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Die
vorliegende Erfindung bezieht sich allgemein auf Moleküle wie Peptide,
Polypeptide und Proteine, die in Patienten mit präklinischem
oder klinischem insulinabhängigem
Diabetes mellitus (IDDM) immunologisch mit Antikörpern oder T-Zellen Wechselwirken.
Diese Moleküle
sind in Patienten mit präklinischem
oder klinischem IDDM vorzugsweise immunreaktiv gegenüber T-Zellen
und eignen sich für
die Entwicklung von diagnostischen, therapeutischen und prophylaktischen
Mitteln für
IDDM.
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Aminosäuresequenzen
werden hier durch Sequenzidentitätsnummern
(SEQ ID Nr.) bezeichnet, die am Ende der Beschreibung definiert
sind.
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Wenn
der Kontext nichts anderes erfordert, soll das Wort "umfassen" oder Variationen
davon, wie "umfasst" oder "umfassend", in dieser gesamten
Beschreibung implizieren, dass ein genanntes Element oder eine ganze
Zahl oder eine Gruppe von Elementen oder ganzen Zahlen umfasst ist,
aber ohne irgendein anderes Element oder eine ganze Zahl oder eine
Gruppe von Elementen oder ganzen Zahlen auszuschließen.
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Insulinabhängiger Diabetes
mellitus ist eine ernste Krankheit, die sich aus der Zerstörung von
insulinsezernierenden β-Zellen
ergibt, welche wahrscheinlich von T-Zellen, die β-Zell-Autoantigene erkennen,
vermittelt ist. Ein Hauptantigen, das an der für IDDM charakteristischen T-Zell-vermittelten β-Zell-Zerstörung beteiligt ist,
ist Glutaminsäure-Decarboxylase
(GAD), die in zwei Hauptisoformen GAD 65 und GAD 67 vorkommt. Diese
beiden Isoformen weisen auf dem Aminosäuresequenzniveau ungefähr 65% Ähnlichkeit
auf. Patienten mit IDDM oder mit einem hohen Risiko für die Krankheit
zeigen Autoantikörper
und autoreaktive T-Zell-Antworten auf GAD-Insulin oder beide Autoantigene.
In NOD-Mäusen,
einem Tiermodell für
spontane IDDM, ist GAD ein dominantes und frühes Zielantigen (Tisch et al.,
Nature 366: 72-75, 1993).
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Die
Identifizierung der immundominanten Epitope von pathogenen Autoantigenen,
die an der β-Zell-Autoimmunität beteiligt
sind, könnte
zu verbesserten Diagnoseverfahren sowie therapeutischen Strategien
zur Verhinderung von IDDM führen.
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In
Arbeiten, die zur vorliegenden Erfindung führten, versuchten die Erfinder,
immundominante Epitope in GAD- und Proinsulin-Molekülen zu identifizieren,
um derzeitige Diagnoseverfahren zu verbessern und therapeutische
und prophylaktische Zusammensetzungen und Behandlungsansätze für IDDM weiterzuentwickeln.
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EP 0 171 886 beschreibt
antidiabetische Verbindungen, die von humanem Proinsulin abgeleitet
sind.
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Gemäß der vorliegenden
Erfindung wurden Peptide auf der Grundlage eines dreizehn Aminosäuren umfassenden
Bereichs mit hoher Ähnlichkeit
zwischen den Sequenzen von humanem GAD 65 (Aminosäurereste
Nr. 506-518) und humanem Proinsulin (Aminosäurereste Nr. 24-36) synthetisiert,
wobei sich der Bereich der Ähnlichkeit
auch auf humanes GAD 67 und Maus-Proinsuline und Maus-GADs erstreckt
(1). Die Immunreaktivität dieser Peptide wird gemäß der vorliegenden
Erfindung auf der Basis der Interaktivität von peripheren Blutzellen
identifiziert, und zwar T-Zellen, die aus dem peripheren Blut von
Patienten mit präklinischem oder
klinischem IDDM erhalten wurden, wodurch sie die Basis für einen
neuen Bereich von diagnostischen, therapeutischen und prophylaktischen
Verfahren für
IDDM bilden.
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Gemäß einem
Aspekt der vorliegenden Erfindung wird ein Verfahren zum Testen
der Reaktivität
eines Patienten auf IDDM-Autoantigen angegeben, wobei das Verfahren
das Inkontaktbringen eines Peptids mit der Formel X2, wobei:
X2 eine
Aminosäuresequenz
mit 10 bis 100 Resten, abgeleitet von, homolog zu oder zusammenhängend mit den
Aminosäuren
24 und 36 inklusive von menschlichem Proinsulin ist; und
wobei
das Peptidmolekül
in der Lage ist, mit T-Zeilen zu reagieren und die Funktion von
T-Zellen zu modifizieren, wenn es mit Zellen von Patienten mit präklinischem
oder klinischem IDDM inkubiert wird,
mit Zellen von dem Patienten
und die Bestimmung der Reaktivität
mit einem geeigneten Test umfasst.
