FI103976B - Menetelmä insuliinista riippuvan diabetes mellituksen (IDDM:n) diagnosoimiseksi in vitro ja siinä käyttökelpoinen välineistö ja polypeptidi - Google Patents

Description

103976

Menetelmä insuliinista riippuvan diabetes mallituksen (IDDM:n) diagnosoimiseksi in vitro ja siinä käyttökelpoinen välineistö ja polypeptidi ' 5 Keksinnön kenttä Tämä keksintö koskee menetelmää insuliinista riippuvan diabetes mellituksen (IDDM:n) läsnäolon tai alkamisen diagnosoimiseksi in vitro potilaasta. Tarkemmin sanoen kuvataan menetelmää insuliinista riippuvan sokeritaudin (IDDM, 10 insulin dependent diabetes mellitus) olemassaolon, sen kehitys taipumuksen tai siihen johtavan prosessin käynnistymisen detektoimiseksi määrittämällä 65 kD:n lämpösokkiproteiinin (hsp65:n) tai sen kanssa ristireagoivan molekyylin tai mainitunlaisen proteiinin kanssa reagoivien vasta-aineiden tai 15 T-solujen läsnäolo.

Tämä keksintö koskee myös välineistöä ja polypepti-diä, jotka ovat käyttökelpoisia IDDM:n läsnäolon diagnosoimiseksi .

Keksinnön tausta 20 Insuliinista riippuvan sokeritaudin (IDDM:n) esiin tymistiheys on kasvanut monikertaiseksi viime vuosikymmenien aikana monissa maissa, ja arvioidaan, että 1 %:lle tällä hetkellä elävistä ihmisistä on kehittynyt IDDM, ennen kuin he saavuttavat 70 vuoden iän. IDDM:n aiheuttaa autoimmuunit 25 niprosessi, joka tuhoaa insuliinia tuottavia beetasoluja. i Diabetes tulee kliinisesti havaittavaksi vasta hyvin suuren

• M

osan (ehkä 90 %) beetasoluista tuhouduttua peruuttamattomas- • · « ti, ja tämän yksilön elämä tulee riippuvaiseksi ulkoisesta * · i insuliinilähteestä. Toisin sanoen kliinisen diagnoosin teko-30 hetkellä autoimmuuniprosessi on jo aiheuttanut palautumaton- 4 II· *’ * ta vahinkoa, suurimman osan siitä ilman havaittavia oireita.

• · « · · *·' ' Mainitun sairauden syynä olevan autoimmuuniprosessin menestyksellinen hoito tulisi aloittaa, ennen kuin potilaal-la on ilmeisiä sokeritaudin oireita ja hän tarvitsee insu- II· 35 liinia korvaamaan menetetty kyky tuottaa insuliinia. Tämän « « « ' autoimmuuniprosessin pysäyttäminen johtaisi sairauden para- < * · I « 2 103976 nemiseen ja ulkopuolisen insuliinin tarpeen estämiseen vain silloin, jos sairausprosessi voitaisiin pysäyttää vaiheessa, jossa potilaalla vielä on riittävä määrä beetasoluja endo-geenisen insuliinin tuottamiseksi riittävässä määrin. Siksi 5 mikä tahansa hoitomuoto olisi tehokkaampi, jos vaarassa olevat henkilöt voitaisiin identifioida silloin, kun heillä ei vielä ole näkyviä IDDM-oireita, ja ennen kuin potilaat tarvitsevat eksogeenista insuliinia. Noin 90 % uusista IDDM-tapauksista ilmenee muualla kuin suvuissa, joissa on tunnet-10 tuja tapauksia. Siksi massaseulontaan soveltuvia määrityksiä tarvitaan kipeästi detektoimaan sairausprosessi ennen kliinisiä oireita vaiheessa, jossa se ei vielä ole palautumaton.

Onneksi on olemassa erilaisia IDDM-eläinmalleja, mukaan luettuina BB-rotat ja NOD-hiiret [katso esimerkiksi 15 Rossini et ai., Ann. Rev. Immunol. 3 (1985) 289 - 320]. Monilla eläimillä kehittyy spontaanisti autoimmuuni-IDEM, jolla on monia ihmisten IDDM:m piirteitä.

Lämpösokkiproteiinit (hsp:t) ovat ryhmä proteiineja, joita tuottavat korotetuille lämpötiloille tai muille rasi-20 tuksille altistetut solut. hsp:ihin kuuluu proteiineja, joilla on erilainen moolimassa, mukaan luettuina 20 kD, 65 -68 kD, 70 kD, 90 kD, 110 kD jne. Lämpösokkiproteiineja esiintyy kaikkialla luonnossa; niitä tuottavat bakteerit, hiivat, kasvit, hyönteiset ja ylemmät eläimet, mukaan luet-:#j#; 25 tuna ihminen, hsp-proteiinit ovat hyvin evoluutiossa säily- • neitä ja huomattavan homologisia kaikkien näiden erilaisten .··*. eliöiden kesken. Koska lämpösokkiproteiinit ovat säilyneet • · · äärimmäisen hyvin koko evoluution ajan, niiden ajatellaan • · · toteuttavan elintärkeitä tehtäviä. Niiden synteesi tavalli-... 30 sesti lisääntyy solujen jouduttua alttiiksi rasittaville är-

I « I

*·]φ* sykkeille, mukaan luettuina lämpö, tietyt metallit, lääkkeet t « » *·* * tai aminohappoanalogit. Näiden proteiinien erityistehtävät ovat kuitenkin vielä tuntemattomia.

Systeemistä punahukkaa (SLE, systemic lupus erythe- « I < 35 matosus) sairastavilla potilailla on esimerkiksi havaittu

I I I

·. ' vasta-aineita 90 kD:n lämpösokkiproteiinille [Minota et ai., • * «

I (I

3 103976 J. Clin. Invest. 81 (1988) 106 - 109]. Näiden hsp90:n vasta-aineiden toimintaa ei tunneta.

hsp65:n on havaittu liittyvän adjuvanttiartriittiin rotilla [katso van Eden et ai., Nature 331 (1988) 171 - 5 173]. Adjuvanttiartriitti on autoimmuuniartriitti, jonka laukaisee tiettyjen rottakantojen immunisointi Mycobacterium tuberculosis -organismien (MT) suhteen. On havaittu, että T-lymfosyyttiklooni, joka reagoi MT:n hsp65:n erääseen 9 aminohapon pituiseen peptidisekvenssiin (180-188), voi siirtää 10 tämän taudin immunologisesti kehittymättömiin, säteilytet-tyihin rottiin. Niinpä ilmeni, että adjuvanttiartriitti on anti-hsp65-T-lymfosyyttien aikaansaama autoimmuunisairaus. Niveliin kohdistuvan autoimmuunihyökkäyksen aiheutti osittainen sekvenssihomologia hsp65-peptidin 180-185 ja ruston 15 proteoglykaanin kytkentäproteiinin erään segmentin välillä [katso Cohen, Scientific American 256 (988) 52 - 60] . On myös havaittu reumatoidista artriittia sairastavien potilaiden nivelnesteiden T-lymfosyyttien reagoivan MT:n hsp65:een [katso Res et ai., Lancet II (1988) 478 - 480].

20 hsp65:n annon rotille ennen adjuvanttiartriitin in- dusointia havaittiin estävän artriitin myöhempi kehittyminen. Niinpä immuunivasteen läsnäolo hsp65:lle liittyi art- riittiin sekä rotissa että ihmisissä, ja hsp65:n anto pystyi johtamaan resistenssiin artriitin suhteen.

: 25 EP-hakemusjulkaisussa 262 710 esitetään polypeptide- • jä, jotka ovat käyttökelpoisia mm. autoimmuuniartriitin ja IM f .···. vastaavien autoimmuunisairauksien diagnosoinnissa. Ihmisen • · ·

Pl-proteiinin koko primaarirakenne, mukaan luettuina nukleo- t t · tidisekvenssi ja päätelty aminohapposekvenssi, on julkaistu ... 30 jokin aika sitten [Jindal, S. et ai., Primary Structure of a τ · ·

Human Mitochondrial Protein Homologous to the Bacterial and • · m V ' Plant Chaperonins and to the 65-Kilodalton Mycobacterial An- tigen, Molecular and Cellular Biology 9, 5 (1989) 2 279 - 2 283]. Tämä proteiini, jonka moolimassan ilmoitetaan olevan

I I I

..·. 35 noin 63 kD, on ihmisen lämpösokkioproteiini, jota kutsutaan

t I I

·’ tässä hHSP65-proteiiniksi. Tämän julkaisun koko sisältö mai- • » 4 103976 nitaan tässä viitteenä. Tämän hakemuksen kuviossa 3 toistetun tämän proteiinin rakenteen on tarkoitus olla identtinen Jindalin julkaisussa esitetyn kanssa.

Yhteenveto keksinnöstä 5 Tämän keksinnön eräänä päämääränä on tarjota mene telmiä insuliinista riippuvan sokeritaudin (IDDMrn) diagnosoimiseksi varhaisessa vaiheessa.

Tämän keksinnön eräänä lisäpäämääränä on tarjota käyttöön välineistöjä käytettäviksi IDDMrn varhaisessa diag-10 nosoinnissa.

Tämän keksinnön toisena lisäpäämääränä on tarjota käyttöön diagnosoinnissa käyttökelpoisia polypeptidejä.

Tämän keksinnön yhteydessä tehtyjen havaintojen mukaan IDDMrn kehittymisen aikana eläimet tuottavat hsp65-15 molekyylejä tai molekyylejä, jotka ovat sen kanssa ristire-aktiivisia ja jotka kulkeutuvat eläinten vereen ja virtsaan.

Ne tuottavat myös vasta-aineita ja T-soluja, jotka ovat spesifisesti tällaisten molekyylien vastaisia. Niinpä hsp65rn tai sen kanssa ristireaktiivisten molekyylien tai sille spe-20 sifisten vasta-aineiden tai T-solujen läsnäolo veressä tai virtsassa osoittaa IDDM-prosessin, ennen kuin beetasolut ovat kokonaan tuhoutuneet ja yksilö on tuomittu elinikäiseen sokeritautiin.

IDDMrn esiintyminen tai alkaminen potilaassa voidaan : 25 diagnosoida tutkimalla hsp65rn tai sen kanssa ristireaktii- ·«· • visten molekyylien tai sille spesifisten vasta-aineiden tai ··* · .···. T-solujen läsnäolo.

• » .···, Keksintö koskee siten menetelmää insuliinista riip- • · » puvan diabetes mellituksen (IDDMrn) läsnäolon tai alkamisen ,,, 30 diagnosoimiseksi in vitro potilaasta, jolle menetelmälle on • « · *·* ' tunnusomaista, että potilaan veri tai virtsa testataan kuvi- • » * V 5 ossa 3 esitettyä ihmisen 65 kDrn lämpösokkiproteiinia \r (hHSP65:ä) tai sen sekvenssiä p277, Val-Leu-Gly-Gly-Gly-Cys- ,' ·1, Ala-eu-Leu-Arg-Cys-Ile-Pro-Ala-Leu-Asp-Ser-Leu-Thr-Pro-Ala- 35 Asn-Glu-Asp, vastaan muodostettujen vasta-aineiden kanssa ( I « : *' immunologisesti reagoivan proteiinin läsnäolon tai hHSP65rn « « · • · * • « 5 103976 tai sen sekvenssin p277 käsittävän polypeptidin kanssa immu-nologisesti reagoivien vasta-aineiden tai T-solujen läsnäolon toteamiseksi.

Keksintö koskee myös välineistöä IDEM:n läsnäolon 5 diagnosoimiseksi, jolle on tunnusomaista, että se käsittää kuviossa 3 esitetyn hHSP65:n idiotyyppivasta-aineita ja leimattua vasta-ainetta, joka kykenee tunnistamaan detektoitavan hHSP65-vasta-aineen tai anti-hHSP65-idiotyyppi-vasta-aineen muuttumattoman alueen, ja reagenssia, joka kykenee 10 aikaansaamaan detektoitavissa olevan, hHSP65:n tai sen vasta-aineiden läsnäolon ilmoittavan signaalin.

