JP3420245B2 - ペプチドp277類似体及びこれを含む糖尿病の治療又は診断のための薬剤組成物 - Google Patents
ペプチドp277類似体及びこれを含む糖尿病の治療又は診断のための薬剤組成物Info
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Description
エピトープの変形である新規ペプチド、これを含む薬剤
組成物及びこのようなペプチドを用いたインシュリン依
存性糖尿病(IDDM)の診断及び治療方法に関する。
ュリン生産性β−細胞を攻撃し、破壊するT細胞に起因
する自己免疫疾患である(カスタノ及びアイゼンバー
ス、1990年)。IDDMにおいて完結する自己免疫過程は症
状を発現することなく始まり、進行する。この疾患はβ
−細胞の累積的損失量がインシュリンを供給する残余β
−細胞の容量を越えた場合にのみ臨床的に表面化する。
実際、グルコース恒常性の破壊及び臨床的なIDDMは80−
90%のβ−細胞が免疫系により不活性化された後にのみ
生じると考えられている。従って、IDDMに罹患したと特
定することができる患者はβ−細胞の自己免疫による破
壊の進行した段階に至る。さらに、自己免疫マーカーに
よる初期の前臨床的な糖尿病の診断は自己免疫過程が開
始した後にのみ行うことができる。従って、治療法を探
索するということは、既に進行している自己免疫過程を
停止する安全、明確且つ有効な方法を見出すことであ
る。
れるNOD種のマウスに進行している自然発症性糖尿病の
研究によりこの問題を検討した(カスタノ及びアイゼン
バース、1990年)。NODマウスは生後約4週でインシュ
リン炎を発症し、これは小島周辺部の穏やかな浸潤とし
て開始し、重篤な小島内の炎症という過程をたどる。イ
ンシュリン不足を証明する高血糖症は本発明者のコロニ
ーのメスでは生後約14−17週で始まる。生後約35−40週
までに殆ど全てのメスNODマウスは重篤な糖尿病を発症
し、インシュリン療法を行わなかった場合殆ど死亡す
る。オスNODマウスは低い罹患率を示すがその理由は明
らかでない。NODマウスの糖尿病は自己免疫T細胞に起
因することが示されている(ベンデラックら、1987
年)。
NODマウスの場合と同様に、ヒトIDDM患者においても検
出されており、可能な標的抗原に対する免疫がこの疾病
の主たる原因であるかは明らかではない。治療の問題は
因果関係の問題の背後にある。
始まる前に、マウスを食事制限、ウイルス感染又は免疫
系の不特定な刺激のような種々の操作の対象とすること
により防止することができることが示されている(ボウ
マンら、1994年)。NOD糖尿病は、グルタミン酸デカル
ボキシラーゼ(GAD)抗原に対する免疫寛容を前糖尿病
マウスに誘発することにより防止される(カウフマン
ら、1993年;ティッシュら、1993年)。
子のp277ペプチド配列に特異的なT細胞を用いたT細胞
のワクチン接種により防止されることを見出している
(エリアスら、1991年)。このタンパク質は以前はhsp6
5と称されていたが、現在は分子量に関するより正確な
情報を参照してhsp60と称されており、いずれの名称を
用いてもタンパク質は同一である。
sp60の配列の位置437−460に対応するp277ペプチドは本
出願人のイスラエル特許出願第94241号及びエリアス及
びコーエン、1994年において最初に開示され、以下のよ
うな配列を有する。
と、おそらくNOD糖尿病に必須の抗−p277免疫の抑制す
るように規制することにより、糖尿病の進行を防止する
ことが示されている(エリアスら、1991年;イスラエル
特許出願第94241号)。最近の研究により、p277ペプチ
ドはβ−細胞自己免疫の段階の進行を逆転するために用
いることもできることが示されている(エリアス及びコ
ーエン、1994年)。
素であるストレプトゾトシン(STZ)の投与により、自
己免疫糖尿病の形態をマウスのC57BL/KsJ種に誘発する
ことができることを報告した(エリアスら、1994年)。
標準少量のSTZの40mg/kgを5日間投与すると通常3週間
以内に臨床的な糖尿病を誘発するが、30mg/kgを5日間
投与すると約3ヶ月の遅滞期間後にのみ臨床的な糖尿病
が誘発される。この誘発された糖尿病のモデルは、イン
シュリンに対する自己抗体、インシュリン自己抗体に対
する抗−イディオタイプ抗体及びhsp60に対する自己抗
体の前兆期間内の外観により標識される。また、マウス
もhsp60及びそのp277ペプチドに対する自然的なT−細
胞活性を明らかに示す(エリアスら、1994年)。従っ
て、STZの標準少量より少ない量の投与により、NODマウ
スにおいて進行する自然発症的な糖尿病において観察さ
れるものとは異なるものでなく、自己免疫過程の引き金
を引くということは明らかである(エリアスら、1990
年)。
のであり、この変異体はIDDMの診断及び治療に有用であ
る。
て、単一のスレオニン残基がリジン残基に置換され及び
/又は1又は両方のシステイン残基がバリン残基により
置換されたペプチドは糖尿病の治療においてp277と同程
度の活性を有するということが思いがけなく見出され
た。セリン残基によるシステイン残基の置換は不活性な
ペプチドをもたらすので、これらの結果は驚くべきこと
であった。
である。
r又はLys残基であるが、X3がThr残基である場合、X1及
びX2の両方がCysであることはできない。) 本発明の具体的実施例は、配列Iを有し、X1及びX2の
両方がCysであり、X3はLysであるp277(Lys19)(配列
番号(SEQ ID NO):3)、X1がValであり、X2がCysで
あり、X3がThr又はLysであるp277(Va16)(配列番号
(SEQ ID NO):4)及びp277(Val6−Lys19)(配列番