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Gemäß einem
anderen Aspekt der vorliegenden Erfindung wird ein Verfahren zum
Testen der Reaktivität
eines Patienten auf IDDM-Autoantigen angegeben, wobei das Verfahren
das Inkontaktbringen eines Peptids mit der Formel X2, wobei X2 =
FFYTPKTRREAED ist und wobei das Peptid in der Lage ist, mit T-Zellen zu reagieren
und die Funktion von T-Zellen zu modifizieren, wenn es mit Zellen
von Patienten mit präklinischem oder
klinischem IDDM inkubiert wird,
mit Zellen von dem Patienten
und die Bestimmung der Reaktivität
mit einem geeigneten Test umfasst.
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Gemäß einem
anderen Aspekt der vorliegenden Erfindung wird die Verwendung eines
Peptids mit der Formel X2, wobei:
X2 eine Aminosäuresequenz mit 10 bis 100 Resten,
abgeleitet von, homolog zu oder zusammenhängend mit den Aminosäuren 24
bis 36 inklusive von menschlichem Proinsulin ist und
wobei
das Peptidmolekül
in der Lage ist, mit T-Zellen zu reagieren und die Funktion von
T-Zellen zu modifizieren, wenn es mit Zellen von Subjekten mit präklinischem
oder klinischem IDDM inkubiert wird
zum Testen der Reaktivität eines
Patienten auf IDDM-Autoantigen durch Inkontaktbringen des Peptids
mit Zellen des Patienten und Bestimmen der Reaktivität mit einem
geeigneten Test angegeben.
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Gemäß einem
anderen Aspekt der vorliegenden Erfindung wird die Verwendung eines
Peptids mit der Formel X2, wobei
X2 = FFYTPKTRREAED ist und wobei das Peptid
in der Lage ist, mit T-Zellen
zu reagieren und die Funktion von T-Zellen zu modifizieren, wenn
es mit Zellen von Patienten mit präklinischem oder klinischem
IDDM inkubiert wird,
zum Testen der Reaktivität eines
Patienten auf IDDM-Autoantigen durch Inkontaktbringen des Peptids
mit Zellen des Patienten und Bestimmen der Reaktivität mit einem
Proliferationstest angegeben.
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Dementsprechend
beschreibt die vorliegende Anmeldung ein rekombinantes oder synthetisches
Peptid oder chemische Äquivalente
davon mit der Formel: X1X2X3, wobei:
X1 und
X3 gleich oder verschieden sein können und
jeweils eine Aminosäuresequenz
sind, die 0 bis 40 natürlich oder
nichtnatürlich
vorkommende Aminosäure reste
umfasst; X2 eine Aminosäuresequenz mit 10 bis 100 Resten,
abgeleitet von, homolog zu oder zusammenhängend mit den Aminosäuren 24
bis 36 inklusive oder Derivaten davon von menschlichem Proinsulin
ist; und wobei das Peptidmolekül
in der Lage ist, mit T-Zellen zu reagieren und die Funktion von
T-Zellen zu modifizieren,
wenn es mit Zellen von Patienten mit präklinischem oder klinischem
insulinabhängigem
Diabetes mellitus (IDDM) inkubiert wird. Zu den bevorzugten Zellen
gehören
unter anderem mononukleäre
Zellen des peripheren Bluts (PBMCs), Zellen aus antikoaguliertem
Vollblut und Gewebebiopsiezellen.
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Wenn
von einem "Peptid" die Rede ist, ist
ein Polypeptid oder Protein oder Teile davon gemeint.
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Geeigneterweise
umfasst X2 nicht weniger als etwa 10 und
nicht mehr als etwa 50 Aminosäurereste, besonders
bevorzugt nicht weniger als etwa 10 und nicht mehr als etwa 30 Aminosäurereste
und ganz besonders bevorzugt nicht weniger als etwa 10 und nicht
mehr als etwa 15 Aminosäurereste.
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Geeigneterweise
hat X2 die folgende Aminosäuresequenz:
FFYTPKTRREAED
(SEQ ID Nr. 1).
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Dementsprechend
wird auch ein rekombinantes oder synthetisches Peptid oder chemisches Äquivalent
davon mit der Sequenz: X1X2X3 beschrieben, wobei:
X1 und X3 gleich oder
verschieden sein können
und jeweils eine Aminosäuresequenz
sind, die 0 bis 15 natürlich oder
nichtnatürlich
vorkommende Aminosäurereste
umfasst; X2 = FFYTPKTRREAED oder ein Derivat
oder chemisches Äquivalent
davon ist und wobei das Peptidmolekül in der Lage ist, mit T-Zellen
zu reagieren und die Funktion von T-Zellen zu modifizieren, wenn
es mit Zellen von Patienten mit präklinischem oder klinischem IDDM
inkubiert wird. Zu den bevorzugten Zellen gehören unter anderem PBMCs, Zellen
aus antikoaguliertem Vollblut und Gewebebiopsiezellen.
