JP2000055916A - インスリン依存性糖尿病の診断と治療 - Google Patents
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Abstract
(57)【要約】
【課題】 インスリン依存性糖尿病の新しい診断方法を
提供することを目的とする。 【解決手段】 患者の血液又は尿を検査して、hHSP６５
に対する抗体と免疫学的に反応性のある蛋白の有無、又
はhHSP６５と免疫学的に反応性のある抗体又はＴ細胞の
有無を調べることよりなる、患者のインスリン依存性糖
尿病（ＩＤＤＭ）の存在又はその発生段階（incipienc
e）を検出することができる。
提供することを目的とする。 【解決手段】 患者の血液又は尿を検査して、hHSP６５
に対する抗体と免疫学的に反応性のある蛋白の有無、又
はhHSP６５と免疫学的に反応性のある抗体又はＴ細胞の
有無を調べることよりなる、患者のインスリン依存性糖
尿病（ＩＤＤＭ）の存在又はその発生段階（incipienc
e）を検出することができる。
Description
【０００１】
【発明の属する技術分野】本発明はインスリン依存性糖
尿病（ＩＤＤＭ）の存在、ＩＤＤＭになり易い性向、又
はＩＤＤＭになる過程の開始を検出する方法に関し、さ
らに詳しくは本発明は６５キロダルトンの熱ショック蛋
白（hsp ６５)（又はこれと免疫学的に交差反応をする
分子）、又はこのような蛋白に反応性の抗体やＴ細胞に
関する。
尿病（ＩＤＤＭ）の存在、ＩＤＤＭになり易い性向、又
はＩＤＤＭになる過程の開始を検出する方法に関し、さ
らに詳しくは本発明は６５キロダルトンの熱ショック蛋
白（hsp ６５)（又はこれと免疫学的に交差反応をする
分子）、又はこのような蛋白に反応性の抗体やＴ細胞に
関する。
【０００２】さらに本発明は、 hsp６５又はその免疫学
的に関連する蛋白又は断片を投与するか、又はこのよう
な蛋白又は断片に活性化されたＴ細胞（このようなＴ細
胞は処理してその免疫原性を減弱化されている）又はこ
のようなＴ細胞や処理されたＴ細胞の断片を、その免疫
学的寛容を引き起こすように投与することによる、ＩＤ
ＤＭを防止したり発生中のＩＤＤＭを治療する方法に関
する。
的に関連する蛋白又は断片を投与するか、又はこのよう
な蛋白又は断片に活性化されたＴ細胞（このようなＴ細
胞は処理してその免疫原性を減弱化されている）又はこ
のようなＴ細胞や処理されたＴ細胞の断片を、その免疫
学的寛容を引き起こすように投与することによる、ＩＤ
ＤＭを防止したり発生中のＩＤＤＭを治療する方法に関
する。
【０００３】
【従来の技術】インスリン依存性糖尿病（ＩＤＤＭ）の
発生率は、多くの国でこの数十年間に数倍増加し、現在
生きているヒトの１％は７０才になるまでにＩＤＤＭに
なるだろうと予想されている。ＩＤＤＭはインスリン産
生ベータ細胞を破壊する自己免疫学的反応により引き起
こされる。糖尿病の臨床症状はベータ細胞の大部分（お
そらく９０％）が再生できないほど破壊された後に初め
て現れ、患者の生存はインスリンの外的供給に依存する
ことになる。即ち臨床診断ができる時期にはこの自己免
疫反応は不可逆的な損傷を与えており、しかもその多く
は顕著な症状を示さない。糖尿病に関与する自己免疫反
応の治療を成功させるためには、患者の症状が明らかに
なる前に治療を開始することと、インスリンを産生する
能力をなくした患者へのインスリン補充が必要である。
自己免疫反応を停止させることにより糖尿病が直り外因
性インスリンが不要になるのは、患者がまだ充分量の内
因性インスリンを与えることができる充分な数のベータ
細胞を有しているうちに、病気の進行をとめることがで
きた場合のみである。従ってＩＤＤＭの症状が明らかに
なる前にそして外因性インスリンが必要になる前に危険
のある患者が同定できたら、いかなる療法ももっと有効
となるであろう。ＩＤＤＭの新しい患者の約９０％は、
患者歴のある家族以外から発生している。従って疾患を
止めることが不可能な段階になる前に疾患を検出するた
めに、マススクリーニングに適した測定法が緊急に必要
とされている。
発生率は、多くの国でこの数十年間に数倍増加し、現在
生きているヒトの１％は７０才になるまでにＩＤＤＭに
なるだろうと予想されている。ＩＤＤＭはインスリン産
生ベータ細胞を破壊する自己免疫学的反応により引き起
こされる。糖尿病の臨床症状はベータ細胞の大部分（お
そらく９０％）が再生できないほど破壊された後に初め
て現れ、患者の生存はインスリンの外的供給に依存する
ことになる。即ち臨床診断ができる時期にはこの自己免
疫反応は不可逆的な損傷を与えており、しかもその多く
は顕著な症状を示さない。糖尿病に関与する自己免疫反
応の治療を成功させるためには、患者の症状が明らかに
なる前に治療を開始することと、インスリンを産生する
能力をなくした患者へのインスリン補充が必要である。
自己免疫反応を停止させることにより糖尿病が直り外因
性インスリンが不要になるのは、患者がまだ充分量の内
因性インスリンを与えることができる充分な数のベータ
細胞を有しているうちに、病気の進行をとめることがで
きた場合のみである。従ってＩＤＤＭの症状が明らかに
なる前にそして外因性インスリンが必要になる前に危険
のある患者が同定できたら、いかなる療法ももっと有効
となるであろう。ＩＤＤＭの新しい患者の約９０％は、
患者歴のある家族以外から発生している。従って疾患を
止めることが不可能な段階になる前に疾患を検出するた
めに、マススクリーニングに適した測定法が緊急に必要
とされている。
【０００４】幸いなことにＩＤＤＭにはＢＢラットやＮ
ＯＤマウスのように多くの動物モデルがある（例えばロ
ッシーニ（Rossini)ら、アニュアル・レビュー・イムノ
ロジー（Ann. Rev. Immunol.) 第３巻、２８９−３２０
頁（1985年）を参照）。この動物の多くは自然にＩＤＤ
Ｍを発症し、ヒトのＩＤＤＭの多くの特徴を示す。熱シ
ョック蛋白（hsp's)は、高温条件又は他のストレスをか
けた時に細胞から産生される蛋白群の１員である。熱シ
ョック蛋白には種々の分子量のものがある（例えば２０
キロダルトン、６５−６８キロダルトン、７０キロダル
トン、９０キロダルトン、１１０キロダルトンなど）。
熱ショック蛋白は自然界に普遍的に存在しており、細
菌、酵母、植物、昆虫、及びヒトを含む高等動物により
産生される。この蛋白は高度に保存されており、これら
の多様な生物のすべてで著しい相同性を示している。長
い進化の時間にわたって極端に保存されているため、熱
ショック蛋白は重要な機能を果たすと考えられる。細胞
をストレス（例えば熱、ある種の金属、薬剤、又はアミ
ノ酸類似体）で刺激すると、普通これらの蛋白の合成が
増加する。しかしこれらの蛋白の特殊な機能は今のとこ
ろ不明である。
ＯＤマウスのように多くの動物モデルがある（例えばロ
ッシーニ（Rossini)ら、アニュアル・レビュー・イムノ
ロジー（Ann. Rev. Immunol.) 第３巻、２８９−３２０
頁（1985年）を参照）。この動物の多くは自然にＩＤＤ
Ｍを発症し、ヒトのＩＤＤＭの多くの特徴を示す。熱シ
ョック蛋白（hsp's)は、高温条件又は他のストレスをか
けた時に細胞から産生される蛋白群の１員である。熱シ
ョック蛋白には種々の分子量のものがある（例えば２０
キロダルトン、６５−６８キロダルトン、７０キロダル
トン、９０キロダルトン、１１０キロダルトンなど）。
熱ショック蛋白は自然界に普遍的に存在しており、細
菌、酵母、植物、昆虫、及びヒトを含む高等動物により
産生される。この蛋白は高度に保存されており、これら
の多様な生物のすべてで著しい相同性を示している。長
い進化の時間にわたって極端に保存されているため、熱
ショック蛋白は重要な機能を果たすと考えられる。細胞
をストレス（例えば熱、ある種の金属、薬剤、又はアミ
ノ酸類似体）で刺激すると、普通これらの蛋白の合成が
増加する。しかしこれらの蛋白の特殊な機能は今のとこ
ろ不明である。
【０００５】例えば、全身性エリテマトーデス（ＳＬ
Ｅ）の患者は９０キロダルトンの熱ションク蛋白に対す
る抗体を有することが観察されている（ミノタ（Minot
a) ら、ジャーナル・オブ・クリニカルインベスティゲ
ーション（J. Clin. Invest.) 第８１巻、１０６−１０
９頁（1988年））。 hsp９０に対する抗体の機能は不明
である。HSP ６５はラットのアジュバント関節炎に関与
していることが知られている（バンエデン（van Eden)
ら、ネーチャー（Nature) 第３３１巻、１７１−１７３
頁（1988年）参照）。アジュバント関節炎はある株のラ
ットをマイコバクテリウムテューバーキュローシス(Myc
obacterium tubeculosis, MT) に対して免疫することに
より発症する自己免疫関節炎である。この疾患はＭＴの
hsp６５の９個のアミノ酸ペプチド配列（１８０−１８
８）に対して反応性のＴリンパ球のクローンにより、放
射線照射を受けた免疫学的に無防備の(naive) ラットに
移すことができることが見いだされた。従ってアジュバ
ント関節炎は抗 hsp６５Ｔリンパ球により引き起こされ
る自己免疫疾患のようである。関節に対するこの自己免
疫攻撃は、１８０−１８５ hsp６５ペプチドと軟骨プ
ロテオグリカンの結合蛋白の一部との部分配列の相同性
に起因していた（コーエン（Cohen)、サイエンティフィ
ックアメリカン（Scinetific American)第２５６巻、５
２−６０頁（1988年）を参照）。またリウマチ関節炎の
患者の滑液のＴリンパ球はＭＴの hsp６５に対して応答
した（レス（Res)ら、ランセット（Lancet）第II巻、４
７８−４８０頁（1988年）参照）。アジュバント関節炎
の誘導の前にラットに hsp６５を投与すると、後に関節
炎が発症するのを防ぐことができることがわかった。従
って hsp６５に対する免疫応答の存在はラット及びヒト
の両方の関節炎に関連しており、 hsp６５の投与により
関節炎に対する耐性が与えられた。
Ｅ）の患者は９０キロダルトンの熱ションク蛋白に対す
る抗体を有することが観察されている（ミノタ（Minot
a) ら、ジャーナル・オブ・クリニカルインベスティゲ
ーション（J. Clin. Invest.) 第８１巻、１０６−１０
９頁（1988年））。 hsp９０に対する抗体の機能は不明
である。HSP ６５はラットのアジュバント関節炎に関与
していることが知られている（バンエデン（van Eden)
ら、ネーチャー（Nature) 第３３１巻、１７１−１７３
頁（1988年）参照）。アジュバント関節炎はある株のラ
ットをマイコバクテリウムテューバーキュローシス(Myc
obacterium tubeculosis, MT) に対して免疫することに
より発症する自己免疫関節炎である。この疾患はＭＴの
hsp６５の９個のアミノ酸ペプチド配列（１８０−１８
８）に対して反応性のＴリンパ球のクローンにより、放
射線照射を受けた免疫学的に無防備の(naive) ラットに
移すことができることが見いだされた。従ってアジュバ
ント関節炎は抗 hsp６５Ｔリンパ球により引き起こされ
る自己免疫疾患のようである。関節に対するこの自己免
疫攻撃は、１８０−１８５ hsp６５ペプチドと軟骨プ
ロテオグリカンの結合蛋白の一部との部分配列の相同性
に起因していた（コーエン（Cohen)、サイエンティフィ
ックアメリカン（Scinetific American)第２５６巻、５
２−６０頁（1988年）を参照）。またリウマチ関節炎の
患者の滑液のＴリンパ球はＭＴの hsp６５に対して応答
した（レス（Res)ら、ランセット（Lancet）第II巻、４
７８−４８０頁（1988年）参照）。アジュバント関節炎
の誘導の前にラットに hsp６５を投与すると、後に関節
炎が発症するのを防ぐことができることがわかった。従
って hsp６５に対する免疫応答の存在はラット及びヒト
の両方の関節炎に関連しており、 hsp６５の投与により
関節炎に対する耐性が与えられた。
【０００６】ヨーロッパ特許出願第２６２，７１０号
は、自己免疫関節炎や類似の自己免疫疾患の緩和、治
療、そして診断に有用なポリペプチドを開示している。
ヒトのＰ１蛋白の完全な一次構造（ヌクレオチド配列と
推定アミノ酸配列を含む)が、最近エス・ジンダイ(Jind
ai, S.)ら、「バクテリアや植物シャペロニン及び６５
キロダルトンのマイコバクテリア抗原に類似のヒトミト
コンドリア蛋白の一次構造」("Primary Structure of a
Human MitochondrialProtein Homologous to the Bact
erial and Plant Chapero-nins and to the 65-Kilodal
ton Mycobacterial Antigen") 、モレキュラーアンドセ
リュラーバイオロジー(Molecularand Cellular Biolog
y) 第９巻、５、2279-2283 頁（1989年) に最近発表さ
れた。分子量が約６３キロダルトンであると開示されて
いるこの蛋白は、本明細書でhHSP65蛋白として記載され
ているヒト熱ショック蛋白である。前記文献の内容のす
べては参考のため本明細書に引用されている。図３に復
元されているこの蛋白の構造は、ジンダイが開示してい
るものと同じである。
は、自己免疫関節炎や類似の自己免疫疾患の緩和、治
療、そして診断に有用なポリペプチドを開示している。
ヒトのＰ１蛋白の完全な一次構造（ヌクレオチド配列と
推定アミノ酸配列を含む)が、最近エス・ジンダイ(Jind
ai, S.)ら、「バクテリアや植物シャペロニン及び６５
キロダルトンのマイコバクテリア抗原に類似のヒトミト
コンドリア蛋白の一次構造」("Primary Structure of a
Human MitochondrialProtein Homologous to the Bact
erial and Plant Chapero-nins and to the 65-Kilodal
ton Mycobacterial Antigen") 、モレキュラーアンドセ
リュラーバイオロジー(Molecularand Cellular Biolog
y) 第９巻、５、2279-2283 頁（1989年) に最近発表さ
れた。分子量が約６３キロダルトンであると開示されて
いるこの蛋白は、本明細書でhHSP65蛋白として記載され
ているヒト熱ショック蛋白である。前記文献の内容のす
べては参考のため本明細書に引用されている。図３に復
元されているこの蛋白の構造は、ジンダイが開示してい
るものと同じである。
【０００７】ヨーロッパ特許出願第 261,648号は、自己
免疫疾患の治療に自己免疫疾患に特異的な活性化Ｔ細胞
の使用を開示している。このＴ細胞は好ましくはまず圧
力で処理し、次に化学的架橋剤及び／又は細胞骨格（cy
toskeletal) 破壊剤で処理して免疫原性を改良する。完
全に処理した細胞又はその画分は、Ｔ細胞が特異的な自
己免疫疾患に対するワクチンとして使用することができ
る。自己免疫性Ｔ細胞を阻止するための公知の方法で
は、特定の自己免疫特異性を有する減弱化した又は無毒
性のＴ細胞の試料、又はその断片又は画分で対象を免疫
する。対象は少なくとも２つのタイプの制御Ｔ細胞を活
性化して応答する（Ｔ細胞活性化マーカーを認識する抗
エルゴタイプ（anti-ergo-typic)Ｔ細胞と、病原性内因
性自己免疫Ｔ細胞上に存在する自己抗原リセプターを認
識するらしい抗イディオタイプＴ細胞）。実験動物での
Ｔ細胞ワクチン接種は、疾患の予防とともに、確立した
疾患の永久的緩解を誘導するのに有効である。ハウウェ
ル（Howell) ら、サイエンス（Science)第２４６巻、６
６８−６７０頁（1989年）、及びバンデンバーク(Vande
n-bark) ら、ネーチャー（Nature) 第３４１巻、５４１
−５４４頁（1989年）は、実験的自己免疫性脳脊髄炎に
対するラットのワクチン接種にＴ細胞リセプターのβ鎖
のペプチド配列の使用を開示しており、従って自己免疫
Ｔ細胞リセプター自身が制御Ｔ細胞の標的エピトープを
供給することができるという結論を支持している。自己
免疫疾患一般に関してＴ細胞又は断片をこのように使用
することは公知であるが、ＩＤＤＭに特異的な特定の抗
原はこれまで知られていなかった。即ちＩＤＤＭに対す
るワクチン接種のための活性化Ｔ細胞は、本発明以前に
は得られていなかった。
免疫疾患の治療に自己免疫疾患に特異的な活性化Ｔ細胞
の使用を開示している。このＴ細胞は好ましくはまず圧
力で処理し、次に化学的架橋剤及び／又は細胞骨格（cy
toskeletal) 破壊剤で処理して免疫原性を改良する。完
全に処理した細胞又はその画分は、Ｔ細胞が特異的な自
己免疫疾患に対するワクチンとして使用することができ
る。自己免疫性Ｔ細胞を阻止するための公知の方法で
は、特定の自己免疫特異性を有する減弱化した又は無毒
性のＴ細胞の試料、又はその断片又は画分で対象を免疫
する。対象は少なくとも２つのタイプの制御Ｔ細胞を活
性化して応答する（Ｔ細胞活性化マーカーを認識する抗
エルゴタイプ（anti-ergo-typic)Ｔ細胞と、病原性内因
性自己免疫Ｔ細胞上に存在する自己抗原リセプターを認
識するらしい抗イディオタイプＴ細胞）。実験動物での
Ｔ細胞ワクチン接種は、疾患の予防とともに、確立した
疾患の永久的緩解を誘導するのに有効である。ハウウェ
ル（Howell) ら、サイエンス（Science)第２４６巻、６
６８−６７０頁（1989年）、及びバンデンバーク(Vande
n-bark) ら、ネーチャー（Nature) 第３４１巻、５４１
−５４４頁（1989年）は、実験的自己免疫性脳脊髄炎に
対するラットのワクチン接種にＴ細胞リセプターのβ鎖
のペプチド配列の使用を開示しており、従って自己免疫
Ｔ細胞リセプター自身が制御Ｔ細胞の標的エピトープを
供給することができるという結論を支持している。自己
免疫疾患一般に関してＴ細胞又は断片をこのように使用
することは公知であるが、ＩＤＤＭに特異的な特定の抗
原はこれまで知られていなかった。即ちＩＤＤＭに対す
るワクチン接種のための活性化Ｔ細胞は、本発明以前に
は得られていなかった。
【０００８】
【発明が解決しようとする課題】本発明の目的は、イン
スリン依存性糖尿病（ＩＤＤＭ）の早期診断の方法を与
えることである。本発明の別の目的はＩＤＤＭの早期診
断に使用されるキットを与えることである。本発明のさ
らに別の目的は、ＩＤＤＭを予防する方法を与えること
である。本発明のさらに別の目的は、発生段階でＩＤＤ
Ｍを治療する方法を与えることである。本発明のさらに
別の目的は、ＩＤＤＭの予防又は治療のための免疫学的
寛容誘導性組成物を与えることである。本発明のさらに
別の目的はＩＤＤＭの予防又は治療のための新規ポリペ
プチドを与えることである。本発明のさらに別の目的
は、ＩＤＤＭの予防又は発生段階でのＩＤＤＭの治療に
有効なＴ細胞又は断片を与えることである。本発明のさ
らに別の目的は、本発明のＩＤＤＭ特異抗原を使用して
これに特異的なＴ細胞を単離した後、このようなＴ細胞
のリセプター領域のペプチド配列を性状解析し、ＩＤＤ
Ｍの予防又は治療にこのようなリセプターペプチドを使
用することである。
スリン依存性糖尿病（ＩＤＤＭ）の早期診断の方法を与
えることである。本発明の別の目的はＩＤＤＭの早期診
断に使用されるキットを与えることである。本発明のさ
らに別の目的は、ＩＤＤＭを予防する方法を与えること
である。本発明のさらに別の目的は、発生段階でＩＤＤ
Ｍを治療する方法を与えることである。本発明のさらに
別の目的は、ＩＤＤＭの予防又は治療のための免疫学的
寛容誘導性組成物を与えることである。本発明のさらに
別の目的はＩＤＤＭの予防又は治療のための新規ポリペ
プチドを与えることである。本発明のさらに別の目的
は、ＩＤＤＭの予防又は発生段階でのＩＤＤＭの治療に
有効なＴ細胞又は断片を与えることである。本発明のさ
らに別の目的は、本発明のＩＤＤＭ特異抗原を使用して
これに特異的なＴ細胞を単離した後、このようなＴ細胞
のリセプター領域のペプチド配列を性状解析し、ＩＤＤ
Ｍの予防又は治療にこのようなリセプターペプチドを使
用することである。
【０００９】
【課題を解決するための手段】本発明においてＩＤＤＭ
の研究の過程で、動物は hsp６５分子又はこれと交差反
応する分子を発現し、これが動物の血液や尿中に出現す
ることが発見された。またこれらの動物はこのような分
子に特異的な抗体やＴ細胞を発現する。即ち hsp６５
