküle beruhen, wenn das Cystein 101 nicht vorhanden ist.

Beispiel 5

Wirkungsort des Peptids A2.98-1 13

Der Ort, an dem das Peptid A2.98-113 interagiert, um einen inhibitorischen Effekt auf HLA-A2-spezifische CTL-vermittelte Cytolyse hervorzuufen, d.h. mit der CTL und/oder mit der Zielzelle, wurde wie folgt bestimmt.
Die CTLs (1 x 10&sup6; CTL-A2) und/oder die Zielzellen (&sup5;¹Cr-markierte JY-Zielzellen) wurden 30 min lang bei 37ºC mit 100 ug A2.98-113, oder alternativ mit dem Kontrollpeptid Aw68.98-113 inkubiert. Die Sequenzen dieser Peptide sind in Beispiel 1 dargestellt. Als eine weitere Kontrolle wurden die Zellen mit Komplett-Medium ohne Peptid inkubiert. Im Anschluß an die Inkubation, wurden die Zellen dreimal in Komplett- Medium gewaschen und in einem &sup5;¹Cr-Freisetzungs-Assay (siehe Beispiel 2) getestet.
Die Ergebnisse sind in Fig.2 dargestellt, worin ersehen werden kann, daß die Lyse inhibiert wurde, wenn die CTLs, jedoch nicht wenn die Zielzellen, mit A2.98-113 vorbehandelt wurden. Inhibitorische Effekte wurden nicht beobachtet, wenn CTLs oder Zielzellen mit dem Kontrollpeptid Aw68.98-113 vorbehandelt wurden.

Beispiel 6

Mechanismus der Inhibition von CTLs durch A2.98-113 Effekt auf die CTL-Lebensfähigkeit

Um zu bestimmen, ob CTLs wegen ihrer durch A2.98-113 induzierten Autolyse inhibiert wurden, wurden entweder &sup5;¹Cr-markierte CTL-A2-Zellen oder unmarkierte CTL-A2- Zellen 6 Stunden lang mit dem Peptid bei 37ºC in einem Vollmedium ink:ubiert. Während der 6 Stunden langen Inkubation trat keine nachweisbare Verminderung in der Zell- Lebensfahigkeit aufs wie durch Exklusion von Trypanblau oder durch &sup5;¹Cr-Freisetzung beurteilt wurde (Ergebnisse nicht gezeigt).

Beispiel 7

Mechanismus der Inhlbition von CTLs durch A2.98-113 Effekt auf die Freisetzung von Serinesterase enthaltenden Granulae bzw. Vesikeln