Keksintö koskee lisäksi polypeptidiä, jolle on tunnusomaista, että se sisältää sekvenssin Val-Leu-Gly-Gly-Gly-Cys-Ala-Leu-Leu-Arg-Cys-Ile-Pro-Ala-Leu-Asp-Ser-Leu-Thr-Pro-15 Ala-Asn-Glu-Asp tai sen minkä tahansa muunnoksen, joka on sen kanssa immunologisesti ristireaktiivinen, mutta joka ei ole koko lämpösokkiproteiini, edellyttäen, että polypeptidi, jolla on seuraava aminohapposekvenssi

1 MAKTIAYDEE ARRGLERGLN ALADAVKVTL GPKGRNWLE KKWGAPTITN 20 DGVSIAKEIE

61 LEDPYEKIGA ELVKEVAKKT DDVAGDGTTT ATVLAQALVR EGLRNVAAGA NPLGLKRGIE

i

121 KAVEKVTETL LKGAKEVETK EQIAATAAIS AGDQSIGDLI AEAMDKVGNE GVITVEESNT

: 25 181 FGLQLELTEG MRFDKGYISG YFVTDPERQE avledpyill vsskvstvkd • · · : llpllekvig

!···! 241 AGKPLLIIAE DVEGEALSTL WNKIRGTFK SVAVKAPGFG DRRKAMLQDM

• ·

.··.·. AILTGGQVIS

301 EEVGLTLENA DLSLLGKARK VWTKDETTI VEGAGDTDAI AGRVAQIRQE

30 IENSDSDYDR

! 361 EKLQERLAKL AGGVAVIKAG AATEVELKER KHRIEDAVRN AKAÄVEEGIV

• · ·

! AGGGVTLLQA

421 APTLDELKLE GDEATGANIV KVALEAPLKQ IAFNSGLEPG WAEKVRNLP

."'; AGHGLNAQTG

.Λ 35 481 VYEDLLAAGV ADPVKVTRSA LQNAASIAGL FLTTEAWAD KPEKEKASVP

: ’ GGGDMGGMDF

• · I I < • · · • « 6 103976 ja polypeptidit, joilla on aminohapposekvenssit 234-540, 61-540, 109-540, 171-540, 272-540 ja 280-540 sekä ihmisen mitokondrioproteiini P1 ovat poissuljettuja.

Piirustusten lyhyt kuvaus 5 Keksintö lienee helpommin ymmärrettävissä seuraavas- ta piirustusten lyhyestä kuvauksesta ja sitä seuraavasta edullisten suoritusmuotojen yksityiskohtaisesta kuvauksesta.

Kuvio 1 esittää hsp65:n, anti-hsp65:n, anti-insuliinivasta-aineen ja anti-idiotyyppivasta-aineen määriä 10 NOD-hiirien seerumissa, joille ei ole kehittynyt IDDMrää.

Kuvio 2 on käyrä, joka osoittaa, että merkittävä hsp65:n ja anti-hsp65:n lisääntyminen edeltää näkyvän IDDMrn kehittymistä NOD-hiirissä, joille tämä sairaus kehittyy. Anti-insuliini- ja anti-idiotyyppivasta-aine (DM) edelsivät 15 IDDM:ää vähäisemmässä määrin.

Kuvio 3 esittää ihmisen Pl-proteiinin, joka on hHSP65, nukleotidisekvenssiä ja pääteltyä aminohapposekvenssiä. Vasemmalla olevat numerot viittaavat nukleotidisekvens-siin suhteessa koordinaattiin 1, joka on otaksutun aloitus-20 kodonin alussa. Aminohapposekvenssi on numeroitu samasta pisteestä lähtien aloittaen numerosta 1. Tämän lukukehyksen 5'-pään pidennys esitetään yksikirjaimisin koodein. Sisäi-sen, lambda22a-sekvenssin alkua osoittavan EcoRI-kohdan ’J": (nukleotidi 712) sijainti on osoitettu. Polyadenylaatiosig- : 25 naali, joka on 15 nukleotidin päässä 3'-pään A-hännästä, on • alleviivattu. Oletettu mitokondriokohdistussekvenssi N-··· · .··. terminaalisessa päässä ja keratiinin kaltainen aminohappo- sekvenssi C-terminaalisessa päässä, joka sisältää toistuvia • · ·

Gly-Gly-Met-jaksoja, on merkitty laatikolla. Positiivisesti 30 varatut aminohapot C-terminaalisessa alkujaksossa on osoi- • 4 · tettu (+) .

• · · ’·* * Kuvio 4 on käyrä, joka esittää NOD/Lt-hiirten Τι',. solujen spontaania reaktiivisuutta ihmisen hsp65:n, MT- hsp65:n ja MT-hsp70:n suhteen iän funktiona.

I I t I

I t c i » r « » i i « i i

< I

7 103976

Kuvio 5 on käyrä, joka esittää T-solujen proliferaa-tiovastetta p277:ään ja p278:aan peptidipitoisuuden funktiona.

Kuvio 6 on pylväsdiagrammi/ joka esittää T-solu- 5 kloonien C7 ja C9, joilla on kyky siirtää akuutti diabetes nuoriin, diabetesta edeltävässä vaiheessa oleviin NOD/Lt-hiiriin, proliferaatiovastetta p277:ään, MThsp65:een ja plasmidivertailunäytteeseen.

Edullisten suoritusmuotojen yksityiskohtainen kuvaus 10 Seuraavissa esimerkeissä esitetään tämän keksinnön erityissuoritusmuotoja ja tähän keksintöön liittyviä kokeita. Ne on tarkoitettu vain esimerkeiksi ja esitetään keksintöä rajoittamattomina.

Esimerkki 1 15 MThsp65-molekyylin tuotanto

Mycobacterium tuberculosisin hsp-molekyyli transfek-toitiin E. coliin tavanomaisin menettelyin ja puhdistettiin van Edenin et ai. [Nature 331 (1988) 171 - 173] kuvaamalla tavalla. Tällaiset geeniteknisesti käsitellyt E. coli -solut 20 tuottavat olennaisia määriä MThsp65:ä. Erilaisista lähteistä peräisin olevien hsp:iden läheisen homologian ansiosta nisäkäs- tai ihmisperäinen hsp65 on myös tehokas tuotettuna gee-niteknisesti tai eristämällä soluista.

Esimerkki 2 : 25 MThsp65:n vastaisten vasta-aineiden tuotanto • · · • Tavanomaisen laboratoriokannan kaniinit (New Zealand • · · ·

White) inokuloitiin injektoimalla ihonalaisesti selkään • · « .·;·. 100 mg esimerkin 1 mukaisesti tuotettua MThsp65:ä fysiologi- • · · sessa suolaliuoksessa (0,5 ml) emulgoituna mineraaliöljyyn ...^ 30 (0,1 ml) (epätäydellinen adjuvantti) . Kuukauden kuluttua ka- niineille annettiin tehosteeksi 100 mg MThsp65:ä fysiologi- • ft *·* ‘ sessa suolaliuoksessa (1,0 ml) ja kahden viikon kuluttua ka- i niineista otettiin verinäytteet ja kerättiin seerumi. Kanii- neille annettiin tehosteannos samalla tavalla kahden kuukau- ( i t 35 den kuluttua ja otettiin jälleen verinäyte. Seerumin vasta-

« « I

< « 4 I I 4 4 14

4 I

8 103976 aineita käytettiin hsp65:n detektointiin koe-eläinten ja ihmisten verestä ja virtsasta.

Esimerkki 3 hsp65-määri tys 5 hsp65-molekyylin läsnäolon toteamiseen käytetään ta vanomaista kiinteäfaasiradioimmuunimääritystä. Taipuisia PVC-mikromaljoja pidetään päällystettyinä tutkittavalla seerumilla tai virtsalla (100 ml) 18 tuntia lämpötilassa 4 °C ja pestään sitten fosfaattipuskuroidulla fysiologisella suo-10 laliuoksella (PBS). Kaniinin vertailuseerumi tai anti-hsp65-seerumi (tuotettu esimerkin 2 mukaisesti) laimennetaan sitten suhteessa 1:100 PBS:llä, joka sisältää 0,1 % naudan see-rumialbumiinia (BSA), lisätään 50 ml seosta kuhunkin syvennykseen ja inkuboidaan 2-3 tuntia lämpötilassa 37 °C. Sy-15 vennykset pestään sitten kolmesti PBSrllä. Lisätään kuhunkin syvennykseen 100 000 cpm (sykäystä minuutissa) 125I-leimattua vuohen anti-kaniini-Ig:tä ja pidetään syvennyksiä kaksi tuntia lämpötilassa 37 °C. Maljat pestään sitten neljästi PBS:llä, kuivataan ja tehdään laskenta gammalaskurissa. An-20 ti-hsp65-seerumilla saadut arvot, jotka ovat 2 kertaa stan-dardipoikkeman verran normaalilla kaniinin seerumilla saadun keskimääräisen cpm-arvon yläpuolella, katsotaan osoitukseksi hsp65:n läsnäolosta.

Esimerkki 4 : 25 Anti-hsp65-vasta-aineiden määritys • · · • hsp65:n vastaiset vasta-aineet detektoidaan samalla IM · tavalla, paitsi että maljoihin sidottava antigeeni ei ole • · m tutkittava seerumi eikä virtsa vaan esimerkin 1 mukaisesti • · · tuotettu puhdistettu MThsp65, jota käytetään 5 mm/syvennys.

... 30 Seerumi, josta on määrä testata anti-hsp65-vasta-aineet, • · · * laimennetaan suhteessa 1:50. Virtsa käytetään laimentamatto- • · · * mana. Seerumia tai virtsaa lisätään syvennyksiin, jotka si- : sältävät hsp65:ä, ja hsp65:een sitoutuvien vasta-aineiden ; läsnäolo detektoidaan käyttämällä radionuklidileimattua vuo- « ( : 35 hen anti-hiiri-Ig:tä hiirinäytteille ja vuohen anti-ihmis- « I · :t \ Ig:tä ihmisnäytteille. Loppuosa määrityksestä toteutetaan « « < « « « 9 103976 esimerkissä 3 kuvatulla tavalla. Positiivisiksi tuloksiksi määritellään cpm-arvot, jotka ovat yli 2 kertaa standardi-poikkeaman verran suurempia kuin keskimääräinen cpm-arvo, joka saadaan käyttämällä terveistä hiiristä, rotista tai ih-5 misistä peräisin olevia vertailuseerumeita.

Esimerkki 5 hsp65-molekyylit ja anti-hsp65-vasta-aineet detek-toivat IDDM:n kehittymisen ennen sen puhkeamista NOD-hiiret 10 14 NOD-naarashiirestä otettiin verinäytteitä aloit taen 21. elinpäivästä säännöllisin väliajoin noin 200 päivän ajan ja arvioitiin ne IDDM:n kehittymisen suhteen. Seerumeista testattiin hsp65, anti-hsp65, anti-insuliinivasta-aineet ja DM-idiotyypin vastaiset anti-idiotyyppivasta-15 aineet.

hsp65 tutkittiin käyttämällä esimerkin 3 mukaista määritystä. Anti-hsp65-vasta-aineiden läsnäolo määritettiin esimerkin 4 mukaisella menettelyllä. Anti-insuliinivasta-aineet ovat idiotyyppivasta-aineita, jotka tunnistavat insu-20 liinin reseptorisitoutumiskohtia ja joita joskus kutsutaan DM-idiotyyppivasta-aineiksi. Anti-idiotyyppivasta-aineet ovat DM-idiotyyppivasta-aineiden vastaisia vasta-aineita, joita joskus kutsutaan anti-DM-idiotyyppivasta-aineiksi. EP-hakemusjulkaisussa 334 687 esitetään, että DM-idiotyyppi-: 25 vasta-aineiden tai anti-DM-idiotyyppivasta-ainei- den läsnä- t · · : olo potilaan seerumissa tai virtsassa on positiivinen osoi- • · t · .···. tus alkuvaiheessa olevasta tai aktiivisesta IDDM:stä. Täi- • · ,···. laisia vasta-aineita ei esiinny terveiden potilaiden seeru- i · * missä eikä virtsassa. Anti-insuliinivasta-aineiden ja anti- ... 30 idiotyyppivasta-aineiden läsnäolon määrittämiseen käytettä- • · · vät menettelyt ovat samanlaisia, kuin on kuvattu mainitussa • · · ’·' ' EP-hakemusjulkaisussa 334 687, jonka koko sisältö mainitaan : tässä viitteenä.