（又はこれと交差反応する分子）、又はこれらに特異的
な抗体又はＴ細胞の血液又は尿中での存在は、β細胞が
完全に破壊され患者が一生涯糖尿病が続くようになる前
にＩＤＤＭを検出するための測定法に役立つ。ある患者
におけるＩＤＤＭの存在又はその発生段階は、 hsp６５
（又はこれと交差反応する分子）、又はこれらに特異的
な抗体又はＴ細胞の存在を試験することにより診断する
ことができる。本発明はまたこのような測定を実施する
方法、及びこのような測定を実施するためのキットを与
える。発生段階の糖尿病を検出することにより、自己免
疫反応を終結させるための方法を開始することができ
る。例えばＩＤＤＭに関与する自己免疫反応に対する耐
性を誘導するのに、 hsp６５、又はその活性なエピトー
プ又はこれと交差反応をする別の分子（抗原）の投与が
効果的である。このような抗原（減弱化されているか無
毒性の型、又は処理して抗原性を改良した後のもの) 、
又はその断片又は活性画分に特異的なＴ細胞の投与は、
ＩＤＤＭに関与する自己免疫反応に対する耐性を誘導す
るのに有効であろう。
の研究の過程で、動物は hsp６５分子又はこれと交差反
応する分子を発現し、これが動物の血液や尿中に出現す
ることが発見された。またこれらの動物はこのような分
子に特異的な抗体やＴ細胞を発現する。即ち hsp６５
（又はこれと交差反応する分子）、又はこれらに特異的
な抗体又はＴ細胞の血液又は尿中での存在は、β細胞が
完全に破壊され患者が一生涯糖尿病が続くようになる前
にＩＤＤＭを検出するための測定法に役立つ。ある患者
におけるＩＤＤＭの存在又はその発生段階は、 hsp６５
（又はこれと交差反応する分子）、又はこれらに特異的
な抗体又はＴ細胞の存在を試験することにより診断する
ことができる。本発明はまたこのような測定を実施する
方法、及びこのような測定を実施するためのキットを与
える。発生段階の糖尿病を検出することにより、自己免
疫反応を終結させるための方法を開始することができ
る。例えばＩＤＤＭに関与する自己免疫反応に対する耐
性を誘導するのに、 hsp６５、又はその活性なエピトー
プ又はこれと交差反応をする別の分子（抗原）の投与が
効果的である。このような抗原（減弱化されているか無
毒性の型、又は処理して抗原性を改良した後のもの) 、
又はその断片又は活性画分に特異的なＴ細胞の投与は、
ＩＤＤＭに関与する自己免疫反応に対する耐性を誘導す
るのに有効であろう。
【００１０】本発明はさらにＩＤＤＭの予防又は治療法
に関する。適当なアジュバント中でhsp６５、又はその
活性エピトープ又はこれと免疫学的に交差反応する別の
分子（抗原）に対して免疫することによりＩＤＤＭが誘
導されることが発見された。しかし有効なアジュバント
は用いないで、好ましくは寛容誘導性担体とともに、こ
のような抗原をワクチン接種すると、該抗原に対する特
異的寛容を作り出すことができる。これによりＩＤＤＭ
に対する自己免疫反応に対する耐性を作り出すことがで
きる。このような抗原（減弱化されているか無毒性の
型、又は処理して抗原性を改良した後のもの）、又はそ
の断片又は活性画分に特異的なＴ細胞によるワクチン接
種の場合も同じことが言える。もし患者がＩＤＤＭの前
臨床的な発生段階にあれば、このような抗原又はＴ細胞
（又は画分）を注射することにより、この抗原に対する
寛容を作り出すことができ、重症の永久的な障害が与え
られる前に自己免疫過程を阻止することができる。
に関する。適当なアジュバント中でhsp６５、又はその
活性エピトープ又はこれと免疫学的に交差反応する別の
分子（抗原）に対して免疫することによりＩＤＤＭが誘
導されることが発見された。しかし有効なアジュバント
は用いないで、好ましくは寛容誘導性担体とともに、こ
のような抗原をワクチン接種すると、該抗原に対する特
異的寛容を作り出すことができる。これによりＩＤＤＭ
に対する自己免疫反応に対する耐性を作り出すことがで
きる。このような抗原（減弱化されているか無毒性の
型、又は処理して抗原性を改良した後のもの）、又はそ
の断片又は活性画分に特異的なＴ細胞によるワクチン接
種の場合も同じことが言える。もし患者がＩＤＤＭの前
臨床的な発生段階にあれば、このような抗原又はＴ細胞
（又は画分）を注射することにより、この抗原に対する
寛容を作り出すことができ、重症の永久的な障害が与え
られる前に自己免疫過程を阻止することができる。
【００１１】
【発明の実施の形態】以下の実施例により、本発明の具
体的な態様と本発明に関連する実験を示す。これらは例
示のために示すのみであり、非限定的に記載されてい
る。
体的な態様と本発明に関連する実験を示す。これらは例
示のために示すのみであり、非限定的に記載されてい
る。
【００１２】
【実施例】実施例１： MT hsp６５分子の産生 マイコバクテリウムテューバーキュローシス (Mycobact
e-rium tuberculosis)の hsp分子を標準的方法で大腸菌
(E.coli)にトランスフェクションし、バン・エデン（va
n Eden) ら、ネーチャー (Nature) 第３３１巻、１７１
−１７３頁（1988年）に記載の方法により精製した。こ
のように遺伝子操作した大腸菌細胞は大量のMT hsp６５
分子を産生するであろう。種々の供給源からの hspは密
接な相同性があるため、遺伝子工学又は細胞からの単離
により産生される場合、哺乳類又はヒト由来の hsp６５
でも有効である。
e-rium tuberculosis)の hsp分子を標準的方法で大腸菌
(E.coli)にトランスフェクションし、バン・エデン（va
n Eden) ら、ネーチャー (Nature) 第３３１巻、１７１
−１７３頁（1988年）に記載の方法により精製した。こ
のように遺伝子操作した大腸菌細胞は大量のMT hsp６５
分子を産生するであろう。種々の供給源からの hspは密
接な相同性があるため、遺伝子工学又は細胞からの単離
により産生される場合、哺乳類又はヒト由来の hsp６５
でも有効である。
【００１３】実施例２： MT hsp６５に対する抗体の産
生 標準的な実験室種のウサギ（ニュージーランドホワイ
ト）の背中に、０５mlの無機油中に乳化させた０５mlの
生理食塩水（不完全アジュバント）中の、実施例１に従
い産生させたMT hsp６５の１００μｇを皮下注射した。
１月後１０ml生理食塩水中の１００μｇのMT hsp６５分
子でウサギを追加免疫し、２週間後にウサギから血液を
とり血清を採取した。２月後同様にしてウサギに追加免
疫をして、もう一度血液を取った。この血清抗体を使用
して、試験動物及びヒトの血液及び尿中の hsp６５を検
出した。
生 標準的な実験室種のウサギ（ニュージーランドホワイ
ト）の背中に、０５mlの無機油中に乳化させた０５mlの
生理食塩水（不完全アジュバント）中の、実施例１に従
い産生させたMT hsp６５の１００μｇを皮下注射した。
１月後１０ml生理食塩水中の１００μｇのMT hsp６５分
子でウサギを追加免疫し、２週間後にウサギから血液を
とり血清を採取した。２月後同様にしてウサギに追加免
疫をして、もう一度血液を取った。この血清抗体を使用
して、試験動物及びヒトの血液及び尿中の hsp６５を検
出した。
【００１４】実施例３： hsp６５の測定 標準的固相ラジオイムノアッセイを用いて hsp６５分子
の存在を検出した。やわらかいＰＶＣマイクロタイター
プレートを１００μｌの試験血清又は尿で４℃で１８時
間被覆し、リン酸緩衝化生理食塩水（ＰＢＳ）で洗浄し
た。次に対照ウサギ血清又は抗 hsp６５血清（実施例２
に従い産生した）を、ＰＢＳ＋０１％ウシ血清アルブミ
ン（ＢＳＡ）で１：１００希釈し、各ウェルに５０μｌ
添加し、３７℃で２−３時間インキュベートした。次に
ウェルをＰＢＳで３回洗浄した。125Ｉ−ヤギ抗ウサギ
免疫グロブリンを100,000CPM／ウェルで添加し、ウェル
を３７℃で２時間維持した。次にプレートをＰＢＳで４
回洗浄し、乾燥させ、ウェルをガンマカウンター中で計
測した。抗 hsp６５血清で得られた値で、標準ウサギ血
清で得られた平均値ＣＰＭ＋２Ｓ. Ｄ. を越えるもの
を、 hsp６５の存在について陽性とした。
の存在を検出した。やわらかいＰＶＣマイクロタイター
プレートを１００μｌの試験血清又は尿で４℃で１８時
間被覆し、リン酸緩衝化生理食塩水（ＰＢＳ）で洗浄し
た。次に対照ウサギ血清又は抗 hsp６５血清（実施例２
に従い産生した）を、ＰＢＳ＋０１％ウシ血清アルブミ
ン（ＢＳＡ）で１：１００希釈し、各ウェルに５０μｌ
添加し、３７℃で２−３時間インキュベートした。次に
ウェルをＰＢＳで３回洗浄した。125Ｉ−ヤギ抗ウサギ
免疫グロブリンを100,000CPM／ウェルで添加し、ウェル
を３７℃で２時間維持した。次にプレートをＰＢＳで４
回洗浄し、乾燥させ、ウェルをガンマカウンター中で計
測した。抗 hsp６５血清で得られた値で、標準ウサギ血
清で得られた平均値ＣＰＭ＋２Ｓ. Ｄ. を越えるもの
を、 hsp６５の存在について陽性とした。
【００１５】実施例４： 抗 hsp６５抗体の測定 hsp６５の抗体を同様にして検出した。ただしプレート
に結合した抗原は血清又は尿ではなく、実施例１に従い
産生した精製MT hsp６５の５μm ／ウェルである。抗 h
sp６５抗体について試験すべき血清は１：５０に希釈さ
れる。尿は希釈しない。 hsp６５を含むウェルに血清又
は尿を添加し、マウスの試料については放射標識ヤギ抗
マウス免疫グロブリンを使用し、ヒトの試料については
ヤギ抗ヒト免疫グロブリンを使用して、 hsp６５に結合
している抗体の存在を検出した。残りの測定は実施例３
に記載したように実施する。健康なマウス、ラット又は
ヒトの対照血清で得られた平均ＣＰＭ＋２Ｓ. Ｄ. より
大きいＣＰＭを陽性と定義した。
に結合した抗原は血清又は尿ではなく、実施例１に従い
産生した精製MT hsp６５の５μm ／ウェルである。抗 h
sp６５抗体について試験すべき血清は１：５０に希釈さ
れる。尿は希釈しない。 hsp６５を含むウェルに血清又
は尿を添加し、マウスの試料については放射標識ヤギ抗
マウス免疫グロブリンを使用し、ヒトの試料については
ヤギ抗ヒト免疫グロブリンを使用して、 hsp６５に結合
している抗体の存在を検出した。残りの測定は実施例３
に記載したように実施する。健康なマウス、ラット又は
ヒトの対照血清で得られた平均ＣＰＭ＋２Ｓ. Ｄ. より
大きいＣＰＭを陽性と定義した。
【００１６】実施例５： hsp６５分子と抗 hsp抗体は
ＩＤＤＭの進行を発症前に検出するＮＯＤマウス １４匹の雌のＮＯＤマウスから、生後２１日目から一定
の間隔で約２００日間採血し、ＩＤＤＭの進行について
点数をつけた。 hsp６５、抗 hsp６５、抗インスリン抗
体、そしてＤＭイディオタイプに対す抗イディオタイプ
抗体について、血清を試験した。実施例３の測定法を使
用して hsp６５を試験した。抗 hsp６５の存在は実施例
４に記載の方法に従い測定した。抗インスリン抗体は、
インスリンのリセプター結合部位を認識するイディオタ
イプ抗体であり、時にＤＭ−イディオタイプ抗体と称す
る。本明細書の譲受人の所有する米国特許出願第07／29
5,401 号では、患者の血清又は尿中にＤＭ−イディオタ
イプ抗体又は抗ＤＭ−イディオタイプ抗体が存在するこ
とは発生段階ＩＤＤＭ又は活性なＩＤＤＭが陽性である
兆候であることが開示されている。このような抗体は、
健常患者の血清又は尿中には存在しない。抗インスリン
抗体及び抗イディオタイプ抗体の測定に使用した方法
は、上記出願第07／295,401 号に記載されているもので
あり、その内容は参考のため本明細書に引用されてい
る。
ＩＤＤＭの進行を発症前に検出するＮＯＤマウス １４匹の雌のＮＯＤマウスから、生後２１日目から一定
の間隔で約２００日間採血し、ＩＤＤＭの進行について
点数をつけた。 hsp６５、抗 hsp６５、抗インスリン抗
体、そしてＤＭイディオタイプに対す抗イディオタイプ
抗体について、血清を試験した。実施例３の測定法を使
用して hsp６５を試験した。抗 hsp６５の存在は実施例
４に記載の方法に従い測定した。抗インスリン抗体は、
インスリンのリセプター結合部位を認識するイディオタ
イプ抗体であり、時にＤＭ−イディオタイプ抗体と称す
る。本明細書の譲受人の所有する米国特許出願第07／29
5,401 号では、患者の血清又は尿中にＤＭ−イディオタ
イプ抗体又は抗ＤＭ−イディオタイプ抗体が存在するこ
とは発生段階ＩＤＤＭ又は活性なＩＤＤＭが陽性である
兆候であることが開示されている。このような抗体は、
健常患者の血清又は尿中には存在しない。抗インスリン
抗体及び抗イディオタイプ抗体の測定に使用した方法
は、上記出願第07／295,401 号に記載されているもので
あり、その内容は参考のため本明細書に引用されてい
る。
【００１７】ＮＯＤマウスのうち１０匹はＩＤＤＭを発
症し、４匹はＩＤＤＭにならなかった。図１は、ＩＤＤ
Ｍを発症しなかった１匹のマウスの血清を試験した結果
であり、図２は、ＩＤＤＭを発症したマウスの１匹の血
清を試験した結果を示す。ここからＩＤＤＭのないマウ
スに比較して、ＩＤＤＭを発症したマウスは８５日目か
ら始まって生後１８５日目に著しく高濃度の hsp６５を
示していることがわかる。実際にＩＤＤＭが発症してか
らは hsp６５濃度は減少した。抗 hsp６５抗体は hsp６
５出現の数週間後に現れた。抗インスリン及び抗イディ
オタイプ (ＤＭ) 抗体はそれよりさらに後に現れた。従
って hsp６５と抗 hsp６５は臨床的ＩＤＤＭより先行し
ており、発症前の疾患の進行の早期指標として有用であ
った。表１は、１４匹の各マウスのデータを累積したも
のである。
症し、４匹はＩＤＤＭにならなかった。図１は、ＩＤＤ
Ｍを発症しなかった１匹のマウスの血清を試験した結果
であり、図２は、ＩＤＤＭを発症したマウスの１匹の血
清を試験した結果を示す。ここからＩＤＤＭのないマウ
スに比較して、ＩＤＤＭを発症したマウスは８５日目か
ら始まって生後１８５日目に著しく高濃度の hsp６５を
示していることがわかる。実際にＩＤＤＭが発症してか
らは hsp６５濃度は減少した。抗 hsp６５抗体は hsp６
５出現の数週間後に現れた。抗インスリン及び抗イディ
オタイプ (ＤＭ) 抗体はそれよりさらに後に現れた。従
って hsp６５と抗 hsp６５は臨床的ＩＤＤＭより先行し
ており、発症前の疾患の進行の早期指標として有用であ
った。表１は、１４匹の各マウスのデータを累積したも
のである。
【００１８】
【表１】
【００１９】発症したマウスにおいて発症の平均年齢は
１５０５日であった。 hsp６５血清試験の平均はＩＤＤ
Ｍの７２５日前に陽性であり、抗 hsp６５試験の平均は
ＩＤＤＭの４４日前に陽性であった。抗インスリンと抗
イディオタイプ抗体は、平均してＩＤＤＭのわずか２９
日と１９日前に陽性であった。従って、 hsp６５と抗hs
p６５は最終的にＩＤＤＭになるか否かの比較的早期の
指標である。約１００日例のＮＯＤマウスの hsp６５の
存在について尿を試験した。表２はＩＤＤＭを発症した
マウスでは、試験したマウスの尿は陽性であったことを
示している。
１５０５日であった。 hsp６５血清試験の平均はＩＤＤ
Ｍの７２５日前に陽性であり、抗 hsp６５試験の平均は
ＩＤＤＭの４４日前に陽性であった。抗インスリンと抗
イディオタイプ抗体は、平均してＩＤＤＭのわずか２９
日と１９日前に陽性であった。従って、 hsp６５と抗hs
p６５は最終的にＩＤＤＭになるか否かの比較的早期の
指標である。約１００日例のＮＯＤマウスの hsp６５の
存在について尿を試験した。表２はＩＤＤＭを発症した
マウスでは、試験したマウスの尿は陽性であったことを
示している。
【００２０】
【表２】
【００２１】ＢＢラット 表３は、ＩＤＤＭを発症しなかったＢＢラットは血清又
は尿に hsp６５又は抗hsp６５が出現しなかったことを
示す。ＩＤＤＭが発症（９０−１００日目）したラット
は、ＩＤＤＭの発症の１０から２０日前に試験したと
き、陽性であった。測定は実施例３と４に開示された方
法で実施した。
は尿に hsp６５又は抗hsp６５が出現しなかったことを
示す。ＩＤＤＭが発症（９０−１００日目）したラット
は、ＩＤＤＭの発症の１０から２０日前に試験したと
き、陽性であった。測定は実施例３と４に開示された方
法で実施した。
【００２２】
【表３】
【００２３】ヒトＩＤＤＭ患者 ＩＤＤＭを発症する前の種々の時期に５人の患者から血
清を入手した。これらのヒトは既知のＩＤＤＭ患者の第
１親等の親類であり、ＩＤＤＭを発症する危険があると
考えられたので、ＩＤＤＭの発症の１／２から２年前に
血清を採取した。これらの人以外に新たにＩＤＤＭと診
断された４人の患者の血清又は尿について hsp６５を調
べた。対照血清及び尿は、１０人の活動性多発性硬化症
患者と、ＩＤＤＭに関係のない種々の病気で一般病院に
いる３５人の小児から得た。その結果を表４に示す。測
定は実施例３と４に記載の方法に従い実施した。
清を入手した。これらのヒトは既知のＩＤＤＭ患者の第
１親等の親類であり、ＩＤＤＭを発症する危険があると
考えられたので、ＩＤＤＭの発症の１／２から２年前に
血清を採取した。これらの人以外に新たにＩＤＤＭと診
断された４人の患者の血清又は尿について hsp６５を調
べた。対照血清及び尿は、１０人の活動性多発性硬化症
患者と、ＩＤＤＭに関係のない種々の病気で一般病院に
いる３５人の小児から得た。その結果を表４に示す。測
定は実施例３と４に記載の方法に従い実施した。
【００２４】
【表４】
【００２５】前ＩＤＤＭ患者の５人のうち４人とＩＤＤ
Ｍ患者のうち４人のうち２人は、hHSP６５と抗hHSP６５
測定で陽性であることが上の表からわかる。対照で陽性
のものはいない。従ってＭＴの hsp６５に対するウサギ
の抗 hsp６５は、ＩＤＤＭの発症に関連するヒトの血清
又は尿中のhHSP６５を検出することができる。さらにＭ
Ｔの hsp６５はヒト抗体を検出できる。前述したよう
に、ヒト又は他の供給源から得られた hsp６５と同様
に、ヒト又は他の供給源の hsp６５に対して作成された
抗体もまた、これらの測定に使用できる。生物の進化の
過程で hsp６５は高い保存性を有しているため、これが
可能なのである。
Ｍ患者のうち４人のうち２人は、hHSP６５と抗hHSP６５
測定で陽性であることが上の表からわかる。対照で陽性
のものはいない。従ってＭＴの hsp６５に対するウサギ
の抗 hsp６５は、ＩＤＤＭの発症に関連するヒトの血清
又は尿中のhHSP６５を検出することができる。さらにＭ
Ｔの hsp６５はヒト抗体を検出できる。前述したよう
に、ヒト又は他の供給源から得られた hsp６５と同様
に、ヒト又は他の供給源の hsp６５に対して作成された
抗体もまた、これらの測定に使用できる。生物の進化の
過程で hsp６５は高い保存性を有しているため、これが
可能なのである。
【００２６】前ＩＤＤＭ患者と新ＩＤＤＭ患者のすべて
が陽性ではなかったことは、図２に記載したようにＩＤ
ＤＭの実際の発症時又はその近辺の時期には、hHSP６５
と抗hHSP６５の濃度は減少しがちであるという事実から
説明できる。従ってこれらの陰性の患者は、ＩＤＤＭの
発症の時期に近い時に試験されたために、陽性が消失し
ているのかも知れない。上記より、ヒト患者ではＩＤＤ
Ｍの発症の少し前にhHSP６５（又はこれと交差反応する
分子）又は抗hHSP６５は陽性になることが明らかであ
る。従ってhHSP６５又は抗hHSP６５の測定は、ＩＤＤＭ
が進行しているかも知れない人たちをスクリーニングす
るのに有効である。
が陽性ではなかったことは、図２に記載したようにＩＤ
ＤＭの実際の発症時又はその近辺の時期には、hHSP６５
と抗hHSP６５の濃度は減少しがちであるという事実から
説明できる。従ってこれらの陰性の患者は、ＩＤＤＭの
発症の時期に近い時に試験されたために、陽性が消失し
ているのかも知れない。上記より、ヒト患者ではＩＤＤ
Ｍの発症の少し前にhHSP６５（又はこれと交差反応する
分子）又は抗hHSP６５は陽性になることが明らかであ
る。従ってhHSP６５又は抗hHSP６５の測定は、ＩＤＤＭ
が進行しているかも知れない人たちをスクリーニングす
るのに有効である。
【００２７】ＩＤＤＭが進行しているヒトの血清又は尿
に現れるhHSP６５はいくつかの起源に由来するであろ
う。その起源は、健常なベータ細胞に普通に発現され、
このベータ細胞がウイルス感染や毒性の攻撃を受けた時
免疫学的また破壊の前兆として放出されるhHSP６５かも