号(SEQ ID NO):5)、X1がCysであり、X2がValであ
り、X3がThr又はLysであるp277(Val11)(配列番号(S
EQ、ID NO):6)及びp277(Val11−Lys19)(配列番号
SEQ ID NO):7)、X1とX2の両方がValであり、X3がTh
r又はLysであるp277(Val6−Val11)(配列番号(SEQ
ID NO):8)及びp277(Val6,11−Lys19)(配列番号
(SEQ ID NO):9)のペプチドからなる。p277(Val6
−Val11)はp277(V)と称する。
たIDDMの早期の診断方法及びキットを提供することであ
る。IDDMが進行する過程において、動物はhsp60分子又
はこれと交差反応する分子を発現し、これは動物の血液
又は尿にたどり着く。また、これらはこのような分子を
特異的に対象とする抗体及びT細胞を発現する。従っ
て、血液又は尿中のhsp60(又はこれと交差反応する分
子)又は抗体又はこれと特異的なT細胞は、β−細胞の
破壊が完結し、固体が生涯糖尿病を運命づけられる前に
IDDMの過程を検出するためのアッセイの目的にかなう。
尿についてヒトhsp60と免疫学的に反応する抗−hsp60抗
体又はT細胞の存在を抗原としての本発明の配列Iのペ
プチドでテストすることにより診断することができる。
実際、ペプチドp277が使用可能であると従来より記述さ
れているいかなる方法、例えば、WO90/10449で国際公開
されているPCT国際出願に記載されている方法であっ
て、引用により本明細書に一体化される方法は、本発明
の配列Iのペプチドをp277の代用とする場合に使用する
ことができる。
診断する方法であって、前記患者についてhsp60と免疫
反応する抗−hsp60抗体又はT細胞の存在をテストし
て、これによってhsp60と免疫的に反応する抗−hsp60抗
体又はT細胞の存在が陽性を示す結果がIDDMの存在又は
開始の可能性が高いことを示す方法を提供する。
hsp60抗体の存在がテストされ、このテスト法はラジオ
イムノアッセイ又はELISAテストを含むことができる。
れることもできる。この形態の実施例においては、テス
ト方法はT細胞増殖テストを含み、このT細胞増殖テス
トは (i)患者から得られて血液サンプルからT細胞を含む
非核細胞フラクションを調製し、 (ii)前記非核細胞フラクションに請求項1記載のペプ
チドから選択された抗原を加え、 (iii)前記抗原の存在下で適切な時間、適切な培養条
件で前記細胞フラクションを培養し、 (iv)前記培養時間の終了前の適切な時点で(iii)の
培養された細胞のカルチャーに対し標識されたヌクレオ
チドを加え、前記標識されたヌクレオチドを増殖してい
るT細胞のDNAに取り込ませ、 (v)前記T細胞に取り込まれた標識されたヌクレオチ
ドの量を分析することにより増殖しているT細胞の量を
決定する工程を含む。
オチドは好ましくは3H−チミジンである。増殖している
T細胞の量の決定は標準的な方法でT細胞の刺激指数を
計算することにより行われる。
法はT−細胞サイトカイン応答テストを含み、これにお
いてはステップ(i)から(iii)は上記T細胞増殖テ
ストと同一であるが、ステップ(iv)において応答して
いるリンパ細胞により培地中に分泌されたIFN−γ、IL
−2、IL−4、IL−6、IL−10、TNFα又はTGFβのよう
なサイトカインが商業的に入手可能なキットで標準的な
方法で検出される。
選択される抗原が患者に皮下注射され、検出可能な皮膚
反応(DTH)の発生が観察されるインヴィヴォ系の方法
を提供する。
キットとともに、このようなアッセイを実行する手段を
提供する。キットは本発明を達成するために用いられる
種々のアッセイのいずれかを実行するために調製するこ
とができる。このようなキットの各々は単一のアッセイ
又は所定数のアッセイを実行するのに必要な全ての物質
を含む。例えば、抗−hsp60抗体の存在を決定するキッ
トは固相に固定された配列Iのペプチドと、標識された
抗−ヒトFabのような検出される抗−hsp60抗体の不変領
域を認識することができる標識された抗体とを含む。ま
た、キットはキットを使用するための説明書とキットの
物質を保持するための容器を含んでもよい。ラジオアイ
ソトープ、酵素、発色団又は発蛍光団のような従来から
ある標識を用いることができる。典型的なラジオアイソ
トープはヨウ素−125又はイオウ−35である。本目的の
ための典型的な酵素はホースラディッシュペルオキシダ
ーゼ、β−ガラクトシダーゼ及びアルカリホスファター
ゼを含む。
存在を診断するキットは、 (i)配列Iのペプチドから選択される抗原と、 (ii)検出される抗−hsp60抗体の不変領域を認識する
ことができる標識された抗体とを含む。
によりIDDMの存在を診断するキットは、 (i)配列Iのペプチドから選択される抗原と、 (ii)リンパ細胞(T細胞)の培養に適した培地と、 (iii)T細胞増殖テストのための標識されたヌクレオ
チド又はサイトカインテストのためのIFN−γ、IL−
2、IL−4、IL−6、IL−10、TNFα又はTGFβのような
サイトカインとアッセイキットのいずれかを含む。
した形態の配列Iのペプチドのみを含むことができる。
する。本発明の配列Iの抗原ペプチドのワクチン接種は
抗原に対する自己免疫を下降調節し、IDDMの自己免疫過
程に対する抵抗性を有効に作り出す。このような抗原に
特異的なT細胞によるワクチン接種が、希釈化又は弱毒
化された形式による場合、抗原性を向上させるために処
理された後である場合、又はそのフラグメント又は活性
フラクションである場合でも同一である。患者が既にID
DMの前臨床的な開始段階にあると示されている場合、こ
のような抗原又はT細胞(又はフラクション)はこの抗