Der Effekt von A2.98-113 auf die Freisetzung von Serinesterase enthaltenden Granulae während der Cytolyse von Zielzellen durch CTLs wurde wie folgt bestimmt.
Die Spezifität der Freisetzung wurde durch 2 Stunden langes Inkubieren von 3 x 10&sup5; HLA-A2-speziftschen CTLs mit JY-Zellen (HLA-A2; B7; Dr4, 6) oder IBW4-Zellen (HLA-A3; B35; DR1) in Mikrotiterplatten-Vertiefungen mit V-förmigem Boden bestimmt. Die Verhältnisse von CTL:Zielzellen waren 1:0,01, 1:0,05, 1:0,10, 1:0,5 und 1:1. Nach der Inkubation wurden die Platten 2 Minuten lang bei 1000 Upm zentrifugiert, und der Überstand wurde im wesentlichen wie in Young et al, Cell 47:183 (1986), was hiermit als Referenz hier eingebunden ist, beschrieben auf Serinesterase-Aktivtät geassayt bzw. untersucht. Die Reaktionsmischungen bestanden aus 20 ul des Überstandes plus 200 ul des Substrates (2 x 10&supmin;&sup4; M N-Benzyloxycarbonyl-L-Lysin-thiobenzylester, 2,2 x 10&supmin;&sup4; M Nitrobenzoesäure, 0,1 M Tris-HCl, pH 8,0). Nach 30 min bei 37ºC wurde die Absorption bei 410 nm ermittelt. Die Serinesterase-Gesamtaktivität wurde durch Einsetzen von 0,01% Triton X-100 anstelle der Stimulatorzellen bestimmt.
Die, in Fig. 3A gezeigten, Resultate verweisen darauf, daß die Freisetzung von Granulae stattfand wenn die HLA-A2-spezifischen CTLs mit JY-Zellen inkubiert wurden (geschlossene Kreise), aber nicht, wenn die HLA-A2-spezifischen CTLs mit IBW4- Zellen inkubiert wurden (geschlossene Quadrate).
Der Effekt des Peptides A2.98-113 auf die Freisetzung von Serinesterase enthaltenden Granulae wurde auf eine ähnliche Weise bestimmt, außer daß die HLA-A2-spezifischen CTLs mit 100 ug Peptid, entweder A2.98-113 oder Aw68.98-113, oder nur mit Komplett-Medium, 30 min lang bei 37ºC vor der Zugabe von JY-Zielzellen bei Verhältnissen von CTL:Zielzellen von 1:0,01, 1:0,05, 1:0,1, 1:0,5 und 1:1 vorinkubiert wurden.
Wie in Fig. 3B zu sehen ist, wurde eine vollständige Inhibition der Esterase-Freisetzung bei 100 ug/ml A2.98-113 bei einem Effektor-zu-Ziel-Verhältnis von 1:0,1 beobachtet (geschlossene Quadrate). Das Kontrollpeptid Aw68.98-113 hatte keinen Effekt auf die Esterase-Freisetzung (geschlossene Dreiecke), zumal die Freisetzung in diesem Fall gleich war zu derjenigen, die mit Kontrollzellen erhalten wurde, die mit Komplett- Medium vorinkubiert worden waren (geschlossene Kreise).
Diese Ergebnisse, in Verbindung mit denjenigen in Beispiel 5, zeigen, daß das Peptid A2.98-113 Ereignisse, die früiizeitig in der T-Zell-Aktivierung stattfmden, durch direktes Binden an die CTL blockiert. Diese Bindung könnte an den Antigen-Rezeptor erfolgen.

Beispiel 8

Isolierung von CTLs welche spezifisch für das Epitop, das HLA-A2 und HLA-B17 gemeinsam haben, für HLA-B17 und für HLA-2 sind.

CTLs mit den verschiedenen Spezifitäten wurden aus peripheren Blut-Lymphocyten eines normalen Spenders (HLA-A3; B7; DR6) im wesentlichen wie von Clayberger et al (1985), siehe oben, beschrieben abgeleitet. Für CTLs, die spezifisch für das zwischen HLA-A2 und HLA-B17 gemeinsame Epitop sind, wurden die Zellen in Primärkulutr mit der bestrahlten (10 000 R) B-lymphoblastoiden Zellinie Mag (HLA-A26, 33; B17, 51) stimuliert und unter Verwendung der SB-Zellinie (HLA-A 1, 2; B 17, 44; DR2, 6) als Stimulatoren kloniert. Für B17 spezifische CTLs wurden aus der selben Primärkultur abgeleitet, aber wurden unter Verwendung der SH-Zellinie (HLA-A3, w33; B7, 17(w57)) als Stimulatoren kloniert. HLA-A2-spezifische CTLs wurden aus Zellen hergeleitet, die in Primärkultur mit der JY-Zellinie stimuliert wurden, und wurden unter Verwendung der Herluff-Zellinie (HLA-A2; B12, 35; DR4 7) als Stimulator kloniert. Die Feinspezifität dieser CTL-Kione wurde unter Verwendung einer Palette von 11 HLA-B17-exprimierenden Zielen, 8 HLA-A2-exprimierenden Zielen und 15 Zielen mit nicht-verwandten HLA-Molekülen geprüft. Mehrere Klone von den gewünschten Spezifitäten wurden erhalten. Ein individueller Kion, der Cytolyse sowohl von Zielzellen des HLA-A2-Typs, als auch von Zielzellen des HLA-B17-Typs verursachte, wurde als Kion A2/B17 bezeichnet. Die Cytolyse von Zielzellen des Klons A2/B17 wurde durch den Antikörper MA2.1 verhindert. Ein zweiter KIon, der alle HLA-B17-Zielzellen, aber keine anderen lysierte, wurde B17 genannt. Ein dritter Klon, der alle HLA-A2-Zielzellen, aber keine anderen, lysierte, wurde als CTL-A2 bezeichnet.
Die Zielspezifität von Klon A2/B17 und der Befund, daß die Cytolyse durch diesen Klon durch den monoklonalen Antikörper MA2.1 blockiert wurde, deutet darauf hin, daß Zellen des Kions A2/B17 das Epitop erkennen, das HLA-A2 und HLA-B17 gemeinsam ist.