知れないし、又は免疫学的破壊のストレスによりベータ
細胞から放出されるのかも知れない。hHSP６５はまたベ
ータ細胞に対する長期の活性のある時期に、免疫系の細
胞により発現されるかも知れない。この系におけるhHSP
６５の起源は現在明らかではないが、いったんhHSP６５
が放出されると、その人は刺激されてhHSP６５分子に対
する抗体を作り出す。
に現れるhHSP６５はいくつかの起源に由来するであろ
う。その起源は、健常なベータ細胞に普通に発現され、
このベータ細胞がウイルス感染や毒性の攻撃を受けた時
免疫学的また破壊の前兆として放出されるhHSP６５かも
知れないし、又は免疫学的破壊のストレスによりベータ
細胞から放出されるのかも知れない。hHSP６５はまたベ
ータ細胞に対する長期の活性のある時期に、免疫系の細
胞により発現されるかも知れない。この系におけるhHSP
６５の起源は現在明らかではないが、いったんhHSP６５
が放出されると、その人は刺激されてhHSP６５分子に対
する抗体を作り出す。
【００２８】分子量64,000の規定されていない分子に対
する抗体は、バエケスコフ（Baekeskov)ら、ネーチャー
(Nature) 第２９８巻、１６７−１６８頁（1982年）に
より、数人の新たに診断されたＩＤＤＭ患者に記載され
ている。しかしこの６４キロダルトンの抗原が hspであ
るか否かは不明である。さらに３４キロダルトン抗原
は、ＩＤＤＭの発症の前に血液又は尿に現れることは知
られていない。この規定されていない６４キロダルトン
ベータ細胞抗原に対して、 hsp６５はアミノ酸配列が公
知の規定された蛋白である（トーレ（Thole)ら、インフ
ェクション・アンド・イミュニティー (Infection and
Immunity) 第５５巻、１４６６−１４７５頁（1987
年））。同様に、hHSP６５のアミノ酸配列は、図３に示
されている。
する抗体は、バエケスコフ（Baekeskov)ら、ネーチャー
(Nature) 第２９８巻、１６７−１６８頁（1982年）に
より、数人の新たに診断されたＩＤＤＭ患者に記載され
ている。しかしこの６４キロダルトンの抗原が hspであ
るか否かは不明である。さらに３４キロダルトン抗原
は、ＩＤＤＭの発症の前に血液又は尿に現れることは知
られていない。この規定されていない６４キロダルトン
ベータ細胞抗原に対して、 hsp６５はアミノ酸配列が公
知の規定された蛋白である（トーレ（Thole)ら、インフ
ェクション・アンド・イミュニティー (Infection and
Immunity) 第５５巻、１４６６−１４７５頁（1987
年））。同様に、hHSP６５のアミノ酸配列は、図３に示
されている。
【００２９】実施例６： C57BL/Ksj 株の雄のマウスの
研究 ４０mg／kg／日の投与量のベータ細胞毒ストレプトゾト
シン（streptozotocin) を５日間連続で接種すると、C5
7BL/ksj マウスは約２週間後にＩＤＤＭを発症する。こ
の実験では、１０匹の雄のC57BL/ksj マウス（３月齢）
の群に、ＩＤＤＭを誘発する（約１４日目）ために低投
与量のストレプトゾトシン注射（４０mg／kg／日×５）
をしたか又はしなかった。そしてＩＤＤＭの発症（２５
０mg％より高い血中グルコース）と血中の hsp６５と抗
hsp６５の出現について調べた。表５に示すように、１
０日目（ＩＤＤＭの臨床症状の現れる前）までに hsp６
５が出現し、次に抗 hsp６５が出現した。
研究 ４０mg／kg／日の投与量のベータ細胞毒ストレプトゾト
シン（streptozotocin) を５日間連続で接種すると、C5
7BL/ksj マウスは約２週間後にＩＤＤＭを発症する。こ
の実験では、１０匹の雄のC57BL/ksj マウス（３月齢）
の群に、ＩＤＤＭを誘発する（約１４日目）ために低投
与量のストレプトゾトシン注射（４０mg／kg／日×５）
をしたか又はしなかった。そしてＩＤＤＭの発症（２５
０mg％より高い血中グルコース）と血中の hsp６５と抗
hsp６５の出現について調べた。表５に示すように、１
０日目（ＩＤＤＭの臨床症状の現れる前）までに hsp６
５が出現し、次に抗 hsp６５が出現した。
【００３０】
【表５】
【００３１】実施例７： マイコバクテリウムの hsp６
５に交差反応性のある多種の齧歯類の分子 マイコバクテリウムの hsp６５に認識される哺乳類の分
子を同定するために、上記のウサギの抗 hsp６５抗血清
と、ＴＢ７８と命名されたモノクローナル抗体を使用し
た。この抗体は、エム・アール・シー結核ユニット（MR
C TuberculosisUnit) 、ハマースミス病院 (Hammersmit
h Hospital) 、ロンドン、のジェイ・イバニイ（J. Iva
nyi)博士に開発され、供給されたものである。この抗体
はマイコバクテリウムテューバーキュローシス (M. tub
eculosis) の hsp６５分子に対して特異的である。これ
らの抗体の結合に対して３種類の調製物を測定した：
クローン化したマイコバクテリウムテューバーキュロー
シス（M. tubeculosis) のhsp６５；ＩＤＤＭを発症し
ているＮＯＤマウスと健常な対照の血清；そして熱ショ
ックで処理したラットの繊維芽細胞溶解物と対照の繊維
芽細胞溶解物。
５に交差反応性のある多種の齧歯類の分子 マイコバクテリウムの hsp６５に認識される哺乳類の分
子を同定するために、上記のウサギの抗 hsp６５抗血清
と、ＴＢ７８と命名されたモノクローナル抗体を使用し
た。この抗体は、エム・アール・シー結核ユニット（MR
C TuberculosisUnit) 、ハマースミス病院 (Hammersmit
h Hospital) 、ロンドン、のジェイ・イバニイ（J. Iva
nyi)博士に開発され、供給されたものである。この抗体
はマイコバクテリウムテューバーキュローシス (M. tub
eculosis) の hsp６５分子に対して特異的である。これ
らの抗体の結合に対して３種類の調製物を測定した：
クローン化したマイコバクテリウムテューバーキュロー
シス（M. tubeculosis) のhsp６５；ＩＤＤＭを発症し
ているＮＯＤマウスと健常な対照の血清；そして熱ショ
ックで処理したラットの繊維芽細胞溶解物と対照の繊維
芽細胞溶解物。
【００３２】hHSP６５は実施例１に記載の方法で調製し
た。ラットの胎児繊維芽細胞を標準的方法を使用して培
養した。熱ショック蛋白を誘導するために、繊維芽細胞
の培養物を４２５℃で２時間インキュベートし、次に３
７℃で１／２時間インキュベートした。熱ショック繊維
芽細胞と対照繊維芽細胞を３７℃で培養し、プロテアー
ゼインヒビターとともに０１％ＳＤＳと１％トリトンよ
りなる溶解緩衝液を用いて、約５×１０6個の細胞を溶
解した。ブラッドフォード（Brad ford)定量法により蛋
白濃度を２mg／mlに調製した。この物質を標準的電気泳
動法で還元条件（２％の２−メルカプトエタノール）下
で１レーンにつき１００μｇで１０％ポリアクリルアミ
ドゲルに流した。健常な対照マウスとＩＤＤＭを発症し
ているＮＯＤマウスからの血清を２mg／mlに希釈した。
これらの血清の調製物を上記したようにポリアクリルア
ミドゲル電気泳動で分離した。次に標準的方法により、
分離した蛋白をニトロセルロースペーパー上に移した。
次にペーパーを１％ヘモグロビン（ブロッキング用）と
ともに室温で１時間インキュベートした後、１：１００
希釈の正常ウサギ血清又は抗 hsp６５で、又は１：１０
０希釈のＴＢ７８又は対照モノクローナル抗体で室温で
２時間インキュベートした。125Ｉ放射標識ヤギ抗ウサ
ギ免疫グロブリン又はヤギ抗マウス免疫グロブリンでイ
ンキュベートして洗浄し、オートラジオグラフィーで現
像して、分離したバンドへの抗体の結合を検出した。分
子量標準物質も含めた。
た。ラットの胎児繊維芽細胞を標準的方法を使用して培
養した。熱ショック蛋白を誘導するために、繊維芽細胞
の培養物を４２５℃で２時間インキュベートし、次に３
７℃で１／２時間インキュベートした。熱ショック繊維
芽細胞と対照繊維芽細胞を３７℃で培養し、プロテアー
ゼインヒビターとともに０１％ＳＤＳと１％トリトンよ
りなる溶解緩衝液を用いて、約５×１０6個の細胞を溶
解した。ブラッドフォード（Brad ford)定量法により蛋
白濃度を２mg／mlに調製した。この物質を標準的電気泳
動法で還元条件（２％の２−メルカプトエタノール）下
で１レーンにつき１００μｇで１０％ポリアクリルアミ
ドゲルに流した。健常な対照マウスとＩＤＤＭを発症し
ているＮＯＤマウスからの血清を２mg／mlに希釈した。
これらの血清の調製物を上記したようにポリアクリルア
ミドゲル電気泳動で分離した。次に標準的方法により、
分離した蛋白をニトロセルロースペーパー上に移した。
次にペーパーを１％ヘモグロビン（ブロッキング用）と
ともに室温で１時間インキュベートした後、１：１００
希釈の正常ウサギ血清又は抗 hsp６５で、又は１：１０
０希釈のＴＢ７８又は対照モノクローナル抗体で室温で
２時間インキュベートした。125Ｉ放射標識ヤギ抗ウサ
ギ免疫グロブリン又はヤギ抗マウス免疫グロブリンでイ
ンキュベートして洗浄し、オートラジオグラフィーで現
像して、分離したバンドへの抗体の結合を検出した。分
子量標準物質も含めた。
【００３３】抗 hsp６５によりいくつかのバンドが検出
されることが見いだされた。マイコバクテリウム hsp６
５はウサギ抗血清とモノクローナル抗体ＴＢ６８の両方
により検出された。これらの抗体はまた、熱ショック後
に発現が増強された齧歯類の繊維芽細胞中の６５キロダ
ルトンのバンドを認識した。加熱した繊維芽細胞溶解物
では、３０キロダルトンと４７キロダルトンに陽性のバ
ンドがあった。ＩＤＤＭを発症しているＮＯＤマウスの
血清中に約２５キロダルトンに追加のバンドが検出され
た。従って哺乳類の６５キロダルトン、４７キロダルト
ン、３０キロダルトン、２５キロダルトンの分子はマイ
コバクテリウムの hsp６５と交差反応性がある。
されることが見いだされた。マイコバクテリウム hsp６
５はウサギ抗血清とモノクローナル抗体ＴＢ６８の両方
により検出された。これらの抗体はまた、熱ショック後
に発現が増強された齧歯類の繊維芽細胞中の６５キロダ
ルトンのバンドを認識した。加熱した繊維芽細胞溶解物
では、３０キロダルトンと４７キロダルトンに陽性のバ
ンドがあった。ＩＤＤＭを発症しているＮＯＤマウスの
血清中に約２５キロダルトンに追加のバンドが検出され
た。従って哺乳類の６５キロダルトン、４７キロダルト
ン、３０キロダルトン、２５キロダルトンの分子はマイ
コバクテリウムの hsp６５と交差反応性がある。
【００３４】実施例８： hHSP６５は膵臓のランゲルハ
ンス島で発現される ＩＤＤＭの進行には血液や尿中の hsp６５の発現の上昇
が伴うため、ランゲルハンス島のベータ細胞が hsp６５
の供給源かも知れないと考えられた。この理論を試験す
るために、抗 hsp６５がランゲルハンス島細胞に結合す
るか否かを調べるために試験した。標準的方法を使用し
てラットの膵臓の凍結切片（厚さ６−８μ）を作成し
た。切片に１：５０希釈した正常ウサギ血清又は抗 hsp
６５抗血清（非特異的抗体を除去するために肝臓粉末で
吸収されている）を重層し、室温で３０分間インキュベ
ートし、ＰＢＳで完全に洗浄し、次に５％正常ヤギ血清
で５分間インキュベートした後、フルオレセイン標識ヤ
ギ抗ウサギ免疫グロブリンで室温で３０分間インキュベ
ートし、ＰＢＳで洗浄し、螢光顕微鏡で調べた。ランゲ
ルハンス島は抗hsp６５抗血清で明るく染色されていた
が、対照ウサギ血清は染色されなかった。従ってランゲ
ルハンス島は hsp６５を発現する。
ンス島で発現される ＩＤＤＭの進行には血液や尿中の hsp６５の発現の上昇
が伴うため、ランゲルハンス島のベータ細胞が hsp６５
の供給源かも知れないと考えられた。この理論を試験す
るために、抗 hsp６５がランゲルハンス島細胞に結合す
るか否かを調べるために試験した。標準的方法を使用し
てラットの膵臓の凍結切片（厚さ６−８μ）を作成し
た。切片に１：５０希釈した正常ウサギ血清又は抗 hsp
６５抗血清（非特異的抗体を除去するために肝臓粉末で
吸収されている）を重層し、室温で３０分間インキュベ
ートし、ＰＢＳで完全に洗浄し、次に５％正常ヤギ血清
で５分間インキュベートした後、フルオレセイン標識ヤ
ギ抗ウサギ免疫グロブリンで室温で３０分間インキュベ
ートし、ＰＢＳで洗浄し、螢光顕微鏡で調べた。ランゲ
ルハンス島は抗hsp６５抗血清で明るく染色されていた
が、対照ウサギ血清は染色されなかった。従ってランゲ
ルハンス島は hsp６５を発現する。
【００３５】実施例９： hspに対する免疫はＩＤＤＭ
を誘発する ランゲルハンス島は hsp６５を発現することがわかった
ため、抗 hsp免疫応答はベータ細胞に障害を与え従って
ＩＤＤＭを誘発するかも知れないと仮定された。雄のC5
7BL/ksj マウス（８週齢）又は雌のＮＯＤマウス（４５
週齢）の腹腔内に、５０μｇの hsp６５を注射し、ＩＤ
ＤＭを発症するか否かを試験した（２５０mg％より多い
血中グルコースで証明される）。４５週齢でＮＯＤマウ
スは自然発生ＩＤＤＭより少なくとも３カ月早かった。
C57BL/ksj マウスは自然発生ＩＤＤＭはなかった。 hsp
６５を油又はＰＢＳで乳化して投与した。油に乳化した
ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）を対照として使用した。
その結果を表６に示す。油中の hsp６５はＩＤＤＭを誘
発するがＰＢＳ中の hsp６５はＩＤＤＭを誘発しないこ
とがわかった。従っておそらくベータ細胞は hsp６５と
交差反応する抗原を発現するため、 hsp６５に対する免
疫応答はＩＤＤＭ発症の引金となる。
を誘発する ランゲルハンス島は hsp６５を発現することがわかった
ため、抗 hsp免疫応答はベータ細胞に障害を与え従って
ＩＤＤＭを誘発するかも知れないと仮定された。雄のC5
7BL/ksj マウス（８週齢）又は雌のＮＯＤマウス（４５
週齢）の腹腔内に、５０μｇの hsp６５を注射し、ＩＤ
ＤＭを発症するか否かを試験した（２５０mg％より多い
血中グルコースで証明される）。４５週齢でＮＯＤマウ
スは自然発生ＩＤＤＭより少なくとも３カ月早かった。
C57BL/ksj マウスは自然発生ＩＤＤＭはなかった。 hsp
６５を油又はＰＢＳで乳化して投与した。油に乳化した
ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）を対照として使用した。
その結果を表６に示す。油中の hsp６５はＩＤＤＭを誘
発するがＰＢＳ中の hsp６５はＩＤＤＭを誘発しないこ
とがわかった。従っておそらくベータ細胞は hsp６５と
交差反応する抗原を発現するため、 hsp６５に対する免
疫応答はＩＤＤＭ発症の引金となる。
【００３６】
【表６】
【００３７】追加の実験で正常な株のマウス（これはＮ
ＯＤマウスのようにＩＤＤＭを自然発症せず、C57BL/ks
j のように低投与量ストレプトゾトシン投与後でもＩＤ
ＤＭを発症しない）に、５０μｇの抗原、不完全フロイ
ントアジュバント（油）で乳化した hsp６５又はウシ血
清アルブミン（ＢＳＡ）を腹腔内投与した。１９日後の
朝にマウスから採血し、血中グルコースを測定した。２
００mg％を越えるグルコース濃度によりＩＤＤＭを診断
した。その結果を表７に示す。 hsp６５による免疫は、
特に適当な投与量で投与した場合、一見正常な系統のマ
ウスでもＩＤＤＭを誘発することができる。これは、hs
p ６５又は hsp６５と免疫学的に交差反応する分子はＩ
ＤＤＭの標的抗原であるという結論を支持している。
ＯＤマウスのようにＩＤＤＭを自然発症せず、C57BL/ks
j のように低投与量ストレプトゾトシン投与後でもＩＤ
ＤＭを発症しない）に、５０μｇの抗原、不完全フロイ
ントアジュバント（油）で乳化した hsp６５又はウシ血
清アルブミン（ＢＳＡ）を腹腔内投与した。１９日後の
朝にマウスから採血し、血中グルコースを測定した。２
００mg％を越えるグルコース濃度によりＩＤＤＭを診断
した。その結果を表７に示す。 hsp６５による免疫は、
特に適当な投与量で投与した場合、一見正常な系統のマ
ウスでもＩＤＤＭを誘発することができる。これは、hs
p ６５又は hsp６５と免疫学的に交差反応する分子はＩ
ＤＤＭの標的抗原であるという結論を支持している。
【００３８】
【表７】
【００３９】実施例１０： HSP６５はＩＤＤＭの誘発
に対する耐性を誘導できる 有効なアジュバントなしで、又は免疫学的寛容誘導性担
体を用いて抗原を投与すると、免疫学的非応答性（即ち
抗原に対する特異的寛容）を誘導することができること
は充分確立されている。従ってＰＢＳ中の hsp６５を注
射したマウスが、油中の hsp６５により誘導されたＩＤ
ＤＭに対する耐性を獲得したか否かを調べるため試験し
た。ＰＢＳ中の hsp６５を受けた後１月後に、C57BL/ks
j マウスに油中 hsp６５を投与したが、どのマウスも３
週間後にＩＤＤＭは発症しなかった（血中グルコース濃
度が２５０mg％を越えることにより判定した）。これに
対してＰＢＳ中の hsp６５を受けた１０匹の対照マウス
のうち８匹が、油中 hsp６５を受けた後にＩＤＤＭを発
症した。別の実験で３０週齢の雌のＮＯＤマウスにＰＢ
Ｓ中の hsp６５を腹腔内投与した後、ＩＤＤＭを誘発す
るために１５日後に５０μｇの油中 hsp６５を投与し
た。ＩＤＤＭの存在は投与後３５日目の血中グルコース
が２００mg％を越えることにより測定した。マウスが５
月齢になったときもう一度ＩＤＤＭの存在を測定した。
この年齢ではすべての未処理の雌のＮＯＤマウスのうち
５０％でＩＤＤＭが検出されることがわかっている。結
果を表８に示す。
に対する耐性を誘導できる 有効なアジュバントなしで、又は免疫学的寛容誘導性担
体を用いて抗原を投与すると、免疫学的非応答性（即ち
抗原に対する特異的寛容）を誘導することができること
は充分確立されている。従ってＰＢＳ中の hsp６５を注
射したマウスが、油中の hsp６５により誘導されたＩＤ
ＤＭに対する耐性を獲得したか否かを調べるため試験し
た。ＰＢＳ中の hsp６５を受けた後１月後に、C57BL/ks
j マウスに油中 hsp６５を投与したが、どのマウスも３
週間後にＩＤＤＭは発症しなかった（血中グルコース濃
度が２５０mg％を越えることにより判定した）。これに
対してＰＢＳ中の hsp６５を受けた１０匹の対照マウス
のうち８匹が、油中 hsp６５を受けた後にＩＤＤＭを発
症した。別の実験で３０週齢の雌のＮＯＤマウスにＰＢ
Ｓ中の hsp６５を腹腔内投与した後、ＩＤＤＭを誘発す
るために１５日後に５０μｇの油中 hsp６５を投与し
た。ＩＤＤＭの存在は投与後３５日目の血中グルコース
が２００mg％を越えることにより測定した。マウスが５
月齢になったときもう一度ＩＤＤＭの存在を測定した。
この年齢ではすべての未処理の雌のＮＯＤマウスのうち
５０％でＩＤＤＭが検出されることがわかっている。結
果を表８に示す。
【００４０】
【表８】
【００４１】即ち hsp６５は糖尿病性免疫反応に対する
寛容を誘導するために使用できることがわかる。この寛
容は hsp６５の免疫学的な攻撃に対して有効なだけでな
く、ＮＯＤマウスでの自然発生ＩＤＤＭの自然の進行に
対する治療法としても有効である。
寛容を誘導するために使用できることがわかる。この寛
容は hsp６５の免疫学的な攻撃に対して有効なだけでな
く、ＮＯＤマウスでの自然発生ＩＤＤＭの自然の進行に
対する治療法としても有効である。
【００４２】実施例１１： hHSP６５を用いる発生段階
のＩＤＤＭの治療 図１０に示すように hsp６５はＩＤＤＭの自己免疫反応
に対する耐性を誘導するのに使用される。これは、外因
性 hsp６５に対する接触を通してベータ細胞のhHSP６５
に対する免疫学的寛容の機構により引き起こされるよう
である。即ちhsp ６５はＩＤＤＭが臨床的に明らかにな
る前に治療に使用することができ、重症の永久的障害が
与えられる前に自己免疫反応を阻止することができる。
この実験の結果は表８にまとめられており、ＮＯＤマウ
スにおける自然発生ＩＤＤＭの自然の進行は有意に阻止
することができ、 hsp６５（特にhHSP６５）は治療的に
使用することができる。ＮＯＤマウスでは自己免疫反応
は非常に早く始まる。１月齢ですでにインスリン炎が検
