AT398495B - Diagnose oder vorhersage von atherosklerose - Google Patents

Description

AT 398 495 B

Die Erfindung betrifft Verfahren und die Verwendung von Verfahren zur Feststellung des Gehaltes an HSP-Antikörpern in menschlichem Blut zur Diagnose oder Vorhersage von Atherosklerose.

Es gibt zunehmende Beweise dafür, daß zelluläre und humorale Immunreaktionen in der Pathogenese von Atherosklerose involviert sind. Es wurden das Vorhandensein einer großen Zahl von aktivierten T-Lymphocyten, die "abweichende" Expression von MHC (Major Histocompatibility Complex)-Klasse II-Antigen durch Endothelzellen und glatte Muskelzellen und Immunkomplexablagerung im menschlichen atherosklerotischen Läsionen gezeigt. Um den spezifischen T- und B-Zellreaktionen hervorrufenden Mechanismus in der Entwicklung von Atherosklerose zu identifizieren, wurde eine Serie von Experimenten durch Immunisierung von Kaninchen mit einer Reihe von Antigenen durchgeführt, darunter solchen, die von atherosklerotischen Läsionen isoliert worden sind. Die Resultate zeigten, daß atherosklerotische Läsionen nur in Tieren auftraten, die mit HSP65-enthaltenden Materialien entweder in der Form von Mykobakterien oder oder rekombinanten HSP65 allein immunisiert worden sind.

Im Rahmen der vorliegenden Erfindung werden unter HSP die sogenannten "Hitzeschock-Proteine" (heatshock proteins) und allgemein Streß-Proteine verstanden, die eine Gruppe von Familien von ungefähr zwei Dutzend Proteinen und Verwandten darstellen, die ein hohes Maß an Sequenzhomologie zwischen verschiedenen Arten, von Bakterien bis hin zum Menschen, aufweisen. Eine erhöhte Expression von HSP, die durch verschiedene Arten von Streß, beispielsweise Infektionen oder Temperatur, freie Radikale oder mechanische Belastung hervorgerufen sein kann, schützt die Zelle von äußeren Einflüssen, kann aber auch pathologisch Autoimmunantworten aufgrund von gegenseitigen Reaktionen zwischen dem Mikroorganismus HSP und zellulären "$elbst"-Komponenten hervorrufen. Da zahlreiche HSP in einigen Zelltypen normalerweise nicht gebildet werden, sondern nur unter der Einwirkung von verschiedenen Streßarten auftreten, können diese vom Immunsystem als fremd oder als "verändertes Selbst" erkannt werden. Auch primäre Autoimmunreaktionen können gegen HSP hervorgerufen werden.

Interessanterweise wird die erhöhte HSP65-Expression auch in endothelialen Zellen, Makrophagen und Muskelzellen in menschlichen atherosklerotischen Läsionen beobachtet. Es ist gut bekannt, daß die zunehmende Rate von Atherosklerose stetig mit einem Alter von über 40 Jahren korreliert.

Die Erfindung beruht auf der Erkenntnis, daß Antikörper gegen HSP (kurz: HSP-Antikörper) in humanem Serum von Testsubjekten mit Atherosklerose in der Carotis gegenüber solchen ohne Läsionen stark erhöht ist. Diese Korrelation von zirkulierenden HSP-Antikörpern mit Atherosklerose weist darauf hin, daß eine Immunreaktion gegen HSP auch beim Hervorrufen von Atherosklerose im Menschen eine Rolle spielt.

Erfindungsgemäß wird daher die Verwendung eines Verfahrens zur Feststellung des Gehaltes an HSP-Antikörpern in aus dem menschlichen Körper entnommenen Blut zur Diagnose und Vorhersage von Atherosklerose vorgeschlagen.

Vorteilhaft werden H$P65-Antikörper nachgewiesen.

Im Gegensatz zu bisher angewandten sonographischen Verfahren zur Feststellung von Atherosklerose sind erfindungsgemäß keine aufwendigen und lediglich an bestimmten Stellen zur Verfügung stehenden und nur durch geschultes Personal zu bedienende Apparaturen nötig. Vielmehr kann die Blutabnahme überall erfolgen, und die Bestimmung des Gehaltes an HSP-Antikörpern ist praktisch in jedem Labor machbar. Die HSP-Antikörper in menschlichem Blut stellen somit einen neuen und vorteilhaften Parameter bei der Diagnose und Vorhersage von Atherosklerose dar.