Beispiel 9

Der Effekt von Peptiden von verschiedenen HLA-A2-Epitopen auf die Cytolyse von Zielzellen durch CTLs von verschiedenen Spezifitäten.

Die Beispiele 2-7, siehe oben, betraffen die Effekte von Peptiden, welche aus der Region um Tryptophan 107 in der α2-Domäne hergeleitet waren. Dieser Rest, der an einem Knick zwischen zwei Strängen eines β-Faltblattes liegt (Bjorkman et al, (1987), siehe oben), ist bedeutend bzw. kritisch für ein serologisches Haupt-Epitop von HLA-A2. Salter et al, J. Exp. Med. 166:283(1987); Layet et al, J. Immunol. 138:2197(1987).
Ein anderes bedeutendes Epitop beinhaltet die Reste 62-65 der α-helikalen Region der α1-Domäne. Bjorkman et al, siehe oben. Dieses Epitop wurde ursprünglich durch den monoklonalen Antikörper MA2.1 definiert (McMichael et al, Hum. Immunol. 1:121 (1980)), und ist allen bekannten Untertypen von HLA-A2 und HLA-B17 gemeinsam (Ways und Parham, Biochem J. 216:423 (1983)). Ein Vergleich der Aminosäuresequenz von HLA-A2 und HLA-B17 und von acht anderen HLA-A-, B-, C-Proteinen zeigte, daß nur der Glycinrest an der Position 62 einzigartig ist, was nahelegt, daß dieser Rest zu einer gemeinsamen Determinante beiträgt (Ways et al, J. Immunol. 137:217 (1986)).
Aus den obengenannten zwei Regionen abgeleitete Peptide wurden auf ihren inhibitorischen Effekt auf die Cytolyse von Zielzellen durch CTLs mit verschiedenen HLA-Spezifitäten, d.h. diejenigen von Klon A2/B17, Klon CTL-A2 und Klon B17 (siehe Beispiel 8, obenstehend), hin untersucht. Die CTLs wurden mit den folgenden Peptiden inkubiert: A2.56-69, Aw68.56-69, A2.98-113 oder Aw68.98-113.
Die untersuchten Epitope und in der Studie verwendeten Peptide sind in Fig. 4 gezeigt, worin die Proteinsequenzen in den drei extrazellulären Domänen (α1, α2 und α3) von acht HLA-A-, B-Molekülen unter Verwendung des Standard-Ein-Buchstaben- Aminosäurecodes gezeigt sind. Die Sequenz des HLA.8w58-Subtyps von HLA-B17 ist aus Ways et al, J. Biol. Chef 260:11924 (1985), die von HLA-A3.1 ist aus Strachen et al, EMBO J. 3:887 (1984), und die übrigen Sequenzen der HLA-A2/28-Familie sind aus Holmes et al, J. Immunol. 139:936 (1987). Die Peptide A2.56-69 und Aw68.56-69, und A2.98-113 und Aw68.98-113, welche von α1 bzw. α2 abgeleitet sind, sind durch Schräg-Schraffierung gezeigt. Die zwei Reste, die als kritisch für die den Subtypen von HLA-A2 und HLA-B17 (Glycin 62) und den Subtypen HLA-A2 und HLA-Aw69 (Tryptophan 107) gemeinsamen Epitope befunden wurden, sind durch Punktierung und die senkrechten Pfeile dargestellt. Die Konsensussequenz ist aus einer Gesamtheit von 23 HLA-A, B-, C-Sequenzen hergeleitet.