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Das
Peptid der vorliegenden Erfindung kann durch rekombinante oder chemisch-synthetische Mittel hergestellt
werden. Die Anmeldung beschreibt ein rekombinantes Peptid, das vorzugsweise
gegenüber
T-Zellen von Individuen mit klinischem oder präklinischem IDDM immunologisch
reaktiv ist und durch Expression in einer Wirtszelle, die mit einer
Cassette transformiert ist, welche für die Peptidsequenzen der vorliegenden
Erfindung codiert, hergestellt wird. Das Peptid kann mit einem anderen
Peptid, Polypeptid oder Protein fusioniert sein. Alternativ dazu
kann das Peptid durch chemisch-synthetische Techniken, wie das Merrifield-Festphasen-Syntheseverfahren,
hergestellt werden. Das synthetische oder rekombinante Peptid kann
GAD-Aktivität oder
Proinsulinaktivität
beibehalten oder auch nicht. Weiterhin stellen synthetische Peptide
der oben angegebenen Formel zwar eine bevorzugte Ausführungsform
dar, doch erstreckt sich die vorliegende Erfindung auch auf biologisch
reine Präparate
der natürlich
vorkommenden Peptide oder von Fragmenten davon. "Biologisch rein" bedeutet ein Präparat, das wenigstens etwa
60%, vorzugsweise wenigstens etwa 70%, besonders bevorzugt wenigstens
etwa 80% und ganz besonders bevorzugt wenigstens etwa 90% oder mehr
umfasst, bestimmt anhand des Gewichts, der Aktivität oder einem
anderen geeigneten Mittel.
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Der
hier verwendete Ausdruck "präklinisches
IDDM" bedeutet diejenigen
Patienten, die Verwandte ersten Grades von jemandem mit IDDM sein
können
oder auch nicht und die genetische und/oder immunologische Marker
von Autoimmunität
gegen Inselzellen (β-Zellen)
des Pankreas aufweisen. "Immunmarker" soll unter anderen
Parametern , die dem Fachmann bekannt sind, auch zirkulierende Antikörper und/oder
T-Zellen umfassen, die gegenüber
Autoantigenen von Inselzellen (β-Zellen)
reaktiv sind.
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Der
hier verwendete Ausdruck "Derivate" soll jede Substitution,
Deletion und/oder Addition von einzelnen oder mehreren Aminosäuren relativ
zu der natürlich
vorkommenden Aminosäuresequenz
im nativen Molekül,
von dem das Peptid abgeleitet ist, einschließlich jeder einfachen oder
mehrfachen Substitution, Deletion und/oder Addition von anderen
Molekülen,
die mit dem Peptid assoziiert sind, einschließlich Kohlehydraten, Lipid
und/oder anderen proteinartigen Molekülen umfassen. Zu diesen Derivaten
gehören
daher auch glycosylierte oder nichtglycosylierte Formen oder Moleküle mit veränderten
Glycosylierungsmustern.
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Der
hier verwendete Ausdruck "mit
T-Zellen reagieren und die Funktion von T-Zellen modifizieren" soll auch eine T-Zell-Aktivierung,
T-Zell-Inaktivierung und/oder T-Zelltod umfassen.
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Die
vorliegende Erfindung beschreibt auch chemische Analoga der betreffenden
Peptide, die unter anderem Modifikationen an Seitenketten, den Einbau
von unnatürlichen
Aminosäuren
und/oder ihren Derivaten während
der Peptidsynthese und die Verwendung von Vernetzern und anderen
Verfahren, die den Peptiden oder ihren Analoga konformatorische
Einschränkungen
auferlegen, umfassen.
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Beispiele
für Seitenkettenmodifikationen,
die in der vorliegenden Erfindung in betracht gezogen werden, sind
Modifikationen von Aminogruppen, wie durch reduktive Alkylierung
durch Reaktion mit einem Aldehyd und anschließende Reduktion mit NaBH4, Amidinierung mit Methylacetimidat, Acylierung
mit Essigsäureanhydrid,
Carbamoylierung von Aminogruppen mit Cyanat, Trinitrobenzylierung
von Aminogruppen mit 2,4,6-Trinitrobenzolsulfonsäure (TNBS), Acylierung von
Aminogruppen mit Bernsteinsäureanhydrid
und Tetrahydrophthalsäureanhydrid
sowie Pyridoxylierung von Lysin mit Pyridoxal-5'-phosphat und anschließende Reduktion
mit NaBH4.
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Die
Guanidingruppe von Argininresten kann durch die Bildung von heterocyclischen
Kondensationsprodukten mit Reagentien wie 2,3-Butandion, Phenylglyoxal
und Glyoxal modifiziert werden.
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Die
Carboxygruppe kann durch Carbodiimid-Aktivierung über O-Acylisoharnstoff-Bildung und anschließende Derivatisierung,
zum Beispiel zu einem entsprechenden Amid, modifiziert werden.
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Sulfhydrylgruppen
können
durch Verfahren wie Carboxymethylierung mit Iodessigsäure oder
Iodacetamid, Oxidation mit Perameisensäure zu Cysteinsäure, Bildung
von gemischten Disulfiden mit anderen Thiolverbindungen, Reaktion
mit Maleinimid, Maleinsäureanhydrid
oder einem anderen substituierten Maleinimid, Bildung von Quecksilberderivaten
mit Hilfe von 4-Chlormercuribenzoat, 4-Chlormercuriphenylsulfonsäure, Phenylquecksilberchlorid,
2-Chlormercuri-4-nitrophenol
und anderen Quecksilberverbindungen oder Carbamoylierung mit Cyanat
bei alkalischem pH-Wert modifiziert werden.
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Tryptophanreste
können
zum Beispiel durch Oxidation mit N-Bromsuccinimid oder Alkylierung
des Indolrings mit 2-Hydroxy-5-nitrobenzylbromid oder Sulfenylhalogeniden
modifiziert werden. Tyrosinreste können andererseits durch Nitrierung
mit Tetranitromethan unter Bildung eines 3-Nitrotyrosin-Derivats
verändert
werden.