出される。この系統の雌のマウスでは５０％は５月目に
ＩＤＤＭが臨床的に明瞭になる。３０日齢のマウスに h
sp６５を投与すると、この自然の進行を阻止する。これ
はランゲルハンス島に対する自己免疫が始まった後でも
治療が有効であることを示している。
のＩＤＤＭの治療 図１０に示すように hsp６５はＩＤＤＭの自己免疫反応
に対する耐性を誘導するのに使用される。これは、外因
性 hsp６５に対する接触を通してベータ細胞のhHSP６５
に対する免疫学的寛容の機構により引き起こされるよう
である。即ちhsp ６５はＩＤＤＭが臨床的に明らかにな
る前に治療に使用することができ、重症の永久的障害が
与えられる前に自己免疫反応を阻止することができる。
この実験の結果は表８にまとめられており、ＮＯＤマウ
スにおける自然発生ＩＤＤＭの自然の進行は有意に阻止
することができ、 hsp６５（特にhHSP６５）は治療的に
使用することができる。ＮＯＤマウスでは自己免疫反応
は非常に早く始まる。１月齢ですでにインスリン炎が検
出される。この系統の雌のマウスでは５０％は５月目に
ＩＤＤＭが臨床的に明瞭になる。３０日齢のマウスに h
sp６５を投与すると、この自然の進行を阻止する。これ
はランゲルハンス島に対する自己免疫が始まった後でも
治療が有効であることを示している。
【００４３】実施例１２： hHSP６５に対するＴ細胞の
応答は糖尿病の進行に関連している 図３に示されているヒト hsp６５は通常の方法で発現の
ためにクローン化し、そこから実質的に純粋な組換えヒ
ト hsp６５が得られた。本実験は、自然発生的にベータ
細胞を破壊しているマウスはヒト hsp６５に対して反応
性のＴ細胞を明示していることを確証している。種々の
年齢の雌のNOD/Ltマウスの５から７匹の群から得られた
脾臓細胞懸濁液について、基本的にサイクグロブリンに
対するＴ細胞応答について記載された方法（アール・マ
ロン（Maron, R) ら、ジャーナルオブイミュノロジー
（J. Immunology)第１３１巻、２３１６−２３２２頁 1
983 年））に従い、Ｔ細胞の増殖について測定した。簡
単に説明すると、１×１０6細胞／mlの細胞を、５μg
／mlの以下の抗原の存在下又は欠如下で、マイクロタイ
ターウェル中の０.２mlの培養液の中で３重測定で７２
時間インキュベートした： ヒト hsp６５、MThsp６
５、又は MThsp７０。最後の１２時間のインキュベート
の間のＤＮＡへの［3Ｈ］チミジンの取り込みにより増
殖を測定した。結果はΔＣＰＭとして示す： 試験抗原
を含むウェルの平均ＣＰＭ−抗原を加えないで培養した
対照ウェルの平均ＣＰＭ±標準誤差（ＳＥ）。対照ＣＰ
Ｍは9,000 から10,500まで変化した。マウスの約５０％
でＩＤＤＭの発症は４から５月齢の間であり、図４で
「ＩＤＤＭ」として示してある。
応答は糖尿病の進行に関連している 図３に示されているヒト hsp６５は通常の方法で発現の
ためにクローン化し、そこから実質的に純粋な組換えヒ
ト hsp６５が得られた。本実験は、自然発生的にベータ
細胞を破壊しているマウスはヒト hsp６５に対して反応
性のＴ細胞を明示していることを確証している。種々の
年齢の雌のNOD/Ltマウスの５から７匹の群から得られた
脾臓細胞懸濁液について、基本的にサイクグロブリンに
対するＴ細胞応答について記載された方法（アール・マ
ロン（Maron, R) ら、ジャーナルオブイミュノロジー
（J. Immunology)第１３１巻、２３１６−２３２２頁 1
983 年））に従い、Ｔ細胞の増殖について測定した。簡
単に説明すると、１×１０6細胞／mlの細胞を、５μg
／mlの以下の抗原の存在下又は欠如下で、マイクロタイ
ターウェル中の０.２mlの培養液の中で３重測定で７２
時間インキュベートした： ヒト hsp６５、MThsp６
５、又は MThsp７０。最後の１２時間のインキュベート
の間のＤＮＡへの［3Ｈ］チミジンの取り込みにより増
殖を測定した。結果はΔＣＰＭとして示す： 試験抗原
を含むウェルの平均ＣＰＭ−抗原を加えないで培養した
対照ウェルの平均ＣＰＭ±標準誤差（ＳＥ）。対照ＣＰ
Ｍは9,000 から10,500まで変化した。マウスの約５０％
でＩＤＤＭの発症は４から５月齢の間であり、図４で
「ＩＤＤＭ」として示してある。
【００４４】NOD/LtＴ細胞の自発的反応性（spontaneou
s reactivity) の程度を種々の抗原に対して年齢の関数
として示しているこの実験の結果は、図４でグラフで示
してある。NOD/Ltマウスがインスリン炎をほとんど示さ
ないか又は全く示さない１月齢の時期は、どの抗原に対
してもＴ細胞の反応性は検出されなかった。しかし２か
ら３月齢の時期はインスリン炎の上昇とともに、ヒト h
sp６５に対しては強く上昇傾向の反応性が認められた
が、 MThsp６５に対する反応性は比較的小さくMThsp７
０に対する反応性は全くなかった。ヒト hsp６５とMT h
sp６５に対する反応性は４５月にＩＤＤＭの発症ととも
に低下し、ＩＤＤＭの臨床症状の出現した後の６月目で
もさらに低下した。従ってヒト hsp６５に対するＴ細胞
の応答は、明瞭なＩＤＤＭに先行するベータ細胞の障害
の増加に関連しているようであった。ＩＤＤＭの発症に
伴うＴ細胞の反応性の低下は、ベータ細胞とそれらの抗
原が失われることによる免疫刺激の低下により説明する
ことができる。
s reactivity) の程度を種々の抗原に対して年齢の関数
として示しているこの実験の結果は、図４でグラフで示
してある。NOD/Ltマウスがインスリン炎をほとんど示さ
ないか又は全く示さない１月齢の時期は、どの抗原に対
してもＴ細胞の反応性は検出されなかった。しかし２か
ら３月齢の時期はインスリン炎の上昇とともに、ヒト h
sp６５に対しては強く上昇傾向の反応性が認められた
が、 MThsp６５に対する反応性は比較的小さくMThsp７
０に対する反応性は全くなかった。ヒト hsp６５とMT h
sp６５に対する反応性は４５月にＩＤＤＭの発症ととも
に低下し、ＩＤＤＭの臨床症状の出現した後の６月目で
もさらに低下した。従ってヒト hsp６５に対するＴ細胞
の応答は、明瞭なＩＤＤＭに先行するベータ細胞の障害
の増加に関連しているようであった。ＩＤＤＭの発症に
伴うＴ細胞の反応性の低下は、ベータ細胞とそれらの抗
原が失われることによる免疫刺激の低下により説明する
ことができる。
【００４５】実施例１３： ヒト hsp６５に応答するＴ
細胞は糖尿病を引き起こす NOD/Lt、C57BL/6 、又はC57BL/KS株の３５月齢の雌の５
匹のマウス群から、脾臓細胞の懸濁液を得た。１群のNO
D/Ltマウス（第２群）はあらかじめ油中の５０μｇ/ ml
のMT hsp６５の腹腔内投与によりプライム（prime)して
おいた。いくつかの脾臓細胞（第４、６、８群）は、１
２５μg/mlの ConＡで４８時間インキュベートして活性
化した。 ConＡ後の細胞を ConＡを含まない増殖培地に
移し、さらに５日間培養した。実施例１２に記載したよ
うに、組換えヒト hsp６５、組換え MThsp６５又は対照
大腸菌抗原に対する、活性化一週間後の脾臓細胞の増殖
性応答について試験した。対照大腸菌は、hsp ６５遺伝
子を含まない pEX２プラスミッドでトランスフェクショ
ンした。抗原は５μｇの濃度で使用した。増殖性応答は
３重測定で行い、刺激指数（ＳＩ）として示してある：
試験抗原でインキュベートした脾臓細胞に取り込まれた
3Ｈ−チミジンの、抗原無添加の対照培養物に取り込ま
れた3Ｈ−チミジンに対する比率。対照培養物の平均Ｃ
ＰＭは5,000 − 7,000であり、平均ＣＰＭからの標準偏
差はいつも平均の１０％より小さかった。
細胞は糖尿病を引き起こす NOD/Lt、C57BL/6 、又はC57BL/KS株の３５月齢の雌の５
匹のマウス群から、脾臓細胞の懸濁液を得た。１群のNO
D/Ltマウス（第２群）はあらかじめ油中の５０μｇ/ ml
のMT hsp６５の腹腔内投与によりプライム（prime)して
おいた。いくつかの脾臓細胞（第４、６、８群）は、１
２５μg/mlの ConＡで４８時間インキュベートして活性
化した。 ConＡ後の細胞を ConＡを含まない増殖培地に
移し、さらに５日間培養した。実施例１２に記載したよ
うに、組換えヒト hsp６５、組換え MThsp６５又は対照
大腸菌抗原に対する、活性化一週間後の脾臓細胞の増殖
性応答について試験した。対照大腸菌は、hsp ６５遺伝
子を含まない pEX２プラスミッドでトランスフェクショ
ンした。抗原は５μｇの濃度で使用した。増殖性応答は
３重測定で行い、刺激指数（ＳＩ）として示してある：
試験抗原でインキュベートした脾臓細胞に取り込まれた
3Ｈ−チミジンの、抗原無添加の対照培養物に取り込ま
れた3Ｈ−チミジンに対する比率。対照培養物の平均Ｃ
ＰＭは5,000 − 7,000であり、平均ＣＰＭからの標準偏
差はいつも平均の１０％より小さかった。
【００４６】細胞のいくつかを ConＡで４８時間培養し
て活性化することにより、糖尿病を引き起こす細胞の能
力について試験した。前糖尿病性（prediabetic)の、１
月齢の雌のマウスの群の腹腔内に、２５×１０6個の何
も添加していない脾臓細胞、又は MThsp６５で刺激して
おいた、又は刺激していないマウスの ConＡで活性化し
た脾臓細胞を投与した。２１日後に高血糖症（血中グル
コース＞２００mg／dl）と組織学的インスリン炎として
現れた急性糖尿病の出現について、マウスに点数をつけ
た。大体午前９時頃に各マウスの尾静脈から血液を取
り、ジスカングルコースメーター （Discan Glucose Me
ter) と試験紙（ベーリンガーベルケ (Behringwerk
e)、西ドイツ）を使用して血中グルコース濃度を測定し
た。インスリン炎は組織的証拠により判定した（ワイズ
マンインスティテュート（Weizmann Institute) の組織
学実験室でヘマトキシリン染色とライトグリーン染色を
行った）。試験スライドがどのマウスに由来するかは明
らかにしていない人間によりインスリン炎のグレード分
類を行った。その結果を表９に示す。ヒト hsp６５に対
するNOD/Ltマウス脾臓細胞の応答と、 MThsp６５に対す
るNOD/Ltマウス脾臓細胞の応答の間の差（１−４群）
は、対照大腸菌抗原に対するNOD/Lt脾臓細胞の応答、又
は hsp６５に対する他の株の応答（５−７群）よりも有
意に大きかった（Ｐ＜0.01）（スチュデントのＴ検定を
使用： ＮＤ、測定されなかった)。
て活性化することにより、糖尿病を引き起こす細胞の能
力について試験した。前糖尿病性（prediabetic)の、１
月齢の雌のマウスの群の腹腔内に、２５×１０6個の何
も添加していない脾臓細胞、又は MThsp６５で刺激して
おいた、又は刺激していないマウスの ConＡで活性化し
た脾臓細胞を投与した。２１日後に高血糖症（血中グル
コース＞２００mg／dl）と組織学的インスリン炎として
現れた急性糖尿病の出現について、マウスに点数をつけ
た。大体午前９時頃に各マウスの尾静脈から血液を取
り、ジスカングルコースメーター （Discan Glucose Me
ter) と試験紙（ベーリンガーベルケ (Behringwerk
e)、西ドイツ）を使用して血中グルコース濃度を測定し
た。インスリン炎は組織的証拠により判定した（ワイズ
マンインスティテュート（Weizmann Institute) の組織
学実験室でヘマトキシリン染色とライトグリーン染色を
行った）。試験スライドがどのマウスに由来するかは明
らかにしていない人間によりインスリン炎のグレード分
類を行った。その結果を表９に示す。ヒト hsp６５に対
するNOD/Ltマウス脾臓細胞の応答と、 MThsp６５に対す
るNOD/Ltマウス脾臓細胞の応答の間の差（１−４群）
は、対照大腸菌抗原に対するNOD/Lt脾臓細胞の応答、又
は hsp６５に対する他の株の応答（５−７群）よりも有
意に大きかった（Ｐ＜0.01）（スチュデントのＴ検定を
使用： ＮＤ、測定されなかった)。
【００４７】
【表９】
【００４８】表９に示された結果は、ヒト hsp６５に対
する３５月齢のNOD/LtマウスのＴ細胞応答は、マウスを
NThsp６５に対して免疫することにより（２群）、又は
Ｔ細胞マイトジェンであるコンカナバリンＡ(ConＡ；４
群）でＴ細胞集団を活性化することにより増強させるこ
とができることを示している。Con Ａは、in vivo で動
物内に存在する活性化された自己免疫性Ｔ細胞を優先的
に刺激することが証明されている。従ってin vivo で M
Thsp６５に対する免疫をしたか、又は in vitro で Con
Ａで活性化したNOD/LtＴ細胞は、ヒト hsp６５に対する
本質的な応答を示す。
する３５月齢のNOD/LtマウスのＴ細胞応答は、マウスを
NThsp６５に対して免疫することにより（２群）、又は
Ｔ細胞マイトジェンであるコンカナバリンＡ(ConＡ；４
群）でＴ細胞集団を活性化することにより増強させるこ
とができることを示している。Con Ａは、in vivo で動
物内に存在する活性化された自己免疫性Ｔ細胞を優先的
に刺激することが証明されている。従ってin vivo で M
Thsp６５に対する免疫をしたか、又は in vitro で Con
Ａで活性化したNOD/LtＴ細胞は、ヒト hsp６５に対する
本質的な応答を示す。
【００４９】ヒトhHSP６５はそれ自身マイトジェンでは
ない； ＩＤＤＭを自然発症しない株 (C57BL/6(５群と
６群）又はC57BL/KS（７群と８群））の成体マウスは C
onＡ刺激によるＴ細胞反応性を示さない。最後に表９
は、in vitroでの ConＡによる抗ヒト hsp６５Ｔ細胞集
団の活性化は、１月齢の前糖尿病性のNOD/Ltマウス（２
群と４群）に急性糖尿病を移すことができることを示し
ている。
ない； ＩＤＤＭを自然発症しない株 (C57BL/6(５群と
６群）又はC57BL/KS（７群と８群））の成体マウスは C
onＡ刺激によるＴ細胞反応性を示さない。最後に表９
は、in vitroでの ConＡによる抗ヒト hsp６５Ｔ細胞集
団の活性化は、１月齢の前糖尿病性のNOD/Ltマウス（２
群と４群）に急性糖尿病を移すことができることを示し
ている。
【００５０】ヒト hsp６５と糖尿病に対するＴ細胞応答
性の関連性は表１０に示されている。表１０のデータを
出した実験では、マロン (Maron)の記載する方法（前
述）に従い、 MThsp６５( ５μｇ／ml）で脾臓細胞を繰
り返し刺激することにより、Ｔ細胞株が得られた。クロ
ーンは株細胞の限界希釈法により単離した。基本的に表
９に関して説明した方法に従い、Ｔ細胞クローンの、急
性糖尿病を移すことができる能力について試験した。た
だし５×１０6個の ConＡ活性化細胞を腹腔内に移し
た。表９について説明したよう、抗原に対するクローン
の増殖性応答はＳＩとして測定した。対照培養物のＣＰ
Ｍは4,500-6,500 CPM であり、平均ＣＰＭからの標準偏
差はいつも１０％未満であった。
性の関連性は表１０に示されている。表１０のデータを
出した実験では、マロン (Maron)の記載する方法（前
述）に従い、 MThsp６５( ５μｇ／ml）で脾臓細胞を繰
り返し刺激することにより、Ｔ細胞株が得られた。クロ
ーンは株細胞の限界希釈法により単離した。基本的に表
９に関して説明した方法に従い、Ｔ細胞クローンの、急
性糖尿病を移すことができる能力について試験した。た
だし５×１０6個の ConＡ活性化細胞を腹腔内に移し
た。表９について説明したよう、抗原に対するクローン
の増殖性応答はＳＩとして測定した。対照培養物のＣＰ
Ｍは4,500-6,500 CPM であり、平均ＣＰＭからの標準偏
差はいつも１０％未満であった。
【００５１】
【表１０】
【００５２】これらのクローンは MThsp６５又は大腸菌
対照に対するよりもヒト hsp６５に対してより激しく応
答することがわかった。さらに、クローン２７、Ｃ７、
そしてＣ９はヒト hsp６５に対して強く応答し糖尿病誘
発性であったが、ヒト hsp６５に対して比較的弱く応答
したクローン２１は糖尿病を移すことができなかった。
クローン化Ｔ細胞はただ１つの特異性を有する抗原リセ
プターを発現するため、ヒト hsp６５上のエピトープ(M
Thsp６５上のエピトープにある程度交差反応性のエピト
ープ）を認識するＴ細胞により、急性糖尿病は前糖尿病
性NOD/Ltマウスに移されると結論される。
対照に対するよりもヒト hsp６５に対してより激しく応
答することがわかった。さらに、クローン２７、Ｃ７、
そしてＣ９はヒト hsp６５に対して強く応答し糖尿病誘
発性であったが、ヒト hsp６５に対して比較的弱く応答
したクローン２１は糖尿病を移すことができなかった。
クローン化Ｔ細胞はただ１つの特異性を有する抗原リセ
プターを発現するため、ヒト hsp６５上のエピトープ(M
Thsp６５上のエピトープにある程度交差反応性のエピト
ープ）を認識するＴ細胞により、急性糖尿病は前糖尿病
性NOD/Ltマウスに移されると結論される。
【００５３】実施例１４： 毒性（virulent) Ｔ細胞は
自然発生ＩＤＤＭに対してワクチン予防をする ５−７匹の２月齢の雌のNOD/Ltマウスの群を、５０μｇ
の油中抗原の腹腔内投与によりプライムしたか、あるい
はしなかった。マウスの脾臓細胞を、実施例１３の表９
に関して説明したように抗原（５μｇ／ml）又は ConＡ
（１２５μｇ／ml）でインキュベートしたか、あるいは
しなかった。次に１月齢の前糖尿病性マウスの群の腹腔
内に細胞を移した（２５×１０6個）。実施例１３に記
載した方法で３週間後に急性糖尿病（高血糖症；血中グ
ルコース＞２００mg／dl）についてマウスを調べた。８
月齢に高血糖症とインスリン炎により自然発生ＩＤＤＭ
について検査した。この実験の結果を表１１に示す。対
照（１群）との差は有意であった。（＊Ｐ＜００１）。
数字は２−３回の実験の累積の結果である。
自然発生ＩＤＤＭに対してワクチン予防をする ５−７匹の２月齢の雌のNOD/Ltマウスの群を、５０μｇ
の油中抗原の腹腔内投与によりプライムしたか、あるい
はしなかった。マウスの脾臓細胞を、実施例１３の表９
に関して説明したように抗原（５μｇ／ml）又は ConＡ
（１２５μｇ／ml）でインキュベートしたか、あるいは
しなかった。次に１月齢の前糖尿病性マウスの群の腹腔
内に細胞を移した（２５×１０6個）。実施例１３に記
載した方法で３週間後に急性糖尿病（高血糖症；血中グ
ルコース＞２００mg／dl）についてマウスを調べた。８
月齢に高血糖症とインスリン炎により自然発生ＩＤＤＭ
について検査した。この実験の結果を表１１に示す。対
照（１群）との差は有意であった。（＊Ｐ＜００１）。
数字は２−３回の実験の累積の結果である。
【００５４】
【表１１】
【００５５】予想されたように未処理の対照マウス（１
群）は７週齢で高血糖症ではなく、８月齢では８１％に
ついて自然発生ＩＤＤＭが見られた。これに対して、脾
臓細胞をin vitroでMThs６５（２具）又は ConＡ（３
群）で活性化してあった場合は前糖尿病性マウスの脾臓
細胞を用いて急性糖尿病（血中グルコースが２００mg／
dlを越える）を移すことができた。in vivo で MThsp６
５、ＢＳＡ、 MThsp７０でプライムしてあったマウスか
ら得られた脾臓細胞を、in vitroで各抗原で活性化の後
投与した。抗 MThsp６５細胞（６群）により急性糖尿病
は誘発されたが、抗ＢＳＡ又は抗 MThsp７０細胞では活
性化されなかった（４群と５群）。ヒト hsp６５に対し
て強く応答した ConＡ及び MThsp６５活性化細胞に対し
て（表８と表９）、ＢＳＡ又は MThsp７０反応性細胞の
増殖定量では、 MThsp６５又はヒト hsp６５に対する反
応性は検出されなかった（図には示していない）。従っ
て急性糖尿病の転移は、ヒト hsp６５に応答するＴ細胞
を含有する細胞集団に特異的であった。
群）は７週齢で高血糖症ではなく、８月齢では８１％に
ついて自然発生ＩＤＤＭが見られた。これに対して、脾
臓細胞をin vitroでMThs６５（２具）又は ConＡ（３
群）で活性化してあった場合は前糖尿病性マウスの脾臓
細胞を用いて急性糖尿病（血中グルコースが２００mg／
dlを越える）を移すことができた。in vivo で MThsp６
５、ＢＳＡ、 MThsp７０でプライムしてあったマウスか
ら得られた脾臓細胞を、in vitroで各抗原で活性化の後
