DE69229562T2

DE69229562T2 - Peptide, die cd8 moleküle auf ctl-vorläufern binden

Info

Publication number: DE69229562T2
Application number: DE69229562T
Authority: DE
Inventors: Carol Clayberger; Alan Krensky
Original assignee: Leland Stanford Junior University
Current assignee: Leland Stanford Junior University
Priority date: 1991-11-08
Filing date: 1992-11-03
Publication date: 1999-11-25
Anticipated expiration: 2012-11-04
Also published as: AU3062892A; GR3031169T3; EP0661985B1; EP0661985A4; US5620956A; ES2136094T3; CA2122266A1; DK0661985T3; EP0661985A1; AU673985B2; ATE181836T1; JP3345419B2; DE69229562D1; WO1993008817A1; JPH07505609A

Description

GEBIET DER ERFINDUNG

Die vorliegende Erfindung betrifft HLA-Peptid-Zusammensetzungen, welche die T-Zellen-Aktivität beeinflussen. Es werden Verfahren und Zusammensetzungen zur Modulation zytolytischer T-Lymphozyten-Aktivität bereitgestellt.

HINTERGRUND DER ERFINDUNG

Zytolytische T-Lymphozyten (auch als "zytotoxische T-Lymphozyten" bezeichnet und üblicherweise als "CTLs" abgekürzt) sind eine Klasse von T-Zellen, die sich an Zielzellen binden und diese lysieren. Die meisten CTLs sind in ihrer Abzielaktivität eingeschränkt, indem auf der Oberfläche einer Zielzelle ein Histokompatibilitäts-Hauptmolekül der Klasse 1 (Klasse I-MHC) erkannt wird, das ein assoziiertes Antigen trägt. Man nimmt an, daß die Wechselwirkung zwischen dem CTL und seinem Ziel durch Haftung eines T-Zellen-Rezeptors (TCR) und eines assoziierten Proteinkomplexes, der als "CD3" bekannt ist (zusammen als "TCR:CD3"-Komplex bezeichnet), vermittelt wird, wobei sich auf der Zielzelle ein MHC-Antigen-Komplex befindet. CTLs, die mit Klasse I-MHC- Molekülen in Wechselwirkung treten, besitzen häufig ein anderes als "CD8" bezeichnetes Hilfsprotein. Man geht davon aus, daß CD8 ein Oberflächen-Glykoprotein ist, das die Wechselwirkung zwischen dem TCR:CD3-Komplex und dem MHC-Antigen-Komplex erleichtert. CD8 bindet sich an einen Bereich auf dem Klasse I-MHC-Molekül, der sich von der TCR:CD3-Bindestelle unterscheidet, und verstärkt die Haftung. Das CD8- Molekül ist an der Vermittlung von Signalumwandlung beteiligt und moduliert die funktionellen Reaktionen, die mit der Bindung des CTL an sein Ziel einhergehen.
Eine der primären Funktionen des CTL-Systems ist die Zerstörung von Zellen, die fremde Antigene produzieren, z. B. mit einem Virus infizierte Zellen. CTLs sind aber auch an der Zerstörung fremder Zellen beteiligt, die absichtlich als Transplantate allogener Wirte in den Körper eingesetzt werden. Dieser als "Allotransplantat-Abstoßung" bekannter Prozeß umfaßt die Wechselwirkung von Wirts-CTLs mit fremden MHC-Molekülen. Der am häufigsten gewählte Ansatz zur Verhinderung der Allotransplantat-Abstoßung ist die Unterdrückung des Immunsystems des Empfängers, typischerweise durch Verwendung von Immunsuppressoren. Die Verwendung dieser Arzneimittel kann jedoch zu schweren Nebenwirkungen wie Nephrotoxizität, Hypertonie, Knochenverlust oder Lymphom führen. Eine weitere Möglichkeit ist der Einsatz von Antikörpern gegen menschliche T- Zellen, z. B. OKT3 und OKT4. Es ergaben sich jedoch hierbei Probleme, da Menschen Antikörper-Reaktionen gegen die Proteine entwickeln, sodaß diese wirkungslos werden.
Es besteht nach wie vor ein Bedarf an der Regulierung des zytolytischen Systems in einem Wirt durch selektive Modulierung von T-Zellenaktivität. Deutliche Verbesserungen bei der Gewebetransplantation könnten durch die Entwicklung spezifischerer, weniger toxischer Therapien erzielt werden, um Allotransplantat-Abstoßungen zu verhindern.

ZUSAMMENFASSUNG DER ERFINDUNG

Die vorliegende Erfindung bietet Zusammensetzungen, umfassend ein Peptid mit einer Länge von etwa 7 bis etwa 20 Resten, wobei das Peptid eine Aminosäuresequenz umfaßt, in der zumindest 40% der Reste mit Resten an entsprechenden Positionen in einer Sequenz in der α3-Domäne eines Klasse I-MHC-Moleküls identisch sind. Das Peptid bindet sich selektiv an ein CD8-Molekül auf einem zytolytischen T-Lymphozyten-(CTL-) Vorläufer und hemmt die Differenzierung des CTL-Vorläufers zu einem reifen CTL. Die Sequenz der α3-Domäne befindet sich vorzugsweise zwischen Rest 220 und Rest 235. Die Peptide umfassen typischerweise die Sequenzen DQTQDTE (Seq-ID. Nr. 1) oder EDQTQDTELVETRP (Seq-ID. Nr. 2).
Die Erfindung betrifft ferner pharmazeutische Zusammensetzungen, die einen pharmazeutisch annehmbaren Träger und die oben beschriebenen Peptide umfassen, sowie Verfahren zur Modulation der Aktivität von CTLs bei einem Patienten. Die Zusammensetzungen und Verfahren können dazu dienen, beispielsweise Allotransplantat-Ab stoßung zu behandeln. In diesen Zusammensetzungen kann das Peptid eine D-Aminosäure umfassen.