Die CTLs wurden mit den Peptiden bei Konzentrationen von 100 ug/ml, 200 ug/ml oder 300 ug/ml inkubiert. Kontrollproben wurden in der Abwesenheit des Peptids inkubiert. Die molaren Endkonzentrationen der in dem Assay bei 100 ug/ml verwendeten Peptide waren 4,9 x 10&supmin;&sup5;M für A2.98-113; 5,2 x 10&supmin;&sup5;M für Aw68.98-113; 5,9 x 10&supmin;&sup5;M für A2.56-69; und 5,9 x 10&supmin;&sup5;M für Aw68.56-69. Die CTL-Zellen wurden mit den Peptiden 20 min lang vor der Zugabe von 10³ &sup5;¹Cr-markierten T7529-Zellen (HLA-Aw33; B17(w58); DR6) oder JY-Zellen (HLA-A2; B17; DR4, 6) ink:ubiert. In allen Fällen waren die Effektor-zu-Ziel-Verhältnisse bei 1:1.
Die Resultate hinsichtlich der Cytotoxizität, wie gemessen durch &sup5;¹Chrom-Freisetzung aus den Zielzellen, sind in Fig. 5 gezeigt. Die Figuren 5A und 5B zeigen die Ergebnisse des Effekts der Peptide auf Zellen des Kions A2/B17; Fig. 5C zeigt die Effekte auf Zellen des Kions B17, und Fig. 5D auf CTL-A2. Die Peptide sind wie folgt dargestellt: (offene Kreise) A2.56-69; (offene Quadrate) Aw68.56-69; (offene Dreiecke) Aw.98-113; und (geschlossene Quadrate) Aw68.98-113.
Das Peptid A2.56-69, das das gemeinsame serologische Epitop umfaßt, inhlbierte spezifisch die Abtötung von sowohl HLA-A2 als auch HLA-B17 exprimierenden Zielzellen durch Klon A2/B17-Zellen. Im Gegensatz dazu hatte dieses Peptid keinen Effekt auf die Lyse von HLA-B17 exprimierenden Zellen durch Klon B17-Zellen. Die Kion A2/B 17-Zellen wurden nicht durch ein von den Resten 56-69 von fiA-Aw68. 1 hergeleitetes Peptid, oder durch eine Reihe von nicht-verwandten Peptiden inhibiert. Das Peptid A2.98- 113 beeinträchtigte die Lyse von HLA-B 17 exprimierenden Zielen durch Klon A2/B17-Zellen nicht aber es wurde etwas Inhibition bei hohen Konzentrationen mit HLA-A2 exprimierenden Zielen beobachtet. Diese Differenz zeigt, daß die Epitope von HLA-A2 und HLA-B17, die von Klon A2/B17-Zellen erkannt werden, nicht präzise gleich sind.
Diese Ergebnisse zeigen, daß die Fähigkeit der Peptide, alloreaktive CTLs zu inhibieren, nicht auf die Region, welche die Reste 101-108 aus der α2-Domäne beinhaltet, restringiert bzw. beschränkt ist, und daß selbige aus einem zweiten Epitop von HLA-A2 abgeleitet werden können.
Die Diskrepanz der mit dem Peptid A2.56-69 unter Einsatz von Kion A2/B17 und der mit der PWSB-Zellinie (siehe Tabelle 2) erhaltenen Ergebnisse hinsichtlich dem inhibitorischen Effekt dieses Peptides kann durch die polyklonale Natur der PWSB-Zellen erklärt werden. Das bedeutet. daß die PWSB-Linie wahrscheinlich eine Mischung von CTLs ist, einschließlich individueller Kione, die spezifisch für HLA-A2 oder HLA-B17 sind.

