JP3165148B2 - インスリン依存性糖尿病の診断と治療 - Google Patents

インスリン依存性糖尿病の診断と治療

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Description

【発明の詳細な説明】 発明の分野 本発明はインスリン依存性糖尿病（IDDM）の存在、ID
DMになり易い性向、又はIDDMになる過程の開始を検出す
る方法に関し、さらに詳しくは本発明は65キロダルトン
の熱ショック蛋白（hsp65）（又はこれと免疫学的に交
差反応をする分子）、又はこのような蛋白に反応性の抗
体やＴ細胞に関する。
さらに本発明は、hsp65又はその免疫学的に関連する
蛋白又は断片を投与するか、又はこのような蛋白又は断
片に活性化されたＴ細胞（このようなＴ細胞は処理して
その免疫原性を減弱化されている）又はこのようなＴ細
胞や処理されたＴ細胞の断片を、その免疫学的寛容を引
き起こすように投与することにより、IDDMを防止したり
発生中のIDDMを治療する方法に関する。
発明の背景 インスリン依存性糖尿病（IDDM）の発生率は、多くの
国でこの数十年間に数倍増加し、現在生きているヒトの
１％は70才になるまでにIDDMになるだろうと予想されて
いる。IDDMはインスリン産生ベータ細胞を破壊する自己
免疫学的反応により引き起こされる。糖尿病の臨床症状
はベータ細胞の大部分（おそらく90％）が再生できない
ほど破壊された後に初めて現れ、患者の生存はインスリ
ンの外的供給に依存することになる。即ち臨床診断がで
きる時期にはこの自己免疫反応は不可逆的な損傷を与え
ており、しかもその多くは顕著な症状を示さない。
糖尿病に関与する自己免疫反応の治療を成功させるた
めには、患者の症状が明らかになる前に治療を開始する
ことと、インスリンを産生する能力をなくした患者への
インスリン補充が必要である。自己免疫反応を停止させ
ることにより糖尿病が直り外因性インスリンが不要にな
るのは、患者がまだ充分量の内因性インスリンを与える
ことができる充分な数のベータ細胞を有しているうち
に、病気の進行をとめることができた場合のみである。
従ってIDDMの症状が明らかになる前にそして外因性イン
スリンが必要になる前に危険のある患者が同定できた
ら、いかなる療法ももっと有効となるであろう。IDDMの
新しい患者の約90％は、患者歴のある家族以外から発生
している。従って疾患を止めることが不可能な段階にな
る前に疾患を検出するために、マススクリーニングに適
した測定法が緊急に必要とされている。
幸いなことにIDDMにはBBラットやNODマウスのように
多くの動物モデルがある（例えばロッシーニ（Rossin
i）ら、アニュアル・レビュー・イムノロジー（Ann.Re
v.Immunol.）第３巻、289−320頁（1985年）を参照）。
この動物の多くは自然にIDDMを発症し、ヒトのIDDMの多
くの特徴を示す。
熱ショック蛋白（hsp's）は、高温条件又は他のスト
レスをかけた時に細胞から産生される蛋白群の１員であ
る。熱ショック蛋白には種々の分子量のものがある（例
えば20キロダルトン、65−68キロダルトン、70キロダル
トン、90キロダルトン、110キロダルドンなど）。熱シ
ョック蛋白は自然界に普遍的に存在しており、細菌、酵
母、植物、昆虫、及びヒトを含む高等動物により産生さ
れる。この蛋白は高度に保存されており、これらの多様
な生物のすべてで著しい相同性を示している。長い進化
の時間にわたって極端に保存されているため、熱ショッ
ク蛋白は重要な機能を果たすと考えられる。細胞をスト
レス（例えば熱、ある種の金属、薬剤、又はアミノ酸類
似体）で刺激すると、普通これらの蛋白の合成が増加す
る。しかしこれらの蛋白の特殊な機能は今のところ不明
である。
例えば、全身性エリテマトーデス（SLE）の患者は90
キロダルトンの熱ションク蛋白に対する抗体を有するこ
とが観察されている（ミノタ（Minota）ら、ジャーナル
・オブ・クリニカルインベスティゲーション（J.Clin.I
nvest.）第81巻、106−109頁（1988年）。hsp90に対す
る抗体の機能は不明である。
HSP 65はラットのアジュバント関節炎に関与している
ことが知られている（バンエデン（ven Eden）ら、ネー
チャー（Nature）第331巻、171−173頁（1988年）参
照）。アジュバント関節炎はある株のラットをマイコバ
クテリウムテューバーキュローシス（Mycobacterium tu
beculosis,MT）に対して免疫することにより発症する自
己免疫関節炎である。この疾患のMTのhsp65は９個のア
ミノ酸ペプチド配列（180−188）に対して反応性のＴリ
ンパ球のクローンにより、放射線照射を受けた免疫学的
に無防備の（naive）ラットに移すことができることが
見いだされた。従ってアジュバント関節炎は抗hsp65Tリ
ンパ球により引き起こされる自己免疫疾患のようであ
る。関節に対するこの自己免疫攻撃は、180−185 hsp6
5ペプチドと軟骨プロテオグリカンの結合蛋白の一部と
の部分配列の相同性に起因していた（コーエン（Cohe
n）、サイエンティフィックアメリカン（Scinetific Am
erican）第256巻、52−60頁（1988年）を参照）。また
リウマチ関節炎の患者の滑液のＴリンパ球はMTのhsp65
に対して応答した（レス（Res）ら、ランセット（Lance
t）第II巻、478−479頁（1988年）参照）。
アジュバント関節炎の誘導の前にラットにhsp65を投
与すると、後に関節炎が発症するのを防ぐことができる
ことがわかった。従ってhsp65に対する免疫応答の存在
はラット及びヒトの両方の関節炎に関連しており、hsp6
5の投与により関節炎に対する耐性が与えられた。
ヨーロッパ特許出願第262,710号は、自己免疫関節炎
や類似の自己免疫疾患の緩和、治療、そして診断に有用
なポリペプチドを開示している。
ヒトのP1蛋白の完全な一次構造（ヌクレオチド配列と
推定アミノ酸配列を含む）が、最近エス・ジンダイ（Ji
ndai,S.）ら、「バクテリヤや植物シャペロニン及び65
キロダルトンのマイコバクテリア抗原に類似のヒトミト
コンドリア蛋白の一次構造」（“Primary Structure of
a Human Mitochondrial Protein Homologous to the B
acterial and Plant Chaperonins and to the 65−Kilo
dalton Mycobacterial Antigen"）、モレキュラーアン
ドセリュラーバイオロジー（Molecular and Cellular B
iology）第９巻、５、2279−2283頁（1989年）に最近発
表された。分子量が約63キロダルトンであると開示され
ているこの蛋白は、本明細書でhHSP65蛋白として記載さ
れているヒト熱ショック蛋白である。前記文献の内容の
すべては参考のため本明細書に引用されている。図３に
復元されているこの蛋白の構造は、ジンダイが開示して
いるものと同じである。
ヨーロッパ特許出願第261,648号は、自己免疫疾患の
治療に自己免疫疾患に特異的な活性化Ｔ細胞の使用を開
示している。このＴ細胞は好ましくはまず圧力で処理
し、次に化学的架橋剤及び／又は細胞骨格（cytoskelet
al）破壊剤で処理して免疫原性を改良する。完全に処理
した細胞又はその画分は、Ｔ細胞が特異的な自己免疫疾
患に対するワクチンとして使用することができる。
自己免疫性Ｔ細胞を阻止するための公知の方法では、
特定の自己免疫特異性を有する減弱化した又は無毒性の
Ｔ細胞の試料、又はその断片又は画分で対象を免疫す
る。対象は少なくとも２つのタイプの制御Ｔ細胞を活性
化して応答する（Ｔ細胞活性化マーカーを認識する抗エ
ルゴタイプ（anti−ergo−typic）Ｔ細胞と、病原性内
因性自己免疫Ｔ細胞上に存在する自己抗原リセプターを
認識するらしい抗イディオタイプＴ細胞）。実験動物で
のＴ細胞ワクチン接種は、疾患の予防とともに、確立し
た疾患の永久的緩解を誘導するのに有効である。ハウウ
ェル（Howell）ら、サイエンス（Science）第246巻、66
8−670頁（1989年）、及びバンデンバーク（Vandenbar
k）ら、ネーチャー（Nature）第341巻、541−544頁（19
89年）は、実験的自己免疫性脳脊髄炎に対するラットの
ワクチン接種にＴ細胞リセプターのβ鎖のペプチド配列
の使用を開示しており、従って自己免疫Ｔ細胞リセプタ
ー自身が制御Ｔ細胞の標的エピトープを供給することが
できるという結論を支持している。
自己免疫疾患一般に関してＴ細胞又は断片をこのよう
に使用することは公知であるが、IDDMに特異的に特定の
抗原はこれまで知られていなかった。即ちIDDMに対する
ワクチン接種のための活性化Ｔ細胞は、本発明以前には
得られていなかった。
発明の要約 本発明の目的は、インスリン依存性糖尿病（IDDM）の
早期診断の方法を与えることである。
本発明の別の目的はIDDMの早期診断に使用されるキッ
トを与えることである。
本発明のさらに別の目的は、IDDMを予防する方法を与
えることである。
本発明のさらに別の目的は、発生段階でIDDMを治療す
る方法を与えることである。
本発明のさらに別の目的は、IDDMの予防又は治療のた
めの免疫学的寛容誘導性組成物を与えることである。
本発明のさらに別の目的はIDDMの予防又は治療のため
の新規ポリペプチドを与えることである。
本発明のさらに別の目的は、IDDMの予防又は発生段階
でのIDDMの治療に有効なＴ細胞又は断片を与えることで
ある。
本発明のさらに別の目的は、本発明のIDDM特異抗原を
使用してこれに特異的なＴ細胞を単離した後、このよう
なＴ細胞のリセプター領域のペプチド配列を性状解析
し、IDDMの予防又は治療はこのようなリセプターペプチ
ドを使用することである。
本発明においてIDDMの研究の過程で、動物はhsp65分
子又はこれと交差反応する分子を発現し、これが動物の
血液や尿中に出現することが発見された。またこれらの
動物はこのような分子に特異的な抗体やＴ細胞を発現す
る。即ちhsp65（又はこれと交差反応する分子）、又は
これらに特異的な抗体又はＴ細胞の血液又は尿中での存
在は、β細胞が完全に破壊され患者が一生涯糖尿病が続
くようになる前にIDDMを検出するための測定法に役立
つ。
ある患者におけるIDDMの存在又はその発生段階は、hs
p65（又はこれと交差反応する分子）、又はこれらに特
異的な抗体又はＴ細胞の存在を試験することにより診断
