JPH06508030A - ヒトすい島グルタミン酸デカルボキシラーゼ自己抗原のクローニング及び発現 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 ヒトすい島グルタミン酸デカルボキシラーゼ自己抗原のクローニング及び発現 発明の背景 Ｔ−アミノ酪酸（ＧＡＢＡ）は、哺乳動物中枢神経系の主要な阻害性神経伝達物 質である。ＧＡＢＡ生合成における律速段階は、グルタミン酸デカルボキシラー ゼ（ＣＡＤ）によるし−グルタミン酸の脱カルボキシル化である。ＧＡＤ活性又 はＧＡＤ遺伝子の調節に関しては、確実にはほとんど知られていない。脳の中で 広く分布しているにもかかわらず、ＣＡＤタンパク質は非常に少量でしか存在せ ず、均質になるまで精製するのは非常にむずかしい。 ＣＡＤの研究は、分子量、運動特性、配列（わかっている場合）及び疎水性を異 にする多数の形態の酵素の存在によって妨げられてきた。例えば、ブタの脳の中 には異なる３つの形態のＣＡＤが存在すること（Ｓｐｉｎｋ　ｅｔ　ａｌ、、　 Ｊ、　Ｎｅｕｒｏｃｈｅｍ、　４０　：　１１１３−１１１９　（１９８３）） 又ラットの脳の中には４つの形態のＣＡＤが存在すること（Ｓｐｉｎｋ　ｅｔ　 ａｌ、＋Ｂｒａｉｎ　Ｒｅｓ、　４２１：　２３５−２４４　（１９８７））が 報告されている。マウスの脳ＣＡＤ　（ｔ（ｕａｎｇ　ｅｔ　ａｌ、＋　Ｐｒｏ ｃ、　Ｎａｔｌ、＾ｃａｄ、　Ｓｃｉ、　ＬＩＳＡ　８７　：　８４９１−８４ ９５（１９９０））及びネコの脳から分離されたＣＡＤクローン（Ｋｏｂａｙａ ｓｈｉ　ｅｔａｌ、、　Ｊ、　Ｎｅｕｒｏｓｃｉ、　７　：　２７６８−２７７ ２　（１９８７））　も同様に報告されている。ヒトの脳においては、ＣＡＤの 少なくとも２つの異性体が報告されたＣｈａｎｇ　ａｎｄ　Ｇｏｔｔｌｉｅｂ、 　Ｊ、　Ｎｅｕｒｏｓｃｉ、　８　：　２１２３−２１３０　（１９８Ｂ）。 全く異なるＣＡＤアイソザイムの特徴づけをさらに複雑にしているのは、ＣＡＤ が脳の外側の組織内にも発見され、このＣＡＤが脳のＣＡＤと種々の程度の相同 性を有するという事実である。例えば、ＣＡＤは、例えばラットといった複数の 異なる種について報告されてきたように（Ｐｅｒｓｓｏｎ　ｅｔ　ａｌ、＋　Ｐ ｅｒｓｐｅｃｔｉｙｅｓ　ｏｆ　Ａｄｒｏｌｏｇｙ、　Ｍ＋　５ｅｒｉｏ、　（ ｅｄ、）ｐ１２９−１３８．　Ｒａｙｅｎ　Ｐｒｅｓｓ、　ＮＹ　（１９８９） ）こう丸の生殖細胞内及びヒト、モルモット、サル及びマウスのこう兎肉でも（ Ｐｅｒｒｓｏｎ　ｅｔ　ａｌ、＋　Ｍｏｌ。 Ｃｅ１ｌ　Ｂｉｏｌ、　１０　：　４７０１−４７１１　（１９９０））発現さ れている。ヒトこう丸ＣＡＤは、ネコの脳ＣＡＤに対し比較的高度の全体的ヌク レオチド配列の相同性をもつことがわかった。すい臓内のＣＡＤの存在について も同様に記述されている。０ｋａｄａ　ｅｔ　ａｌ、、　５ｃｉｅｎｃｅ　１９ ０　：　６２０−６２２（１９７６）　、Ｇａｒｒｙ　ｅｔ　ａｌ、　Ｊ、　Ｈ ｉｓｔｏ堕ｅｍ、　Ｃｔｏｃｈｅｍ、　３６　：　５７３−５８０（１９８Ｂ） 　、及びＶｉｎｃｅｎｔ　ｅｔ　ａｌ、、　Ｎｅｕｒｏｅｎｄｏｃｉｎ、　３６ 　：　１９７−２０４（１９８３）。 スティッフマン症候群（ＳＭＳ）と呼ばれる稀な神経障害が、ＧＡＢＡ分泌神経 細胞に対する自己抗体の存在と関連づけされている。ＳＭＳにおける自己抗体に 対する支配的自己抗原は脳ＣＡＤであることが最近になって立証された。　Ｓｏ ｌｉｍｅｎａ　ｅｔ　ａｌ、＋　Ｎ、　Ｅｎ　］、　Ｊ、　Ｍｅｄ、　３１８　 ：１０１２−１０２０　（１９８８）及びＳｏｌｉｍｅｎａ　ｅｔ　ａｌ、、　 Ｎ、　Ｅｎ　１．　Ｊ、　Ｍｅｄ、　３２２　：１５５５−１５６０　（１９９ ０）。 インシュリン依存性糖尿病（ＩＤＤＭ）患者のうちＳＭＳも発生させるのはわず かな割合である。自己免疫メカニズムがＩＤＤＭの臨床的発症を早める可能性が あるということが推測されている。典型的には、ランゲルハンス島の中のすい臓 β（ベータ）−細胞の破壊がＩＤＤＭに先行する。この破壊は、島内へのリンパ 球の大量浸潤及びβ細胞への循環する自己抗原の存在によって中介されるものと 考えられている。 ＩＤＤＨの発生に関連づけられる自己抗体の主たる標的は、相対分子量６４００ ０（６４Ｋ　＞のすい臓β細胞抗原である。Ｂａａｋｋｅｓｋｏｖ　ｅｔ　ａｌ 、。 Ｊ、　Ｃｌ１ｎ、　Ｉｎｖｅｓｔ、　７９　：　９２６−９３４　（１９８７） 　。６４に抗原に対する抗体は、新たに診断された患者の約８０％以上に存在し 、漸進的なβ細胞喪失に付随して臨床的な１００Ｍ発症より前数年以内に検出さ れた。６４に抗原は最近になってＣＡＤとして同定された。Ｂａｅｋｋｅｓｋｏ ｖ　ｅｔ　ａｌ、。 Ｎａｔｕｒｅ　３４７　：　１５１−１５６　（１９９０）。 脳ＣＡＤの場合と同様に、未変性ヒトすい島細胞ＣＡＤは、いくつかの欠点をも つ。ヒトすい島ＣＡＤは単に微量タンパク質にすぎず、天然供給源から有効量を 単離することは実施不可能である０例えば、未変性ヒトすい島細胞ＣＡＤの精製 には多数のヒトのすい臓が必要とされ、それ自体大きな障害となっている。さら に、ヒトの組織からの精製は、肝炎ウィルス、旧ｖ−１及び旧Ｖ−２といったレ トロウィルス及びその他のウィルス性作用物質などの感染力ある作用物質を同時 精製するという危険性をはらんでいる。このことは、治療用製剤の受容者をこの ような作用物質に感染させる可能性を呈するのみならず、これらの製剤を製造し 試験する作業員及び診断研究室で製剤を用いることになる人々の間で重大な懸念 をひき起こす。 従って、当該技術分野において、ヒトすい島細胞ＣＡＤポリペプチドの純粋調製 物を比較的大量に生成する安全な方法に対するニーズが存在する。これらのポリ ペプチドは、とりわけ、ＩＤＤＭといったＣＡＤ関連疾病の治療及びこれらの疾 病の診断及び監視における治療用剤として有用である。きわめて顕著なことに、 本発明は、組換えＤＮＡ技術を使用することによってこれらの及びその他の関連 するニーズを満たし、かくしてウィルス汚染の問題を無くし、又ヒトすい島細胞 のＣＡＤポリペプチドを商業的に実現可能な量で提供する。 発明の要約 本発明は、組換え又は合成手段によりヒトすい島細胞ＣＡＤポリペプチドを製造 する可能性を提供する。このように製造されたヒトすい島ＧＡＤポリペプチドは 、意閲される用途に応じて生来の酵素の生物学的活性を有していてもよいし又有 していなくてもよい。従って、ポリヌクレオチドがｃＤＮＡ又はゲノム性ＤＮＡ といったＤＮＡ又はＲＮＡの形をとっていてよいヒトすい島ＧＡＤポリペプチド をコードする単離され精製されたポリヌクレオチドが記述される。これらの配列 に基づいて、ヒトすい島細胞ＣＡＤをコードするプローブを、これらの遺伝子及 びその関連遺伝子又はその転写産物を同定するべくハイブリダイゼーションのた めに設計することができる。 関連する実施態様においては、本発明は、ＣＡＤポリペプチドの発現のために各 々作用可能に連結された、転写プロモーフ、ヒトすい島細胞ＣＡＤポリペプチド をコードするＤＮＡ配列及び任意には転写ターミネータを含むＤＮＡ構成体に関 する。これらの構成体は、好ましくは、宿主細胞、好ましくは真核細胞、さらに 好ましくは哺乳動物又は酵母細胞をトランスフェクション又は形質転換するのに 用いられる。大規模製造のためには、発現されたヒトすい島細胞ＣＡＤポリペプ チドを例えば免疫アフィニティー精製などによって細胞から単離することができ る。ＣＡＤ抗原決定基又はＣＡＤ分子のその他の領域を免疫学的に模倣する小さ な合成ペプチドも調製することができる。 本発明のＣＡＤポリペプチドは同様に、例えば、体外免疫吸着手段によって適切 にＣＡＤすい島細胞自己抗原に対する自己抗体を除去するために、治療用にも用 いることができる０本書に記述するＣＡＤポリペプチドは又、特にＩＤＤＭとい ったＧＡ［］自己抗原に対する自己抗体によってひき起こされるか又はこれに関 連する疾病を発生する傾向をもつか又はすでにこのような疾病に悩まされている 人において免疫寛容を誘発するのに使用される場合、医薬組成物として処方され 投与され得る。 その他の実施態様においては、ＣＡＤポリペプチドは、対象となる人物の体内の ＣＡＤ自己抗体レベルを検出しそして／又は定量する診断用試薬として使用され る。これらの診断方法及び化合物を、特にＩＤＤＭの治療といったＧＡ［ｌ関連 疾病の治療的アプローチと合わせて使用することが可能である。 図面の簡単な説明 図１は、部分的ヒトすい島ＣＡＤクローンのダイヤグラムである。 図２は、ヌクレオチド及びアミノ酸がラインの左端に番号づけされた状態で、ヒ トすい島ＧＡＤの予想上の一次構造とヌクレオチド配列を示している；又 図３は、ヒトすい島ＧＡＤとラット及びネコの脳ＣＡＤのバイトロバシー（ｈｙ ｄｒｏｐａｔｈｙ）プロットである。 選定された実施態様の説明 ヒトすい島細胞ＧＡＤは、ＧＡＢＡの合成を触媒する酵素である０本発明は、ヒ トすい島細胞ＣＡＤの単離されたヌクレオチド配列を提供し、かくしてヒトすい 島細胞ＣＡＤポリペプチドの最終的発現を提供している。組換え型ＤＮＡ発現シ ステムは、比較的純粋な形で、大量の組換え型ヒトすい島細胞ＣＡＤ及びそのフ ラグメントを得るための便利な手段を提供する。 本発明は同様に、岨換え型ヒトすい島細胞ＣＡＤポリペプチドをも提供する。「 組換え型」というのは、組換え型発現システムにより産生され典型的には生来の 内因性物質を含まないポリペプチドのことを意味する。「ポリペプチド」という のは、最高で全てのヒトすい島ＧＡＤタンパク質を含め、少なくとも６個、典型 的には１０〜２５個、最高１００−２００を越えるアミノ酸の配列を含むことを 意味する。ポリペプチドが全ＣＡＤタンパク質を含む場合、そのポリペプチドは 、図２に開示されているような全ヒトすい島細胞ＣＡＤ配列と実質的に相同とな る。「実質的に相同」というのは、本発明のヒトすい島細胞ＣＡＤ配列のアミノ 酸配列に対して少なくとも約８５％好ましくは９０％、より好ましくは約９５％ 以上の相同性を有ししかも生来のＣＡＤの少なくとも幾分かの生物学的活性をな おも保持している配列を含むことを意味する。「生物学的活性」というのは、Ｌ −グルタミン酸の脱カルボキシル化を触媒し、生来のヒトすい島細胞ＣＡＤタン パク質に結合する抗体（すなわちヒトすい島細胞ＣＡＤに対する自己抗体）を特 異的に結合しそして／又は生来のタンパク質にも結合する抗体を惹起する能力の ことである。 本発明のポリペプチドが全部よりも少ないＣＡＤタンパク質を含む場合、このポ リペプチドは好ましくは、ＣＡＤタンパク質の可変領域の少なくとも約６個、時 として１０個、さらに通常は少なくとも１５個のアミノ酸の部分に対し実質的に 相同である。すなわち、いくつかの配列ドメインは可変的であり、その他の組織 及び／又は種のＣＡＤの類似の領域と少なくとも１５％、より典型的には少なく とも約２０％異なっており、一方ヒトすい島細胞ＣＡＤのその他の領域はその他 のＣＡＤと同一か又はほぼ同一であり、か（して保存領域を表わす。本発明のヒ トすい島細胞ＣＡＤの保存及び可変配列領域は、例えばライスコンシン大学生物 工学センター、遺伝学コンピュータグループ、１７１０　Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ 　Ａｖｅｎｕｅ、Ｍａｄｉｓｏｎ、［５３７０５ＣＤｅｖｅｒｅｕｘ、Ｎｕｅ。 