投与した。抗 MThsp６５細胞（６群）により急性糖尿病
は誘発されたが、抗ＢＳＡ又は抗 MThsp７０細胞では活
性化されなかった（４群と５群）。ヒト hsp６５に対し
て強く応答した ConＡ及び MThsp６５活性化細胞に対し
て（表８と表９）、ＢＳＡ又は MThsp７０反応性細胞の
増殖定量では、 MThsp６５又はヒト hsp６５に対する反
応性は検出されなかった（図には示していない）。従っ
て急性糖尿病の転移は、ヒト hsp６５に応答するＴ細胞
を含有する細胞集団に特異的であった。
【００５６】表１１は、急性糖尿病に引き続いて、８月
目に発生する自然発生ＩＤＤＭの発生率は有意に低下す
ることを示している。マウスを抗ＢＳＡ又は抗 MThsp６
５脾臓細胞でインキュベートしても、急性糖尿病も自然
発生ＩＤＤＭも誘導されなかった（４群と５群）。急性
の採用的に転移された（adoptively transferred) 糖尿
病が自然発生ＩＤＤＭを防ぐ能力も、上記（表９) の抗
hsp ６５Ｔ細胞で行った実験で見られた。３１匹のマウ
スに毒性のクローン２７、Ｃ７、Ｃ９を注射すると、す
べてが１−２週間で急性糖尿病になった。２週間以内に
これらはすべて高血糖症から自然に回復し、自然発生Ｉ
ＤＤＭを発症した３１匹のうち２匹のみが８月齢で自然
発生ＩＤＤＭを発症した。これに対して、無毒性クロー
ン２１を注射された１３匹のマウスは急性糖尿病を発症
せず、これらのマウスのうち６匹は６月目までに自然発
生糖尿病になった（Ｐ＜００１）。従って抗ヒト hsp６
５Ｔ細胞の採用的転移(adoptive trans fer)による糖尿
病は一過性である。しかしこれらのマウスは急性糖尿病
から回復しただけでなく、後の自然発生ＩＤＤＭの進行
に対して耐性を獲得した。従って前糖尿病性マウスを無
毒性Ｔ細胞に接触させるとＩＤＤＭの発症を加速した
り、症状を悪化させたりすることはなく、むしろ糖尿病
反応に対して耐性を獲得させることになる。
目に発生する自然発生ＩＤＤＭの発生率は有意に低下す
ることを示している。マウスを抗ＢＳＡ又は抗 MThsp６
５脾臓細胞でインキュベートしても、急性糖尿病も自然
発生ＩＤＤＭも誘導されなかった（４群と５群）。急性
の採用的に転移された（adoptively transferred) 糖尿
病が自然発生ＩＤＤＭを防ぐ能力も、上記（表９) の抗
hsp ６５Ｔ細胞で行った実験で見られた。３１匹のマウ
スに毒性のクローン２７、Ｃ７、Ｃ９を注射すると、す
べてが１−２週間で急性糖尿病になった。２週間以内に
これらはすべて高血糖症から自然に回復し、自然発生Ｉ
ＤＤＭを発症した３１匹のうち２匹のみが８月齢で自然
発生ＩＤＤＭを発症した。これに対して、無毒性クロー
ン２１を注射された１３匹のマウスは急性糖尿病を発症
せず、これらのマウスのうち６匹は６月目までに自然発
生糖尿病になった（Ｐ＜００１）。従って抗ヒト hsp６
５Ｔ細胞の採用的転移(adoptive trans fer)による糖尿
病は一過性である。しかしこれらのマウスは急性糖尿病
から回復しただけでなく、後の自然発生ＩＤＤＭの進行
に対して耐性を獲得した。従って前糖尿病性マウスを無
毒性Ｔ細胞に接触させるとＩＤＤＭの発症を加速した
り、症状を悪化させたりすることはなく、むしろ糖尿病
反応に対して耐性を獲得させることになる。
【００５７】実施例１５： 減弱化Ｔ細胞はhHSP６５の
自己免疫をワクチン予防しＩＤＤＭを阻止する 実施例１３の表８に関して記載した方法により、Ｔ細胞
をConＡ又はMThsp６５でインキュベートした後、ライダ
ー(Leider)ら、プロシーディングズオブナショナルアカ
デミーオブサイエンシーズオブユーエスエー（Proc. Na
tl. Acad. Sci.U.S.A.)第８４巻、４５７７頁（1987
年）に記載の方法に従い、活性化細胞をγ線照射（1500
R)又はグルタルアルデヒド（０３％、１５分）で減弱化
することにより、３月齢の前糖尿病性NOD/Ltマウスの脾
臓細胞からＴ細胞ワクチンを作成した。５週齢の雌の前
糖尿病性NOD/Ltマウスの１５又は２５匹の群の腹腔内に
１０ 7個の処理した脾臓細胞をワクチン接種したか、又
はしなかった。６月齢の時、各群の５匹のマウスについ
て、ヒト hsp６５に対する脾臓のＴ細胞の増殖応答を試
験した（刺激指数（ＳＩ）で表示してある）。抗原を添
加しない場合の対照ＣＰＭはワクチン接種をしなかった
ものは2,４６５±２３５であり、ワクチン接種したもの
は2,２４６±１８５であった。残りのマウスから採血
し、標準的固相ラジオイムノアッセイ（シェクター（Sc
hecter) ら、ジャーナルオブバイオロジカルケミストリ
ー(J. Biol. Chem.)第２５９巻、６４１１−６４１９頁
（1984年））により、ヒト hsp６５に対する抗体を測定
した。血清抗体を検出するためにマイクロタイタープレ
ートを、 hsp６５（抗 hsp６５用）、インスリン（抗イ
ンスリン用）又はＤＭイディオタイプ陽性モルモット抗
インスリン（イディオタイプ抗体用）でインキュベート
（５０μｇ／ml）することにより被覆した。
自己免疫をワクチン予防しＩＤＤＭを阻止する 実施例１３の表８に関して記載した方法により、Ｔ細胞
をConＡ又はMThsp６５でインキュベートした後、ライダ
ー(Leider)ら、プロシーディングズオブナショナルアカ
デミーオブサイエンシーズオブユーエスエー（Proc. Na
tl. Acad. Sci.U.S.A.)第８４巻、４５７７頁（1987
年）に記載の方法に従い、活性化細胞をγ線照射（1500
R)又はグルタルアルデヒド（０３％、１５分）で減弱化
することにより、３月齢の前糖尿病性NOD/Ltマウスの脾
臓細胞からＴ細胞ワクチンを作成した。５週齢の雌の前
糖尿病性NOD/Ltマウスの１５又は２５匹の群の腹腔内に
１０ 7個の処理した脾臓細胞をワクチン接種したか、又
はしなかった。６月齢の時、各群の５匹のマウスについ
て、ヒト hsp６５に対する脾臓のＴ細胞の増殖応答を試
験した（刺激指数（ＳＩ）で表示してある）。抗原を添
加しない場合の対照ＣＰＭはワクチン接種をしなかった
ものは2,４６５±２３５であり、ワクチン接種したもの
は2,２４６±１８５であった。残りのマウスから採血
し、標準的固相ラジオイムノアッセイ（シェクター（Sc
hecter) ら、ジャーナルオブバイオロジカルケミストリ
ー(J. Biol. Chem.)第２５９巻、６４１１−６４１９頁
（1984年））により、ヒト hsp６５に対する抗体を測定
した。血清抗体を検出するためにマイクロタイタープレ
ートを、 hsp６５（抗 hsp６５用）、インスリン（抗イ
ンスリン用）又はＤＭイディオタイプ陽性モルモット抗
インスリン（イディオタイプ抗体用）でインキュベート
（５０μｇ／ml）することにより被覆した。
【００５８】被覆ウェルを試験マウス血清（１：５０希
釈）でインキュベートし、125Ｉ標識ヤギ抗マウス免疫
グロブリン（アマーシャム社 （Amersham) 、英国；
１０ 5CPM／ウェル）を反応させて、これらの抗原に対す
る抗体の存在を検出した。 hsp６５抗原（又はこれと交
差反応する抗原）を検出するためにウェルを１：５希釈
した試験血清１５μｌでインキュベートし、ウサギ抗 h
sp６５免疫グロブリン（１：１００希釈）で重層した。
125Ｉ標識ヤギ抗ウサギ免疫グロブリン（アマーシャム
社（Amersham) を使用して結合を測定した。相対的抗体
価は、１：１００希釈血清のヒト hsp６５に対する結合
のＣＰＭを意味する。糖尿病ではない１月齢のNOD/Ltマ
ウスから得られた血清抗ヒト hsp６５の平均ＣＰＭは1,
４５０±１９４であった。前記の固相ラジオイムノアッ
セイにより hsp６５又は交差反応性抗原の存在について
マウスの血清を試験した。その結果を表１２に示す。ワ
クチン接種したマウスはワクチン接種しなかったマウス
とは有意に差があった。（＊ｐ＜００１）。
釈）でインキュベートし、125Ｉ標識ヤギ抗マウス免疫
グロブリン（アマーシャム社 （Amersham) 、英国；
１０ 5CPM／ウェル）を反応させて、これらの抗原に対す
る抗体の存在を検出した。 hsp６５抗原（又はこれと交
差反応する抗原）を検出するためにウェルを１：５希釈
した試験血清１５μｌでインキュベートし、ウサギ抗 h
sp６５免疫グロブリン（１：１００希釈）で重層した。
125Ｉ標識ヤギ抗ウサギ免疫グロブリン（アマーシャム
社（Amersham) を使用して結合を測定した。相対的抗体
価は、１：１００希釈血清のヒト hsp６５に対する結合
のＣＰＭを意味する。糖尿病ではない１月齢のNOD/Ltマ
ウスから得られた血清抗ヒト hsp６５の平均ＣＰＭは1,
４５０±１９４であった。前記の固相ラジオイムノアッ
セイにより hsp６５又は交差反応性抗原の存在について
マウスの血清を試験した。その結果を表１２に示す。ワ
クチン接種したマウスはワクチン接種しなかったマウス
とは有意に差があった。（＊ｐ＜００１）。
【００５９】
【表１２】
【００６０】表１２の結果は、本来は毒性の ConＡ又は
MThsp６５活性Ｔ細胞は、γ線照射（1,500R) 又はグル
タルアルデヒド（０３％）処理で減弱化することがで
き、自然発生ＩＤＤＭに対してワクチン予防することが
できることを証明している。他の実験的疾患で証明され
たように、照射処理又はグルタルアルデヒド処理自己免
疫Ｔ細胞は毒性がなく、急性糖尿病を引き起こさなかっ
た（データは示していない）。ＩＤＤＭの予防は、ヒト
hsp６５にに対するワクチン接種マウスの自然発生性の
Ｔ細胞と後退の反応性の著しい低下に関連していた。前
の例で説明したように、NOD/Ltマウスのランゲルハンス
島に対する障害は、血清中に抗 hsp６５抗体に認識され
る蛋白が出現することで示される。この血清抗体はおそ
らく障害されたベータ細胞に由来するため、その量に対
するＴ細胞ワクチン接種の影響をみるのは興味深いこと
である。Ｔ細胞ワクチンの投与は、６月齢で血清中に現
れる hsp６５又は交差反応性抗原の量を著しく低下させ
ることがわかる（表１２)。この低下は組織学的観察で
インスリン炎が検出されないことと関連していた（デー
タは示されていない）。
MThsp６５活性Ｔ細胞は、γ線照射（1,500R) 又はグル
タルアルデヒド（０３％）処理で減弱化することがで
き、自然発生ＩＤＤＭに対してワクチン予防することが
できることを証明している。他の実験的疾患で証明され
たように、照射処理又はグルタルアルデヒド処理自己免
疫Ｔ細胞は毒性がなく、急性糖尿病を引き起こさなかっ
た（データは示していない）。ＩＤＤＭの予防は、ヒト
hsp６５にに対するワクチン接種マウスの自然発生性の
Ｔ細胞と後退の反応性の著しい低下に関連していた。前
の例で説明したように、NOD/Ltマウスのランゲルハンス
島に対する障害は、血清中に抗 hsp６５抗体に認識され
る蛋白が出現することで示される。この血清抗体はおそ
らく障害されたベータ細胞に由来するため、その量に対
するＴ細胞ワクチン接種の影響をみるのは興味深いこと
である。Ｔ細胞ワクチンの投与は、６月齢で血清中に現
れる hsp６５又は交差反応性抗原の量を著しく低下させ
ることがわかる（表１２)。この低下は組織学的観察で
インスリン炎が検出されないことと関連していた（デー
タは示されていない）。
【００６１】従って MThsp６５又はConＡで活性化され
た抗ヒトhsp６５Ｔ細胞は、減弱化され自然発生ＩＤＤ
Ｍの進行に対してNOD/Ltマウスをワクチン予防するのに
使用できる。ワクチン化状態はＩＤＤＭ過程の免疫学的
兆候が減少したことで特徴づけられた： 抗ヒト hsp６
５Ｔ細胞と抗体。同時に hsp６５又はhHSP６５に交差反
応性の血清抗原が減少していた（インスリン炎の停止に
より説明できる）。
た抗ヒトhsp６５Ｔ細胞は、減弱化され自然発生ＩＤＤ
Ｍの進行に対してNOD/Ltマウスをワクチン予防するのに
使用できる。ワクチン化状態はＩＤＤＭ過程の免疫学的
兆候が減少したことで特徴づけられた： 抗ヒト hsp６
５Ｔ細胞と抗体。同時に hsp６５又はhHSP６５に交差反
応性の血清抗原が減少していた（インスリン炎の停止に
より説明できる）。
【００６２】実施例１６： Ｔ細胞ワクチン接種は急性
の誘発性糖尿病に対する耐性を作り出す 実施例９において、インスリン炎と高血糖症に特徴づけ
られる急性糖尿病は、油中 MThsp６５で前糖尿病性NOD/
Ltマウスを免疫することにより誘発することができるこ
とが証明された。またこの型の糖尿病は一過性であり、
実際には後の自然発生ＩＤＤＭにつながることも示され
た。本実験は急性誘発性糖尿病に対する、ヒト hsp６５
に対する免疫の効果とＴ細胞ワクチン接種の影響を試験
する。実施例１５の表１２に関して記載したように１０
7個のCon Ａ活性化、グルタルアルデヒド処理した脾臓
細胞で、４週齢の雌のNOD/Ltマウスの群をワクチン接種
したか、又はしなかった。２週間後に急性糖尿病を誘発
するために、マウスにMThsp６５又はヒト hsp６５ (油
中５０μｇ) で刺激（challenge)した。次に８月齢で自
然発生ＩＤＤＭの進行を見るために、実施例１３に記載
したように高血糖症とインスリン炎を測定して、マウス
を調べた。その結果を表１３に示す。有意差は＊ｐ＜０
０１であった。
の誘発性糖尿病に対する耐性を作り出す 実施例９において、インスリン炎と高血糖症に特徴づけ
られる急性糖尿病は、油中 MThsp６５で前糖尿病性NOD/
Ltマウスを免疫することにより誘発することができるこ
とが証明された。またこの型の糖尿病は一過性であり、
実際には後の自然発生ＩＤＤＭにつながることも示され
た。本実験は急性誘発性糖尿病に対する、ヒト hsp６５
に対する免疫の効果とＴ細胞ワクチン接種の影響を試験
する。実施例１５の表１２に関して記載したように１０
7個のCon Ａ活性化、グルタルアルデヒド処理した脾臓
細胞で、４週齢の雌のNOD/Ltマウスの群をワクチン接種
したか、又はしなかった。２週間後に急性糖尿病を誘発
するために、マウスにMThsp６５又はヒト hsp６５ (油
中５０μｇ) で刺激（challenge)した。次に８月齢で自
然発生ＩＤＤＭの進行を見るために、実施例１３に記載
したように高血糖症とインスリン炎を測定して、マウス
を調べた。その結果を表１３に示す。有意差は＊ｐ＜０
０１であった。
【００６３】
【表１３】
【００６４】ワクチン接種しなかったマウスはヒト hsp
６５又は MThsp６５に対して応答し、急性、一過性糖尿
病を発症したことがわかる。この後に自然発生ＩＤＤＭ
に対する耐性が起きた。これに対してＴ細胞処理マウス
は、抗原誘発急性糖尿病に対して耐性であった。これら
も自然発生ＩＤＤＭに対しては防御性であった。即ちＴ
細胞ワクチン接種は、人工免疫により誘発された急性糖
尿病と後の自然発生ＩＤＤＭに対して、有効に耐性を作
り出している。
６５又は MThsp６５に対して応答し、急性、一過性糖尿
病を発症したことがわかる。この後に自然発生ＩＤＤＭ
に対する耐性が起きた。これに対してＴ細胞処理マウス
は、抗原誘発急性糖尿病に対して耐性であった。これら
も自然発生ＩＤＤＭに対しては防御性であった。即ちＴ
細胞ワクチン接種は、人工免疫により誘発された急性糖
尿病と後の自然発生ＩＤＤＭに対して、有効に耐性を作
り出している。
【００６５】実施例１７： ペプチド合成 ヒトhsp ６５分子上の最も重要なエピトープは、MThsp
６５配列と完全ではないが部分的相同性を有するアミノ
酸配列であると推定された。完全な相同性を有するもの
はそれほど作用が強くないため、対応するエピトープは
おそらく少し異なるのであろう。ヒト hsp６５配列のカ
ルボキシル基末端で始まる一連のペプチドを合成し、マ
イコバクテリウムとヒトの配列でわずかに違いがある配
列を選んだ。このようなペプチドのひとつは、図３に示
すヒト hsp６５分子のアミノ酸配列４３７−４６０を有
している、即ちH-Val-Leu-Gly-Gly-Gly-Cys-Ala-Leu-Le
u-Arg-Cys-Ile-Pro-Ala-Leu-Asp-Ser-Leu-Thr-Pro-Ala-
Asn-Glu-Asp-OH。このペプチドはｐ２７７と命名した。
対照ペプチドｐ２７８は、３個のアミノ酸分だけｐ２７
７と重複し、次の配列を有する： H-Asn-Glu-Asp-Gln-L
ys-Ile-Gly-Ile-Glu-Ile-Ile-Lys-Arg-Thr-Leu-Lys-Ile
-OH 。これは図３のアミノ酸配列４５８−４７４に相当
する。
６５配列と完全ではないが部分的相同性を有するアミノ
酸配列であると推定された。完全な相同性を有するもの
はそれほど作用が強くないため、対応するエピトープは
おそらく少し異なるのであろう。ヒト hsp６５配列のカ
ルボキシル基末端で始まる一連のペプチドを合成し、マ
イコバクテリウムとヒトの配列でわずかに違いがある配
列を選んだ。このようなペプチドのひとつは、図３に示
すヒト hsp６５分子のアミノ酸配列４３７−４６０を有
している、即ちH-Val-Leu-Gly-Gly-Gly-Cys-Ala-Leu-Le
u-Arg-Cys-Ile-Pro-Ala-Leu-Asp-Ser-Leu-Thr-Pro-Ala-
Asn-Glu-Asp-OH。このペプチドはｐ２７７と命名した。
対照ペプチドｐ２７８は、３個のアミノ酸分だけｐ２７
７と重複し、次の配列を有する： H-Asn-Glu-Asp-Gln-L
ys-Ile-Gly-Ile-Glu-Ile-Ile-Lys-Arg-Thr-Leu-Lys-Ile
-OH 。これは図３のアミノ酸配列４５８−４７４に相当
する。
【００６６】実施例１８： 進行中のＩＤＤＭの診断に
おけるｐ２７７に対する免疫応答 実施例１２に記載した方法に従いｐ２７７に対する増殖
性応答について、前糖尿病性の３月齢の雌のNOD/Ltマウ
スからの脾臓細胞の懸濁液を試験し、その結果を表５に
示した。これらのマウスはさらに１−３月の間明瞭なＩ
ＤＤＭを発現しないが、それらの脾臓Ｔ細胞はｐ２７７
に対して強い応答を示すが、ｐ２７８に対しては応答し
ない。本実験及び他のinvitro 実験で、ペプチドの最適
濃度は５μｇ／mlである。
おけるｐ２７７に対する免疫応答 実施例１２に記載した方法に従いｐ２７７に対する増殖
性応答について、前糖尿病性の３月齢の雌のNOD/Ltマウ
スからの脾臓細胞の懸濁液を試験し、その結果を表５に
示した。これらのマウスはさらに１−３月の間明瞭なＩ
ＤＤＭを発現しないが、それらの脾臓Ｔ細胞はｐ２７７
に対して強い応答を示すが、ｐ２７８に対しては応答し
ない。本実験及び他のinvitro 実験で、ペプチドの最適
濃度は５μｇ／mlである。
【００６７】実施例１９： 病原性Ｔ細胞クローンはｐ
２７７と hsp６５変種に対して応答する 急性糖尿病を若い前糖尿病性NOD/Ltマウスに移すことが
できるＣ７とＣ９Ｔ細胞クローン（前記の表１０参照）
は、ｐ２７７に対して応答する。このクローンはｐ２７
７と全マイコバクテリウム hsp６５に対して応答する
が、 hsp６５遺伝子を含まないプラスミッドの対照調製
物には応答しないことがわかる。従って病原性Ｔ細胞が
ｐ２７７を認識するため、ｐ２７７ペプチドは病原性エ
ピトープを有すると結論することができる。Ｃ７とＣ９
もマイコバクテリウム hsp６５分子に対して応答するた
め、ｐ２７７エピトープはマイコバクテリウム hsp６５
分子上にも存在するようである。従ってｐ２７７配列に
相同性のマイコバクテリウム hsp６５配列は免疫学的に
機能性である。マイコバクテリウムの配列は以下のよう
であり、ｐ２７７のヒトの配列から下線の部分が置換を
受けている：H-Val-Ala-Gly-Gly-Gly-Val-Thr-Leu-Leu-
Gln-Ala-Ala-Pro-Thr-Leu-Asp-Glu-Leu-Lys- - - -Leu-
Glu-Gly-Asp-OH 。２４個のアミノ酸のうち１３個が置
換されていることがわかる。従ってｐ２７７の免疫学的
な性質は、その配列の約６０％の変化を許容できると結
論することができる。最小エピトープは２４個でなく１
０個のアミノ酸であったとしても、マイコバクテリウム
の配列から少なくとも４から６個のアミノ酸だけ異なら
ないｐ２７７の１０個のアミノ酸の配列はない。
２７７と hsp６５変種に対して応答する 急性糖尿病を若い前糖尿病性NOD/Ltマウスに移すことが
できるＣ７とＣ９Ｔ細胞クローン（前記の表１０参照）
は、ｐ２７７に対して応答する。このクローンはｐ２７