原に対する自己免疫を下降調節し、明確で恒久的な損失
が生じる前に自己免疫過程を抑止することができる。ま
た、ペプチドp277によるNODマウスの治療に関し本発明
の発明者が最近示したように(エリアス及びコーエン、
1994年)、ペプチドは自己免疫過程がはるかに進行した
後であってもこれを停止するための治療剤として用いる
ことができる。
の予防又は治療のための調製物を提供するものであり、
この調製物は(a)ヒトhsp60のp277配列の特異性を明
らかにし、配列Iのペプチドの存在下で培養されること
により活性化されるヒトT細胞、(b)放射されさもな
ければ希釈された前記ヒトT細胞、(c)水圧による圧
力処理、化学架橋剤による処理及び/又は細胞骨格架橋
剤による処理を受けた前記ヒトT細胞、(d)上記
(a)(b)又は(c)のT細胞のフラグメント又は
(a)(b)又は(c)のT細胞から得られた表面タン
パク質又は(e)前記タンパク質、その塩、機能的誘導
体、前駆体又は活性フラクションに特異的な(a)のリ
セプターの可変領域からなるペプチドから成る群から選
択されるT細胞生産物を含む。
されるIDDM患者から得られた同原T細胞であり、このT
細胞は配列Iの前記ペプチドとインヴィトロ系で接触さ
せることにより活性化される。このような特異的で活性
化されたT細胞は、細胞を得た同一の患者に投与され
る。
の主剤としての配列Iのペプチド、その塩又はその作用
的誘導体とを含むIDDMを予防又は治療するための薬剤組
成物を提供する。薬剤学的に許容可能な担体とは、好ま
しくは、不完全フロインドアジュバント(IFA)として
知られるミネラルオイルのエマルジョンのようなオイル
担体である。しかしながら、IFAは、完全フロインドア
ジュバント(CFA;マイコバクテリアの死滅した組織を含
むミネラルオイルの調製物)と同様、ヒトに対する使用
は認められない。その理由はミネラルオイルは代謝可能
でなく、身体により分解されることができないからであ
る。
使用されてきた特定の脂肪エマルジョンが本発明のペプ
チドを用いたペプチド療法の担体として機能することが
できることを見出した。このようなエマルジョンの例
は、イントラリピッド及びリポフンディンとして知られ
ている商業的に入手可能な脂肪エマルジョンである。
“イントラリピッド”は静脈内栄養のための脂肪エマル
ジョンに対するスウェーデンのカビ・ファーマシアの登
録商標であり、米国特許第3,169,094号に記載されてい
る。リポフンディンはドイツのビー・ブラウン・メルシ
ュンゲンの登録商標である。両方とも脂肪としてダイズ
油(蒸留水1000ml中各々100又は200g、各々10%又は20
%)を含む。卵黄リン脂質はイントラリピッド中で乳化
剤として用いられており(12g/l蒸留水)、卵黄レシチ
ンはリポフンディン中で用いられている(12g/l蒸留
水)。イントラリピッド及びリポフンディンの両方にお
いて、等張性はグリセロール(25g/l)の添加による。
方法は配列Iのペプチドを含む薬剤組成物又は本発明の
配列Iのペプチドに対し特異性を発現するT細胞を含む
調製物をこれを必要とする患者に投与することを含む。
グラフである。黒塗りの円はp277を用いた結果を示し、
白抜きの円はp277(Val6−Val11)を用いた結果を示
す。大きい円は1週間の貯蔵後の結果を示し、中間の大
きさの円は9週後を示し、最も小さい円は20週後を示
す。
チドp277(黒塗りの円)及びp277(Val6−Val11)(白
抜きの円)に応答して増殖することを示す。
増殖することを示す。5匹のメスマウスの脾臓が各々の
月齢のグループでペプチドp277(Lys19)(黒塗りの
円)、p277(白抜きの円)及びコントロールペプチドp2
78(黒塗りの四角形)に応答したT細胞の増殖がテスト
された。
チドp277に応答して増殖することを示す。
の処置又はGADp34による処置と比較してIFA中のp277
(V)による前処置の有効性を示すグラフである。
プチドの糖尿病に対する生物活性が維持される限り、そ
の塩及び作用的誘導体も意味する。
容され得る有機及び無機塩である。
体”は、残基又はN−又はC−末端の側鎖として現れる
官能基から公知の手段により調製されることができる誘
導体を含み、これは薬剤的に許容可能である、即ち、p2
77の公知の活性の類似性に関する限りペプチドの活性を
破壊せず、これを含む組成物に毒性を与えず、その抗原
性に不利な影響を与えない限り、本発明に含まれる。こ
のような“作用的誘導体”は1個のアミノ酸を他に有効
に変換する変化を含むものと意図されない。
ば、カルボキシル基の脂肪酸エステル、アンモニア又は
第1級又は第2級アミンとの反応により生産されるカル
ボキシル基のアミド、アシル部分(例えば、アルカノイ
ル又はカルボサイクリックアロイル基)との反応により
形成されるアミノ酸残基の遊離アミノ基のN−アシル誘
導体又はアシル部分との反応により形成される遊離ヒド
ロキシル基(例えば、セリル又はスレオニル残基のそ
れ)のO−アシル誘導体を含む。
断用組成物における抗原と同様に、薬剤組成物における
免疫原、特にIDDMの軽減又は治療のためのワクチンとし
て用いることができる。これらの薬剤及び診断用組成物
は、本技術分野における公知の方法により調製すること
ができるものであるが、本発明の一部をなす。
られる場合、本発明のペプチドは自己免疫T細胞のTH1
→TH2のシフトを促進する生物活性を有する担体ととも
に投与されることが好ましい。CD4ヘルパー型のT細胞
は活性化された場合に分泌するサイトカインにより2つ
のグループに分類される(モスマン及びコフマン、1989
年)。TH1細胞はIL−2及びIFN−γを分泌し、TH2細胞
はIL−4及びIL−10を分泌する。このような担体は10−
20%の植物及び/又は動物起源のトリグリセライド、1.
