JP2802634B2 - トランスカリオチック移植 - Google Patents

トランスカリオチック移植

Info

Publication number
JP2802634B2
JP2802634B2 JP63504046A JP50404688A JP2802634B2 JP 2802634 B2 JP2802634 B2 JP 2802634B2 JP 63504046 A JP63504046 A JP 63504046A JP 50404688 A JP50404688 A JP 50404688A JP 2802634 B2 JP2802634 B2 JP 2802634B2
Authority
JP
Japan
Prior art keywords
cells
gene
recipient
cell
composition according
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Expired - Lifetime
Application number
JP63504046A
Other languages
English (en)
Other versions
JPH02503265A (ja
Inventor
セルデン，リチャード・エフ
Original Assignee
ザ・ジェネラル・ホスピタル・コーポレーション
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by ザ・ジェネラル・ホスピタル・コーポレーション filed Critical ザ・ジェネラル・ホスピタル・コーポレーション
Publication of JPH02503265A publication Critical patent/JPH02503265A/ja
Application granted granted Critical
Publication of JP2802634B2 publication Critical patent/JP2802634B2/ja
Anticipated expiration legal-status Critical
Expired - Lifetime legal-status Critical Current

Links

Classifications

    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
    • A01K—ANIMAL HUSBANDRY; AVICULTURE; APICULTURE; PISCICULTURE; FISHING; REARING OR BREEDING ANIMALS, NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; NEW BREEDS OF ANIMALS
    • A01K67/00—Rearing or breeding animals, not otherwise provided for; New or modified breeds of animals
    • A01K67/027—New or modified breeds of vertebrates
    • A01K67/0275—Genetically modified vertebrates, e.g. transgenic
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
    • A01K—ANIMAL HUSBANDRY; AVICULTURE; APICULTURE; PISCICULTURE; FISHING; REARING OR BREEDING ANIMALS, NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; NEW BREEDS OF ANIMALS
    • A01K67/00—Rearing or breeding animals, not otherwise provided for; New or modified breeds of animals
    • A01K67/027—New or modified breeds of vertebrates
    • A01K67/0271—Chimeric vertebrates, e.g. comprising exogenous cells
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • A61K38/16—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • A61K38/17—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • A61K38/22—Hormones
    • A61K38/27—Growth hormone [GH], i.e. somatotropin
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • A61K38/16—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • A61K38/17—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • A61K38/22—Hormones
    • A61K38/28—Insulins
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K49/00—Preparations for testing in vivo
    • A61K49/0004—Screening or testing of compounds for diagnosis of disorders, assessment of conditions, e.g. renal clearance, gastric emptying, testing for diabetes, allergy, rheuma, pancreas functions
    • A61K49/0008—Screening agents using (non-human) animal models or transgenic animal models or chimeric hosts, e.g. Alzheimer disease animal model, transgenic model for heart failure
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K9/00—Medicinal preparations characterised by special physical form
    • A61K9/0012—Galenical forms characterised by the site of application
    • A61K9/0019—Injectable compositions; Intramuscular, intravenous, arterial, subcutaneous administration; Compositions to be administered through the skin in an invasive manner
    • A61K9/0024—Solid, semi-solid or solidifying implants, which are implanted or injected in body tissue
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/575—Hormones
    • C07K14/61—Growth hormone [GH], i.e. somatotropin
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/575—Hormones
    • C07K14/62—Insulins
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/26—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against hormones ; against hormone releasing or inhibiting factors
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
    • A01K—ANIMAL HUSBANDRY; AVICULTURE; APICULTURE; PISCICULTURE; FISHING; REARING OR BREEDING ANIMALS, NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; NEW BREEDS OF ANIMALS
    • A01K2217/00—Genetically modified animals
    • A01K2217/05—Animals comprising random inserted nucleic acids (transgenic)
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
    • A01K—ANIMAL HUSBANDRY; AVICULTURE; APICULTURE; PISCICULTURE; FISHING; REARING OR BREEDING ANIMALS, NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; NEW BREEDS OF ANIMALS
    • A01K2267/00—Animals characterised by purpose
    • A01K2267/03—Animal model, e.g. for test or diseases
    • A01K2267/035—Animal model for multifactorial diseases
    • A01K2267/0362—Animal model for lipid/glucose metabolism, e.g. obesity, type-2 diabetes
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/51—Medicinal preparations containing antigens or antibodies comprising whole cells, viruses or DNA/RNA
    • A61K2039/515—Animal cells
    • A61K2039/5156—Animal cells expressing foreign proteins
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K48/00—Medicinal preparations containing genetic material which is inserted into cells of the living body to treat genetic diseases; Gene therapy