Kymmenelle NOD-hiirelle kehittyi IDDM, ja neljä säi-

I I I

35 lyi vapaina iDDMrstä. Kuviossa 1 esitetään tulokset, joita • i « ·_ ·'_ saatiin tutkittaessa yhden hiiren seerumit, jolle ei kehit- • · « « · « · 10 103976 tynyt IDDM:ää, ja kuviossa 2 esitetään tulokset, jotka saatiin tutkittaessa yhden hiiren seerumit, jolle kehittyi IDDM. On nähtävissä, että verrattuna IDDM:stä vapaaseen hiireen hiirellä, jolle kehittyi IDDM 185. elinpäivänä, hsp65-5 pitoisuus alkoi kasvaa merkittävästi päivänä 85. hsp65-pitoisuus laski, kun IDDM oli todella ilmaantunut. Anti-hsp65-vasta-aineet ilmaantuivat muutamia viikkoja hsp65:n ilmaantumisen jälkeen. Anti-insuliini- ja anti-idiotyyyppi-vasta-aineet (DM) ilmaantuivat paljon myöhemmin. Niinpä 10 hsp65- ja anti-hsp65-tasojen nousu edelsi kliinistä IDDM:ää ja toimivat varhaismerkkeinä kliinistä vaihetta edeltävästä sairausprosessista.

Taulukossa 1 esitetään kumulatiiviset tulokset, joita saatiin 14 yksittäiselle hiirelle.

• « 1 • · · • · • · · • · · M· · • · · • · • · • · · • · · • · · • · M· t · · • · • · · • · · • · · • · « « « a · • · · • « · • · · · i « · • « · « 11 103976

Taulukko 1

Tulossa olevan IDDM:n määritys NOD-hiirten seerumista 5

Positiivisen testin ja IDDM:n puhkeamisen välinen aika (päivää)________ IDDM:n - .

puhkeamis- anti-

Hiiri päivä hsp65 hsp65 « il il T·· ' ' 1 ei IDDM:ää 000 0 10 2 ei IDDM:ää 000 0 3 ei IDDM:ää 000 0 4 ei IDDM:ää 000 0 15 5 185 90 45 45 30 6 185 100 50 45 20 7 170 90 60 60 30 8 170 100 50 30 20 20 9 145 60 60 25 15 10 145 70 30 15 15 .,’i' 11 145 60 40 20 20 12 130 50 20 0 0 ’/‘I 13 115 55 55 20 20 • · · f · · 14 115 50 30 30 20 • * I II " f · · « · · 150,5 72,5 44 29 19 M': 30 8-)28 6>47 4 j2 2 5,47 2,67 mediaani 145 65 47,5 27,5 20 • · • · • f · IDDM:n keskimääräinen puhkeamisikä oli 150,5 päivää • · « 35 hiirillä, joille sairaus kehittyi. hsp65-seerumitesti oli : * : ·. *, positiivinen keskimäärin 72,5 päivää ennen IDDM:ää, ja anti- (Il f · · 12 103976 hsp65-testi oli positiivinen keskimäärin 44 päivää ennen IDDM:ää. Anti-insuliini- ja anti-idiotyyppivasta-ainetestit olivat positiivisia vain keskimäärin 29 ja 19 päivää ennen IDDMrää. Testitulokset eivät olleet merkitsevästi positiivi-5 siä hiirillä, jotka välttyivät IDEMrstä. Siksi hsp65 ja an-ti-hsp65 ovat suhteellisen varhaisia IDDM:n lopulta tapahtuvan kehittymisen indikaattoreita.

NOD-hiirten virtsasta tutkittiin hsp65:n läsnäolo noin 100 päivän iässä. Taulukko 2 osoittaa, että virtsako-10 keen tulos oli positiivinen hiirillä, joille kehittyi IDDM.

Taulukko 2

Tulossa olevan IDDM:n määritys NOD-hiirten virtsasta 15 IDDM hsp65-positiiviset virtsanäytteet kyllä 10/10 ei 0/4 20 B-rotat 9 II» ··! Taulukko 3 osoittaa, että BB-rotilla, joille ei ke- hittynyt IDDMrää, ei esiintynyt hsp65:ä eikä anti-hsp65:ä

·,·.ί 25 seerumissa eikä virtsassa. Rotilla, joille kehittyi IDDM

(päivänä 90 - 100), saatiin positiivinen tulos, kun testi ·"*: tehtiin 10 - 20 päivää ennen IDEM:n puhkeamista. Määritykset • · · tehtiin esimerkeissä 3 ja 4 esitetyllä tavalla.

• · · • · t • · · • · · «·» • f · i · · • • · 9 · I I |

Ml • · I i · 9 I · · • « · • 9 • · * 9 I · * I | · • «

J

Taulukko 3 13 103976 IDDM:ään liittyvän hsp65:n ja anti-hsp65:n määritys BB-rotista 5 _______ IDDM: n kehittyminen_Seerumi__Virtsa_ hsp65 anti-hsp65 hsp65 anti-hsp65 10 kyllä 10/10 5/5 4/5 3/5 ei 0/5 0/5 0/5 0/5 IDDM-ihmispotilaat 15 Viidestä potilaasta erilaisina aikoina ennen IDDM:n kehittymistä kerättyjä seerumeja oli saatavana. Nämä seerumit oli otettu mainituista henkilöistä H - 2 vuotta ennen IDDM:n puhkeamista, koska he olivat tunnettujen IDDM-potilaiden lähisukulaisia ja heidän ajateltiin olevan itse 20 vaarassa saada IDDM.

Mainittujen henkilöiden lisäksi hsp65 tutkittiin neljän äskettäin diagnosoidun IDDM-potilaan seerumista ja virtsasta. Vertailuseerumi- ja virtsanäytteitä otettiin 10 "·potilaasta, joilla oli aktiivinen multippeliskleroosi, ja 35 : 25 lapsesta, jotka olivat yleissairaalassa erilaisten ongelmien { vuoksi, jotka eivät liittyneet IDDM:ään. Määritykset tehtiin

Ml · .···, noudattaen esimerkkien 3 ja 4 mukaisia menettelyjä.

• · φ • · · • · » • · · • * ♦

I I I III

• t · • t · • · · t • ·

* I

«Il ,

• I I

• I «

III

•

I I

• I I

• I

• I

t ·

• Il I II

• I

Taulukko 4 14 103976 hHSP65 ja anti-hHSP65 IDDM-ihmispotilaissa 5 Ihmiset _Seerumi_ Virtsa _ hHSP65 anti-hHSP65 hHSP65 anti-hHSP_65

Esi-IDDM 4/5 4/5 N.D. N.D.

Uusi IDDM 2/4 2/4 2/4 2/4 10

Multippeli- 0/10 0/10 N.D. N.D.

Sairaalahoidossa olevat Ö/35 0/35 N.D. N.D.

lapset (ei IDDM:ää) 15 aikuiset 0/10 0/10 0/10 0/10

Edellä olevasta taulukosta on nähtävissä, että neljä viidestä esi-IDDM-potilaasta ja kaksi neljästä IDDM-potilaasta olivat positiivisia hHSP65- ja anti-hHSP65-20 määrityksissä. Yksikään vertailupotilaista ei ollut positiivinen. Niinpä kaniineissa MT:n hsp65:ä vastaan muodostetulla anti-hsp65:llä pystyttiin detektoimaan IDDM:n kehittymiseen liittyvä hHSP65 ihmisen seerumista ja virtsasta. Lisäksi *!“! MT: n hsp65:llä pystyttiin detektoimaan ihmisen vasta- : 25 aineita. Kuten edellä mainittiin, näissä määrityksissä voi- t · · |daan käyttää myös ihmisestä tai muusta lähteestä peräisin ,···. olevaa hsp65:ä vastaan muodostettuja vasta-aineita samoin • · kuin ihmis- tai muusta lähteestä saatua hsp65:ä. Tämä on • · · * mahdollista sen ansiosta, että hsp:t ovat säilyneet hyvin 30 läpi biologisen evoluution.

*·* ’ Sen, että kaikki esi-IDDM- ja uudet IDDM-potilaat ··· v : eivät olleet positiivisia, selittää tosiasia, että hHSP65- ja anti-hHSP65-pitoisuuksilla on taipumus laskea IDDM:n to- • .···. dellisella puhkeamishetkellä tai sen lähellä, kuten kuvio 2 f · · 35 osoittaa. Niinpä negatiiviset potilaat ovat saattaneet me- • · * i · • · • * • · · I « I • · 15 103976 nettää positiivisuutensa, kun heidät testattiin lähellä IDDM:n puhkeamista.

Edellä esitetyn perusteella on ilmeistä, että ihmis-potilailla saadaan positiivinen tulos testattaessa hHSP65 5 (tai jokin sen kanssa ristireaktiivinen molekyyli) tai anti-hHSP65 jollakin hetkellä aikaisin ennen IDDM:n puhkeamista. hHSP65- ja anti-hHSP65-määritykset ovat siksi käyttökelpoisia seulottaessa populaatioista yksilöitä, joilla IDDM saattaa olla kehittymässä.

10 hHSP65, jota esiintyy veressä tai virtsassa yksi löillä, joissa on kehittymässä IDDM, voisi tulla muutamista lähteistä. Näihin lähteisiin voi kuulua hHSP65, jota tuottavat normaalisti terveet beetasolut ja jota vapautuu immunologisen tuhoutumisen esivaiheena beetasolujen joutuessa vi-15 rusinfektion tai myrkkyvaikutuksen kohteiksi, tai sitä voi vapautua beetasoluista immunologisen tuhoutumisen aiheuttaman rasituksen vuoksi. hHSP65:ä voisivat myös erittää immuunijärjestelmän solut pitkittyneen beetasolujen vastaisen aktiivisuutensa aikana. Vaikka hHSP65:n lähteitä tässä järjes-20 telmässä ei tällä hetkellä tunneta lopullisesti, on määritetty, että kun hHSP65:ä vapautuu, yksilö stimuloituu tuottamaan vasta-aineita hHSP65-molekyylille.

Vasta-aineita määrittämättömälle molekyylille, jonka ·:"! moolimassa on 64 000, on kuvattu esiintyvän joissakin juuri ; 25 diagnosoiduissa IDDM-potilaissa [Baekeskov et ai., Nature : 298 (1982) 167 - 168] . Ei kuitenkaan tiedetä, onko 64 kD:n • · · · j··*. antigeeni hsp. Lisäksi tämän 64 kD:n antigeenin ei tiedetä ,···. esiintyvän veressä tai virtsassa ennen IDDM:n puhkeamista.

i * i

Toisin kuin tämä määrittämätön 64 kD:n beetasoluantigeeni on ... 30 hsp65 määritetty proteiini, jonka aminohapposekvenssi tunne-

I I I

taan [Thole et ai., Infection and Immunity 55 (1987) 1 466 - « · i V * 1 475]. Samoin hHSP65:n aminohapposekvenssi tunnetaan ja esitetään kuviossa 3.

«

• I f I I

I ( « « f «

• « I

« I

• * • f f « I > · I « I i · 16 103976

Esimerkki 6

Kannan C57BL/Ksi uroshiirten tutkiminen C57BL/Ksj-hiirille kehittyy IDDM noin kahden viikon kuluttua siitä, kun ne on inokuloitu viitenä peräkkäisenä 5 päivänä beetasolutoksiini streptotsotosiinilla annoksina 40 mg/kg vuorokaudessa.