Beispiel 10

Durch ein von HLA-A2 abgeleitetes Polypeptid hervorgerufene Sensitivierung von Zielzellen gegen CTLs

Der Klon A2/B17 wurde 5 Stunden lang mit Peptid A2.56-69 und &sup5;¹Cr-markierten Zielzellen bei einem Effektor-zu-Ziel-Verhältnis von 5:1 inkubiert, wonach das freigesetzte &sup5;¹chrom gemessen wurde. Die Peptidkonzentrationen waren 10, 30, 100 und 300 ug/ml. Die Ergebnisse des Effekts des Peptides auf den Prozentsatz der spezifischen Lyse der Zielzellen durch Klon A2/B17-Zellen sind in Fig. 6 dargestellt. Die Zielzellen waren: (geschlossenes Quadrat), IBW4 (HLA-A3; B35; DR1); (geschlossenes Dreieck), LB (HLA-Aw68.1; B40, DR6); (geschlossener Kreis), Pally (HLA-Aw68.2, 26; B14, 38; DR1, 4), oder (offene Raute), IDF (HLA-Aw69, 26; B18, 38; DR5).
In der Abwesenheit des Peptides lysieren Klon A2/B17-Zellen keine Ziele, welche HLA- Aw69, HLA-Aw68.1 und HA-Aw68.2 exprimieren (Daten nicht gezeigt). Die Unfahigkeit von Kion A2/B17-Zellen, diese Ziele zu lysieren, beruht auf den Unterschieden in den kritischen Resten um Position 62 gegenüber denen, die in HLA-A2 und HLA-B17 zu finden sind. Wenn jedoch das Peptid A2.56-69 in den Cytotoxizitäts- Assay eingebunden wurde, fand eine signifkante Lyse von HLA-Aw69 exprimierenden Zielen durch A2/B17-Zellen statt (Fig. 5). Im Gegensatz dazu wurden Ziele, die HLA- Aw68.1, HLA-Aw68.2 oder die nicht-verwandten HLA-A3-Moleküle exprimierten, nicht lysiert.
Die Lyse von HLA-Aw69-Zellen durch Kion A2/B17-Zellen in der Gegenwart des Peptides A2.56-69 wurde durch den monoklonalen Antikörper DR11-351 blockiert, der nur an das HLA-Aw69 der Zielzelle bindet. 1m Gegensatz dazu inhibierte der monoklonale Antikörper MA2.1 die Lyse nicht (Daten nicht gezeigt). MA2.1 bindet an das Epitop von HLA-A2 und HLA-B17, das von den Resten 56-69 gebildet wird, aber bindet nicht an das HLA-Aw69 oder das Peptid A2.56-69. Diese Ergebisse demonstrieren die Beteiligung des HLA-Aw69-Moleküls bei der Sensitivierung durch das Peptid A2.56-69.
Die Zugabe des Peptides A2.98-113 zu B-Zellinien, welche nicht HLA-A2 exprimieren, verursachte keine Sensitivierung gegenüber der Lyse, wobei Zielzellen verwendet wurden, die eine Reihe von HLA-Molekülen exprimierten. Dies war gültig, selbst über einen breiten Bereich von Peptidkonzentrationen hinweg (0, 1 bis 300 ug/ml wurden eingesetzt).
Bei der Bindung von A2.56-69 ist das HLA-Aw69-Molekül in der Lage, ein Epitop zu präsentieren, das die native Struktur von HLA-A2 imitiert. Daß HLA-Aw69, aber keine anderen Mitglieder der HLA-A2/28-Familie sensitiviert werden können, ist von Interesse. HLA-Aw69 ist ein rekombinantes Molekül, das al abgeleitet von HLA-Aw68 und α2 und α3 abgeleitet von HLA-A2.1 aufweist (Holmes und Parham, EMBO J. 4:2849 (1985)). Somit unterscheiden sich HLA-A2.1 und HLA-Aw69 nur in 6 Aminosäuren, die alle in der α1-Domäne liegen, und von denen drei in dem A2.56-69- Peptid vorhanden sind.

Beispiel 11

Ort der Peptidinteraktion bei der Sensitivierung

Um zu prüfen, ob die Sensitivierung aus Peptidinteraktion mit der CTL oder dem Ziel resultierte, wurden Zellen mit A2.56-69 vorbehandelt, gewaschen und dann auf Cytolyse getestet. Genauer gesagt wurden 1x 10&sup6; Klon A2/B17-Zellen oder &sup5;¹Cr-markierte IDF (HLA-Aw69, 26; B18, 38; DR5) mit 100 ug Peptid oder Medium 30 min lang bei 37ºC inkubiert, dreimal gewaschen, und die Cytotoxizität, wie durch Freisetzung von &sup5;¹chrom bestimmt, wurde gemessen.
Wie aus den in Fig. 7 präsentierten Ergebnissen zu sehen, wurden HLA-Aw69 exprimierende Zielzellen lysiert wenn die Ziele, jedoch nicht die CTLs, mit A2.56-69 vorbehandelt worden waren.