Ａｃ１ｄｓ、　Ｒｅｓ、　１２　：　３８７−３９６　（１９８４）の配列解析 ソフトウェアパッケージを用いた配列アラインメント技術といった当業者には既 知の技術によって決定できる。相同性は、本書に参考として内含されているＪｕ ｌｉｅｎ　ｅｔ　ａｌ、、　Ｊ、　Ｎｅｕｒｏｃｈｅｍ、　５４　：　７０３− ７０５　（１９９０）内に開示されているような例えばラット及びネコの脳ＣＡ Ｄ配列を用いて当該ＣＡＤ配列の最適なアラインメントを達成することによって 決定される。 例えば、図２を参照すると、ヒトすい島ＧＡＤ可変領域ドメインは、ネコ及びラ ットのアミノ酸配列に比較したとき、Ｎ末端残基１−９１及び位置１３７−１７ １　、４０５−４３１及び５１１〜５４０で同定される。少なくとも可変領域ド メインの一部分、典型的には可変領域から少なくとも約６つの隣接するアミノ酸 及び往々にして１０個以上の残基を含むエピトープは、ヒトすい島細胞ＣＡＤ特 異標識として役立つことができる。 当業者であれば理解できるとおり、本発明は同様にアミノ酸配列及びその他の特 性についてわずかな変更を伴うポリペプチドをも含む、このような変更は、天然 に対立遺伝子の変化（例えば遺伝子多量現象などによる）として発生することも あれば、誘発された点、欠失、挿入及び置換突然変異体といったヒトの介入（例 えばクローニングされたＤＮ＾配列の突然変異誘発）により生成されることもあ る。保存的アミノ酸置換、小さな内部的欠失又は挿入及び分子の端部における付 加又は欠失といったアミノ酸配列内のわずかな変化が一般に好まれる。置換は例 えばＤａｙｈｏｆｆ　ｅｔ　ａｌ、　（Ａｔｌａｓ　ｏｆ　ＰｒｏｔｅｉｎＳｅ 　ｕｅｎｃｅ　ａｎｄ　５ｔｒｕｃｔｕｒｅ　ンパク　の　１　び　°告゛″１ ９７８年、Ｎａｔ’ｌ　Ｂｉｏｍｅｄ、　Ｒｅｓ、　Ｆｏｕｎｄ、＋　Ｗａｓｈ ｉｎｇｔｏｎ　Ｄ、Ｃ，）のモデルを基本にして設計することができる。これら の変更はアミノ酸配列の変化という結果をもたらし、サイレント突然変異を提供 し、制限部位を変更し、或いは又その他の特異的突然変異を提供する可能性があ る。ポリペプチドは、ヒトすい島ＣＡＤの選択された１又は複数の抗原決定基を 含み、生来のＣＡＤタンパク質が示す触媒活性を有するか又はこのような活性を 欠如し、ＣＡＤ結合領域などを積数することができる。 本書に記述されているようなヒトすい島細胞ＣＡＤをコードする核酸配列は、こ の酵素を発現するヒト細胞供給源から直接クローニングすることができる。好ま しい供給源としては、ヒトすい島細胞があるが、ＧＡＢ＾を分泌する神経細胞も 同様に、相同なヒト脳ＣＡＤの供給源として役立ちうる。本発明が提供するヌク レオチド及びアミノ酸配列は、以下でさらに詳しく記述するようにその他の組織 特異的ヒトＣＡＤを同定しクローニングするためにも使用できる。ＣＡＤ配列を クローニングし発現するための有用な核酸配列としては、ｍＲＮＡ、ゲノムＤＮ Ａ及びｃＤＮＡがあるが、発現のためには発現を妨害するイントロンが欠如して いることがらｃＤＮＡが一般に好まれる。 ヒトすい島ＣＡＤと実質的に相同なヒトすい島ＧＡＤクローン又はその他のヒ） 　ＣＡＤクローンを得るためには、例えばヒトすい島細胞から調製されたｃＤＮ パライブラリを、ここで提供されているヒトすい島ＣＡＤから或いは又例えば各 々本書中に引用により組み入れられるマウス脳ＧＡＤ　（Ｋａｔａｒｏｖａ　ｅ ｔ　ａｌ、、　Ｅｕｒ、　Ｊ、　Ｎｅｕｒｏｓｃｉ、　２　：　１９０−２０２ （１９９０））、ネコ脳ＣＡＤ　（Ｋｏｂａｙａｓｈｉ　ｅｔ　ａｌ、　Ｊ、　 Ｎｅｕｒｏｓｃｉ、　７　：　２７６８−２７７２　（１９８７））又はラット 脳ＣＡＤ　（Ｊｕｌｉｅｎ　ｅｔ　ａｌ、、　Ｊ、　Ｎｅｕｒｏｃｈｅｍ、　５ ４　ニア０３−７０５　（１９９０））の相同な配列領域からの標識されたプロ ーブを用いてスクリーニングする。ヒトすい島細胞又は望ましい場合にはその他 の組織／細胞から精製されたｐｏｌｙＡ’ＲＮＡを用いて、オリゴ−ｄＴ、プラ イムのｃＤＮパライブラリを構築することができる。このライブラリは、例えば 相同性ＣＡＤに対する抗体及び／又は標識づけされたプローブを用いてスクリー ニングできる。完全なコード配列が得られるまで、追加のスクリーニングにおい てプローブとして部分的クローンを使用することができる。必要とあらば、完全 なコード配列を構築するため適正なリーディングフレーム内で部分的クローンを 連結する。連結は、適当な制限エンドヌクレアーゼを用いてクローンを消化し、 適切な方向で酵素的にフラグメントを連結させることによって達成される。フラ グメント及び選択された特定の制限エンドヌクレアーゼに応して、欠失突然変異 誘発の「ループアウト」プロセス又は制限エンドヌクレアーゼ開裂及び突然変異 誘発の組合せにより、望ましくないＤＮＡ配列を除去することが必要となる場合 もある。生じた配列は連続したオーブンリーディングフレームの形であること、 すなわち介在配列（イントロン）が欠如していることが好まれる。 本書に記述されているように単離された代表的なヒトｃＤＮＡすい島ＧＡＤクロ ーンはヒトすい島細胞ＣＡＤの完全なコード配列を与えるべく組合わせることが できる。例えばｐＨｌＧ１．９及びｐＨｌＧ１１と呼ばれる２つのクローンを組 合わせると、図２に示されているような完全コード配列と３′−非翻訳配列が得 られる。このクローンは、３′末端でポリＡ配列の上流にポリアデニル化配列を 有する。当業者であれば、コードの縮重のため、同じアミノ酸配列をコードする か或いは又図２のもののような基準配列から変化する突然変異体配列をコードす るヌクレオチド配列に著しい多様性が存在しうるということが容易に理解できる だろう。基準配列の少なくとも一部分と実質的に相同であるべき突然変異体の配 列の場合、突然変異の正味効果が、生来の配列と突然変異体配列の間に不利な機 能的差異を生み出してはならない。ヒトすい島ＣＡＤクローンの同一性は、例え ば、インビ上旦翻訳及びそれに続く免疫反応性及び５ＤＳ−ポリアクリルアミド ゲル上の移動、配列決定によって又は適当な酵素活性例えばＴ−アミノブチル酸 合成を触媒することによって、確認できる０例えばＣｈｕｄｅ及びＷｕ、　Ｊ、 　Ｎｅｕｒｏｃｈｅ＋ｃ、　２７　：　８３−８６　（１９７６）に記されてい るように、Ｃｏ２及び／又はＧＡＢＡ法によりＣＡＤ触媒活性を検定することが できる。簡単に言うと、これらの検定では、例えば基質としてＬ−［Ｕ−”　Ｃ Ｉ　グルタミン酸塩を利用することができ、形成された１４ｃｏ。 及び（”Ｃ）　ＧＡＢＡの量が決定される。 本書で提供されるヒトすい島ＧＡＤのヌクレオチド及び演鐸されたアミノ酸配列 を用いて、既知の手順に従ってその他の細胞及び組織から調製されたライブラリ から、その他のヒトＣＡＤをコードするゲノム性配列又はｃＤＮＡ配列を得るこ とができる０例えば、一般に少なくとも約１４以上で最高２５又はそれ以上のヌ クレオチドの長さをもつヒトすい島細胞ＣＡＤ配列から誘導されたオリゴヌクレ オチドプローブを用いて、ベータ細胞、こう丸又は神経細胞からのアイソザイム といったその他の細胞のＣＡＤをコードするＤＮＡ配列を得ることができる。こ こでも又、部分クローンが得られる場合、エンドヌクレアーゼ開裂、連結及びル ープアウト突然変異誘発といった技術を用いて、それらを適正なリーディングフ レーム内で連結して全長クローンを生成することが必要である。 発現のためには、それ自体発現のための適切な宿主細胞を形賞転慎又はトランス フェクションするのに使用される適当な発現ベクターの中に、ヒトすい島ＧＡＤ をコードするＤＮＡ配列が挿入される。本発明を実施する上で使用する発現ベク ターには、リーディングフレーム内で配列を生成する連続的に転写可能な遺伝子 配列を生成するようヒトすい島ＣＡＤをコードする配列と作用可能に連結されヒ トすい島ＧＡＤポリペプチドを生成するよう連続的に翻訳される、クローニング されたＤＮＡの転写を誘導できるプロモータ及び転写ターミネータが含まれる。 本発明を実施する上で用いられる宿主細胞としては、哺乳動物、鳥類、植物、昆 虫、細菌及び真菌の細胞が含まれるが、好ましくは真核細胞である。好ましい真 核細胞には、培養された哺乳動物細胞系（例えばげっ歯頚又はヒト細胞系、ただ し最も好ましくはヒト細胞系）及び酵母の挿（例えば５ａｃｃｈａｒｏ＊ｙｃｅ ｓ　ｓｐｐ、、特にＳ、　Ｃｅｒｅｖｔｓ：ａｅ。 Ｓｃｈｉｚｏｓａｅｃｈａｒｏｍ　ｃｅｓ　ｓｐｐ、又はＫｌｕｖｖｅｒｏｍ　 ｃｅｓ　ｓｐｐ、）又は糸状真菌（例えばハ朋」匡比ｕｓ　ｓｐｐ、、　Ｎｅ肛 坦匣■Ｓｐｐ、）を含む真菌細胞が含まれる。さまざまな原核及び真核性宿主細 胞内で組換え型ポリペプチドを産生ずるための方法は、当該技術分野において一 般に知られている。 哺乳動物の細胞内で本発明の組換え型ヒトすい島ＣＡＤポリペプチドを産生ずる ためには、さまざまな宿主細胞を使用することができる。本発明において使用す るための培養された哺乳動物細胞には、ＣＯ３−１（ＡＴＣＣＣＲＬ　１６５０ ）、　ＢＡＬＢ／ｃ　３Ｔ３　（ＡＴＣＣＣＲＬ　１６３）、　ＢＨＫ　（ＡＴ ＣＣＣＲＬ　１０３１４）、　２９３　（ＡＴＣＣＣＲＬ　１５７３）、　Ｒａ ｔ　Ｈｅｐ　Ｉ　（ＡＴＣＣＣＲＬ　１６００）。 Ｒａｔ　Ｈｅｐ　ＩＩ　（ＡＴＣＣＣＲＬ　１５４８）、　ＴＣＭＫ　（ＡＴＣ ＣＣＣＬ　１３９）、ヒトの肺（ＡＴＣＣＣＣＬ　７５．１）　、ヒト肝がん（ ＡＴＣＣＨＴＢ−５２）、　Ｈｅｐ　Ｇ２　（ＡＴＣＣＨＢ８０６５）、マウス の肝Ｎ（ＡＴＣＣＣＣＬ　２９．１）、　ＮＣＴＣ１４６９（ＡＴＣＣＣＣＬ　 ９．１）及びＤＵＫＸ細胞（［Ｊｒｌａｕｂ及びＣｈａｓｉｎ、　Ｐｒｏｃ、　 Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、　ＵＳＡ　７７　：４２１６−４２２０．１ ９８０）が含まれる。ラット（ＲＩＮ−５Ａｔ（−Ｂ　；　Ｋａｒｌｓｅｎ　ｅ ｔ。 ａｌ、、　Ｊ、　Ｂｉｏｌ、　Ｃｈｅｍ、　２６６　：　７５４２−７５４８． 　（１９９１））、マウス（ＮＩＴ　；Ｈａ＋ｎａｇｕｃｈｉ　ｅｔ　ａｌ、、 　Ｄｉａｂｅｔｅｓ　（糖尿病）　３９　：　４１５−４２５　（１９９０）） 及びハムスター（）ＩＩＴ　；　５ａｎｔｅｒｒｅ＋　ｅｔ　ａｌ、＋　Ｐｒｏ ｃ、　Ｎａｔｌ、Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、　ＵＳＡ。 ７８　：　４３３９−４３４３　（１９８１））などのベータ細胞系も同様に使 用できる。 本発明を実施する上で使用するための哺乳動物発現ベクターには、クローニング された遺伝子又はｃＤＮＡの転写を誘導することのできるプロモータが含まれる 。好ましいプロモータにはウィルス性プロモータ及び細胞性プロモータが含まれ る。ウィルス性プロモータには、即時型早期サイトメガロウィルスプロモータ　 （Ｂｏｓｈａｒｔ　ｅｔ　ａｌ、＋らの主要後期プロモータ　ＣＫａｕｆｔｍａ ｎ　ａｎｄ　５ｈａｒｐ、　Ｍｏ１．　Ｃｅ１１．　Ｂｉｏｌ。 ２　：　１３０４−１３１９．１９８２）が含まれる。細胞性プロモータには、 マウスメタロチオネイン−１プロモータ（Ｐａｌｎｉｔｅｒ　ｅｔ　ａｌ、、　 Ｕ、Ｓ、特許４．