KURZE BESCHREIBUNG DER ABBILDUNGEN

Die Fig. 1A, 1B, 1D und 1D zeigen die Wirkung von Peptiden der Erfindung auf die Differenzierung von CTL (gemessen durch Grenzverdünnungsanalyse). Das Ziel in Fig. 1A ist HLA-A2-1. Das Ziel in Fig. 1B ist HLA-B27. Das Ziel in Fig. 1C ist HLA-B27 + INF- NP-Peptid. Das Ziel in Fig. 1D ist HLA-A2-I.
Fig. 2 veranschaulicht, daß Peptide der Erfindung keine Auswirkungen auf Lyse durch reife CTLs haben.
Fig. 3 zeigt, daß Peptide der Erfindung die durch Alloantigen hervorgerufene Proliferation ruhender Peripherblut-Lymphozyten nicht blockieren.
Es werden Verfahren und Zusammensetzungen zum Modulieren der Wirkung zytolytischer T-Lymphozyten bereitgestellt. Unterschiedliche Klasse I-MHC-Moleküle sind in Verbindung mit einem assoziierten Proteinantigen in der Lage, sich an TCR: CD3-Komplexe auf CTLs zu binden. Variable Bereiche existieren sowohl auf TCR als auch dem Klasse I-MHC-Molekül und sind wahrscheinlich an der Spezifität des CTL-Abzielens beteiligt. Wie oben besprochen ist das CD8-Glykoprotein auf der CTL-Oberfläche ein Hilfsmolekül, das an der Wechselwirkung zwischen CTLs und ihren Zielen beteiligt ist.
Im Gegensatz zu TCR ist das CD8-Molekül innerhalb einer Tierart im allgemeinen invariant. Die Reste 215-239 der α3-Domäne von Klasse I-MHC-Molekülen sind stark konserviert, wobei zwischen den Ratten- und Human-Molekülen nur vier Unterschiede bestehen:
Wie nachstehend beschrieben werden Polypeptide, die Abschnitte dieses stark konservierten Bereichs umfassen, z. B. einschließlich des 14-Mers EDQTQ DTELV ETRP (Seq- ID. Nr. 2) (entspricht den Resten 222-235) dazu verwendet, die Wechselwirkungen zwischen CTLs und ihren Zielen zu modulieren.
Eine bevorzugte Modulation der CTL-Funktion ist die Hemmung der CTL-Differenzierung. Reife CTLs differenzieren von "Prä-CTLs", die im Blut und in peripheren Lymphgeweben vorhanden sind. Prä-CTLs haben bereits thymische Reifung erfahren und sind für ein bestimmtes fremdes Antigen spezifisch, ihnen fehlt aber zytolytische Funktion. Der erste Schritt bei der Differenzierung oder "Aktivierung" ist die Bindung des Prä-CTLs an fremdes Antigen. Diese Wechselwirkung mit fremdem Antigen sorgt dafür, daß CTL auf Zytokine reagiert, die am Abschluß des Differenzierungsprozesses beteiligt sind.
Der Ausdruck "Differenzierung" umfaßt hierin den Prozeß der Reifung von einem Prä- CTL zu einem reifen CTL. Die Gegenwart reifer CTLs kann in unterschiedlicher Weise nachgewiesen werden, wie nachstehend beschrieben. Sie werden typischerweise durch ihre Fähigkeit nachgewiesen, geeignete antigen-präsentierende Zellen zu lysieren. Eine Übersicht über die Vorgänge bei der CTL-Differenzierung findet sich z. B. bei Abbas, A. et al., Cellular and Molecular Immunology, W. B. Saunders (1991).
Polypeptide, die sich zur Verwendung in der Erfindung eignen, können in unterschiedlicher Weise erhalten werden. Günstigerweise können sie durch herkömmliche Verfahren unter Verwendung automatischer Synthesizer, wie z. B. des Beckman, Applied Biosystems oder anderer allgemein erhältlicher Peptid-Synthesizer mittels allgemein bekannter Arbeitsvorschriften synthetisiert werden. Sie können auch manuell unter Anwendung auf dem Gebiet bekannter Verfahren synthetisiert werden. Siehe z. B. Stewart und Young, Solid Phase Peptide Synthesis, Rocklord, IL, USA, Pierce, 2. Ausgabe (1984).
Alternativ dazu können DNA-Sequenzen, die für ein Protein kodieren, welches das jeweilige Peptid umfaßt, kloniert und exprimiert werden, um das Peptid zu liefern. Zellen, die eine Vielzahl an MHC-Genen umfassen, sind problemlos erhältlich; sie können z. B. von der American Type Culture Collection ("Catalogue of Cell Lines and Hybridomas", 6. Ausgabe (1988), Rockville, Maryland, USA) erhalten werden. Beispielsweise können Standardverfahren dazu dienen, cDNA-Sammlungen zu screenen und Sequenzen zu identifizieren, die für die gewünschten Sequenzen kodieren (siehe Sambrook et al., Molecular Cloning - A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, New York, 1989). Beispielsweise können Fusionsproteine (jene, die zur Gänze oder teilweise aus den Aminosäuresequenzen zweier oder mehrerer Proteine bestehen) rekombinarit produziert werden. Unter Anwendung von in vitro-Mutageneseverfahren kann nicht verwandtes Protein mutiert werden, um die geeigneten CD8-Bindesequenzen zu umfassen.
Klasse I-MHC-Glykoproteine aus einer Vielzahl natürlicher Quellen werden günstigerweise mittels herkömmlicher Proteinreinigungsverfahren isoliert. Peptide können durch jedes einer Vielzahl bekannter Verfahren gereinigt werden, z. B. durch Umkehrphasen- Hochdruckflüssigchromatographie (RP-HPLC), Ionenaustausch- oder Immunaffinitätschromatographie, Größentrennung oder Elektrophorese (ein allgemeiner Überblick findet sich bei Scopes, R., Protein Purification, Springer-Verlag, N. Y. (1982).
Obwohl relativ kurze Peptidfragmente für die vorliegende Erfindung bevorzugt werden, kann es in bestimmten Fällen wünschenswert sein, größere Polypeptide zu verwenden (mit mehr als etwa 30 Resten), welche die hierin geoffenbarten Sequenzen umfassen. Der Ausdruck "Polypeptid" oder "Peptid" bezieht sich hierin auf eine Molekülkette aus Resten, die über Peptidbindungen (oder Peptidbindungs-Imitate) verknüpft sind. Der Ausdruck umfaßt auch Proteinmoleküle (z. B. Fusionsproteine) oder Abschnitte davon, welche die CD8-Bindesequenz beinhalten. Der Ausdruck "Rest" bezieht sich auf eine Aminosäure (D- oder L-) oder ein Aminosäure-Imitat, die bzw. das über eine Peptidbindung oder ein Peptidbindungs-Imitat in ein Polypeptid oder Peptid eingebaut ist. Ein Peptidbindungs-Imitat der Erfindung umfaßt Peptid-Hauptkettenmodifikationen, die Fachleuten auf dem Gebiet allgemein bekannt sind. Zu solchen Modifikationen zählen Modifikationen des Amidstickstoffs, des α-Kohlenstoffs, von Amidcarbonyl, die vollständige Ersetzung der Amidbindungen, Verlängerungen, Deletionen oder Hauptketten- Querverbindungen. Ein allgemeiner Überblick findet sich bei Spatola, Chemistry and Biochemistry of Amino Acids, Peptides and Proteins, Bd. VII (Weinstein, Hrsg., 1983). Es sind mehrere Peptid-Hauptkettenmodifikationen bekannt, z. B. ψ[CH&sub2;S], ψ[CH&sub2;NH], ψ[CSNH&sub2;], ψ[NHCO], ψ[COCH&sub2;] und ψ[(E) oder (Z) CH=CH]. Die obige Nomenklatur folgt der von Spatola vorgeschlagenen (s. o.). In diesem Zusammenhang bedeutet ψ die Abwesenheit einer Amidbindung. Die Struktur, welche die Amidgruppe ersetzt, ist in den Klammern angeführt.
Ein "Aminosäure-Imitat" ist hierin eine andere Gruppe als eine natürlich vorkommende Aminosäure, die sich hinsichtlich der Konformation und funktionell als Substitut für eine Aminosäure in einem Peptid der Erfindung dient. Eine derartige Gruppe dient als Substitut für einen Aminosäurerest, wenn die Fähigkeit des Peptids nicht beeinträchtigt wird, sich an CD8 zu binden. Aminosäure-Imitate sind z. B. Nicht-Protein-Aminosäuren, wie β-γ-δ-Aminosäuren, β-γ-δ-Iminosäuren (z. B. Piperidin-4-carbonsäure) sowie viele Derivate von L-α-Aminosäuren. Einige geeignete Aminosäure-Imitate sind Fachleuten auf dem Gebiet bekannt: Cyclohexylalanin, 3-Cyclohexylpropionsäure, L-Adamantylalanin, Adamantylessigsäure und dergleichen. Peptid-Imitate, die sich für Peptide der Erfindung eignen, werden von Morgan und Gainor besprochen, siehe Ann. Rents. Med. Chem. 24, 243-252 (1989).