Tässä kuvatuissa kokeissa ryhmille, jotka koostuivat kymmenestä 3 kk:n ikäisestä C57BL/Ksj-uroshiirestä, annettiin tai oltiin antamatta injektioina pieniä streptotsoto-10 siiniannoksia (40 mgxkg-1xvrk-1x5) IDDM:n indusoimiseksi (ilmaantui päivänä 14) ja tutkittiin IDDM:n kehittymistä, jonka mittana on arvon 250 mg/100 ml ylittävä veren glukoosipitoi-suus, ja hsp65:n ja anti-hsp65:n esiintymistä veressä. Kuten taulukossa 5 esitetään, hsp65 ilmaantui päivään 10 mennessä 15 (ennen IDDM:n kliinistä toteamista) ja sen jälkeen anti-hsp65.

Taulukko 5

Pieni streptotsosiiniannos IDDM-malli C57Bl/ksj-hiirissä 20 IDDM:n kumulatiivinen esiintymistiheys ajan (päivinä) funktiona .,, Ilmaantuminen S treptot so tosiini 0 5_UQ_£5 : :IDDM kyllä 0 0 0 100 .*‘1 ei 0 0 0 0 • · · • · · • · · · :*··; hsp65 kyllä 0 0 90 100 *···* ei 0 0 0 0 • ·· • · t • · · anti-hsp65 kyllä 0 0 0 90 ei 0 0 0 0 30 • · ·

Esimerkki 7 • · · *· Monet hiiren molekyylit ovat ristireaktiivisia my- kobakteeri-hsp65:n kanssa

« I I

Mykobakteeri-hsp65:n tunnistamien nisäkäsmolekyylien 35 identifioimiseksi testattiin edellä kuvattua kaniinin anti- < 4 : hsp65-antiseerumia samoin kuin monoklonaalista vasta- • 4 · 4 17 103976 ainetta, josta käytetään merkintää TB78. Tämän vasta-aineen on kehittänyt ja toimitti tri J. Ivanyi, MCR Tuberculosis Unit, Hammersmith Hospital, Lontoo. Tämä vasta-aine on spesifinen M. tuberculosisin hsp65-molekyylille. Tutkittiin si-5 toutuminen näihin vasta-aineisiin viiden tyyppisestä valmisteesta: kloonatusta M. tuberculosishsp65:stä; NOD-hiirien, joille on kehittymässä IDDM, ja terveiden vertailueläinten seerumeista; ja lämpösokilla käsiteltyjen rotan fibroblas-tien lysaateista ja vertailufibroblastilysaateista.

10 hsp65 valmistettiin esimerkissä 1 kuvatulla tavalla.

Rotan embryofibroblasteja viljeltiin tavanomaisin menettelyin. Lämpösokkiproteiinien indusoimiseksi fibroblastivil-jelmiä inkuboitiin lämpötilassa 42,5 °C kaksi tuntia ja sitten lämpötilassa 37 °C ½ tuntia. Lämpösokkikäsiteltyjä 15 fibroblasteja ja vertailufibroblasteja viljeltiin lämpötilassa 37 °c, ja hajotettiin sitten (noin 5xl06 solua kumpaakin lajia) käyttämällä hajotuspuskuria, joka sisälsi 0,1 % SDS:ää ja 1 % Tritonia, yhdessä proteaasi-inhibiittoreiden kanssa. Proteiinipitoisuus säädettiin Bradford-määrityksen 20 avulla arvoon 2 mg/ml. Materiaalille tehtiin tavanomainen elektroforeettinen käsittely 10-%:isessa polyakryyliamidi-. geelissä pelkistävissä olosuhteissa (2 % 2-merkaptoetano- lia); näytemäärä oli 100 mg/kaista. Terveistä vertailuhii-ristä ja IDDM:n kehittävistä NOD-hiiristä saadut seerumit • · · 25 laimennettiin pitoisuuteen 2 mg/ml. Kullekin näistä seerumi- • · :.: I valmisteista tehtiin erotus polyakryyliamidigeelielektrofo- • · · reettisesti edellä kuvatulla tavalla. Erotettuja proteiineja ·’ siirrettiin sitten yön yli nitroselluloosapaperiin tavan omaisin menettelyin. Papereita inkuboitiin sitten yksi tunti 30 huoneenlämpötilassa hemoglobiinin kanssa (1 %, suojaamista .·;·. varten) ja sitten joko normaalin kaniinin seerumin tai anti- t · · *· hsp65:n kanssa laimennussuhteen ollessa 1:100 tai TB78:n tai : " monoklonaalisen vertailuvasta-aineen kanssa laimennussuhteen ollessa 1:100 kaksi tuntia huoneenlämpötilassa, Vasta-35 aineiden sitoutuminen mihin tahansa erottuneeseen vyöhykkee- I f : seen detektoitiin inkuboimalla vuohen 125I-leimatun anti- 18 103976 kaniini-Ig:n tai anti-hiiri-Ig:n kanssa, pestiin ja kehitettiin autoradiografisesti. Mukaan sisällytettiin moolimas-sastandardit.

Havaittiin, että anti-hsp65-vasta-aineet tunnistivat 5 muutaman vyöhykkeen. Mykobakteeri-hsp65:n tunnisti sekä kaniinin antiseerumi että monoklonaalinen TB68. Vasta-aineet tunnistivat myös yhden hiiren fibrioblastien 65 kD:n vyöhykkeen, joka syntyi autetusti lämpösokin jälkeen. Kuumennetuissa fibroblastilysaateissa oli myös positiivisia vyöhyk-10 keitä moolimassojen 30 kD ja 47 kD kohdalla. IDDM:n kehittävien NOD-hiirten seerumeissa tuli detektoiduksi yksi lisä-vyöhyke suunnilleen kohdalla 25 kD. Niinpä nisäkäsmolekyy-lit, joiden moolimassa on 65, 47, 30 ja 25 kD, ovat ristire-aktiivisia mykobakteeri-hsp65:n kanssa.

15 Esimerkki 8 hsp65:ä muodostuu haiman saarekkeissa Koska IDDM:n kehittymiseen liittyy hsp65:n voimistunut esiintyminen veressä ja virtsassa, ajateltiin, että saarekkeiden beetasolut voisivat olla hsp65:n lähde. Tämän teo-20 rian testaamiseksi tutkittiin kaniinin anti-hsp65:ä, jotta nähtäisiin, sitoutuuko se saarekesoluihin.

Käytettiin tavanomaista menetelmää 6 - 8 mm:n pak- • Il suisten pakastettujen rotan haimaleikkeiden valmistamiseksi.

* * Leikkeet peitettiin normaalilla kaniinin seerumilla tai an- 25 ti-hsp65-antiseerumilla (absorptiokäsitelty maksa jauheella • · · epäspesifisten vasta-aineiden poistamiseksi) laimennettuna suhteessa 1:50( inkuboitiin 30 min huoneenlämpötilassa, pes-tiin perusteellisesti PBS:llä ja inkuboitiin sitten 5 min 5-%risen normaalin vuohen seerumin kanssa ennen inkubointia 30 vuohen fluoreseiinilla leimatun anti-kaniini-Ig:n kanssa 30 * * * min huoneenlämpötilassa. Saarekkeet värjäytyivät voimakkaas- • · · ti anti-hsp65-seerumin vaikutuksesta, mutta eivät kaniinin « • '·· vertailuseerumilla. Siksi saarekkeet tuottavat hsp65:ä.

« · « 4 4 4 4 4 4 4 4 4 4 4 4 4 4 4 4 a 19 103976

Esimerkki 9

Immunisoitumlnen hsprlle indusoi IDDM: n

Koska havaittiin, että saarekesolut tuottavat hsp65:ä, oletettiin, että hsp:n vastainen immuunivaste vau-5 rioittaa beetasoluja ja aiheuttaa siksi IDDM:n. C57BL/Ksj-uroshiiret, jotka olivat 8 viikon ikäisiä, tai 4,5 viikon ikäiset NOD-naarashiiret immunisoitiin injektoimalla vatsa-kalvonsisäisesti 50 mg hsp65:ä, ja testattiin saattaisiko niille kehittyä IDDM, jonka osoituksena on arvon 10 250 mg/100 ml ylittävä veren glukoosipitoisuus. 4,5 viikon ikäisillä NOD-hiirillä spontaanin IDDM:n kehittyminen kestää vielä ainakin kolme kuukautta. C57BL/Ksj-hiirillä ei kehity spontaania IDDM:ää. hsp65 annettiin eumulgoituna öljyyn tai i PBS:ään. öljyyn emulgoitua naudan seerumialbumiinia (BSA) 15 käytettiin vertailunäytteenä. Tulokset esitetään taulukossa 6. Havaittiin, että hsp65 indusoi IDDMrn öljyssä mutta ei PBS:ssä annettuna. Siksi immuunivaste hsp65:een voi laukaista IDDM:n, todennäköisesti siitä syystä, että beetasolut tuottavat hsp65:n kanssa ristireaktiivista antigeeniä.

20

Taulukko 6 hsp65 adjuvantissa indusoi IDDM:n 11«

I I I I

IDDM:n esiinty- , ,·, mistiheys 3 vii- ' ·' 25 Hiiret Antigeeni Adiuvantti kon kuluttua • · · NOO hsp65 öljy 7/10 hsp65 PBS 0/10 BSA öljy 0/20 C57BL/ksj hsp65 öljy 6/7 30 hsp65 PBS 0/9 . '.· · ei anti- ei adjuvanttia 0/15 .·:·. geeniä • · · • ·' " Lisäkokeessa normaalihiirikannat, joille ei kehity spontaanisti IDDM:ää, kuten NOD-hiirille, eikä edes pienen 35 streptotsosiiniannoksen jälkeen, kuten C57BL/ksj-hiirille, /.*: inokuloitiin intraperitoneaalisesti 50 mg:11a antigeeniä, · · « * 20 103976 joko hsp65:ä tai naudan seerumiantigeenia (BSA), emulgoituna epätäydelliseen Freundin adjuvanttiin (öljy). Hiiristä otettiin verinäytteet aamulla 19 päivän kuluttua ja mitattiin veren glukoosi. IDDM-diagnoosina pidettiin veren glukoosipi-5 toisuutta yli 200 mg/100 ml. Tulokset esitetään taulukossa 7. On nähtävissä, että immunisointi hsp65:llä voi indusoida IDDM:n jopa näennäisesti normaaleissa hiirikannoissa, erityisesti sopivana annoksena annettuna. Tämä tukee päätelmää, että hsp65 tai sen kanssa immunologisesti ristireaktiiviset 10 molekyylit ovat kohdeantigeenejä IDDM:n yhteydessä.

Taulukko 7

Immunisointi hsp65:llä indusoi IDDM:n diabetesta sairasta-15 mattomissa hiirikannoissa IDDMrn esiinty-

Veren glukoosi ^ | mistiheys___

Antigeenit ^ Antigeenit

20 Hiirikanta hsp65 BSA I hsp65 BSA

···' C3H. eB/Fej 270+41 96+32 I 5/5 0/5 m " | .

C57BL/6j 298+52 122±26 I 5/5 0/5 : DBA/2 146+33 126+21 I 0/5 0/5 IM · SJL/j 162±27 139±26 I 0/5 0/5 • « · • · · • · ·

Esimerkki 10 30 T-solujen reagointi hHSP65:een liittyy kehittymässä • · olevaan sokeritautiin • ♦ ·

Kuviossa 3 esitetty ihmisen hsp65-geeni kloonattiin • · i *· ilmentämistä varten tavanomaisella tavalla ja siitä saatiin suurin piirtein puhdasta ihmisen yhdistelmä-hsp65:ä.