５７９，８２１号）、マウス■プロモータ（Ｂｅｒｇ）ａｎ　 ｅｔ　ａｌ、＋　Ｐｒｏｃ。 含まれているのは、対象となっているコード配列の下流にあるポリアデニル化シ グナルである。ポリアデニル化シグナルには、ＳＶ４０からの前期又は後期ポリ アデニル化シグナル（Ｋａｕｆｍａｎ　ａｎｄ　５ｈａｒｐｓ同書）、アデノウ ィルス５ＥＩＢｅＪ［域からのポリアデニル化シグナル及びヒト成長ホルモン遺 伝子ターミネータ　（ＤｅＮｏｔｏ　ｅｔ　ａｌ、、　Ｎｕｃ、　Ａｃ１ｄｓＲ ｅｓ、　９　：　３７１９−３７３０．１９８１）が含まれる。ベクターには、 ＳＶ４０＋：　ｙハンサー及びマウスμエンハンサ−（Ｇｉｌｌｉｅｓ、　Ｃｅ 旦３３　：　７１７−７２８゜１９８３）　といったエンハンサ−配列も含まれ ろる。発現ベクターには同様に、アデノウィルスＶＡ　ＲＮＡをコードする配列 も含まれうる。 ベクターは、商業的供給′ａ（例、Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ＋　Ｌａ　Ｊｏｌｌａ 、　ＣＡ）から得ることができる。 クローニングされたＤＮＡ配列は、当業者であれば明確に理解できるように、さ まざまな手段によって、培養されだ哺乳動物の細胞の中に導入することができる 。例えば、リン酸カルシウムが媒介するトランスフェクション（Ｗｉｇｌｅｒ　 ｅｔ　ａｌ、、釦旦（細胞＞　１４　：　７２５゜１９７８　：　Ｃｏｒｓａｒ ｏ及びＰｅａｒｓｏｎ、　Ｓｏｍａｔｉｃ　Ｃｅ１ｌ　Ｇｅｎｅｔｉｃｓ（’　 云ギリ；　６０３＋　１９８１　；　Ｇｒａｈａｍ　ａｎｄ　Ｖａｎ　ｄｅｒ　 Ｅｂ、　ｕ組棟■＋　５２　；　４５６゜１９７３）、電気穿孔法（Ｎｅｕｍａ ｎｎ　ｅｔ　ａｌ、、　ＥＭＢＯＪ、　１　：　８４１−８４５．１９８２）又 はＤＥＡＥ−デキストラン媒介されたトランスフェクション（Ａｕｓｕｂｅｌｅ ｔ　ａｌ、、　（ｅｄ、）　Ｃｕｒｒｅｎｔ　Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ　ｉｎ　Ｍｏ １ｅｃｕｌａｒ　Ｂｉｏｌｏ　ゝ物８における　のプロトコル　、Ｊｏｈｎ　Ｗ ｉｌｅｙ　ａｎｄ　５ｏｎｓ、　Ｉｎｃ、＋ＮＹ　（１９Ｂ？）　、本書に参考 として内含）などが便利に使用できる。クローニングされたＤＮＡを安定した形 で組込んだ細胞を同定するためには、一般に、対象となる遺伝子又はｃＤＮＡと 共に細胞内へ選択可能な標識が導入される。培養哺乳動物細胞の中で使用するの に好ましい選択可能な標識としては、ネオマイシン、ヒグロマイシン及びメトト レキセートといった薬物に対する耐性を付与する遺伝子が含まれる。さらに、選 択可能な標識は増幅可能な選択可能標識であってよく、好ましい増幅可能な選択 可能標識にはＤＨＦＲ遺伝子及びネオマイシン耐性遺伝子が含まれる。選択可能 標識についてはＴｈ１ｌｌｙにより総説されている　（Ｍａｍｍａｌｉａｎ　Ｃ ｅ１ｌ　Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、　Ｂｕｔｔｅｒｗｏｒｔｈ　−Ｐｕｂｌｉｓｈ ｅｒｓ、　Ｓｔｏｎｅｈａｍ＋　Ｍ＾、本書に引用により組み入れる）。選択可 能標識の選択は、当業者のレベル範囲内に充分大るものである。 選択可能標識は、問題のすい島細胞ＣＡＤ配列と同時に別々のベクター上で細胞 内に導入することもできるし、或いは又同じベクター上で導入することもできる 。同じベクター上の場合、問題の選択可能標識及びすい島細胞ＣＡＤ配列は、異 なるプロモータ又は同じプロモータの制限下にあってよく、後者の場合ジシスト ロンメッセージを生成する。このタイプの構成体は、当該技術分野において知ら れている（例えば、Ｌｅｖｉｎｓｏｎ及びＳｉｍｏｎｓｅｎ、米国特許４，７１ ３，３３９号）。 細胞内に導入される混合物に対して「担体ＤＮＡ　Ｊとして知られる付加的なり ＮＡを付加することも同様に有利である。 トランスフェクションを受けた哺乳動物細胞は、一定期間、典型的には１〜２日 間増殖させられた後、問題のＤＮＡ配列を発現し始める。その後、安定した形で 選択可能な標識を発現している細胞の増殖について選択するため、薬物選択が応 用される。増殖可能な選択可能標識でトランスフェクションを受けた細胞につい ては、クローニングされた配列の増大したコピー数について選択し発現レベルを 増大させるように段階的に薬物濃度を増加させることができる。 ヒトすい島ＣＡＤなどの外因性タンパク質をコードする発現ベクターを植物、鳥 類及び昆虫の細胞の中に導入するためのプロモータ、ターミネータ及び方法は、 当該技術分野において充分に知られている０例えば、昆虫細胞内で異種ＤＮＡ配 列を発現するためのベクターとしてのバキュロウィルスの使用は、Ａｔｋｉｎｓ ｏｎ　ｅｔ　ａｌによって総説されている（Ｐｅｓｔｉｃ、　Ｓｃｉ、　２８　 ：　２１５−２２４．１９９０）　、植物細胞内で遺伝子を発現するためのベク ターとしてのアグロバクテリウム・リゾゲネス（れｐ畑且迫■堕（加μｍ狙虹） の使用は、５ｉｎｋａｒ　ｅｔ　ａｌ。 （Ｌ−現且胚１エエＩ」目力」搬−１１：　４７−５８．１９８７）によって総 説された。 真菌を形質転換するための技術は、文献により周知のものであり、例えば本書中 に引用により組み入れられるＢａｇｇｓ　（Ｎａｔｕｒｅ　２７５　：１０４− １０８　（１９７Ｂ））、Ｈｉｎｎｅｎ　ｅｔ　ａｌ、（Ｐｒｏｃ、Ｎａｔｌ、 八ｃａｄ、Ｓｃｉ、Ｕ、Ｓ、＾。 ７５　：　１９２９−１９３３．１９７８）、　Ｙｅｌｔｏｎ　ｅｔ　ａｌ、　 （Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ。 ＵＳＡ　８１　：　１７４０−１７４７．１９８４）、　Ｒｕ５ｓｅｌｌ　（Ｎ ａｔｕｒｅ　３０１　：　１６７−１６９゜１９８３）及び米国特許４，９３５ ，３４９号によって記述されている。宿主細胞の遺伝子型は一般に、発現ベクタ ー上に存在する選択可能な標識により相補される遺伝的欠陥を含んでいる。特定 の宿主及び選択可能な標識の選択は、当業者のレベル範囲内に充分大るものであ る。 本発明において使用される適切な酵母ベクターにはＹＲｐ７　（Ｓｔｒｕｈｌｅ ｔ　ａｌ、、　Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、　ｌｌ５Ａ　７ ６　：　１０３５−１０３９．１９７８）。 ＹＥｐ１３　（Ｂｒｏａｃｈ　ｅｔ　ａｌ、、　Ｇｅｎｅ　（遺倣王）　８　： 　１２１−１３３．１９７９）、　ＰＯＴヘクター（Ｋａｗａｓａｋｉ　ｅｔ　 ａｌ、米国特許Ｎα４，９３１，３７３、引用により本書に組み入れる）　、ｐ ＪＤＢ２４９及びｐＪＤＢ２１９　（Ｂｅｇｇｓ、　１ｂｉｄ、）及びその誘導 体が含まれる。このようなベクターは一般に、形質転換体を選択できるようにす る表現型検定が存在する優性の表現型を示す任意の数の遺伝子のうちの１つであ ってよい選択可能標識を含むことになる。好ましい選択可能標識は、宿主細胞の 栄養要求性を相補し、抗生物質耐性を提供するか又は細胞が特定の炭素供給源を 利用できるようにし、ＬＥＵ２　（Ｂｒｏａｃｈ　ｅｔ　ａｌ、、前掲）　、Ｕ ＲＡ３　（Ｂｏｔｓｔｅｉｎ　ｅｔａｌ、、　Ｇｅｎｅ　８　：　１７．１９７ ９）＋　ＨＩＳ３　（Ｓｔｒｕｈｌ　ｅｔ　ａｌ、、前掲）又は皿（Ｋａｗａｓ ａｋｉ　ｅｔ　ａｌ、＋前掲）を含むものである。もう１つの適切な選択可能ｉ 識は、酵母菌細胞上にクロランフェニコール耐性を付与するｑ口遺伝子である。 酵母において使用するための好ましいプロモータには、酵母解糖系遺伝子（Ｈｉ ｔｚｅｍａｎ　ｅｔ　ａｌ、、　Ｊ、　Ｂｉｏｌ、　Ｃｈｅｗ、　２５５　：　 １２０７３−１２０８０゜１９８０　；　Ａｌｂｅｒ　ａｎｄ　Ｋａｗａｓａｋ ｉ、Ｊ、Ｍｏ１．　Ａ　１．　Ｇｅｎｅｔ、１　二　４１９−４３４−＋１９８ ２　：　Ｋａｗａｓａｋｉ　、米国特許４，５９９．３１１号）又はアルコール デヒドロゲナーゼ遺伝子（Ｙｏｕｎｇ　ｅｔ　ａｌ、、　Ｇｅｎｅｔｉｃ　Ｅｎ ｇｉｎｅｅｒｉｎｇ　ｏｆ　Ｍｉｃｒｏ−ｏｒｇａｎｉｓｍｓ　ｆｏｒ　Ｃｈｅ ｍｉｃａｌｓ＋　Ｈｏ１ｌａｅｎｄｅｒ　ｅｔ　ａｌ、＋　（ｅｄｓ、）＋　ｐ ３５５＋Ｐｌｅｎｕｍ、　Ｎｅｓ　Ｙｏｒｋ＋　１９８２　；　Ａｍ＋ｗｅｒｅ ｒ、　Ｍｅｔｈ、　Ｅｎｚ　ｍｏｌ、　１０１　：　１９２−２０Ｌ　１９８３ ）からのプロモータが含まれる。この点において、特に好ましいプロモータは、 ＴＰＩＩプロモータ（Ｋａｗａｓａｋｉ、米国特許第４．５９９，３１１号、１ ９８６）及びＡＤＨ２−４Ｃプロモータ　（Ｒｕｓｓｅｌｌ　ｅｔ　ａｌ、。 Ｎａｔｕｒｅ　３０４　：　６５２−６５４．１９８３　；　Ｉｒａｎｉ　ａｎ ｄ　Ｋｉｌｇｏｒｅ、米国特許出願第１８３，１３０号、引用により本書に組み 入れる）である。発現ユニットは同様に転写ターミネータをも含みうる。好まし い転写ターミネータはＴＰＩＩターミネータ　（Ａｍｂｅｒ　ａｎｄ　Ｋａｗａ ｓａｋｉ、前掲）である。 酵母において本発明のヒトすい島ＧＡＤと発現する上で用いることのできる追加 のベクター、プロモータ及びターミネータは、当該技術分野において充分知られ ており、例えば本書に引用により組み入れるＥｍｒ、　Ｍｅｔｈ、　Ｅｎｚ　ｍ ｏｌ、　１８５　：　２３１−２７９　（１９９０）によって総説されている。 本発明のＤＮＡ構成体を含む宿主細胞は次に、ヒトすい高細胞ＣＡＤポリペプチ ドを産生ずるべ（培養される。細胞は、選択された宿主細胞の増殖に必要とされ る栄養素を含む培地の中で標準的方法に従って培養される。当該技術分野におい ては適当なさまざまな培地が知られており、−ｉに、炭素源、窒素源、必須アミ ノ酸、ビタミン及びミネラルならびに特定の宿主細胞によって必要とされうる成 長因子又は血清といったその他の構成成分が含まれる。増殖培地は一般に、例え ばＤＮＡ　ｊ＊成体上の選択可能標識により相補されるが又はＤＮＡ構成体で同 時トランスフェクションされる必須栄養素の欠損又は薬物選択によって、ＤＮＡ 構成体を含む細胞について選択することになる。特定の細胞系に適した培地の選 択は、当業者のレベル範囲内に入る。 例えば、酵母細胞は好ましくは、窒素源（例えば酵母エキス）、無機塩、ビタミ ン及び微量元素を含む培地内で培養される。培地のｐＨは好ましくは２以上８未 満のｐ）Ｉ、好ましくはｐＨ５〜６に維持される。安定したｐＨを維持するため の方法としては、好ましくは水酸化ナトリウムの添加を通しての緩衝と一定ｐＨ ｍ節が含まれる。好ましい緩衝剤としては、コハク酸及びＢ１５−Ｔｒｉｓ　（ Ｓｉｇｍａ　Ｃｈｅｍｉｃａｌ　Ｇｏ、。 Ｓｔ、、　Ｌｏｕｉｓ、　ＭＯ）が含まれる。培養された哺乳動物細胞は一般に 、市販の血清含有又は血清を含まない培地内で培養される。 本発明に従って産生されたヒトずい島細胞ＧＡＤは、ＧＡＤに対して向けられた 抗体好ましくはモノクローナル抗体を用いて抗体カラム上のアフィニティクロマ トグラフィによって精製することができる。 中でも液体クロマトグラフィ、勾配遠心分離及びゲル電気泳動法などの従来の科 学的精製手段により、追加の精製を達成することが可能である。タンパク譬精製 法は当該技術分野では知られており（−的に、引用により本書に組み入れる５ｃ ｏｐｅｓ、　Ｒ，、ｐｒｏＬ旦、胆ｒｉｆｉｃ仕」（タンパク質精製）　、Ｓｐ ｒｉｎｇｅｒ−νｅｒｌａｇ、　ＮＹ　（１９８２）を参照）、本書に記述され ている＆ＩＩ換え型ヒトすい島ＧＡＤの精製に応用できる。