2−2.4%の植物及び/又は動物起源のリン脂質、2.25−
4.5%の浸透圧調整剤、0−0.5%の抗酸化剤及び100%
までの蒸留水を含む脂肪エマルジョンでることが好まし
い。このような担体はイントラリピッド又はリポフンデ
ィンであることが最も好ましい。このような担体の使用
は、本発明についてのイスラエル特許出願(出願人の参
照番号9451Aにより特定される)と同日に本出願と同一
の出願人により出願人されたイスラエル特許出願(出願
人の参照番号9523により特定される)に記載されてお
り、この内容は全体として本明細書中に一体化される。
肉内、静脈内、鼻腔内などのように非経口的に投与する
ことができる。
れる動物モデルにおいて本発明の化合物及び組成物によ
る治療上の処置の有効性を確立するものである。
スラエル、レホヴォトのウィズマンインスティチュート
オブサイエンスのアニマルブリーディングセンターより
提供された。これらのマウスは生後14から17週でヒトの
IDDMに類似する自己免疫性糖尿病を自然発症する。
いた標準フェモック化学により合成され、逆相クロマト
グラフィーによりHPLCで精製された。配列はアミノ酸分
析により確認された。以下のようなペプチドが合成され
た。p277ペプチド;配列:Asn−Glu−Asp−Gln−Lys−Il
e−Gly−Ile−Glu−Ile−Ile−Lys−Arg−Thr−Leu−Ly
s−Ile(配列番号(SEQ ID NO):10)のコントロール
ペプチドp278、ヒトhsp60分子の458−474の位置に対応;
p277のフラグメント:p277のアミノハーフ(p277.N)、p
277のカルボキシハーフ(p277.C)、及びp278と結合し
ているp277C(p277.C−p278);ペプチドp277(Ly
s19);配列中の2つのシステイン残基が種々のアミノ
酸で置換されたペプチドp277は以下の通りである:−SH
基で架橋されたp277(p277(Cys−Cys架橋));両方の
システイン残基がバリンで置換されたp277(p277(Val6
−Val11))又はセリンで置換されたp277(p277(Ser6
−Ser11))。
又はウシ血清アルブミン(BSA,USA,MO,セントルイスの
シグマから購入)のエマルジョン0.1mlを背中に皮下注
射するにより処置された。抗原はPBS中で希釈され、同
量のミネラルオイル(不完全フロインドアジュバント
(IFA);シグマ)又は10%のイントラリピッド中で乳
化された。マウスの血中グルコースレベルはエリアス
ら、1991年に記載されているように、10A.M.の非絶食状
態、治療時(生後7、12、15又は17週)及び生き残った
マウスについては生後40週でテストされた。グルコース
濃度が11.1mM/L以上の場合に明確な高血糖症であるとさ
れた。その理由は、この濃度の血中グルコースは100匹
の健康なマウスで測定された平均血中グルコース濃度よ
り高い3つの標準偏差だからである(示さず)。脾臓の
小島の組織学的検査はヘマトキシリン及びエオシンで着
色された部分について行われた。この部分は群の特性を
知らない2人の観察者により別個に評価された。種々の
処置の統計的な差異を明らかにするためχ2テストが用
いられた。
れたクローンC9細胞及び脾臓細胞のサスペンションが前
述のように(エリアスら、1991年)T−細胞増殖が試験
された。簡単に言うと、1×105個クローン細胞/ml又は
1×106個脾臓細胞/mlが、5μg/mlの種々の抗原の存在
下又は不存在下で、マイクロタイターウェル中の0.2ml
の培養培地中で72時間4組にわたって培養された。増殖
は、培養の最後の12時間の[3H]−チミジンのDNAへの
取り込みにより測定された。結果は刺激指数、即ち抗原
存在下における平均テストcpmの抗原不存在下における
平均バックグラウンドcpmに対する比として計算され
た。4組のサンプル間における標準偏差は常に平均cpm
の<10%であった。脾臓細胞の実験におけるバックグラ
ウンドは<1000cpmであり、C9細胞については<200cpm
であった。各々のマウスの脾臓は別々にテストされた。
各々のグループのマウスの結果は平均±SDとして示され
ている。
が、単独であるいは結合して、p277のようにNODマウス
において有効であるかどうかをテストするため、メスNO
Dマウスは生後7週の時点で、オイル中の種々のペプチ
ド50μgを皮下接種することにより治療された。生後40
週までのマウスの状態が決定された。
は糖尿病の進行に効果を有しなかったことが分かる。即
ち、治療された40匹のマウス中、全てが糖尿病であり、
90%が生後40週までに死亡した。これに対して、p277ペ
プチドは死亡を完全に防止し、20匹の処置したマウスの
60%を治癒した。p277のフラグメントはそれほど有効で
はなかった。即ち、p277のアミノハーフ(p277.N)、p2
77のカルボキシハーフ(p277.C)及びこれらの混合物
(p277.N,p277.C)は、完全なp277の約半分の作用を果
たした。ペプチドp277.Cはペプチドp278に結合して合成
され、長いペプチドを生産する。しかしながら、p277.C
−p278はp277.C単独よりも良い結果を示さなかった。従
って、完全な治療上の効果を得るためには完全な、p277
ペプチドが必要であると結論することができる。
277(Cys−Cys架橋)、p277(Val6−Val11)及びp277
(Ser6−Ser11)。
A)0.2cc中の100μgのペプチドを皮下投与することに
より治療された。マウスは生後12週で処置され、糖尿病
の罹病率が生後30週の時点で決定された。
治療においてp277と同じように有効であり、未処置のマ
ウスの糖尿病の罹病率は80%であるが、p277及びp277
(Val6−Val11)で処置されたマウスは各々22%及び23