Eine Anzahl von Konformations-Analogen der Aminosäuresequenzen in der obigen α3- Domäne kann somit zur Modulation von CTL-Funktion verwendet werden. Die Fähigkeit der Analoge, CD8 zu binden und CTL-Funktion zu modulieren, kann in den nach stehend beschriebenen Assays untersucht werden. "Konformations-Analoge" sind hierin Moleküle mit räumlicher oder polarer Anordnung, die den Aminosäuresequenzen der α3-Domäne ausreichend ähnlich sind, damit spezifische Bindung des CD8-Moleküls erfolgt. Wie andere spezifische Binde-Wechselwirkungen umfaßt die Erkennung typischerweise reversible nicht-kovalente Assoziationen, sie z. B. elektrostatische Anziehung, Van der Waals-Kräfte und Wasserstoffbrückenbindungen. Die Konformations-Analoge der Erfindung können zur Gänze aus anderen Aminosäureresten bestehen als jenen, die in der α3-Sequenz vorgefunden werden. Alternativ dazu können sie eine beliebige Anzahl an Aminosäure-Imitaten enthalten, die über Peptidbindungs-Imitate miteinander verbunden sind.
Die Peptide und ihre Analoge umfassen typischerweise zumindest etwa 7 Reste, noch bevorzugter zumindest etwa 13 Reste. Vorzugsweise übersteigen sie nicht etwa 30 Reste, noch bevorzugter übersteigen sie nicht etwa 20 Reste.
Die Peptide oder Polypeptide der Erfindung können in unterschiedlicher Weise modifiziert werden, sofern sie eine Sequenz umfassen, die im wesentlichen zu einer Sequenz in der α3-Domäne eines Klasse I-MHC-Moleküls homolog ist. "Im wesentlichen homolog" bedeutet hierin, daß der Prozentsatz identischer Reste an entsprechenden Positionen in zwei Sequenzen zumindest etwa 40%, üblicherweise etwa 75%, vorzugsweise etwa 95% oder mehr, ist. Zwei Reste gelten als identisch, wenn die Reste gleich sind (D- und L-Isomere einer bestimmten Aminosäure gelten als gleicher Rest) oder wenn ein Rest ein Imitat des anderen ist (Definition siehe oben).
Die modifizierten Peptide und anderen Konformations-Analoge können in unterschiedlicher Weise auf biologische Aktivität getestet werden. Wenn die zu modulierende CTL- Funktion die Differenzierung zu reifen CTLs ist, umfassen die Assays typischerweise den Nachweis reifer CTLs anhand ihrer Fähigkeit, geeignete antigen-präsentierende Zellen zu lysieren. Die Assays in einem nachstehend beschriebenen Beispiel für eine Arbeitsvorschrift umfassen Grenzverdünnungsanalyse zur Messung der Wirkungen zugegebe ner Peptide auf CTL-Differenzierung in einem in vitro-Assay unter Verwendung von Peripherblut-Lymphozyten.
Die Fähigkeit von Peptiden, CTL-Aktivität in vitro zu modulieren, kann dann mit der Fähigkeit korreliert werden, den Immunresponse in vivo zu beeinflussen. Die in vivo-Aktivität wird typischerweise unter Verwendung geeigneter Tiermodelle, wie z. B. Ratten, untersucht. Die Sequenz der Ratten-α3-Domäne ist bekannt; wie besprochen ist die Sequenz von Rest 21 5 bis 239 der menschlichen Sequenz recht ähnlich. Um den Einfluß der Peptide auf Allotransplantat-Abstoßung zu untersuchen, können z. B. allogene Zellen nach oder gleichzeitig mit der Verabreichung verschiedener Konzentrationen der HLA- Peptide und geeigneter Vergleiche in ein Tier eingepflanzt werden. Zu Vergleichen zählen z. B. synthetische Peptide, welche die gleichen Reste enthalten wie die Versuchspeptide, jedoch statistisch angeordnet sind. Der Immunresponse auf die allogenen Zellen kann z. B. durch Grenzverdünnungsassays gemessen werden (siehe unten).
Tiermodelle können auch verwendet werden, um die Fähigkeit der Peptide, Allotransplantat-Abstoßung zu hemmen, direkt zu untersuchen. Beispielsweise können die Peptide den Tieren zu unterschiedlichen Zeitpunkten vor Einführung des allogenen Gewebes verabreicht werden; die Tiere können hinsichtlich Transplantat-Abstoßung überwacht werden. Die Tests können an Primaten, wie z. B. Cynomolgus-Affen, durchgeführt werden. Geeignete Verfahren zur Durchführung der Transplantation und Überwachung von Transplantat-Abstoßung sind für Fachleute auf dem Gebiet allgemein bekannt (siehe z. B. Hislop et al., J. Thorac. Cardiovasc. 100, 360-370 (1990)).
Die Sequenzen werden je nach ihrem letztendlichen Verwendungszweck unterschiedlich modifiziert. Beispielsweise kann die Wirkung einzelner Aminosäure-Substitutionen auch unter Verwendung von D-Aminosäuren oder Aminsäure-Imitate untersucht werden. Restsubstitutionen, die zu einer verstärkten Bindeaffinität der Peptide führen, können dann identifiziert werden. Die Assays der Erfindung dienen zweckmäßigerweise dazu, Peptide mit verstärkter Affinität für CD8-Moleküle zu identifizieren, indem z. B. Kompetitionsassays durchgeführt werden, um Konzentrationen von Peptiden zu bestimmen, die zur Erzielung 50%-iger Hemmung der Bindung zwischen CD8 und dem geeigneten MHC-Molekül erforderlich sind.
Eine Kern-Bindedomäne kann identifiziert werden, indem eine Reihe verwandter Peptide gebildet werden, die sich durch eine oder mehrere Substitutionen, Additionen oder Deletionen von Resten unter Anwendung von auf dem Gebiet bekannten Verfahren vom nativen Peptid unterscheiden. Die Substitutionen können hinsichtlich ihres Einflusses auf die Bindung gescreent werden, indem z. B. ein Grenzverdünnungs- oder ein Kompetitionsassay mit unsubstituierten Peptiden durchgeführt wird. Die Beschreibung verschiedener Punktmutationen in Genen, die für die α3-Domäne kodieren, von Salter, R. D. et al. (Nature 345, 41 (1990)) liefert Beweise, daß verschiedene Cluster von Resten an der Wechselwirkung mit CD8 beteiligt sind. Ein Cluster enthält die Positionen 223- 229, die eine freiliegende Schleife zwischen den Strängen 3 und 4 der α3-Domäne bilden. Die Sequenz der Positionen 220-232, welche die freiliegende Schleife enthält, umfaßt keine basischen Reste, enthält jedoch 6 saure Reste (220, 222, 223, 227, 229 und 232) und ist stark konserviert. Ein zweiter Cluster umfaßt Reste 233 und 235, die sich im 4. Strang des β-Faltblatts befinden. Das Threonin an Position 233 befindet sich an der freiliegenden Oberfläche der α3-Domäne, wobei selbst recht konservative Änderungen beispielsweise zu Alanin oder Isoleucin die Bindung an CD8 direkt beeinflussen können. Ein dritter Cluster umfaßt die Positionen 245 und 247, die sich auf dem 5. Strang des β-Faltblatts nach den Resten befinden, die den ersten oben beschriebenen Cluster bilden.
Neben Modifikationen, welche die Wechselwirkung mit CD8 beeinflussen, können die Peptide und ihre Analoge modifiziert werden, um z. B. ihre in vivo-Stabilität zu verändern. Beispielsweise erhöht der Einbau einer oder mehrerer D-Aminosäuren in das Peptid typischerweise die Stabilität, insbesondere wenn die D-Aminosäurereste an einem oder beiden Termini der Peptidsequenz substituiert sind. Die Stabilität kann in unterschiedlicher Weise untersucht werden, z. B. durch Messen der Halbwertszeit der Pro teine während der Inkubation mit Peptidasen oder menschlichem Plasma oder Serum. Einige derartiger Assays über Proteinstabilität wurden beschrieben (siehe z. B. Verhoef et al., Eur. J. Drug. Metab. Pharmacokin. 11, 291-302 (1986)).
Die Peptide können durch Verbindung mit anderen Molekülen modifiziert werden. Beispielsweise können unterschiedliche N- oder C-terminale Gruppen eingebracht werden, um die physikalischen und/oder chemischen Eigenschatten des Moleküls zu verändern. Solche Veränderungen können z. B. die Adhäsion, Stabilität, biologische Verfügbarkeit, Lokalisierung oder Detektion der Moleküle beeinflussen. Für diagnostische Zwecke kann eine große Vielzahl an Markern mit dem Terminus verbunden werden, was direkt oder indirekt ein detektierbares Signal liefert. Die Peptide der Erfindung können somit in unterschiedlicher Weise für diverse Endverwendungszwecke modifiziert sein und trotzdem ihre biologische Aktivität beibehalten.