することができる。
本発明はまたこのような測定を実施する方法、及びこ
のような測定を実施するためのキットを与える。発生段
階の糖尿病を検出することにより、自己免疫反応を終結
させるための方法を開始することができる。例えばIDDM
に関与する自己免疫反応に対する耐性を誘導するのに、
hsp65、又はその活性なエピトープ又はこれと交差反応
をする別の分子（抗原）の投与が効果的である。このよ
うな抗原（減弱化されているか無毒性の型、又は処理し
て抗原性を改良した後のもの）、又はその断片又は活性
画分に特異的なＴ細胞の投与は、IDDMに関与する自己免
疫反応に対する耐性を誘導するのに有効であろう。
本発明はさらにIDDMの予防又は治療法に関する。適当
なアジュバント中でhsp65、又はその活性エピトープ又
はこれと免疫学的に交差反応する別の分子（抗原）に対
して免疫することによりIDDMが誘導されることが発見さ
れた。しかし有効なアジュバントは用いないで、好まし
くは寛容誘導性担体とともに、このような抗原をワクチ
ン接種すると、該抗原に対する特異的寛容を作り出すこ
とができる。これによりIDDMに対する自己免疫反応に対
する耐性を作り出すことができる。このような抗原（減
弱化されているか無毒性の型、又は処理して抗原性を改
良した後のもの）、又はその断片又は活性画分に特異的
なＴ細胞によるワクチン接種の場合も同じことが言え
る。もし患者がIDDMの前臨床的な発生段階にあれば、こ
のような抗原又はＴ細胞（又は画分）を注射することに
より、この抗原に対する寛容を作り出すことができ、重
症の永久的な障害が与えられる前に自己免疫過程を阻止
することができる。
図面の簡単な説明 本発明は以下の図面を簡単な説明と好適な態様の詳細
な記載からより良く理解できるであろう。
図１は、IDDMを発症しなかったNODマウスの血清中のh
sp65、抗hsp65、抗インスリン抗体、そして抗イディオ
タイプ抗体の量を示す。
図２は、IDDMを発症したNODマウスでは疾患の進行が
明瞭になる前にhsp65と抗hsp65が顕著に増加しているこ
とを示すグラフである。IDDMに先行する抗インスリン抗
体とイディオタイプ（DM）抗体の増加は軽微であった。
図３は、ヒトP1蛋白（これはhHSP65である）のヌクレ
オチドと、推定されるアミノ酸配列を示す。左側の数字
は、推定される開始コドンの最初の座標１に対するヌク
レオチド配列を示す。アミノ酸配列は同じ点の１から始
まって番号をつけてある。このリーディングフレームの
５′延長部分は１文字コードで示してある。λ22a配列
の開始を示す内部EcoR I部位（nt712）の位置も示して
ある。３′末端のＡテイル（A tail）からのポリアデニ
ル化シグナル15ntには下線が引いてある。Ｎ末端の推定
のミトコンドリア標的配列（targeting sequence）と、
Gly−Gly−Metのリピート配列を含むＣ末端のケラチン
様アミノ酸配列は、四角で囲ってある。
リーダー配列中の陽性に荷電したアミノ酸（＋）と記
載してある。
図４は、年齢の関数としてのヒトhsp65、MT−hsp65及
びMT−hsp70に対するNOD/LtT細胞の自然の反応性の程度
を示すグラフである。
図５は、ペプチドの濃度の関数としての、p277とp278
に対するＴ細胞の増殖応答を示すグラフである。
図６は、p277、MT hsp65そしてプラスミッドコントロ
ールに応答しての、若い前糖尿病性NOD/Ltマウスに急性
糖尿病を移すことができるC7とC9T細胞の増殖を示す棒
グラフである。
図７は、休止している誘導された糖尿病における、ペ
プチドp277とp278に対する免疫の結果を示す。ドットは
試験群の各マウスの免疫３週間後のグルコース濃度を示
す。
好適な態様の詳細な説明 以下の実施例により、本発明の具体的な態様と本発明
に関連する実験を示す。これらは例示のために示すのみ
であり、非限定的に記載されている。
実施例1:MT hsp65分子の産生 マイコバクテリウムテューバーキュローシス（Mycoba
cterium tuberculosis）のhsp分子を標準的方法で大腸
菌（E.coli）にトランスフェクションし、バン・エデン
（van Eden）ら、ネーチャー（Nature）第331巻、171−
173頁（1988年）に記載の方法により精製した。このよ
うに遺伝子操作した大腸菌細胞は大量のMT hsp65分子を
産生するであろう。種々の供給源からのhspは密接な相
同性があるため、遺伝子工学又は細胞からの単離により
産生される場合、哺乳類又はヒト由来のhsp65でも有効
である。
実施例2:MT hsp65に対する抗体の産生 標準的な実験室種のウサギ（ニュージーランドホワイ
ト）の背中に、0.5mlの無機油中に乳化させた0.5mlの生
理食塩水（不完全アジュバント）中の、実施例１に従い
産生させたMT hsp65の100μｇを皮下注射した。１月後
1.0ml生理食塩水中の100μｇのMT hsp65分子でウサギを
追加免疫し、２週間後にウサギから血液をとり血清を採
取した。２月後同様にしてウサギに追加免疫をして、も
う一度血液を取った。この血清抗体を使用して、試験動
物及びヒトの血液及び尿中のhsp65を検出した。
実施例3:hsp65の測定 標準的固相ラジオイムノアッセイを用いてhsp65分子
の存在を検出した。やわらかいPVCマイクロタイタープ
レートを100μの試験血清又は尿で４℃で18時間被覆
し、リン酸緩衝化生理食塩水（PBS）で洗浄した。次に
対照ウサギ血清又は抗hsp65血清（実施例２に従い産生
した）を、PBS＋0.1％ウシ血清アルブミン（BSA）で1:1
00希釈し、各ウェルに50μ添加し、37℃で２−３時間
インキュベートした。次にウェルをPBSで３回洗浄し
た。125I−ヤギ抗ウサギ免疫グロブリンを100,000CPM/
ウェルで添加し、ウェルを37℃で２時間維持した。次に
プレートをPBSで４回洗浄し、乾燥させ、ウェルをガン
マカウンター中で計測した。抗hsp65血清で得られた値
で、標準ウサギ血清で得られた平均値CPM＋2S.D.を越え
るものを、hsp65の存在について陽性とした。
実施例4:抗hsp65抗体の測定 hsp65の抗体を同様にして検出した。ただしプレート
に結合した抗原は血清又は尿ではなく、実施例１に従い
産生した精製MT hsp65の５μm/ウェルである。抗hsp65
抗体について試験すべき血清は1:50に希釈される。尿は
希釈しない。hsp65を含むウェルに血清又は尿を添加
し、マウスの試料については放射標識ヤギ抗マウス免疫
グロブリンを使用し、ヒトの試料についてはヤギ抗ヒト
免疫グロブリンを使用して、hsp65に結合している抗体
の存在を検出した。残りの測定は実施例３に記載したよ
うに実施する。健康なマウス、ラット又はヒトの対照血
清で得られた平均CPM＋2S.D.より大きいCPMを陽性と定
義した。
実施例5:hsp65分子と抗hsp抗体はIDDMの進行を発症前に
検出する NODマウス 14匹の雌のNODマウスから、生後21日目から一定の間
隔で約200日間採血し、IDDMの進行について点数をつけ
た。hsp65、抗hsp65、抗インスリン抗体、そしてDMイデ
ィオタイプに対す抗イディオタイプ抗体について、血清
を試験した。
実施例３の測定法を使用してhsp65を試験した。抗hsp
65の存在は実施例４に記載の方法に従い測定した。抗イ
ンスリン抗体は、インスリンのリセプター結合部位を認
識するイディオタイプ抗体であり、時にDM−イディオタ
イプ抗体と称する。本明細書の譲受人の所有する米国特
許出願第07/295,401号では、患者の血清又は尿中にDM−
イディオタイプ抗体又は抗DM−イディオタイプ抗体が存
在することは発生段階IDDM又は活性なIDDMが陽性である
兆候であることが開示されている。このような抗体は、
健常患者の血清又は尿中には存在しない。抗インスリン
抗体及び抗イディオタイプ抗体の測定に使用した方法
は、上記出願第07/295,401号に記載されているものであ
り、その内容は参考のため本明細書に引用されている。
NODマウスのうち10匹はIDDMを発症し、４匹はIDDMに
ならなかった。図１は、IDDMを発症しなかった１匹のマ
ウスの血清を試験した結果であり、図２は、IDDMを発症
したマウスの１匹の血清を試験した結果を示す。ここか
らIDDMのないマウスに比較して、IDDMを発症したマウス
は85日目から始まって生後185日目に著しく高濃度のhsp
65を示していることがわかる。実際にIDDMが発症してか
らはhsp65濃度は減少した。抗hsp65抗体はhsp65出現の
数週間後に現れた。抗インスリン及び抗イディオタイプ
（DM）抗体はそれよりさらに後に現れた。従ってhsp65
と抗hsp65は臨床的IDDMより先行しており、発症前の疾
患の進行の早期指標として有用であった。
表１は、14匹の各マウスのデータを累積したものであ
る。
発症したマウスにおいて発症の平均年齢は150.5日で
あった。hsp65血清試験の平均はIDDMの72.5日前に陽性
であり、抗hsp65試験の平均はIDDMの44日前に陽性であ
った。抗インスリンと抗イディオタイプ抗体は、平均し
てIDDMのわずか29日と19日前に陽性であった。従って、
hsp65と抗hsp65は最終的にIDDMになるか否かの比較的早
期の指標である。
約100日例のNODマウスのhsp65の存在について尿を試
験した。表２はIDDMを発症したマウスでは、試験したマ
ウスの尿は陽性であったことを示している。
BBラット 表３は、IDDMを発症しなかったBBラットは血清又は尿
にhsp65又は抗hsp65が出現しなかったことを示す。IDDM
が発症（90−100日目）したラットは、IDDMの発症の10
から20日前に試験したとき、陽性であった。測定は実施
例３と４に開示された方法で実施した。
ヒトIDDM患者 IDDMを発症する前の種々の時期に５人の患者から血清
を入手した。これらのヒトは既知のIDDM患者の第１親等
の親類であり、IDDMを発症する危険があると考えられた
ので、IDDMの発症の1/2から２年前に血清を採取した。
これらの人以外に新たにIDDMと診断された４人の患者
の血清又は尿についてhsp65を調べた。対照血清及び尿
は、10人の活動性多発性硬化症患者と、IDDMに関係のな
い種々の病気で一般病院にいる35人の小児から得た。そ
の結果を表４に示す。測定は実施例３と４に記載の方法
に従い実施した。
前IDDM患者の５人のうち４人とIDDM患者のうち４人の
うち２人は、hHSP65と抗hHSP65測定で陽性であることが