%の罹病率を示した。一方、p277(Cys−Cys架橋)また
はp277(Ser6−Ser11)のいずれも治療上の効果を奏し
なかった。位置6及び11におけるシステイン残基がアラ
ニン又はγ−アミノブチル酸残基で置換された2つの追
加のp277の変異体もまたクローンC9細胞及びNOD脾臓T
−細胞の双方でインヴィトロでテストした場合有効でな
かった。これらの2つのペプチドは抗−p277特異的T細
胞(示さず)により認識されなかったので、これらは治
療効果のためのインヴヴィヴォテストには供されなかっ
た。
の問題であったので、p277(Val6−Val11)の安定性が
合成後のいくつかの時点でテストされた。p277ペプチド
は不安定であり、厳格な条件(真空中の凍結乾燥パウダ
ー、−20℃)においても悪化する。
較するため、両方のペプチドが同時に合成され、乾燥粉
末として−20℃で貯蔵された。合成日の1、9及び20週
後、アリクウォットが計量され、溶解され、テストされ
た。ペプチドの安定性はT細胞クローンC9を刺激する能
力により評価された。図1は実験の結果を示す。元のp2
77は合成後9週間以内にほとんどの効果を失い、20週ま
でに全ての効果を失うが、p277(Val6−Val11)は20週
間の貯蔵の後でも変化しないことが分かる。
れるので、p277の生物活性を保持する本発明の全ての類
似体は、p277(Val6−Val11)の例で示されたのと同様
の方法で、p277よりも優れた安定性を有することが期待
される。
療はインシュリン炎を逆転する NODメスマウスは、生後12週で、ミネラルオイルのエ
マルジョン(不完全フロイントアジュバント)0.1cc中
の改変されていないp277又はp277(Val6−Val11)を100
μg/マウスだけ皮下投与することにより治療された。コ
ントロールマウスはPBS及びミネラルオイルのエマルジ
ョンを投与された。生後6ヶ月で各々の群の5匹のマウ
スが犠牲にされ、脾臓が摘出され、ブワン固定液中で固
定され、その部分がヘマトキシリン、エオシンで着色さ
れた。インシュリン炎はブラインド法で評価された。コ
ントロールマウスでは重篤な糖尿病が進行したので、こ
れらのマウスは生後5ヶ月で犠牲にされた。その時まで
に、コントロールマウスの血中グルコースレベルは29−
48mmol/Lの範囲であった。結果を表3に示す。
の小島の約60%が小島内のインシュリン炎を示し、約20
%の小島が小島周辺部のインシュリン炎を有し、約20%
の小島はインシュリン炎を示さなかった。小島内の浸潤
はβ細胞の作用の欠如に関連したインシュリン炎の重篤
の形態であると考えられる。表3に示すように、小島部
の外観の顕著な分岐は、オイル単独で処置されたコント
ロールマウスと比較して処置された2つの群において発
達した。オイルで処置を受けたマウス(コントロール)
では影響を受けなかった小島部の比率が斬新的に下降
し、生後22週、即ち全てのマウスが明らかな糖尿病とな
る時点までには、わずか10%の正常な小島部を観察する
ことができるだけであった。小島部の約67%は22週の時
点で小島内のインシュリン炎を示し、残りの23%の小島
部は小島周辺部のインシュリン炎を示した。対照的に、
p277又はp277(Val6−Val11)で処置されたマウスは正
常な小島の数の上昇(25%から52%の間)及び小島内に
インシュリン炎を有する小島の数の下降(6%から17%
の間)を示した。小島周辺部のインシュリン炎を起こし
ている小島は約31%−69%にまで上昇した。従って、p2
77及びp277(Val6−Val11)による治療は、治療後3ヶ
月以上持続するインシュリン炎の程度の逆転と関連する
組織学上の描写の改善に関連する。
スマウスの群の各々が生後12−15週でオイル中のp277
(V)又はオイル単独で処置された。オイル単独で処置
された150匹のマウスの総数の内、90%で糖尿病が進行
し、85%が生後32週まで死亡した。対照的に、p277(V
で処置されたマウスはわずか50%(p<0.01)の罹病率
を示しただけであり、わずか20%が重篤な糖尿病で死亡
しただけであった(p<0.01)。従って、p277(V)に
よる後期の治療は致命的な糖尿病の進行を停止させるの
に有効であった。
型糖尿病のペプチド療法 膵臓のインシュリン生産性β−細胞の自己免疫による
破壊はT−リンパ球により行われる。炎症性浸潤は生後
5−8週で膵臓の小島周辺部で発達し、インシュリン欠
乏症及び完全な糖尿病をもたらすβ細胞の破壊は生後14
−20週で認められるようになり、生後35−40週までには
ほとんど100%のメスNODマウスは影響を与える。
%の卵リン脂質及び2.25%のグリセロールからなる10%
の油性エマルジョン(イントラリピッド、カビファーマ
シアAB、スウェーデン)0.1ml中の100μgのペプチドp2
77(Val6−Val11)をマウスごとに皮下投与することに
より処置された。
Val11)抗体の生産は以下の通りであった。糖尿病は持
続的な高血糖症、即ちベックマングルコースアナライザ
ーIIで1週間の間隔をおいて少なくとも2回11.1mmol/L
以上の血中グルコースレベルが測定された場合に診断さ
れた。ペプチド療法は、正常な血中グルコース濃度(1
1.1mmol/L以下)が維持された場合、膵臓の小島内の炎
症(インシュリン炎)が軽減された場合及びTH2型の免
疫応答のインディケーターとして治療に用いるペプチド
に対する抗体が誘発された場合に成功したと判断され
た。結果を表4に示す。
された本発明のペプチドによる処置は糖尿病の罹病率及
び死亡率を低下するのに有効であった。一方、PBS中で
投与された処置は無効であった。
差反応性である 前糖尿病のNODマウスから単離されたT−細胞クロー
ンC9の細胞はペプチドp277(黒塗りの円)、p277(Val6
−Val11)(白抜きの円)、p277(Ser6−Ser11)(黒塗