７と全マイコバクテリウム hsp６５に対して応答する
が、 hsp６５遺伝子を含まないプラスミッドの対照調製
物には応答しないことがわかる。従って病原性Ｔ細胞が
ｐ２７７を認識するため、ｐ２７７ペプチドは病原性エ
ピトープを有すると結論することができる。Ｃ７とＣ９
もマイコバクテリウム hsp６５分子に対して応答するた
め、ｐ２７７エピトープはマイコバクテリウム hsp６５
分子上にも存在するようである。従ってｐ２７７配列に
相同性のマイコバクテリウム hsp６５配列は免疫学的に
機能性である。マイコバクテリウムの配列は以下のよう
であり、ｐ２７７のヒトの配列から下線の部分が置換を
受けている：H-Val-Ala-Gly-Gly-Gly-Val-Thr-Leu-Leu-
Gln-Ala-Ala-Pro-Thr-Leu-Asp-Glu-Leu-Lys- - - -Leu-
Glu-Gly-Asp-OH 。２４個のアミノ酸のうち１３個が置
換されていることがわかる。従ってｐ２７７の免疫学的
な性質は、その配列の約６０％の変化を許容できると結
論することができる。最小エピトープは２４個でなく１
０個のアミノ酸であったとしても、マイコバクテリウム
の配列から少なくとも４から６個のアミノ酸だけ異なら
ないｐ２７７の１０個のアミノ酸の配列はない。
【００６８】実施例２０： ペプチドｐ２７７は糖尿病
に対する処理として使用できる 非免疫原性型の全 hsp６５分子は、アジュバント中の免
疫原性 hsp６５に対する免疫により誘発されたNOD/Ltマ
ウスの急性糖尿病に対して、耐性を誘発することができ
ることが実施例１０で証明された。図７は、ペプチドｐ
２７７は誘発糖尿病に対する耐性を得るのに使用するこ
とができる（しかしｐ２７８は異なる）ことを示してい
る。７匹の５週齢の雌の前糖尿病性NOD/Ltマウスの群
を、不完全フロイントアジュバント中の５０μｇのｐ２
７７又はｐ２７８で処理した。２週間後、急性糖尿病を
誘発するためにマウスを不完全フロイントアジュバント
中の５０μｇの免疫原性 hsp６５で免疫した。３週間
後、血中グルコースを測定した。ｐ２７７で処理したマ
ウスはいずれも高血糖症（血中グルコースが２００mg／
dl以上）にはならなかったことがわかる。これに対して
ペプチドｐ２７８で処理した７匹のマウスのうち５匹は
糖尿病になった。ｐ２７７による処理はまた、これらの
７匹のマウスのすべてで自然発生糖尿病の発症を防止し
たが、種々の抗原（例えばウシ血清アルブミン又は hsp
７０）で処理された対照マウスの８０％は７月齢までに
糖尿病を発症した。即ち、ｐ２７７による処理は、誘発
性糖尿病及び自然発生糖尿病の両方に対して耐性を与え
た。従って特異抗原は、非免疫原性型で投与された全 h
sp６５分子で見られる治療効果を生み出すことができ
る。
に対する処理として使用できる 非免疫原性型の全 hsp６５分子は、アジュバント中の免
疫原性 hsp６５に対する免疫により誘発されたNOD/Ltマ
ウスの急性糖尿病に対して、耐性を誘発することができ
ることが実施例１０で証明された。図７は、ペプチドｐ
２７７は誘発糖尿病に対する耐性を得るのに使用するこ
とができる（しかしｐ２７８は異なる）ことを示してい
る。７匹の５週齢の雌の前糖尿病性NOD/Ltマウスの群
を、不完全フロイントアジュバント中の５０μｇのｐ２
７７又はｐ２７８で処理した。２週間後、急性糖尿病を
誘発するためにマウスを不完全フロイントアジュバント
中の５０μｇの免疫原性 hsp６５で免疫した。３週間
後、血中グルコースを測定した。ｐ２７７で処理したマ
ウスはいずれも高血糖症（血中グルコースが２００mg／
dl以上）にはならなかったことがわかる。これに対して
ペプチドｐ２７８で処理した７匹のマウスのうち５匹は
糖尿病になった。ｐ２７７による処理はまた、これらの
７匹のマウスのすべてで自然発生糖尿病の発症を防止し
たが、種々の抗原（例えばウシ血清アルブミン又は hsp
７０）で処理された対照マウスの８０％は７月齢までに
糖尿病を発症した。即ち、ｐ２７７による処理は、誘発
性糖尿病及び自然発生糖尿病の両方に対して耐性を与え
た。従って特異抗原は、非免疫原性型で投与された全 h
sp６５分子で見られる治療効果を生み出すことができ
る。
【００６９】ｐ２７７の上記のデータは NODマウスの糖
尿病に関するものであるが、全 hsp６５分子又はこれと
免疫学的に交差反応性の他の分子と同様にこのペプチド
は、ヒトにおける診断と治療に使用できることは明白で
ある。これはＮＯＤマウスの糖尿病はヒトＩＤＤＭの忠
実なモデルとして認識されているからである。さらにＮ
ＯＤマウスは、ヒトＩＤＤＭに関連したＤＱβの主要組
織適合性抗原複合体（ＭＨＣ）のクラスII分子に類似の
分子（ＩＡ）を有することが、トッド（Ｔｏｄｄ) ら、
ネーチャー（Nature) 第３２９巻、５９９頁（1987年）
により発表されている。従ってヒトとＮＯＤ糖尿病誘発
性Ｔ細胞は両方とも、ＤＱβ鎖の５７位のアスパラギン
酸の欠如したＭＨＣクラスII分子により提示される同じ
ペプチド配列を認識するはずである。もし糖尿病を発症
しているヒトとＮＯＤマウスが同じ抗原（例えばｐ２７
７）を見ているなら、このようなペプチドはヒト及びＮ
ＯＤマウスのＩＤＤＭの診断と治療に使用することがで
きる。
尿病に関するものであるが、全 hsp６５分子又はこれと
免疫学的に交差反応性の他の分子と同様にこのペプチド
は、ヒトにおける診断と治療に使用できることは明白で
ある。これはＮＯＤマウスの糖尿病はヒトＩＤＤＭの忠
実なモデルとして認識されているからである。さらにＮ
ＯＤマウスは、ヒトＩＤＤＭに関連したＤＱβの主要組
織適合性抗原複合体（ＭＨＣ）のクラスII分子に類似の
分子（ＩＡ）を有することが、トッド（Ｔｏｄｄ) ら、
ネーチャー（Nature) 第３２９巻、５９９頁（1987年）
により発表されている。従ってヒトとＮＯＤ糖尿病誘発
性Ｔ細胞は両方とも、ＤＱβ鎖の５７位のアスパラギン
酸の欠如したＭＨＣクラスII分子により提示される同じ
ペプチド配列を認識するはずである。もし糖尿病を発症
しているヒトとＮＯＤマウスが同じ抗原（例えばｐ２７
７）を見ているなら、このようなペプチドはヒト及びＮ
ＯＤマウスのＩＤＤＭの診断と治療に使用することがで
きる。
【００７０】本発明による発生段階のＩＤＤＭの診断マ
ーカーとして役立つＩＤＤＭの進行中にヒトの体で産生
される特定の蛋白は、約６５キロダルトンのヒト熱ショ
ック蛋白（又はこれと交差反応性の抗原）である。６５
キロダルトンのヒト熱ショック蛋白のヌクレオチドと推
定されるアミノ酸配列を図３に示す。以下この蛋白をhH
SP６５と呼ぶ。６５キロダルトン蛋白に結合する同じ抗
体と交差反応する他の蛋白もin vivo で産生される。例
えばマイコバクテリウムテューバーキュローシス(M. tu
beculosis)の hsp６５分子に対して特異的なモノクロー
ナル抗体と交差反応する４７キロダルトン、３０キロダ
ルトンそして２５キロダルトン分子が、マウスとラット
中に見いだされた。このような抗体と交差反応する４７
キロダルトン分子もラット繊維芽細胞中に見いだされて
いる。種間の熱ショック蛋白の保存性を考慮すると、こ
れらはヒトにも存在するであろうことは充分予想され
る。さらにＩＤＤＭの進行中に血液又は尿中に放出され
る蛋白は、hHSP６５ではなくhHSP６５と交差反応性の分
子であるかも知れない。それはベータ細胞上の表面蛋
白、又はhHSP６５上に存在するエピトープを保持してい
る蛋白の断片かも知れない。
ーカーとして役立つＩＤＤＭの進行中にヒトの体で産生
される特定の蛋白は、約６５キロダルトンのヒト熱ショ
ック蛋白（又はこれと交差反応性の抗原）である。６５
キロダルトンのヒト熱ショック蛋白のヌクレオチドと推
定されるアミノ酸配列を図３に示す。以下この蛋白をhH
SP６５と呼ぶ。６５キロダルトン蛋白に結合する同じ抗
体と交差反応する他の蛋白もin vivo で産生される。例
えばマイコバクテリウムテューバーキュローシス(M. tu
beculosis)の hsp６５分子に対して特異的なモノクロー
ナル抗体と交差反応する４７キロダルトン、３０キロダ
ルトンそして２５キロダルトン分子が、マウスとラット
中に見いだされた。このような抗体と交差反応する４７
キロダルトン分子もラット繊維芽細胞中に見いだされて
いる。種間の熱ショック蛋白の保存性を考慮すると、こ
れらはヒトにも存在するであろうことは充分予想され
る。さらにＩＤＤＭの進行中に血液又は尿中に放出され
る蛋白は、hHSP６５ではなくhHSP６５と交差反応性の分
子であるかも知れない。それはベータ細胞上の表面蛋
白、又はhHSP６５上に存在するエピトープを保持してい
る蛋白の断片かも知れない。
【００７１】従って本発明に従ってその血液又は尿中の
存在を測定される、ＩＤＤＭの存在又はその発生段階の
診断マーカーとして役立つ分子は、hHSP６５に対するポ
リクローナル抗体、そして好ましくはhHSP６５のｐ２７
７配列に対するモノクローナル抗体又はポリクローナル
抗体と免疫学的に反応するものである。本明細書と請求
の範囲の目的において、「hHSP６５」という用語は６５
キロダルトンのヒト熱ショック蛋白のみでなく、任意の
種の６５キロダルトンの熱ショック蛋白に対するヒト血
清中に見いだされる他の関連分子も含むものと意図され
る。この定義は具体的には、すでに見いだされ本明細書
中で議論されている６５キロダルトン、２５キロダルト
ン及び４７キロダルトン蛋白を含むが、これらに限定さ
れるものではない。
存在を測定される、ＩＤＤＭの存在又はその発生段階の
診断マーカーとして役立つ分子は、hHSP６５に対するポ
リクローナル抗体、そして好ましくはhHSP６５のｐ２７
７配列に対するモノクローナル抗体又はポリクローナル
抗体と免疫学的に反応するものである。本明細書と請求
の範囲の目的において、「hHSP６５」という用語は６５
キロダルトンのヒト熱ショック蛋白のみでなく、任意の
種の６５キロダルトンの熱ショック蛋白に対するヒト血
清中に見いだされる他の関連分子も含むものと意図され
る。この定義は具体的には、すでに見いだされ本明細書
中で議論されている６５キロダルトン、２５キロダルト
ン及び４７キロダルトン蛋白を含むが、これらに限定さ
れるものではない。
【００７２】自然界の熱ショック蛋白の構造の類似性の
ため、本明細書に開示した診断マーカーの存在は、具体
的に任意の生物の熱ショック蛋白に対するポリクローナ
ル抗体又はモノクローナル抗体によって検出することが
できる。例えばマイコバクテリウムテューバーキュロー
シス（M. tubeculosis、 MT)の熱ショック蛋白は、遺伝
子工学的方法により容易に大量に産生することができ
る。この蛋白はウサギやマウスにおいて抗体の産生に使
用することができる。本発明に従ってウサギ抗MThsp６
５ポリクローナル抗体は、hHSP６５の存在を測定するた
めに使用することができる。同様に MThsp６５に対して
免疫したマウスの脾臓から得られた MThsp６５と反応す
るモノクローナル抗体が選択される。このような抗体は
またhHSP６５と交差反応するであろう。ｐ２７７は病原
的に活性のエピトープを含むことが証明されているた
め、好適なモノクローナル抗体はｐ２７７蛋白に対して
作成されたものである。本明細書の実施例で使用される
特定のモノクローナル抗体は例示のためのみである。あ
る抗原と特異的に反応する性質に関して特異的に産生さ
れたこのような任意のモノクローナル抗体が、本発明の
目的のために他のどれよりも優れていると考えられる理
由はない。
ため、本明細書に開示した診断マーカーの存在は、具体
的に任意の生物の熱ショック蛋白に対するポリクローナ
ル抗体又はモノクローナル抗体によって検出することが
できる。例えばマイコバクテリウムテューバーキュロー
シス（M. tubeculosis、 MT)の熱ショック蛋白は、遺伝
子工学的方法により容易に大量に産生することができ
る。この蛋白はウサギやマウスにおいて抗体の産生に使
用することができる。本発明に従ってウサギ抗MThsp６
５ポリクローナル抗体は、hHSP６５の存在を測定するた
めに使用することができる。同様に MThsp６５に対して
免疫したマウスの脾臓から得られた MThsp６５と反応す
るモノクローナル抗体が選択される。このような抗体は
またhHSP６５と交差反応するであろう。ｐ２７７は病原
的に活性のエピトープを含むことが証明されているた
め、好適なモノクローナル抗体はｐ２７７蛋白に対して
作成されたものである。本明細書の実施例で使用される
特定のモノクローナル抗体は例示のためのみである。あ
る抗原と特異的に反応する性質に関して特異的に産生さ
れたこのような任意のモノクローナル抗体が、本発明の
目的のために他のどれよりも優れていると考えられる理
由はない。
【００７３】前記したように、hHSP６５蛋白（又はこれ
と交差反応性の分子）は診断マーカーとして使用できる
のみでなく、hHSP６５に対する抗体も使用することがで
きる。ヒトの患者においてhHSP６５又は関連蛋白が放出
されたとき自然発生的に形成される抗体が測定される。
hHSP６５又は関連蛋白の測定がこの目的に役立つのと同
程度に、このような抗体の陽性の結果は、ＩＤＤＭが迫
っていることの指標として有用である。任意の hsp６５
蛋白との反応性を捜して、抗 hsp６５抗体は測定され
る。即ち MThsp６５蛋白は抗hHSP６５抗体と交差反応す
る。もちろん抗hHSP６５抗体の存在の測定のための使用
に好適な蛋白はhHSP６５蛋白であり、さらに好ましくは
そのｐ２７７配列である。しかし通常の技術を有する当
業者は過度に実験をしなくても、ある蛋白又は蛋白断片
が抗hHSP６５抗体と交差反応するかどうかを、経験的に
決めることができる。このような蛋白又は他の分子が抗
hHSP６５抗体と免疫反応するか否かを求めるために、簡
単なin vitro試験が使用される。もし交差反応する場合
は、本発明の方法において使用され、それも本発明に包
含されると考えられる。
と交差反応性の分子）は診断マーカーとして使用できる
のみでなく、hHSP６５に対する抗体も使用することがで
きる。ヒトの患者においてhHSP６５又は関連蛋白が放出
されたとき自然発生的に形成される抗体が測定される。
hHSP６５又は関連蛋白の測定がこの目的に役立つのと同
程度に、このような抗体の陽性の結果は、ＩＤＤＭが迫
っていることの指標として有用である。任意の hsp６５
蛋白との反応性を捜して、抗 hsp６５抗体は測定され
る。即ち MThsp６５蛋白は抗hHSP６５抗体と交差反応す
る。もちろん抗hHSP６５抗体の存在の測定のための使用
に好適な蛋白はhHSP６５蛋白であり、さらに好ましくは
そのｐ２７７配列である。しかし通常の技術を有する当
業者は過度に実験をしなくても、ある蛋白又は蛋白断片
が抗hHSP６５抗体と交差反応するかどうかを、経験的に
決めることができる。このような蛋白又は他の分子が抗
hHSP６５抗体と免疫反応するか否かを求めるために、簡
単なin vitro試験が使用される。もし交差反応する場合
は、本発明の方法において使用され、それも本発明に包
含されると考えられる。
【００７４】ｐ２７７配列は、上記した実験において記
載したNOD/Ltマウス、ヒトhHSP６５に誘発されそのＴ細
胞はヒト hsp６５に対して応答する他の株のマウス、C5
7BL/6 、上の病原性エピトープに対応することが証明さ
れているが、そのＴ細胞はｐ２７７に対して応答しな
い。従ってこれはhHSP６５上の唯一の病原性エピトープ
でないことは明らかである。実際に前糖尿病性ヒト患者
の血液又は尿中に見いだされる診断マーカーは、約６２
キロダルトンの分子量を有すると性状解析されている。
従って主要組織適合性複合体（ＭＨＣ）で提示される特
定のエピトープ（ヒト白血球抗原、ＨＬＡ）は個人毎に
異なるであろうと予想される。従って現在ｐ２７７配列
が好適であると提示されているが、通常の技術を有する
当業者は、hHSP６５蛋白中の抗原性配列はｐ２７７と同
じ又は関連した配列を有するものが見つかるであろうこ
とを理解できるであろう。本発明はすべてこのような配
列を包含すると意図される。
載したNOD/Ltマウス、ヒトhHSP６５に誘発されそのＴ細
胞はヒト hsp６５に対して応答する他の株のマウス、C5
7BL/6 、上の病原性エピトープに対応することが証明さ
れているが、そのＴ細胞はｐ２７７に対して応答しな
い。従ってこれはhHSP６５上の唯一の病原性エピトープ
でないことは明らかである。実際に前糖尿病性ヒト患者
の血液又は尿中に見いだされる診断マーカーは、約６２
キロダルトンの分子量を有すると性状解析されている。
従って主要組織適合性複合体（ＭＨＣ）で提示される特
定のエピトープ（ヒト白血球抗原、ＨＬＡ）は個人毎に
異なるであろうと予想される。従って現在ｐ２７７配列
が好適であると提示されているが、通常の技術を有する
当業者は、hHSP６５蛋白中の抗原性配列はｐ２７７と同
じ又は関連した配列を有するものが見つかるであろうこ
とを理解できるであろう。本発明はすべてこのような配
列を包含すると意図される。
【００７５】前記の例は hsp６５又は交差反応性抗原そ
してそれに特異的な抗体が、発生段階の糖尿病の診断マ
ーカーとして使用できるのみでなく、このような蛋白に
特異的なＴ細胞も使用できることを示している。実際に
このような特異的なＴ細胞は抗体の出現に先行するよう
である。実際にベータ細胞を攻撃するのは抗体ではなく
Ｔ細胞である。通常の技術を有する当業者は、特定の抗
原に対するＴ細胞活性の多くの測定法があることを理解
できるであろう。例えば試験対象者からリンパ球を得
て、hHSP６５又は交差反応性抗原に接触させ、活性化に
対して起きる種々の効果（例えば増殖、サイトカイン産
生又はリンホカイン産生、酵素産生、カルシウムフラッ
クスなど）を測定する。このような測定法は当該分野の
技術の範囲内にある。
してそれに特異的な抗体が、発生段階の糖尿病の診断マ
ーカーとして使用できるのみでなく、このような蛋白に
特異的なＴ細胞も使用できることを示している。実際に
このような特異的なＴ細胞は抗体の出現に先行するよう
である。実際にベータ細胞を攻撃するのは抗体ではなく
Ｔ細胞である。通常の技術を有する当業者は、特定の抗
原に対するＴ細胞活性の多くの測定法があることを理解
できるであろう。例えば試験対象者からリンパ球を得
て、hHSP６５又は交差反応性抗原に接触させ、活性化に
対して起きる種々の効果（例えば増殖、サイトカイン産
生又はリンホカイン産生、酵素産生、カルシウムフラッ
クスなど）を測定する。このような測定法は当該分野の
技術の範囲内にある。
【００７６】上記したように hsp６５はラットのアジュ
バント関節炎やヒトのリウマチ関節炎に関連しているこ
とが知られている。ＩＤＤＭ過程と異なり関節炎の過程
はその顕著な症候や症状により明白に表現されているた
め、ＩＤＤＭを発症している人と関節炎の人との鑑別に
おいて、 hsp６５又は抗 hsp６５の測定に関する不確定
性はないであろう。従って関節炎の症候や症状がないの
に hsp６５又は抗 hsp６５が検出される場合は、全臨床
的ベータ細胞の破壊と発生段階のＩＤＤＭの可能性に注
意を向けさせるのに役立つであろう。ベータ細胞に対す
る自己免疫の診断を確定するのに、追加の検査（例えば
ベータ細胞に対する抗体）が利用されるであろう。ＩＤ
ＤＭ過程が臨床的には無症状であるのに対し、全身性エ
リテマトーデス（ＳＬＥ）は明白な症候と症状で特徴づ
けられるため、全身性エリテマトーデスとhsp９０との
関連は、ＩＤＤＭ過程と混乱されることはないであろ
う。
バント関節炎やヒトのリウマチ関節炎に関連しているこ
とが知られている。ＩＤＤＭ過程と異なり関節炎の過程
はその顕著な症候や症状により明白に表現されているた
め、ＩＤＤＭを発症している人と関節炎の人との鑑別に
おいて、 hsp６５又は抗 hsp６５の測定に関する不確定
性はないであろう。従って関節炎の症候や症状がないの
に hsp６５又は抗 hsp６５が検出される場合は、全臨床
的ベータ細胞の破壊と発生段階のＩＤＤＭの可能性に注
意を向けさせるのに役立つであろう。ベータ細胞に対す
る自己免疫の診断を確定するのに、追加の検査（例えば
ベータ細胞に対する抗体）が利用されるであろう。ＩＤ
ＤＭ過程が臨床的には無症状であるのに対し、全身性エ
リテマトーデス（ＳＬＥ）は明白な症候と症状で特徴づ
けられるため、全身性エリテマトーデスとhsp９０との
関連は、ＩＤＤＭ過程と混乱されることはないであろ