特に薬学的用途のた めには、少なくとも約５０％の均質性の実質的に純粋な組換え型ヒトすい島ＣＡ Ｄが好ましく、さらに好ましいのは約７０〜８０％以上、最も好ましいのは９５ 〜９９％の均質性である。望ましい通りに部分的にであれ均質性が得られるまで であれ、ひとたび精製されると、組換え型ヒトすい島ＣＡＤは、以下にさらに詳 しく記述するように、診断、治療などに用いることができる。 ヒトすい島ＧＡＤポリペプチドはまた、プロテアーゼ又は化学的作用物質を用い てより大きい精製された組換え型ＣＡＤポリペプチドを断片化することによって か、或いは父祖換え型ポリペプチドフラグメントを産生することによっても製造 することができる。合成すい島細胞ＣＡＤペプチドもまた、例えば引用により本 書に組み入れられるＭｅｒｒｉｆｉｅｌｄ、　Ｆｅｄ、　Ｐｒｏｃ、　２１　： 　４１２　（１９６２）及びＢａｒａｎｙ　ａｎｄＭｅｒｒｉｆｉｅｌｄ、　Ｔ ｈｅ　Ｐｅｐｔｉｄｅｓ　（ペプチド）、第２巻ｐｉ−２８４（１９７９）Ａｃ ａｄｅｍｉｃ　Ｐｒｅｓｓ、　ＮＹに記述されているような従来の固相合成手順 を用いて、本書で提供されるアミノ酸配列からも製造できる０選択されたヒトす い島ＧＡＤ領域に相応する約６個乃至約３５個のアミノ酸の短かいポリペプチド 配列又オーバラップするペプチドのライブラリを容易に合成することができ、そ の後、ＣＡＤ触媒活性、結合活性、免疫優性エピトープ（特に自己抗体により認 識されるもの）などの原因であるか又はこれらに寄与するドメインといった望ま しい活性をもつペプチドを同定するべく設計されたスクリーニング検定において スクリーニングすることができる。組換え型ポリペプチドは、適当な制限部位に おいてヒトすい島細胞ＧＡＤのｃＤＮＡを消化することにより生成されるフラグ メントといったＧＡＤ　ＤＮＡフラグメントを発現することによって産生され得 る。次に、上述のような活性について、単離した組換え型ポリペプチド又は細胞 −馴化培地を検定する。 本発明に従って製造されたヒトすい高細胞ＣＡＤポリペプチドは、さまざまな用 途を有している０例えば、組換え型又は合成のＣＡＤポリペプチド化合物は、生 物学的試料すなわち、制限的ではないが細胞培養上清、細胞リゼイト、清澄細胞 リゼイト、細胞抽出物、組織抽出物、血液、血漿、血清及びその分画を含む細胞 、細胞成分又は細胞産物から誘導されたか又はこれらを含むあらゆる試料の中で の遊＃ＣＡＤ　（ベータ細胞破壊の尺度としての）の検出において又は抗ＧＡＤ 自己抗体の検出及び数量化において、診断用に用いることができる。 ヒトすい島ＧＡＤ自己抗体に特異的に結合するヒトすい島ＧＡＤポリペプチドを 手にすることによって、患者体内の自己抗体の濃度を測定することができ、この レベルは次に危険な状態にある患者体内の有害である可能性のある自己抗体の進 行又は退行を監視するのに使用することができる。検定結果は又、ＩＤＤＭ、ス ティッフマン症候群又は関連疾病の治療のための治療措置の有効性を監視するた めにも使用できる。 当業者であれば明確に理解できるように、本発明において使用することのできる 免疫検定法には数多くのタイプがある。例えば、各々引用により本書に組み入れ られる米国特許第４，６４２，２８５号；４．３７６．１１０号；　４，０１６ ，０４３号；３，８７９，２６２号；　３，８５２．１５７号；３．８５０，７ ５２号；　３．８３９．１５３号；　３，７９１，９３２号及びＨａｒｌｏｗ　 ａｎｄ　Ｌａｎｅ＋八ｎｔｉへｏｄｉｅｓ、＾　Ｌａｂｏｒａｔｏｒ　Ｍａｎｕ ｅｌ＋　Ｃｏ１ｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　）ＩａｒｂｏｒＰｕｂｌｉｃａｔｉｏｎｓ、 　Ｎ、Ｙ、　（１９８８）に一般に記述されているように直接及び間接結合検定 、競合検定、サンドインチ検定などがある。１つの゛検定形式においては、生物 学試料中の抗ヒトすい島ＣＡＤ自己抗体は、直接、組換え型又は合成ＣＡＤポリ ペプチドに対する抗体の結合を測定することによって数量化される。生物学的試 料は、免疫複合体形成へと導く条件の下で本発明の少なくとも１つのヒトすい島 細胞ＣＡＤポリペプチドと接触させられる。ＣＡＤポリペプチドと抗体の間で形 成された免疫複合体を、次に検出し、試料中のヒトすい島細胞ＣＡＤに対する自 己抗体の存在を決定した。免疫複合体は、例えば抗１ｇＧ。 Ｉｇ？Ｉ及び／又はＩｇＡ　ヒト抗体といった標識付けされた抗体又はヒトＣＡ Ｄに結合する抗体を用いて検出することができる。場合によっては、バックグラ ウンド全体にわたる特異的結合を識別するため、分離段階（例えば洗浄）が必要 となることもある。もう１つの形式においては、患者の抗体又は血清ＣＡＤは、 結合のためそれぞれＣＡＤ又はＣＡＤポリペプチドに対する標識された又は標識 されていない抗体と競合することによって測定できる。標識されていないＣＡＤ は、ヒト抗体又はＣＡＤに結合する標識された抗体を組合わせて用いることがで きる。あるいは、ＣＡＤポリペプチドを直接標識することが可能である。放射性 核種、粒子（例えば金、フェリチン、磁性粒子、赤血球）、螢光物質、酵素、酵 素基質、酵素コファクター、酵素阻害物質、リガンド（特にハプテン）、化学発 光物質などといったさまざまな標識を利用することができる。 従って、β−すい島細胞ＧＡＤ自己抗原に対する自己抗体を識別することができ 、望ましくはＣＡＤへの結合により患者の血清から抽出することができる。　Ｃ ＡＤポリペプチドは、アフィニティー樹脂として機能するべく　ＥＬＩＳＡマイ クロタイターウェル、マイクロビーズ、フィルタ膜、不溶性又は沈降可能で可溶 性の重合体などの不溶性又は固体の支持体に対して例えば吸収などによって付着 することができる。このとき捕捉された自己抗体は、複数の方法によって同定で きる。例えば、抗体に対するモノクローナル抗体又は抗血清を用いることができ る。これらの抗血清又はモノクローナル抗体は、典型的にはヒト以外に由来する もの、例えばウサギ、ヤギ、マウスなどに由来するものである。これらの抗抗体 は、１０Ｉ、酵素、ビオチンなどの標識に付着された場合直接検出することがで き、又抗抗体を特異的に検出するために作られた標識づけされた二次抗体によっ て間接的に検出することもできる。 β−すい島細胞に対する自己抗体を検出する上で組換え型又は合成のヒトすい島 ＣＡＤポリペプチドと共に使用するため、キットも供給することができる。従っ て本発明の対象となっているＣＡＤポリペプチド化合物は、通常凍結乾燥された 形で容器内に入って、単独で又はＧＡＤ特異的抗体、標識及び／又は抗ヒト抗体 などの付加的試薬と組合せて提供できる。１つの標識にコンジュゲートされてい ても又コンジュゲートされていなくてもよいＣＡＤポリペプチド及び抗体は、キ ット内にトリス、リン酸塩、炭酸塩などの緩衝液、安定剤、殺生物剤、不活性タ ンパク質例えば血清アルブミンなどと共にキット内に含められる。時として、有 効成分を希釈するため不活性増量剤又は賦形剤を含めることが望ましく、ここで この賦形剤は全化合物の約１％乃至９９％の割合で存在していてよい。検定にお いてすい島ＧＡＤ自己抗体又は組換え型又は合成ＣＡＤに結合することのできる 抗体が利用される場合、この抗体は典型的には、別々のバイアルの中に存在する ことになる。 本発明のヒトすい島ＧＡＤ及び／又はずい島細胞ＧＡＤポリペプチドを結合する 診断又は治療向けの抗体は、さまざまな手段で製造することができる。例えばマ ウスといったヒト以外のモノクローナル抗体の産生は、良く知られており、例え ば組換え型又は合成のＣＡＤ分子又はその選択された部分（例えば１つのペプチ ド）で動物を免疫化することによって達成できる。例えば、選択されたスクリー ニングによって、抗ＧＡＤ自己抗体による認識の卓越した原因であるものといっ たＣＡＤ分子の１領域、又はかくしてすい島細胞ＣＡＤ特異的標識として役立ち うるずい島細胞ＧＡＤ可変領域のエピトープを含む一部分を同定することが可能 である。免疫化された動物から得られた抗体産生細胞は不滅化され、スクリーニ ングされるか又は例えばＣＡＤ分子と抗ＧＡＤ自己抗体の相互作用を阻害する抗 体の産生についてまずスクリーニングされその後で不滅化される。ヒトすい島細 胞ＣＡＤ分子といったヒト抗原に対するヒトモノクローナル抗体の生成は従来の 不滅化技術では困難である場合があることから、まずヒト以外の抗体を作り次に 組換え型ＤＮＡ技術を介して、非ヒト抗体の抗原結合領域例えばＦ（ａｂ’　） ｚ又は超可変領域をヒト定常領域（Ｆｃ）又はフレームワーク領域までトランス ファして実質的にヒトの分子を産生ずることが望ましい場合もある。このような 方法は当該技術分野において一般に知られており、例えば本書中に引用により組 み入れる米国特許４，８１６，３９７号、欧州特許公報１７３，４９４号及び２ ３９，４００号に記述されている。あるいは、本書引用により組み入れるＨｕｓ ｅ　ｅｔ　ａｔ−＋５ｃｉｅｎｃｅ　２４６　二１２７５−１２８１　（１９８ ９）により概略的に記されている一般的プロトコルに従ってヒトＢ細胞からＤＮ Ａ　ライブラリをスクリーニングし、次に望まれる特異性の抗体（又は結合フラ グメント）をコードする配列をクローニングし増幅することによってヒトすい島 細胞ＣＡＤタンパク質に対し特異的に結合するヒトモノクローナル抗体又はその 一部分をコードするＤＮＡ配列を単離することができる。 ヒトすい島細胞ＣＡＤ自己抗原に対する自己抗体の結合を阻害するような抗体を 含む、組換え型ヒトすい島細胞ＣＡＤに結合する抗体も同様に抗イデイオタイプ 抗体の生成に使用することができる。抗イデイオタイプ抗体は例えば、−次抗体 又はその抗原結合フラグメントで動物を免疫化することにより産生できる。ヒト すい島細胞ＣＡＤ分子によって一次抗体に対する結合が阻害されるような抗イデ イオタイプ抗体が選択される。抗イデイオタイプ抗体及びＣＡＤ分子の両方共が 一次抗体に結合することから、抗イデイオタイプ抗体は、１つのエピトープの「 内部（ｉ　ｎｔｅｒｎａ　ｌ）イメージ」を表わすことができ、かくしてＣＡＤ 自己抗原に代ってＣＡＤ自己抗体を遮断することにより疾病を阻害することがで きる。抗イデイオタイプの抗体を含む静脈内免疫グロブリン調製物での自己免疫 疾患の治療は、例えば、Ｎｙｄｅｇｇｅｒ　ｅｔ　ａｌ、　（ＣＩｉｎ、　［ｗ ＠ｕｎｏ１．　Ｉ＋ｕ＋ｕｎｏ　ａｔｈｏｌ、　５３　（２部２）：５７２−８ ２　（１９８９））によって開示されている。 本発明のもう１つの態様においては、本発明のヒトすい島ＧＡＤポリペプチドを 、ＣＡＤ分子に対する特異的レセプタをもつＴ細胞をクローニングするのに使用 することができる。　ＧＡＤ−特異的Ｔ細胞が当業者にとって一般に利用可能な 技術を用いてひとたび単離されクローニングされたならば、Ｔ細胞又はその膜調 製物を用いてＴ細胞上ですい島ＧＡＤレセプタに対する抗体を産生ずるべく動物 を免疫化することができる。抗体はポリクローナルでもモノクローナルでもよい 、ポリクローナルである場合、抗体はマウス抗体、ウサギ抗体、ウマ抗体、ヒツ ジ抗体又はその他のさまざまな哺乳動物からのものであってよい。モノクローナ ル抗体は標準的には、既知の技術に従って産生されたマウス由来のものであるか 上述のようなヒト由来のものであるか又はキメラ抗体又はヒト化抗体の形でのそ れらの組合せとなる。