りの四角形)及びp277(Cys−Cys架橋)(白抜きの菱
形)と共に培養された。結果を図2に示す。クローンC9
はペプチドp277及びp277(Val6−Val11)に対してのみ
陽性の増殖応答を示すことが見出された。これはp277及
びp277(Val6−Val11)が交差反応性であり、ペプチドp
277(Ser6−Ser11)及びp277(Cys−Cys架橋)は治療上
は有効でなく、免疫学的に交差反応性でないことを示
す。
l11)の両方に対してT−細胞増殖応答を示す 新しくIDDMと診断された患者(2−4週)が増殖アッ
セイでテストされた。末梢血のリンパ球がヘパリンを加
えた全血からフィコール−ハイパーク法で単離され、イ
ンヴィトロ系で増殖がスクリーニングされ、これは3H−
チミジンの取り込みとして測定され、hsp60ペプチドP27
7、P277(Val60−Val11)及びコントロールペプチドp27
8により誘発された。T細胞増殖応答は刺激指数(S
I)、即ち、ペプチドで刺激されたチミジン取り込みの
量とT細胞によるチミジンのバックグラウンド(抗原が
加えられていない)の取り込み量との割合として表され
る。
は、p277ペプチドと同様に、p277(Val6−Val11)に対
して応答する。従って、p277(Val6−Val11)は免疫学
的にp277と均等である。p277の治療上の効果は、免疫学
上の認識により達成されるので、p277(Val6−Val11)
がp277と免疫学的に交差反応性であるという事実は、p2
77(Val6−Val11)は糖尿病の治療においてp277の代り
に用いることができるということを示している。
細胞の応答 21人のIDDM患者及び14人の健康な血液ドナーが実施例
7の増殖アッセイにより抗−hsp60及びp277(V)のス
クリーニングを受けた。表6及び表7はコントロール抗
原(コントロールAg)、即ち破傷風毒素及びテキサス株
のインフルエンザウィルス及び全体の遺伝子組み替え型
hsp60及びp277(V)に対する各々の個体のT細胞の増
殖応答(刺激指数;SI)を示す。3又はそれ以上のSI値
は陽性と考えられた。
に対し応答したのに対し、21%及び14%がコントロール
に応答したこと(p<0.05)を示す表である。従って、
IDDM群はhsp60及びp277(V)に対する応答が明らかに
陽性であった。これによって、IDDM患者ではhsp60及びp
277(V)に反応する個体の割合は健康人よりも高いと
いう結論が導かれる。
なる。p277(Lys19)がNODのIDDMにおける自己抗原であ
ることを確認するため、ペプチドp277及びペプチドp277
(Lys19)に対するT−細胞の増殖を比較した。図3は
メスNOD脾臓のT細胞がp277と同一の程度p277(Lys19)
に対して増殖したことを示す。コントロールペプチドp2
78に対する応答は存在しなかった。
対して応答することが知られている糖尿病誘発性のNOD
のT−細胞クローンを使用することで確認された(エリ
アスら、1991年)。C9細胞はp277ペプチドと同程度p277
(Lys19)ペプチドに対して増殖することが見出された
(図4)。
れる進行したインシュリン炎はヒトp277の単一注射で処
置することで停止することができ、処置されたマウスで
は臨床的に完全な糖尿病の罹病率及び重篤な高血糖症に
よる死亡率が低下することを報告した。ペプチドp277
(Lys19)、即ちマウスの自己p277ペプチドが有効であ
るかどうかテストするため、本発明者は生後3ヶ月のメ
スNODマウスをIFA中のヒトp277又はp277(Lys19)100μ
gで処置した。
ドp277又はp277(Lys19)は同量の不完全フロインドア
ジュバント(IFA)で乳化された。10匹の生後3ヶ月の
メスNODマウスの群はいずれかのペプチドを含むエマル
ジョン0.1ml(ペプチド100μg)が皮下注射された。コ
ントロールマウスはPBS及びIFAのエマルジョンが注射さ
れた。マウスは4週毎に採血され、血中グルコースレベ
ルがベックマングルコースアナライザーIIで求められ
た。高血糖症の罹病率及び糖尿病による死亡率は、生後
6ヶ月で評価された。マウスは血中グルコースが11mmol
/Lより大きい場合に糖尿病と診断された。
ルマウスが完全な高血糖症となり、60%が糖尿病により
死亡した。これに対して、p277又はp277(Lys19)によ
る処置により糖尿病(各々40%及び50%の罹病率)及び
死亡(各々10及び20%の死亡率)が防止された。従っ
て、マウスの自己ペプチドp277(Lys19)は進行したイ
ンシュリン炎の治療に異種p277として有効であると思わ
れる。
ドを用いて検出されたNODのT細胞の増殖応答は、マウ
スhsp60及マウスp277(Lys19)配列に対する自己免疫応
答と均等であることを示す。これは前糖尿病マウスの脾
臓において進行している自然応答と同様、糖尿病誘発性
C9T細胞クローンについても示された。さらに、p277(L
ys19)はNODマウスの糖尿病の治療にp277と同程度有効
であった。月齢及び性別が一致する他の種類のマウスの
脾臓T細胞はp277に対する自然的なT−細胞の増殖応答
を示さなかった(示さず)。
列に対する自己免疫性の発見は、IDDMが自己免疫過程に
起因するという一般的な考え方を支持するものである。
射されると、24−48時間以内にβ−細胞を破壊すること
により中毒性糖尿病を引き起こすことができるβ−細胞
特異性毒素である。これを少量投与すると糖尿病に結び
つく遺伝的なマウスのインシュリン炎を誘発する。炎症
過程はSTZの容量により、20−30日かかる。STZ誘発性糖
尿病のための通常のプロトコールは体重1kgに対し200mg
のSTZを連日40mg/kgの容量を5回投与することであり
(ライク及びロジニ、1976年)、このモデルは低量STZ