上の表からわかる。対照で陽性のものはない。従ってMT
のhsp65に対するウサギの抗hsp65は、IDDMの発症に関連
するヒトの血清又は尿中のhHSP65を検出することができ
る。さらにMTのhsp65はヒト抗体を検出できる。前述し
たように、ヒト又は他の供給源から得られたhsp65と同
様に、ヒト又は他の供給源のhsp65に対して作成された
抗体もまた、これらの測定に使用できる。生物の進化の
過程でhsp65は高い保存性を有しているため、これが可
能なのである。
前IDDM患者と新IDDM患者のすべてが陽性ではなかった
ことは、図２に記載したようにIDDMの実際の発症時又は
その近辺の時期には、hHSP65と高hHSP65の濃度は減少し
がちであるという事実から説明できる。従ってこれらの
陰性の患者は、IDDMの発症の時期に近い時に試験された
ために、陽性が消失しているのかも知れない。
上記より、ヒト患者ではIDDMの発症の少し前にhHSP65
（又はこれと交差反応する分子）又は抗hHSP65は陽性に
なることが明らかである。従ってhHSP65又は抗hHSP65の
測定は、IDDMが進行しているかも知れない人たちをスク
リーニングするのに有効である。
IDDMが進行しているヒトの血清又は尿に現れるhHSP65
はいくつかの起源に由来するであろう。その起源は、健
常なベータ細胞に普通に発現され、このベータ細胞がウ
イルス感染や毒性の攻撃を受けた時免疫学的また破壊の
前兆として放出されるhHSP65かも知れないし、又は免疫
学的破壊のストレスによりベータ細胞から放出されるの
かも知れない。hHSP65はまたベータ細胞に対する長期の
活性のある時期に、免疫系の細胞により発現されるかも
知れない。この系におけるhHSP65の起源は現在明らかで
はないが、いったんhHSP65が放出されると、その人は刺
激されてhHSP65分子に対する抗体を作り出す。
分子量64,000の規定されていない分子に対する抗体
は、バエケスコフ（Baekeskov）ら、ネーチャー（Natur
e）第298巻、167−168頁（1982年）により、数人の新た
に診断されたIDDM患者に記載されている。しかしこの64
キロダルトンの抗原がhspであるか否かは不明である。
さらに34キロダルトン抗原は、IDDMの発症の前に血液又
尿に現れることは知られていない。この規定されていな
い64キロダルトンベータ細胞抗原に対して、hsp65はア
ミノ酸配列が公知の規定された蛋白である（トーレ（Th
ole）ら、インフェクション・アンド・イミュニティー
（Infection and Immunity）第55巻、1466−1475頁（19
87年））。同様に、hHSP65のアミノ酸配列は、図３に示
されている。
実施例6:C57BL/Ksj株の雄のマウスの研究 40mg/kg/日の投与量のベータ細胞毒ストレプトゾトシ
ン（streptozotocin）を５日間連続で接種すると、C57B
L/ksjマウスは約２週間後にIDDMを発症する。
この実験では、10匹の雄のC57BL/ksjマウス（３月
齢）の群に、IDDMを誘発する（約14日目）のために低投
与量のストレプトゾトシン注射（40mg/kg/日×５）をし
たか又はしなかった。そしてIDDMの発症（250mg％より
高い血中グルコース）と血中のhsp65と抗hsp65の出現に
ついて調べた。表５に示すように、10日目（IDDMの臨床
症状の現れる前）までにhsp65が出現し、次に抗hsp65が
出現した。
実施例7:マイコバクテリウムのhsp65に交差反応性のあ
る多種の齧歯類の分子 マイコバクテリウムのhsp65に認識される哺乳類の分
子を同定するために、上記のウサギの抗hsp65抗血清
と、TB78と命名されたモノクローナル抗体を使用した。
この抗体は、エム・アール・シー結核ユニット（MRC Tu
berculosis Unit）、ハマースミス病院（Hammersmith H
ospital）、ロンドン、のジェイ・イバニイ（J.Ivany
i）博士に開発され、供給されたものである。この抗体
はマイコバクテリウムテューバーキュローシス（M.tube
culosis）のhsp65分子に対して特異的である。これらの
抗体の結合に対して３種類の調製物を測定した：クロー
ン化したマイコバクテリウムテューバーキュローシス
（M.tubeculosis）のhsp65;IDDMを発症しているNODマウ
スと健常な対照の血清；そして熱ショックで処理したラ
ットの繊維芽細胞溶解物と対照の繊維芽細胞溶解物。
hHSP65は実施例１に記載の方法で調製した。ラットの
胎児繊維芽細胞を標準的方法を使用して培養した。熱シ
ョック蛋白を誘導するために、繊維芽細胞の培養物を4
2.5℃で２時間インキュベートし、次に37℃で1/2時間イ
ンキュベートした。熱ショック繊維芽細胞と対照繊維芽
細胞を37℃で培養し、プロテアーゼインヒビターととも
に0.1％SDSと１％トリトンよりなる溶解緩衝液を用い
て、約５×106個の細胞を溶解した。ブラッドフォーム
（Brad ford）定量法により蛋白濃度を2mg/mlに調製し
た。この物質を標準的電気泳動法で還元条件（２％の２
−メルカプトエタノール）下で１レーンにつき100μｇ
で10％ポリアクリルアミドゲルに流した。健常な対照マ
ウスとIDDMを発症しているNODマウスからの血清を2mg/m
lに希釈した。これらの血清の調製物を上記したように
ポリアクリルアミドゲル電気泳動で分離した。次に標準
的方法により、分離した蛋白をニトロセルロースペーパ
ー上に移した。次にペーパーを１％ヘモグロビン（ブロ
ッキング用）とともに室温で１時間インキュベートした
後、1:100希釈の正常ウサギ血清又は抗hsp65で、又は1:
100希釈のTB78又は対照モノクローナル抗体で室温で２
時間インキュベートした。125I放射標識ヤギ抗ウサギ免
疫グロブリン又はヤギ抗マウス免疫グロブリンでインキ
ュベートして洗浄し、オートラジオグラフィーで現像し
て、分離したバンドへの抗体の結合を検出した。分子量
標準物質も含めた。
抗hsp65によりいくつかのバンドが検出されることが
見いだされた。マイコバクテリウムhsp65はウサギ抗血
清とモノクローナル抗体TB68の両方により検出された。
これらの抗体はまた、熱ショック後に発現が増強された
齧歯類の繊維芽細胞中の65キロダルトンのバンドを認識
した。加熱した繊維芽細胞溶解物では、30キロダルトン
と47キロダルトンに陽性のバンドがあった。IDDMを発症
しているNODマウスの血清中に約25キロダルトンに追加
のバンドが検出された。従って哺乳類の65キロダルト
ン、47キロダルトン、30キロダルトン、25キロダルトン
の分子はマイコバクテリウムのhsp65と交差反応性があ
る。
実施例8:hHSP65は膵臓のランゲルハンス島で発現される IDDMの進行には血液や尿中のhsp65の発現の上昇が伴
うめ、ランゲルハンス島のベータ細胞がhsp65の供給源
かも知れないと考えられた。この理論を試験するため
に、抗hsp65がランゲルハンス島細胞に結合するか否か
を調べるために試験した。
標準的方法を使用してラットの膵臓の凍結切片（厚さ
６−８μ）を作成した。切片に1:50希釈した正常ウサギ
血清又は抗hsp65抗血清（非特異的抗体を除去するため
に肝臓粉末で吸収されている）を重層し、室温で30分間
インキュベートし、PBSで完全に洗浄し、次に５％正常
ヤギ血清で５分間インキュベートした後、フルオレセイ
ン標識ヤギ抗ウサギ免疫グロブリンで室温で30分間イン
キュベートし、PBSで洗浄し、螢光顕微鏡で調べた。ラ
ンゲルハンス島は抗hsp65抗血清で明るく染色されてい
たが、対照ウサギ血清は染色されなかった。従ってラン
ゲルハンス島はhsp65を発現する。
実施例9:hspに対する免疫はIDDMを誘発する ランゲルハンス島はhsp65を発現することがわかった
ため、抗hsp免疫応答はベータ細胞に障害を与え従っでI
DDMを誘発するかも知れないと仮定された。雄のC57BL/k
sjマウス（８週齢）又は雌のNODマウス（4.5週齢）の腹
腔内に、50μｇのhsp65を注射し、IDDMを発症するか否
かを試験した（250mg％より多い血中グルコースで証明
される）。4.5週齢でNODマウスは自然発生IDDMより少な
くとも３カ月早かった。C57BL/ksjマウスは自然発生IDD
Mはなかった。hsp65を油又はPBSで乳化して投与した。
油に乳化したウシ血清アルブミン（BSA）を対照として
使用した。その結果を表６に示す。油中のhsp65はIDDM
を誘発するがPBS中のhsp65はIDDMを誘発しないことがわ
かった。従っておそらくベータ細胞はhsp65と交差反応
する抗原を発現するため、hsp65に対する免疫応答はIDD
M発症の引金となる。
追加の実験で正常な株のマウス（これはNDOマウスの
ようにIDDMを自然発症せず、C57BL/ksjのように低投与
量ストレプトゾトシン投与後でもIDDMを発症しない）
に、50μｇの抗原、不完全フロイントアジュバント
（油）で乳化したhsp65又はウシ血清アルブミン（BSA）
を腹腔内投与した。19日後の朝にマウスから採血し、血
中グルコースを測定した。200mg％を越えるグルコース
濃度によりIDDMを診断した。その結果を表７に示す。hs
p65による免疫は、特に適当な投与量で投与した場合、
一見正常な系統のマウスでもIDDMを誘発することができ
る。これは、hsp65又はhsp65と免疫学的に交差反応する
分子はIDDMの標的抗原であるという結論を支持してい
る。
実施例10:HSP65はIDDMの誘発に対する耐性を誘導できる 有効なアジュバントなしで、又は免疫学的寛容誘導性
担体を用いて抗原を投与すると、免疫学的非応答性（即
ち抗原に対する特異的寛容）を誘導することができるこ
とは充分確立されている。従ってPBS中のhsp65を注射し
たマウスが、油中のhsp65により誘導されたIDDMに対す
る耐性を獲得したか否かを調べるため試験した。PBS中
のhsp65を受けた後１月後に、C57BL/ksjマウスに油中hs
p65を投与したが、どのマウスも３週間後にIDDMは発症
しなかった（血中グルコース濃度が250mg％を越えるこ
とにより判定した）。これに対してPBS中のhsp65を受け
た10匹の対照マウスのうち８匹が、油中hsp65を受けた
後にIDDMを発症した。
別の実験で30週齢の雌のNODマウスにPBS中のhsp65を
腹腔内投与した後、IDDMを誘発するために15日後に50μ
ｇの油中hsp65を投与した。IDDMの存在は投与後35日目