かくして得られた抗ＧＡＤレセプタ抗体は次に、疾患にか かりやすい又はすでにかかっている患者の体内でのＣＡＤ支持細胞の免疫学的破 壊を認識するか又はそれに参与するＴ細胞並集団を減少又は除去するべく、患者 に投与することができる。さらに、かくしてＣＡＤ−特異的Ｔ細胞レセプタを同 定し、クローニングし、配列決定することが可能であり、又ＧＡＤ分子に結合し ＣＡＤ支持細胞の認識を遮断して宿主すい島細胞に対する自己免疫応答を妨げる レセプタポリペプチドを合成することができる。　）Ｉｏｗｅｌｌ　ｅＬ　ａｌ 、　（Ｓｃｉｅｎｃｅ２４６　：　６６８−６７０　（１９Ｂ９））は、Ｔ細胞 レセプタペプチドが、自己免疫疾患モデル中のＴ細胞、自己抗原及び主要な組織 適合性複合体の間での３分子複合体の形成を遮断できることを実証した。 その他の実施態様においては、本発明は、ヒ）　ＣＡＤすい島細胞自己抗原に対 する自己抗体の結合を阻害しＴ細胞の増殖を阻害するヒトすい島ＧＡＤポリペプ チドに関する。自己抗体を結合するＣＡＤ自己自己抗原タンパク一部分は、上で 一般的に記述されているようにＣＡＤすい島ポリペプチドの比較的短かいフラグ メントを用いて又以下て゛論述するような血漿分離交換法を用いて患者から分離 された抗体といった自己抗体特にＩＤＤＭ又は関連疾患に結びついた自己抗体に 対しどのフラグメントが結合するかを決定することによって同定され得る。 従って、本発明のもう１つの態様においては、ヒトすい島細胞ＣＡＤポリペプチ ドは、患者の循環系から自己抗体を除去するため免疫吸着血漿分離交換法による 療法において使用できる。このような治療を受けている患者は、典型的に検出可 能なレベルの抗ＧＡＤ自己抗体を有し、かくしてＩＤＤＭ又はスティッフマン症 候群といったこのような自己抗体と関連する疾患を発生する危険性があるか、又 はすでにこのような疾患に悩まされていることになる。血漿分離交換法による治 療は、患者の血液を取出し、そこから血球を分離し、自己抗体を除去するべく例 えば免疫吸着カラム内で分離した血漿を処理し、処理済み血漿と血球を混合して 直接患者に戻すことによって提供される。標準的には、患者の血液は連続的に患 者から取り出し、処理され、又患者に戻される。 血漿を処理するための免疫吸着カラムは、固相マトリクスに共有結合（カップリ ング）された形で、本書に記述されているような組換え型すい島細胞ＣＡＤを含 む。さまざまな面相マトリクスにポリペプチドをカップリングするための手段は 、一般に当該技術分野において知られている。典型的には、引用により本書に組 み入れる例えば米国特許４，６８５，９００号に記載の「スペーサ３分子を含み うる共有結合（カップリング）は、固相マトリクスを適切に誘導体化し、本発明 のＣＡＤポリペプチドの能力及び結合活性を最大限にする条件の下でタンパク質 を連結することによって達成される。望ましくは、かくして形成された免疫吸着 剤は、自己抗体の吸着に対する高い能力を有し、きわめて安定していて、血漿内 へ解放されない。処理される血漿の体積及び処理の頻度は、例えば処理中の疾患 の重症度、患者の血漿中の自己抗体の量、患者の健康及び全身状態及び医師の判 断によって左右される。いかなる場合であれ、処理は症状を予防又は軽減するか 又は疾病の進行を抑えるのに充分なものでなくてはならない。 本発明のヒトすい島細胞ＣＡＤポリペプチドはまた、すい島β細胞のＣＡＤ自己 抗原に対する免疫応答の傾向をもつか又はすでにそれを示している患者体内でＣ ＡＤ自己抗原に対する免疫寛容又は非応答性（アレルギー）を誘発するのにも使 用できる。自己免疫疾患の抑制におけるポリペプチド抗原の使用は、Ｗｒａｉｔ ｈ　ｅｔ、　ａｌ、、によって開示されている（並置５９：２４７−２５５．　 （１９８９））。寛容を誘発するための条件はさまざまな要因に応して変動する ものの、寛容は成人及び新生児の両方において誘発されうる。新生児においては 、寛容は組換え型ポリペプチド又は合成抗原のいずれかを用いてＣＡＤ抗原を非 経口投与することによって、又さらに便利には適切な製剤形態での経口投与によ って誘発されうる。正確な投与量、その様式及び用量頻度は変動する。 ＩＤＤＭといったＣＡＤ関連疾患にかかりやすいか又はすでに患っている成人に おいてＧＡＩＩ自己抗原に対する免疫寛容を誘発するためには、正確な投与量及 びその頻度は同様に変動するが、成人については一般に毎日又は−週間に１回か ら数回の投与で約１〜１０００＋ｎｇ／ｋｇであり、さまざまな経路例えば非経 口、経口、エアゾル、皮肉注射などによって但し好ましくは静脈内注入により投 与される。新生児については、用量は成人に対して投与されるものよりも一般に 高くなる。 例えば、典型的には約１００〜１０００ｍｇ／ｋｇである。さらに低い用量の抗 原で寛容を誘発するためには（「低ゾーン寛容」）、シクロホスファミド又は小 児に使用するのに好まれるアザチオプリンといった免疫抑制薬の同時投与が、抗 体合成を阻害するべく低用量抗原治療可溶性形態で投与したとき、さらに寛容原 性を増す０本発明のＣＡＤポリペプチド抗原の持続性が成人における寛容の維持 にとって一般に必要であり、従ってこれには抗原のさらに頻繁な投与又はＣＡＤ すい島細胞ポリペプチドの半減期を延ばす形でのその投与が必要となる可能性が ある。 以下の例は、制限的な意味をもたず、例として提供されるものである。 氾 ヒトすい島細胞ＣＡＤのクローニング’ｆｆｌ！に！ｌ’冗−すい島細胞は、整 合した被移植者が利用不能な器官移植ドナーから得られたヒトのすい臓から単離 した。低温開溶液（ＤｕＰｏｎｔ、　Ｂｏｓｔｏｎ＋？ＩＡ）でのインサイチュ 潅流の後、各々のすい臓を入念に摘出し、すい管にカニユーレ挿入し、４＋ｎｇ ／ｍｌのコラゲナーゼ溶液（Ｖ型、Ｓｉｇｍａ、　Ｓｔ、　Ｌｏｖｉｓ、　ＭＱ ）を一定の速度でまず４°Ｃ次に３９°Ｃで注入した。腺を細かく切り裂き、解 放されたフラグメントを遠心分離により洗浄し、減少する径をもつ針を通して研 和させ、不連続フィコール密度遠心分離により精製した（Ｇ、Ｌ、Ｗａｒｎｏｃ ｋ、　Ｄｉａｂａｔｅｓ３５：５ｕｐｐｉ　１．　ｐｐ１３６−１３９．　Ｊａ ｎ、１９８９）　、上部界面から収穫した材料をプールし、ジチアシン染色によ りすい島純度を決定した後計数した。ライブラリ構築において用いられたすい島 は６５％純度よりも高く、一方ノーザンプロット法において用いられたすい島は ４０％純度より高かった。平均すい島直径は１７５μｍであった。さらに、単離 されたすい島は、高グリコース又はイソブチルメチルキサンチン（ＩＢＭＸ）の いずれかでの潅流後第１及び第２相の両方のインシュリン分泌機能を示した。 Ｆａｓｔ　Ｔｒａｃｋ”＋ｎＲＮＡ単離キット（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ＋　Ｓａ ｎｄｉｅｇｏ、　ＣＡ）を用いて、メーカーの指示事項に従ってポリ（Ａ）　” 　ＲＮＡを分離した。簡単に言うと、３００００の精製されたすい島を細胞溶解 緩衝液中で迅速に熔解させ、減少する径のニードルを用いて均質化し、プロティ ナーゼＫ及びＲＮアジンの存在下で消化し、次にポリ（Ａ）′″ＲＮＡをオリゴ −ｄ　（Ｔ）セルロースクロマトグラフィにより選択した。溶出した分画の濃度 及び純度をｏＤｔｂｏｉ。。で決定した。 メーカーの指示事項に従って、Ｌｉｂｒａｒｉａｎ　ＲＩ［ｃＤＮＡライブラリ 構築システム（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）及びＥｌｅｃｔｒｏｍａｘ”ＤＨＩＯＢ 　Ｅ、　ｃｏｌｉ　（大腸菌）細胞（ＧＩＢＣＯＢＲＬ、　Ｇａｉｔｈｅｒｓｂ ｕｒｇ、　ＭＤ）を用いて、ｃＤＮＡライブラリの構築のためにヒトすい島から の約２．５ｄｇのポリ（Ａ）′″ＲＮ＾を使用した。要するに、ヒトすい島から 分離した約２．５ｄｇのポリ（Ａ）　”　ＲＮＡを２末鎖ｃＤＮＡに変換し、次 にＢｓｔＸＩ非回帰性リンカ−（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を付加した。ｃＤＮＡ をサイズ分画し、反応しなかったリンカ−をアガロースゲル電気泳動法及び電気 溶出法により除去した。 ６００ｂｐよりも大きい相補的ＤＮＡ鎖を選択し、Ｌｉｂｒａｒｉａｎ　Ｒ１１ ｐｃＤＮＡ　Ｕベクターに連結した。連結された材料の一分画をＤＨＩＯＢ　Ｅ 。 ｃｏｌｉ細胞内に電気穿孔させた後、約１０％のバックグラウンドを伴う合計２ Ｘ１０’のコロニーをハイブリダイゼーションによりスクリーニングした。これ らのコロニーをナイロンフィルターに対し全く同ａ１．．　Ｍｏ１ｅｃｕｌａｒ 　Ｃ１ｏｎｉｎ　、Ｃｏ１ｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ　Ｐｒｅｓｓ＋　Ｃ ｏ１ｄ　ＳｐｒｉｎｇＨａｒｂｏｒ、　ＮＹ、　（１９８９年）により記述され ているとおりに、溶解、中和、洗浄及びベータした。 ヒトすい島ＧＡＤｃＤＮＡを含むコロニーを同定するためには、ネコ（Ｋｏｂａ ｙａｓｈｉ　ｅｔ　ａｌ、　Ｊ、Ｎｅｕｒｏｓｃｉ、　７：２７６Ｂ−２７７２ （１９８７））　、ラット（Ｊｕｌｉｅｎ　ｅｔ　ａｌ、、　Ｊ、Ｎｅｕｒｏ　 ｃｈｅＩｌｌ、　５４ニア０３−７０５（１９９０））及びマウス（Ｋａｔａｒ ｏｕａ　ｅｔ　ａｌ、同書）の脳ＣＡＤのコード領域の内部ならびにＮ−及びＣ −末端部分の３つの異なる相同ヌクレオチド配列からの保存された領域を代表す る２Ｏ−ｖｅｒのオリゴヌクレオチドプローブを合成しく表１）、キナーゼを用 いて３２Ｐ−ＡＴＰ標識付けし、ヒトすい島ｃＤＮＡライブラリのナイロンフィ ルター複製をスクリーニングするのに用いた。増大するストリンジエンシーでの ハイブリダイゼーションと連続的洗浄の後、０．７〜１．４ｋｂのインサートサ イズを表わす６つの陽性コロニーを、コロニー精製及びそれに続く配列分析のた めに選択した。３′コ一ド配列（ｐＨＩＧｌ、３）の１２８１の塩基対を含む（ μ徂１３００ｂｐクローンの６００ｂｐ　Ｐｖｕ　ＩＩ　−Ｐｓｔ　Ｉフラグメ ントでライブラリを再度スクリーニングすることにより、１．９ｋｂのインサー トを伴うもう１つのクローンＰＨＩＧ１．９　、図１を単離した。 表１ ５　’　−ＧＣＧＧＧＡＧＣＧＧＡＴＣＣＴＡＡＴＡＣＴＡＣＣＡＡＣＣＴＧＣ Ｇ−３’　ＺＣ３３３８５′プローブ ５　′　−八ＣＣＡＴＧＧＴＴＧＴＴＣＣＴＧＡＣＴＣＣＡＴＣＡＴ−３’　Ｚ Ｃ３３３９３′プローブ ５　’　−ＣＴＧＡＣＡＴＣＡＡＣＴＧＣＣＡＡＴＡＣＣＡＡＴＡＴＧＴＴＣＡ ＣＡＴＡＴＧＡＡＡ−ＴＴＧＣＡ−３’　ＺＣ３３３７主プローブ、−次スクリ ーンＤＮＡ配列決定のためには、プラスミドを急速沸とう方法により陽性クロー ンから分離した（Ｈｏｍｅｓ　ａｎｄ　Ｑｕｉｇｌｅｙ、　Ａｎａｌ、Ｂｉｏｃ ｈｅｍ、　１１４：１９３−１９７（１９８１）　、得られた２末鎖ｃＤＮＡを 、フランキングＳＰ６及びＴ７プロモータにハイブリダイズするプライマと共に 、５ｅｑｕｅｎａｓｅ　＠キット（バージョン２．０．　Ｕｎｉｔｅｄ　５ｔａ ｔｅｓ　Ｂｉｏｃｈｅａ＋１ｃａｌ、　Ｃ１ｅｖｅｌａｎｄ。 ＯＨ）を用いて配列決定した。