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2510/00—Genetically modified cells
    • C12N2510/02—Cells for production

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Endocrinology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Environmental Sciences (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Toxicology (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Diabetes (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Animal Husbandry (AREA)
  • Biodiversity & Conservation Biology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Neurosurgery (AREA)
  • Dermatology (AREA)
  • Pathology (AREA)
  • Rheumatology (AREA)
  • Urology & Nephrology (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
  • Saccharide Compounds (AREA)
  • Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
  • Iron Core Of Rotating Electric Machines (AREA)
  • Acyclic And Carbocyclic Compounds In Medicinal Compositions (AREA)

Description

【発明の詳細な説明】 発明の分野 本発明は、遺伝子学的に操作した細胞を受容個体に導
入することに関連する遺伝子発現レベルを変化させるた
めの方法に関する。さらに、、本発明はこのような細胞
から産生された化合物、特に抗体、およびそのような化
合物の用途に関する。
従来技術 個体の両親から遺伝する疾患は遺伝子疾患として知ら
れている。区別し得るヒトの疾患のうち少なくとも1,50
0は遺伝子学的に決定付けられている［マックシック（M
cKusick,V.A.）,Mendelian Inheritance in Man（Johns
Hopkins Press,3編，ボルチモア,1971）］。これら疾
患の殆どは、その詳細な分子主体が未だに理解されてい
ないが、多くの場合、疾患の基礎は特定の酵素欠損であ
ると決定付けられている。［McKusick,V.A.,Ann Rev.Ge
net.４:1（1970）］。
現在、全面的に許容された遺伝子治療法は知られてい
ない。ヒトの遺伝子疾患は、食事療法（たとえば、フェ
ニルケトン尿症に罹患した患者からフェニルアラニンを
回避させるなど）、薬物療法（たとえば、痛風およびリ
ーシューナイハン症候群などに伴う尿酸の蓄積を減少さ
せるために、キサンチンオキシダーゼ酵素の阻害物質
（アロプリノール）を使用することなど）、また遺伝子
産物置換療法（たとえば、血友病の患者に第VIII因子を
投与するなど）のいずれかによって通常は治療される。
しかし、多くの遺伝子患者は上記の治療のいずれかに
対しても依然として反応しない。たとえば、一般に、ア
ミノ酸代謝の遺伝子障害は食事療法によって十分にコン
トロールすることはできない。さらには、ライソソーム
酵素欠損に伴う蓄積症は酵素療法に反応しないことが見
いだされている。さらに、疾患を上記いずれかの方法で
コントロールしたとしても、疾患の管理は殆どの場合、
完全ではない。
上記の方法の欠点に対応し、多くの研究者が組換えDN
A技術を遺伝子疾患の治療に応用している。このような
遺伝子療法は、患者のゲノムを意図的に変化させて病態
生理状態を改善させるという内科的／外科的な介入手段
として広く定義付けられており、このような用語はさら
に生殖細胞ラインおよび体細胞遺伝子療法に分けること
ができる。倫理的および実地上の両見地から、ヒトを対
象としては生殖細胞ライン遺伝子療法を実行することは
できない。倫理的観点から、生殖ラインを改変すること
は、若干であってもヒトの次世代に変化を及ぼしかね
ず、その長期間作用は全く予期できない。これとは対照
的に、体細胞遺伝子療法は適用した個体に作用するので
あり、新しい遺伝子は遺伝子プールには入らないであろ
う。実地的観点から、生殖ライン遺伝子導入は比較的非
能率的であり、注入した遺伝子の運命は予想することが
できず、おそらくは最重要事項として、殆ど例外なく、
単一細胞または胚の未来の表現型（特定の疾患に関し
て）を決定することはできないであろう。
しかし、体細胞遺伝子療法は、人類の特定疾患に対処
し、治療するための妥当な方法であるように思われる。
体細胞遺伝子供給システムでは、患者由来の細胞を取り
出し、インビトロ培養し、トランスフェクトし、再移植
する。この基礎的な方式の変法としては、細胞タイプお
よび細胞ドナー（患者である必要はない）、トランスフ
ェクションプロトコール、および再移植の部位の選択が
挙げられるが、これらに限定されない。
このように、DNAを個体に供給するための手段として
有望視された幾つかの方法が開発されている。広く開示
されている方法は、レトロウイルスベクター［バルマス
（Varmus,H.）らのRNA Tumor Viruses,ワイス（Waisu）
ら編，（コールド・スプリング・ハーバー・ラボラトリ
ー，ニューヨーク,1982）;Varmus,H.Science 216:812
（1982）；リザー（Risser,R.）らのAnn.Rev.Genet.17:
85（1983）］に関連している。この方法では、個々の遺
伝子をレトロウイルスに挿入し、次いでそれを個体に導
入する。レトロウイルスはRNAの遺伝子情報を蓄えてお
り、細胞に入ると、この情報はDNAへと逆転写され（し
たがって「レトロ」と命名されている）、次いで宿主細
胞のゲノムに組み込まれ、発現することができるように
なる。実際には、遺伝子操作法によって、目的とする遺
伝子およびレトロウイルスのゲノム（幾つかのレトロウ
イルス遺伝子はウイルスが複製できないように除去す
る）を含有する組換えレトロウイルスを構築する。この
人工ウイルスを利用してインビトロで骨髄細胞を感染
し、得られた細胞を致死的に照射した受容マウスに静注
すると、これらを最終的には、骨髄および脾臓に達す
る。この方法を使用し、ネオマイシンホスホトランスフ
ェラーゼ［ウイリアムス（Williams,D.A.）らのネイチ
ャー（Nature），310:476−481（1984）、アデノシンデ
アミナーゼ［Williams,D.A.らのプロシーディング・オ
ブ・ナショナル・アカデミー・オブ・サイエンスUSA（P
roc.Natl.Acad.Sci.,U.S.A.），83:2566−2570（198
6）］、およびヒポサンチンホスホリボシルトランスフ
ェラーゼ［ミラー（Miller,A.D.）らの225:630−632（1
984）Science］をコードしている遺伝子がマウスにおい
て発現された。
過去数年来で、遺伝子供給システムを基礎とするレト
ロウイルスの移植は、主としてレトロウイルス自身の性
質に関連した大きな障害に直面することが明らかになっ
てきた［ロバートソンァア（Robertoson,M.）,Nature 3
20:213−214（1986）、マークス（Marx,J.L.）,Science
232:824−825（1986）］。まず第１に、ヒト細胞を感
染するのに使用したレトロウイルスベクターでは、一般
に哺乳動物遺伝子を発現させることができず、この問題
が解決するまでは、遺伝子発現を調節する問題に取り組
むことができない。第２に、レトロウイルスを一群の骨
髄細胞の感染に使用した場合、実質的にいずれの細胞を
感染され、レトロウイルスの宿主ゲノムへの組込み部位
が細胞毎に異なる。感染細胞を再導入前には特性化しな
いので、有害な組込み事象の起こる可能性を排除するこ
とができない、第３に、感染に使用した複製障害性のレ
トロウイルスと哺乳動物のゲノムに存在する内生レトロ
ウイルスとの間に組換えが起こることが知られており
［ホック（Hock,R.A.）らのNature 320:275−277（198
6）］、宿主動物の慢性的なレトロウイルス感染症を開
始させる可能性がある。第４に、骨髄は、治療的に移入
する多くの（殆どでなければ）遺伝子の発現にとって最
適の部位とはおそらくはいえない。
遺伝子療法の他の方法は、DNAをウイルスではなく化
学的な方法によって細胞に導入することである。この方
法では、リン酸カルシウム−介在性トランスフェクショ
ンによって受容細胞にDNAを導入する。一般に、まず受
容細胞を個体から取り出し、導入したい遺伝子を含有す
るDNA溶液の存在下にそれをインキュベートする。その
遺伝子が細胞に導入された後に、得られた細胞を個体に
戻す。現在、個体から取り出し、処理し、次いで再導入
できる細胞は骨髄幹細胞および皮膚線維芽細胞（フィブ
ロブラスト）［アンダーソン（Anderson,W.J.）らのSci
ence 226:401−409（1984）］のみである。クライン（C
line,M.J.）らは、機能的なジヒドロ葉酸レダクターゼ
遺伝子をマウスの骨髄に導入するのに成功したことを開
示している［Nature 284:422（1982）］。
この化学的方法は、低い能率性という本質的な欠点を
有している。トランスフェクションは、細胞106または1
07個当たり１つしか起こらないことが見いだされた。し
たがって、骨髄移植によっては個体から約107または108
個の細胞しか得ることができないので、この化学的方法
は、10から100個の幹細胞のトランスフェクトが必要で
あろう。さらに、このような細胞を数日以上にわたって
培養することが困難であることより、本方法は実質的に
制限されている。骨髄集団の全細胞したとき、非常に少
ない修飾細胞しか存在しないことは、治療学的価値が殆
どないと一般に考えられる。
遺伝子治療についての３番目の主流の方法は、マイク
ロインジェクションまたはエレクトロポレーション（el
ectroporation）などの物理的手法を使用することであ
る。マイクロインジェクションは単離した個体細胞にDN
Aを注入することに関連する。この方法は極めて有効で
あるが、一度に１つの細胞しか注入できないという欠点
を有する。これは、マウスの受精卵へのDNAの注入に最
も成功を収めている［ゴードン（Gordon,J.W.）らのSci
ence 214:1244（1981）；ワグナー（Wagner,E.F.）らの
Proc.Natl.Acad.Sci.,U.S.A.78:5016（1981）；ワグナ
ー（Wagner,T.F.）らのProc.Natl.Acad.Sci.,U.S.A.78:
6376（1981）；パルミター（Palmiter,R.D.）らのNatur