の血中グルコースが200mg％を越えることにより測定し
た。マウスが５月齢になったときもう一度IDDMの存在を
測定した。この年齢ではすべての未処理の雌のNODマウ
スのうち50％でIDDMが検出されることがわかっている。
結果を表８に示す。
即ちhsp65は糖尿病性免疫反応に対する寛容を誘導す
るために使用できることがわかる。この寛容はhsp65の
免疫学的な攻撃に対して有効なだけでなく、NODマウス
での自然発生IDDMの自然の進行に対する治療法としても
有効である。
実施例11:hHSP65を用いる発生段階のIDDMの治療 図10に示すようにhsp65はIDDMの自己免疫反応に対す
る耐性を誘導するのに使用される。これは、外因性hsp6
5に対する接触を通してベータ細胞のhHsp65に対する免
疫学的寛容の機構により引き起こされるようである。即
ちhsp65はIDDMが臨床的に明らかになる前に治療に使用
することができ、重症の永久的障害が与えられる前に自
己免疫反応を阻止することができる。この実験の結果は
表８にまとめられており、NODマウスにおける自然発生I
DDMの自然の進行は有意に阻止することができ、hsp65
（特にhHSP65）は治療的に使用することができ。NODマ
ウスでは自己免疫反応は非常に早く始まる。１月齢です
でにインスリン炎が検出される。この系統の雌のマウス
では50％は５月目にIDDMが臨床的に明瞭になる。30日齢
のマウスにhsp65を投与すると、この自然の進行を阻止
する。これはランゲルハンス島に対する自己免疫が始ま
った後でも治療が有効であることを示している。
実施例12:hHSP65に対するＴ細胞の応答は糖尿病の進行
に関連している 図３に示されているヒトhsp65は通常の方法で発現の
ためにクローン化し、そこから実質的に純粋な組換えヒ
トhsp65が得られた。
本実験は、自然発生的にベータ細胞を破壊しているマ
ウスはヒトhsp65に対して反応性のＴ細胞を明示してい
ることを確証している。種々の年齢の雌のNOD/Ltマウス
の５から７匹の群から得られた脾臓細胞懸濁液につい
て、基本的にサイクグロブリンに対するＴ細胞応答につ
いて記載された方法（アール・マロン（Maron,R）ら、
ジャーナルオブイミュノロジー（J.Immunology）第131
巻、2316−2322頁1983年））に従い、Ｔ細胞の増殖につ
いて測定した。簡単に説明すると、１×106細胞/mlの細
胞を、５μg/mlの以下の抗原の存在下又は欠如下で、マ
イクロタイターウェル中の0.2mlの培養液の中で３重測
定で72時間インキュベートした：ヒトhsp65、MThsp65、
又はMThsp70。最後の12時間のインキュベートの間のDNA
への［3H］チミジンの取り込みにより増殖を測定した。
結果はΔCPMとして示す：試験抗原を含むウェルの平均C
PM−抗原を加えないで培養した対照ウェルの平均CPM±
標準誤差（SE）。対照CPMは9,000から10,500まで変化し
た。マウスの約50％でIDDMの発症は４から５月齢の間で
あり、図４で「IDDM」として示してある。
NOD/LtT細胞の自発的反応性（spontaneous reactivit
y）の程度の種々の抗原に対して年齢の関数として示し
ているこの実験の結果は、図４でグラフで示してある。
NOD/Ltマウスがインスリン炎をほとんど示さないか又は
全く示さない１月齢の時期は、どの抗原に対してもＴ細
胞の反応性は検出されなかった。しかし２から３月齢の
時期はインスリン炎の上昇とともに、ヒトhsp65に対し
ては強く上昇傾向の反応性が認められたが、MThsp65に
対する反応性は比較的小さくMThsp70に対する反応性は
全くなかった。ヒトhsp65とMThsp65に対する反応性は4.
5月にIDDMの発症とともに低下し、IDDMの臨床症状の出
現した後の６月目でもさらに低下した。従ってヒトhsp6
5に対するＴ細胞の応答は、明瞭なIDDMに先行するベー
タ細胞の障害の増加に関連しているようであった。IDDM
の発症に伴うＴ細胞の反応性の低下は、ベータ細胞とそ
れらの抗原が失われることによる免疫刺激の低下により
説明することができる。
実施例13:ヒトhsp65に応答するＴ細胞は糖尿病を引き起
こす NOD/Lt、C57BL/6、又はC57BL/KS株の3.5月齢の雌の５
匹のマウス群から、脾臓細胞の懸濁液を得た。１群のNO
D/Ltマウス（第２群）はあらかじめ油中の50μg/mlのMT
hsp65の腹腔内投与によりプライム（prime）しておい
た。いくつかの脾臓細胞（第４、６、８群）は、1.25μ
g/mlのconAで48時間インキュベートして活性化した。Co
nA後の細胞をConAを含まない増殖培地に移し、さらに５
日間培養した。実施例12に記載したように、組換えヒト
hsp65、組換えMThsp65又は対照大腸菌抗原に対する、活
性化一週間後の脾臓細胞の増殖性応答について試験し
た。対照大腸菌は、hsp65遺伝子を含まないpEX2プラス
ミッドでトランスフェクションした。抗原は５μｇの濃
度で使用した。増殖性応答は３重測定で行い、刺激指数
（SI）として示してある：試験抗原でインキュベートし
た脾臓細胞に取り込まれた3H−チミジンの、抗原無添加
の対照培養物に取り込まれた3H−チミジンに対する比
率。対照培養物の平均CPMは5,000−7,000であり、平均C
PMからの標準偏差はいつも平均の10％より小さかった。
細胞のいくつかをConAで48時間培養して活性化すること
により、糖尿病を引き起こす細胞の能力について試験し
た。前糖尿病性（prediabetic）の、１月齢の雌のマウ
スの群の腹腔内に、25×106個の何も添加していない脾
臓細胞、又はMThsp65で刺激しておいた、又は刺激して
いないマウスのConAで活性化した脾臓細胞を投与した。
21日後に高血糖症（血中グルコース＞200mg/dl）と組織
学的インスリン炎として現れた急性糖尿病の出現につい
て、マウスに点数をつけた。大体午前９時頃に各マウス
の尾静脈から血液を取り、ジスカングルコースメーター
（Discan Glucose Meter）と試験紙（ベーリンガーベル
ケ（Behringwerke）、西ドイツ）を使用して血中グルコ
ース濃度を測定した。インスリン炎は組織的証拠により
判定した（ワイズマンインスティテュート（Weizmann I
nstitute）の組織学実験室でヘマトキシリン染色とライ
トグリーン染色を行った）。試験スライドがどのマウス
に由来するかは明らかにしていない人間によりインスリ
ン炎のグレード分類を行った。
その結果を表９に示す。ヒトhsp65に対するNOD/Ltマ
ウス脾臓細胞の応答と、MThsp65に対するNOD/Ltマウス
脾臓細胞の応答の間の差（１−４群）は、対照大腸菌抗
原に対するNOD/Lt脾臓細胞の応答、又はhsp65に対する
他の株の応答（５−７群）よりも有意に大きかった（Ｐ
＜0.01）（スチュデントのＴ検定を使用:ND、測定され
なかった）。
表９に示された結果は、ヒトhsp65に対する3.5月齢の
NOD/LtマウスのＴ細胞応答は、マウスをNThsp65に対し
て免疫することにより（２群）、又はＴ細胞マイトジェ
ンであるコンカナバリンＡ（ConA;4群）でＴ細胞集団を
活性化することにより増強させることができることを示
している。ConAは、in vivoで動物内に存在する活性化
された自己免疫性Ｔ細胞を優先的に刺激することが証明
されている。従ってin vivoでMThsp65に対する免疫をし
たか、又はin vitroでConAで活性化したNOD/LtT細胞
は、ヒトhsp65に対する本質的な応答を示す。
ヒトhsp65はそれ自身マイトジェンではない;IDDMを自
然発症しない株（C57BL/6（５群と６群）又はC57BL/KS
（７群と８群））の成体マウスはConA刺激によるＴ細胞
反応性を示さない。
最後に表９は、in vitroでのConAによる抗ヒトhsp65T
細胞集団の活性化は、１月齢の前糖尿病性のNOD/Ltマウ
ス（２群と４群）に急性糖尿病を移すことができること
を示している。
ヒトhHsp65と糖尿病に対するＴ細胞応答性の関連性は
表10に示されている。表10のデータを出した実験では、
マロン（Maron）の記載する方法（前述）に従い、MThsp
65（５μg/ml）で脾臓細胞を繰り返し刺激することによ
り、Ｔ細胞株が得られた。クローンは株細胞の限界希釈
法により単離した。基本的に表９に関して説明した方法
に従い、Ｔ細胞クローンの、急性糖尿病を移すことがで
きる能力について試験した。ただし５×106個のconA活
性化細胞を腹腔内に移した。表９について説明したよ
う、抗原に対するクローンの増殖性応答はSIとして測定
した。対照培養物のCPMは4,500−6,500CPMであり、平均
CPMからの標準偏差はいつも10％未満であった。
これらのクローンはMThsp65又は大腸菌対照に対する
よりもヒトhsp65に対してより激しく応答することがわ
かった。さらに、クローン27、C7、そしてC9はヒトhsp6
5に対して強く応答し糖尿病誘発性であったが、ヒトhsp
65に対して比較的弱く応答したクローン21は糖尿病を移
すことができなかった。クローン化Ｔ細胞はただ１つの
特異性を有する抗原リセプターを発現するため、ヒトhs
p65上のエピトープ（MThsp65上のエピトープにある程度
交差反応性のエピトープ）を認識するＴ細胞により、急
性糖尿病は前糖尿病性NOD/Ltマウスに移されると結論さ
れる。
実施例14:毒性（virulent）Ｔ細胞は自然発生IDDMに対
してワクチン予防をする ５−７匹の２月齢の雌のNOD/Ltマウスの群を、50μｇ
の油中抗原の腹腔内投与によりプライムしたか、あるい
はしなかった。マウスの脾臓細胞を、実施例13の表９に
関して説明したように抗原（５μg/ml）又はConA（1.25
μg/ml）でインキュベートしたか、あるいはしなかっ
た。次に１月齢の前糖尿病性マウスの群の腹腔内に細胞
を移した（25×106個）。実施例13に記載した方法で３
週間後に急性糖尿病（高血糖症；血中グルコース＞200m
g/dl）についてマウスを調べた。８月齢に高血糖症とイ
ンスリン炎により自然発生IDDMについて検査した。この
実験の結果を表11に示す。対照（１群）との差は有意で
あった。（＊Ｐ＜0.01）。数字は２−３回の実験の累積
の結果である。
予想されたように未処理の対照マウス（１群）は７週
齢で高血糖症ではなく、８月齢では81％について自然発
生IDDMが見られた。これに対して、脾臓細胞をin vitro
でMThs65（２頁）又はConA（３群）で活性化してあった