Verschiedene reaktive Stellen können am Terminus eingebracht werden, um sich mit Teilchen, testen Substraten, Makromolekülen o. dgl. zu verknüpfen. Beispielsweise kann eine interne Aminogruppe einer wachsenden Kette, die an ein festes Substrat gebunden ist, wobei die dazwischenliegenden Seitengruppen geschützt sind, mit Methyldithiobenzoesäure (MDTB) verbunden werden. Die freie Mercaptangruppe kann dann zur Verbindung mit aktivierten Olefinen verwendet werden. Proteine wie etwa Serum albumin, Napfschnecken-Hämocyanin, Rinder-β-Globulin oder dergleichen können mit dem Peptid verbunden werden, um ein Immunogen bereitzustellen und Antikörper gegen das Peptid zur Verwendung in Immunassays, bei der Affinitätschromatographie oder dergleichen zu produzieren. Alternativ dazu kann das Peptid mit einem anderen Polypeptid verbunden werden, indem eine DNA-Sequenz hergestellt wird, deren Peptid sich am N-Terminus, C-Terminus oder im Inneren des Proteins befindet, um ein fusioniertes Protein bereitzustellen, welches das Bindepeptid von Interesse enthält. Auf diese Weise können fusionierte Proteine hergestellt werden, die enzymatische Aktivität aufweisen, die durch Makromoleküle moduliert werden kann.
Die vorliegenden Peptide können zur Modulation von CTL-Aktivität in einem Säugetierwirt, vorzugsweise einem Menschen, verwendet werden. In einer Ausführungsform können die Peptide dazu dienen, die Differenzierung von CTL-Vorläufern zu reifen CTLs zu hemmen, um Allotransplantat-Abstoßung zu verhindern. Die Differenzierung von CTLs kann mittels Grenzverdünnungsanalyse (LDA) untersucht werden, was in einem Beispiel nachstehend beschrieben wird. Da die Peptide selektiver und im allgemeinen weniger toxisch als ihre herkömmlichen Immunmodulatoren sind, führen sie weniger wahrscheinlich zu Nebenwirkungen, die oft bei den herkömmlichen Mitteln zu beobachten sind. Da die Peptide den menschlichen Proteinsequenzen entsprechen, rufen sie weniger wahrscheinlich immunologische Reaktionen hervor wie z. B. jene, die bei der Verwendung von Mäuse-Anti-CD3-Antikörpern festgestellt werden. Die Peptide der Erfindung können auch mit diesen traditionellen Therapeutika kombiniert und dazu verwendet werden, die Dosis solcher Mittel auf Werte unter jenen abzusenken, die mit Nebenwirkungen verbunden sind.
Eine ähnliche Verwendung der Erfindung umfaßt die Modulation des Immunresponses in der "Graft-versus-Host-Krankheit" (GVHD). GVHD ist eine potentiell tödliche Krankheit, die auftritt, wenn immunologisch kompetente Zellen an einen allogenen Empfänger übertragen werden. Wenn die immunkompetenten Zellen des Spenders durch den Empfängerwirt nicht inaktiviert werden (z. B. in einem immunsupprimiertem Individuum), können diese Spenderzellen Gewebe im Empfänger angreifen. Gewebe der Haut, des Darmepithels und der Leber sind häufig Ziele und können im Verlauf von GVHD zerstört werden. Die Krankheit stellt ein besonders gravierendes Problem dar, wenn Immungwebe transplantiert wird, z. B. bei der Knochenmarkstransplantation; es wurde aber auch in anderen Fällen - z. B. bei Herz- und Lebertransplantaten - von weniger schwerer GVHD berichtet. Im GVHD-Zusammenhang werden die Peptide der Erfindung dazu verwendet, die Bindedomäne auf den CD8-Molekülen der Spender-CTLs zu blockieren, wodurch die Fähigkeit, Zielzellen im Wirt zu lysieren, beeinträchtigt wird.
Die Nützlichkeit der Peptide der Erfindung ist nicht auf Therapeutika für Allotransplantat-Abstoßung und Graft-versus-Host-Krankheit beschränkt. Beispielsweise eignet sich die Erfindung auch für jene Fälle, in denen es wünschenswert ist, die Wechselwirkung zwischen CD8- und Klasse I-MHC-Molekülen zu blockieren oder modulieren, z. B. allergische Reaktionen, Autoimmunresponses und dergleichen.
Darüber hinaus eignet sich die Erfindung zur Verhinderung eines Immunresponse im Zusammenhang mit bestimmten somatischen Gentherapien. Obwohl Gentherapie die Korrektur der eigenen Zellen eines Individuums umfassen kann und nicht mit dem gleichen Problem verbunden ist wie die Allotransplantat-Abstoßung (bei der fremde MHC- Moleküle beteiligt sind), könnte die Expression fremder Proteine einen CTL-vermittelten Immunresponse auslösen, der die Behandlung gefährden könnte. Im Kontext der Gentherapie könnten die eigenen Zellen eines Individuums modifiziert werden, um die Produktion eines neuen Proteins zu ermöglichen und damit beispielsweise einen angeborenen Stoffwechselfehler zu korrigieren, was zum Verlust oder zur Modifikation eines wesentlichen Proteins führt. Dies kann verhindert werden, wenn die CTLs des Empfängers gegen Zellen reagieren, die das neue Protein exprimieren. Die Erfindung kann diese Erkennung hemmen, indem die Wechselwirkung zwischen dem CD8- und MHC-Molekül, welches das "fremde" Antigen präsentiert, gestört wird.
Peptide der Erfindung können auch verwendet werden, um auf CTLs abzuzielen. In diesem Zusammenhang sind die Peptide typischerweise mit einem anderen Molekül verbunden. Die Peptide können z. B. mit Liposomen, die bestimmte Immunsuppressiva enthalten, mit einem spezifischen monoklonalen Antikörper oder Immunglobulin oder mit einem Cytotoxin oder einem anderen Modulator der Zellaktivität verbunden werden, wodurch die Bindung des Konjugats am CTL zur Veränderung des CTL führt. Beispielsweise sind einige Proteintoxine auf dem Gebiet bekannt, z. B. Ricin, Diphterietoxin, Gelonin, Pseudomonas-Toxin und Abrin. Chemotherapeutika sind z. B. Doxorubicin, Daunorubicin, Methotrexat, Cytotoxin und Antisense-RNA. Antibiotika kommen ebenfalls in Frage. Außerdem eignen sich Radioisotope wie Yttrium-90, Phosphor-32, Blei-212, Iod-131 oder Palladium-109. Die ausgesandte Strahlung zerstört die Ziel-T- Zellen.
Die Peptide der Erfindung eignen sich auch zum Markieren zytolytischer T-Lymphozyten. Die Markierung von CTLs, die für diagnostische Zwecke nützlich sein kann, kann durch Kombinieren einer Vielzahl bekannter Marker mit dem Peptid erreicht werden. Nach dem Kontakt des markierten Peptids mit den CTLs, können markierte CTLs entweder direkter oder indirekt detektiert werden. Fluoreszenzmittel, Enzyme oder andere detektierbare Moleküle können mit den Peptiden der Erfindung verbunden werden. Diese detektierbaren Moleküle können direkt mit dem CTL-modulierenden Peptid oder indirekt über andere Moleküle verbunden sein. In das Peptid eingeführtes Biotin beispielsweise bindet sich anschließend mit Enzymen oder Fluoreszenzmitteln an Avidinkonjugat. Fluoreszenzmarkierung kann z. B. nützlich sein, da es CTLs ermöglicht wird, in einem fluoreszenzaktivierten Zellsortierer (FACS) detektiert zu werden. Eine Vielzahl an Markern kommt in Frage, z. B. Radionuklide (z. B. gammastrahlende Radioisotope wie etwa Technetium-99 oder Indium-111), Fluoreszenzmittel (z. B. Fluorescein), Enzyme, Enzymsubstrate, Enzymcofaktoren, Enzyminhibitoren, chemolumineszente Verbindungen, biolumineszente Verbindungen usw. Fachleute auf dem Gebiet kennen andere geeignete Marker zur Bindung an die Komplexe oder können sie mittels Routineexperimenten identifizieren. Die Bindung dieser Marker wird anhand von für Fachleute auf dem Gebiet geläufigen Standardverfahren erzielt.