e 300:611（1982）］。ハマー（Hammer,R.E.）らは、こ
の手法を成長ホルモン産生に障害を有するマウスを部分
的に矯正するのに使用した［Nature 311:65（1984）。
エレクトロポレーションは、電流を使用して細胞膜を介
し直接DNAを移入させることである。これはDNAをＢリン
パ球に移すのに使用されている［ニューマン（Neumann,
E.）らのEMBO J.１:841（1982）］。
要約すれば、遺伝子疾患に対処するために、種々の常
法および組換え法が提示されている。しかし、現在は、
完全に満足のいくような単一の手法はない。ウイルスベ
クターを使用するのは、内生遺伝子の再配列のおそれ、
および発癌作用を誘発させるおそれがある。物理的手法
は非常に効率的ではあるが、現在では妥当な治療法を行
うためにトランスフェクトが必要であると考えられる非
常に多くの細胞には適用することができない。化学的方
法は既に対象個体から抽出している細胞にDNAを導入す
ることに関連する。現在、この手法は骨髄細胞および線
維芽細胞に限定されており、実行可能な治療法を構成す
るには効率的でない。この分野の状態は、フリードマン
（Friedman,T.）らのScience 175:949−955（1972）、
およびアンダーソン（Anderson,W.E.）のScience 226:4
01−409（1984）に概説されている。
抗体などの結合性タンパク質は、抗原またはハプテン
などの特定の分子の存在または濃度を検定するために広
範に使用されている。抗原は、動物に導入したとき、動
物を刺激してそれと結合することが可能な抗体を産生せ
しめる分子である。これとは対照的に、ハプテン分子
は、抗体と結合することができるが、その産生を誘発す
ることはできない。抗体は、個々の構造領域（「エピト
ープ」として知られている）を確認することによってハ
プテンおよび抗原の両者と結合する。ハプテンまたは抗
原分子は１つ以上のエピトープ領域を有する場合があ
る。
抗体の調製物は、大きく２つに分類される。ポリクロ
ーナル抗体は、抗原分子を動物に注入（またはそうでな
かれば提示する）することによって調製される。抗原分
子の存在により、抗体−産生細胞がその抗原のエピトー
プと結合できる抗体種を産生するよう該細胞は刺激され
る。異なる抗体−産生細胞は異なる抗体分子を産生する
ことができる。このように、抗原を動物に導入すれば、
その抗原分子のエピトープそれぞれと結合することがで
きる抗体など、異なる抗体分子の系列が産生される。こ
のような調製物は、異なる産生細胞から産生された抗体
群を包含するので、「ポリクローナル」抗体調製物と命
名される。
ポリクローナル抗体を調製するための方法および手法
の優れた概説を、Microbiology,2版；デイビス（Davis,
B.D.）ら;Harper ＆ Row,ニューヨーク（1973）,345−3
58頁；およびRemington's Pharmaceutical Sciences,16
版,Osol,A.,編,Mack Puplishing,イーストン,Pa（198
0）,1315−1351頁に見いだすことができる。
特定の抗体産生細胞はただ１種の抗体を産生すること
もできるので、非常に意義がある。このような特定の細
胞はクローンして精製し、不滅化骨髄腫細胞（ミエロー
マ）と融合することによって、単一の抗体種を産生する
ことができる不滅化細胞を調製することができる。この
ような融合細胞は、「ハイブリドーマ」細胞として知ら
れ、それから産生される抗体は、「モノクローナル」抗
体として知られている。モノクローナル抗体を産生させ
る操作法は、米国特許第4,172,124号（コプロウスキー
（Koprowski,H.ら））、およびモノクローナル抗体、ハ
イブリドーマ（Monoclonal Antibodies,Hybridomas:A N
ew Dimension in Biorogical Analyese），ケネット（K
ennett,R.H.ら）編，プレウス・プレス（Pleum Pres
s），ニューヨーク（1980）に開示されている。
モノクローナル抗体とポリローナル抗体との違いは、
それら個々の特異性または結合親和性にあるのではな
い。両タイプの抗体分子は抗原分子に対して同等の特異
性と結合親和性を示す。ポリクローナル抗体の調製物
は、多くは異なるエピトープと結合することができる異
なる抗体種のIgG分子の、分画されていない混合物また
はその精製混合物のいずれからなるものである。対照的
に、モノクローナル抗体の調製物は、ただ１つの抗体種
を含有するものである。これらは単一種の抗体から構成
されているので、モノクローナル抗体の調製物は（必ず
しも抗体自身は必要でないが）ポリクローナル抗体の調
製物で得られるよりも大きな特異性を有する可能性があ
る。
モノクローナルまたはポリクローナル抗体のいずれか
を産生させるためには、一般に実質的な量の抗原を抗体
産生細胞に提示させることが必要であることは明らかで
ある。したがって、一般には、抗体産生を誘発させる前
に、抗原を単離し、精製することが必須である。しか
し、実際には、特定の抗原分子を単離精製することは困
難であることが多い。このことは、抗原分子がホルモ
ン、膜タンパク質、または供給材料中に極めて少ない濃
度でしか存在しない他の分子の場合には、特に当てはま
る。したがって、このような分子では、抗体を得るのが
困難であるか、あるいは得られないことが多い。このよ
うな事情から、抗原分子を前もって単離または精製する
必要のない抗体の生産方法が要求されている。
発明の要旨 本発明は、所望の遺伝子産物の受容対象内濃度を変化
させるための方法を提供するものである。さらに、本発
明は、対象における目的遺伝子の発現に存在し得る欠陥
を補償する手段、あるいは対象における特定遺伝子を増
加または減少させる手段を提供するものである。
詳細には、本発明は、所望の遺伝子産物の受容対象濃
度を変化させるための方法であって、受容対象に供給し
たとき、所望の遺伝子配列の発現を指令して所望の遺伝
子産物を産生させる所望の遺伝子配列を含有するトラン
スフェクト細胞を少なくとも１つ含有しているトランス
フェクト細胞調製物を受容対象に供給することを特徴と
する方法を提供するものである。
また、本発明は、所望の遺伝子産物の受容対象内濃度
を変化させるための方法であって、受容対象に供給した
とき、エフェクター遺伝子配列の発現を指令して所望の
遺伝子産物を産生させるエフェクター遺伝子配列を含有
するトランスフェクト細胞を少なくとも１つ含有してい
るトランスフェクト細胞調製物を受容対象に供給するこ
とを特徴とする方法を提供するものである。
本発明はさらに、生物学的化合物の産生を誘導する方
法であって、受容対象に供給したとき、受容対象の非−
トランスフェクト細胞の生物学的化合物の産生を誘発さ
せるに十分な所望の遺伝子配列の発現を指令することに
よって所望の遺伝子産物（Ｉ）を産生させる所望の遺伝
子配列を含有するトランスフェクト細胞を少なくとも１
つ含有しているトランスフェクト細胞調製物の有効量を
受容対象に供給することを特徴とする方法を提供するも
のである。
本発明はさらに、試料中の所望の遺伝子産物（II）の
濃度を測定するための方法であって、 （ａ）所望の遺伝子産物（II）と結合できる生物学的化
合物の存在下に試料をインキュベートし、受容対象に供
給したとき、受容対象の非−トランスフェクト細胞の生
物学的化合物の産生を誘発させるに十分な所望の遺伝子
配列の発現を指令することによって所望の遺伝子産物
（Ｉ）を産生させる所望の遺伝子配列を含有するトラン
スフェクト細胞を少なくとも１つ含有しているトランス
フェクト細胞調製物の有効量を受容対象に供給すること
を特徴とする方法によって生物学的化合物の産生を誘発
し、 （ｂ）所望の遺伝子産物（II）と結合した生物学的分子
の量を測定することによって所望の遺伝子配列の濃度を
測定する ことを特徴とする方法を提供するものである。
さらに、本発明は、所望の遺伝子産物（II）の試料中
濃度を測定する方法であって、 （ａ）所望の遺伝子産物（II）と結合できる２つの異な
る生物学的化合物の存在下に試料をインキュベートし、
受容対象に供給したとき、受容対象の非−トランスフェ
クト細胞の生物学的化合物の産生を誘発させるに十分な
所望の遺伝子配列の発現を指令することによって所望の
遺伝子（Ｉ）を産生させる所望の遺伝子配列を含有する
トランスフェクト細胞を少なくとも１つ含有しているト
ランスフェクト細胞調製物の有効量を受容対象に供給す
ることを特徴とする方法によって少なくとも１つの生物
学的化合物の産生を誘発し、 （ｂ）所望の遺伝子産物（II）と結合した生物学的分子
の量を測定することによって所望の遺伝子産物の濃度を
測定する ことを特徴とする方法を提供するものである。
本発明はさらに、免疫抑制活性を有するのでないか疑
わしい物質の評価法であって、 （ａ）抗原を発現するトランスフェクト細胞調製物を受
容対象に導入し、 （ｂ）評価すべき物質を該受容対象に投与し、そして （ｃ）物質の投与により、抗原と結合できる抗体の受容
対象における産生能に影響を受けたか否かを決定する ことを特徴とする方法をも包含するものである。
さらに、本発明はトランスフェクト細胞からなる移植
物をも包含するものである。
図面の簡単な説明 第１図は、トランスカリオチック移植の１態様を示す
模式図である。培養細胞に、治療目的とした遺伝子およ
び選択マーカーをコードしている遺伝子を共に共トラン
スフェクトア（co−transfect）する。選択手法に対す
る生存能として評価されるマーカー遺伝子の発現能によ
って、安定にトランスフェクトされた細胞を同定する
（マーカー遺伝子を取り込んでいない細胞はこれにより
破壊される）。次いで、安定にトランスフェクトされた
細胞の個々のコロニーを増幅し、治療目的とした遺伝子
の発現および調節に関して特性化する。次いで、所望の
発現性を有するクローン系統（それ自身は目的とする遺
伝子の発現として特性化される）を、宿主動物における
種々の解剖学的位置のひとつに導入する。
第２図は、一時的にトランスフェクトされた（点
線）、または安定にトランスフェクトされた（実線）細
胞を腹腔内注射したマウスの血流で検出されたヒト成長
ホルモンの量を示すものである。
第３図は、トランスフェクト細胞を皮下投与した（実
線、三角）、またはトランスフェクト細胞を被膜下に移
植した（実線、丸）マウスの血流で検出されたヒト成長
ホルモンの量を示すものである。点線は、移植した細胞
の数に対して正規化した被膜下トランスカリオチック移
植に関するデータを示している。
第４図は、成長ホルモン遺伝子がメタロチオネイン−
Ｉプロモーターによって制御された、トランスフェクト
細胞を含有するマウスにおける成長ホルモンのレベルに
対する亜鉛投与の作用を示している。
第５図は、被膜移植から回収したトランスフェクト細
胞におけるマウスメタロチオネイン−I/ヒト成長ホルモ
ンmRNAの検出を示している。
第６図は、前もってトランスカリオチック移植物を投
与しておいた受容マウスに安定にトランスフェクトされ
た細胞を移植した後日数の関数としてヒト成長ホルモン
のレベルを示している。
第７図は、異種（allogetneic）マウスにおいて、ト
ランスフェクト移植物によって発現された成長ホルモン
のレベルを示している（実線）。点線は、その後の別の
移植に起因した成長ホルモンの発現を示している。
第８図は、トランスカリオチック移植物を使用した正