と呼ばれている。全量が150mg/kg(30mg/kg X 5)に減
量されると、糖尿病は80−100日以内に発現するという
ことが見出されている。このSTZ誘発性糖尿病の穏やか
な進行形態はおそらくヒトにおける自己免疫性糖尿病と
類似し、NODマウスの自然発症的な糖尿病の前臨床的段
階と同一の期間持続する(カスタノ及びアイゼンバー
ス、1990年)。さらに、急性の毒素効果は容量が減少す
ると減少する。
ら、1990年)及びSTZ誘発性(エリアスら、1994年)糖
尿病の両方において役割を果たしている。完全な糖尿病
が始まる前に、hsp60に対する抗体及びT細胞増殖応答
が生じていることが示されている。hsp60に特異的なT
細胞クローンは前糖尿病NODマウスに由来し、若いNOD
(エリアスら、1991年)又はτγιδNODマウスにイン
シュリン炎及び高血糖症を養子免疫伝達することができ
る。NOD糖尿病誘発性T細胞クローンはp277と呼ばれるh
sp60配列437−460の24個のアミノ酸からなる長いペプチ
ドを認識する。誘発性糖尿病は前臨床段階で抗−p277T
細胞応答を伴う。
スを保護することを示した。本実験は低量STZモデルに
おけるp277(V)療法の有効性をテストするものであ
る。
TZで5日間治療された。1週間後、マウスはオイル中の
100μgのp277(V)、カウフマンらが1993年にNODマウ
スの糖尿病に関連すると記載したグルタミン酸デカルボ
キシラーゼ(GADp34)のペプチド又はオイル単独で処置
された。この処置は、85日間繰り返された。100日目に
マウスは採血され、その血液が高血糖症かどうかテスト
された(15mmol/L以上のグルコース濃度)。結果を図5
に示す。GADp34で処置されたマウス又は処置されなかっ
たマウスの平均血中グルコースは高血糖症の範囲にある
ことが分かる。反対に、p277(V)で処置されたマウス
の平均血中グルコースは正常の範囲内であった。従っ
て、p277(V)は遺伝的に異なるメスNODマウスで自然
的に進行した糖尿病と同様STZにオスC57BL/ksjマウスに
誘発された糖尿病の治療においても有効である。p277
(V)療法の適用性は、1の原因又は1の遺伝子型又は
性別の糖尿病に限定されない。
は要約、又は公開された若しくは対応する米国若しくは
外国出願、発行された米国又は外国出願、更には他の参
照文献を含むものであるが、全体として本明細書に一体
化され、これは、引用された文献中の全てのデータ、
表、数値及びテキストを含む。更に、ここに引用した参
照文献中で引用されている参照文献の全体の内容もまた
本明細書に一体化される。
の方法又は従来の方法への参照は、本発明の観点、説明
及び実施例が関連技術において開示、教示又は示唆され
ていることを認めるものではない。
しているので、本技術の属する分野の通常の知識を適用
することにより(ここに引用した参照文献の内容を含
む)、不必要な実験を行うことなく、本発明の一般的概
念から離れることなく、容易に実施例の変更及び/又は
応用を行うことができる。従って、このような変更及び
応用は、本明細書中における教示及び指導に基づき、実
施例と均等の意味及び範囲内であると意図される。本明
細書中で用いられた用語は発明の説明のためのものであ
り、発明を限定するものではないので、本明細書の用語
は本明細書の開示及び教示を参照して、発明の属する技
術の分野における通常の知識を有する者の知識と組み合
わせることにより、通常の知識を有する者により解釈さ
れなければならない。
C)、バッハ(Bach JF)、(1987)、糖尿病NODマウス
から健康な新生児への自己免疫糖尿病の親縁移転:L3T4
+及びLy+−2+T細胞の要件(Syngeneic transfer o
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答は非肥満性糖尿病マウスにおいてインシュリンと相互
関連する(Immune response to glutamic acid decarbo
xylase correlates with insulitis in non−obese dia
betic mice)、Nature,366:72−75 配列表 (1)一般情報: (i)出願人: (A)氏名:イェダ リサーチ アンド ディヴェ
ロップメントカンパニー、リミテッド (B)番地:P.O.Box 95 (C)町名:レホヴォト (E)国名:イスラエル (F)郵便番号(ZIP):76100 (A)氏名:コーエン、イルン アール (B)番地:ハンキン ストリート 11 (C)都市名:レホヴォト (E)国名:イスラエル (F)郵便番号(ZIP):76354 (A)氏名:エリアス、ダナ (B)番地:デレチ ヤヴネ 57 (C)都市名:レホヴォト (E)国名:イスラエル (F)郵便番号(ZIP):76344 (A)氏名:フリドキン、マティチャフ (B)番地:ミラー ストリート 23 (C)都市名:レホヴォト (E)国名:イスラエル (F)郵便番号(ZIP):76284 (ii)発明の名称:ペプチドp277類似体及びこれを含
む糖尿病の治療又は診断のための薬剤組成物 (iii)配列の数:10 (iv)コンピューター判読: (A)媒体の種類:フロッピーディスク (B)コンピューター:IBM PC compatible (C)オペレイティングシステム:PC−DOS/MS−DOS (D)ソフトウェア:パテントイン リリース #