う。
【００７７】hHSP６５又は関連蛋白に対する抗体は、Ｉ
ＤＤＭの診断に使用され、ここで hsp６５又は他の免疫
学的に交差反応性分子は患者に皮下注射され、皮膚反応
の有無が観察される。またはhHSP６５又は関連分子を患
者の血液又は血液成分と接触させ、患者の血液中に任意
の公知の免疫学的方法により検出される抗hHSP６５との
免疫学的反応の有無（即ち hsp６５と交差反応する抗
体）について観察される。このような公知の免疫学的方
法にはラジオイムノアッセイ、蛍光免疫定量法、ELISA
（酵素免疫測定法）、ケミルミネセンス測定法などがあ
る。
ＤＤＭの診断に使用され、ここで hsp６５又は他の免疫
学的に交差反応性分子は患者に皮下注射され、皮膚反応
の有無が観察される。またはhHSP６５又は関連分子を患
者の血液又は血液成分と接触させ、患者の血液中に任意
の公知の免疫学的方法により検出される抗hHSP６５との
免疫学的反応の有無（即ち hsp６５と交差反応する抗
体）について観察される。このような公知の免疫学的方
法にはラジオイムノアッセイ、蛍光免疫定量法、ELISA
（酵素免疫測定法）、ケミルミネセンス測定法などがあ
る。
【００７８】in vivo の皮膚試験では、充分な時間の後
（例えば投与後２４から７２時間後）に注射部位での皮
膚反応が測定される。膨大化及び／又は発赤は遅延化過
敏症に起因する。in vitroの血清学的検査では、患者の
血清をhHSP６５又は関連蛋白と接触させる。血清が hsp
６５の抗原決定基に対する抗体を含有する場合は、免疫
反応が起こり、これを標準的方法（例えばELISA 、凝集
など）により検出し定量する。hHSP６５、抗hHSP６５又
はhHSP６５特異的Ｔ細胞の存在を検出するのに公知の免
疫測定技術が使用される。例えば hsp６５を使用する測
定法により、ある人の血清中の抗hHSP６５抗体の存在が
陽性であると測定された場合はＩＤＤＭが発生段階であ
るか又は存在することを意味するという事実を通常の技
術を有する当業者が知れば、このような当業者は使用で
きる免疫測定技術のタイプは充分認識しているであろ
う。ラジオイムノアッセイ（固相又は液相）以外に、任
意の従来の免疫測定法（例えば酵素結合免疫吸着定量法
（ELISA)、酵素やラジオアイソトープ以外の標識物を用
いる不均一免疫測定法（競合法及び非競合法）、蛍光消
光法及び酵素チャネリング法に基づく均一免疫測定法、
免疫沈降法（放射免疫拡散法を含む）、そして肉眼の半
定量的検出法と定量的濁度的検出法に基づく凝集測定法
など）が使用できる。
（例えば投与後２４から７２時間後）に注射部位での皮
膚反応が測定される。膨大化及び／又は発赤は遅延化過
敏症に起因する。in vitroの血清学的検査では、患者の
血清をhHSP６５又は関連蛋白と接触させる。血清が hsp
６５の抗原決定基に対する抗体を含有する場合は、免疫
反応が起こり、これを標準的方法（例えばELISA 、凝集
など）により検出し定量する。hHSP６５、抗hHSP６５又
はhHSP６５特異的Ｔ細胞の存在を検出するのに公知の免
疫測定技術が使用される。例えば hsp６５を使用する測
定法により、ある人の血清中の抗hHSP６５抗体の存在が
陽性であると測定された場合はＩＤＤＭが発生段階であ
るか又は存在することを意味するという事実を通常の技
術を有する当業者が知れば、このような当業者は使用で
きる免疫測定技術のタイプは充分認識しているであろ
う。ラジオイムノアッセイ（固相又は液相）以外に、任
意の従来の免疫測定法（例えば酵素結合免疫吸着定量法
（ELISA)、酵素やラジオアイソトープ以外の標識物を用
いる不均一免疫測定法（競合法及び非競合法）、蛍光消
光法及び酵素チャネリング法に基づく均一免疫測定法、
免疫沈降法（放射免疫拡散法を含む）、そして肉眼の半
定量的検出法と定量的濁度的検出法に基づく凝集測定法
など）が使用できる。
【００７９】測定には任意の通常の固相法又はサンドイ
ッチ測定技術を使用することができる。同様に本発明を
達成するための種々の測定を実施するために、キットを
調製してもよい。このようなキットは単一の測定又は決
まった数の測定を実施するのに必要なすべての材料を含
むであろう。例えば抗hHSP６５抗体の存在を測定するた
めのキットは、固相に固定された hsp６５と、検出すべ
き抗hHSP６５抗体の非可変領域を認識することができる
標識した抗体（例えば標識抗ヒトFab)を含む。hHSP６５
の存在を測定するためのキットは、固相に固定された抗
体（これはhHSP６５と反応するか又は交差反応する）、
そして固定抗体が認識するエピトープとは異なるhHSP６
５のエピトープと反応することができる標識抗体を含
む。キットはまた、 hsp６５と抗hHSP６５抗体の免疫複
合体を沈降させることができる試薬と、キットの使用法
を記載する説明書とキットの材料を入れるための容器を
含む。任意の従来の標識物（例えばラジオアイソトー
プ、酵素、発色団、又は発蛍光団）を使用することがで
きる。典型的なラジオアイソトープはヨード−１２５又
はイオウ−３５である。本目的のための典型的な酵素に
は、西洋ワサビペルオキシダーゼ（horseradish peroxi
dase) 、α−ガラクトシダーゼ及びアルカリ性ホスファ
ターゼがある。本発明の診断用組成物は、 hsp６５に適
当なアジュバントや付属成分を組合せることにより調製
される。
ッチ測定技術を使用することができる。同様に本発明を
達成するための種々の測定を実施するために、キットを
調製してもよい。このようなキットは単一の測定又は決
まった数の測定を実施するのに必要なすべての材料を含
むであろう。例えば抗hHSP６５抗体の存在を測定するた
めのキットは、固相に固定された hsp６５と、検出すべ
き抗hHSP６５抗体の非可変領域を認識することができる
標識した抗体（例えば標識抗ヒトFab)を含む。hHSP６５
の存在を測定するためのキットは、固相に固定された抗
体（これはhHSP６５と反応するか又は交差反応する）、
そして固定抗体が認識するエピトープとは異なるhHSP６
５のエピトープと反応することができる標識抗体を含
む。キットはまた、 hsp６５と抗hHSP６５抗体の免疫複
合体を沈降させることができる試薬と、キットの使用法
を記載する説明書とキットの材料を入れるための容器を
含む。任意の従来の標識物（例えばラジオアイソトー
プ、酵素、発色団、又は発蛍光団）を使用することがで
きる。典型的なラジオアイソトープはヨード−１２５又
はイオウ−３５である。本目的のための典型的な酵素に
は、西洋ワサビペルオキシダーゼ（horseradish peroxi
dase) 、α−ガラクトシダーゼ及びアルカリ性ホスファ
ターゼがある。本発明の診断用組成物は、 hsp６５に適
当なアジュバントや付属成分を組合せることにより調製
される。
【００８０】上記の実験で証明されたように、ランゲル
ハンス島細胞と熱ショック繊維芽細胞はマイコバクテリ
ウム hsp６５と交差反応する分子を放出する。マイコバ
クテリウム hsp６５の免疫はＩＤＤＭを引き起こすとい
う事実は、マイコバクテリウム hsp６５と交差反応する
抗原に対する免疫攻撃はベータ細胞に障害を与えること
を示している。このような免疫応答は、交差反応性 hsp
６５又は侵入する微生物により偶然免疫された後に起き
る最初の出来事である。hHSP６５又は関連蛋白の放出
も、ウイルス又は毒素（toxin)によるベータ細胞の障害
の後に起きるであろう。即ち血液又は尿中の hsp６５陽
性分子の出現がなぜＩＤＤＭの進行の初期の兆候である
かというと、それはこれらの分子はベータ細胞の障害の
進行に伴って放出されるからである。同様にhHSP６５に
対する免疫応答それ自身がＩＤＤＭを引き起こすため、
抗hHSP６５抗体はＩＤＤＭが迫っていることの信頼でき
る兆候である。
ハンス島細胞と熱ショック繊維芽細胞はマイコバクテリ
ウム hsp６５と交差反応する分子を放出する。マイコバ
クテリウム hsp６５の免疫はＩＤＤＭを引き起こすとい
う事実は、マイコバクテリウム hsp６５と交差反応する
抗原に対する免疫攻撃はベータ細胞に障害を与えること
を示している。このような免疫応答は、交差反応性 hsp
６５又は侵入する微生物により偶然免疫された後に起き
る最初の出来事である。hHSP６５又は関連蛋白の放出
も、ウイルス又は毒素（toxin)によるベータ細胞の障害
の後に起きるであろう。即ち血液又は尿中の hsp６５陽
性分子の出現がなぜＩＤＤＭの進行の初期の兆候である
かというと、それはこれらの分子はベータ細胞の障害の
進行に伴って放出されるからである。同様にhHSP６５に
対する免疫応答それ自身がＩＤＤＭを引き起こすため、
抗hHSP６５抗体はＩＤＤＭが迫っていることの信頼でき
る兆候である。
【００８１】hHSP６５の抗体が本来偶然の免疫の結果で
あっても、又はウイルスや毒素によるベータ細胞の障害
の後のhHSP６５の放出によるものであっても、ベータ細
胞中に含まれるhHSP６５が攻撃されるため、抗hHSP６５
抗体又は抗hHSP６５Ｔ細胞の産生は、ベータ細胞破壊の
過程を増強し永続させる。毒性抗 hsp６５Ｔ細胞により
移されたか又は hsp６５に対する能動的免疫により誘発
された急性糖尿病から回復した後は、自然発生ＩＤＤＭ
を防ぐことができるとうい事実は重要である。これは自
己免疫応答の動力学と規模がそれ自身の調節につながる
ということを示唆している。潜行性で慢性の過程は自己
免疫疾患に対する自然の防御に対し「こそこそ逃げてし
まう」ようであるが、明かな自己免疫刺激は制御を増強
するようである。疾患の急性発症による自己免疫疾患に
対する耐性の獲得は、実験的自己免疫脳脊髄炎（ＥＡ
Ｅ）のラットモデルで普通に見られる。ミエリン塩基性
蛋白（ myelin basic protein)に対する能動的免疫又は
活性Ｔ細胞の受動的転移により誘発された急性ＥＡＥか
らの自然回復の後は、ラットはＥＡＥをさらに誘発させ
ようとする試みに対して耐性を示す。ＥＡＥの発現は、
ミエリン塩基性蛋白に応答する毒性Ｔ細胞を調節するこ
とができる機構（おそらく抗イディオタイプ抑制）を活
性化することが見いだされた。減弱化した自己免疫Ｔ細
胞を使用してＴ細胞ワクチン接種をすることが、急性疾
患を引き起こさずに制御機構を活性化させる１つの方法
のようである。ＥＡＥに対するワクチン接種で示された
種類の抗イディオタイプ及び抗エルゴタイプ（anti-erg
otypic）Ｔ細胞は、自己免疫性抗 hsp６５Ｔ細胞を鎮
め、ＩＤＤＭの臨床症状の発現を防止する。
あっても、又はウイルスや毒素によるベータ細胞の障害
の後のhHSP６５の放出によるものであっても、ベータ細
胞中に含まれるhHSP６５が攻撃されるため、抗hHSP６５
抗体又は抗hHSP６５Ｔ細胞の産生は、ベータ細胞破壊の
過程を増強し永続させる。毒性抗 hsp６５Ｔ細胞により
移されたか又は hsp６５に対する能動的免疫により誘発
された急性糖尿病から回復した後は、自然発生ＩＤＤＭ
を防ぐことができるとうい事実は重要である。これは自
己免疫応答の動力学と規模がそれ自身の調節につながる
ということを示唆している。潜行性で慢性の過程は自己
免疫疾患に対する自然の防御に対し「こそこそ逃げてし
まう」ようであるが、明かな自己免疫刺激は制御を増強
するようである。疾患の急性発症による自己免疫疾患に
対する耐性の獲得は、実験的自己免疫脳脊髄炎（ＥＡ
Ｅ）のラットモデルで普通に見られる。ミエリン塩基性
蛋白（ myelin basic protein)に対する能動的免疫又は
活性Ｔ細胞の受動的転移により誘発された急性ＥＡＥか
らの自然回復の後は、ラットはＥＡＥをさらに誘発させ
ようとする試みに対して耐性を示す。ＥＡＥの発現は、
ミエリン塩基性蛋白に応答する毒性Ｔ細胞を調節するこ
とができる機構（おそらく抗イディオタイプ抑制）を活
性化することが見いだされた。減弱化した自己免疫Ｔ細
胞を使用してＴ細胞ワクチン接種をすることが、急性疾
患を引き起こさずに制御機構を活性化させる１つの方法
のようである。ＥＡＥに対するワクチン接種で示された
種類の抗イディオタイプ及び抗エルゴタイプ（anti-erg
otypic）Ｔ細胞は、自己免疫性抗 hsp６５Ｔ細胞を鎮
め、ＩＤＤＭの臨床症状の発現を防止する。
【００８２】この理論は、hHSP６５に対する免疫応答の
寛容又は抑制の誘導は、どのようにして糖尿病過程が開
始した後でもこれを防止し治療することができるかを説
明するのに役立つ。即ちhsp６５、hsp６５と交差反応す
る低分子量分子（２５、３０又は４７キロダルトン）、
又は断片、修飾されたペプチド配列、合成ペプチド、又
は融合蛋白の計画に基づく又は hsp６５の物理化学的要
求を満足するように計画された有機分子でさえも、hHSP
６５に対するポリクローナル抗体と交差反応するか又は
hHSP６５と交差反応する抗体の産生を引き起こすことが
できる限りは、ＩＤＤＭ過程を防止又は治療するのに使
用することができる。この目的のためには hsp６５のｐ
２７７配列が好適な物質である。さらにhHSP６５又は関
連抗原に対して特異的な減弱化Ｔ細胞は、その断片又は
活性部分とともに、このような免疫の誘発又はこのよう
な免疫応答の抑制に使用することができる。
寛容又は抑制の誘導は、どのようにして糖尿病過程が開
始した後でもこれを防止し治療することができるかを説
明するのに役立つ。即ちhsp６５、hsp６５と交差反応す
る低分子量分子（２５、３０又は４７キロダルトン）、
又は断片、修飾されたペプチド配列、合成ペプチド、又
は融合蛋白の計画に基づく又は hsp６５の物理化学的要
求を満足するように計画された有機分子でさえも、hHSP
６５に対するポリクローナル抗体と交差反応するか又は
hHSP６５と交差反応する抗体の産生を引き起こすことが
できる限りは、ＩＤＤＭ過程を防止又は治療するのに使
用することができる。この目的のためには hsp６５のｐ
２７７配列が好適な物質である。さらにhHSP６５又は関
連抗原に対して特異的な減弱化Ｔ細胞は、その断片又は
活性部分とともに、このような免疫の誘発又はこのよう
な免疫応答の抑制に使用することができる。
【００８３】hsp６５分子はhHSP６５に対する寛容を作
りだしてベータ細胞の自己破壊を停止させることによ
り、ＩＤＤＭの進行の持続に対して効果的な治療用組成
物として有用であることが証明されている。発生段階の
ＩＤＤＭのこのような治療に使用される活性成分は、hH
SP６５と免疫学的に交差反応する任意の物質である（即
ちそれはhHSP６５に対するポリクローナル抗体と交差反
応するか、又はhHSP６５と交差反応する抗体を誘導す
る）。このような物質はペプチドであろうと蛋白、炭水
化物又は他の物質であろうと、寛容を誘導する方法で投
与された場合は、この交差反応性によりhHSP６５に対す
る寛容を誘導するのに役立つ。この物質が hsp６５蛋白
の場合は、任意の種のものが使用できる。hHSP６５と免
疫学的に交差反応するために、この物質は完全な蛋白で
ある必要はなく、蛋白自身の抗原活性を保持する蛋白の
断片（例えばｐ２７７）でもよい。ある物質がhHSP６５
と交差反応するか否かはルーチンの実験により測定する
ことができる。その物質がhHSP６５に対するポリクロー
ナル抗体と交差反応するか、又はhHSP６５と交差反応す
る抗体の産生を誘導する場合、それは発生段階のＩＤＤ
Ｍの治療法に関する限り、本発明の範囲に含まれると考
えられる。このような物質がヒトの治療に使用できると
いう追加の証明は、実施例１０に記載したようにマウス
の試験で寛容の誘導を試験することである。このような
実験はルーチン的であり、過度な実験は必要ない。
りだしてベータ細胞の自己破壊を停止させることによ
り、ＩＤＤＭの進行の持続に対して効果的な治療用組成
物として有用であることが証明されている。発生段階の
ＩＤＤＭのこのような治療に使用される活性成分は、hH
SP６５と免疫学的に交差反応する任意の物質である（即
ちそれはhHSP６５に対するポリクローナル抗体と交差反
応するか、又はhHSP６５と交差反応する抗体を誘導す
る）。このような物質はペプチドであろうと蛋白、炭水
化物又は他の物質であろうと、寛容を誘導する方法で投
与された場合は、この交差反応性によりhHSP６５に対す
る寛容を誘導するのに役立つ。この物質が hsp６５蛋白
の場合は、任意の種のものが使用できる。hHSP６５と免
疫学的に交差反応するために、この物質は完全な蛋白で
ある必要はなく、蛋白自身の抗原活性を保持する蛋白の
断片（例えばｐ２７７）でもよい。ある物質がhHSP６５
と交差反応するか否かはルーチンの実験により測定する
ことができる。その物質がhHSP６５に対するポリクロー
ナル抗体と交差反応するか、又はhHSP６５と交差反応す
る抗体の産生を誘導する場合、それは発生段階のＩＤＤ
Ｍの治療法に関する限り、本発明の範囲に含まれると考
えられる。このような物質がヒトの治療に使用できると
いう追加の証明は、実施例１０に記載したようにマウス
の試験で寛容の誘導を試験することである。このような
実験はルーチン的であり、過度な実験は必要ない。
【００８４】ヒトＩＤＤＭの治療に好適な化合物はhHSP
６５である。ヒト熱ショック蛋白のアミノ酸配列は図３
に記載されている。この目的のためにこの蛋白を使用す
ることができる。そのｐ２７７配列はこの目的のための
もう一つの好適な分子である。ここに記載した hsp６５
蛋白以外に、 hsp６５と交差反応する能力を有するその
塩、官能性誘導体、前駆体及び活性画分も使用すること
ができる。図３の配列又はバンエデン(vanEden）ら（前
述）の記載する配列（１つ又はそれ以上のアミノ酸が欠
失しているか付加されている、又は他のアミノ酸で置換
されている）も、それらがhHSP６５と免疫学的に交差反
応する能力を有している限り、本発明に包含される。
６５である。ヒト熱ショック蛋白のアミノ酸配列は図３
に記載されている。この目的のためにこの蛋白を使用す
ることができる。そのｐ２７７配列はこの目的のための
もう一つの好適な分子である。ここに記載した hsp６５
蛋白以外に、 hsp６５と交差反応する能力を有するその
塩、官能性誘導体、前駆体及び活性画分も使用すること
ができる。図３の配列又はバンエデン(vanEden）ら（前
述）の記載する配列（１つ又はそれ以上のアミノ酸が欠
失しているか付加されている、又は他のアミノ酸で置換
されている）も、それらがhHSP６５と免疫学的に交差反
応する能力を有している限り、本発明に包含される。
【００８５】本明細書において「塩」という用語は、蛋
白分子のカルボキシル基の塩とアミノ基の酸付加塩の両
方を意味する。カルボキシル基の塩は当業者に公知の方
法で作成され、例えばナトリウム塩、カリウム塩、カル
シウム塩、アンモニウム塩、第二鉄塩、又は亜鉛塩など
の無機塩、そして例えばアミン（例えばトリエタノール
アミン、アルギニン又はリジン、ピペリジン、プロカイ
ンなど）との有機塩基の塩を含む。酸付加塩としては、
例えば無機酸（例えば塩酸又は硫酸）との塩、そして有
機酸（例えば酢酸又はシュウ酸）との塩を含む。本明細
書で使用される「官能性誘導体」という用語は、残基又
はＮ−又はＣ−末端基上の側鎖として存在する官能基か
ら当業者に公知の方法で調製される誘導体を意味してお
り、薬剤として許容される限り（即ち蛋白の活性を破壊
せず、それを含む組成物に有害な性質を与えず、その抗
原性に悪影響を与えない限り）本発明に包含される。
白分子のカルボキシル基の塩とアミノ基の酸付加塩の両
方を意味する。カルボキシル基の塩は当業者に公知の方
法で作成され、例えばナトリウム塩、カリウム塩、カル
シウム塩、アンモニウム塩、第二鉄塩、又は亜鉛塩など
の無機塩、そして例えばアミン（例えばトリエタノール
アミン、アルギニン又はリジン、ピペリジン、プロカイ
ンなど）との有機塩基の塩を含む。酸付加塩としては、
例えば無機酸（例えば塩酸又は硫酸）との塩、そして有
機酸（例えば酢酸又はシュウ酸）との塩を含む。本明細
書で使用される「官能性誘導体」という用語は、残基又
はＮ−又はＣ−末端基上の側鎖として存在する官能基か
ら当業者に公知の方法で調製される誘導体を意味してお
り、薬剤として許容される限り（即ち蛋白の活性を破壊
せず、それを含む組成物に有害な性質を与えず、その抗
原性に悪影響を与えない限り）本発明に包含される。
【００８６】これらの誘導体としては、例えばカルボキ
シル基の脂肪族エステル、アンモニウム又は一級又は二
級アミンとの反応によるカルボキシル基のアミド、アシ