35 Tämä koe osoittaa, että hiirissä, joiden beetasolut < « tuhoutuvat spontaanisti, T-solut reagoivat ihmisen yhdistel- * * 21 103976 mä-hsp65:een. Pernasolususpensioista, jotka saatiin 5-7 eri ikäisen NOD/Lt-naarashiiren ryhmistä, tutkittiin T-solujen proliferaatio olennaisilta osiltaan T-solujen ty-roglobuliinivasteiden yhteydessä kuvatulla tavalla [Haron, 5 R. et ai., J. Immunol. 131 (1983) 2 316 - 2 322]. Lyhyesti esitettynä soluja (1*106 solua/ml) inkuboitiin 72 tuntia kolmena rinnakkaisnäytteenä mikromaljan syvennyksissä kasvualustassa (0,2 ml) seuraavien antigeenien (5 mg/ml) läsnä tai poissa ollessa: ihmisen hsp65, MThsp65 ja MThsp70. Pro-10 liferaatio mitattiin sisällyttämällä [3H]tymidiiniä DNArhan 12 viimeisen inkubointitunnin aikana. Tulokset esitetään Acpm-arvona, joka on tutkittavaa antigeeniä sisältävien syvennysten keskimääräinen cpm-arvo miinus ilman lisättyä antigeeniä viljeltyjen vertailusyvennysten keskimääräinen cpm-15 arvo ± standardivirhe (SE). Vertailu-cpm-arvot vaihtelivat alueella 9 000 - 10 500. IDDMrn puhkeaminen noin 50 %:ssa hiiristä tapahtui 4-5 kuukauden iässä, kuten osoitetaan merkinnällä "IDDM" kuviossa 4.

Tämän kokeen tulokset, jotka osoittavat NOD/Lt-20 hiirten T-solujen spontaanin reaktiivisuuden erilaisten antigeenien suhteen iän funktiona, esitetään käyränä kuviossa 4. 1 kuukauden iässä, kun NOD/Lt-hiirissä esiintyy vähän tai ' ei ollenkaan insuliittia, ei ollut havaittavissa T-solujen reaktiivisuutta minkään antigeenin suhteen. 2 ja 3 kuukauden ’•i·’ 25 iässä, lisääntyvän insuliitin ohella, havaittiin kuitenkin • · i.i : voimakas ja kasvava reaktiivisuus ihmisen hsp65:n suhteen, · · suhteellisesti heikompi reaktiivisuus MThsp65:n suhteen eikä :T: ollenkaan reaktiivisuutta MThsp70:n suhteen. Reaktiivisuus ihmisen hsp65:n ja MThsp65:n suhteen aleni IDDMrn puhjetessa 30 4,5 kuukauden iässä ja laski edelleen 6 kuukauden iässä

• · I

IDDMrn kliinisen ilmenemisen jälkeen. Niinpä T-solujen reak- • · t tio ihmisen hsp65:een näytti liittyvän beetasolujen vaurioi- • · : *·· tumisen lisääntymiseen ennen näkyvää IDDMrää. T-solujen re- • · · 5.,,’· aktiivisuuden lasku IDDMrn puhkeamisen yhteydessä voidaan :v. 35 selittää alentuneella immuunistimulaatiolla, kun beetasolut ]·/: ja niiden antigeenit on menetetty.

« · · 22 103976

Esimerkki 11

Ihmisen hsp65:een reagoivat T-solut aiheuttavat diabeteksen

Pernasolususpensioita tehtiin ryhmistä/ jotka sisäl-5 sivät viisi 3,5 kuukauden ikäistä kannan NOD/Lt, C57NL/6 tai C57BL/KS naarashiirtä. Yksi NOD/Lt-hiiriryhmä (ryhmä 2) oli pohjustettu 9 päivää aikaisemmin immunisoimalla intraperito-neaalisesti MThsp65:llä (50 mg/ml) öljyssä. Jotkut pernasoluista (ryhmät 4, 6 ja 8) aktivoitiin inkuboimalla niitä 48 10 tuntia Con A:n kanssa (1,25 mg/ml). Con A -käsitellyt solut siirrettiin kasvamaan vielä 5 päiväksi elatusalustaan, josta puuttui Con A. Pernasoluista testattiin niiden lisääntymis-vasteet ihmisen yhdistelmä-hsp65:een, yhdistelmä-MThsp65:een tai E. coli -vertailuantigeeniin viikon kuluttua aktivoin-15 nista esimerkissä 12 kuvatulla tavalla. E. coli-ver-tailusolut transfektoitiin plasmidilla pEX2, joka ei sisältänyt hsp65-geenejä. Antigeenejä käytettiin pitoisuutena 5 μg. Kolmesta rinnakkaisnäytteestä saadut lisääntymisvaste-tulokset esitetään stimulaatioindeksinä (SI), joka on tut-20 kittavan antigeenin kanssa inkuboituihin pernasoluihin si sällytetyksi tulleen [3H]tymidiinin cpm-arvon suhde lisättyä antigeeniä sisältämättömiin vertailuviljelmiin sisällytetyk-si tulleen [3H] tymidiinin cpm-arvoon. Vertailuviljelmien cpm-arvo oli 5 000 - 7 000 ja standardipoikkeamat cpm-arvon • » « *·ί·* 25 keskiarvosta olivat aina alle 10 % keskiarvosta. Solujen ky- • · : ky saada aikaan diabetes testattiin aktivoimalla jotkut ··· niistä viljelemällä Con A:n kanssa 48 tuntia. Diabetesta edeltävässä vaiheessa olevista, 1 kuukauden ikäisistä vas-taanottajanaarashiiristä koostuvat ryhmät inokuloitiin int-30 raperitoneaalisesti koskemattomilla pernasoluilla tai MThsp65:llä pohjustetuista tai käsittelemättömistä hiiristä ♦ · · saaduilla Con A -aktivoiduilla pernasoluilla. Vastaanottaja-: *·· hiiristä arvioitiin 21 päivän kuluttua akuutin sokeritaudin kehittyminen, josta olivat osoituksena hyperglysemia (veren :v. 35 glukoosi > 200 mg/100 ml) ja histologiset merkit insuliitis- f * /.*: ta. Veren glukoosi mitattiin ottamalla kunkin hiiren häntä- < « 4 » 23 103976 laskimosta verinäyte noin klo 9 ja glukoosipitoisuus mitattiin käyttämällä Diascan Glucose Meter -laitetta ja testi-liuskoja (Behringwerke, Saksan liittotasavalta). Insuliitti määritettiin histologisesti osoittamalla (hematoksilineo-5 siini ja vaalean vihreä värjäytyminen, tekijä the Histology Laboratory of The Weizmann Institute). Insuliitin arvosteli yksilö, joka ei tuntenut testilevyjen identiteettiä.

Tulokset esitetään taulukossa 8. Erot NOD/Lt-perna-solujen reaktioiden välillä ihmisen hsp65:n ja MThsp65:n 10 suhteen ' (ryhmät 1 - 4) olivat merkitsevästi suuremmat (P <0,01) kuin NOD-Lt-pernasolujen reaktiot E. coli -vertailuani igeeniin tai muiden hiirikantojen (ryhmät 5-7) reaktiot hsp65-antigeeneihin käytettäessä Studentin T-testiä; ND = ei määritetty.

« · 1 • · • · · * · · «Il · * · · f · * · · • · · f · · t · · • · # • · 1

III

• Il • · · • · ·

• I

* · • « • · · • · 1 I « • · · • I I I · 1 24 103976

CO

<υ 0 42

U -H

3 -2 SS S o> QQ QD

05 e v. \ ^ · · ‘ ^ o co o oo z Z Z 2 C 4-> 01 e to ·η λ: ·η φ tn <-> ω φ ,Ο φ •Η Π3 C ·Η •H 4-1

4J C

φ -Η :Φ :Φ C Ο Η Ή

Ai > Η Η · . ·

< < ·Η ·Η >, Ή >, Q Q Q Q

4-4 φ Α! Φ Μ . . . .

§Φ Ζ 2: 2 2 ο ι F ί <u e ?> ·Η Φ ΙΟ XI 4-1 CD ·Η >, Q φ ;φ . · « ·

X g Son HO QO QQ

S g ._3 — n 4Γ4 · · ·· ^ 00 i-4 ·Η ι—I H H H Z 2 Z 2 TO -H O tt)

_ 4J O 4J

Se»-1 m Φ . Φ ,ϊ W > ^^

<g M

S CO

£ 1Λ ^ 4-i Έ in r* m r" cmh oo ^ Φ tO ^ ^ O. Λ

ni ΦΧίη^}· 04 Tr HH HO

-¾ 4-1 H

i s s cc | H e

| | S -Sd * “ ^ O H O H

3 o U E p. e* \D o CO ?_T : _T

r , nH g a) 42 CO H <N H (N H H HH

e a i+- m x

‘ ' (tj — -H

• EH rt) 1—I 4-4 ’; : -¾ O e Ö ;rt e .

.2 μ 4-4 4-* *H 4-> ·Η B Ή

. O CL, :Φ :Φ C :Φ C :o C

... <P e ecscDc •,!. * μΐ :o :o -h :o h u ·η

. , ^ 4-1 4J O W O :Φ O

i . . 4-1 4-1 > u > B > • · » :ctj :co 4-t :cc3 -H :tt) Ή φ ·Η ···· 4-1 B ι—4 D B 4-4 B 4-4 (—14-4 ··· P φ i—| 4-4 Φ Ai Φ Ai Φ Ai • · t“H H ·· <U H flj H CÖ 4J ccj ... O Φ LO 4-4 Φ I e Φ I C 4-4 | e ... tO 44 lO CO 4-4 Φ 4-4 Φ Ή Φ • · · Π) 4-1 P.3 44 <!® 4-4 < Φ tn < φ . e -HM T-) "H Ai -rl M !Φ Ai

μ to ΐΐ to Cl—I tn CH Ai tIH

Φ :cti Eh o :ctj o :n) :« o :cfl O :<t) 04 Ai S O. Αί υ·π AiO-t-i yjU-i-i

• · · VO W

• · · 4J 4-1 "S. ''i*

* Q Q iJ 4J

-H Φ \ \ « o . -H e o O in ft . . S JS 25 2 o u • « 4 · ‘ ' :cts

• S

I * ' ^ ef·· (ξ]ΗΓ4 n inio r^a> I < 4 4 4 4 4 25 103976

Tulokset, jotka esitetään taulukossa 8 osoittavat, että 3,5 kuukauden ikäisten NOD/Lt-hiirten T-solujen reaktioita ihmisen hsp65:een voitiin voimistaa immunisoimalla hiiret MThsp65:llä (ryhmä 2) tai aktivoimalla T-solupopulaatio 5 T-solumitogeenilla konkanavaliini A (Con A; ryhmä 4) . Con A:n on osoitettu in vitro stimuloivan ensisijaisesti eläimissä in vivo esiintyviä aktivoituja autoimmuuni-T-soluja. Niinpä NOD/Lt-T-solut, jotka on herätetty in vivo immunisoimalla MThsp65:llä tai aktivoitu in vitro Con A:11a, reagoi-10 vat luonnostaan ihmisen hsp65:een.

Itse ihmisen hsp65 ei ole mitogeeni; täysikasvuisilla hiirillä, jotka kuuluvat kantoihin, joille ei spontaanisti kehity IDDM:ää, kuten kantaan C57BL/6 (ryhmät 5 ja 6) tai C57BL/KS (ryhmät 7 ja 8), ei esiinny T-solujen reaktiivi-15 suutta Con A -stimuloinnin jälkeen.

Lopuksi mainittakoon, että taulukko 8 valaisee sitä, että ihmisen hsp65:n vastaisen T-solupopulaation aktivointi in vitro Con A: 11a teki T-solut kykeneviksi siirtämään akuutin diabeteksen 1 kuukauden ikäisiin diabetesta edeltävässä 20 vaiheessa oleviin NOD/Lt-hiiriin (ryhmät 2 ja 4).