Die positive Korrelation von HSP65-Antikörpern mit Atherosklerose in der Carotis wurde durch eine epidemiologische Studie bestätigt, die den HSP65-Antikörper-Gehalt im Blut bzw. Serum von 876 Testsubjekten mit oder ohne sonographisch detektierbaren atherosklerotischen Läsionen in der Carotis untersucht worden ist.

Die Studie wurde an Einwohnern der Stadt Bruneck in Südtirol (Italien) mit einer Bevölkerung von 13.534 Einwohnern durchgeführt. Alle Testsubjekte waren zwischen 40 und 80 Jahren alt und wurden registriert. Die Anzahl der Testsubjekte n betrug 4.775. Von dieser Gruppe wurden 1.000 Individien nach dem Zufallsprinzip für die vorliegende Studie ausgewählt. Vier Gruppen, von denen jede ca. 125 Männer und 125 Frauen umfaßt, wurden gebildet.

Das Blut wurde zwischen 7 und 10 Uhr abgenommen, und alle Testsubjekte waren gezwungen, an diesem Tag kein Frühstück einzunehmen. Das Serum wurde gewonnen und bei -20 *C bis zur Verwendung aufbewahrt. Zur Bestimmung der Serumantikörper gegen HSP65 wurde der Enzym-Iinked Immunosorben-tassay (ELISA) angewandt. Für den ELISA wurden Mikrotiterplatten (96 Vertiefungen: Petra-Plastic, Würzburg, BRD) mit 1 ug/ml des rekombinanten HSP65 von Mykobakterien (Mycobacterium bovis BCG) in 100 ul PBS/Vertiefung gefüllt und bei 4*C über Nacht inkubiert. Nach dem Waschen mit 0,02%igem PBS-Tween und Blockieren mit 1% BSA (bovines Serumalbin) wurden die Platten mit 100 ul humanem Serum verdünnt 1:10 bis 1:5000, eine Stunde bei Raumtemperatur inkubiert. Nach einem weiteren Waschgang mit Tween-PBS wurden die Platten mit Peroxidase-konjugierten Kaninchenantikörpern gegen humane immuno- 2

AT 398 495 B globuline mit einer Verdünnung von 1:300 in PBS inkubiert. Nach einer weiteren Waschung wurde 100 ul Citratphosphatpuffer (0,1 M, pH 4,2), der 0,53 mg/ml von 2,2-Azino-bis (3-ethylbenzthiazolin-6-sulfonsäure) (Sigma, München, BRD) enthält, hinzugegeben. Nach 30 Minuten wurde die Absorption bei 490 nm in einem Microelisa Autoreader (Dynatech Labatories Inc., Alexandria, Virginia) gemessen. Die Hintergrundabsorption mit dem Antigen und den Konjugaten wurde mit der optischen Dichte (OD) von 0 korrigiert. Eine Serumverdünnung wurde dann als positiv für Antikörper gegen HSP bewertet, wenn die OD 490 0,400 überschritt.

Die Sonographie an der Carotis aller Testsubjekte wurde durch speziell geschulte Ärzte mit einem hochauflösenden Doppler-Scanning-Apparat im Ultraschall-Labor der Innsbrucker Klinik durchgeführt. Bei sitzendem Testsubjekt wurden Läsionen an sechs Stellen in beiden Carotis-Arterien (untere gemeinsame Carotis unterhalb der Gabelung und oberhalb der Gabelung) in der vorderen schrägen, seitlichen und hinteren Ebene quantifiziert, wobei ein kompakter Biosound-Echtzeitabbilder (B-Mod) mit einer 8-MHZ-Sektor-Scannersonde und einem digitalen Scan-Konverter verwendet worden ist. Durch Summieren der maximalen Dicken der Läsionen an den nahen und fernen Wänden jeder der drei Bildstellen in jedem CarotisSystem führte zu einem Maß für das Ausmaß der Atherosklerose in der Carotis in Millimetern. Läsionen, die 0,8 mm überschritten, wurden als positiv unabhängig von ihrer Größe gewertet.

Die statistische Analyse wurde mit dem linearen Regressionstest, dem Mann-Whitney U-Test, und einer Zwei-Faktoren-Varianzanalyse, der Varianz, durchgeführt. Ein P-Wert von weniger als 0,05 wurde als statistisch signifikant betrachtet.

Um den Effekt des Alterns auf den HSP65-Antikörper-Gehalt in humanem Serum zu erfassen, wurde eine einfache lineare Regressionsanalyse unter Verwendung kontinuerlicher Varianz und des Alters (1 Jahr als eine Einheit) und des Antikörper-Titers durchgeführt. Diese Daten sind in der Tabelle 1 aufgeführt und zeigen eine positive Korrelation von Alter und dem Antikörpergehalt im Serum, und zwar unabhängig vom Geschlecht.