配列決定が進むにつれて、インサートの２０−＋ ｍｅｒ３　’オリゴヌクレオチドを表わす新しいプライマを合成し、ヒトすい島 ＧＡＤｃＤＮＡインサートの全配列を得るために用いた。ライスコンシン大学遺 伝学コンピュータグループの配列解析ソフトウェアパッケージを用いて、ヌクレ オチド配列を解析した（Ｄｅｖｅｒｅｕｘ　＋Ｎｕｃ、Ａｃ１ｄｓ、Ｒｅｓ、　 １２：３８７−３９６．　（１９８４）　、本書中に参考として内含）全長クロ ーンを得るため、ＰＣＢ−１？ＡＣＥプロトコルの一変形態様（Ｆｒｏｈ稍ａｎ 　ｅｔ　ａｌ、、　Ｐｒｏｃ　Ｎａｔｌ、Ａｃａｄ、Ｓｃｉ　ＵＳ＾８５：８９ ９Ｂ−９００２，４９８８）を用いて２つのクローンの５　’　ｃＤＮＡ末端を 延長した。　ＣＡＤクローンの５′末端近くの領域に相補的でかつＥｃｏＲＩ制 限部位を伴うアダプタ配列を含むオリゴヌクレオチドプライマ（ＺＣ３６１４， ＺＣ３６２３、表２）を、すい島細胞ポリ（Ａ）　’　ＲＮＡのアリコートでア ニールした。延長に続いて、生成物をｄＧＴＰを用い末端デオキシヌクレオチシ ルトランスフェラーゼでティリングし、ＣＡＤについて富化されているものの内 部プライマの非特異的対合のためなおも不均質であるｃＤＮＡ集団を生成するべ く第２の鎖の合成時点で、ＥｃｏＲＩアダプタを伴うポリーｄＣＴＰプライマ（ ＺＣ２４８８、表２）を用いた。第２段階として、内部プライマから上流の領域 （ＺＣ３６１４の上流のＺＣ３７４６又はＺＣ３６２３の上流のＺＣ３７４５； 表２）に相補的な第２のオリゴヌクレオチドを用いて負鎖をプライミングし、一 方ＥｃｏＲＩアダプタ（ＺＣ２６３３；表２）に相補的なプライマを用いて玉鎖 をプライミングした。ＰＣＲ増幅はＣＡＤ配列のさらなる富化を生じさせた。　 Ｇｅｎｅ　Ａ＋ｎｐ　ＰＣＲキット（Ｐｅｒｋｉｎ−ＥｌｍｅｒＣｅｔｕｓ−Ｎ ｏｒｗａｌｋ＋　ＣＴ）を用いて、反応を１分間９４°Ｃで変性させるべく４０ 回循環させ、２分間５０°Ｃで又２分間７２°Ｃで循環させた。得られた生成物 をアガロースゲル上で電気泳動させ、ＣＡＤ配列を溶出させ、ＥｃｏＲＩで消化 し、ベクターｐｔｌｃ１９へとクローニングした。 表２ ５　’　−ＡＡＡＴＧＡＧＡＡＴＴＣＡＣＡＣＧＣＣＧＧＣＡＧＣＡＧＧＴＧ− ３’　ＺＣ３６１４５’　−ＡＡＧＧＡＡＴＴＣＡＡＧＴＴＧＡＴＴＧＡＡＧＴ ＡＴＣＴ−３’　ＺＣ３６２３５’　−ＧＧＣＧＡＡＴＴＣＧＣＡＴＡＴＴＴＴ ＡＧＡＧＴＴＧＴＴＴＧＧ−３’　ＺＣ３７４５５’　−ＧＧＣＧＡＡＴＴＣＧ ＧＡＧＣＡＧＣＴＧＣＡＧＧＧＣＴＴＣＴＧ−３’　ＺＣ３７４６５’　−ＡＧ ＧＧＡＧＡＣＣＧＧＡＡＴＴＣＧＡＣＴＣＧＡＧＴＣＧＡＣＡＴＣＧＡＴＣＡＩ 、−３’　ＺＣ２６３３５’　−ＧＡＣＴＣＧＡＧＴＣＧＡＣＡＴＣＧＡＴＣＡ ＧＣＣＣＣＣＣＣＣＣＣ−３’　ＺＣ２４８８ｐｌｔｃ１９内に挿入されたＣＡ Ｄ配列の５′末端を含む２本鎖プラスミドを、表３のプライマを用いてライブラ リから最初に単離された陽性クローンと同じ要領で配列決定した。 表３ ５　’　−ＧＧＣＧＡＴＴＡＡＧＴＴＧＧＧＴＡＡ−３’５　’　−ＴＡＡＣＡ ＡＴＴＴＣＡＣＡＣＡＧＧ−３’ヒトすい島細胞ＧＡＤｃＤＮ＾の配列全てが図 ２に示されている。これは、２つの重複するｃＤＮＡクローン、ｐＨｌＧ１１と ｐ）ｌＩＧｌ、９　、及び５つのＲＡＬＥ反応産物ＲＡＣＥ２０．２８Ａ、　４ ７Ａ、　４１及び４２（図１）の複合物を組み立てることによって決定された。 ２つのｃＤＮＡクローンは１１０ｂｐだけ重複し、５つのＲＡＣＥ配列は３′末 端で１４０のヌクレオチドによりρ旧６１．９と重複するよう設計された（図１ 　）　、　ｐＨｌＧ１．９クローンは１９００ｂｐを含み、アミノ酸３９４−３ ９９でのビリドキサル５′−リン酸塩結合部位（Ｐｒｏ−旧ｓ−Ｌｙｓ−Ｍｅｔ −Ｍｅｔ−Ｇｌｙ）　、Ｃ末端Ｌｅｕコドンの後の停止コドン及び３′末端のポ リＡ配列より１７ヌクレオチド上流のボリアデー　／Ｌ、化部位（ＡＡＡＴＡＡ Ａ）をコードする（図２　）　、　ｐ［Ｇ１１は、ｃＤＮＡ配列の５′末端を予 想されたＮ末ｉＭｅｔから２５０ｂｐ上流まで延長した、　ｐＨｌＧ１．１は、 異状にスプライシングされたＲＮＡからのクローニンゲインドロンとして１つの イントロンを含んでいる。 ヒトすい島ＧＡＤｃＤＮ＾ヌクレオチド配列は、ラット、ネコ及びマウスの脳Ｇ ＡＤｃＤＮＡ配列に対しわずか約７０％の全体的相同性しかもたないが、一方脳 の配列はこれら３つの間で約９１％の相同性を示した。 ヒトすい島ＧＡＤとネコ、ラット及びマウスの脳配列のＣＡＤの間の予想された アミノ酸配列の相同性は、約７６％であり、ここでも又脳ＣＡＤアミノ酸配列の 間で見られた約９８％以上の相同性と好対照をなしている。ヒトのこう丸の６８ のアミノ酸５′−末端に対するヒトすい島配列の５′−末端の比較（Ｐｅｒｒｓ ｏｎ　ｅｔ　ａｌ、、　Ｍｏ１．Ｃｅ１１．Ｂｉｏｌ、　１０：４７０１−４７ １１（１９９０））は１５のアミノ酸位置での相異を示し、゛一方ヒトこう丸配 列とラット脳ＣＡＤの間ではわずか２つのアミノ酸置換しか見られなかった。 ヒトすい島ＧＡＤ−次構造のヒトロバシープロットは、ラット及びネコの脳ＣＡ Ｄに比べた場合疎水性が増大している領域を示した（図３）、Ｎ末端差異以外に 、アミノ酸位置１６５−１９５の配列は特に異なっていた。ヒトロバシープロッ ト分析は、ヒトすい島ＧＡＤがラットやマウスの脳Ｇ　Ａ　Ｄ配列とは全く異な る特徴を有することを示唆している。 例■ ヒトすい２　び汎色　の６所 正常なヒトすい島ならびに異なるインビトロ培養されたベータ細胞系内でのヒト すい島ＧＡＤｍＲＮＡ発現を検出するため、ノーザンブロノト分析を用いた。低 い継代数のう７　）　（ＲＩＮ−５ＡＨ−８）　、マウス（ＮＩＴ細胞）及びハ ムスター（ＨＩＴ）の細胞からのベータ細胞系を、１５０ｃｎ”入り組織培養フ ラスコ内で１０％（ｖ／ｖ　）の熱不活性化したウシ胎児血清、２０ｍｍｏｌ／ 　ｌの）Ｉｅｐｅｓ　、２ａ＋ａ＋ｏｌ／　ｌのＬ−グルタミン、２４ｓ−ｏ１ ／１のＮａＨＣＯ，，１００ｕ／ｍｌのペニシリン及び１００μｇ／ｍｌのスト レプトマイシン（ＲＰＭＩ培地）で補足されたＲＰＭ１１６４０培地の中で３７ °Ｃで培養したａ　１ｃｍ”あたり２３Ｘ１０’の細胞の密度で標準的要領でプ レートされた細胞を用いて結果を得た。培養を確立できるように３日間放置した 後、培地を新しくした。０日日と呼ばれるこの時点で、細胞密度は約ｌＸｌ０’ 細胞／ｃｍ”であった０次の４日間（１日日〜４日目）にわたり、細胞をノーダ ンプロット法によりＣＡＤ遺伝子発現の分析のために収集した。５分間３７°Ｃ で０．２５％（ｗ／ｖ）のトリプシン（ＧＩＢＣＯＢＲＬ、　Ｇａｉｔｈｅｒｓ ｂｕｒｇ、　ＭＤ）及びｌ）ｍｏｌ／１のＥＤＴＡを補足したアール培地の中で インキュベートすることにより、Ｃａ２″−及びＭｇＺ−一を含まないアール培 地中での洗浄の後、細胞を離脱させた。離脱後、細胞を洗浄し、前記例Ｉに記さ れているようなｍＲＮＡ単離のため直ちに溶解させた。 ノーザンプロット分析は次のように行なった。Ａ１゜で見積った約５μｇのポリ Ａ″ＲＮＡを２分間９５°Ｃまで加熱し、１％のアガロースホルムアルデヒドゲ ル電気泳動により分離した０分離の後、２０分間１０Ｘク工ン酸ナトリウム食塩 水緩衝液（ＳＳＣ）内で２回アガロースゲルを洗浄し、ＲＮＡをニトロセルロー スフィルタ（Ｓｃｈｅｉｃｈｅｒ　＆　５ｃｈｕｅｌｌ。 Ｉｎｃ、、　Ｋｅｅｎｅ、　ＮＨ）上で一晩プロットし、フィルターを記述通り ８０°Ｃで２時間焼成した（Ｄａｒｒｔｓ　ｅｔ　ａｌ、、　Ｂａ５ｉｃ　Ｍｅ ｔｈｏｄｓ　Ｍｏ１ｅｃ、Ｂｉｏｌ。 Ｅｌｓｅｖｉｅｒ、　Ａｍｓｔｅｒｄａｍ＋　１９８６）。上述のようなｃＤＮ Ａ又はオリゴヌクレオチドプローブを、メーカーが提供する指示事項に従ってニ ックトランスレーション（Ｇ　ＩＢＣＯＢＲＬ）の後に用いた。４２°Ｃでの４ 時間の予備ハイブリダイゼーションの後、約１０’ＣＰＭ／ｍｌで一本積プロー プを含む新鮮なハイブリダイゼーション緩衝液をフィルターに付加し、記述され ているとおり（Ｄａｒｒｉｓ　ｅｔ　ａｌ、同書）−晩４２℃でハイブリダイゼ ーションに付した。０．１％のＳＤＳを含む２ｘｓｓｃ中で室温で２０分間３回 、そして４２°Ｃで０，１％のＳＤＳを含む２ＸＳＳＣ中で２０分間２回フィル ターを洗浄してから、Ｘ線フィルム（Ｘ−ｏｍａｔ　ＸＡＲ＋　Ｅａｓｔｍａｎ Ｋｏｄａｋ、　Ｒｏｃｈｅｓｔｅｒ＋　ＮＹ）に暴露した。再度プロービングす る前に、フィルターを９５°Ｃで０．１％ＳＤＳ　、０．２　Ｘ５ＳＣ中で５分 間３回洗浄した。 ノーザンブロント分析は、イヌ及びラットのすい島ならびにイヌ、サル及びラッ トの脳から分離されたポリＡ′″Ｉ？ＮＡ内での顕著な５．７ｋｂの転写物を明 らかにした。ヒトすい島ＧＡＤの発現は、ＲＩＮ−５＾Ｈ細胞、ＡＬ−３４＃ｉ Ｂ胞、ラットの肝臓、筋肉、こう丸及び腎臓の中で検出されなかった。ラットの 脳ＧＡＤｃＤＮＡを代表するプローブでのノーザンブロノトは、イヌ及びラット の脳のみならずＩ？ＩＮ細胞内で３．７ｋｂの転写物を明らかにした。　５．６ ｋｂの転写物に対する交叉ハイブリダイゼーションは全く検出されなかった。 ＩＤＤＭにかかった患者の細胞から及び健康な人からのゲノムＤＮ＾を、ヒトす い島ＧＡＤｃＤＮＡを用いてサザンプロノト法においてプローブした。ゲノムＤ Ｎ＾（２０μｇ）を異なる制限酵素で消化し、それに続いてアガロースゲル上で 電気泳動分離に付した。ヒトすい島ＧＡＤｃＤＮ＾プローブで得られたパターン は、ラットの脳ＧＡＤｃＤＮ＾プローブで得られたものと明らかに異なっており 、フラグメントパターンが異なる遺伝子により生成されたことを示唆していた。 例■ 銃り皇旦五豆Ω坦班 ｐＥＸ９を構築するためＧＡＤｃＤＮ＾をヘクターｐｃＤＮＡ　ＩＩ　（Ｉｎｖ ｉ　ｔｒｏｇｅｎ。 Ｓａｎ　Ｄｉｅｇｏ、　ＣＡ）内に挿入し、インビトロで転写した。反応混合物 は、２０μｌの５ＸＳＰ６転写緩衝液（ＧＩＢＣＯＢＲＬ）；１０μｌの１００ ｍＭ　ＤＴＴ；１００単位のＲＮＡ　シン；７．５μｍの２．５ｍＭ　ＡＴＰ、 　ＣＴＰ及びＵＴＰ各々；２．５μｌのｌｄ　ＧＴＰ；　５　ｕ　］の５　ｍＭ 　ｍ７Ｇ　ｐｐｐＧ（ｃａｐ類似体）；２μｇの線状化ｐＥＸ９ＤＮＡ　；　２ μｍのＳＰ６ボリメラーゼ（ＧＩＢＣＯＢＲＬ）及び精製水を最終体積１００μ ｌとなるよう組合わせることによって調製した０反応混合物は、３７°Ｃで９０ 分間インキュベートした。混合物をフェノール−クロロホルム−イソアミルアル コールで抽出し、次にエタノールで沈降させた。１＋＊ｇ／ｌｌの最終濃度まで 精製水内にてＲＮＡペレットを再懸濁させた。 得られた合成ｍＲＮＡをウサギ網状赤血球リゼイト系内で３８３−メチオニンを 用いてインビトロ翻訳に付した。不工旦上旦翻訳（ＩＶＴ）反応混合物は、３５ μｍのヌクレアーゼ処理されたウサギ赤血球リゼイ）　（Ｐｒｏ＋ｎｅｇａ、　 Ｍａｄｉｓｏｎ＋　Ｗｌ）、５０単位のＲＮＡ　シン、１μｍのアミノ酸混合（ −Ｎｅｔ）、１μｌの濃度１５０Ｃｉ　／ｍｍｏｌ及び５０翰Ｃｉ　７’＋１で の３ＳＳ−メチオニン及び精製水を４８μＩの体積になるまで含んだ。上述のと おりに調製したＳＰＡ　ＲＮＡを１０分間６７°Ｃで変性し、次に氷上に置いた 。ＴＶＴ反応混合物に対し２μｌの最終体積中１ミリグラムの変性５Ｐ６ＲＮＡ を付加した０反応混合物を９０分間３０°Ｃでインキュベートした。 