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Die
Modifikation des Imidazolrings eines Histidinrests kann durch Alkylierung
mit Iodessigsäure-Derivaten
oder N-Carbethoxylierung mit Diethylpyrocarbonat erreicht werden.
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Beispiele
für den
Einbau unnatürlicher
Aminosäuren
und Derivate während
der Peptidsynthese sind unter anderem die Verwendung von Norleucin,
4-Aminobuttersäure,
4-Amino-3-hydroxy-5-phenylpentansäure, 6-Aminohexansäure, t-Butylglycin, Norvalin,
Phenylglycin, Ornithin, Sarcosin, 4-Amino-3-hydroxy-6-methylheptansäure, 2-Thienylalanin
und/oder D-Isomeren von Aminosäuren.
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Vernetzer
können
verwendet werden, um zum Beispiel 3D-Konformationen zu stabilisieren,
wobei man homobifunktionelle Vernetzer, wie die bifunktionellen
Imidoester mit (CH2)n-Spacer-Gruppen
mit n = 1 bis n = 6, Glutaraldehyd und N-Hydroxysuccinimidester,
sowie heterobifunktionelle Reagentien, die gewöhn lich eine aminoreaktive Struktureinheit,
wie N-Hydroxysuccinimid, und eine andere gruppenspezifisch reaktive Struktureinheit,
wie Maleinimido- oder Dithio-Struktureinheit
(SH) oder Carbodiimid (COOH), enthalten, verwendet. Außerdem können Peptide
konformatorisch eingeschränkt
sein, zum Beispiel durch Einbau von Cα- und
Nα-Methylaminosäuren, Einbau
von Doppelbindungen zwischen Cα- und Cβ-Atomen
von Aminosäuren
und die Bildung von cyclischen Peptiden oder Analoga durch Einführung von
kovalenten Bindungen, wie Bildung einer Amidbindung zwischen dem
N- und dem C-Terminus, zwischen zwei Seitenketten oder zwischen
einer Seitenkette und dem N- oder C-Terminus.
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Beschrieben
wird auch die Verwendung der Peptide oder von Derivaten davon gemäß der vorliegenden
Erfindung bei der Behandlung von Patienten. In diesem letzteren
Aspekt umfassen solche Behandlungsverfahren ihre Verwendung als
Adsorbens zur Entfernung von Autoantikörpern oder autoreaktiven Zellen
aus einem Patienten, ihre Verwendung bei der direkten Verabreichung
an einen Patienten als Mittel zur Desensibilisierung oder zum Induzieren
einer immunologischen Toleranz oder anderer Mechanismen zur Beseitigung oder
Reduktion der Reaktivität
von autoreaktiven T-Zellen oder Autoantikörpern gegenüber IDDM-Autoantigenen oder zur Erzeugung von
T-Zelllinien oder -klonen zur Verwendung als Therapeutika.
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Beschrieben
wird ein Behandlungsverfahren, das das Verabreichen einer wirksamen
Menge eines Peptids an einen Patienten während einer Zeit und unter
Bedingungen umfasst, die ausreichen, um autoreaktive T-Zellen und/oder
Autoantikörper
gegen IDDM-Autoantigene zu entfernen oder deren Anwesenheit oder Funktion
in dem Patienten wesentlich zu reduzieren, wobei das Peptid die
Formel X2 umfasst, wobei:
X2 eine Aminosäuresequenz mit 10 bis 1000
Resten, abgeleitet von, homolog zu oder zusammenhängend mit den
Aminosäuren
24 und 36 inklusive von menschlichem Proinsulin ist; und
wobei
das Peptidmolekül
in der Lage ist, mit T-Zellen zu reagieren und die Funktion von
T-Zellen zu modifizieren, wenn es mit Zellen von Patienten mit klinischem
oder präklinischem
insulinabhängigem
Diabetes mellitus (IDDM) inkubiert wird. Zu den bevorzugten Zellen
gehören
unter anderem mononukleäre
Zellen des peripheren Bluts (PBMCs), Zellen aus antikoaguliertem
Vollblut und Gewebebiopsiezellen.
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Das
hier in Betracht gezogene Behandlungsverfahren umfasst unter anderem
die folgenden Beispiele. Ein erstes Beispiel für eine Behandlung ist die Desensibilisierung
oder Toleranzinduktion unter Verwendung einer wirksamen Menge eines
synthetischen Peptids oder Derivats davon zur Veränderung
der T-Zell-Erkennung von oder der Antwort auf GAD und/oder Proinsulin
und/oder andere IDDM-Antigene
und/oder zur Induktion der Unterdrückung oder Regulation von T-Zellen. Dies kann
durch Ausnutzung der bekannten Wirkung bestimmter Ultraviolettwellenlängen, insbesondere
UV-B, einer Modifikation der Antigenpräsentierung durch die Haut oder
durch transmukosale oder systemische Verabreichung erreicht werden.
Wirksame Mengen der Peptide oder Derivate davon würden epikutan
auf die Haut von Patienten aufgetragen, die eine Reaktivität der T-Zellen
des peripheren Bluts gegenüber
GAD- oder Proinsulinpeptide oder -polypeptide aufweisen. Nach Einwirkung
von UV-B-Strahlung auf die Haut würde man die Behandlung wiederholen,
bis die T-Zell-Reaktivität gegenüber GAD
oder Proinsulin unterdrückt
ist.