T-solujen reagoivuuden ihmis-hsp65:een ja diabetek-. sen välinen yhteys vahvistetaan taulukossa 9. Kokeessa, jos- i r · • ^ sa saatiin taulukon 9 tulokset, T-solulinjat saatiin stimu-

? .· I I

’ ' loimalla toistuvasti pernasoluja MThsp65:llä (5 mg/ml) Maro- 25 nin (supra) kuvaamalla tavalla. Kloonit eristettiin solulin- • · ·,· · joista rajalaimennusmenetelmällä. T-soluklooneista testat- tiin niiden kyky siirtää akuutti diabetes olennaisilta osil-taan taulukon 8 yhteydessä kuvatulla tavalla, paitsi että siirrettiin intraperitoneaalisesti 51106 Con A -aktivoitua 30 solua. Kloonien lisääntymisvasteet antigeeneihin mitattiin • · · SI:nä taulukon 8 yhteydessä kuvatulla tavalla. Vertailuvil- • « · jelmien cpm-arvo oli 4 500 - 6 500 ja standardipoikkeamat « : cpm-keskiarvosta olivat aina alle 10 %.

f a · * < 35 « 1 wv • 1

I « I

I <1

• I

26 103976

Taulukko 9

Diabetogeeniset T-solukloonit tunnistavat ihmisen hsp65:n 5 T-solu- Akuutin diabe- Proliferaatiovasteet (SI) anti- klooni teksen siirto geeneihin ___ (Esiintymis- Ihmisen E. coli __ tiheys)_hsp65 MT-hsp65_vertailunäyte 10 27 9/11 16,9 7,1 0,9 C7 10/12 23,8 6,7 1,1 C9 10/15 38,5 5,8 1,2 21 0/13 6,3 2,8_ 15

Kloonien havaittiin reagoivan voimakkaammin ihmisen hsp65:een kuin MThsp65:een tai E. coli -vertailuantigeeniin. Lisäksi kloonit 27, C7 ja C9, jota reagoivat voimakkaasti ihmisen hsp65:een, olivat diabetogeenisiä, kun taas klooni 20 21, joka reagoi suhteellisen heikosti ihmisen hsp65:een, ei pystynyt siirtämään diabetesta. Koska kloonatuilla T- soluilla esiintyy spesifisyydeltään vain yhdenlaisia anti-geenireseptoreja, voidaan päätellä, että akuutin diabeteksen : voivat siirtää diabetesta edeltävässä vaiheessa oleviin • a · • 25 NOD/Lt-hiiriin T-solut, jotka tunnistavat ihmisen hsp65:llä ··· · .·**. epitoopin, joka on jossakin määrin ristireaktiivinen • · · MThsp65:n epitoopin kanssa.

• · ·

Esimerkki 12 ... Peptidi synteesi • · * 30 Otaksuttiin, että ihmisen hsp65-molekyylin avainepi- • · · ’* * tooppi oli aminohapposekvenssi, joka on osittain, mutta ei täydellisesti, homologinen MThsp65-sekvenssin kanssa. Koska .’*·. viimeksi mainittu toimii vähemmän hyvin, on vastaavan epi- • · % toopin sekvenssi otaksuttavasti hieman erilainen.

• * * ·’ ·* 35 Syntetisoitiin sarja peptidejä aloittaen ihmisen • · hsp65-sekvenssin karboksyylipäästä ja valiten sekvenssejä, ?! 27 103976 joissa oli pieniä eroja mykobakteerin ja ihmisen sekvenssien välillä. Eräässä tällaisessa peptidissä on kuviossa 3 esitetyn ihmisen hsp65-molekyylin aminohapposekvenssi 437-460, ts. H-Val-Leu-Gly-Gly-Gly-Cys-Ala-Leu-Leu-Arg-Cys-Ile-Pro-5 Ala-Leu-Asp-Ser-Leu-Thr-Pro-Ala-Asn-Glu-Asp-OH. Tälle peptidille on annettu nimeksi p277.

Vertailupeptidi p278 menee päällekkäin p277:n kar-boksyylipään kanssa 3 aminohapon verran, ja sillä on seuraa-va sekvenssi: H-Asn-Glu-Asp-Gln-Lys-Ile-Gly-Ile-Glu-Ile-Ile-10 Lys-Arg-Thr-Leu-Lys-Ile-OH. Tämä vastaa kuvion 3 aminohappo-sekvenssiä 458-474.

Esimerkki 13

Immuunivaste p277:ään IDDM:n kehittymisen diagnosoinnissa 15 Diabetesta edeltävässä vaiheessa olevien 3 kuukauden ikäisten NOD/Lt-naarashiirten pernasolususpensioista testattiin niiden proliferaatiovasteet p277:ään esimerkissä 10 kuvatulla tavalla, ja tulokset esitetään kuviossa 5. Vaikka näillä hiirillä ei kehity näkyvää IDDMiää vielä 1-3 kuu-20 kauteen, niiden pernan T-solut reagoivat voimakkaasti p277:ään mutta eivät p278:aan. Optimaalinen peptidipitoisuus tässä ja muissa in vitro -kokeissa on 5 μg/ml.

'> Esimerkki 14 : : : Patogeeniset T-solukloonit reagoivat p277:ään ja 25 hsp65-variantteihin «t* ·

Kuvio 6 osoittaa, että T-solukloonit C7 ja C9, joil- ,···. la on kyky siirtää akuutti diabetes nuoriin, diabetesta • · · edeltävässä vaiheessa oleviin NOD/Lt-hiiriin (katso edellä t#t oleva taulukko 10), reagoivat p277:ään. Kloonien havaitaan « · t ;'t‘ 30 reagoivan p277:ään samoin kuin koko mykobakteeri-hsp65:een V * mutta ei vertailuplasmidivalmisteeseen, joka ei sisällä ·*·.. hsp65-geeniä. Niinpä on päätelty, että peptidi p277 sisältää « patogeenisen epitoopin, koska patogeeniset T-solut tunnista- • · · vat sen.

• f · :t \ 35 p277-epitooppi esiintyy myös mykobakteerin hsp65- • f · '· '· molekyylissä, koska C7 ja C9 reagoivat myös siihen molekyy- 28 103976 liin. Niinpä sekvenssille p277 homologinen mykobakteerin hsp65-sekvenssi on immunologisesti toimiva. Seuraavana esitetään mykobakteerisekvenssi, jossa on alleviivattu ihmisen p277-sekvenssin korvatut ryhmät: H-Asp-Ala-Gly-Gly-Gly-Val- 5 Thr-Leu-Leu-Gln-Ala-Ala-Pro-Thr-Leu-ASsp-Glu-Leu-Lys-----

Leu-Glu-Gly-Asp-OH. On nähtävissä/ että 13 aminohappoa 24:stä on korvautunut. Siksi voimme päätellä, että peptidin p277 immunologiset ominaisuudet pystyvät sietämään sekvenssin noin 60-%:isen muuttumisen. Vaikka pienin mahdollinen 10 epitooppi olisi 10 aminohappoa 24:n sijasta, ei ole olemassa p277:n 10 aminohapon sekvenssiä, joka ei eroa vähintään 4 -6 aminohapon kohdalla mykobakteerisekvenssistä.

Esimerkki 15

Peptidi p277 diagnostisena markkerina 15 Peptidiä p277 samoin kuin koko hsp65-molekyyliä tai mitä tahansa muuta sen kanssa immunologisesti ristireaktii-vista molekyyliä voidaan käyttää diagnosointiin ihmisillä. Tämä johtuu siitä, että NOD-hiirten diabetes tunnustetaan ihmisen IDDM:n luotettavaksi malliksi. Lisäksi Toddin et ai.

20 mukaan [Nature 329 (1987) 599] NOD-hiirillä on eräs päähis-tokompatibiliteettikompleksiryhmän (MHC-ryhmän) II molekyyli (Ia), joka on samanlainen kuin ihmisen IDDM:ään liittyvä ih-. '! mis-DQu. Siten voidaan odottaa, että sekä ihmisen että NOD- : hiiren diabetogeenisten T-solujen pitäisi tunnistaa sama . * · : 25 peptidisekvenssi, joka esiintyy MHC-ryhmän II molekyylissä, ··· · .···. josta puuttuu asparagiinihappo DQB-ketjun asemasta 57. Jos » · ihmiset ja NOD-hiiret, joille kehittyy diabetes, tunnistavat • · · samanlaisen peptidiantigeenin, kuten p277:n, voidaan täl- ... laista peptidiä käyttää ihmisillä samoin kuin NOD-hiirillä • · · 30 IDDM:n diagnosointiin.

• · · *·* * Se nimenomainen proteiini, jota ihmiselimistö tuot- ·*·,. taa IDDM:n kehittymisen aikana ja joka toimii tämän keksin- nön mukaisena diagnostisena markkerina IDDM:n uhkaavalla puhkeamiselle, on ihmisen lämpösokkiproteiini, jonka koko on ' 35 noin 65 kD (tai sen kanssa ristireagoiva antigeeni). Ihmisen '! 65 kD:n lämpösokkiproteiinin nukleotidisekvenssi ja päätelty 29 103976 aminohapposekvenssi esitetään kuviossa 3. Tätä proteiinia kutsutaan tästedes hHSP65:ksi. In vivo voi syntyä myös muita proteiineja, jotka ristireagoivat 65 kD:n proteiiniin sitoutuvien vasta-aineiden kanssa. Esimerkiksi hiiristä ja rotis-5 ta on löydetty 47, 30 ja 25 kD:n molekyylit, jotka myös ristireagoivat M. tuberculosisin hsp65-molekyylille spesifisen monoklonaalisen vasta-aineen kanssa. Rotan fibroblasteista on löydetty myös 47 kD:n molekyyli, joka on ristireagoiva tällaisen vasta-aineen kanssa. Kun otetaan huomioon lämpö-10 sokkiproteiinin säilyminen lajien kesken, on täysin odotettavaa, että niitä esiintyy myös ihmisessä. Lisäksi IDDM:n aikana vereen ja virtsaan vapautuva proteiini voi olla muu molekyyli kuin hHSP65, joka on kuitenkin ristireagoiva sen kanssa. Se voi olla beetasoluilla esiintyvä pintaproteiini 15 tai jopa proteiinifragmentti, jossa on säilynyt hHSP65:llä esiintyvä epitooppi.

Niinpä molekyyli, joka toimii diagnostisena markke-rina alkavan IDDM:n läsnäololle ja jonka läsnäoloa veressä tai virtsassa määritetään tämän keksinnön mukaisesti, on mo-20 lekyyli, joka reagoi immunologisesti hHSP65:ä vastaan syntyneiden polyklonaalisten vasta-aineiden kanssa ja edullisesti hHSP65:n p277-sekvenssiä vastaan syntyneiden monoklonaalis-·; : ten tai polyklonaalisten vasta-aineiden kanssa. Tämän seli- : tyksen ja patenttivaatimusten yhteydessä termi "hHSP65” on • i » : .·. 25 tarkoitettu lyhenteeksi ihmisen 65 kD:n lämpösokkiproteiinin .···, lisäksi myös mille tahansa muulle ihmisen seerumissa esiin- • · !!! tyvälle sukulaismolekyylille, joka reagoi ristiin minkä ta- • · · hansa lajin 65 kD:N lämpösokkiproteiinia vastaan syntyneiden polyklonaalisten vasta-aineiden kanssa. Tämän määritelmään v ' 30 piiriin on erityisesti tarkoitettu kuuluviksi, mainittuihin • · · V · kuitenkaan rajoittumatta, 65, 30, 25 ja 47 kD:n proteiinit, « jotka on jo löydetty ja joita käsitellään tässä.

.··*. Koska lämpösokkiproteiinit ovat rakenteellisesti sa- '· mankaltaisia kaikkialla luonnossa, tässä käsitellyn diagnos- • « · : ·’ 35 tisen markkerin läsnäolo voidaan detektoida polyklonaalisil- \·: la tai monoklonaalisillä vasta-aineilla, joita syntyy spesi- 30 103976 fisesti minkä tahansa organismin lämpösokkiproteiinia vastaan. Esimerkiksi M. tuberculosisin (MT:n) lämpösokkiproteiinia voidaan helposti tuottaa suuria määriä geeniteknisin menetelmin. Tätä proteiinia voidaan käyttää vasta-aineiden 5 muodostamiseen kaniineissa tai hiirissä. Kaniinin polyklo-naalisia anti-MThsp65-vasta-aineita voidaan käyttää tämän keksinnön mukaisesti hHSP65:n läsnäolon määrittämiseen. Vastaavasti voidaan valita MThsp65:llä immunisoitujen hiirten pernoista saatuja monoklonaalisia vasta-aineita, jotka rea-10 goivat MThsp65:n kanssa. Tällaiset monoklonaaliset vasta-aineet ristireagoivat myös hHSP65:n kanssa. Edullisia monoklonaalisia vasta-aineita ovat p277-proteiinia vastaan muodostetut vasta-aineet, koska tämän proteiinin on osoitettu sisältävän patogeenisesti aktiivisen epitoopin.