常および糖尿病マウスへの機能的なインシュリン遺伝子
のデリバリーを示している。マウスのメタロチオネイン
−I/ヒトインシュリン融合遺伝子（挿入）で共トランス
フェクトした後、Ltk+Insセルラインを選択した。ヌー
ドマウス10匹に約107個Ltk+Ins細胞を腹腔内注射した。
図示したトランスフェクト後の日数の日にマウスを２時
間絶食させ、次いで採血した。推奨された手順（Worthi
ngton）によって血清グルコースレベル（実線）を測定
し、平均レベルおよび標準誤差を示す。マウスから得た
血清試料を採取し、推奨された手順（Diagnostic Produ
cts）にしたがって血清インシュリンの平均レベル（点
線）を測定した。
第９図は、トランスカリオチック移植物により生理学
的に有意なレベルのインシュリンが得られるその能力を
示すものである。既述のように、10匹のC3Hマウスを免
疫抑制し、腹腔内注射した。絶食させて２時間後にマウ
スから採血し、血清グルコースレベルを測定した。５匹
のマウスが長時間の血清グルコースレベルの下降を示し
（実線）、結局、低血糖症になった。トランスカリオチ
ック移植を行わなかった５匹の糖尿病マウスのグループ
から得られた血清グルコースレベルは、対照としてモニ
ターした（点線）。
好ましい態様の説明 本発明の組成物および方法は、２つの異なる方法で使
用することができる。第１の態様では、本発明の組成物
および方法の目的は、遺伝子療法を受容対象に供するこ
とにある。第２の態様では、本発明の組成物および方法
の目的は、トランスフェクト細胞から産生される化合物
の存在に対応して特異的な生物学的化合物を産生するよ
う受容対象を誘発させることにある。
I.本発明の用語の定義 本発明は、所望の遺伝子産物の受容対象内濃度を変化
させるための新規な方法を提供するものである。この変
化方法は、所望の遺伝子配列またはエフェクター遺伝子
配列のいずれかを受容対象に運ぶトランスフェクト細胞
の導入に関連する。本発明の目的に使用するためには、
導入した所望の遺伝子配列は受容対象内で発現できなけ
ればならない。第１図はトランスカリオチック移植の模
式図を示すものである。
本発明で使用することができる「対象受容体」として
は、動物、およびヒトなど挙げられる。本明細書で使用
している「対象受容体」なる用語は、所望の遺伝子を含
有するトランスフェクト細胞の受容体を意味するものと
する。
本発明では、「トランスフェクト細胞」とは、受容対
象において発現させようと望む特定遺伝子を含有するよ
うインビトロで増殖された細胞を呼ぶものとする。した
がって、たとえば、ある特定の対象において成長ホルモ
ン遺伝子を発現させたい場合、細胞が受容対象への導入
時にこの遺伝子を発現するような態様で、成長ホルモン
に係る遺伝子を細胞に導入するであろう（これによっ
て、トランスフェクト細胞が形成される）。この遺伝子
配列は、受容対象を属する種の正常遺伝子配列と同一で
あるのが通常であるが、これは必ずしも必須ではない。
したがって、付加的に成長ホルモンを動物へ供給したい
場合には、その動物の成長ホルモン遺伝子、またはそれ
に代わって、使用する成長ホルモン遺伝子がその受容対
象内で発現可能である限り、それと異なる種の成長ホル
モン遺伝子のいずれかを含有するトランスフェクト細胞
を使用することができるであろう。
このようなトランスフェクト細胞を含有する受容対象
は、「トランスカリオチック（transkaryotic）」な受
容対象と言われる。トランスカリオチック動物は、遺伝
子導入動物（transgenic animals）とは本質的に異なっ
ている。遺伝子導入動物では、すべてのその動物の細胞
が、同種の他の動物では天然に存在しない遺伝子配列を
含有している。トランスカリオチック動物では、導入し
たトランスフェクト細胞しかこのような配列を含有して
おらず、その動物の細胞の大多数は変化していない。こ
のように、遺伝子導入療法は、動物の細胞の各々の遺伝
子内容を変化させる方法によって、動物の生殖細胞ライ
ンを変化させることがある。これとは対照的に、トラン
スカリオチック療法は、体細胞に関連しており、動物の
細胞の遺伝子内容は変化させない。
本明細書では、トランスフェクト細胞を受容対象に導
入することを「トランスカリオチック移植」と命名す
る。
「トランスフェクト細胞調製物」は、（１）生理学的
に許容され得る緩衝液もしくは担体、または（２）生理
学的に許容され得る容器内のいずれかにおいて、少なく
とも１つのトランスフェクト細胞を含有してゐる細胞懸
濁液である、リン酸緩衝化食塩水は、このような担体と
して適当な例である「トランスカリオチック移植物」
は、少なくとも１つのトランスフェクト細胞を含有する
移植物である。
II.受容対象におけるトランスフェクト細胞の発現 本発明は、受容対象に遺伝子療法を行うことができる
手段を提供するものである。このような治療法は、（特
定の遺伝子配列を対象内で発現することができる）トラ
ンスフェクト細胞を導入することによって行うことがで
きる。対象に導入するべき特定の配列、またはその遺伝
子配列の性質は、濃度を変化させたいと望む特定の遺伝
子産物に応じて選択されるものである。導入した遺伝子
配列は、所望の遺伝子産物（または所望の遺伝子産物と
の等価物またはその変異体）を発現し得ることに基づい
て所望の遺伝子産物の濃度を変化させることができる
（ここに、導入される遺伝子配列を「所望の遺伝子配
列」と命名する）。さらに、導入した遺伝子配列は、受
容対象のトランスフェクトされていない細胞（すなわ
ち、それ本来の細胞）［ここに、その遺伝子配列を「エ
フェクター遺伝子配列」と命名する］から所望の遺伝子
産物が発現されることによって所望の遺伝子産物の濃度
を変化させることができる。したがって、成長ホルモン
の濃度を変化させたい場合、成長ホルモンを発現するト
ランスフェクト細胞を供給することによって成長ホルモ
ンの濃度を直接的に変化させるか、またはトランスフェ
クトされていない動物の細胞からの成長ホルモンの発現
を誘発させることによって間接的にホルモン濃度を変化
させることのできる遺伝子配列を導入すればよいであろ
う。同様に、本発明では、単離、クローンが可能なあら
ゆる遺伝子を使用することができる。
本明細書中で使用する「発現」なる用語は、遺伝子配
列のmRNAへの転写、そのmRNAのタンパク質への翻訳、お
よびそのタンパク質の細胞外への分泌を指令する細胞の
作用を意味する。遺伝子産物の分泌は、天然で起こり得
るものであり、あるいは所望のもしくはエフェクター遺
伝子を分泌シグナル配列に機能的に連結させて行わしめ
ることができる。発現がある種のある遺伝子産物に関し
て許容された標準量内のレベルであるならば、またはそ
の発現レベルが受容対象と同種の非処置対象で得られる
ものと実質的に同等であるならば、その発現は「正常」
であると言われる。「正常でない発現」とは通常、対象
の種の正常個体で見いだされるよりも少ない発現を意味
するが、特定の遺伝子産物の過剰発現を説明するのにも
使用することができる。発現は、それにより受容対象の
生理機能が変化するならば、生理学的に意義があると考
えられる。したがって、受容対象にとって生理学的意味
を持たない程に低いレベルの発現は、生理学的に意義が
あるとは考えられない。これとは逆に、発現が受容対象
の全体的生理機能に影響したときは、たとえば本明細書
で使用する用語では生理学的に意義があるものである。
遺伝子発現を行うためには、所望のエフェクター遺伝
子の構造配列をプロモーター領域と機能的に連結させる
ことが必要である。プロモーター領域は、トランスフェ
クト細胞が遺伝子配列の転写を開始する部位として認識
するDNA配列である、遺伝子配列がプロモーター領域の
存在によって転写できる程に連結が十分であるなら、そ
の遺伝子配列はプロモーター領域と機能的に連結してい
ると言われる。本発明の１つの態様では、所望のDNA配
列またはエフェクターDNA配列を、正常かつ自生のプロ
モーター領域に連結したトランスフェクト細胞に導入す
る。このようなトランスフェクト細胞は、遺伝子の正常
調節の制御下でその所望の遺伝子またはエフェクター遺
伝子の産物を産生することができる。あるいは、好まし
い態様としては、特定の所望の遺伝子配列またはエフェ
クター遺伝子配列を、伴っていないのが普通であるプロ
モーター領域に連結することができる。したがって、ト
ランスフェクト細胞内で機能できるあらゆるプロモータ
ーが所望のまたはエフェクター遺伝子配列と連結するこ
とができ、これを使用すればトランスカリオチック細胞
内で遺伝子を発現させることができる。
プロモーター領域はいずれにせよ（すなわち、ある特
定の条件下でしか遺伝子を連続して発現することができ
ないか、あるいはそうでなくても、このような発現を実
質的にプロモートできない場合でも）構築することがで
きる。使用することができる好ましい調節可能なプロモ
ーター領域の中には、マウスのメタロチオネインプロモ
ーター領域がある。このプロモーター領域は、ある種の
重金属（すなわち、亜鉛またはカドミウム）の濃度に直
接応答して、機能的に連結した遺伝子配列の転写を指令
している。したがって、このようなイオンを受容対象に
投与することによって、機能的に連結した遺伝子配列の
発現レベルを制御することができる。
あるいは、温度、糖、２本鎖RNAなどによって調節可
能なプロモーター領域（温度についてドロソフィラ・ヒ
ート・ショック・プロモーター（Drosophila heat shoc
k promoter）、糖について酵母ga1−４プロモーター）
を使用することもできる。
遺伝子療法の有用性は、古典的な遺伝子障害、不存在
性または異所性タンパク質産物に至らしめる遺伝子の欠
損または突然変異に起因する遺伝し得る疾患の治療は言
うに及ばず広範である。糖尿病に対して遺伝子療法を適
用するなど、特定のタンパク質を供給することによっ
て、種々の病態生理学的症状を処置することができる。
Ｉ型およびII型の両糖尿病は遺伝的素因を有し得るが、
非常に多くの場合、インシュリン遺伝子自身は影響を受
けていない。障害性遺伝子の置換に適合しない種々の一
時的な介入もこのカテゴリーに属する。たとえば、組織
プラスミノーゲンアクチベーター（大量生産が非常に困
難である）は日の浅い心筋梗塞に罹患した患者の治療の
ためのものとして広く評価されている。このような患者
から入手した細胞は組織プラスミノーゲンアクチベータ
ーを発現するように操作し、再移植することが可能であ
り、以後の生命を脅かす血餅が形成されるおそれが減じ
るであろう。同様に、トランスカリオチック移植は特定
の悪性腫瘍を破壊するように設計した産物を供給するの
に使用することもできる。トランスカリオチック移植は
外傷または火傷の罹病者を一時的に治療するのにも使用
することができる。
トランスカリオチック移植を利用する遺伝子治療には
望ましい幾つかの特徴がある:I）患者に移植する前に、
トランスフェクト細胞を十分に特性化する必要がある;I
I）遺伝子（群）を効率的に供給し、所望のレベルの調
節された発現を行う必要がある;III）トランスフェクシ
ョンに係る異なる組織から誘導した細胞を利用し、臨床
上の配慮から、それらを異なる解剖学的位置に再移植す
ることが可能なはずれである;IV）トランスフェクト細
胞移植後の機能を検出し、モニターし、おそらくは調節
することができるはずである;V）移植した細胞を要すれ
ば移植後の任意の時点で完全に破壊し、または不活性す
ることができるように、それらを操作する必要がある;V