Ｓａｍｂｒｏｏｋ　ｅｔ　ａｌ、（前掲）が記述しているように、取込み百分率 を計算するため、２マイクロリツトルの反応（混合物？）をＴＣＡで沈降ＧＡＤ 自己抗体の存在について血清をスクリーニングするべく、標識づけされた合成タ ンパク質を用いた。タンパク質入−セファロース免疫沈降は、１０人の新たに診 断されたＩＤＤＭ小児患者からの血清が、２２人の健康な対照において２．３± ０．５％（ｐ　＜０．００１）であるのに比べて、１１．６±２．９％（平均± ＳＥＭ）の合計放射能を沈降させることを示した。ゲル電気泳動及びオートラジ オグラフィは、健康な対照が陰性であり続けたのに対し８／１０の１００Ｍ血清 がインビトロ−合成タンパク質を沈降させることを明らかにした。１００Ｍ血清 での特異的免疫沈降は、主要な自己エピトープが発生期のポリペプチド上に存在 する可能性があり、無傷細胞による翻訳後修飾を必要としないということを示し ている。 類似の実験において、インビトロ−合成された１ｓ３−メチオニン−標識付けさ れたＣＡＤを、遊離リガンドから結合された状態で分離するべきタンパク’ＩＡ −セファロースを用いた一晩の放射リガンド結合検定法において使用した。　１ ５０ｍＭのＮａＣｌ、　２０ｓ＋ＭのトリスｐＨ１，４，１％のトリトンＸ　− １００，０，１％のアプロチニン及び１０ｍＭのベンザミジンを用いてＩＭＦ緩 衝液を調製した。　１５０ｍＭのＮａＣ１に置換させた４００ｍＭのＮａＣ１を 用いて高塩分ＩＭＰ　！ｌ衝液を調製した。　０．５９１のエンビトロ翻訳した ＣＡＤと２μｌの血清に対して４７．５マイクロリツトルのＩＭＰ緩衝液を付加 した。４℃で一晩回転することによって混合物をインキュベートした。タンパク 質入−セファロースをＩＭＦ緩衝液で予め洗浄し、５０μｍ／管の割合で管内に アリコートした。管を４°Ｃで一時間回転させた。次に４００μｌのＩＭＰ緩衝 液で３回、４００μｍの高塩分ＩＭＦ緩衝液で１回そして４００μｌのＩＭＰ緩 衝液で１回、タンパク質入−セファロースを洗浄した。染料を全く含まないｌＸ ５ＤＳの試料緩衝液１００マイクロリツトルを容管に付加し、混合物を１０分間 沸とうさせた。上清を除去し、４ｍｌのシンチレーション流体に付加し、計数し た。ＣＡＤ抗体−正（ＩＣＡ標準化のための若年性糖尿病基金の血清）及び負の 対照血清が各検定に含み入れられ、６４に指標として自己抗体レベルを表現した 。６４に指標は以下のように定義づけされる。 平均ｃｐｍ　（試料）−平均ｃｐｍ（負の対照）平均ｃｐｓ　（正の対照）−平 均ｃｐｍ　（負の対照）２連測定の検定内変動係数は１０．５％であった。３８ 人の０才〜１５才の対照において６４に指標は−０，０３１±０．００７（平均 ±ＳＥＭ）であった。 ６２人の新たに発症した０才〜１５才のＩＤＤＭ患者においては、６４に指標は ０．４８±０．０８２であった。１：２５の希釈で、Ｉ　００Ｍ血清は、対照に おいて１．９±０．１％（ｐ　＜０．００１）であったのに比べて、合計リガン ド放射能の１１．７±１．６％を沈降した。正常の上方レベルとして０．０３の ６４に指標を用いて、ＩＤＤＭ患者の４８／６２　（７７％）に比較して、いが なる対照も（０／３Ｂ）陽性でなかった。　ＩＤＤ？ｌにおける６４に指標はＩ ＣＡのレベル（ｒ、　−０，５８；　ｐ　＜０．００１）に相関していた。従っ て、合成ヒトすい島ＧＡＤに対する自己抗体は、放射リガンド検定において精確 に検出でき、小児における新たに妙断されたＩＤＤＭと密に関連づけされる。 例■ Ｕ販匣虹皇光咀 ヒトすい島ＧＡＤｃＤＮＡの発現には、２の重複するクローンｐＨｌＧ１１及ヒ ｐＨｌＧ１．９が単一の全長クローンの形に組立てられることが必要であった。 クローンｐ）ＩＩＧＩＩのオープンリーディングフレームからの５′配列を、ポ リメラーゼ連鎖反応を用いて分離した。オリゴヌクレオチドが合成され、従って １つのプライマの５′末端はＡＴＧ開始コドンに位置づけされ、以下の配列を含 んでいた。 ５　’　ＣＣＡ　ＧＴＣＴＧＡ　ＡＴＴ　ＣＡＣＣＡＴ　ＧＣＴ　ＡＧＣＣＣＡ 　ＧＧＣＴＣＣＧＧＡ　Ｔ３’３′オリゴヌクレオチドプライマは、開始コドン より４８２ヌクレオチド下流のＮｓｉ　１部位で始まり、以下の配列を含んでい た。 ５　’　ＴＴＴ　ＴＡＧ　ＡＧＡ　ＡＧＣ丁ＴＧ　ＧＣＡ　ＡＴＧ　ＣＡＴ　Ｃ ＡＡ　ＡＡＴ　ＴＴＣＣＴＣＣ３’ＥｃｏＲＩ　（５’　）及び旧ｎｄＩ［［（ ３’）制限部位で消化により０．５ｋｂのＤＮ＾フラグメントを単離し、このフ ラグメントは配列分析の後圧しいサイズであることがわかった。ＥｃｏＲ１部位 は、合成オリゴヌクレオチド５′＾ＴＴ　ＧＧＡ　ＴＣＣ３’を用いてＢａａｌ ｌ（１部位に変化させた。 得られた０、５ｋｂ　ＤＮＡフラグメントを次にＢａ＋ａＨＩ　（５’　）及び Ｎａｉ　１（３′）制限部位を用いて単離した。 ＧＡＤｃＤＮＡの残りのＤＮＡ配列をｐＨｌＧ１．９と呼ばれるクローンから２ つのｃＤＮＡフラグメントとして単離した。制限酵素Ｎｓｉ　Ｉ　（５’　）及 びＢｇｌ　Ｕ　（３’　）を用いて、内部ＤＮＡフラグメントを単離した。得ら れたフラグメントは０．６ｋｂであることがわかった。ＧＡＤｃＤＮＡ配列の３ ′末端と、制限酵素ＢｇＩ　ｎ　（５’　）及びＸｂａ［（３’）でのクローン ｐＨｌＧ１．９の消化により単離し、得られたフラグメントは０．７２ｋｂであ ることがわかった。 発現プラスミドは、５　’　ＢａｍＨｌ　−Ｎｓｉ　ｌフラグメント、内部Ｎｓ ｉ１−Ｂｇｌｌｌフラグメント、３’　Ｂｇｌ　ＩＩ　Ｘｂａ　ｌフラグメント 及び発現ベクターＺｅｍ　２１９ｂを含んだ４部分連結反応がら作られた。 ベクターＺｅｍ　２１９ｂは、以下の要領で構築した。すなわち、プラスミドｐ ｌｃ１９Ｒ（Ｍａｒｓｈ　ｅｔ　ａｌ、、　７伝ｊ−Ｌ３２：４８１−４８６（ １９８４））　をＳｅａ　［及び旧ｎｄＩｆｆで消化した。次に、？−／ブ位２ ２７０（Ｐｖｕ　ｎ　）がら位ＩＦ５１７１（）ｆｉｎｄ　Ｉ［［）までのＳＶ ４０のｏｒｉ領域を、線形化ｐＩｃ１９Ｒに連結してプラスミドＺｅｍ６７を生 成せしめた。次に、このプラスミドをＢｇｌ　Ｕで開裂し、ヒト成長ホルモン遺 伝子（Ｄｅ　Ｎｏｔｏ　ｅｔ　ａｌ、、　Ｎｕｃ。 Ａｃ１ｄｓ　Ｒｅｓ、　９；３７１９−３７３０（１９８０））からのターミネ ータ領域をＢｇｌ　ｌｌ−Ｂａ＋＊ＨＩフラグメントとして挿入してプラスミド Ｚｅｓ＋８６を生成せしめた。　Ｂａ５ｎＨＩ及びＸｈｏ　［ｔでの消化により 、合成されたヒトプラスミノーゲン賦活物質（ｔ　−ＰＡ）　ｐｒｅ−ｐｒｏ配 列を、ＢａｍＨＩ及びＸｈｏ　Ｉｆでの消化により単離した。このフラグメント をＢｇｌ　ＩＩ消化されたＺｅｔｍ８６内に挿入してプラスミドＺｅｍ８Ｂを生 成せしめた。ＢｇＩ　ｎ及びＢａｍＨＩを用いてプラスミドｐＤＲ１２９６（Ａ ＴＣＣ５３３４７）を消化し、ｔ　ＰＡ　ｃＤＮＡフラグメントを単離して、Ｂ ｇｌ　Ｕ−切断されたＺｅＩ１１８８内に挿入した。 得られたプラスミドをＺｅｍ９４と呼称した。次に、ＭＴ−１プロモータ、完全 ｔ−ＰＡコーディング配列及びヒト成長ホルモン（ｈＧ）Ｉ）ターミネータを含 むベクターＺｅｍ９９を組立てた。ＭＴ−１プロモータを含むＫｐｎ　Ｉ　Ｂａ ＋＊ＨＩフラグメントを門ＴｈＧＨ１１Ｌから単離しくＰａ１ｓ＋１ｔｅｒ　ｅ ｔａｌ、、　５ｃｉｅｎｃｅ　２２２：８０９−８１４（１９８３））　、ｐＬ ｌｃ１８内に挿入してＺｅｍ９３を構築した。ｐＢＲ３２２誘導体ｐＢ　Ｘ　３ ２２内にＭＴ−１及びｈＧＨ配列を含むプラスミドＥＶ１４２（Ｐａｌｍｉｔｅ ｒ　ｅｔ　ａｌ、、同書）をＥｃｏＲＩで消化し、ｌ’１Ｔ−１プロモータ及び ｈＧＩ（ターミネータ配列を含むフラグメントを単離した。このフラグメントを ＥｃｏＲＩ−消化されたｐＵｃ１３の形にクローニングしてプラスミドＺｅｍ４ を構築した。次にＢａｌ　ＩＩ及びＳａｌ　Ｉ［での消化によりＺｅａ＋９３を 線状化し、ｈＧＨターミネータを精製した。 Ｓａｕ　３Ａフラグメントとしてｐ［Ｉｃ８ベクターからｔ　−ＰＡ　ｐｒｅ− ｐｒｏ配列を除去した。３つのＤＮＡフラグメントを次に接合してプラスミドＺ ｅｍ９７を生成せしめた。Ｚｅｍ９７をＢａｌ　Ｉｆで切断し、ｐＤＲ１２９６ からのＢｇｌ　ＩＩ−ＢａｍＨＩ　ｔ−ＰＡｌフラグメント挿入した。得られた ベクターをＺｅｍ９９と呼称した。プラスミドｐＳＶ２−ＤＨＰＲ（Ｓｕｂｒａ ａ＋ａｎｉ　ｅｔ　ａｌ、＋　同書）をＣｆｏ　Ｉで消化し、ＤＨＦＲｃＤＮＡ 及び３′付着されたＳＶ４０配列を含むフラグメントを単離し、修復し、Ｂａｓ ＋ＨＩリンカ−に連結した。　ＢａｅａＨＩでの消化の後、全ｃＤＮ＾及びＳＶ ４０ターミネータ領域を含むおよそ５ｏｏｂｐのフラグメントを精製し、Ｂａｍ ＨＩで消化されたｐｔｌｃ８に連結した。 Ｚｅｍ６７をＢｇｌ　ＩＩで消化し、Ｂａｅ＋ＨＩ　ＤＨＦＲ−３Ｖ４０フラグ メントと連結してプラスミドＺｅｍ１７６を生成した。プラスミドＺｅ＋＊９３ を５ｓｔ−１で消化し再度連結してプラスミノーゲン０６を生成し、この中でＭ Ｔ−１プロモータに対し５′の配列的６００ｂｐを削除した。プラスミドＺｅｍ １０６をＥｃｏＲＩで消化し、プラスミドＺｅｍ１７６からの［１）ＩＦＲ遺伝 子を含むＥｃｏＲｌフラグメントに連結した。結果として得られたプラスミドを ｚｔｓ１３と呼称した。プラスミドＺｔｓ１３をＢａｅａＨＩで消化し、全ｔ　 −ＰＡココ−ィング領域とｈＧＩ（ターミネータ配列を含むプラスミドＺｅｍ９ ９からのＢａｍＨ［フラグメントに連結した。得られたプラスミドをＺｔｓ１５ と呼称した。　Ｚｔｓ１５を、ＢａｍＨＩで部分的に消化し、修復し再度連結さ せてプラスミドＺｅｍ２１９を生成し、この中で３　’　Ｂａ＋ｍＨ１部位を破 壊した。 プラスミドＺｅｍ２１９’をＸｂａ　Ｉで部分的に消化し、修復し、再度連結さ せてプラスミドＺｅｓ２１９ａを生成し、この中でｈＧＨターミネータに対する ３’Ｘｂａ１部位を破壊した。Ｂａｇ）ＩＩ及びＸｂａ　Ｉでそのベクターを消 化し、ｔ−ＰＡ配列を除去し、ＢａｍＨＩ　Ｘｂａ　Ｉアダプタでベクター、フ ラグメントを連結することにより、Ｚｅｓ２１９ａからＺｅ＋＊２１９ｂを誘導 した。＾＠ｅｒｉｃａｎ　Ｔｙｐｅ　Ｃｕ１ｔｕｒｅ　Ｃｏ１１ｅｃｔｉｏｎ、 　Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ、　ＭＤ、に、Ｅ、　ｃｏｌｉ　ＸＬＩ−青形質転換体と してＺｅｍ２１９ｂを寄託した。 ＧＡＤｃＤＮＡの発現は、リン酸カルシウム方法（νａｎ　ｄｅｒ　Ｅｂ、＋　 前掲）を用いたｔｋ’　ｔｓ　１３　ＢＨＫ細胞系（＾ＴＣＣＣＲＬ　１６３２ ）のトランスフェクションにより達成された。　４００ｎＨのメトトレキセート を含む培地を用いてトランスフェクシントを選択した。免疫細胞化学を用いてヒ トＣＡＤタンパク質の産生について、トランスフェクシントを試験した。免疫反 応性を試験するため、２つの抗体を使用した（Ｍｉｃｈｅｌｓｅｎｅｔ　ａｔ、 、　Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、＾ｃａｄ、Ｓｃｉ、　ＵＳＡ　８８：８７５４−８ ７５８（１９９１））、　１２６６と呼ばれる第１の抗体は、次の合成Ｃ末端配 列で免疫化されたウサギの体内で生しさせた： Ｔｈｒ−Ｇｌｎ−５ｅｒ−＾ｓｐ−１１ｅ−Ａｓｐ−Ｐｈｅ−Ｌｅｕ−１１ｅ− Ｇ　Ｉｕ−Ｇ　Ｉｕ−１１ｅ−Ｇ　Ｉｕ−Ａｒｇ−Ｌｅｕ−Ｇｌｙ−Ｇｌｎ−＾ ５ｌ）−Ｌｅｕ。 