Zu in vitro-Verwendungen zählen diagnostische Anwendungen, das Isolieren oder Markieren spezifischer Zellen und dergleichen. Beispielsweise können die Peptide der Erfindung dazu verwendet werden, potentielle Inhibitoren von MHC-T-Zellen-Wechselwirkungen zu prüfen. Potentielle Inhibitoren können auf ihre Fähigkeit getestet werden, die Bindung der Peptide an isoliertes CD8 zu hemmen.
Das Markieren von CTLs in vivo kann z. B. zur Überwachung der Gegenwart und Konzentration von CTLs an bestimmten Steilen im Organismus verwendet werden. Für diag nostische in vivo-Bilderzeugung werden Radioisotope typischerweise gemäß bekannter Verfahren eingesetzt. Die Radioisotope können unter Verwendung funktioneller Zwischengruppen, die Fachleuten auf dem Gebiet der Erfindung zum Zeitpunkt der Einreichung der Stammanmeldung bekannt waren, entweder direkt oder indirekt an das Protein oder Peptid gebunden werden. Beispielsweise wurden Chelatbildner, wie z. B. Diethylentriaminpentaessigsäure (DTPA) und Ethylendiamintetraessigsäure (EDTA), und ähnliche Moleküle verwendet, um Proteine an Metallionen-Radioisotope zu binden.
Die Peptide können zur in vivo-Diagnose auch mit einem paramagnetischen Isotop markiert werden, z. B. in der Magnetresonanz-Bilderzeugung (MRI) oder der Elektronenspin- Resonanz (ESR), die beide zum Zeitpunkt der Einreichung der Stammanmeldung bekannt waren. Diese und verwandte Techniken wurden z. B. bei der Diagnose rheumatischer Erkrankungen eingesetzt (siehe Namey, in Textbook of Rheumatology, Kelley et al. (Hrsg.) Saunders, Philadelphia, 1985). Im allgemeinen eignet sich jedes herkömmliche Verfahren zur Visualisierung diagnostischer Bilder. Üblicherweise werden gamma- und positronen-strahlende Radioisotope für Kamerabilder und paramagnetische Isotope für MRI verwendet. Die Peptide der Erfindung können also zur Kontrolle des Verbesserungsverlaufs einer Autoimmunresponse in einem Individuum verwendet werden.
Durch Messen der Zu- oder Abnahme der Zahl an CTLs kann man bestimmen, ob ein bestimmtes therapeutisches Regime, das zur Linderung schädlicher CTL-Aktivität dient, wirksam ist.
Die Peptide eignen sich besonders für therapeutische Anwendungen. Pharmazeutische Zusammensetzungen der Erfindung kommen für eine Vielzahl an Arzneimittel-Zufuhrsystemen in Frage. Einen kurzen Überblick über existierende Verfahren zur Arzneimittelverabreichung gibt Langer, Science 249, 1527-1533 (1990). Vorzugsweise werden die pharmazeutischen Zusammensetzungen parenteral, d. h. intraartikulär, intravenös, subkutan oder intramuskulär, verabreicht.
Die vorliegenden Peptide können an ein Liposom oder eine aus zwei Schichten bestehende Lipidmembran gebunden oder in ein Liposom eingekapselt werden. Verschiedene Verfahren stehen zur Verfügung, um ein Peptid oder Protein mit einem Lipid zu kombinieren, insbesondere einem Phospholipid, um für die Gegenwart des Peptids oder Proteins auf der Liposomoberfläche zu sorgen. Phosphatidylcholin, Phosphatidylethanolamin oder ein anderes Lipid kann zusammen mit einem bifunktionellen Linker, wie z. B. MBSE, Glutaraldehyd, Methyldithiobenzoesäure oder dergleichen, eingesetzt werden.
Die Bildung von Liposomen mit konjugierten Proteinen ist allgemein bekannt. Liposomladung ist eine wichtige Determinante bei der Liposomenausscheidung aus dem Blut, wobei negativ geladene Liposome rascher vom Retikuloendothel-System aufgenommen werden (Juliano, Biochem. Biophys. Res. Commun. 63, 651 (1975)) und somit im Blutkreislauf eine kürzere Halbwertszeit aufweisen. Liposome mit längerer Halbwertszeit im Blutkreislauf sind typischerweise für therapeutische und diagnostische Verwendungszwecke wünschenswert. Beispielsweise sind Liposome, die 8, 12 oder bis zu 24 Stunden im Blutkreislauf gehalten werden können, besonders bevorzugt.
Typischerweise werden Liposome mit etwa 5-14 Mol-% negativ geladenen Phospholipiden, z. B. Phosphatidylglycerin, Phosphatidylserin oder Phosphatidylinosit, hergestellt. Zugesetzte negativ geladene Phospholipide, z. B. Phosphatidylglycerin, dienen auch dazu, spontane Liposomen-Aggregation zu verhindern und somit das Risiko zur Bildung zu kleiner Liposomen-Aggregate zu minimieren. Membranversteifende Mittel, z. B. Sphingomyelin oder ein gesättigtes neutrales Phospholipid, in einer Konzentration von zumindest etwa 50 Mol-% und 5-15 Mol-% Monosialylgangliosid können eine Steigerung des Kreislaufs des Liposomenpräparats im Blutstrom bewirken, wie allgemein z. B. in der US-A-4.837.028 beschrieben.
Außerdem kann die Liposomsuspension Lipid-Schutzmittel enthalten, die Lipide vor radikalischer und lipidperoxidativer Schädigung bei der Lagerung schützen. Lipophile Radikal-Quencher, z. B. α-Tocopherol, und wasserlösliche eisenspezifische Chelatbildner wie etwa Ferrioxianin werden bevorzugt.
Eine Vielzahl an Verfahren zur Herstellung von Liposomen steht zur Verfügung; siehe z. B. Szoka et al., Ann. Rev. Biophys. Bioeng. 9, 467 (1980), US-A-4.235.871, 4.501.728 und 4.837.028. Ein Verfahren erzeugt multilamellare Bläschen heterogener Größe. In diesem Verfahren werden die bläschenbildenden Lipide in einem geeigneten organischen Lösungsmittel oder Lösungsmittelsystem gelöst und unter Vakuum oder einem Inertgas getrocknet, um einen dünnen Lipidfilm zu bilden. Gegebenenfalls kann der Film in einem geeigneten Lösungsmittel, z. B. tert-Butanol, erneut gelöst und dann lyophilisiert werden, um ein homogeneres Lipidgemisch zu bilden, das in einer leichter hydratisierbaren pulverartigen Form vorliegt. Dieser Film ist mit einer wäßrigen Lösung des abgezielten Arzneimittels und der Abzielkomponente bedeckt und kann typischerweise in einem Zeitraum von 15-60 Minuten unter Rühren hydratisiert werden. Die Größenverteilung der resultierenden multilamellaren Bläschen kann durch Hydratisieren der Lipide unter kräftigerem Rühren oder durch Zugabe von Solubilisierungsdetergentien, wie z. B. Desoxycholat, zu kleineren Größen hin verschoben werden.
Das Hydratisierungsmedium enthält das abgezielte Arzneimittel oder Peptide der Erfindung in einer Konzentration, die im Innenvolumen der Liposome in der endgültigen Liposomsuspension gewünscht ist. Typischerweise liegt das Arzneimittel oder Peptid in einer Konzentration von 10-100 mg/ml in gepufferter Salzlösung vor.
Nach der Liposomherstellung können die Liposome dimensioniert werden, um einen gewünschten Größenbereich und eine relativ enge Verteilung der Liposomengröße zu erzielen. Ein bevorzugter Größenbereich beträgt etwa 0,2-0,4 um, wodurch die Liposomsuspension mittels Filtration durch einen herkömmlichen Filter, typischerweise einen 0,22 um-Filter, sterilisiert werden kann. Das Filtersterilisations-Verfahren kann mit hohem Durchsatz durchgeführt werden, wenn die Liposome auf etwa 0,2-0,4 um dimensioniert wurden.
Verschiedene Verfahren stehen zur Dimensionierung von Liposomen auf eine gewünschte Größe zur Verfügung. Ein Dimensionierungsverfahren wird in der US-A- 4.737.323 beschrieben. Die Ultraschallbehandlung einer Liposomsuspension entweder durch Bad- oder Sonden-Ultraschallbehandlung führt zu einer progressiven Größenreduktion bis zur Größe kleiner unilamellarer Bläschen von weniger als etwa 0,05 um. Die Homogenisierung ist ein weiteres Verfahren, das auf Scherenergie beruht, um große Liposome in kleinere zu fragmentieren. In einem typischen Homogenisierungsverfahren werden multilamellare Bläschen durch einen herkömmlichen Emulsionshomogenisator hindurchgeschickt, bis bestimmte Liposomengrößen, typischerweise zwischen etwa 0,1 und 0,5 um, beobachtet werden. In beiden Verfahren kann die Teilchengrößen-Verteilung durch herkömmliche Laserstrahl-Teilchengrößenbestimmung kontrolliert werden.