I）このシステムは明らかな治療上の利点を有している
に違いないが、患者または個体群を過度の危険性にさら
してはならない。既述のように、この変化法によれば、
受容対象のゲノムに存在していなかった新規な遺伝子を
受容対象に供給することができる。このような場合に、
導入した遺伝子配列を受容対象に初めて発現されること
ができるであろう。さらに、本発明は、遺伝子発現の受
容対象内レベルを増大させる手段を提供するものであ
る。
III.遺伝子治療を行うためのトランスカリオチック移植
の使用 本発明は、遺伝子発現の受容対象内レベルを変化させ
るための手段を提供するものである。この変化方法で
は、遺伝子発現の増大または減少のいずれも行うことが
できる。
発現を増大させることを所望とする対象受容体の遺伝
子と実質的に同一のまたは等価の遺伝子を含有するトラ
ンスフェクト細胞をその受容体に供給することによって
遺伝子発現を増大させることができる。このような遺伝
子がトランスフェクト細胞から発現されることにより、
所望の遺伝子産物の濃度が受容対象内で増大する。ここ
で使用している「等価遺伝子」は、受容対象の遺伝子と
同様のものであるが、異なる種から誘導された遺伝子で
ある。たとえば、ウシ成長ホルモンの遺伝子はヒト成長
ホルモンの遺伝子と等価であろう。「同一の遺伝子」
は、受容対象に正常かつ天然で存在する遺伝子配列と実
質的に同様の遺伝子である。「等価」または「同一」の
遺伝子配列は、「所望の遺伝子配列」または「エフェク
ター遺伝子配列」のいずれかりなり得る。
本発明に従えば、「エフェクター遺伝子配列」（すな
わち、その増大した発現を望む遺伝子を調節する遺伝子
配列）を含有するトランスフェクト細胞を受容対象に供
給することによって、遺伝子発現を増大させることがで
きる、したがって、たとえば、特定の遺伝子の受容対象
内における発現レベルは、別の所望の遺伝子配列の受容
対象内における内生発現を刺激する産物の遺伝子を発現
するトランスフェクト細胞を受容対象に供給することに
よって増大させることができる。たとえば、増大したレ
ベルで成長ホルモンを分泌するよう受容対象を誘導する
産物の遺伝子を発現したトランスフェクト細胞を受容対
象に供給することによって遺伝子発現を増大させること
ができるであろう。
本発明はさらに、遺伝子発現の受容対象内レベルを減
少させるためにも使用することができる。内生遺伝子の
受容対象内における発現を抑制する産物のエフェクター
遺伝子配列を発現するトランスフェクト細胞を受容対象
に供給することによって、遺伝子発現を減少させること
ができる。すなわち、たとえば、成長ホルモンの発現を
抑制する産物（すなわち、ソマトスタチン）の遺伝子を
発現するトランスフェクト細胞を供給することによっ
て、受容対象における成長ホルモン遺伝子の内生発現量
を制限することができるであろう。あるいは、特定遺伝
子の正常活性またはその機能を遺伝子産物を発現したト
ランスフェクト細胞を受容対象に供給することによって
も遺伝子発現を減少させることができるであろう。たと
えば、そのトランスフェクト細胞から、特定の内生遺伝
子産物と複合体化することのできる遺伝子産物を得るこ
とができるであろうし、これにより、その遺伝子産物の
活性が減衰される。
受容対象内における遺伝子発現を増大または減少させ
る他の方法は、受容対象内における所望の遺伝子産物の
生理学的に意義のある濃度を変化させるために、トラン
スフェクト細胞を使用することである。このようなトラ
ンスフェクト細胞は、（１）発現の変化を望む遺伝子、
または（２）発現が、目的とする遺伝子配列の発現レベ
ルに作用するその遺伝子のいずれかの突然変異アレルを
発現することができる。したがって、たとえば、成長ホ
ルモン遺伝子の発現レベルを増大させる１つの手段は、
増大した活性を有する突然変異成長ホルモンを産生する
ことができる成長ホルモン遺伝子の突然変異アレルを発
現したトランスフェクト細胞を受容対象に供給すること
である。同様に、突然変異ヒト成長ホルモン産物を産生
することができるトランスフェクト細胞（実質的に補償
された活性を有する）を受容対象に供給することによっ
て、受容対象の内生の正常成長ホルモンと対になること
ができる成長ホルモンレセプターの数を減少することが
できるであろう。このような事象は、内生成長ホルモン
の量を減少させるのと実質的に同じであり、内生遺伝子
発現の生理学的効果が減少するであろう。
トランスフェクト細胞に存在する所望の遺伝子配列
は、受容対象自身、または受容対象と同種の動物、また
はそれと異なる種の動物のいずれからでも得ることがで
きるし、または合成遺伝子であってもよいと考えられ
る。トランスフェクト細胞の所望の遺伝子配列またはエ
フェクター遺伝子配列の供給源を選択するに当たって
は、トランスフェクト細胞から発現される遺伝子産物が
受容対象において抗原として認識されるか否かを考慮す
ることが重要である。したがって、トランスフェクト細
胞の発現産物のあらゆる免疫学的拒絶反応を回避するた
め、受容対象と極めて近縁の種から所望の遺伝子または
エフェクター遺伝子を入手することが望ましく、さらに
その配列は受容対象と同種の動物から入手することが好
ましい。最も好ましくは、受容対象自身から得られた遺
伝子を使用することである。トランスカリオチック細胞
から発現される遺伝子配列のあり得る抗原性は、受容対
象の血清が発現される遺伝子産物と特異的に反応できる
抗体を有しているか、またはプライミングして該抗体を
有し得るかを確認することによって容易に決定すること
ができる。タンパク質の抗原性を決定する手法は当業者
によって周知である。
IV.受容対象中において生物学的化合物の産生を誘導す
るためのトランスカリオチック移植の使用 本発明の１態様は、受容対象に通常存在している非−
トランスフェクト細胞から生物学的化合物を産生せしめ
るためにトランスカリオチック細胞を使用することであ
る。この態様にしたがって生産することができる生物学
的化合物の例としては、抗体、細胞レセプター分子、ホ
ルモン、酵素などがある。特定の所望遺伝子産物の「有
効量」を発現することのできる特定のトランスフェクト
細胞を移植することによって、別の特定遺伝子産物の合
成を（受容対象内の非−トランスフェクト細胞から）誘
導させることができる。「有効量」なる用語は、生理学
的に意義のある発現量を意味するものとする。したがっ
て、ホルモン遺伝子の有効量が受容対象内で発現された
場合、そのホルモンのレベルは対象の生理に対する検出
可能な作用を有する程に十分高いものである。抗原性物
質の有効量が受容対象内で発現された場合、その物質の
レベルは抗体産生を誘発する程に十分高い。したがっ
て、たとえば、トランスフェクト細胞が抗原を発現する
とき、受容細胞はそれと結合できる抗体の産生が誘発さ
れる。あるいはまた、トランスフェクト細胞が抗原性で
ないホルモンまたはホルモンレセプターを発現すると
き、受容対象の非トランスフェクト細胞は、標準的な生
理機構によってホルモンレセプターまたはホルモン分子
を産生するよう誘発される。
本発明の上記の態様により、第１に発現産物分子を精
製しなければならない工程が省略され、トランスフェク
ト細胞の発現産物の存在に対応して産生される生物学的
化合物を回収することができるようになることは重要な
ことである。現在、たとえば、精製抗原の実質的な量を
提供するだけで、高い親和性の特異的ポリクローナル抗
体を生産することができる。抗原分子の精製が困難であ
る故に、ポリクローナル抗体の生産は極めて困難な仕事
であることが多い。対称的に、目的とする抗原をコード
している遺伝子を単離することはしばしば単純な作業で
ある。このような遺伝子を細胞に導入すれば、その抗原
を発現するトランスフェクト細胞を生産することができ
る。次いで、それを発現させて、発現された抗原と特異
的に結合できる抗体を受容対象から産生させる。したが
って、本発明は、抗原分子を精製するための現行の必要
性を克服した、ポリクローナル抗体の生産手段を提供す
るものである。
発現される抗原は、無傷かつ全体の遺伝子の産物であ
る必要がないことは、重要なことである。さらに、「遺
伝子フラグメント」の発現産物であってもよい。「遺伝
子フラグメント」は、発現時に、無傷かつ全体遺伝子の
フラグメントからしか構成されていないポリペプチドの
産生を導くDNA配列である。たとえば、ホルモンを認識
できる抗体の産生誘導を望む場合には、完全なホルモン
分子を発現したトランスフェクト細胞を使用する必要は
ないであろう（すなわち、代わって、ホルモン分子遺伝
子の遺伝子フラグケントを含有する細胞を使用すること
ができるであろう）。
抗体産生を誘発するために遺伝子フラグメントを使用
できることは当業界における実質的な進歩である。都合
の良いことに、遺伝子産物、完全長の遺伝子のいずれを
も単離しなかった場合でさえ、この操作法は、遺伝子の
クローニングに使用することができる。さらに、この方
法により、免疫診断および免疫治療上において実質的に
重要である領域−特異的なポリクローナル抗体を単離す
ることが可能となる。
V.本発明の抗体の使用 トランスフェクト細胞で発現された所望の遺伝子産物
は、免疫抑制療法を施さないならば、受容対象にとって
「抗原性」である（すなわち、抗体の発現を誘発する）
ことが非常に多い。遺伝子産物は「エピトープ」を含有
しているとき、抗原性（すなわち、抗原）である。「エ
ピトープ」は、受容対象から認識され、受容対象の誘発
抗体と結合する分子の部分である。抗原は１つまたはそ
れ以上のエピトープから構成されている場合がある。
本発明を実施することにより、２つの異なる抗体分
子、すなわち「ポリクローナル抗体」および「領域−特
異的ポリクローナル抗体」を産生させることができる。
「ポリクローナル抗体」は、完全（すなわち、全部また
は天然の）遺伝子の産物の存在に応答して対象から産生
される。「領域−特異的ポリクローナル抗体」は、完全
遺伝子の産物のフラグメントの存在に応答して対象から
産生される。たとえば、ヒトインシュリンタンパク質を
免疫コンピーテントなマウスで発現させた場合、そのマ
ウスは、インシュリンエピトープと結合できる一組のポ
リクローナル抗体を産生するであろう。一般に、個々の
抗体それぞれは１つのインシュリンエピトープにしか結
合できないので、その組みは異なるインシュリンエピト
ープそれぞれと結合できる抗体を含有しているであろ
う。これとは対称的に、ヒトインシュリンタンパク質の
半分しかマウスで発現されていない場合、発現されるイ
ンシュリンフラグメント上に存在するインシュリンエピ
トープとしか結合できないポリクローナル抗体の組みを
マウスは産生するであろう。このような抗体は発現され
るフラグメントに関して「ポリクローナル抗体」である
が、それらは完全なインシュリン分子に関しては「領域
−特異的なポリクローナル抗体」である。
要約すれば、ポリクローナル抗体の試料が完全な遺伝
子産物上に天然で存在する幾つかのエピトープとのみ結
合できる場合、その抗体はその完全な遺伝子産物に関し
て領域−特異的なポリクローナル抗体である。代わっ
て、試料中に存在する抗体が抗原のすべてのエピトープ
を結合する場合、その試料はその抗原に関してポリクロ
ーナル抗体を含有しているのである。本発明に従えば、
完全遺伝子産物と結合できる抗体は、その完全遺伝子産
物と結合できる領域−特異的な抗体を含有した抗血清か
ら得られるか、またはその中に存在するならば、領域−
特異的な抗体と呼ばれる。
本発明のトランスフェクト細胞は、完全抗原の遺伝子