場合は前糖尿病性マウスの脾臓細胞を用いて急性糖尿病
（血中グルコースが200mg/dlを越える）を移すことがで
きた。
in vivoでMThsp65、BSA、MThsp70でプライムしてあっ
たマウスから得られた脾臓細胞を、in vitroで各抗原で
活性化の後投与した。抗MThsp65細胞（６群）により急
性糖尿病は誘発されたが、抗BSA又は抗MThsp70細胞では
活性化されなかった（４群と５群）。ヒトhsp65に対し
て強く応答したConA及びMThsp65活性化細胞に対して
（表８と表９）、BSA又はMThsp70反応性細胞の増殖定量
では、MThsp65又はヒトhsp65に対する反応性は検出され
なかった（図には示していない）。従って急性糖尿病の
転移は、ヒトhsp65に応答するＴ細胞を含有する細胞集
団に特異的であった。
表11は、急性糖尿病に引き続いて、８月目に発生する
自然発生IDDMの発生率は有意に低下することを示してい
る。マウスを抗BSA又は抗MThsp65脾臓細胞でインキュベ
ートしても、急性糖尿病も自然発生IDDMも誘導されなか
った（４群と５群）。
急性の採用的に転移された（adoptively transferre
d）糖尿病が自然発生IDDMを防ぐ能力も、上記（表９）
の抗hsp65T細胞で行った実験で見られた。31匹のマウス
に毒性のクローン27、C7、C9を注射すると、すべてが１
−２週間で急性糖尿病になった。２週間以内にこれらは
すべて高血糖症から自然に回復し、自然発生IDDMを発症
した31匹のうち２匹のみが８月齢で自然発生IDDMを発症
した。これに対して、無毒性クローン21を注射された13
匹のマウスは急性糖尿病を発症せず、これらのマウスの
うち６匹は６月目までに自然発生糖尿病になった（Ｐ＜
0.01）。
従って抗ヒトhsp65T細胞の採用的転移（adoptive tra
nsfer）による糖尿病は一過性である。しかしこれらの
マウスは急性糖尿病から回復しただけではなく、後の自
然発生IDDMの進行に対して耐性を獲得した。従って前糖
尿病性マウスを無毒性Ｔ細胞に接触させるとIDDMの発症
を加速したり、症状を悪化させたりすることはなく、む
しろ糖尿病反応に対して耐性を獲得させることになる。
実施例15:減弱化Ｔ細胞はhsp65の自己免疫をワクチン予
防しIDDMを阻止する 実施例13の表８に関して記載した方法により、Ｔ細胞
をConA又はMThsp65でインキュベートした後、ライダー
（Leider）ら、プロシーディングズオブナショナルアカ
デミーオブサイエンシーズオブユーエスエー（Proc.Nat
l.Acad.Sci.U.S.A.）第84巻、4577頁（1987年）に記載
の方法に従い、活性化細胞をγ線照射（1500R）又はグ
ルタルアルデヒド（0.3％、15分）で減弱化することに
より、３月齢の前糖尿病性NOD/Ltマウスの脾臓細胞から
Ｔ細胞ワクチンを作成した。５週齢の雌の前糖尿病性NO
D/Ltマウスの15又は25匹の群の腹腔内に107個の処理し
た脾臓細胞をワクチン接種したか、又はしなかった。６
月齢の時、各群の５匹のマウスについて、ヒトhsp65に
対する脾臓のＴ細胞の増殖応答を試験した（刺激指数
（SI）で表示してある）。抗原を添加しない場合の対照
CPMはワクチン接種をしなかったものは2,465±235であ
り、ワクチン接種したものは2,246±185であった。残り
のマウスから採血し、標準的固相ラジオイムノアッセイ
（シェクター（Schecter）ら、ジャーナルオブバイオロ
ジカルケミストリー（J.Biol.Chem.）第259巻、6411−6
419頁（1984年））により、ヒトhsp65に対する抗体を測
定した。血清抗体を検出するためにマイクロタイタープ
レートを、hsp65（抗hsp65用）、インスリン（抗インス
リン用）又はDMイディオタイプ陽性モルモット抗インス
リン（イディオタイプ抗体用）でインキュベート（50μ
g/ml）することにより被覆した。被覆ウェルを試験マウ
ス血清（1:50希釈）でインキュベートし、125I標識ヤギ
抗マウス免疫グロブリン（アマーシャム社（Amersha
m）、英国;105CPM/ウェル）を反応させて、これらの抗
原に対する抗体の存在を検出した。hsp65抗原（又はこ
れと交差反応する抗原）を検出するためにウェルを1:5
希釈した試験血清1.5μでインキュベートし、ウサギ
抗hsp65免疫グロブリン（1:100希釈）で重層した。125I
標識ヤギ抗ウサギ免疫グロブリン（アマーシャム社（Am
ersham）を使用して結合を測定した。相対的抗体価は、
1:100希釈血清のヒトhsp65に対する結合のCPMを意味す
る。糖尿病ではない１月齢のNOD/Ltマウスから得られた
血清抗ヒトhsp65の平均CPMは1,450±194であった。前記
の固相ラジオイムノアッセイによりhsp65又は交差反応
性抗原の存在についてマウスの血清を試験した。その結
果を表12に示す。ワクチン接種したマウスはワクチン接
種しなかったマウスとは有意に差があった。（＊ｐ＜0.
01）。
表12の結果は、本来は毒性のConA又はMThsp65活性Ｔ
細胞は、γ線照射（1,500R）又はグルタルアルデヒド
（0.3％）処理で減弱化することができ、自然発生IDDM
に対してワクチン予防することができることを証明して
いる。他の実験的疾患で証明されたように、照射処理又
はグルタルアルデヒド処理自己免疫Ｔ細胞は毒性がな
く、急性糖尿病を引き起こさなかった（データは示して
いない）。IDDMの予防は、ヒトhsp65にに対するワクチ
ン接種マウスの自然発生性のＴ細胞と後退の反応性の著
しい低下に関連していた。
前の例で説明したように、NOD/Ltマウスのランゲルハ
ンス島に対する障害は、血清中に抗hsp65抗体に認識さ
れる蛋白が出現することで示される。この血清抗体はお
そらく障害されたベータ細胞に由来するため、その量に
対するＴ細胞ワクチン接種の影響をみるのは興味深いこ
とである。Ｔ細胞ワクチンの投与は、６月齢で血清中に
現れるhsp65又は交差反応性抗原の量を著しく低下させ
ることがわかる（表12）。この低下は組織学的観察でイ
ンスリン炎が検出されないことと関連していた（データ
は示されていない）。
従って、MThsp65又はConAで活性化された抗ヒトhsp65
T細胞は、減弱化され自然発生IDDMの進行に対してNOD/L
tマウスをワクチン予防するのに使用できる。ワクチン
化状態はIDDM過程の免疫学的兆候が減少したことで特徴
づけられた：抗ヒトhsp65T細胞と抗体。同時にhsp65又
はhHSP65に交差反応性の血清抗原が減少していた（イン
スリン炎の停止により説明できる）。
実施例16:T細胞ワクチン接種は急性の誘発性糖尿病に対
する耐性を作り出す 実施例９において、インスリン炎と高血糖症に特徴づ
けられる急性糖尿病は、油中MThsp65で前糖尿病性NOD/L
tマウスを免疫することにより誘発することができるこ
とが証明された。またこの型の糖尿病は一過性であり、
実際には後の自然発生IDDMにつながることも示された。
本実験は急性誘発性糖尿病に対する、ヒトhsp65に対す
る免疫の効果とＴ細胞ワクチン接種の影響を試験する。
実施例15の表12に関して記載したように107個のConA
活性化、グルタルアルデヒド処理した脾臓細胞で、４週
齢の雌のNOD/Ltマウスの群をワクチン接種したか、又は
しなかった。２週間後に急性糖尿病を誘発するため、マ
ウスにMThsp65又はヒトhsp65（油中50μｇ）で刺激（ch
allenge）した。次に８月齢で自然発生IDDMの進行を見
るために、実施例13に記載したように高血糖症とインス
リン炎を測定して、マウスを調べた。その結果を表13に
示す。有意差は＊ｐ＜0.01であった。
ワクチン接種しなかったマウスはヒトhsp65又はMThsp
65に対して応答し、急性、一過性糖尿病を発症したこと
がわかる。この後に自然発生IDDMに対する耐性が起き
た。これに対してＴ細胞処理マウスは、抗原誘発急性糖
尿病に対して耐性であった。これらも自然発生IDDMに対
しては防御性であった。即ちＴ細胞ワクチン接種は、人
工免疫により誘発された急性糖尿病と後の自然発生IDDM
に対して、有効に耐性を作り出している。
実施例17:ペプチド合成 ヒトhsp65分子上の最も重要なエピトープは、MThsp65
配列と完全ではないが部分的相同性を有するアミノ酸配
列であると推定された。完全な相同性を有するものはそ
れほど作用が強くないため、対応するエピトープはおそ
らく少し異なるのであろう。
ヒトhsp65配列のカルボキシル基末端で始まる一連の
ペプチドを合成し、マイコバクテリウムとヒト配列でわ
ずかに違いがある配列を選んだ。このようなペプチドの
ひとつは、図３に示すヒトhsp65分子のアミノ酸配列437
−460を有している。即ちＨ−Val−Leu−Gly−Gly−Gly
−Cys−Ala−Leu−Leu−Arg−Cys−Ile−Pro−Ala−Leu
−Asp−Ser−Leu−Thr−Pro−Ala−Asn−Glu−Asp−O
H。このペプチドはp277と命名した。
対照ペプチドp278は、３個のアミノ酸分だけp277と重
複し、次の配列を有する:H−Asn−Glu−Asp−Gln−Lys
−Ile−Gly−Ile−Glu−Ile−Ile−Lys−Arg−Thr−Leu
−Lys−Ile−OH。これは図３のアミノ酸配列458−474に
相当する。
実施例18:進行中のIDDMの診断におけるp277に対する免
疫応答 実施例12に記載した方法に従いp277に対する増殖性応
答について、前糖尿病性の３月齢の雌のNOD/Ltマウスか
らの脾臓細胞の懸濁液を試験し、その結果を表５に示し
た。これらのマウスはさらに１−３月の間明瞭なIDDMを
発現しないが、それらの脾臓Ｔ細胞はp277に対して強い
応答を示すが、p278に対しては応答しない。本実験及び
他のin vitro実験で、ペプチドの最適濃度は４μg/mlで
ある。
実施例19:病原性Ｔ細胞クローンはp277とhsp65変種に対
して応答する 急性糖尿病を若い前糖尿病性NOD/Ltマウスに移すこと
ができるC7とC9T細胞クローン（前記の表10参照）は、p
277に対して応答する。このクローンはp277と全マイコ
バクテリウムhsp65に対して応答するが、hsp65遺伝子を
含まないプラスミッドの対照調製物には応答しないこと
がわかる。従って病原性Ｔ細胞がp277を認識するため、
p277ペプチドは病原性エピトープを有すると結論するこ
とができる。
C7とC9もマイコバクテリウムhsp65分子に対して応答