15 Kaikki spesifiset monoklonaaliset vasta-aineet, joi ta käytetään tämän hakemuksen esimerkeissä, on tarkoitettu vain esimerkeiksi. Ei ole mitään syytä uskoa, että mikään tällainen monoklonaalinen vasta-aine, joka on spesifisesti muodostettu sen takia, että se pystyy reagoimaan spesifises-20 ti tietyn antigeenin kanssa, olisi parempi kuin mikä tahansa muu tämän keksinnön tarkoituksiin.

Kuten edellä mainittiin, diagnostisena markkerina ei voida käyttää pelkästään hHSP65-proteiinia (tai sen kanssa : ristireaktiivista molekyyliä) vaan sellaisena voidaan käyt- > 25 tää myös hHSP65:n vastaisia vasta-aineita. Voidaan määrittää • · · · .···. vasta-aineita, jotka muodostuu spontaanisti, kun hHSP65:ä ,···. tai sen sukulaisproteiinia vapautuu ihmispotilaassa. Posi- a · · tiivinen tulos tällaisten vasta-aineiden määrityksessä toimii osoituksena alkavasta IDDM:stä samassa määrin, kuin itse * · · ’·] * 30 hHSP65:n ja sen sukulaisproteiinien määritys palvelee tätä *·* : tarkoitusta. hHSP65:n vastaisia vasta-aineita voidaan mää- ·*·.. rittää etsimällä reaktiota minkä tahansa hsp65-proteiinin kanssa. Niinpä MThsp65-proteiini reagoi ristiin hHSP65:n vastaisten vasta-aineiden kanssa. Edullinen proteiini käy- • ·' 35 tettäväksi hHSP65:n vastaisten vasta-aineiden läsnäolon mää- « » '·rittämiseen on tietenkin hHSP65-proteiini ja edullisemmin 31 103976 sen sekvenssi p277. Alan ammattimiehet pystyvät kuitenkin helposti määrittämään empiirisesti, ilman tarpeettomia kokeita, reagoiko tietty proteiini tai proteiinifragmentti ristiin hHSP65:n vastaisten vasta-aineiden kanssa. Yksinker-5 täisiä in vitro -kokeita voidaan käyttää sen määrittämiseen, immuunireagoiko tällainen proteiini tai muu molekyyli hHSP65:n vastaisten vasta-aineiden kanssa. Jos se reagoi, sitä voidaan käyttää tämän keksinnön mukaisessa menetelmässä ja on tarkoitettu kuuluvaksi tämän keksinnön piiriin.

10 Vaikka edellä yksityiskohtaisesti kuvatuissa kokeis sa sekvenssin p277 on osoitettu vastaavan patogeenistä epi-tooppia NOD/Lt-hiirissä, T-solut eivät reagoi p277:ään eräässä toisessa hiirikannassa, C57BL/6:ssa, jossa diabetes voidaan indusoida ihmisen hsp65:llä ja jonka T-solut reagoi-15 vat ihmisen hsp65:een. Siten on ilmeistä, että tämä ei ole hHSP65:n ainoa patogeeninen epitooppi. Itse asiassa on määritetty, että diabetesta edeltävässä vaiheessa olevien ih-mispotilaiden veressä ja virtsassa esiintyvän markkeriprote-iinin moolimassa on noin 62 kD. Niinpä olisi odotettavissa, 20 että päähistokompatibiliteettikompleksissa (MHC) kulloinkin esiintyvä epitooppi (ihmisen leukosyyttiantigeeni, HLA) voi vaihdella yksilöstä toiseen. Niinpä, vaikka sekvenssi p277 on tällä hetkellä edullinen, ammattimiehet ymmärtänevät, et- : tä hHSP65-proteiinista löydettäneen myös muita antigeenisek- : .·. 25 vensseja, joilla on sama tai samantapainen vaikutus kuin • ·· · .·**. p277:llä. Tämän keksinnön tarkoituksena on sulkea piiriinsä .·*·. kaikki tällaiset sekvenssit.

• · ·

Edellä esitetyt esimerkit osoittavat, että hsp65-proteiinin ja sen kanssa ristireaktiivisen antigeenin ja • i i "l!.* 30 sille spesifisten vasta-aineiden lisäksi alkavan diabeteksen • · · '·* ' diagnostisena markkerina voidaan käyttää myös mainitunlai- sille proteiineille spesifisiä T-soluja. Itse asiassa näyt- * tää siltä, että tällaisten spesifisten T-solujen ilmaantumi-nen saattaa edeltää vasta-aineiden ilmaantumista. Beetasolu- • · n \ 35 jen kimppuun hyökkäävät itse asiassa T-solut eivätkä vasta- • « · ’· aineet. Ammattimiehet tuntenevat monia määrityksiä jonkin 32 103976 tietyn antigeenin vastaisen T-soluaktiivisuuden toteamiseksi. Voidaan esimerkiksi ottaa tutkittavasta kohteesta perifeerisiä lymfosyyttejä, käsitellä ne hHSP65:llä tai ristire-aktiivisella antigeenillä ja mitata mikä tahansa tunnetuista 5 vaikutuksista, joita ilmenee aktivoitumisen jälkeen, kuten proliferaatio, sytokiinien tai lymfokiinien tuotanto, entsyymi tuot anto, kalsiumvirtaus jne. Kaikki tällaiset määritykset kuuluvat alan ammattiosaamisen piiriin.

Kuten edellä mainittiin, hsp65:n tiedetään liittyvän 10 adjuvanttiartriittiin rotassa ja reumatoidiseen artriittiin ihmisessä. Ei ole epäilystä hsp65- tai anti-hsp65-määri-tyksen kyvystä erottaa toisistaan henkilöt, joissa on kehittymässä IDDM ja jotka potevat artriittia, koska, toisin kuin IDDM-prosessin, artriittiprosessin osoittavat selvästi ha-15 väittävät merkit ja artriittioireet. Niinpä hsp65:n tai an-ti-hsp65:n detektointi ilman artriitin tunnusmerkkejä ja oireita kehottaisi kiinnittämään huomiota kliinistä vaihetta edeltävän beetasolujen tuhoutumisen ja alkavan IDDM:n mahdollisuuteen. Lisätestejä, kuten beetasolujen vasta-aineita, 20 voitaisiin sitten käyttää vahvistamaan autoimmuunius beeta-soluille -diagnoosi.

a hsp90:n liittymistä systeemiseen punahukkaan (SLE:hen) ei myöskään sekoitettaisi IDDM-prosessiin, koska : myös SLErlle ovat tunnusmerkillisiä selvät sairauden merkit • 25 ja oireet, kun taas IDDM-prosessi on kliinisesti huomaama-« · · · .···. ton.

• · hsp65:n tai sen sukulaisproteiinin vastaisia vasta- • · · aineita voidaan käyttää IDDM:n diagnosointiin injektoimalla potilaaseen ihonalaisesti hsp65:ä tai muuta immunologisesti • · · 30 ristireaktiivista proteiinia ja seuraamalla havaittavissa V ' olevan ihoreaktion ilmaantumista. Vaihtoehtoisesti hsp65 tai f*·,, sen sukulaisproteiini voidaan saattaa kosketukseen potilaan I , veren tai veren rakenneosan kanssa ja detektoida millä tahansa tunnetulla immunologisella menetelmällä mahdollisen I I < : ·' 35 immunologisen reaktion ilmaantuminen anti-hsp65:n, ts. minkä I I · '< tahansa hsp65:n kanssa ristireagoivan vasta-aineen kanssa.

33 103976 Tällaisiin tunnettuihin immunologisiin menetelmiin kuuluvat radioimmuunimääritys, fluoresenssi-immuunimääritys, ELISA, kemiluminesenssimääritys tms.

In vivo -ihotestissä mitataan ihoreaktio injektoin-5 tikohdassa riittävän ajan, esimerkiksi 24 - 72 tunnin kuluttua annosta. Turvotus ja/tai punaisuus johtuu viivästyneestä yliherkkyysreaktion kaltaisesta reaktiosta.

Serologisissa in vitro -testeissä potilaan seerumi saatetaan kosketukseen hsp65:n tai sen sukulaismolekyylin 10 kanssa. Jos seerumi sisältää hsp65:n antigeenideterminanttien vastaisia vasta-aineita, tapahtuu immunologinen reaktio, joka voidaan detektoida ja määrittää tavanomaisin menetelmin, kuten ELISAlla, agglutinaatiomenetelmällä jne.

Mitä tahansa tunnettua immuunimääritysmenetelmää 15 voidaan käyttää hHSP65:n, anti-hHSP65:n tai hHSP65:lle spesifisten T-solujen detektointiin. Tulisi ymmärtää, että kun ammattimiehen tietoon tulee, että hHSP65:n vastaisten vasta-aineiden läsnäolo henkilön seerumissa määritettynä esimerkiksi hsp65-määrityksellä on positiivinen osoitus alkavasta 20 tai olemassa olevasta IDDM:stä, tuntee tällainen ammattimies käytettävissä olevat immuunimääritysmenetelmätyypit. Radi-t<|j’ oimmuunimäärityksen (kiinteä- tai nestefaasimäärityksen) ·:·: ohella voidaan käyttää mitä tahansa tavanomaista immuunimää- : .'. ritysmenetelmää, kuten ELISAa (entsyymiin kytketty immuuni- : .·. 25 sorbentti -määritystä), heterogeenista immuunimääritystä « · i !’··[ (sekä kompetitiivista että ei-kompetetitiivista), jossa käy- • a tetään muita merkkiaineita kuin entsyymejä ja radioisotoop-*’ peja, fluoresenssin sammutukseen ja entsyymikanavointiin pe rustuvia homogeenisia immuunimäärityksiä, immuunisaostusta • ti '·* * 30 (mukaan luettuna säteittäinen immuunidiffuusio) ja visuaali- *.· : seen puolikvantitatiiviseen tai turbidimetriseen kvantita- a ·*·,. tiiviseen detektointiin perustuvia agglutinaatiomäärityksiä.

a .···. Määrityksessä voidaan käyttää mitä tahansa tavanomaisia kiinteäfaasi- tai kerrosmääritysmenetelmiä.

a · a ! ·' 35 Vastaavasti voidaan valmistaa välineistöjä tämän • a keksinnön toteuttamiseen käytettävän minkä tahansa eri mää- 34 103976 rityksen tekemiseksi. Kukin tällainen välineistö sisältäisi kaikki materiaalit, joita tarvitaan tehtäessä yksi määritys tai tietty määrä määrityksiä. Tällainen välineistö hHSP65:n vastaisten vasta-aineiden määrittämiseksi voi sisältää esi-5 merkiksi kiinteään faasin immobilisoitua hsp65:ä ja leimattua vasta-ainetta, jolla on kyky tunnistaa detektoitavan hHSP65:n vastaisen vasta-aineen muuttumaton alue, kuten leimattua anti-ihmis-Fab:ta. Välineistö hHSP65:n läsnäolon määrittämiseksi voi sisältää kiinteään faasiin immobilisoitua 10 vasta-ainetta, joka reagoi tai ristireagoi hHSP65:n kanssa, ja leimattua vasta-ainetta, jolla on kyky reagoida hHSP65:n eri epitoopin kanssa, kuin minkä immobilisoitu vasta-aine tunnistaa. Välineistön tulisi sisältää myös reagenssia, jolla on kyky saostaa hsp65:n ja hHSP65:n vastaisten vasta-15 aineiden immuunikomplekseja, ja se voi sisältää ohjeet välineistön käyttämiseksi ja säiliöt välineistön materiaaleja varten. Voidaan käyttää mitä tahansa tavanomaista merkkiainetta, kuten radioisotooppia, entsyymiä, kromoforia tai fluoroforia. Eräs tyypillinen radioisotooppi on jodi-125 tai 20 rikki-35. Tyypillisiin tähän tarkoitukseen käytettäviin ent syymeihin kuuluvat piparjuuriperoksidaasi, a-galaktosidaasi ja alkalinen fosfataasi.