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Ein
zweites Behandlungsbeispiel besteht darin, eine mukosal vermittelte
Toleranz zu induzieren, wobei man eine wirksame Menge der betreffenden
Peptide oder ihrer Derivate verwendet, um die T-Zell-Erkennung von
oder Antwort auf GAD und/oder Proinsulin und/oder andere IDDM-Antigene
zu verändern
und/oder die T-Zell-Unterdrückung
zu induzieren, und zwar durch die Verabrei chung des Peptids oder
der Derivate durch orale, Aerosol- oder intranasale Mittel, neben
anderen Wegen der mukosalen Verabreichung.
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Eine
andere Behandlung beinhaltet die Auftragung der betreffenden Peptide
auf die Haut zusammen mit einem oder mehreren Cytokinen, wie unter
anderem TNFα oder
-β. Eine
weitere Behandlung beinhaltet die systemische Verabreichung von
löslichem
Peptid über
subkutane oder intravenöse
Wege zur Induktion der immunologischen Toleranz. Noch eine weitere
Behandlung beinhaltet die T-Zell-Immunisierung,
wodurch T-Zelllinien gegen GAD- oder Proinsulinpeptid oder -polypeptid
oder Fragmente davon durch Standardverfahren erzeugt werden, Zellen
durch Fixierung mit Mitteln wie Glutaraldehyd oder Paraformaldehyd
abgeschwächt,
unter sterilen Bedingungen gewaschen und in Patienten reinjiziert
werden, und zwar während
einer solchen Zeit und unter solchen Bedingungen, dass eine Unterdrückung der
endogenen T-Zellantwort auf Autoantigene verursacht wird. Diese
Ansätze
sind auf die Prävention
des Fortschritts von IDDM bei symptomfreien Patienten mit präklinischem
IDDM oder Patienten mit vor kurzem eingesetztem klinischem IDDM
sowie auf die Rezidivierung von IDDM bei Patienten, die Pankreas-,
Inselzellen- oder insulinproduzierende Zelltransplantate erhalten
haben, anwendbar. Diese Ansätze
sind auch auf das Stiff-Man-Syndrom
(SMS) und andere Krankheiten, bei denen GAD und/oder Proinsulin
ein Autoantigen ist, anwendbar.
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Gemäß der vorliegenden
Erfindung beträgt
die wirksame Peptidmenge 0,1 μg
bis 10 mg pro Dosis und vorzugsweise 1,0 μg bis 1 mg pro Dosis. Eine Dosis
kann eine einzelne Verabreichung oder eine Vorschrift mit einzelner
oder mehrfacher Verabreichung stündlich,
täglich,
wöchentlich
oder monatlich oder zu anderen geeigneten Zeitpunkten umfassen.
Die Verabreichung kann durch jedes zweckmäßige Mittel erfolgen, wie unter anderem
intravenöse,
subkutane, epikutane, Infusions-, orale, topische, intranasale,
Aerosol-, Suppositorium- oder intraperitoneale Verabreichung. Das
Peptid kann allein oder in Kombination mit einem oder mehreren anderen
aktiven Molekülen,
wie Molekülen,
die die Aktivität
oder Wirkung des Peptids erleichtern, zum Beispiel Lipopolysaccharid
(LPS), Choleratoxin-β-Kette,
mit der Lymphocytenfunktion assoziiertes Antigen-3 (LFA-3), anderen
Hilfsmitteln und insbesondere Tumornekrosefaktor α (TNF-α), Tumornekrosefaktor β (TNF-β) oder leukämiehemmendem
Faktor (LIF) verabreicht werden.
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In
einer Ausführungsform
wird in der vorliegenden Erfindung die Verwendung der hier beschriebenen Peptide
zur Messung der Reaktivität
der Zellen eines Patienten gegenüber
dem IDDM-Autoantigen in Betracht gezogen. Die Peptide oder ihre
Derivate können
in Lösung
oder an einen festen Träger
gebunden zusammen mit Zellen, die vom peripheren Blut oder von Gewebebiopsien
abgeleitet sind, entweder unfraktioniert, fraktioniert oder als
kontinuierliche Zelllinien abgeleitet, hinzugefügt werden. Dann kann die Reaktivität gegenüber dem
Autoantigen durch Standardproliferationstests, wie Einbau von tritiiertem
Thymidin, cytotoxischen Standardtests, wie Freisetzung von Markerradioaktivität aus Zielzellen,
Messungen exprimierter oder sezernierter Moleküle, wie Oberflächenmarker
oder Cytokine, oder andere Standardtests für zelluläre Reaktivität, die in
der Technik wohlbekannt sind, gemessen werden.
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Gemäß diesem
Aspekt der vorliegenden Erfindung wird ein Verfahren zum Testen
der Reaktivität
eines Patienten gegenüber
IDDM-Autoantigen angegeben, wobei das Verfahren das Inkontaktbringen
eines Peptids mit der Formel X2, wobei:
X2 eine Aminosäuresequenz mit 10 bis 100 Resten,
abgeleitet von, homolog zu oder zusammenhängend mit den Aminosäuren 24
und 36 inklusive von menschlichem Proinsulin ist; und
wobei
das Peptidmolekül
in der Lage ist, mit T-Zellen zu reagieren und die Funktion von
T-Zellen zu modifizieren, wenn es mit Zellen von Patienten mit präklinischem
oder klinischem insulinabhängigem
Diabetes mellitus (IDDM) inkubiert wird,
mit Zellen von dem
Patienten und die Bestimmung der Reaktivität mit einem geeigneten Test
umfasst. Gemäß diesem
Assay kann jeder Zelltyp verwendet werden, aber vorzugsweise ist
er ausgewählt
aus PBMCs, Zellen aus antikoaguliertem Vollblut oder Gewebebiopsiezellen.