配列または完全抗原のフラグメントの遺伝子配列を含有
することができるので、ポリクローナル抗体または領域
−特異的ポリクローナル抗体のいずれかを産生するトラ
ンスカリオチック受容体を産生するのに使用することが
できる。これらの抗体は、抗体が従来使用されてきた免
疫検定法のいずれかに利用することができる。本発明の
領域−特異的なポリクローナル抗体は、モノクローナル
抗体が従来使用されてきた免疫検定に使用することがで
きる。１つの態様では、当業者に周知の通常の標識方法
を利用して抗体を検出可能に標識する。このように、結
合性分子は、たとえば3H、125I、131Iおよび35Sなどの
ような放射活性同位元素を使用することによって、放射
線標識することができる。
さらに抗体は、当業界既知の方法によって、発光標識
物、酵素標識物、遊離ラジカル標識物、またはバクテリ
オアファージ標識物を使用して標識することができる。
代表的な蛍光標識物には、イソチオシアン化フルオレ
セイン、ローダミン、フィコエリスリン、フィコシアニ
ン、アルフィコシアニン（alphycocyanin）、およびテ
キサス・レッドなどがある。
適当な酵素には、アルカリホスフェターゼ、ウレアー
ゼ、β−ガラクトシダーゼ、グルコース−６−ホスフェ
ートデヒドロゲナーゼ、マレートデヒドロゲナーゼ、お
よびペルオキシダーゼなどがある。
酵素免疫検定の２つの主要なタイプは、酵素−結合免
疫吸着検定（ELISA）、および酵素−多重化免疫検定（E
MIT）として知られている同種酵素検定（homogeneous e
nzyme immunoassay）である。ELISAシステムでは、たと
えば固相に結合した抗体を使用することによって、分離
を行うことができる。EMITシステムは、トレーサー−抗
体複合体において酵素の失活に存在しており、すなわち
活性は、分離工程を必要とせずに測定することができ
る。
さらに、化学発光（chemiluminecent）化合物も標識
物として使用することができる。代表的な化学発光化合
物には、ルミノール、イソルミノール、芳香族アクリジ
ニウムエステル、イミダゾール、アクリジニウム塩、お
よびオキサレートエステルなどがある。同様に、生物発
光化合物として、ルシフェリン、ルシフェラーゼ、およ
びエクオリンなどを挙げることができる。
標識すれば、当業界周知の方法によって、その結合性
分子を使用して検出、すなわち免疫学上の相手を同定、
および／または定量することができる。このように、本
発明では、「検出」なる用語は、分子または官能基の存
在を同定すること、およびそれを定量することを包含す
るものである。
ラジオイムノアッセイ（RIA）についての適切な説明
は、ワーク（Workt,T.S.）らのLaboratory Techniques
and Biochemistry in Molecular Biology中に見だすこ
とができ、チャード（Chard.T.）,Notrh Holland Publi
shing Company,New York,ニューヨーク（1978）の章タ
イトル「ラジオイムアッセイおよびその関連技術への手
引き（An Introduction to Radioimmune Assay and Rel
ated Techniques）」を特に参照のこと（これらを引用
して本発明に包含させる）。
本発明のポリクローナル抗体（および特に領域−特異
的ポリクローナル抗体）はさらに、「２点」または「サ
ンドウィッチ」検定としても知られているイムノメトリ
ック（immunometric）検定に利用するために使用するこ
とができる。代表的なイムノメトリック検定では、未知
量の標識されていない抗体を、試験する液中において不
溶性である固相に結合さえ、固相抗体、抗原、および標
識化抗体の３つから形成される複合体の検出および／ま
たは定量を可能とする標識物を担う未知量の可溶性抗体
を加える。
代表的なイムノメトリック検定には、固相に結合した
抗体をまず試験すべき試料と接触させ、２つの固相抗体
−抗原複合体の形成によって試料から抗原を抽出する
「前」検定（“forward" assay）がある。適当なインキ
ュベート時間経過後、固体支持体を洗浄し、未反応の抗
原を含有する液試料の残りを除去し、次いで要すれば、
未知量の標識化抗体を含有する溶液と接触させる。標識
化抗体が標識されていない抗体を介して固体支持体に結
合した抗原と複合体化するのを許容する２回目のインキ
ュベート時間経過後に、その固体支持体を別の時点で洗
浄し、反応していない標識化抗体を除去する。このタイ
プの前サンドウィッチ検定は、抗原が存在しているか否
かを測定する試料「イエス／ノー」検定であり得、また
はこの検定により、標識化抗体の測定値と、既知量の抗
原を含有する標準試料から得られた値とを比較すること
によって定量することができる。これらの「２点」また
は「サンドウィッチ」検定は、ワイド（Wide）の「Radi
oimmuno Assay Method」Kirkham and Hunter,E. ＆ S.L
ivingstone,エジンバラ,1970で説明されている。
さらに、本発明の抗原を用いると有用である他のタイ
プの「サンドウィッチ」検定では、いわゆるあ「同時」
および「逆」検定が使用される。同時検定は、固体支持
体に結合した抗体および標識化抗体の両者を試験する試
料に同時に加える単回インキュベーション工程が関連し
ている。このインキュベーションが完了した後、固体支
持体を洗浄して残りの液試料および複合体化していない
標識化抗体を除去する。次いで、通常の「前」サンドウ
ィッチ検定の場合のように、固体支持体に伴う標識化抗
体の存在を測定する。
逆検定では、まず、標識化抗体の溶液を液試料に徐々
に加え、次いで固体支持体に結合した標識されていない
抗体を適当なインキュベーション後に加える。さらにイ
ンキュベーションした後、常法によって固相を洗浄し、
残った試験する試料および反応していない標識化抗体の
溶液からそれを取り出す。次いで、固相に伴われた標識
化抗体の測定を、同時および前検定のようにして行う。
既述したように、抗原についてのイムノメトリック検
定では、特定の結合性分子を「レポーター分子」で標識
する必要がある。これらの既述したレポーター分子また
は標識物は、当業者には普通であり、周知である。本発
明を実施する上で、酵素標識物が好ましい実施態様であ
る。考えられるあらゆるイムノメトリック検定における
標識物としての使用にとって理想的である単一酵素はな
い。それよりも、いずれの酵素が特定の検定システムに
適当であるかどうかを確認しなければならない。酵素の
選択に当たって重要な基準は、純品酵素の回転数（ター
ンオーバー数）（単位時間当たりの酵素部位当たり、産
物に変換する基質分子の回数）、酵素調製物の純度、そ
の産物の検出感度、酵素反応の検出容易性およびそのス
ピード、試験液中における妨害因子または酵素様活性の
不存在、酵素およびそのコンジュゲート体の安定性、酵
素およびそのコンジュゲート体の入手可能性および値段
などである。本発明のイムノメトリック検定において標
識物として使用される酵素の中には、西洋ワサビペルオ
キシダーゼ、アルカリホスファターゼ、β−ｄ−ガラク
トシダーゼ、ウレアーゼ、グルコースオキシダーゼ、グ
リコミラーゼ、炭酸脱水酵素、アセチルコリンエステラ
ーゼ、リゾチーム、マレートデヒドロゲナーゼ、および
グルコース−６−ホスフェートデヒドロゲナーゼなどが
ある。ウレアーゼは、特にこの活性が肉眼で容易に視覚
化せしめる色素原のpHインジケーターに基づいて、好ま
しい酵素標識物の中の１つである。
当業界周知の方法によって、本発明の抗体を標識する
ことができる。代表的な方法は、ケネディー（Kennedy,
J.H.）らのClin.Chim.Acta 70:1−31（1976）、および
シュールズ（Schuurs,A.H.W.H.）らのClin.Chim.Acta 8
1:1−40（1977）に記載されている。この後者で言及さ
れているカップリング法はグルタルアルデヒド法、過ヨ
ウ素酸塩法、ジマレイミド（dimaleimide）法、ｍ−マ
レイミドベンジル−Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエス
テル法である。これらすべての方法は引用によって本発
明に包含されている。
VI.本発明のトランスフェクト細胞の調製 付加的な遺伝子配列を細胞にインビトロ導入してトラ
ンスカリオチック細胞を調製する（第１図）。このよう
な配列がトランスフェクト細胞の染色体に組込み、また
は染色体外プラスミドとして複製可能である場合、その
細胞は導入された遺伝子配列の発現を指令する永久能力
を獲得することができる。このような細胞を「安定にト
ランスフェクト」されていると言う。このような細胞は
導入遺伝子配列を発現する永久能力を獲得しているの
で、所望の遺伝子産物またはエフェクター遺伝子産物を
長期にわたって産生できる能力を受容対象に供給したよ
うな場合には、安定なトランスフェクト細胞を使用する
のが好ましいであろう。
さらに、所望の遺伝子配列またはエフェクター遺伝子
配列が細胞の染色体に組み込まれていないか、または染
色体外複製しないトランスフェクト細胞を使用すること
もできる。このような細胞は所望の遺伝子配列を発現す
る能力を一時的にしか維持しない。一時的にしか所望の
遺伝子配列を発現しない遺伝子配列を有する細胞を「一
時的トランスフェクト」と呼ぶ。このような一時的発現
のレベルは、所望の遺伝子配列またはエフェクター遺伝
子配列のコピーをさらにトランスフェクト細胞に供給す
ることによって増大させることができる。したがって、
一時的および安定なトランスフェクト細胞の両者共に、
このような配列を実質的なレベルで発現することができ
るが、安定にトランスフェクトされた細胞は、一時的ト
ランスフェクト細胞よりも、長い時間、所望の遺伝子配
列またはエフェクター遺伝子配列を発現することができ
る。実際のところ、細胞に導入できる（一時的トランス
フェクト）遺伝子配列のコピーの数が、安定に維持でき
るコピーの数よりも多いならば、その一時的トランスフ
ェクト細胞は安定な感染細胞で得られるよりも高いレベ
ルの発現を示すであろう。したがって、短時間の発現を
望む場合、または安定なトランスフェクト細胞を使用し
て得られるものとは異なった発現レベルを得たい場合に
は、対象内には一時的トランスフェクト細胞を使用する
のが好ましい。
安定なトランスフェクト細胞を得るためには、ウィグ
ラー（Wigler,M.）らの（セル（Cell），11:233（197
7））の方法を利用すればよい。この方法によれば、
（所望の遺伝子配列またはエフェクター遺伝子配列を含
有する）DNA懸濁液を複合体化し、リン酸カルシウムを
使用して小さい沈澱物にする。これらの沈澱物を、組織
培養皿（37℃）中で増殖している単層の細胞に加える。
好ましくは、所望の遺伝子またはエフェクター遺伝子
を単離し、細胞と共にインキュベートする前にプラスミ
ドにクローンする。しかし、異なる遺伝子配列をそれぞ
れ含有するプラスミドの分画していない採取物、または
所望の遺伝子配列もしくはエフェクター遺伝子配列のみ
と共にその細胞をインキュベートすることもできる。分
画していないプラスミドを使用する場合、所望の遺伝子
配列を含有し、発現する細胞に関し、得られたトランス
フェクト細胞をスクリーニングするのが望ましい。次い
で、対象受容体に導入する前に、既知の常法によって他
のトランスフェクト細胞からこのような細胞を精製する