1.0、バージョン1.30(EPO) (vi)前出願の情報 (A)出願番号:IL 112094 (B)出願日:1994年12月21日 (vi)前出願の情報 (A)出願番号:IL 114460 (B)出願日:1995年7月5日 (2)配列番号(SEQ ID NO):1の情報 (i)配列の特徴 (A)長さ:アミノ酸24個 (B)型:アミノ酸 (C)鎖の数:一本鎖 (D)トポロジー:直鎖状 (ii)配列の種類:ペプチド (xi)配列の記載:配列番号(SEQ ID NO):1: (2)配列番号(SEQ ID NO):2の情報 (i)配列の特徴 (A)長さ:アミノ酸24個 (B)型:アミノ酸 (C)鎖の数:一本鎖 (D)トポロジー:直鎖状 (ii)配列の種類:ペプチド (ix)特徴 (A)名前/キー:ペプチド (B)位置:6、11、19 (D)他の情報:位置6/11のXaaはCys又はValであ
り、位置19のXaaはThr又はLysであり、位置19のXaaがTh
rである場合、位置6/11のXaaの両方がCysでない。
る。
る。
る。
Claims (21)
- 【請求項1】下記のアミノ酸配列からなるペプチド、そ
の塩、又はアミノ酸残基の側鎖上もしくはN−あるいは
C−末端上の官能基から調製されるその機能性誘導体。 (式中、X1及びX2はVal残基であり、X3はThr残基であ
る。) - 【請求項2】患者からの血液もしくは尿サンプル中の、
インシュリン依存性糖尿病(以下、IDDMという。)の存
在もしくは開始を示す、ヒトhsp60と免疫学的に反応す
る抗体もしくはT細胞の存在を検出するための請求項1
記載のペプチドの使用。 - 【請求項3】患者からの血液もしくは尿サンプル中の、
IDDMの存在又は開始を示す、ヒトhsp60と免疫学的に反
応する抗体もしくはT細胞の存在を検出する方法であっ
て、前記患者からの血液又は尿サンプルについて前記抗
体又はT細胞の存在を抗原としての請求項1記載のペプ
チドでテストする方法。 - 【請求項4】前記サンプルについてhsp60と免疫反応す
る抗−hsp60抗体又はT細胞の存在をテストして、これ
によってhsp60と免疫的に反応する抗−hsp60抗体又はT
細胞の存在が陽性を示す結果がIDDMの存在又は開始の可
能性が高いことを示す請求項3記載の方法。 - 【請求項5】前記サンプルは抗−hsp60抗体の存在がテ
ストされる請求項3又は4記載の方法。 - 【請求項6】テスト方法はラジオイムノアッセイを含む
請求項5記載の方法。 - 【請求項7】テスト方法はELISAテストを含む請求項6
記載の方法。 - 【請求項8】請求項3から7のいずれか1項記載の方法
に従って抗−hsp60抗体の存在をテストすることによりI
DDMの存在を診断するためのキットであって、 (i)請求項1のペプチドである抗原と、 (ii)検出される前記抗−hsp60抗体の不変領域を認識
することができる標識された抗体とを含むキット。 - 【請求項9】前記抗原は固相に固定されている請求項8
記載のキット。 - 【請求項10】IDDMの診断においてキットの使用のため
のインストラクションを含む請求項8又は9記載のキッ
ト。 - 【請求項11】標識はラジオアイソトープ、酵素、発色
団及び発蛍光団からなる群から選択される請求項8から
10のいずれか1項記載のキット。 - 【請求項12】前記サンプルはhsp60と免疫反応するT
細胞の存在がテストされる請求項3又は4記載の方法。 - 【請求項13】テスト方法はT細胞増殖テストを含む請
求項12記載の方法であって、このT細胞増殖テストは (i)患者から得られた血液サンプルからT細胞を含む
非核細胞フラクションを調製し、 (ii)前記非核細胞フラクションに請求項1記載のペプ
チドから選択された抗原を加え、 (iii)前記抗原の存在下で適切な時間、適切な培養条
件で前記細胞フラクションを培養し、 (iv)前記培養時間の終了前の適切な時点で(iii)の
培養された細胞のカルチャーに対し標識されたヌクレオ
チドを加え、前記標識されたヌクレオチドを増殖してい
るT細胞のDNAに取り込ませ、 (v)前記T細胞に取り込まれた標識されたヌクレオチ
ドの量を分析することにより増殖しているT細胞の量を
決定する 工程を含む方法。 - 【請求項14】テスト方法はT細胞サイトカイン応答テ
ストを含む請求項12記載の方法であって、このサイトカ
イン応答テストは、 (i)患者から得られた血液サンプルからT細胞を含む
非核細胞フラクションを調製し、 (ii)前記非核細胞フラクションに請求項1記載のペプ
チドから選択された抗原を加え、 (iii)前記抗原の存在下で適切な時間、適切な培養条
件で前記抗原の存在の下で前記細胞フラクションを培養
し、 (iv)応答しているリンパ細胞により培地中に分泌され
たサイトカインの存在を測定する 工程を含む方法。 - 【請求項15】サイトカインはIFN−γ、IL−2、IL−
4、IL−6、IL−10、TNF−α又はTGFβである請求項14
記載の方法。 - 【請求項16】請求項3、4又は13項記載の方法により
hsp60と免疫反応するT細胞の存在をテストすることに
よりIDDMの存在を診断するためのキットであって、 (i)請求項1のペプチドの抗原と、 (ii)標識されたヌクレオチドと、 (iii)リンパ球の培養のために適した培地 とを含むキット。 - 【請求項17】請求項3、4、14又は15項記載の方法に
よりhsp60と免疫反応するT細胞の存在をテストするこ
とによりIDDMの存在を診断するためのキットであって、 (i)請求項1のペプチドの抗原と、 (ii)リンパ細胞の培養に適した培地と、 (iii)応答しているリンパ細胞により培地中に分泌さ
れたサイトカインの存在を測定するためのキット とを含むキット。 - 【請求項18】IDDMの診断においてキットの使用のため
のインストラクションを含む請求項14から17のいずれか
1項記載のキット。 - 【請求項19】請求項1のペプチドと薬剤学的に許容さ
れる担体とを含む薬剤組成物。 - 【請求項20】IDDMの予防又は治療のための請求項19記
載の薬剤組成物。 - 【請求項21】IDDMを治療するための薬剤組成物を調製
するための請求項1記載のペプチドの使用。
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