するため、p277エピトープはマイコバクテリウムhsp65
分子上にも存在するようである。従ってp277配列に相同
性のマイコバクテリウムhsp65配列は免疫学的に機能性
である。マイコバクテリウムの配列は以下のようであ
り、p277のヒトの配列から下線の部分が置換を受けてい
る:H−Val−Ala−Gly−Gly−Gly−Val−Thr−Leu−Leu
−Gln−Ala−Ala−Pro−Thr−Leu−Asp−Glu−Leu−Lys
−−−−Leu−Glu−Gly−Asp−OH。24個のアミノ酸のう
ち13個が置換されていることがわかる。従ってp277の免
疫学的な性質は、その配列の約60％の変化を許容できる
と結論することができる。最小エピトープは24個でなく
10個のアミノ酸であったとしても、マイコバクテリウム
の配列から少なくとも４から６個のアミノ酸だけ異なら
ないp277の10個のアミノ酸の配列はない。
実施例20:ペプチドp277は糖尿病に対する処理として使
用できる。
非免疫原性型の全hsp65分子は、アジュバント中の免
疫原性hsp65に対する免疫により誘発されたNOD/Ltマウ
スの急性糖尿病に対して、耐性を誘発することができる
ことが実施例10で証明された。図７は、ペプチドp277は
誘発糖尿病に対する耐性を得るのに使用することができ
る（しかしp278は異なる）ことを示している。７匹の５
週齢の雌の前糖尿病性NOD/Ltマウスの群を、不完全フロ
イントアジュバント中の50μｇのp277又はp278で処理し
た。２週間後、急性糖尿病を誘発するためにマウスを不
完全フロイントアジュバント中の50μｇの免疫原性hsp6
5で免疫した。３週間後、血中グルコースを測定した。p
277で処理したマウスはいずれも高血糖症（血中グルコ
ースが200mg/dl以上）にはならなかったことがわかる。
これに対してペプチドp278で処理した７匹のマウスのう
ち５匹は糖尿病になった。
p277による処理はまた、これらの７匹のマウスのすべ
てで自然発生糖尿病の発症を防止したが、種々の抗原
（例えばウシ血清アルブミン又はhsp70）で処理された
対照マウスの80％は７月齢までに糖尿病を発症した。即
ち、p277による処理は、誘発性糖尿病及び自然発生糖尿
病の両方に対して耐性を与えた。従って特異抗原は、非
免疫原性型で投与された全hsp65分子で見られる治療効
果を生み出すことができる。
p277の上記のデータはNODマウスの糖尿病に関するも
のであるが、全hsp65分子又はこれと免疫学的に交差反
応性の他の分子と同様にこのペプチドは、ヒトにおける
診断と治療に使用できることは明白である。これはNOD
マウスの糖尿病はヒトIDDMの忠実なモデルとして認識さ
れているからである。さらにNODマウスは、ヒトIDDMに
関連したDQβの主要組織適合性抗原複合体（MHC）のク
ラスII分子に類似の分子（IA）を有することが、トッド
（Todd）ら、ネーチャー（Nature）第329巻、599頁（19
87年）により発表されている。従ってヒトとNOD糖尿病
誘発性Ｔ細胞は両方とも、DQβ鎖の57位のアスパラギン
酸の欠如したMHCクラスII分子により提示される同じペ
プチド配列を認識するはずである。もし糖尿病を発症し
ているヒトとNODマウスが同じ抗原（例えばp277）を見
ているなら、このようなペプチドはヒト及びNODマウス
のIDDMの診断と治療に使用することができる。
本発明による発生段階のIDDMの診断マーカーとして役
立つIDDMの進行中にヒトの体で産生される特定の蛋白
は、約65キロダルトンの熱ショック蛋白（又はこれと交
差反応性の抗原）である。65キロダルトンのヒト熱ショ
ック蛋白のヌクレオチドと推定されるアミノ酸配列を図
３に示す。以下この蛋白をhHSP65と呼ぶ。65キロダルト
ン蛋白に結合する同じ抗体と交差反応する他の蛋白もin
vivoで産生される。例えばマイコバクテリウムテュー
バーキュローシス（M.tubeculosis）のhsp65分子に対し
て特異的なモノクローナル抗体と交差反応する47キロダ
ルトン、30キロダルトンそして25キロダルトン分子が、
マウスとラット中に見いだされた。このような抗体と交
差反応する47キロダルトン分子もラット繊維芽細胞中に
見いだされている。種間の熱ショック蛋白の保存性を考
慮すると、これらはヒトにも存在するであろうことは充
分予想される。さらにIDDMの進行中に血液又は尿中に放
出される蛋白は、hHSP65ではなくhHSP65と交差反応性の
分子であるかも知れない。それはベータ細胞上の表面蛋
白、又はhHSP65上に存在するエピトープを保持している
蛋白の断片かも知れない。
従って本発明に従ってその血液又は尿中に存在を測定
される、IDDMの存在又はその発生段階の診断マーカーと
して役立つ分子は、hHSP65に対するポリクローナル抗
体、そして好ましくはhHSP65のp277配列に対するモノク
ローナル抗体又はポリクローナル抗体と免疫学的に反応
するものである。本明細書と請求の範囲の目的におい
て、「hHSP65」という用語は65キロダルトンのヒト熱シ
ョック蛋白のみでなく、任意の種の64キロダルトンの熱
ショック蛋白に対するヒト血清中に見いだされる他の関
連分子も含むものと意図される。この定義は具体的に
は、すでに見いだされ本明細書中で議論されている65キ
ロダルトン、25キロダルトン及び47キロダルトン蛋白を
含むが、これらに限定されるものではない。
自然界の熱ショック蛋白の構造の類似性のため、本明
細書に開示した診断マーカーの存在は、具体的に任意の
生物の熱ショック蛋白に対するポリクローナル抗体又は
モノクローナル抗体によって検出することができる。例
えばマイコバクテリウムテューバーキュローシス（M.tu
beculosis、MT）の熱ショック蛋白は、遺伝子工学的方
法により容易に大量に産生することができる。この蛋白
はウサギやマウスにおいて抗体の産生に使用することが
できる。本発明に従ってウサギ抗MThsp65ポリクローナ
ル抗体は、hHSP65の存在を測定するために使用すること
ができる。同様に、MThsp65に対して免疫したマウスの
脾臓から得られたMThsp65と反応するモノクローナル抗
体が選択される。このような抗体はまたhHSP65と交差反
応するであろう。p277は病原的に活性のエピトープを含
むことが証明されているため、好適なモノクローナル抗
体はp277蛋白に対して作成されたものである。
本明細書の実施例で使用される特定のモノクローナル
抗体は例示のためのみである。ある抗原と特異的に反応
する性質に関して特異的に産生されたこのような任意の
モノクローナル抗体が、本発明の目的のために他のどれ
よりも優れていると考えられる理由はない。
前記したように、hHSP65蛋白（又はこれと交差反応性
の分子）は診断マーカーとして使用できるのみでなく、
hHSP65に対する抗体も使用することができる。ヒトの患
者においてhHSP65又は関連蛋白が放出されたとき自然発
生的に形成される抗体が測定される。hHSP65又は関連蛋
白の測定がこの目的に役立つのと同程度に、このような
抗体の陽性の結果は、IDDMが迫っていることの指標とし
て有用である。任意のhsp65蛋白との反応性を捜して、
抗hsp65抗体は測定される。即ちMThsp65蛋白は抗hHSP65
抗体と交差反応する。もちろん抗hHSP65抗体の存在の測
定のための使用に好適な蛋白はhHSP65蛋白であり、さら
に好ましくはそのp277配列である。しかし通常の技術を
有する当業者は過度に実験をしなくても、ある蛋白又は
蛋白断片が抗hHSP65抗体と交差反応するかどうかを、経
験的に決めることができる。このような蛋白又は他の分
子が抗hHSP65抗体と免疫反応するか否かを求めるため
に、簡単なin vitro試験が使用される。もし交差反応す
る場合は、本発明の方法において使用され、それも本発
明に包含されると考えられる。
p277配列は、上記した実験において記載したNOD/Ltマ
ウス、ヒトhHSP65に誘発されそのＴ細胞はヒトhsp65に
対して応答する他の株のマウス、C57BL/6、上の病原性
エピトープに対応することが証明されているが、そのＴ
細胞はp277に対して応答しない。従ってこれはhHSP65上
の唯一の病原性エピトープでないことは明らかである。
実際に前糖尿病性ヒト患者の血液又は尿中に見いだされ
る診断マーカーは、約62キロダルトンの分子量を有する
と性状解析されている。従って主要組織適合性複合体
（MHC）で提示される特定のエピトープ（ヒト白血球抗
原、HLA）は個人毎に異なるであろうと予想される。従
って現在p277配列が好適であると提示されているが、通
常の技術を有する当業者は、hHSP65蛋白中の抗原性配列
はp277と同じ又は関連した配列を有するものが見つかる
であろうことを理解できるであろう。本発明はすべてこ
のような配列を包含すると意図される。
前記の例はhsp65又は交差反応性抗原そしてそれに特
異的な抗体が、発生段階の糖尿病の診断マーカーとして
使用できるのみでなく、このような蛋白に特異的なＴ細
胞も使用できることを示している。実際にこのような特
異的なＴ細胞は抗体の出現に先行するようである。実際
にベータ細胞を攻撃するのは抗体ではなくＴ細胞であ
る。通常の技術を有する当業者は、特定の抗原に対する
Ｔ細胞活性の多くの測定法があることを理解できるであ
ろう。例えば試験対象者からリンパ球を得て、hHsp65又
は交差反応性抗原に接触させ、活性化に対して起きる種
々の効果（例えば増殖、サイトカイン産生又はリンホカ
イン産生、酵素産生、カルシウムフラックスなど）を測
定する。このような測定法は当該分野の技術の範囲内に
ある。
上記したようにhsp65はラットのアジャバント関節炎
やヒトのリウマチ関節炎に関連していることが知られて
いる。IDDM過程と異なり関節炎の過程はその顕著な症候
や症状により明白に表現されているため、IDDMを発症し
ている人と関節炎の人との鑑別において、hsp65又は抗h
sp65の測定に関する不確定性はないであろう。従って関
節炎の症候や症状がないのにhsp65又は抗hsp65が検出さ
れる場合は、全臨床的ベータ細胞の破壊と発生段階のID
DMの可能性に注意を向けさせるのに役立つであろう。ベ
ータ細胞に対する自己免疫の診断を確定するのに、追加
の検査（例えばベータ細胞に対する抗体）が利用される
であろう。
IDDM過程が臨床的には無症状であるのに対し、全身性
エリテマトーデス（SLE）は明白な症候と症状で特徴づ
けられるため、全身性エリテマトーデスとhsp90との関