Die Bevölkerung von 40 bis 80 Jahren wurde in vier Gruppen unterteilt, um die Beziehung von HSP65-Antikörpern zu Atherosklerose in der Carotis zu testen unter Beachtung der altersabhängigen Steigerung des Antikörpergehaites. Der Antikörper-Titer wurde weiters in jeweils einer Gruppe analysiert, die in Testsubjekte mit oder ohne atherosklerotischen Läsionen in der Carotis unterteilt wurde, wobei der Mann-Whitney U-Test benutzt wurde. Ein signifikantes Ansteigen der Serumantikörper gegen HSP65 in Testsubjekten mit atherosklerotischen Läsionen wurde in den Gruppen C und D, nicht aber den Gruppen A und B (Tabelle 2) beobachtet. Dieses Ansteigen der Antikörper in den Gruppen C und D war unabhängig vom Geschlecht. Die Serumantikörper-Gehalte der Testsubjekte mit oder ohne erkennbaren atherosklerotischen Läsionen in den Gruppen A und B zeigte keinen signifikanten Unterschied, höchstwahrscheinlich aufgrund der geringen Zahl von Individuen mit Läsionen (A, n = 8: B, n = 30).

Um einen Effekt des Alters auf das Auftreten von Serumantikörpern in einer gegebenen Gruppe auszuschließen, wurde eine Zwei-Faktoren-Analyse auf die Gruppen C und D angewandt. Die Daten sind in der Tabelle 3 dargestellt und zeigen, daß die erhöhten Antikörpergehalte in den Individuen der Gruppen C und D dem Faktor "atherosklerotische Läsion in der Carotis" zuzuschreiben sind und nicht dem Faktor "Alter” oder "Geschlecht". Die Tabelle zeigt keinen signifikanten Effekt einer Wechselwirkung des Alters mit der Läsion auf die Antikörper.

Wie bereits erwähnt, zeigen die in praktisch allen Arten vorhandenen HSP eine sehr hohe Sequenzhomologie, nicht nur zwischen Bakterienarten, sondern über alle Formen des Lebens hinweg. Die Tatsache, daß ältere Menschen länger Mikroorganismen der Umwelt ausgesetzt sind, kann teilweise den altersbedingten Anstieg der HSP65-Serumantikörper, der sich in der studierten Bevölkerung gezeigt hat, erklären. Andererseits haben zahlreiche epidemiologische Studien beim Menschen eine positive Korrelation zwischen Alter und Atherosklerose ähnlich den vorliegenden Beobachtungen gezeigt. Durch Ausschließen eines Effektes des Alters auf das Auftreten von Antikörpern wurde ein signifikanter Anstieg von HSP65-Antikörpem in Individuen mit detektierbaren atherosklerotischen Läsionen der Carotis gefunden. Die in den beiliegenden Tabellen angeführten Daten Zeigen klar einen strengen Zusammenhang zwischen dem Gehalt an HSP65-Antikörpern und atherosklerotischen Läsionen. Dies erlaubt es, HSP-Antikörper zur Diagnose und Vorhersage von Atherosklerose zu verwenden, wie dies erfindungsgemäß vorgesehen ist.

Eine mögliche Rolle der zirkulierenden HSP-Antikörper in der Erzeugung von Atherosklerose könnte eine Autoimmunreaktion auf endothelialen Zellen umfassen, die bereits einen hohen HSP-Gehalt aufgrund von Streß ( mechanische, beispielsweise hämodynamische Einwirkung) gebildet haben. Diese erhöhte Bildung von HSP auf endothelialen Zellen von Arterien mit Läsionen wurde durch immunohistologische Methoden mit einem monoklonalen Antikörper (Ml 30) gegen HSP65 nachgewiesen. Ein weiterer Beweis für die primär kausale Rolle von HSP65 in der Erzeugung von Atherosklerose läßt sich aus einem Tierversuch herleiten, bei dem Kaninchen mit rekombinantem HSP65 immunisiert wurden und daraufhin Atherosklerose 3

AT 398 495 B entstand. Diese Annahme ist auch mit dem sogenannten "Antwort auf Verletzung "-Modell der Hervorrufung von Atherosklerose kompatibel. Arteriell-endotheliale Zellen, die aufgrund verschiedener Faktoren, wie beispielsweise mechanischen Streß, Hyperlipidämie, Toxine, Infektionen, freie Radikale, etc. beschädigt oder tot sind, bilden HSP oder geben dieses ab, welches dann seinerseits eine spezifische Immunantwort hervorruft, die fähig ist, atherosklerotische Läsionen hervorzurufen oder zu verstärken.