免疫螢光標識化のために使用される第２の抗体は、６＾Ｂ＾（１ｍｍｎｎｏｔｒ ＋ｃｈ。 ［ａｒｓｅｒｌｌｅ、　Ｆｒａｎｃｅ）に対して生じさせた。Ｃ末端抗血清１２ ６６及びＧＡＬＡに対する抗血清の免疫反応性の同時位置決定を試験するため、 トランスフェクションを受けたＢＩＩＫ細胞の固定された（１％のバラホルムア ルデヒド、中性）単層上で、２色２重免疫螢光標識を行なった。−次抗体を検出 するため、Ｔｅｘａｓ　Ｒｅｄ−ヤギ抗ウサギＩｇＧ（１：１００の希釈溶液： ＾ｗｅｌｌ（Ｗｅｓｔｂｕｒｙ、　ＮＹ））を用いた。これらの検定は、ヒトＧ ＡＤｃＤＮ＾でのトランスフェクションを受けたＢＨＫ細胞が免疫反応性材料を 発見したのに対し、ＧＡＤｃｌｌＮＡ無しの宿主細胞が反応性を立証しなかった ということを示した。 ９．５　ＸＩＯ”のトランスフェクションを受けた細胞のコンフルエント培養物 から、組換え型ＣＡＤタンパク質を精製した。細胞を４分間室温で３５０Ｘｇで の遠心分離によりペレット化した。結果として得られた細胞ベレットを２０＋ｍ 　Ｉの５０ｍＭリン酸ナトリウム、１ｍＭのピリドキサル５′〜リン酸塩（ＰＬ Ｐ）　、１ｍＭのアミノーエチルーイソチオウロニウムー臭化物（ＡＥＴ）　、 １ｍＭのＥＤＴＡ、　０．０５％ｗ　／　ｖのアプロチニン、１％ｗ／ｖのトリ トンＸ　−１１４（ＴＸ−１１４）　ｐＨ８，０（ＩＩ衝液Ａ）の中で均質化さ せ、穏やかに１時間、４°Ｃで３０分、振とうした。ひとたび懸濁状態になると 、混合物を１００ＯＯＯＸ　ｇで４°Ｃで３０分間遠心分離した。２０ｍ１の６ ％（Ｗ／Ｖ）スクロースの上に２０ミリリツトルの上清を注ぎ込み、混合物を３ 分間３０°Ｃまで加熱した。インキュベーションの後、混合物を５分間３２９０ Ｘｇで遠心分離した。０．５％ｗ／ｖのＴＸ−１１４を付加することにより前述 のとおり水相を抽出し、前に使用したのと同しスクロース分画に適用した。　Ｔ Ｘ−１１４無しの９ｍｌの緩衝液Ａを１ｍｌの洗浄剤相に付加した。　１．ＯＸ ｌ、６　ｃ＋ａのＧＡＤ−１−セファロースアフィニティ力ラムに対し、ｌＯａ ＋１の希釈されたＴＸ−１１４洗浄剤相を適用した。ＧＡＯ−１は、ヒトＧＡｒ Ｊタンパク質に対するモノクローナル抗体である。カラムを４０ｍ１の緩衝液Ａ で洗浄した０合計３回、カラムに対して試料を通用した。最後の適用の後、カラ ムを７０ｍ１の５０ｍＭリン酸ナトリウム、１１ＩＩＭのＰＬ、Ｐ、ｌ＋ａＭの ＡＥＴ　、　０．０５％のアプロチニン及び１％のｗ　／　ｖ　ｎ−オクチルグ ルコシドｐ）１８．０（緩衝液Ｂ）で洗浄した。　ＣＡＤを５０＋ｍＭのＮＨａ ＨＣＯ＊　、１％ｗ　／　ｖのｎ−オクチルグルコシド、１ｍＭＰＬＰ及び１　 ｍＭ　ＡＦＴ　ｐＨ９，５で溶出させ、５００　μｌの分画の形で収集した。各 分画に５００マイクロリンドルの５０ａ＋Ｍリン酸ナトリウムｐｉ（７，０を加 えた。カラムを緩衝液Ｂの中で洗浄し、ＰＢＳ及び０．０２％ＮａＮ３の中で保 管した。最初の１０分画の１０マイクロリツトルのアリコートを、１［１−５Ｏ Ｓポリアクリルアミドゲル電気泳動を用いて分析した。ヒｌ−ＣＡＤタンパク質 のＣ末端に対して育成されたポリクローナル抗体を用いて、ウェスタン分析を行 なった。さらに、クーマシーブリリアントブルーでゲルを染色し、Ｍｕ　（Ｍｅ ｔｈｏｄｓ　ｉｎ江狂肌圏■（酵素学方法）　１１３：３−１０（１９８５）） に記されているように酵素活性を測定した。ブール４−１４を組合せ、合計タン パク質収量を２７μｇ又は２７μｇ／　１０’ＢＨＫ細胞となるよう計算した。 タンパク質純度は、２Ｄ−ＰＡＧＥ分析を用いて評価し、これは６４ｋＤで主要 なバンドを示した。 前述のことから、分離され精製されたヒトすい島細胞ＣＡＤヌクレオチド配列及 び組換え型ヒトすい島ＧＡＤポリペプチドが提供される。 これらの結果は、なかんずく、インシュリン依存性糖尿病患者又は無症状の疾患 をもつ人からの血清中のＭｒ６４０００自己抗原に対する自己抗体を検出するた めの再現可能なシステムを提供する。インサイ上王ですい島細胞配列を検出する ためのオリゴヌクレオチドプローブも、ヒトすい島ＧＡＤ抗原に対する自己免疫 応答に関連する疾患を予防又は軽減するための治療的アプローチと同様、本発明 を用いて提供される。 上述の発明は、明確に理解できるよう図や例を用いて幾分か詳細に説明してきた が、添付のクレームの範囲内で成る種の変更や修正を行なうことができるという ことは明らかである。 １９　１５　２Ｃ５ ２５兇　３５ 物　４５５０ ５５　ω　６５７θ ７５　８９　８Ｓ ％　９５　１鈴 １０５　１１（１！ｌ　１１５ １５５１（イ）　１６５ ２％　２９５　２１０ ２１５　２２の　２２５　２３０ ２３５２翅　２４５ ２５０　２５５　２印 ２６５　２７の　２７５ ２８０２８５　２％ ３１５　３２の　３２５ ３３０　３３５　末 ３４５　３晃　３５５ ３印　３６５　３７（１５ ３７５３８０３８５王ゆ ３９５　屯℃　４朽 ４４５　４４５　４ＣＩ２ ４５５　４印　４６５　４７９ ＦＩＧ、　２ｃ ４７５　４８Ｑｊ　４８５ ４９ｆｌｌｌ　４９５　ヌリ ５０５　５１ｔｌ！ｌ　５１５ ｓｚｏ　ｓｚｓ　ｓ３゜ ５３５５物　５４５　５５Ｇｌ１ ５７０　５７５　５ｇＧ５ ＦＩＧ、　２ｄ ＦＩＧ、　２ｅ １１．１Ａ−１ｉ−１−Ｎ−ＰｃＴ’ＵＳ　９２１０４０７９、　＋ムー＋−Ｐ ＣＴ／ＬＩＳ　９２１０４０７９フロントページの続き （５１）　Ｉｎｔ、Ｃ１，５識別記号　庁内整理番号ＧＯＩＮ　３３１５３　Ｙ 　８３１０−２Ｊ３３１５７３　Ａ　８３１０−２Ｊ ／／（Ｃ１２Ｎ　１／２１ Ｃ１２Ｒ１：１９） （Ｃ１２Ｎ　９１０４ Ｃ１２Ｒ１：１９） （８１）指定国　ＥＰ（ＡＴ、ＢＥ、ＣＨ，ＤＥ。 ＤＫ、ＥＳ、ＦＲ，ＧＢ、ＧＲ，ＩＴ、ＬＵ、ＭＣ，ＮＬ、ＳＥ）、０Ａ（ＢＦ 、ＢＪ、ＣＦ、ＣＧ、ＣＩ、ＣＭ、ＧＡ、ＧＮ、ＭＬ、ＭＲ，ＳＮ、ＴＤ、ＴＧ ）、ＡＴ、　ＡＵ、　ＢＢ、　ＢＧ、　ＢＲ，ＣＡ、　ＣＨ，Ｃ３，ＤＥ。 ＤＫ、　ＥＳ、　ＦＩ、　ＧＢ、　ＨＵ、ＪＰ、　ＫＰ、　ＫＲ，ＬＫ、　ＬＵ 、　ＭＧ、　ＭＮ、　ＭＷ、　ＮＬ、　Ｎｏ、　ＰＬ、　Ｒ○、　ＲＵ、　ＳＤ 、　５Ｅ （７２）発明者　ラーンマーク、エイフアメリカ合衆国、ワシントン　９８１０ ５．シアトル、　＃３０４．　ノースイースト　フォーティフィフス　ストリー ト　３９０２ （７２）発明者　カールセン、アレン　ニー。 デンマーク国、デーコー−２５００パルビー、アルホルムバイ　１５１チー　ベ 一Ｉ （７２）発明者　グラビン、キャサリン　イー。 アメリカ合衆国、ワシントン　９８１２２．シアトル、イースト　コロンビアス トリート（７２）発明者　ハゴビアン、ウィリアムアメリカ合衆国、ワシントン 　９８１０３．シアトル、ディトン　アベニュ　ノース （７２）発明者　オハラ、パトリック　ジェイ。 アメリカ合衆国、ワシントン　９８１０３．シアトル、ノース　シックスティフ ォースストリート　５１５ （７２）発明者　フォスター、ドナルド　シー。 アメリカ合衆国、ワシントン　９８１５５．シアトル、ノースイースト　ワンハ ンドレットエイティファースト　ストリート　３００２

Claims (25)

【特許請求の範囲】
1. １．ヒトのすい島グルタミン酸デカルボキシラーゼをコードする精製され分離さ れたポリヌクレオチド。
2. ２．ヌクレオチド３８からヌクレオチド１７９２までの図２のヌクレオチド配列 を含んで成る、請求項１に記載のポリヌクレオチド。
3. ３．図２のヒトすい島グルタミン酸デカルボキシラーゼ配列をコードする、請求 項１に記載のポリヌクレオチド。
4. ４．ｃＤＮＡである請求項１に記載のポリヌクレオチド。
5. ５．コードされるヒトすい島グルタミン酸デガルボキシラーゼが、生来のヒトす い島グルタミン酸デカルボキシラーゼに結合する抗体を結合できる、請求項１に 記載のポリヌクレオチド。
6. ６．作用可能に連結された下記要素： 転写プロモータ； ヒトすい島グルタミン酸デカルボキシラーゼポリペプチドをコードするＤＮＡ配 列；及び転写ターミネータを含んで成るヒトすい島グルタミン酸デカルボキシラ ーゼの発現のためのＤＮＡ構成体。
7. ７．請求項６のＤＮＡ構成体によりコードされるポリペプチド。
8. ８．前記配列によりコードされるヒトすい島グルタミン酸デカルボキシラーゼポ リペプチドが、γ−アミノブチル酸の合成の触媒として作用する、請求項６に記 載のＤＮＡ構成体。
9. ９．ヒトすい島グルタミン酸デカルボキシラーゼをコードするＤＮＡ配列がヌク レオチド３８からヌクレオチド１７９２までの図２の配列を実質的に含んで成る 、請求項６に記載のＤＮＡ構成体。
10. １０．ヒトすい島グルタミン酸デカルボキシラーゼをコードするＤＮＡ配列が図 ２のヒトすい島グルタミン酸デカルボキシラーゼ配列をコードする、請求項６に 記載のＤＮＡ構成体。
11. １１．請求項６に記載のＤＮＡ構成体で形質転換又はトランスフェクションされ た培養細胞。
12. １２．真核性細胞である、請求項１１に記載の培養細胞。
13. １３．酵母細胞又は哺乳動物細胞である、請求項１２に記載の真核性細胞。
14. １４．請求項６に記載のＤＮＡ構成体で形質転換又はトランスフェクションされ た真核細胞を培養する段階及び細胞からポリペプチドを分離する段階を含む、ヒ トすい島グルタミン酸デカルボキシラーゼポリペプチドの製造方法。
15. １５．形質転換された真核細胞が酵母細胞である、請求項１４に記載の方法。
16. １６．生物学試料内のヒトすい島細胞ＧＡＤに対する自己抗体の存在を決定する 方法において、 −免疫複合体形成へと導く条件の下でヒトすい島細胞ＧＡＤポリペプチドと生物 学試料を接触させ；そして −前記ＧＡＤポリペプチドとヒトすい島細胞ＧＡＤの間の免疫複合体形成の存在 を検出し、試料内のヒトすい島細胞ＧＡＤに対する自己抗体の存在をそれに基づ いて決定する； ことを含んで成る方法。
17. １７．ＧＡＤポリペプチドが固相に付着される、請求項１６に記載の方法。
18. １８．ＧＡＤポリペプチドが標識されている、請求項１６に記載の方法。
19. １９．前記免疫複合体が第２の抗体により検出される、請求項１６に記載の方法 。
20. ２０．前記検出段階が、酵素反応、螢光、発光又は放射線によるものである、請 求項１６に記載の方法。
21. ２１．生物学試料が血液、血漿、血清又は尿である、請求項１６に記載の方法。
22. ２２．図２のヒトすい島グルタミン酸デカルボキシラーゼＤＮＡ配列の配列に少 なくとも８５％相同である、少なくとも約１４個のヌクレオチドのオリゴヌクレ オチドを含むプローブ。
23. ２３．検出可能なシグナルを提供するため標識されている、請求項２２に記載の プローブ。
24. ２４．ヒトすい島細胞ＧＡＤ抗原に対する自己免疫応答について患者を治療する 方法において、 −患者の血漿から体外で、その抗体を特異的に結合する組換え型ヒトすい島細胞 ＧＡＤポリペプチドを含む免疫吸着剤を用いてヒトすい島細胞ＧＡＤ抗原に結合 する抗体をとり除く段階を含む方法。
25. ２５．ヒトすい島細胞ＧＡＤ抗原に対する自己免疫応答について患者を治療する 方法において、未成熟Ｔ又はＢ細胞上のヒトすい島細胞ＧＡＤレセプタを特異的 に結合する組換え型ヒトすい島細胞ＧＡＤポリペプチドを投与することにより患 者体内の免疫寛容を誘発する段階を含む方法。