Die Extrusion von Liposom durch eine kleinporige Polycarbonat-Membran oder eine asymmetrische keramische Membran ist auch ein wirksames Verfahren zur Reduktion von Liposomengrößen auf eine relativ gut definierte Größenverteilung. Typischerweise wird die Suspension ein oder mehrere Male durch die Membran geleitet, bis die gewünschte Lipsomen-Größenverteilung erreicht ist. Die Liposome können durch Membranen mit immer kleinerer Porengröße extrudiert werden, um eine allmähliche Verringerung der Liposomengröße zu erzielen.
Selbst nach den wirksamsten Einkapselungsverfahren kann die Liposomsuspension mit ursprünglicher Größe bis zu 50% oder mehr Arzneimittel in freier (nicht-eingekapselter) Form enthalten.
Verschiedene Verfahren stehen zur Entfernung nicht-eingeschlossener Verbindungen aus einer Liposomsuspension zur Verfügung. In einem Verfahren werden die Liposome in der Suspension durch Hochgeschwindigkeits-Zentrifugation pelletiert, wodurch freie Verbindung und sehr kleine Liposome im Überstand zurückbleiben. Ein weiteres Verfahren umfaßt die Konzentration der Suspension durch Ultrafiltration und erneutes Sus pendieren der konzentrierten Liposome in einem Ersatzmedium. Alternativ dazu kann man mit Gelfiltration große Lipsomteilchen von gelösten Molekülen trennen.
Nach der obigen Behandlung wird die Liposomsuspension auf eine gewünschte Konzentration gebracht, um intravenös verabreicht zu werden. Dies kann das erneute Suspendieren der Liposome in einem geeigneten Volumen des Injektionsmediums, worin die Liposome konzentriert wurden, z. B. durch Zentrifugation oder Ultrafiltration, oder das Konzentrieren der Suspension, worin der Schritt der Arzneimittelentfernung das gesamte Suspensionsvolumen erhöhte, umfassen. Die Suspension wird dann durch Filtration sterilisiert, wie oben beschrieben. Die Liposome, welche die Peptide der Erfindung umfassen, können parenteral oder lokal in einer Dosis verabreicht werden, die je nach Art der Verabreichung, dem zugeführten Arzneimittel, der jeweils behandelten Krankheit usw. variiert.
Die therapeutische Dosierung der Peptide der Erfindung variiert und hängt vom jeweiligen Verwendungszweck der Behandlung, der Verabreichungsart der Peptide, dem Gesundheitszustand des Patienten und vom Urteil des behandelnden Arztes ab. Zur Verhinderung von Allotransplantat-Abstoßung mit einem Peptid der Erfindung liegt beispielsweise die Dosis für einen 70 kg schweren Patienten typischerweise in einem Bereich von etwa 50 ug bis etwa 2.000 mg pro Tag, vorzugsweise etwa 5 mg bis etwa 700 mg pro Tag.
Die vorliegenden Peptide können selbst oder als Konjugate als Formulierungen in pharmazeutisch annehmbaren Medien, z. B. Salzlösung, PBS und Glucose, im allgemeinen in einer pharmakologisch wirksamen Dosis hergestellt werden, wobei die Konzentrationen durch herkömmliche Verfahren für den jeweiligen Verwendungszweck empirisch bestimmt werden. Die Additive können Bakterizide, Stabilisatoren, Puffer oder dergleichen enthalten. Die an den Wirt verabreichte Menge variiert und hängt von der verabreichten Substanz, dem Verabreichungszweck (Prophylaxe oder Therapie), dem Zustand des Wirts, der Verabreichungsart, der Frage, ob Hemmung oder Aktivierung gewünscht wird, und dergleichen ab. Um die Halbwertszeit des vorliegenden Peptids oder der vorliegenden Peptidkonjugate zu verlängern, können die Peptide eingekapselt, in das Lumen von Liposomen und als Kolloid hergestellt werden; es können auch andere herkömmliche Verfahren zum Einsatz kommen, die eine verlängerte Lebensdauer der Peptide bewirken.
Die pharmazeutischen Zusammensetzungen eignen sich zur parenteralen, topischen, oralen oder lokalen Verabreichung, z. B. durch Aerosol oder transdermal, für prophylaktische und/oder therapeutische Behandlungen. Die Zusammensetzungen eignen sich für eine Vielzahl an Arzneimittel-Zufuhrsystemen. Vorzugsweise werden die pharmazeutischen Zusammensetzungen parenteral verabreicht, z. B. intravenös. Somit bietet die Erfindung Zusammensetzungen zur parenteralen Verabreichung, umfassend ein immunmodulierendes Peptid, das in einem annehmbaren Träger gelöst oder suspendiert ist, vorzugsweise in einem wäßrigen Träger, wie z. B. Wasser, gepuffertem Wasser, 0,4% Salzlösung, 0,3% Glycin, Hyaluronsäure und dergleichen. Diese Zusammensetzungen können durch herkömmliche Sterilisationsverfahren sterilisiert oder sterilfiltriert werden. Die resultierenden wäßrigen Lösungen können ohne weitere Schritte zur Verwendung verpackt oder lyophilisiert werden, wobei das lyophilisierte Präparat vor der Verabreichung mit einem sterilen wäßrigen Träger kombiniert wird. Die Zusammensetzungen können pharmazeutisch annehmbare Hilfssubstanzen enthalten, die erforderlich sind, um physiologischen Zuständen gerecht zu werden, z. B. pH-Einstell- und Puffermittel, Tonizitäts-Einstellmittel, Netzmittel, Detergentien und dergleichen, z. B. Natriumacetat, Natriumlactat, Natriumchlorid, Kaliumchlorid, Calciumchlorid, Sorbitanmonolaurat, Triethanolaminoleat usw.
Die Konzentration von immunmodulierenden Peptiden in den pharmazeutischen Formulierungen kann stark variieren - von weniger als etwa 0,01 Gew.-%, üblicherweise bei oder zumindest etwa 5% bis zu 50 bis 75 Gew.-% - und wird vor allem durch Flüssigkeitsvolumina, Viskositäten usw. entsprechend der jeweiligen Verabreichungsart aus gewählt. Eine typische pharmazeutische Zusammensetzung für intravenöse Infutionen könnte somit 250 ml sterile Ringer-Lösung und 10 mg Peptid enthalten.
Für feste Zusammensetzungen können herkömmliche, nicht-toxische, teste Träger verwendet werden, zu denen z. B. pharmazeutische Qualitäten von Mannit, Lactose, Stärke, Magnesiumstearat, Natriumsaccharin, Talcum, Cellulose, Glucose, Saccharose, Magnesiumcarbonat und dergleichen zählen. Zur oralen Verabreichung wird eine pharmazeutisch annehmbare nicht-toxische Zusammensetzung gebildet, indem normalerweise verwendete Exzipienten, z. B. die oben angeführten Träger, und im allgemeinen 10-95% Wirkstoff, d. h. ein oder mehrere Peptide der Erfindung, vorzugsweise 25-75%, eingearbeitet werden.
Bei Aerosol-Verabreichung werden die immunmodulierenden Peptide vorzugsweise in feinteiliger Form zusammen mit einem herkömmlichen nicht-toxischen Tensid und einem geeigneten Treibmittel zugeführt. Typische Prozentsätze von Peptiden sind 0,01- 20 Gew.-%, vorzugsweise 1-10 Gew.-%; und vom Tensid 0,1-20 Gew.-%, vorzugsweise 0,25-5 Gew.-%.
Zwei oder mehr Peptide der Erfindung können unter bestimmten Umständen zwecks Erhöhung der Wirksamkeit zu einem Peptid-"Cocktail" kombiniert werden. Die Peptide der Erfindung können auch in Verbindung mit andren pharmazeutischen Wirkstoffen eingesetzt werden. Beispielsweise können andere Immunsuppressiva, wie z. B. Antikörper gegen die α3-Domäne (wie z. B. von Ozato et al. weiter oben beschrieben), T-Zellen-Antigene (z. B. OKT4 und OKT3), Anti-Thymozyten-Globulin sowie Chemotherapeutika wie Cyclosporin, Glucocorticoide, Azathioprin, Prednison und dergleichen in Verbindung mit den Peptiden verwendet werden.
Die folgenden Beispiele dienen lediglich der Veranschaulichung und sind nicht einschränkend.