Tämän keksinnön mukaisia diagnostisia koostumuksia valmistetaan yhdistämällä hsp65 sopiviin adjuvantteihin ja • 25 apuainekomponentteihin.

• ·· · .*·*. Kuten edellä esitetyissä kokeissa on osoitettu, saa- ·»» rekesolut ja lämpösokkikäsitellyt fibroblastit vapauttavat i · · mykobakteeri-hsp65:n kanssa ristireagoivia molekyylejä. Se, ... että immunisointi mykobakteeri-hsp65:llä voi aiheuttaa « · · 30 IDDM:n, osoittaa, että immuunihyökkäys mykobakteeri-hsp65:n ’.* : kanssa ristireaktiivisia antigeenejä vastaan vaurioittaa ·*·,. beetasoluja. Tällainen immuunireaktio voisi esiintyä ensim- mäisenä tapahtumana sen jälkeen, kun on vahingossa tapahtunut immunisoituminen ristireaktiiviselle hHSP65:lle tai eli- « · · « « · ; «' 35 mistöön tunkeutuvalle mikrobille. hHSP65;n tai sen sukulais- « · :.'i proteiinin vapautuminen voi tapahtua myös viruksen tai tok- 35 103976 siinien aiheuttaman beetasoluvaurion jälkeen. Niinpä on ymmärrettävissä, miksi hsp65:n suhteen positiivisten molekyylien ilmaantuminen vereen ja virtsaan on varhainen merkki kehittymässä olevasta IDDM:stä, koska näitä molekyylejä va-5 pautuu beetasoluista vaurion edetessä. Vastaavasti hHSP65:n vastaisen vasta-aineet ovat eräs luotettava merkki alkavasta IDDM:stä, koska itse immuunireaktio hHSP65:een voi aiheuttaa IDDM:n.

Muodostuupa vasta-aineita hHSP65:lle alunperin va-10 hingossa tapahtuneen immunisoitumisen tai viruksen tai toksiinien aiheuttamaa beetasolujen vaurioitumista seuraavan hHSP65:n vapautumisen jälkeen, hHSP65:n vastaisten vasta-aineiden tai T-solujen tuotanto voisi edistää ja pitää yllä beetasolujen tuhoutumisprosessia, kun itse beetasoluilla 15 oleav hHSP65 joutuu hyökkäyksen kohteeksi.

Tässä käsitellyn hsp65-proteiinin lisäksi sen funktionaalisia johdannaisia, esiasteita ja aktiivisia fraktioita, joilla on kyky immunologisesti ristireagoida hHSP65:n kanssa, voidaan myös käyttää. Sellaiset sekvenssit kuin ku-20 vion 3 mukaiset tai Van Edenin et ai. (supra) esittämät sekvenssit, joissa yksi tai useampi aminohappo on poistettu, * . lisätty tai korvattu muilla aminohapoilla, on tarkoitettu kuuluviksi tämän keksinnön piiriin, kunhan niillä on kyky : immunologisesti ristireagoida hHSP65:n kanssa.

: 25 Termi "funktionaaliset johdannaiset" tässä käytetty- • ·♦ · .··». nä kattaa johdannaiset, joita voidaan valmistaa funktionaa- • ♦ lisistä ryhmistä, joita esiintyy ryhmien sivuketjuina tai N- • · 9 ' tai C-terminaalisina ryhminä, alalla tunnetuin menetelmin, ja ne sisällytetään keksinnön piiriin, kunhan ne säilyvät • · * ' 30 fysiologisesti hyväksyttävinä, ts. ne eivät tuhoa proteiinin v ’ aktiivisuutta, tuo toksisia ominaisuuksia niitä sisältäviin koostumuksiin eivätkä vaikuta haitallisesti niiden antigee- 9 nisiin ominaisuuksiin.

Näihin johdannaisiin voi esimerkiksi kuulua karbok- 4 « · : 35 syyliryhmien alifaattisia estereitä, karboksyyliryhmien ami- '· ” deja, joita muodostuu reaktiossa ammoniakin tai primaaristen 36 103976 tai sekundaaristen amiinien kanssa, aminohapporyhmien vapaiden aminoryhmien N-asyylijohdannaisia, joita muodostuu asyy-liryhmittymien (esimerkiksi alkanoyyli- tai karboksyklisten aroyyliryhmien) kanssa, tai vapaan hydroksyyliryhmän 5 (esimerkiksi seryyli- tai treonyyliryhmien hydroksyyliryhmän) O-asyylijohdannaisia, joita muodostuu asyyliryhmittymien kanssa.

"Esiasteet" ovat yhdisteitä, joita syntyy ennen hsp65:ä ja jotka muuttuvat hsp65:ksi eläin- tai ihmiselimis-10 tössä.

Suurin piirtein puhdistetun proteiinin "aktiivisina fraktioina" tämän keksinnön piiriin kuuluvat hsp65- proteiinimolekyylin polypeptidiketjun mitkä tahansa fragmentit tai esiasteet yksinään tai yhdessä niihin liittyvien mo-15 lekyylien tai kytkeytyneiden ryhmien, esimerkiksi sokeri-tai fosfaattiryhmien, kanssa tai proteiinimolekyyliaggregaa-tit tai itse sokeriryhmät sillä edellytyksellä, että mainitulla fraktiolla on kyky ristireagoida immunologisesti hHSP65:n kanssa. Eräs esimerkki tällaisesta aktiivisesta 20 fraktiosta on hHSP65:n sekvenssi p277.

hsp65:ä tai sen sukulaismolekyyliä (joita on käsi-.,telty edellä) voidaan käyttää antigeeninä diagnostisissa *. koostumuksissa IDDMrn diagnosoimiseksi. Nämä diagnostiset : koostumukset, joita voidaan valmistaa alalla tunnetulla ta-

• > I

I ·*. 25 valla, muodostavat myös osan tästä keksinnöstä.

• · · · ,···. Edellä oleva erityissuoritusmuotojen kuvaus valaisee • t niin täydellisesti keksinnön yleisluonnetta, että muut pys- • ♦ · tyvät yleisesti tunnettuja tietoja soveltamalla helposti ... muuntamaan tällaisia erityissuoritusmuotoja ja/tai sovelta- i i · / 30 maan niitä erilaisiin käyttötarkoituksiin poikkeamatta kek- V * sinnön yleisajatuksesta, ja siksi tällaiset sovellutukset ja muunnokset on tarkoitettu kuuluviksi esitettyjen suoritus-muotojen ajatuksen ja ekvivalenttien piiriin. On ymmärrettä- • »· vä, että tässä käytetyn fraseologian tai terminologian tar-

I I I

35 koituksena on kuvaaminen eikä rajoittaminen.

«f * • f ·

• I

Claims (10)

103976

1. Menetelmä insuliinista riippuvan diabetes melli-tuksen (IDDM:n) läsnolon tai alkamisen diagnosoimiseksi in 5 vitro potilaasta, tunnettu siitä, että potilaan veri tai virtsa testataan kuviossa 3 esitettyä ihmisen 65 kD:n lämpösokkiproteiinia (hHSP65:ä) tai sen sekvenssiä p277, Val-Leu-Gly-Gly-Gly-Cys-Ala-Leu-Leu-Arg-Cys-Ile-Pro-Ala-Leu-Asp-Ser-Leu-Thr-Pro-Ala-Asn-Glu-Asp, vastaan muodostettujen 10 vasta-aineiden kanssa immunologisesti reagoivan proteiinin läsnäolon tai hHSP65:n tai sen sekvenssin p277 käsittävän polypeptidin kanssa immunologisesti reagoivien vasta-aineiden tai T-solujen läsnäolon toteamiseksi.

2. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmä, t u n -15 n e t t u siitä, että potilaan veriseerumi tai virtsa testataan kuviossa 3 esitettyä hHSP65:ä vastaan muodostettujen vasta-aineiden kanssa immunologisesti reagoivan proteiinin läsnäolon toteamiseksi radioimmuunimäärityksellä tai ELISA-testillä. 20 3. Välineistö IDDMrn läsnäolon diagnosoimiseksi, tunnettu siitä, että se käsittää kuviossa 3 esitetyn hHSP65:n idiotyyppivasta-aineita ja leimattua vasta-ainetta, joka kykenee tunnistamaan detektoitavan hHSP65-vasta-aineen tai anti-hHSP65-idiotyyppi-vasta-aineen muuttumattoman alu- 25 een, ja reagenssia, joka kykenee aikaansaamaan detektoita-• ·· · vissa olevan, hHSP65:n tai sen vasta-aineiden läsnäolon il- i « ··· moittavan signaalin. • » i

4. Polypeptidi, tunnettu siitä, että se si- ... sältää sekvenssin Val-Leu-Gly-Gly-Gly-Cys-Ala-Leu-Leu-Arg- « · «

30 Cys-Ile-Pro-Ala-Leu-Asp-Ser-Leu-Thr-Pro-Ala-Asn-Glu-Asp tai t · · '·* * sen minkä tahansa muunnoksen, joka on sen kanssa immunologi- i ·*·,, sesti ristireaktiivinen, mutta joka ei ole koko lämpösokki- f proteiini, edellyttäen, että polypeptidi, jolla on seuraava ,. ·. aminohapposekvenssi f ♦ t « t « · · « · · • I * « · 103976

1 MAKTIAYDEE ARRGLERGLN ALADAVKVTL GPKGRNWLE KKWGAPTITN DGVSIAKEIE 61 LEDPYEKIGA ELVKEVAKKT DDVAGDGTTT ATVLAQALVR EGLRNVAAGA NPLGLKRGIE 121 KAVEKVTETL LKGAKEVETK EQIAATAAIS AGDQSIGDLI AEAMDKVGNE GVITVEESNT 181 FGLQLELTEG MRFDKGYISG YFVTDPERQE AVLEDPYILL VSSKVSTVKD LLPLLEKVIG 5 241 AGKPLLIIAE DVEGEALSTL WNKIRGTFK SVAVKAPGFG DRRKAMLQDM AILTGGQVIS

301 EEVGLTLENA DLSLLGKARK VWTKDETTI VEGAGDTDAI AGRVAQIRQE IENSDSDYDR 361 EKLQERLAKL AGGVAVIKAG AATEVELKER KHRIEDAVRN AKAAVEEGIV AGGGVTLLQA 421 APTLDELKLE GDEATGANIV KVALEAPLKQ IAFNSGLEPG WAEKVRNLP AGHGLNAQTG 481 VYEDLLAAGV ADPVKVTRSA LQNAASIAGL FLTTEAWAD KPEKEKASVP GGGDMGGMDF 10 ja polypeptidit, joilla on aminohapposekvenssit 234-540, 61-540, 109-540, 171-540, 272-540 ja 280-540 sekä ihmisen mito-kondrioproteiini P1 ovat poissuljettuja.

5. Patenttivaatimuksen 4 mukainen polypeptidi, 15 tunnettu siitä, että se sisältää sekvenssin Val-Leu-Gly-Gly-Gly-Cys-Ala-Leu-Leu-Arg-Cys-Ile-Pro-Ala-Leu-Asp-Ser-Leu-Thr-Pro-Ala-Asn-Glu-Asp tai sen minkä tahansa muunnoksen, jonka sekvenssi on vähintään 40-%risesti homologinen sen kanssa.

6. Patenttivaatimuksen 4 mukainen polypeptidi, tunnettu siitä, että siinä on 24 aminohappoa. > I I I I • » I r f • · • » » · f

1 I > f · • f f I I « • ·· « f f · • I • · ·· • · · « I I 4 I I • • tt > I * • « f • • · « • ft I f · • t f • t • ·« « < < « < « i « • I I « 1 · I « t I · i a i 4 t