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Vorzugsweise
wird in der vorliegenden Erfindung ein Verfahren zum Testen der
Reaktivität
eines Patienten auf IDDM-Autoantigen in Betracht gezogen, wobei
das Verfahren das Inkontaktbringen eines Peptids mit der Formel X2, wobei X2 =
FFYTPKTRREAED ist und wobei das Peptid in der Lage ist, mit T-Zellen zu reagieren
und die Funktion von T-Zellen zu modifizieren, wenn es mit Zellen
von Patienten mit präklinischem oder
klinischem IDDM inkubiert wird,
mit Zellen von dem Patienten
und die Bestimmung der Reaktivität
mit einem geeigneten Test umfasst. Vorzugsweise gehören zu den
Zellen unter anderem mononukleäre
Zellen des peripheren Bluts (PBMCs), Zellen aus antikoaguliertem
Vollblut und Gewebebiopsiezellen.
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Die
vorliegende Anmeldung beschreibt auch einen diagnostischen Kit zum
Bestimmen von T-Zellen. Standard-96-Napf-Platten, wie sie bei ELISA
verwendet werden, werden mit einem monoklonalen Antikörper (mAb)
gegen ein T-Zell-Cytokin,
wie γ-Interferon
(γ-IFN),
mit oder ohne Antigen vorbeschichtet. Alternativ dazu wird Antigen
in löslicher
Form zusammen mit Aliquoten von peripherem Blut, mononukleären Zellen
des peripheren Bluts oder T-Zellen hinzugefügt. Die Inkubation wird einen
oder mehrere Tage lang voranschreiten gelassen, der Überstand
(der Medium und Plasma umfasst) und die Zellen werden weggewaschen,
die Näpfe werden
erneut gewaschen, und die Platten werden mit einem markierten zweiten
mAb gegen das Cytokin, wie Anti-γ-FIN,
der mit alkalischer Phosphatase oder Meerrettich-Peroxidase konjugiert
ist, entwickelt. Eine kolorimetrische Reaktion und entsprechende
Ablesesysteme können
verwendet werden. Alternativ dazu werden lösliche Cytokine (z.B. γ-IFN) im Überstand durch
Standardassays, wie ELISA, gemessen; weiterhin ist es möglich, einzelne
Flecken auf Böden
von Näpfen,
die auf dem Einzelzellniveau produziertes Cytokin repräsentieren,
mikroskopisch durch die ELISPOT-Technik sichtbar zu machen, was
eine Bestimmung der Häufigkeit der
gegenüber
dem Peptidepitop reaktiven T-Zellen ermöglicht.
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Die
vorliegende Erfindung wird nun unter Bezugnahme auf die folgenden
nichteinschränkenden
Figuren und Beispiele näher
beschrieben.
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In
den Figuren:
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zeigt 1 einen
Vergleich der Bereiche der Ähnlichkeit
zwischen Maus- und Humaninsulinen und -GADs. Ähnlichkeiten sind mit Kästchen umrahmt;
Identitäten
innerhalb der Kästchen
sind schraffiert. Der C-Terminus der reifen Insulin-B-Kette und der Proinsulin-Spaltungsstelle
sind durch die vertikale Linie bzw. den Pfeil angezeigt;
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ist 2 eine
graphische Darstellung, die das Niveau der zellulären Vermehrung
zeigt, das als Delta-Score nach der Stimulierung von mononukleären Zellen
des peripheren Bluts, die IDDM-Risiko- (wie sie in Beispiel 1 beschrieben
sind) oder Kontrollpatienten entnommen wurden, mit den folgenden
Peptiden ausgedrückt
ist: humanes GAD 65 (Reste 506-518); humanes Proinsulin (Reste 24-36); irrelevantes
Kontrollpeptid; oder Tetanustoxoid (CSL Ltd., Melbourne, Australien).
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ist 3 eine
graphische Darstellung, die die Vermehrung (Mittelwert + Standardfehler
des Mittelwerts) von pbmc gegen Proinsulin (aa 24-36) und Insulin
(aa 1-15) bei präklinischen
und Kontrollpatienten zeigt;
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ist 4 eine
graphische Darstellung, die die IFN-gamma-Antwort (Mittelwert +
Standardfehler des Mittelwerts) auf Proinsulin (aa 24-36) und Insulin-β-Kette (aa
1-15) bei präklinischen
und Kontrollpatienten zeigt;
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ist 5 eine
graphische Darstellung, die die IL10-Antwort (Mittelwert + Standardfehler
des Mittelwerts) auf Proinsulin (aa 24-36) und Insulin-β-Kette (aa
1-15) bei präklinischen
und Kontrollpatienten zeigt.