Beispiel 12

Effekt des Peptids A2.56-69 auf die Freisetzung von Serinesterase enthaltenden Granulae

Der Effekt des Peptides A2.56-69 auf die Freisetzung von Serinesterase enthaltenden Granulae bzw. Vesikeln während Cokultivierung von A2/B17-Zellen mit HLA-Aw69 exprimierenden Zellen kann im wesentlichen wie in Beispiel 7, siehe oben, beschrieben werden, außer daß die CTLs von dem Klon A2/B17 sind, die Zielzellen solche sind, die HLA-Aw69 exprimieren, und daß die Zellen in der Abwesenheit oder Gegenwart des Peptides A2.56-69 cokultiviert werden.
Obwohl die vorstehende Erfindung aus Zwecken des klaren Verständinsses auf dem Wege der Verdeutlichung und in Beispielen in einigem Detail beschrieben worden ist, wird es offensichtlich sein, daß bestimmte Veränderungen und Modikationen ausgeführt werden können, die innerhalb des Umfangs der beigefügten Patentansprüche fällen.

ANWENDUNGSGEBIETE

Es ist aus den obengenannten Ergebnissen offensichtlich, daß cytotoxische Zellen durch Anwendung der vorliegenden Peptide, die kreuzreaktiv mit den polymorphen Regionen eines Klasse I-MHC-Antigens sind, wie mit dem A2-Antigen gezeigt, inhibiert werden können. Auf diesem Wege können CTLs spezifisch daran gehindert werden, Zielzellen zu lysieren, die dasselbe Antigen exprimieren, durch welches die CTLs restringiert werden. Dies ist von Nutzen bei der Transplantation von organischem Gewebe, um eine seitens des Empfängers erfolgende Abstoßung des Gewebes, welches durch CTLs restringiert wird zu verhindern. Darüberhinaus kann dies bei der Prävention/Therapie voll Autoimmunkrankheiten von Nutzen sein.
Alternativ dazu können die CTLs durch Anwenden spezifischer Konjugate, welche die vorliegenden Oligopeptide in Verbindung mit einem Antigen von Interesse beinhalten, aktiviert werden. Dies ist nützlich bei der Aktivierung von CTLs, Zellen zu lysieren, die andere Antigene tragen, als die, die von den CTLs erkannt werden, und kann somit CTLs dazu veranlassen, Zellen zu lysieren, die Antigene tragen, welche für den Wirt kryptisch sind zum Beispiel bei parasitären Erkrankungen und bei Neoplasie.
Die vorliegenden Verbindungen können auch bei viralen Studien zur Bestimmung von mit der Restriktion von T-Lymphozyten assoziierten MHC-Sequenzen im Falle von viraler Infektion verwendet werden.
Die Peptide der Erfindung können ebenfalls benutzt werden, um die Gegenwart oder Abwesenheit von CTLs zu bestimmen, die gegen Zellen gerichtet sind, welche das HLA- Klasse 1-Molekül tragen, von dem das Peptid abgeleitet ist. Die Kenntnis über Gegenwart oder Abwesenheit der gerichteten CTLs ist nützlich bei der Vorhersage des Erfolgs oder Mißerfolgs und/oder der Erforderlichkeit für eine CTL-Modulation bei der Transplantation von organischem Gewebe. Sie kann auch hilfreich zur Bestimmung der Mechanismen sein, durch die Zellen für das Immunsystem kryptisch werden. Darüberhinaus können diese Peptide ebenfalls bei der Detektion von Autoimmmunerkrankungen hilfreich sein.

Claims

1. Peptid das an einen aus einer Markierungsgruppe, einem Immunogen, einem Polypeptid antigen, einem Linker und einem cytotoxischen Mittel gewähiten funktionellen Teil gebunden ist;

worin das Peptid CTL (cytotoxische T-Lymphozyt)-Aktivität modukert und aus einer Sequenz von mindestens 8 innerhalb folgender erweiterten Sequenz vorliegenden Aminosäuren besteht:

worin:

aa&sup5;&sup5; E oder K ist;

aa&sup6;² G, Q, E oder R ist;

aa&sup6;³ eine saure Aminosäure oder ein Amid davon ist;

aa&sup6;&sup5; Q, R oder G ist;

aa&sup6;&sup6; I, N oder K ist;

aa&sup6;&sup7; eine aliphatische neutrale Aminosäure ist;

aa&sup6;&sup9; eine aliphatische neutrale Aminosäure ist;

aa&sup7;&sup0; Q, H, S, N oder K ist;

aa&sup7;¹ eine aliphatische neutrale Aminosäure ist:

aa&sup7;&sup4; D, Y oder H ist:

aa&sup7;&sup6; E oder V ist:

aa&sup7;&sup7; D, S oder N ist;