BEISPIELE

1. Synthese von immunmodulierenden Peptiden

Ein synthetisches Peptid, das den Resten 222-235 der α3-Domäne menschlicher Klasse I-HLA-Moleküle (umfassend die Sequenz EDQTQDTELVETRP (Seq-ID. Nr. 2) und als HLAI.222-235 bezeichnet) entspricht, wurde durch herkömmliche Peptid-Syntheseverfahren hergestellt; siehe z. B. Merrifield, Science 232, 341-347 (1986); Barany und Merrifield, "The Peptides", Gross und Meienhofer, Hrsg., NY, USA, Academic Press, S. 1-284 (1979); und Stewart und Young, "Solid Phase Peptide Synthesis", Rockford, IL, USA, Pierce, 2. Ausgabe (1984).

2. Hemmung von alloreaktiver und virusspezifischer CTL-Aktivierung

Das gemäß Beispiel 1 hergestellte Peptid wurde dazu verwendet, die Differenzierung reifer CTLs aus CTL-Vorläufern zu reduzieren (bestimmte durch LDA). Das Assayverfahren wird von Salter et al., s. o., beschrieben. Kurz gesagt wurden Peripherblut-Lymphozyten von normalen menschlichen Spendern durch Zentrifugation über Ficoll-Hypaque isoliert und in der angegebenen Zahl mit 3 · 10³ bestrahlten (10.000 R) EBV-Zellen (HLA-A2,B27) kultiviert. Zur Zählung von influenza-spezifischem CTL wurden 5 ug/ml des Influenza-Nukleoprotein-("INF-NP-")Peptids jeder Kultur zugegeben. Eine Beschreibung von HLA-B27-Zellen und des INF-NP-Peptids findet sich z. B. bei Huet et al., Int. Immunol. 2, 311-316 (1990). 24 Wiederholungen wurden für jeden Meßpunkt durchgeführt. Die Kulturen wurden mit 200 ug/ml HLAI.222-235-Peptid (O) oder dem HLA A2.1 60-84-Peptid (X) ergänzt und 7 Tage lang inkubiert. Jeweils zwei Aliquote wurden in einem vierstündigen Assay auf Lyse von &sup5;¹Cr-markiertem HLA-A2.1 CIR oder HLA-B27 CIR untersucht. Für influenza-spezifische CTL wurden 2 pg/ml INF-NP 383-394 dem Zytotoxizitätsassay zugesetzt. Die CTL-Vorläufer-Frequenz wurde nach dem Verfahren von Salter et al., s.o., bestimmt.
Wie aus den Fig. 1A, 1B und 1C ersichtlich, blockierte das HLAI.222-235-Peptid die CTL-Erzeugung sowohl für allogene als auch für influenza-spezifische Reaktionen in wirksamer Weise, während HLA A2.1 60-84 nicht wirksam war. Diese Ergebnisse zeigen, daß die Wechselwirkung von CD8 mit Klasse I-MHC für die Aktivierung und Differenzierung ruhender CD8 T-Zellen nicht entscheidend ist. Diese Erkenntnisse belegen ferner, daß ruhende "Memory"-Zellen als naive Zellen CD8-abhängig sind, da sowohl Recall- (influenza-spezifische) als auch naive (allospezifische) Responses durch das HLAI.222-235-Peptid gehemmt wurden.
Typischerweise wird eine dosisabhängige Kurve erstellt, um die optimale Konzentration der immunmodulierenden Peptide für einen bestimmten Verwendungszweck zu bestimmen. In diesem Beispiel bestimmten die Anmelder die Wirkung verschiedener Konzentrationen des HLAI.222-235-Peptids auf die Erzeugung von HLA-A2.1-spezifischen CTLs. Das HLAI.222-235-Peptid bei 200 (O), 100 (X), 50 () oder 25 ( ) ug/ml; oder das INF NP 383-394 ( ) bei 200 ug/ml wurden am Beginn der 7-Tage-Grenzverdünnungskultur so wie oben beschrieben zugegeben. Somit war die Hemmung in diesem System dosenabhängig, wobei eine fast vollständige Blockade bei 200 ug/ml eintrat (Fig. 1D).