Es gibt bereits auch Hinweise darauf, daß nicht nur HSP65 (Molekulargewicht 65.000) sondern auch andere HSP, bespielsweise HSP 60 oder HSP 70, die in größeren Mengen in menschlichen atheroskieroti-schen Läsionen gebildet werden, als Pathogene für Atherosklerose auftreten. Aus diesem Grund ist es auch denkbar, andere HSP als HSP65 als wertvollen Parameter für die Diagnose und Vorhersage von Atherosklerose zu verwenden.

Neben den beschriebenen ELISA-Verfahren zum Nachweis von HSP eignen sich auch andere HSP-Nachweisverfahren, insbeondere immunologische Methoden. Beispielsweis können dabei markierte Isotopen-, Enzym-, fluoreszenz-markierte oder unmarkierte Antikörper verwendet werden.

Im folgenden werden zwei solche immunologische Methoden beispielhaft beschrieben.

Solid-phase Radioimmunassay (RIA) Für diesen Test wurden Polyvinylchlorid Mikrotiterplatten (Dnatech Lab, Chantilly, WA) mit 96 Vertiefungen mit 50 ul Antigen (1 ug/ml) in Phosphat-gepufferter Kochsalzlösung (PBS) gefüllt und 16 Stunden bei 4°C gehalten. Jede Vertiefung wurde viermal mit PBS (enthält 0,05% Tween 20) gewaschen. Die verbliebenen Bindungsstellen wurden dann durch eine Inkubation mit 1% bovinem Serumalbumin (BSA) in PBS eine Stunde bei Raumtemperatur geblockt. Die Vertiefungen wurden abgesaugt und viermal wie oben beschrieben gewaschen. Nach zweistündiger Inkubation bei Raumtemperatur mit geeignet verdünntem humanem Serum wurden die Vertiefungen abgesaugt und viermal gewaschen, bevor ein geeigneter für humane lg spezifischer iodierter Antikörper hinzugefügt wurde und zwei Stunden bei Raumtemperatur inkubiert wurde. Jede Vertiefung wurde abgesaugt und die Radioaktivität wurde in einem Gammazähler bestimmt.

Fluoroimmunoassay

Es wurde eine Modifikation des Micro-Immuno-Fluorescence-Assay verwendet, um HSP65-Antikörper im Serum zu bestimmen. Kurz zusammengefaßt, wurden 96 Vertiefungen der Polyvinylchlorid Mikrotiterplatten mit 100 ul Antigen (1 ul/ml) in Phosphat-gepufferter Kochsalzlösung (PBS) gefüllt und 16 Stunden bei 4*C gehalten. Jede Vertiefung wurde viermal mit PBS (enthält 0,05% Tween 20) gewaschen. Die verbliebenen Bindungsstellen wurden durch eine Inkubation mit 1% bovinem Serumalbumin in PBS eine Stunde bei Raumtemperatur geblockt. Die Vertiefungen wurden abgesaugt und viermal wie oben beschrieben gewaschen. Nach zweistündiger Inkubation bei Raumtemperatur mit geeignet verdünntem humanem Serum wurden die Vertiefungen abgesaugt und viermal gewaschen. Fluorescein-Isothiocyanat-Konjugate gegen humane lg wurden mit Amido-Schwarz als Gegenfärbung benutzt. Nach dem Waschen wurde der Inhalt der Vertiefungen photometrisch bei einer Wellenlänge von 550 nm gemessen.