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Die
folgenden Ein- und Dreibuchstabenabkürzungen werden für Aminosäurereste
verwendet:
| Aminosäure | Dreibuchstabenabkürzung | Einbuchstabensymbol |
| Alanin | Ala | A |
| Arginin | Arg | R |
| Asparagin | Asn | N |
| Asparaginsäure | Asp | D |
| Cystein | Cys | C |
| Glutamin | Gln | Q |
| Glutaminsäure | Glu | E |
| Glycin | Gly | G |
| Histidin | His | H |
| Isoleucin | Ile | I |
| Leucin | Leu | L |
| Lysin | Lys | K |
| Methionin | Met | M |
| Phenylalanin | Phe | F |
| Prolin | Pro | P |
| Serin | Ser | S |
| Threonin | Thr | T |
| Tryptophan | Trp | W |
| Tyrosin | Tyr | Y |
| Valin | Val | V |
| beliebiger
Rest | Xaa | X |
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Beispiel 1
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Patienten
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Patienten
mit IDDM-Risiko stammten aus der Melbourne-Prädiabetes-Familienstudie, Victoria,
Australien. Jeder wurde auf der Grundlage eingegeben, dass er wenigstens
einen Verwandten ersten Grades mit IDDM hat und Inselzellantikörper (ICA) ≥ 20 JDF-Einheiten
und/oder Insulin-Autoantikörper
(IAA) ≥ 100
nE/ml aufwies. Alle hatten im nüchternen
Zustand normale Blutglucosewerte und Werte für glykiertes Hämoglobin und
hatten sich in Abständen
von sechs Monaten wiederholten Antikörper- und Stoffwechseltests
unterzogen.
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Die
Kontrollpatienten waren HLA-DR-angepasst, symptomfrei und ohne IDDM-Historie.
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Alle
Patienten stimmten nach Aufklärung
schriftlich zu, und die Studie wurde von den Ethikkomitees des Royal
Melbourne Hospital und des Walter and Eliza Hall Institute of Medical
Research genehmigt. Einzelheiten zu den Patienten sind in Tabelle
1 beschrieben.
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Beispiel 2
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HLA-Typbestimmung und Tests auf ICA-,
IAA-, GAD-Antikörper,
FPIR:
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HLA-Typbestimmung:
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Die
Typbestimmung von HLA Klasse I (A, B, C) und HLA Klasse II (DR,
DQ) wurde unter Verwendung von Populationen von T- bzw. B-Lymphocyten
durchgeführt.
Die Zellen wurden aus antikoaguliertem Blut isoliert, wobei man
Magnetkügelchen
(Dynal) verwendete, die mit monoklonalen Antikörpern gegen CD8 (Klasse I)
oder eine monomorphe Determinante auf der Klasse-II-beta-Kette (Klasse II)
beschichtet waren. Die angereicherten Zellpopulationen wurden in
einem Standard-Mikrolymphocytotoxizitätstest typisiert, wobei eine
Batterie von 240 Alloseren für
Klasse I und 120 Alloseren für
Klasse II verwendet wurde.
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Antikörpertests:
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ICA
wurden mit Hilfe von indirekter Immunfluoreszenz auf Pankreas von
Spendern der Blutgruppe 0 bestimmt. Die Titer in JDF-Einheiten wurden
bestimmt, indem man die Verdünnung
von positiven Seren verdoppelte und mit Standardseren verglich,
die in jedem Test mitliefen. Der Test wurde in alle internationalen
Diabetes-Workshops und Leistungsprogramme aufgenommen.
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IAA
wurden durch einen international standardisierten Radiobindungstest
bestimmt. Die Obergrenze für
normale Kontrollseren beträgt
40 nE gebundenes Insulin/ml Serum.
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GAD-Antikörper wurden
durch Immunfällung
von enzymatischer GAD-Aktivität
aus Ferkelhirnextrakt bestimmt. Der Mittelwert plus 3 (drei) Standardabweichungen
von 72 gesunden Probanden, 460 nE/ml, wurde verwendet, um den normalen
Bereich zu definieren.
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Insulinfreisetzung der ersten Phase (FPIR):