連は、IDDM過程と混乱されることはないであろう。
hHSP65又は関連蛋白に対する抗体は、IDDMの診断に使
用され、ここでhsp65又は他の免疫学的に交差反応性分
子は患者に皮下注射され、皮膚反応の有無が観察され
る。またはhHSP65又は関連分子を患者の血液又は血液成
分と接触させ、患者の血液中に任意の公知の免疫学的方
法により検出される抗hHSP65との免疫学的反応の有無
（即ちhsp65と交差反応する抗体）について観察され
る。このような公知の免疫学的方法にはラジオイムノア
ッセイ、蛍光免疫定量法、ELISA（酵素免疫測定法）、
ケミルミネセンス測定法などがある。
in vivoの皮膚試験では、充分な時間の後（例えば投
与後24から72時間後）に注射部位での皮膚反応が測定さ
れる。膨大化及び／又は発赤は遅延化過敏症に起因す
る。
in vitroの血清学的検査では、患者の血清をhHSP65又
は関連蛋白と接触させる。血清がhsp65の抗原決定基に
対する抗体を含有する場合は、免疫反応が起こり、これ
を標準的方法（例えばELISA、凝集など）により検出し
定量する。
hHSP65、抗hHSP65又はhHSP65特異的Ｔ細胞の存在を検
出するのに公知の免疫測定技術が使用される。例えばhs
p65を使用する測定法により、ある人の血清中の抗hHSP6
5抗体の存在が陽性であると測定された場合はIDDMが発
生段階であるか又は存在することを意味するという事実
を通常の技術を有する当業者が知れば、このような当業
者は使用できる免疫測定技術のタイプは充分認識してい
るであろう。ラジオイムノアッセイ（固相又は液相）以
外に、任意の従来の免疫測定法（例えば酵素結合免疫吸
着定量法（ELISA）、酵素やラジオアイソトープ以外の
標識物を用いる不均一免疫測定法（競合法及び非競合
法）、蛍光消光法及び酵素チャネリング法に基づく均一
免疫測定法、免疫沈降法（放射免疫拡散法を含む）、そ
して肉眼の半定量的検出法と定量的濁度的検出法に基づ
く凝集測定法など）が使用できる。
測定には任意の通常の固相法又はサンドイッチ測定技
術を使用することができる。
同様に本発明を達成するための種々の測定を実施する
ために、キットを調製してもよい。このようなキットは
単一の測定又は決まった数の測定を実施するのに必要な
すべての材料を含むであろう。例えば抗hHSP65抗体の存
在を測定するためのキットは、固相に固定されたhsp65
と、検出すべき抗hHSP65抗体の非可変領域を認識するこ
とができる標識した抗体（例えば標識抗ヒトFab）を含
む。hHSP65の存在を測定するためのキットは、固相に固
定された抗体（これはhHSP65と反応するか又は交差反応
する）、そして固体抗体が認識するエピトープとは異な
るhHSP65のエピトープと反応することができる標識抗体
を含む。キットはまた、hsp65と抗hHSP65抗体の免疫複
合体を沈降させることができる試薬と、キットの使用法
を記載する説明書とキットの材料を入れるための容器を
含む。任意の従来の標識物（例えばラジオアイソトー
プ、酵素、発色団、又は発蛍光団）を使用することがで
きる。典型的なラジオアイソトープはヨード−125又は
イオウ−35である。本目的のための典型的な酵素には、
西洋ワサビペルオキシダーゼ（horseradish peroxidas
a）、α−ガラクトシダーゼ及びアルカリ性ホスファタ
ーゼがある。
本発明の診断用組成物は、hsp65に適当なアジュバン
トや付属成分を組合せることにより調製される。
上記の実験で証明されたように、ランゲルハンス島細
胞と熱ショック繊維芽細胞はマイコバクテリウムhsp65
と交差反応する分子を放出する。マイコバクテリウムhs
p65の免疫はIDDMを引き起こすという事実は、マイコバ
クテリウムhsp65と交差反応する抗原に対する免疫攻撃
はベータ細胞に障害を与えることを示している。このよ
うな免疫応答は、交差反応性hsp65又は侵入する微生物
により偶然免疫された後に起きる最初の出来事である。
hsp65又は関連蛋白の放出も、ウイルス又は毒素（toxi
n）によるベータ細胞の障害の後に起きるであろう。即
ち血液又は尿中のhsp65陽性分子の出現がなぜIDDMの進
行の初期の兆候であるかというと、それはこれらの分子
はベータ細胞の障害の進行に伴って放出されるからであ
る。同様にhHSP65に対する免疫応答それ自身がIDDMを引
き起こすため、抗hHSP65抗体はIDDMが迫っていることの
信頼できる兆候である。
hHSP65の抗体が本来偶然の免疫の結果であっても、又
はウイルスや毒素によるベータ細胞の障害の後のhHSP65
の放出によるものであっても、ベータ細胞中に含まれる
hHSP65が攻撃されるため、抗hHSP65抗体又は抗hHSP65T
細胞の産生は、ベータ細胞破壊の過程を増強し永続させ
る。
毒性抗hsp65T細胞により移されたか又はhsp65に対す
る能動的免疫により誘発された急性糖尿病から回復した
後は、自然発生IDDMを防ぐことができるとうい事実は重
要である。これは自己免疫応答の動力学と規模がそれ自
身の調節につながるということを示唆している。潜行性
で慢性の過程は自己免疫疾患に対する自然の防御に対し
「こそこそ逃げてしまう」ようであるが、明かな自己免
疫刺激は制御を増強するようである。疾患の急性発症に
よる自己免疫疾患に対する耐性の獲得は、実験的自己免
疫脳脊髄炎（EAE）のラットモデルで普通に見られる。
ミエリン塩基性蛋白（myelin basic protein）に対する
能動的免疫又は活性Ｔ細胞の受動的転移により誘発され
た急性EAEからの自然回復の後は、ラットはEAEをさらに
誘発させようとする試みに対して耐性を示す。EAEの発
現は、ミエリン塩基性蛋白に応答する毒性Ｔ細胞を調節
することができる機構（おそらく抗イディオタイプ制
御）を活性化することが見いだされた。
減弱化した自己免疫Ｔ細胞を使用してＴ細胞ワクチン
接種をすることが、急性疾患を引き起こさずに制御機構
を活性化させる１つの方法のようである。EAEに対する
ワクチン接種で示された種類の抗イディオタイプ及び抗
エルゴタイプ（anti−ergotypic）Ｔ細胞は、自己免疫
性抗hsp65T細胞を鎮め、IDDMの臨床症状の発現を防止す
る。
この理論は、hHsp65に対する免疫応答の寛容又は抑制
の誘導は、どのようにして糖尿病過程が開始した後でも
これを防止し治療することができるかを説明するのに役
立つ。即ちhsp65、hsp65と交差反応する低分子量分子
（25、30又は47キロダルトン）、又は断片、修飾された
ペプチド配列、合成ペプチド、又は融合蛋白の計画に基
づく又はhsp65の物理化学的要求を満足するように計画
された有機分子でさえも、hHSP65に対するポリクローナ
ル抗体と交差反応するか又はhHSP65と交差反応する抗体
の産生を引き起こすことができる限りは、IDDM過程を防
止又は治療するのに使用することができる。この目的の
ためにはhsp65のp277配列が好適な物質である。さらにh
HSP65又は関連抗原に対して特異的な減弱化Ｔ細胞は、
その断片又は活性部分とともに、このような免疫の誘発
又はこのような免疫応答の抑制に使用することができ
る。
hsp65分子はhHSP65に対する寛容を作りだしてベータ
細胞の自己破壊を停止させることにより、IDDMの進行の
持続に対して効果的な治療用組成物として有用であるこ
とが証明されている。発生段階のIDDMのこのような治療
に使用される活性成分は、hHSP65と免疫学的に交差反応
する任意の物質である（即ちそれはhHSP65に対するポリ
クローナル抗体と交差反応するか、又はhHSP65と交差反
応する抗体を誘導する）。このような物質はペプチドで
あろうと蛋白、炭水化物又は他の物質であろうと、寛容
を誘導する方法で投与された場合は、この交差反応性に
よりhHSP65に対する寛容を誘導するのに役立つ。この物
質がhsp65蛋白の場合は、任意の種のものが使用でき
る。hHSP65と免疫学的に交差反応するために、この物質
は完全な蛋白である必要はなく、蛋白自身の抗原活性を
保持する蛋白の断片（例えばp277）でもよい。ある物質
がhHSP65と交差反応するか否かはルーチンの実験により
測定することができる。その物質がhHSP65に対するポリ
クローナル抗体と交差反応するか、又はhHSP65と交差反
応する抗体の産生を誘導する場合、それは発生段階のID
DMの治療法に関する限り、本発明の範囲に含まれると考
えられる。このような物質がヒトの治療に使用できると
いう追加の証明は、実施例10に記載したようにマウスの
試験で寛容の誘導を試験することである。このような実
験はルーチン的であり、過度の実験は必要ない。
ヒトIDDMの治療に好適な化合物はhHSP65である。ヒト
熱ショック蛋白のアミノ酸配列は図３に記載されてい
る。この目的のためにこの蛋白を使用することができ
る。そのp277配列はこの目的のためのもう一つの好適な
分子である。
ここに記載したhsp65蛋白以外に、hsp65と交差反応す
る能力を有するその塩、官能性誘導体、前駆体及び活性
画分も使用することができる。図３の配列又はバンエデ
ン（van Eden）ら（前述）の記載する配列（１つ又はそ
れ以上のアミノ酸が欠失しているか付加されている、又
は他のアミノ酸で置換されている）も、それらがhHSP65
と免疫学的に交差反応する能力を有している限り、本発
明に包含される。
本明細書において「塩」という用語は、蛋白分子のカ
ルボキシル基の塩とアミノ基の酸付加塩の両方を意味す
る。カルボキシル基の塩は当業者に公知の方法で作成さ
れ、例えばナトリウム塩、カリウム塩、カルシウム塩、
アンモニウム塩、第二鉄塩、又は亜鉛塩などの無機塩、
そして例えばアミン（例えばトリエタノールアミン、ア
ルギニン又はリジン、ピペリジン、プロカインなど）と
の有機塩基の塩を含む。酸付加塩としては、例えば無機
酸（例えば塩酸又は硫酸）との塩、そして有機酸（例え
ば酢酸又はシュウ酸）との塩を含む。
本明細書で使用される「官能性誘導体」という用語
は、残基又はＮ−又はＣ−末端基上の側鎖として存在す
る官能基から当業者に公知の方法で調製される誘導体を
意味しており、薬剤として許容される限り（即ち蛋白の
活性を破壊せず、それを含む組成物に有害な性質を与え
ず、その抗原性に悪影響を与えない限り）本発明に包含
される。
これらの誘導体としては、例えばカルボキシル基の脂
肪族エステル、アンモニウム又は一級又は二級アミンと
の反応によるカルボキシル基のアミド、アシル部分（例
えばアルカノイル、カルボサイクリックアロイル基）と
作成されるアミノ酸残基の遊離アミノ基のＮ−アシル誘