aa&sup7;&sup9; R oder G ist;

aa&sup8;&sup0; T, I oder N ist;

aa&sup8;¹ eine aliphatische nicht-polare Aminosäure ist:

aa&sup8;² R oder L ist;

aa&sup8;³ G oder R ist;

aa&sup9;&sup4; T oder I ist:

aa&sup9;&sup5; eine nicht-polare aliphatische Aminosäure mit 5 bis 6 Kohlenstoffatomen ist;

aa&sup9;&sup7; eine aliphatische Aminosäure oder W ist;

aa&sup9;&sup9; eine aromatische Aminosäure ist:

aa¹&sup0;³ eine nicht-polare aliphatische Aminosäure mit 5 bis 6 Kohlenstoffätomen ist;

aa¹&sup0;&sup5; P oder S ist;

aa¹&sup0;&sup7; G oder W ist;

aa¹&sup0;&sup9; L oder F ist;

aa¹¹³ Y oder H ist;

aa¹¹&sup4; H, Q, D, N oder R ist;

aa¹¹&sup6; Y, D, S, F oder H ist;

mit der Maßgabe, daß das Peptid nicht ein markiertes Peptid folgender Formel ist:

(i) R E T Q I C K A K

(ii) A Q T D R E aa&sup7;&sup7; L R, worin aa&sup7;&sup7; D, S oder N ist;

(iä) G Y Y N Q S E A G S H T L Q aa&sup9;&sup7;, worin aa&sup9;&sup7; S oder R ist;

(iv) Y G C D V G P D G R

2. Peptid gemaß Anspruch 1, welches aus mindestens 8 innerhalb folgender erweiterten Sequenz vorliegenden Aminosäuren besteht:

G S H T [V, I oder L] Q R M Y G C D V G S D [W oder G] R F L R G Y H Q Y A Y D G;

oder

Q E G P E Y W D (G oder R) (E oder N) T (R oder Q) (K oder N) V K A (H oder Q) S Q T (H oder D) R (V oder E) (D, S oder N) L (G oder R) (T oder I) (L oder A) (R oder L) (G oder R) Y Y N Q S E A.

worin die Aminosäuren in den Klammern anzeigen daß eine beliebige der Aminosäuren in den Klammern vorliegt.

3. Peptid nach Anspruch 1 oder 2, welches entweder an dem N- oder C-Terminus durch eine Aminosäuresequenz erweitert ist, die eine andere als die Sequenz vom Wild-Typ des Proteins ist von dem das Peptid abgeleitet ist.

4. Pharmazeutische Zusammensetzung, welche ein Peptid enthält, wie es in mindestens einem der vorhergehenden Ansprüche definiert ist, vorliegend in einer pharmakologisch wirksamen Dosis in einem pharmazeutisch zulässigen Medium.

5. Pharmazeutische Zusammensetzung gemäß Anspruch 4, worin die Peptidverbindung aus folgenden Sequenzen gewählt ist.

T L Q R M Y G C D V G S D W R F L R G,

M Y G C D V G S D W R F L R G Y,

M Y G C D V G S D G R F L R G Y,

G P E Y W D G E T R K V K A und

G P E Y W D R N T R N V K A.

6. Ex vivo-Verfahren zur Bestimmmg der Anwesenheit von MHC-restringierten cytotoxischen T-Lymphozyten (CTLs), welches folgendes umfaßt:

Kontaktieren cytotoxischer T-Lymphozyten mit einem Peptid, wie es nach mindestens einem der Ansprüche 1 bis 3 definiert ist, wobei das Peptid kovalent an eine Verbindung gebunden ist, die zur Bereitstellung eines detektierbaren Signals in der Lage ist: und

Bestimmen der Anwesenheit von Zellen, an denen die ein detektierbares Signal hervorbringende Verbindung spezifisch gebunden ist.

7. Peptidverbindung mit mindestens 8 Aminosäuren und nicht mehr als etwa 30 Aminosäuren wobei das Peptid CTL-Aktivität moduliert und aus einer Sequenz von mindestens 8 innerhalb der erweiterten Sequenz vorliegenden Annnosäuren, definiert in Anspruch 1 besteht, zur Verwendung bei einem Verfahren zur Behandlung des menschlichen oder tierischen Körpers.