のが好ましい。細胞培養の方法は、フレッシュネイ（Fr
eshney,R.I.）（Culture of Animal Cells,A Manual of
Basic Techniqueにおいて）（Aln R.Liss,Inc.,ニュー
ヨーク55−78頁（1983）、およびランバート（Lambert,
K.J.ら）（Animal Cell Biotechnology,1巻，スピアー
（Spier,R.E.）ら編，アカデミック・プレス・ニューヨ
ーク,86−122頁（1985））によって包括的に開示されて
いる（これらは引用によって本発明に包含させる）。
安定なトランスフェクト細胞を同定するためには、一
般には、トランスフェクト細胞の全培養物からこのよう
な細胞をスクリーニングするか、または選択することが
必要である。したがって、トランスフェクト細胞を、そ
の細胞に選択特性を付与できる別の遺伝子配列と共に共
トランスフェクトすることが望ましい。この別の配列
は、異なる分子に存在するものであってもよいし、また
は所望の遺伝子配列を有する分子と結合することもでき
る。この第２の配列によって付与される選択特性として
は、たとえばG418などの薬物耐性、またはヒポキサンチ
ンもしくは８−アザグアニジンなどの代謝産物の存在下
における、またはチミジンなどのヌクレオチドの不存在
下における増殖能などが挙げられる。チミジンキナーゼ
遺伝子の発現が障害を受けているトランスフェクト細胞
を使用し、そして第２の選択可能な遺伝子配列として単
純ヘルペスウイルスのチミジンキナーゼ遺伝子を使用す
ることが好ましい。選択特性の安定な発現を示すトラン
スフェクト細胞を調査し、所望の遺伝子配列をも発現し
ているか否かを確認する。この調査は、このような発現
に由来するタンパク質産物を検定することによって行わ
れる。当然ながら、使用する特定の検定法は、タンパク
質産物の性質および機能に応じて異なるものである。
安定または一時的なトランスフェクション反応の操作
法は当業界で周知である［パスラー（Pasleau,F.）らの
ジーン（Gene）38:227−232（1985）；コップチック（K
opchick,J.）らのDNA ４:23−31（1985）；ロパタ（Lop
ata,M.A.）らのNucleic Acid Research 12:5707−5717
（1984）；ギンヘング（Gynheung,A.）らのMol.Cell Bi
ol. ２:1628−1632（1982）］（これらは引用によって
本発明に包含される）。
一時的トランスフェクション実験を行う場合には、所
望の遺伝子配列またはエフェクター遺伝子配列を含有す
るDNA10−50μｇを細胞５×105−５×106に供給するの
が好ましい。安定なトランスフェクション実験では、所
望の遺伝子配列またはエフェクター遺伝子配列を含有す
るDNA1−20μｇを細胞５×105−５×106に供給するのが
好ましい。選択特性を付与する遺伝子配列が所望の遺伝
子配列を含有する分子と同じ分子上にないならば、別個
にそれを細胞に供給しなければならない。この場合は、
この遺伝子配列を受容細胞５×105−５×106当たり1.0
−100μｇを供給するのが好ましい。トランスフェクト
した後、得られたトランスフェクト細胞を増殖させ、次
いで受容対象をそれぞれに105−1010細胞を供給する。
受容体に導入された細胞の数は、所望の遺伝子またはエ
フェクター遺伝子の産物の発現、産物の回転速度、およ
び所望の程度の生理学的活性に要する産物量などの基準
に応じて測定される。
本発明のトランスフェクト細胞は、受容対象の腹膜
腔、または皮内（subdrmally）（すなわち、皮下または
筋肉下）、皮内、筋肉内のいずれに導入することによっ
ても、受容対象に導入することができ、好ましくは腎を
取り囲む被膜に被膜下移植物を挿入することである。さ
らに、頭蓋内移植、または肝内、静脈内、腹腔内、肺
内、眼内、睾丸内、内蔵内手段によっても導入すること
ができる。導入は、注射または移植によって行うことが
できる（すなわち、細胞における導入部位からの拡散能
または移動能が制限されている場合である）。好ましい
態様では、移植は腎の被膜下であり、あるいは、受容体
から容易に回収でき、研究できる移植物も同様に好まし
い。
本発明は、細胞が（１）導入遺伝子配列を享受し、発
現でき、また（２）インビトロ培養でき、受容対象に再
導入できる限りは、数多くの別種の組織から誘導された
トランスカリオチック細胞を用いて実施することができ
る。たとえば、本発明は、線維芽細胞（フィブロブラス
ト）、筋細胞、肝細胞、腎被膜細胞、内蔵の内皮細胞、
上皮細胞、下垂体細胞などを使用して行うことができ
る。本発明は、一次細胞またはトランスフェクト細胞の
いずれを使用しても実施することができる。好ましいタ
イプの細胞としては、マスウＬ細胞、腎被膜細胞、およ
びAtT−20細胞などが挙げられる。しかし、トランスフ
ェクト細胞としてはフィブロブラスト細胞を使用するの
が最も好ましい。トランスカリオチック細胞に対する受
容対象のあらゆる免疫反応を最小限にしたいならば、受
容対象の種と近縁の種由来の細胞を使用するのが望まし
く、受容対象と同一の種由来の細胞を使用するのが好ま
しい。免疫応答を回避するには、予め受容対象自身から
得ておいた細胞を使用するのが最も好ましい。あるい
は、受容対象の反応またはトランスカリオチック移植物
の破壊を防ぎ、または減じる程に十分な投与量の免疫抑
制剤（たとえば、デキサメタゾン、または抗−胸腺細胞
抗血清）を受容対象に投与してもよい。さらに、免疫応
答を刺激（たとえば、抗体産生を誘発）したいならば、
同種または別種いずれかの安定または一時的なトランス
フェクト細胞を含有するトランスカリオチック移植物を
導入すればよいであろう。
このように、本発明は、組織培養細胞または器官外移
値（organ explant）由来の一次細胞のインビトロ培養
から始まる。次いで、所望の遺伝子配列またはエフェク
ター遺伝子配列を、細胞への吸着を許容する条件下にお
いて、該細胞の存在下にインキュベートする。次いで、
種々のあらゆる手段によって、得られらトランスフェク
ト細胞を受容対象に導入することができる。次いで、受
容対象内に一旦導入されれば、トランスフェクト細胞に
インビトロ導入された遺伝子配列が発現され、受容対象
に所望の遺伝子産物が供給される。
以下の実施例では、ヒト成長ホルモンまたはインシュ
リンを発現するトランスフェクト細胞を使用した。しか
し、本発明はこのようなトランスフェクト細胞の使用に
は限定されないと考えられ、むしろ、受容対象内であら
ゆる遺伝子を発現できるあらゆるトランスフェクト細胞
の使用をも包含するものである。さらに、使用すること
のできた他の遺伝子としては、ホルモン、酵素、抗体な
どの遺伝子を挙げることができる。
さらに、以下の実施例で使用したフィブロブラストお
よび下垂体細胞は、受容対象として使用した特定のマウ
スから誘導したものでないが、その受容対象自身から誘
発されたトランスフェクト細胞を使用することもでき
る。以下に記載の実験は、遺伝学的に操作した細胞を移
植するための幾つかの部位が満足のいくものであり、受
容対象に運搬した後では、このような細胞が活発に機能
できることを示している。
トランスフェクト細胞を皮膜下移植した受容対象マウ
スの成長が、少なくとも移植後７日間で、対照マウスよ
りも急速に成長することが見いだされたので、ヒト成長
ホルモンを使用することは実際上意義がある。したがっ
て、トランスフェクト細胞の投与により、生理学的に意
義のあるレベルで発現されたことにある。このような移
植は、新生児の動物の迅速成長を促進するのに使用する
ことができる（免疫抑制療法を行わないために、トラン
スフェクト細胞に対して動物を寛容にする必要があるか
もしれない）。同様に、インシュリンの発現も、生理学
的に意義があることが見いだされた。
本発明を概略説明したが、本明細書に記載した特定の
実施例の引用は本発明を単に説明するためのものであっ
て、特記しない限り、本発明の限定を意図するものでな
いことは理解されるであろう。
実施例１ ヒト成長ホルモン遺伝子を含有するトランス
フェクト細胞の形成 A.一時的にトランスフェクトされた細胞（一時的トラン
スフェクト細胞）の形成 培養マウスLtK-線維芽細胞を、プラスミドpXCH5と一
緒に、線維芽細胞がそれを取り込む条件下で培養した。
プラスミドpOGHの誘導体であるプラスミドpXGH5はマウ
スメタロチオネイン−Ｉ（mMT−Ｉ）プロモーター領域
と融合したヒト成長ホルモン遺伝子を含有している。こ
のプラスミドは同時係属中の米国特許出願No.896,483に
記載されている。プラスミドpOGHはAmerican Type Cult
ure Collection,Rockville,Marylandに、受託番号ATCC
67180の下で寄託されている。プラスミドによるトラン
スフェクションはロパタら（Lopata,M）の方法に従っ
た。
B.安定なトランスフェクト細胞の形成 安定なトランスフェクト細胞を生産するために、マウ
スLTK-（チミジンキナーゼ欠損）線維芽細胞をプラスミ
ドpXCH5と単純性疱疹ウイルス（単純ヘルペスウイル
ス）のチミジンキナーゼ遺伝子とによるコトランスフェ
クションに付し、HAT耐性細胞系統（セルライン）をヒ
ト成長ホルモンの発現に関して分析した。安定なトラン
スフェクションはウイグラーら［Wegler,Cell,11:223
（1977）］の方法に従って行われた。ヒト成長ホルモン
発現物を産生していることが分かった一個の細胞系統を
LtK+GHと命名した。
実施例２ 一時的なトランスフェクト細胞の腹腔内移植 実施例1A記載の方法に従って一時的なトランスフェク
ト細胞を得た。pXCH5DNAでトランスフェクトした４日後
にLtK-受容細胞をチプシン処理（typsinize）し、ペレ
ット化し、りん酸緩衝化食塩水に再懸濁し、10匹のC3H
マウス群に腹腔内注射した。これらのマウスは培養LtK-
細胞系統の供給源と同一種であった。各動物に約２×10
7細胞を導入した。移植後３時間以内に、ヒト成長ホル
モンが受容体マウスの血清中に現れた。血清中のヒト成
長ホルモン濃度は翌日中に低下し始め（平均値45.1mg/m
l）、移植後４日目にホルモンをようやく検出できる程
度になった（平均値0.6mg/ml）。この実験結果は第２図
に点線で示されている。この実験は、一時的なトランス
フェクト細胞のトランスカリオチック移植によって、移
植後４日間（トランスフェクション後約５−８日に相
当）、受容体マウスの血清中にタンパク質生産を引き起
こし得ることを示すものである。移植された細胞は、受
容体の有する該細胞へのなんらかの不活化作用または排
斥作用によってヒト成長ホルモンの生産を停止する。
実施例３ 安定なトランスフェクト細胞の腹腔内移植 実施例1B記載の方法に従って安定なトランスフェクト
細胞を得た。LtK-GH細胞系統から得た細胞を10匹のC3H
マウス群に腹腔内注射し、血清中のヒト成長ホルモンを
測定するために、移植後の様々な時期に数回、採血し
た。この実験の結果は第２図に実線で示されている。こ
れらの実験において、移植細胞の機能上の完全性（健全
性）を３期に分けることができた。実施例２の一時的な
トランスフェクト細胞においては、血清中ヒト成長ホル
モンは移植後３時間以内に検出され、続く２日間の内に
迅速に減少し始めた（“外傷期”）。次いで、血清中の
ヒト成長ホルモン濃度は７日目までに劇的に増大した
（“順応期間（日）”）後、15日目には辛うじて検出さ