導体、又はアシル部分と作成される遊離ヒドロキシ基
（例えばセリン残基又はスレオニン残基のヒドロキシ
基）のＯ−アシル誘導体がある。
「前駆体」とは、動物又はヒトの体内でhsp65の前に
形成されhsp65に変換される化合物である。
本発明において実質的に精製された「活性画分」とし
ては、hHSP65と交差反応する能力を有する限り、hsp65
蛋白分子単独又は関連する分子と一緒であるか又はそこ
に結合している残基（糖又はリン酸残基）と一緒である
hsp65蛋白のポリペプチド鎖の断片又は前駆体、又は蛋
白分子又は糖残基自身の凝集体を含む。このような活性
画分の例としては、hHSP65のp277配列がある。
前記の活性成分は、免疫原性応答を誘導するより寛容
を誘導するような方法で投与することが、非常に重要で
ある。即ちそれは油又は他の免疫原性アジュバント中で
投与されるべきである。活性成分が寛容を誘導するのに
好適な投与方法は、抗原−担体複合体が投与された時抗
原に対する寛容の誘導を促進する担体とともに投与する
ことである。このような担体は寛容誘導性担体（tolero
genic）として知られている。公知の寛容誘導性担体と
しては、Ｄ−アミノ酸の重合体、ポリエチレングリコー
ル、糖分子の重合体、自己IgG分子、自己脾臓細胞、及
び脂肪酸分子がある。寛容を誘導するために、抗原はモ
ノマーとして非常に可溶性の形で投与される。抗原に対
する寛容を誘導する他の公知の方法は、寛容誘導性特徴
により具体的に選択された担体さえなしで経口的に投与
する方法である。寛容を誘導するために具体的な投与方
法は、通常の知識を有する当業者に公知であり、このよ
うな方法は本発明において使用される。このような方法
自体は本発明には含まれない。
IDDMの予防又は治療に使用されるＴ細胞調製物は、前
記のIDDM特異的抗原に対する特異性を獲得したＴ細胞
（即ちhHsp65、又はこれと交差反応性の抗原、例えばp2
77に特異的）から得られる。これらの特異的細胞は、こ
のような抗原の存在下でインキュベートするか、又はＴ
細胞による免疫応答を誘導することができるマイトジェ
ン（例えばコンカナバリンＡ）でインキュベートして活
性化されていることが必要である。このような活性化ID
DM特異的Ｔ細胞は、好ましくは例えば放射線照射により
減弱化される。好適な減弱化の方法（これはＴ細胞の免
疫原性を増加させる好ましい効果もある）は、充分な圧
力と時間の水圧で処理して、膜蛋白の実質的な損失を伴
うことなくＴ細胞の免疫原性を増強させることによる、
圧力処理である。又はその圧力は、細胞から細胞表面蛋
白が剥がれるような強さと時間であってもよい。低速遠
心分離により細胞を除去した後、高速遠心分離をしてそ
の断片を、上澄液中に残存している可溶性蛋白のよう
に、ワクチンとして使用する。これらの方法のすべては
本特許の譲受人のヨーロッパ特許第261,648号に記載さ
れており、その内容は参考のため本明細書中に引用され
ている。
IDDM特異的、活性化Ｔ細胞はまた、化学的架橋剤（例
えばホルムアルデヒド、グルタルアルデヒド、又は８−
メトキシソラレンのような光活性化ソラレン架橋剤（本
特許の譲受人のヨーロッパ特許333,606号に記載されて
おり、その内容は参考のため本明細書中に引用されてい
る））で処理してもよい。このようなＴ細胞はまた細胞
骨格破壊剤（例えばサイトカルシン（cytochalsin）又
はコルヒチン（cochicine））で処理してもよい。圧力
処理、化学的架橋剤処理及び細胞骨格破壊剤処理のどれ
を組合せてもよい。さらにこの様に処理した細胞は、溶
解し、固定された細胞膜のみ回収し、使用することがで
きる。これらの方法のすべては、ヨーロッパ特許第261,
648号に詳細に記載されている。
IDDM抗原（即ちhHSP65蛋白、又はこれと交差反応性の
抗原）に特異的なＴ細胞リセプターの可変領域、及び好
ましくはそのVDJ領域を単離し、自己免疫脳脊髄炎Ｔ細
胞リセプターに対する、ハウウェル（Howell）（前述）
とバンデンバーグ（Vandenbark）（前述）の記載した方
法で、本発明のＴ細胞ワクチン調製物として使用するこ
とができる。
本明細書に記載したようにIDDM抗原がいったん明らか
になれば、IDDMに関してこれらすべての公知の方法を使
用することができる。いったん抗原が公知になれば、通
常の技術を有する当業者は、過度の実験をすることなく
これらのすべての技術を実施することができる。従って
本発明はこのような方法のすべてを含むものと意図され
る。これらのすべては、本発明の抗原の使用する追加の
方法である。
このような寛容誘導性組成物は、例えばIDDMの進行に
関して遺伝的な危険性のあるIDDM患者の家族で、IDDMの
進行を防止するためのワクチンとして投与される。しか
し好ましくは、血液又は尿中にhHSP65が検出される人
で、好ましくはhHSP65に対する免疫応答が発現する前
に、IDDMの持続的進行を防止するために使用される。寛
容誘導性は免疫応答を防止し、従って調節不可能な抗hH
SP65応答により引き起こされる障害（IDDM）を防止す
る。しかし抗hHSP65抗体が出現した後に本発明の組成物
を治療に使用しても遅すぎることはない。表８と表13に
示した実験の結果は、本発明のランゲルハンス島に対す
る自己免疫が始まった後でも免疫応答を停止するのに役
立つことを示している。ヒトの自己免疫過程の進行は何
年もかかるため、応答のダウン調節（down regulatio
n）でさえ有効であろう。
hHSP65又は関連蛋白（前述）は、IDDMの診断のための
診断組成物における抗原とともに、特にIDDMの緩解と治
療のためのワクチンとして、薬剤組成物における免疫原
として使用することができる。当業者に公知の方法で調
製される、これらの薬剤組成物及び診断用組成物は、ま
た本発明の一部を構成する。
hsp65のワクチンとしての又は治療薬としての効果を
改良するための別の方法は、公知の遺伝子工学的方法で
hsp65をそのまま又は融合蛋白の一部として又はその多
分子体（multimer）として発現する微生物を作成するこ
とである。これらの微生物自身は、その微生物に対する
抗体の産生を刺激するのみでなく、IDDMの緩解と治療に
有用な生きたワクチンの調製に使用することができる。
これらの遺伝子工学的に作成された微生物、及びそれら
を含む薬剤組成物もまた、本発明の一部を構成する。適
切な遺伝子工学的に作成された微生物の例としては、バ
クシニア（Vaccinia）やサルモネラ（Solmonella）の株
がある。
本発明の組成物は、経口的に又は非経口的（例えば皮
下、筋肉内、静脈内、鼻腔内、肛門内）に投与される。
寛容誘導性薬剤組成物は当業者に公知の方法で調製され
る。
前記の具体的な態様は、現在の知識を応用することに
より本発明の概念から逸脱することなく、本発明の具体
的な態様を他人が容易に修飾又は適用することができる
ように、充分記載されており、従ってその様な改良や応
用は開示された態様内に包含されるものと考えられる。
本明細書で使用された用語は説明のためのみであり、限
定するものではない。
図面の簡単な説明 図１は、IDDMを発症しなかったNODマウスの血清中のh
sp65、抗hsp65、抗インスリン抗体、そして抗イディオ
タイプの抗体の量を示す。
図２は、IDDMを発症したNODマウスでは疾患の進行が
明瞭になる前にhsp65と抗hsp65が顕著に増加しているこ
とを示すグラフである。
図３は、ヒトP1蛋白（これはhHSP65である）のヌクレ
オチドと、推定されるアミノ酸配列を示す。
図４は、年齢の関数としてのヒトhsp65、MT−hsp65及
びMT−hsp70に対するNOD/LtT細胞の自然の反応性の程度
を示すグラフである。
図５は、ペプチドの濃度の関数としてのp277とp278に
対するＴ細胞の増殖応答を示すグラフである。
図６は、p277、MT hsp65そしてプラスミッドコントロ
ールに応答しての、若い前糖尿病性NOD/Ltマウスに急性
糖尿病を移すことができるC7とC9T細胞の増殖を示す棒
グラフである。
図７は、休止している誘導された糖尿病における、ペ
プチドp277とp278に対する免疫の結果を示す。
フロントページの続き (72)発明者 マルコビッツ，ドロン イスラエル国70 700 ジエデラ，ホロ ビッツ ストリート 11 (56)参考文献 Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．Ｖｏ ｌ．９，Ｎｏ．５（1989．Ｍａｙ）ｐ. 2279−2283 (58)調査した分野(Int.Cl.7，ＤＢ名) C07K 14/47 ＢＩＯＳＩＳ（ＤＩＡＬＯＧ) ＣＡ（ＳＴＮ) ＲＥＧＩＳＴＲＹ（ＳＴＮ) ＷＰＩ（ＤＩＡＬＯＧ)

Claims (3)

    (57)【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】65kDaのヒト熱ショック蛋白（hHSP65）の
    位置437から460のVal−Leu−Gly−Gly−Gly−Cys−Ala
    −Leu−Leu−Arg−Cys−Ile−Pro−Ala−Leu−Asp−Ser
    −Leu−Thr−Pro−Ala−Asn−Glu−Aspのp277配列で表
    わされる実質的に純粋なポリペプチド。
  2. 【請求項２】配列Val−Leu−Gly−Gly−Gly−Cys−Ala
    −Leu−Leu−Arg−Cys−Ile−Pro−Ala−Leu−Asp−Ser
    −Leu−Thr−Pro−Ala−Asn−Glu−Aspのポリペプチドp
    277、その塩、又はそれと免疫学的に交差反応するが完
    全なヒト熱ショック蛋白ではないその誘導体であって、
    該ポリペプチドp277中のアミノ酸残基が側鎖のカルボキ
    シル基、アミノ基もしくは水酸基あるいはＮ末端のアミ
    ノ基もしくはＣ末端のカルボキシル基から調製される誘
    導体であり、且つカルボキシル基の脂肪族エステル、カ
    ルボキシル基とアンモニアあるいは一級もしくは二級ア
    ミンとからのアミド、アミノ基のＮ−アシル誘導体及び
    水酸基のＯ−アシル誘導体から選ばれる誘導体。
  3. 【請求項３】活性成分としての請求項１又は２のポリペ
    プチド、及び薬剤として許容される免疫学的寛容誘導性
    の担体を含むインスリン依存性糖尿病の予防又は治療の
    ための薬剤組成物。
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