8. Peptid zur Verwendung gemäß Anspruch 7, worin das Peptid folgende Formel aufweist:

(A) wie in Anspruch 1 oder 2 definiert;

(B) G S H aa&sup9;&sup4; aa&sup9;&sup5; Q aa&sup9;&sup7; M aa&sup9;&sup9; G C D aa¹&sup0;³ G aa¹&sup0;&sup5; D aa¹&sup0;&sup7; R aa¹&sup0;&sup9; L R G a¹¹³ aa¹¹&sup4; Q a¹¹&sup6; A Y D G;

worin

aa&sup9;&sup4; T oder I ist;

aa&sup9;&sup5; eine nicht-polare aiiphatische Aminosäure mit 5 bis 6 Kohlenstoffatomen ist;

aa&sup9;&sup7; eine aliphatische Aminosäure oder W ist;

aa&sup9;&sup9; eine aromatische Aminosäure ist;

aa¹&sup0;³ eine nicht-polare aliphatische Aminosäure mit 5 bis 6 Kohlenstoffatomen ist;

aa¹&sup0;&sup5; P oder S ist;

aa¹&sup0;&sup7; G oder W ist;

aa¹&sup0;&sup9; L oder F ist;

aa¹¹³ Y oder H ist;

aa¹¹&sup4; H,Q,D,N oder R ist;

aa¹¹&sup6; Y,D,S,F oder H ist;oder

(C) aa&sup5;&sup5; G P E Y W D aa&sup6;² aa&sup6;³ T aa&sup6;&sup5; aa&sup6;&sup6; aa&sup6;&sup7; K aa&sup6;&sup9; aa&sup7;&sup0; aa&sup7;¹ Q T aa&sup7;&sup4; R aa&sup7;&sup6; aa&sup7;&sup7; aa&sup7;&sup9; aa&sup8;&sup0; aa&sup8;¹ aa&sup8;² aa&sup8;³ Y Y N Q S E A

worin

aa&sup5;&sup5; E oder K, insbesondere E ist;

aa&sup6;² G, Q, E oder R, insbesondere R oder G ist;

aa&sup6;³ eine saure Aminosäure oder ein Amid davon ist: einschließend E und N,

insbesondere E:

aa&sup6;&sup5; Q, R oder G, insbesondere Q oder R ist:

aa&sup6;&sup6; I, N oder K, insbesondere N oder K ist:

aa&sup6;&sup7; eine aliphatische neutrale Aminosäure ist, einschließend V, M, S, C und Y, insbesondere V;

aa&sup6;&sup9; eine aliphatische neutrale Aminosäure ist, einschließend A, T und P, insbesondere A;

aa&sup7;&sup0; Q, H, S, N oder K, insbesondere Q oder H ist;

aa&sup7;¹ eine aliphatische neutrale Aminosäure ist, einschließend S, A und T, insbesondere S;

aa&sup7;&sup4; D, Y oder H, insbesondere D oder H ist;

aa&sup7;&sup6; E oder V ist;

aa&sup7;&sup7; D, S oder N insbesondere D ist;

aa&sup7;&sup9; R oder G, insbesondere G ist:

aa&sup8;&sup0; T, I oder N, insbesondere T oder I ist:

aa&sup8;¹ eine aliphatische nicht-polare Aminosäure ist, einschließend L oder A, insbesondere L;

aa&sup8;² R oder L, insbesondere R ist;

aa&sup8;³ G oder R, insbesondere G ist;

zur Verwendung bei einem Verfahren der Behandlung des menschlichen oder tierischen Körpers.

9. Peptid zur Verwendung gemäß Anspruch 7 oder 8, worin das Verfahren der Behandlung die Inhibierung der cytolytischen Akvität eines cytotoxischen T-Lymphozyten inhibiert.

10. Peptid zur Verwendung nach Anspruch 8, worin das Peptid die Formel (C) besitzt und das Verfahren der Behandlung das Sensibilisieren von MHC-restringierten Zellen auf einen cytotoxischen T-Lymphozyten uinfäßt.

11. Peptid, wie es nach mindestens einem der Ansprüche 1 bis 3 definiert ist, konjugiert an einem Mittel, welches Cytotoxizität verursacht, zur Verwendung bei einem Verfahren der Inhibierung cytolytischer Aktivität eines CTL (cytotoxischer T-Lymphozyt) durch irreversible Bindung des CTL.