Bei der praktischen Durchführung des erfindungsgemäßen Artherosklerose-Tests mittels HSP ist zur Berücksichtigung der rein altersbedingten Zunahme von HSP günstig, wenn in aus dem menschlichen Körper entnommenem Blut der Gehalt an HSP-Antikörpern nachgewiesen und der ermittelte Gehalt mit einem dem Alter des Menschen entsprechenden Sollwert bzw. Sollwertbereich einer Reihe von als Funktion des Alters aufgezeichneten Sollwerten bzw. Sollwertbereichen verglichen wird. Der für einen bestimmten Patienten ermittelte HSP-Wert braucht dann nur mehr mit dem seinem Alter entsprechenden Sollwert (beispielsweise in einer Tabelle) verglichen werden. Liegt der HSP-Wert über dem alterspezifischen Sollwert, so läßt dies auf Atherosklerose bzw. Atheroskleroserisiko schließen. Ähnlich können bevorzugt die geschlechtsspezifischen Abweichungen der HSP-Soll-bzw."Normar-Werte berücksichtigt werden, indem für die beiden Geschlechter jeweils eine gesonderte Reihe von als Funktion des Alters aufgezeichneten Sollwerten bzw. Sollwertbereichen angelegt wird, und daß der für einen bestimmten Menschen ermittelte Gehalt an HSP-Antikörpern mit einem dem Alter des Menschen entsprechenden Sollwert bzw. Sollwertbereich der dem Geschlecht des Menschen entsprechenden Reihe verglichen wird. 4

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Claims (5)

1. AT 398 495 B Tabelle 2 HSP65-Antikörper-Titer in Testsubjekten mit und ohne atherosklerotischen Läsionen in der Carotis Beide Geschlechter 40-49 Jahre (A) 50-59 Jahre (B) 60-69 Jahre (C) 70-80 Jahre (D) ‘Läsion ( + ) 280486 (n-8) 324487 (n-30) 478464 (n=77) 442447 (ty* 128) Läsion (-) 242419 (n~203) **p=0.6582 313437 (n~174) p*0.5696 316430 (n~ 135) p-0.0181 314438 (n~79) P=0.0037 Frauen Läsion (+) 187471 (n-3) 3624126 (n-6) 5424122 (n~28) 517499 (n-51) Läsion (-) 248431 (n-106) p-0.9167 309432 (n=97) p*0.7780 319437 (n~76) p=0.0210 371460 (n~44) p=0.0412 Männer Läsion (+) 3364130 (n=5) 3144105 (n=24) 441472 (n-49) 391441 (n=77) Läsion (-) 237422 (n-97) p-0.6378 319474 (n=77) p=0.9122 312450 (n-59) p=0.0348 241+35 (n=35) p*0.0103 ‘Läsion (+ ,·) mit, ohne sonographischen detektierbaren atherosklerotischen Läsionen in der Carotis. **Mann-Whitney U-Test. Tabelle 3 Zwei-FAktoren-Analyse der Varianz des HSP65-Antikörper-Titers Beide Geschlechter mittlere Quadrate F-Test P-Wert After (C,D)‘ 33386.5 0.164 0.6853 Läsion ( + ,-) 2040481.5 10.05 0.0016 Alter x Läsion 29208.4 0.144 0.7047 Frauen After (C,D) 8076.4 0.031 0.8605 Läsion (+,-) 1497800.7 5.746 0.0175 After x Läsion 65528.4 0.251 0.6167 Männer Alter (C,D) 177980.9 1.187 0.2771 Läsion ( + ,-) 981091.8 6.543 0.0112 Alter x Läsion 5825.4 0.039 0.8439 ‘Gruppe C, 60*69 Jahre; Gruppe D: 70-80 Jahre. Patentansprüche 1. Verwendung eines Verfahrens zur Feststellung des Gehaltes an HSP-Antikörpem in aus dem menschlichen Körper entnommenem Blut zur Diagnose oder Vorhersage von Atherosklerose.
2. 2. Verwendung nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß HSP65-Antikörper nachgewiesen werden. 6 AT 398 495 B
3. 3. Verfahren zur Diagnose oder Vorhersage von Atherosklerose, dadurch gekennzeichnet daß in aus dem menschlichen Körper entnommenem Blut der Gehalt an HSP-Antikörpern nachgewiesen und der ermittelte Gehalt mit einem dem Alter des gesunden Menschen entsprechenden Sollwert bzw. Sollwertbereich einer Reihe von als Funktion des Alters aufgezeichneten Sollwerten bzw. Sollwertbereichen verglichen wird.
4. 4. Verfahren nach Anspruch 3, dadurch gekennzeichnet, daß für die beiden Geschlechter jeweils eine gesonderte Reihe von als Funktion des Alters aufgezeichneten Sollwerten bzw. Sollwertbereichen angelegt wird, und daß der für einen bestimmten Menschen ermittelte Gehalt an HSP-Antikörpern mit einem dem Alter des Menschen entsprechenden Sollwert bzw. Sollwertbereich der dem Geschlecht des Menschen entsprechenden Reihe verglichen wird.
5. 5. Verfahren nach Anspruch 3 oder 4, dadurch gekennzeichnet, daß die HSP-Antikörper HSP65-Antikörper sind. 7