ル部分（例えばアルカノイル、カルボサイクリックアロ
イル基）と作成されるアミノ酸残基の遊離アミノ基のＮ
−アシル誘導体、又はアシル部分と作成される遊離ヒド
ロキシ基（例えばセリン残基又はスレオニン残基のヒド
ロキシ基）のＯ−アシル誘導体がある。「前駆体」と
は、動物又はヒトの体内で hsp６５の前に形成され hsp
６５に変換される化合物である。
シル基の脂肪族エステル、アンモニウム又は一級又は二
級アミンとの反応によるカルボキシル基のアミド、アシ
ル部分（例えばアルカノイル、カルボサイクリックアロ
イル基）と作成されるアミノ酸残基の遊離アミノ基のＮ
−アシル誘導体、又はアシル部分と作成される遊離ヒド
ロキシ基（例えばセリン残基又はスレオニン残基のヒド
ロキシ基）のＯ−アシル誘導体がある。「前駆体」と
は、動物又はヒトの体内で hsp６５の前に形成され hsp
６５に変換される化合物である。
【００８７】本発明において実質的に精製された「活性
画分」としては、hHSP６５と交差反応する能力を有する
限り、 hsp６５蛋白分子単独又は関連する分子と一緒で
あるか又はそこに結合している残基（糖又はリン酸残
基）と一緒である hsp６５蛋白のポリペプチド鎖の断片
又は前駆体、又は蛋白分子又は糖残基自身の凝集体を含
む。このような活性画分の例としては、hHSP６５のｐ２
７７配列がある。
画分」としては、hHSP６５と交差反応する能力を有する
限り、 hsp６５蛋白分子単独又は関連する分子と一緒で
あるか又はそこに結合している残基（糖又はリン酸残
基）と一緒である hsp６５蛋白のポリペプチド鎖の断片
又は前駆体、又は蛋白分子又は糖残基自身の凝集体を含
む。このような活性画分の例としては、hHSP６５のｐ２
７７配列がある。
【００８８】前記の活性成分は、免疫原性応答を誘導す
るより寛容を誘導するような方法で投与することが、非
常に重要である。即ちそれは油又は他の免疫原性アジュ
バント中で投与されるべきである。活性成分が寛容を誘
導するのに好適な投与方法は、抗原−担体複合体が投与
された時抗原に対する寛容の誘導を促進する担体ととも
に投与することである。このような担体は寛容誘導性担
体（tolerogenic)として知られている。公知の寛容誘導
性担体としては、Ｄ−アミノ酸の重合体、ポリエチレン
グリコール、糖分子の重合体、自己ＩｇＧ分子、自己脾
臓細胞、及び脂肪酸分子がある。寛容を誘導するため
に、抗原はモノマーとして非常に可溶性の形で投与され
る。抗原に対する寛容を誘導する他の公知の方法は、寛
容誘導性特徴により具体的に選択された担体さえなしで
経口的に投与する方法である。寛容を誘導するための具
体的な投与方法は、通常の知識を有する当業者に公知で
あり、このような方法は本発明において使用される。こ
のような方法自体は本発明には含まれない。
るより寛容を誘導するような方法で投与することが、非
常に重要である。即ちそれは油又は他の免疫原性アジュ
バント中で投与されるべきである。活性成分が寛容を誘
導するのに好適な投与方法は、抗原−担体複合体が投与
された時抗原に対する寛容の誘導を促進する担体ととも
に投与することである。このような担体は寛容誘導性担
体（tolerogenic)として知られている。公知の寛容誘導
性担体としては、Ｄ−アミノ酸の重合体、ポリエチレン
グリコール、糖分子の重合体、自己ＩｇＧ分子、自己脾
臓細胞、及び脂肪酸分子がある。寛容を誘導するため
に、抗原はモノマーとして非常に可溶性の形で投与され
る。抗原に対する寛容を誘導する他の公知の方法は、寛
容誘導性特徴により具体的に選択された担体さえなしで
経口的に投与する方法である。寛容を誘導するための具
体的な投与方法は、通常の知識を有する当業者に公知で
あり、このような方法は本発明において使用される。こ
のような方法自体は本発明には含まれない。
【００８９】ＩＤＤＭの予防又は治療に使用されるＴ細
胞調製物は、前記のＩＤＤＭ特異的抗原に対する特異性
を獲得したＴ細胞（即ちhHSP６５、又はこれと交差反応
性の抗原、例えばｐ２７７に特異的）から得られる。こ
れらの特異的細胞は、このような抗原の存在下でインキ
ュベートするか、又はＴ細胞による免疫応答を誘導する
ことができるマイトジェン（例えばコンカナバリンＡ）
でインキュベートして活性化されていることが必要であ
る。このような活性化ＩＤＤＭ特異的Ｔ細胞は、好まし
くは例えば放射線照射により減弱化される。好適な減弱
化の方法（これはＴ細胞の免疫原性を増加させる好まし
い効果もある）は、充分な圧力と時間の水圧で処理し
て、膜蛋白の実質的な損失を伴うことなくＴ細胞の免疫
原性を増強させることによる、圧力処理である。又はそ
の圧力は、細胞から細胞表面蛋白が剥がれるような強さ
と時間であってもよい。低速遠心分離により細胞を除去
した後、高速遠心分離をしてその断片を、上澄液中に残
存している可溶性蛋白のように、ワクチンとして使用す
る。これらの方法のすべては本特許の譲受人のヨーロッ
パ特許第 261,648号に記載されており、その内容は参考
のため本明細書中に引用されている。ＩＤＤＭ特異的、
活性化Ｔ細胞はまた、化学的架橋剤（例えばホルムアル
デヒド、グルタルアルデヒド、又は８−メトキシソラレ
ンのような光活性化ソラレン架橋剤（本特許の譲受人の
ヨーロッパ特許 333,606号に記載されており、その内容
は参考のため本明細書中に引用されている））で処理し
てもよい。このようなＴ細胞はまた細胞骨格破壊剤（例
えばサイトカルシン（cytochalsin)又はコルヒチン（co
chicine)）で処理してもよい。圧力処理、化学的架橋剤
処理及び細胞骨格破壊剤処理のどれを組合せてもよい。
さらにこの様に処理した細胞は、溶解し、固定された細
胞膜のみ回収し、使用することができる。これらの方法
のすべては、ヨーロッパ特許第261,648 号に詳細に記載
されている。
胞調製物は、前記のＩＤＤＭ特異的抗原に対する特異性
を獲得したＴ細胞（即ちhHSP６５、又はこれと交差反応
性の抗原、例えばｐ２７７に特異的）から得られる。こ
れらの特異的細胞は、このような抗原の存在下でインキ
ュベートするか、又はＴ細胞による免疫応答を誘導する
ことができるマイトジェン（例えばコンカナバリンＡ）
でインキュベートして活性化されていることが必要であ
る。このような活性化ＩＤＤＭ特異的Ｔ細胞は、好まし
くは例えば放射線照射により減弱化される。好適な減弱
化の方法（これはＴ細胞の免疫原性を増加させる好まし
い効果もある）は、充分な圧力と時間の水圧で処理し
て、膜蛋白の実質的な損失を伴うことなくＴ細胞の免疫
原性を増強させることによる、圧力処理である。又はそ
の圧力は、細胞から細胞表面蛋白が剥がれるような強さ
と時間であってもよい。低速遠心分離により細胞を除去
した後、高速遠心分離をしてその断片を、上澄液中に残
存している可溶性蛋白のように、ワクチンとして使用す
る。これらの方法のすべては本特許の譲受人のヨーロッ
パ特許第 261,648号に記載されており、その内容は参考
のため本明細書中に引用されている。ＩＤＤＭ特異的、
活性化Ｔ細胞はまた、化学的架橋剤（例えばホルムアル
デヒド、グルタルアルデヒド、又は８−メトキシソラレ
ンのような光活性化ソラレン架橋剤（本特許の譲受人の
ヨーロッパ特許 333,606号に記載されており、その内容
は参考のため本明細書中に引用されている））で処理し
てもよい。このようなＴ細胞はまた細胞骨格破壊剤（例
えばサイトカルシン（cytochalsin)又はコルヒチン（co
chicine)）で処理してもよい。圧力処理、化学的架橋剤
処理及び細胞骨格破壊剤処理のどれを組合せてもよい。
さらにこの様に処理した細胞は、溶解し、固定された細
胞膜のみ回収し、使用することができる。これらの方法
のすべては、ヨーロッパ特許第261,648 号に詳細に記載
されている。
【００９０】ＩＤＤＭ抗原（即ちhHSP６５蛋白、又はこ
れと交差反応性の抗原）に特異的なＴ細胞リセプターの
可変領域、及び好ましくはそのＶＤＪ領域を単離し、自
己免疫脳脊髄炎Ｔ細胞リセプターに対する、ハウウェル
（Ｈowell)（前述）とバンデンバーク（Vandenbark)
（前述）の記載した方法で、本発明のＴ細胞ワクチン調
製物として使用することができる。本明細書に記載した
ようにＩＤＤＭ抗原がいったん明らかになれば、ＩＤＤ
Ｍに関してこれらすべての公知の方法を使用することが
できる。いったん抗原が公知になれば、通常の技術を有
する当業者は、過度の実験をすることなくこれらのすべ
ての技術を実施することができる。従って本発明はこの
ような方法のすべてを含むものと意図される。これらの
すべては、本発明の抗原を使用する追加の方法である。
このような寛容誘導性組成物は、例えばＩＤＤＭの進行
に関して遺伝的な危険性のあるＩＤＤＭ患者の家族で、
ＩＤＤＭの進行を防止するためのワクチンとして投与さ
れる。しかし好ましくは、血液又は尿中にhHSP６５が検
出される人で、好ましくはhHSP６５に対する免疫応答が
発現する前に、ＩＤＤＭの持続的進行を防止するために
使用される。寛容誘導性は免疫応答を防止し、従って調
節不可能な抗hHSP６５応答により引き起こされる障害
（ＩＤＤＭ）を防止する。しかし抗hHSP６５抗体が出現
した後に本発明の組成物を治療に使用しても遅すぎるこ
とはない。表８と表１３に示した実験の結果は、本発明
はランゲルハンス島に対する自己免疫が始まった後でも
免疫応答を停止するのに役立つことを示している。ヒト
の自己免疫過程の進行は何年もかかるため、応答のダウ
ン調節（down regulation)でさえ有効であろう。
れと交差反応性の抗原）に特異的なＴ細胞リセプターの
可変領域、及び好ましくはそのＶＤＪ領域を単離し、自
己免疫脳脊髄炎Ｔ細胞リセプターに対する、ハウウェル
（Ｈowell)（前述）とバンデンバーク（Vandenbark)
（前述）の記載した方法で、本発明のＴ細胞ワクチン調
製物として使用することができる。本明細書に記載した
ようにＩＤＤＭ抗原がいったん明らかになれば、ＩＤＤ
Ｍに関してこれらすべての公知の方法を使用することが
できる。いったん抗原が公知になれば、通常の技術を有
する当業者は、過度の実験をすることなくこれらのすべ
ての技術を実施することができる。従って本発明はこの
ような方法のすべてを含むものと意図される。これらの
すべては、本発明の抗原を使用する追加の方法である。
このような寛容誘導性組成物は、例えばＩＤＤＭの進行
に関して遺伝的な危険性のあるＩＤＤＭ患者の家族で、
ＩＤＤＭの進行を防止するためのワクチンとして投与さ
れる。しかし好ましくは、血液又は尿中にhHSP６５が検
出される人で、好ましくはhHSP６５に対する免疫応答が
発現する前に、ＩＤＤＭの持続的進行を防止するために
使用される。寛容誘導性は免疫応答を防止し、従って調
節不可能な抗hHSP６５応答により引き起こされる障害
（ＩＤＤＭ）を防止する。しかし抗hHSP６５抗体が出現
した後に本発明の組成物を治療に使用しても遅すぎるこ
とはない。表８と表１３に示した実験の結果は、本発明
はランゲルハンス島に対する自己免疫が始まった後でも
免疫応答を停止するのに役立つことを示している。ヒト
の自己免疫過程の進行は何年もかかるため、応答のダウ
ン調節（down regulation)でさえ有効であろう。
【００９１】hHSP６５又は関連蛋白（前述）は、ＩＤＤ
Ｍの診断のための診断組成物における抗原とともに、特
にＩＤＤＭの緩解と治療のためのワクチンとして、薬剤
組成物における免疫原として使用することができる。当
業者に公知の方法で調製される、これらの薬剤組成物及
び診断用組成物は、また本発明の一部を構成する。
Ｍの診断のための診断組成物における抗原とともに、特
にＩＤＤＭの緩解と治療のためのワクチンとして、薬剤
組成物における免疫原として使用することができる。当
業者に公知の方法で調製される、これらの薬剤組成物及
び診断用組成物は、また本発明の一部を構成する。
【００９２】hsp６５のワクチンとしての又は治療薬と
しての効果を改良するための別の方法は、公知の遺伝子
工学的方法で hsp６５をそのまま又は融合蛋白の一部と
して又はその多分子体(multimer)として発現する微生物
を作成することである。これらの微生物自身は、その微
生物に対する抗体の産生を刺激するのみでなく、ＩＤＤ
Ｍの緩解と治療に有用な生きたワクチンの調製に使用す
ることができる。これらの遺伝子工学的に作成された微
生物、及びそれらを含む薬剤組成物もまた、本発明の一
部を構成する。適切な遺伝子工学的に作成された微生物
の例としては、バクシニア（Vaccinia) やサルモネラ(S
almonella)の株がある。本発明の組成物は、経口的に又
は非経口的（例えば皮下、筋肉内、静脈内、鼻腔内、肛
門内）に投与される。寛容誘導性薬剤組成物は当業者に
公知の方法で調製される。前記の具体的な態様は、現在
の知識を応用することにより本発明の概念から逸脱する
ことなく、本発明の具体的な態様を他人が容易に修飾又
は適用することができるように、充分記載されており、
従ってその様な改良や応用は開示された態様内に包含さ
れるものと考えられる。本明細書で使用された用語は説
明のためのみであり、限定するものではない。
しての効果を改良するための別の方法は、公知の遺伝子
工学的方法で hsp６５をそのまま又は融合蛋白の一部と
して又はその多分子体(multimer)として発現する微生物
を作成することである。これらの微生物自身は、その微
生物に対する抗体の産生を刺激するのみでなく、ＩＤＤ
Ｍの緩解と治療に有用な生きたワクチンの調製に使用す
ることができる。これらの遺伝子工学的に作成された微
生物、及びそれらを含む薬剤組成物もまた、本発明の一
部を構成する。適切な遺伝子工学的に作成された微生物
の例としては、バクシニア（Vaccinia) やサルモネラ(S
almonella)の株がある。本発明の組成物は、経口的に又
は非経口的（例えば皮下、筋肉内、静脈内、鼻腔内、肛
門内）に投与される。寛容誘導性薬剤組成物は当業者に
公知の方法で調製される。前記の具体的な態様は、現在
の知識を応用することにより本発明の概念から逸脱する
ことなく、本発明の具体的な態様を他人が容易に修飾又
は適用することができるように、充分記載されており、
従ってその様な改良や応用は開示された態様内に包含さ
れるものと考えられる。本明細書で使用された用語は説
明のためのみであり、限定するものではない。
【図面の簡単な説明】
【図１】図１は、ＩＤＤＭを発症しなかったＮＯＤマウ
スの血清中の hsp６５、抗 hsp６５、抗インスリン抗
体、そして抗イディオタイプ抗体の量を示す。
スの血清中の hsp６５、抗 hsp６５、抗インスリン抗
体、そして抗イディオタイプ抗体の量を示す。
【図２】図２は、ＩＤＤＭを発症したＮＯＤマウスでは
疾患の進行が明瞭になる前に hsp６５と抗 hsp６５が顕
著に増加していることを示すグラフである。
疾患の進行が明瞭になる前に hsp６５と抗 hsp６５が顕
著に増加していることを示すグラフである。
【図３Ａ】図３Ａは、ヒトＰ１蛋白（これはhHSP６５で
ある）のヌクレオチドと、推定されるアミノ酸配列を示
す。
ある）のヌクレオチドと、推定されるアミノ酸配列を示
す。
【図３Ｂ】図３Ｂは、ヒトＰ１蛋白のヌクレオチドと推
定されるアミノ酸配列を示す。
定されるアミノ酸配列を示す。
【図４】図４は、年齢の関数としてのヒト hsp６５、 M
T-hsp ６５及び MT-hsp ７０に対するNOD/LtＴ細胞の自
然の反応性の程度を示すグラフである。
T-hsp ６５及び MT-hsp ７０に対するNOD/LtＴ細胞の自
然の反応性の程度を示すグラフである。
【図５】図５は、ペプチドの濃度の関数としてのｐ２７
７とｐ２７８に対するＴ細胞の増殖応答を示すグラフで
ある。
７とｐ２７８に対するＴ細胞の増殖応答を示すグラフで
ある。
【図６】図６は、ｐ２７７、 MT hsp６５そしてプラス
ミッドコントロールに応答しての、若い前糖尿病性NOD/
Ltマウスに急性糖尿病を移すことができるＣ７とＣ９Ｔ
細胞の増殖を示す棒グラフである。
ミッドコントロールに応答しての、若い前糖尿病性NOD/
Ltマウスに急性糖尿病を移すことができるＣ７とＣ９Ｔ
細胞の増殖を示す棒グラフである。
【図７】図７は、休止している誘導された糖尿病におけ
る、ペプチドｐ２７７とｐ２７８に対する免疫の結果を
示す。
る、ペプチドｐ２７７とｐ２７８に対する免疫の結果を
示す。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者 マルコビッツ，ドロン イスラエル国70 700 ジエデラ，ホロビ ッツ ストリート 11
Claims (7)
- 【請求項１】 患者の血液又は尿を検査して、hHSP６５
に対する抗体と免疫学的に反応性のある蛋白の有無、又
はhHSP６５と免疫学的に反応性のある抗体又はＴ細胞の
有無を調べることよりなる、患者のインスリン依存性糖
尿病（ＩＤＤＭ）の存在又はその発生段階（incipienc
e）を検出する方法。 - 【請求項２】 関節炎の激しい症状もしくはサインを示
さない患者のＩＤＤＭの存在又はその発生段階を検出す
る方法であって、 患者に対して、hHSP６５蛋白、抗−hHSP６５抗体、hHSP
６５と免疫反応するＴ細胞、又は、hHSP６５に対する抗
体と免疫反応するいずれかの蛋白と免疫反応するＴ細胞
もしくは抗体の存在を調べて、 hHSP６５蛋白、抗−hHSP６５抗体、hHSP６５と免疫反応
するＴ細胞、又は、hHSP６５に対する抗体と免疫反応す
るいずれかの蛋白と免疫反応するＴ細胞もしくは抗体の
存在陽性を示す結果によってＩＤＤＭの存在又は発生段
階の高い可能性を示す、 ことを含む請求項１の方法。 - 【請求項３】 抗−hHSP６５抗体の存在、又は、hHSP６
５に対する抗体と免疫反応するいずれかの蛋白と免疫反
応する抗体の存在について患者を調べる請求項１又は２
の方法。 - 【請求項４】 抗−hHSP６５抗体の存在、又はhHSP６５
に対する抗体と免疫反応するいずれかの蛋白と免疫反応
する抗体の存在を検出するために用いる抗原が、 (a) hHSP６５、 及び(b) Val-Leu-Gly-Gly-Gly-Cys-Ala-Leu-Leu-Arg-
Cys-Ile-Pro-Ala-Leu-Asp-Ser-Leu-Thr-Pro-Ala-Asn-Gl
u-Asp の配列を含むポリペプチド、又はそのいずれかの
修飾物であってそれと免疫学的に交差反応をするが完全
な熱ショック蛋白ではない修飾物、 からなる群より選ばれる請求項３の方法。 - 【請求項５】 hHSP６５と免疫反応するＴ細胞の存在、
又はhHSP６５に対する抗体と免疫反応するいずれかの蛋
白と免疫反応するＴ細胞の存在を、患者について調べる
請求項１の方法。 - 【請求項６】 Ｔ細胞増殖テストであって、 (i) 患者から得た血液サンプルのＴ細胞を含む単核細
胞フラクションを調製し； (ii) 該単核細胞フラクションに、(a)hHSP ６５；及
び(b)Val-Leu-Gly-Gly-Gly-Cys-Ala-Leu-Leu-Arg-Cys-I
le-Pro-Ala-Leu-Asp-Ser-Leu-Thr-Pro-Ala-Asn-Glu-Asp
の配列を含むポリペプチド、又はそのいずれかの修飾
物であってそれと免疫学的に交差反応をするが完全な熱
ショック蛋白ではない修飾物；からなる群より選ばれる
抗原を添加し； (iii) 該単核細胞フラクションを該抗原の存在下で、
適当な培養条件で適当な期間インキュベートし； (iv) インキュベーション期間が終る前の適当な時期
に(iii) のインキュベートした細胞培養物にラベル化ヌ
クレオチドを加えて、増殖するＴ細胞のＤＮＡにラベル
化ヌクレオチドが取り込まれるようにし； (v) 該Ｔ細胞へ取り込まれたラベル化ヌクレオチドの
量を分析して増殖するＴ細胞の量を決定する、 ことを含む上記Ｔ細胞増殖テストからなる、請求項５の
方法。 - 【請求項７】 ＩＤＤＭを診断するための、(a)hHSP ６
５；及び(b)Val-Leu-Gly-Gly-Gly-Cys-Ala-Leu-Leu-Arg
-Cys-Ile-Pro-Ala-Leu-Asp-Ser-Leu-Thr-Pro-Ala-Asn-G
lu-Aspの配列を含むポリペプチド、又はそのいずれかの
修飾物であってそれと免疫学的に交差反応をするが完全
な熱ショック蛋白ではない修飾物；からなる群より選ば
れる抗原。
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