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Die
FPIR wurde als Summe der Seruminsulinkonzentrationen 1 und 3 Minuten
nach der Beendigung von intravenöser
Glucose (0,5 g/kg Körpergewicht),
die über
3 Minuten injiziert wurde, berechnet.
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Beispiel 3
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T-Zell-Proliferationstest
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Blut
wurde gleichzeitig (innerhalb von 30 Minuten) von gepaarten IDDM-Risikopatienten und HLA-DR-angepassten
Kontrollpatienten entnommen und in gleicher Weise verarbeitet, um
die Wirkungen der Variation im Tageslauf und von Handhabungsartefakten
zu reduzieren. Mononukleäre
Zellen des peripheren Bluts wurden durch Ficoll-Paque(Pharmacia
Biotech)-Dichtezentrifugation aus heparinisiertem Vollblut isoliert, gewaschen
und in RPMI-1640-Medium (Biosciences Pty Ltd.), das 20 mM Hepes
(CSL Ltd.), 10-5 M 2-Mercaptoethanol (BDH),
Penicillin (100 E/ml), Streptomycin (100 μg/ml) und 10 Vol.-% autologes Plasma
enthielt, resuspendiert. Aliquote von 200 μl (2 × 105 Zellen)
wurden in Näpfe
einer 96-Napf-Runbodenplatte (Falcon) übergeführt und in sechs Replikaten
mit den folgenden Peptiden in Endkonzentrationen von 10, 2 und 0,4 μg/ml inkubiert:
humanes GAD 65 (506-518), humanes Proinsulin (24-36) (synthetisiert
mit Hilfe eines Applied Biosystems Model 431A Synthesizers (ABI,
Foster City, CA)) und ein irrelevantes Kontrollpeptid (CRFDPQFALTNIAVRK)
(Macromolecular Resources, Fort Collins, CO). Tetanustoxoid (CSL
Ltd., Melbourne, Australien) in Endkonzentrationen von 1,8, 0,18
und 0,018 LfE/ml wurde als positive Kontrolle verwendet. Zwölf "nur-autolog"-Näpfe, die
Zellen enthielten, aber ohne Antigen, wurden als Hintergrundkontrolle
mit aufgenommen. Die Platten wurden 6 Tage lang bei 37 °C in einem
befeuchteten Inkubator mit 5 Vol.-% CO2 inkubiert;
während
der letzten 6 Stunden wurden 0,25 μCi [3H]Thymidin
(ICN) in jeden Napf gegeben. Dann wurden die Zellen auf Glasfaserfilter
geerntet, und die eingebaute Radioaktivität wurde durch Zählen von
Betateilchen gemessen (Packard Model 2000 Flüssigszintillationszähler). Das
Niveau der zellulären
Vermehrung wurde als Delta-Score ausgedrückt (DS = mittlere Zahl der
Zählereignisse
pro Minute (cpm) eingebaut in Gegenwart von Antigen minus der mittleren
cpm der "nur-autolog"-Näpfe).
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Beispiel 4
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T-Zell-Vermehrungsantworten
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T-Zell-Vermehrungsantworten
auf die ähnlichen
13-mer-Peptide aus Proinsulin und GAD wurden bei zehn Paaren von
HLA-DR-angepassten Risiko- und Kontrollpatienten verglichen. Die
HLA-DR-Anpassung wurde nicht nur wegen der Spezifität der Peptidbindung
an MHC-Klasse-II-Allele, sondern auch wegen der bekannten Assoziation
zwischen MHC Klasse II und IDDM als wichtig erachtet. Daher würden T-Zell-Antworten eher
die IDDM- als die MHC-Spezifität
widerspiegeln. Antworten auf die höchste Konzentration von jedem
der beiden Peptide waren signifikant (Proinsulin, p < 0,008; GAD, p < 0,018 – einseitige
gepaarte Wilcoxon-Analyse) größer unter
IDDM-Risiko- als unter Kontrollpatienten. Die Ergebnisse sind in
Tabelle 2 zusammengefasst.
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Die
Reaktivität
der Proinsulinsequenz war fast völlig
auf IDDM-Risikopatienten beschränkt,
während einige
Kontrollen auch auf das GAD-Peptid ansprachen (Tabelle 2, 2).
Beide Gruppen sprachen ähnlich auf
Tetanus an, und kein Patient sprach auf das nichtverwandte Kontrollpeptid
an.
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Für sechs
dieser Paare (Nr. 1, 2, 3, 5, 6, 7) wurde der Test bei einer anderen
Gelegenheit, aber unter Verwendung von doppelt so vielen Zellen
(4 × 105 pro Napf) durchgeführt. Die Erschöpfung der
Medien führte in
drei Fällen
zu unzuverlässigen
Ergebnissen. Bei zwei der anderen drei Fälle (Nr. 5 und 6) waren die
Ergebnisse mit den hier tabellierten im Einklang, während im
dritten Fall (Nr. 3) der Risikopatient bei der höheren Zellzahl eine größere Reaktivität gegenüber beiden
Antigenen aufwies.
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Beispiel 5
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T-Zell-Cytokin-Sekretionsassays
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In
einer zweiten Kohorte von 18 gepaarten IDDM-Risiko- und HLA-DR-angepassten
Kontrollen wurden PBMCs, wie sie in Beispiel 3 angegeben sind, mit
humanem Proinsulin 24-36 und humaner Insulin-β-Kette 1-15 jeweils mit 0,5,
5 bzw. 50 μg/ml
unter denselben Bedingungen wie in Beispiel 3 inkubiert. Außer dem
Ernten von Zellen für
die Messung der Vermehrung anhand der [3H]-Thymidin-Aufnahme nach 6 Tagen, wie
in Beispiel 3, wurden nach 2 Tagen Proben aus den Inkubationsmedien über den
Zellen für
die Messung von IFN-γ und
Interleukin (IL) 10 durch Standard-ELISA-Verfahren entnommen.
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Beispiel 6
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T-Zell-Antworten
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T-Zell-Vermehrungs-
und IFN-γ-
und IL-10-Sekretionsantworten auf humanes Proinsulin 24-36 und humanes
Insulin B 1-15 wurden bei 18 Paaren von HLA-DR-angepassten IDDM-Risiko- und Kontrollpatienten miteinander
verglichen. Wie in Beispiel 4 gab es eine signifikant größere (p
= 0,003) Vermehrungsantwort von IDDM-Risikopatienten auf das Proinsulinpeptid
(3). Außerdem
war die Sekretion von sowohl IFN-γ als auch
IL-10 als Reaktion auf das Proinsulinpeptid im Vergleich zu angepassten
Kontrollpatienten signifikant (p = 0,005 bzw. p = 0,001) erhöht (4, 5).
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