3. Auswirkung der Zugabe von Peptid in unterschiedlichen Stadien der Kultur

In Beispiel 2 wurde das Peptid zu Beginn der siebentägigen Kultur zugegeben; es ist jedoch auch möglich, das immunmodulierende Peptid etwas vor oder nach dem Kontakt mit den stimulierenden Zellen zuzugeben. Die Anmelder verglichen die Wirkung der Zugabe des Peptids am Anfang der 7-Tage-Kultur sowie 24 und 48 Stunden nach dem Beginn. Die Assays wurden wie oben durchgeführt.
Maximale Reduktion der CTL-Vorläufer-Frequenz wurde beobachtet, als das HLAI.222- 235-Peptid zu Beginn der 7-Tage-Kultur zugegeben wurde (pCTL-Frequenz: 1/33.723 für HLAI.222-235 gegenüber 1/10.999 für den Vergleich); mittlere Hemmung zeigte sich, als das Peptid 24 Stunden später zugegeben wurde (pCTL-Frequenz: 1/16.946), und minimale oder keine Hemmung wurde beobachtet, als das Peptid 48 Stunden oder später zugegeben wurde (pCTL-Frequenz: I/II, 862). Die Reduktion der CTL-Vorläufer-Frequenz war sequenzspezifisch, da ähnlich hergestellte Peptide (HLA-A2.I 60-84 und INF NP) keine Wirkung zeigten.

4. Wirkung des HLA-Peptids auf reife Zellen

Es ist auch möglich, die Wirkung der Peptide auf reife Effektor-CTLs zu testen. Das HLAI.222-235-Peptid hatte keine Wirkung auf kultivierte CTLs, die CD8-abhängig oder unabhängig waren (Fig. 2), was durch Hemmung von Lyse in einem herkömmlichen 4 Stunden dauernden Zytotoxizitätsassay bestimmt wurde - ein Anzeichen dafür, daß die CD8-Klasse I-Wechselwirkung eine weniger entscheidende Rolle für reifen, aktivierten CTL spielt oder daß die Konformation des CD8-Moleküls auf kultiviertem CTL die Bindestelle für das HLAI.222-235-Peptid verändert.

5. Wirkung des HLA-Peptids auf primäre proliferative Reaktionen auf Alloantigen und Mitogen

Wie aus Fig. 3 ersichtlich, blockiert das HLAI.222-235-Peptid durch Alloantigen hervorgerufene Proliferation ruhender PBLs nicht. PBLs (5 · 10&sup5;) aus einem normalen Donor wurden mit 3 · 10³ bestrahlten EBV-Zellen ko-kultiviert. In einigen Fällen wurden PBL zuerst von CD4+-Zellen ( , ) oder CD8+-Zellen ( , Δ) abgereichert, indem sie über mit Anti-CD4- oder Anti-CD8-Antikörper beschichtete Platten geschickt wurden. Die Abreicherung war zu mehr als 95% effizient, wie sich in FACS-Analyse zeigte. In einigen Fällen ( , ) wurden Kulturen CD4-abgereicherter Zellen mit durch T-Zellen konditionierten Medien ergänzt. Das HLAI.222-235-Peptid wurde zu Beginn der Kultur in der angegebenen Konzentration zugegeben. Nach 6 Tagen wurde 1 ug/l H-Thymidin jedem Napf zugegeben, und die Kulturen wurden 16 Stunden später geerntet.
Die obigen Beispiele zeigen die Fähigkeit der Peptide der Erfindung, Differenzierung von CTL-Vorläufern zu hemmen. Die Erfindung wurde in den vorliegenden Beispielen und der obigen Offenbarung ausführlich beschrieben, um sie näher zu erläutern. Man beachte jedoch, daß bestimmte Veränderungen und Modifikationen innerhalb des Schutzumfangs der beiliegenden Patentansprüche vorgenommen werden können.

Sequenzauflistung:

(1) Allgemeine Informationen:
(i) Anmelder: The Board of Trustees of the Leland Stanford Junior University
(ii) Titel der Erfindung: CD8-Bindedomänen-Peptide
(iii) Anzahl an Sequenzen: 2
(iv) Kontaktadresse:
(A) Adressant: Bertram I. Rowland
(B) Straße: 4 Embarcadero Center, Suite 3400
(C) Stadt: San Francisco
(D) Bundesstaat: Kalifornien
(E) Land: USA
(F) Postleitzahl: 94111
(v) Computerlesbare Form:
(A) Art des Mediums: Floppy-Disk
(B) Computer: IBM-Kompatibler
(C) Betriebssystem: PC-DOS/MS-DOS
(D) Software: PatentIn Release Nr. 1.0, Version Nr. 1.25
(vi) Daten der laufenden Anmeldung:
(A) Anmeldenummer:
(B) Einreichdatum:
(C) Klasse:
(viii) Informationen bezüglich Anwalt/Vertreter:
(A) Name: Rowland, Bertram I.
(B) Zulassungsnummer: 20.015
(C) Referenz-/Prozeßlisten-Nummer: FP-56849-PC/BIR
(ix) Telekommunikations-Daten:
(A) Telefon: (415) 781-1989
(B) Telefax: (415) 398-3249
(2) Daten für Seq.-ID. Nr. 1:
(i) Sequenzeigenschaften:
(A) Länge: 7 Aminosäuren
(B) Art: Aminosäure
(C) Stränge: einstrangig
(D) Topologie: linear
(ii) Molekülart: Peptid
(xi) Sequenzbeschreibung: Seq.-ID. Nr. 1:
(2) Daten für Seq.-ID. Nr. 2:
(i) Sequenzeigenschaften:
(A) Länge: 14 Aminosäuren
(B) Art: Aminosäure
(C) Stränge: einstrangig
(D) Topologie: linear
(ii) Molekülart: Peptid
(xi) Sequenzbeschreibung: Seq.-ID. Nr. 2:

Claims

1. Zusammensetzung, umfassend ein Peptid mit einer Länge von 7 bis etwa 20 Aminosäureresten, wobei das Peptid eine Aminosäuresequenz umfaßt, in der zumindest 40 der Reste mit Resten an entsprechenden Positionen in einer Sequenz in der α3-Domäne eines MHC-Moleküls der Klasse I identisch sind,

worin das Peptid ein CD8-Molekül an einem zytolytischen T-Lymphozyten-(CTL-) Vorläufer bindet und Differenzierung des CTL-Vorläufers zu einem reifen CTL beeinflußt.

2. Zusammensetzung nach Anspruch 1, worin sich die Sequenz in der α3-Domäne eines MHC-Moleküls der Klasse I zwischen Rest 220 und Rest 235 befindet.

3. Zusammensetzung nach Anspruch 1 oder 2, worin das Ausmaß an Identität zumindest 75% beträgt.

4. Zusammensetzung nach Anspruch 1, worin das Peptid aus der aus SEQ-ID Nr. 1 und SEQ-ID Nr. 2 bestehenden Gruppe ausgewählt ist.

5. Pharmazeutische Zusammensetzung, die einen pharmazeutisch annehmbaren Träger und ein Peptid nach einem der vorangegangenen Ansprüche umfaßt.

6. Zusammensetzung nach Anspruch 5, die weiters einen Immunsuppressor umfaßt.

7. Zusammensetzung zum Modulieren der Aktivität von CTLs bei einem Patienten, umfassend eine therapeutisch wirksame Dosis einer pharmazeutischen Zusammensetzung nach Anspruch 5 oder 6.

8. Zusammensetzung zum Hemmen der Differenzierung eines zytotoxischen T- Lymphozyten-(CTL-)Vorläufers zu einem reifen CTL, der für ein fremdes Antigen spezi fisch ist, wobei die Zusammensetzung die Zusammensetzung nach einem der Ansprüche 1 bis 4 und einen pharmazeutisch wirksamen Träger umfaßt.

9. Verwendung einer Zusammensetzung nach einem der vorangegangenen Ansprüche zur Herstellung eines Medikaments zum Hemmen der Differenzierung eines zytotoxischen T-Lymphozyten-(CTL-)Voräufers zu einem reiten CTL, der für ein fremdes Antigen spezifisch ist.