れる程に減少した（消失期）。
一時的なトランスフェクト細胞および安定なトランス
フェクト細胞の移植の比較は、移植当初数日間における
ヒト成長ホルモン発現の停止の原因がおそらく、細胞操
作による損傷作用と腹腔内での細胞の増殖条件とが重な
って細胞が死ぬことにあることを示唆していた。安定な
トランスフェクト細胞はこの初期ショックから回復する
が、一時的なトランスフェクト細胞は、その一時的なト
ランスフェクション処理において、細胞がそれ以後に外
傷を受けた際の生存を危うくされているために回復しな
い。順応期間中には、ヒト成長ホルモンの生産に反映さ
れているように、生存細胞は増殖している。第７日目以
降のイト成長ホルモンの減少は移植された細胞が本来、
長期的に生存し得ないものであるからというよりは、む
しろ受容体の移植に対する応答によるものと思われる。
実施例４ トランスフェクト細胞の発現および長寿に及
ぼす移植部位の影響 トランスフェクトされた細胞の発現および長寿に対す
る移植部位の影響を決定するために実施例1B記載の如く
にして得られた安定なトランスフェクト細胞をC3Hマウ
スの様々な部位に皮下移植した。動物あたり約２×107
細胞を導入した。この実験の結果を第３図に示す。皮下
移植されたトランスフェクト細胞は10日目までヒト成長
ホルモンを産生することが分かった（第３図、実線、三
角）。血清中のヒト成長ホルモン濃度は移植後第１日目
から着実に低下し、腹腔内移植の際に見られた順応期
は、皮下移植においては認められなかった。同様のパタ
ーンは、腎被膜下に移植した細胞についても認められた
（第３図、実線、丸）。破線は被膜下移植における結果
を移植細胞数いついて標準化して示したものである。こ
の実験では各動物を３×106細胞で感染させた。移植後
７日目までは、これらの移植物による血清中成長ホルモ
ンの生産は殆んどなかった。皮下移植物を摘出し組織学
的研究に付した。被膜下移植物中にはヒト成長ホルモン
陽性に染色される細胞が存在しており、腎プレンキマ
（praenchyma）の形態学は正常であることが分かった。
ヒト成長ホルモンの働き（あるとすれば）と移植細胞の
生存に関する対照として、トランスフェクトされていな
いLtk-細胞をも被膜下移植した。これらの細胞の死は被
膜下に移植したトランスフェクト細胞のそれと同一であ
った。
体内の様々な部位における移植細胞のヒト成長ホルモ
ン産生能力の相違には、種々の因子が関与している。移
植部位が多いことは、生きるための栄養物の細胞への供
給によって細胞の生存性と循環系に取り込まれるヒト成
長ホルモンの量の両者に影響を及ぼし得る。細胞が受け
る静水圧も腎被膜下の移植−−細胞、例えば、おそらく
腹腔内よりも有意に高い静水圧下にある、の機能化に影
響を及ぼしたであろう。細胞は幾つかの部位によりよく
付着し、最終的には免疫系細胞による相対的な監視によ
ってヒト成長ホルモンの量が左右されたであろう。
実施例５ 移植細胞の状態 上記のごとく、プラスミドpXGH5はマウスのメタロチ
オネイン−Ｉプロモーターを含有している。移植細胞が
それらの局所環境に応答するのに十分な程度に健常であ
るか否を決定するために、高レベルのヒト成長ホルモン
の発現を誘導する亜鉛の能力を調べた。実施例1B記載の
ごとくにして調製した、安定なトランスフェクト細胞を
マウス（その内、数匹は76mM ZnSO4を飲料水から摂
取）の腹腔内に移植した。亜鉛処理動物の血清中には、
未処理動物と比較してヒト成長ホルモンが10倍多く発現
された。この実験の結果を第４図に示す。この誘導はメ
タロチオネイン融合遺伝子に関して以前に報告された結
果に匹敵しており［シールら（Searle,P.F.）、Molec.C
ell Biol.、５:1480〜1488（1985）；セルデンら（Seld
en,R.F.）、Molec.Cell Biol.、６:3173〜179（198
6）］、細胞が腹腔内環境にも応答し得ることを示すも
のであった。また、被膜下移植物から回収した細胞から
調製したRNAは正しく、mMT−I/ヒト成長ホルモン融合mR
NAを含有していた（第５図）。これらの実験は総合的
に、移植細胞が健常であって予測した行動をとることを
強く示唆している。実質的に重要な点は、一度動物に移
植された細胞を外的手段でなおも変調（モデュレート）
し得るという事実である。この結果は、臨床面で所望の
遺伝子産物またはエフェクター産物の発現を薬学的な作
用を介して変調し得ることを強く示唆している。
受容対象の血清中にヒト成長ホルモンが検出されれ
ば、常にトランスフェクトされた細胞の存在を検出でき
る。例えば、移植後１〜７日間、腎被膜下にヒト成長ホ
ルモン産生細胞が観察された（肉眼または光学顕微鏡に
よる）。血清中のヒト成長ホルモンが消失した時点で、
移植細胞は検出されなくなった。ヒト成長ホルモンが一
度血清から消失すると、移植細胞が再び検出されること
はなかった。しかも、ヒト成長ホルモンを発現している
（トランスカリオチック移植により）マウスから被膜下
移植にかかる腎臓を摘出すると、腎摘出後数時間以内に
そのような発現の痕跡がすべて消失した。トランスフェ
クト細胞は腹腔内および皮下の移植部位に止まっている
ようであった。これらの知見はヒト成長ホルモンの発現
の停止が移植細胞の分解によることを示唆している。
実施例６ トランスカリオチック移植における免疫系の
役割 ヒト成長ホルモンの血清中濃度は腹腔内移植後７〜15
日の間に厳格な低下を示したことから、この消失期は免
疫系に仲介されていると思われた。トランスカリオチッ
ク移植における免疫系の役割の研究の第１段階として、
あらかじめ安定なトランスフェクト細胞を腹腔内移植さ
れた６匹のC3Hマウス（実施例２記載の10匹のマウスか
ら得た）を、安定なトランスフェクト細胞に再挑戦させ
た。新しいトランスフェクト細胞への第１回の暴露に際
して、これらのマウスでヒト成長ホルモン発現パターン
は15日間持続した（第６図、実線）が第２回目の挑戦の
後には、７日間でヒト成長ホルモンがようやく検出でき
る程になり、９日目までに存在しなくなった（第６図、
破線）。再挑戦マウスの血清中ヒト成長ホルモン濃度に
も順応期が存在しなかった。これらの結果はトランスフ
ェクト細胞に対する宿主マウスのアナメスティック（an
amestic）な応答と一致していた。元々、トランスフェ
クト細胞はC3Hマウスから導かれているが、細胞または
マウスのいずれかが基の細胞系統から樹立された後、ほ
ぼ４個のデケードのコース中に何等かの遺伝的変化を受
け、その結果、もはや完全に相互にシンジェネイックで
なくなったと思われる。平明なアナゲネイック（異種
型）マウス（C57Bl/6;非適合性に基づいて決定した結
果、Ｈ−２と非Ｈ−２の両者を表す）をトランスフェク
ト細胞の腹腔内移植に付すと、それらのヒト成長ホルモ
ン発現パターンは再挑戦したC3Hマウスの発現パターン
と似通っていた（第７図、実線）。第２回目の挑戦の４
日後、アロゲネイック受容体にはヒト成長ホルモンが検
出されなかった（第７図、破線）。これらの実験は、腹
腔内移植後のヒト成長ホルモン発現の停止が主として宿
主の免疫系による細胞の死に起因することを示唆してい
た。
実施例７ 移植物の機能的寿命の延長 トランスフェクトされた細胞が移植拒否反応によって
破壊されるのならば、免疫抑制によって移植物の機能的
寿命が延長されるはずである。この仮説を試験するため
に、安定なトランスフェクト細胞のトランスカリオチッ
ク移植物を移植されたマウスを３種の異なる免疫抑制法
で処した：家兎抗マウス胸腺細胞血清［バルドムスら
（Baldamus,C.A.）、immunol.、110:1532〜1541（197
3）］、デキサメサゾン、およびそれらの混合物。C3Hマ
ウスにヒト成長ホルモンを発現するトランスフェクト細
胞を腹腔内移植した後、免疫抑制処理し、血清中ヒト成
長ホルモンを監視した。抗マウス胸腺細胞血清を投与さ
れたマウス（移植日に関して、−１、１、０、＋１、お
よび＋３日に、マウスあたり0.25ml/日を投与）は、高
い血清中ヒト成長ホルモン濃度を示し、非処理マウスに
比べて約２週間長くヒト成長ホルモンを発現した（表
Ｉ）。デキサメサゾン処理マウスも高められ、延長され
た発現を示し、移植後48日まで血清中にヒト成長ホルモ
ンが検出された。
抗マウス胸腺細胞血清とデキサメサゾンによる２重の
免疫抑制を受けているマウスへの投与は上記のごとくに
して行われた。これらのマウスは３カ月にわたってヒト
成長ホルモンを発現した（表II）。このグループのほぼ
205％で、ヒト成長ホルモン濃度は約500mg/mlに達し
た。長期間に及ぶそのような高レベルの血清中ヒト成長
ホルモンは、しばしば腎摘出術を受けたマウスにとって
致命的であることが分かっており、多くの腹腔表面に広
範囲に分布した新組織のプラークを形成している多数の
トランスフェクト細胞の集合を発見した。腹水中にも生
存細胞が浮遊していることが見い出された。
トランスフェクトされていない腺維芽細胞を注射した
対照C3Hマウスの約20％も同様の細胞増殖を示したこと
から、これらのマウスの研究の死因は腹腔内細胞塊の増
加ではなかった。しかしながら、対照マウスは移植後10
0日間生存した。従って、トランスカリオチック移植を
受けたマウスの死亡は、極端に高い血清中成長ホルモン
濃度に帰された。
実施例８ 免疫抑制マウスにおける被膜下移植物の生存 免疫抑制によって、被膜下移植物のトランスフェクト
細胞によるヒト成長ホルモンの発現が延長されるか否か
を決定するために、腎被膜下にそのような移植物を移植
されたマウスを、ラットの抗マウス胸腺細胞血清とデキ
サメサゾンの併用により処理し、ヒト成長ホルモンの発
現レベルを監視した。移植後約10日目に形成中ヒト成長
ホルモン濃度はピークに達し、続く６日間で下降した
後、２カ月間以上、濃度約５−10mg/mlを維持した。腹
腔内または被膜下細胞移植の１週間後にこれらのマウス
にデキサメサゾンを投与したが、それはデキサメサゾン
投与中止の数週間後まで移植物を生存させた。最終的な
細胞の破壊は移植後すぐに起きたデキサメサゾン感受性
事象と関連していた可能性がある。C3H細胞をデキサメ
サゾン単独による継続処理に付すと、トランスフェクト
細胞は最終的に破壊されたので、破壊に関与しているの
はこの事象のみではなかった。
実施例９ トランスカリオチック移植によるヒトインシ
ュリンの生産 マウスLtk-細胞をチミジンキナーゼ遺伝子とヒトプレ
プロインユリンメッセンジャーRNAを発現するように成
形された融合遺伝子でトランスフェクトした。そのよう
な誘導遺伝子でトランスフェクトされるとマススLtk-細
胞は構成的にプロインシュリンを分泌するが、成熟イン
シュリンを産生することはできない。幾つかのヒトイン
シュリン融合遺伝子、合成ヒトインシュリンメッセンジ
ャーRNAを含有し、ヒトプロインシュリンを分泌する一
個のクローナルライン（クローン細胞系統）（Ltk-In
s）を選択し以後の分析に用いた。
免疫抑制の必要性を打開するためにヌードマウスをlt
k-Ins細胞の受容体として用いた。10匹の各マウスの腹
腔内に約107の細胞を注射し、血清試料を（２時間の絶
食の後）一週間に２〜３回採取した（第８図）。移植の
約一週間後、血清中のグルコース濃度は移植前の値（16
0mg％＋／−標準誤差10mg％）に止まった。第１週およ
び第２週の間にグルコース濃度の急速な減少が認められ
（77mg％＋／−4mg％）濃度は実験の持続中、低いまま
であった。このグルコース濃度の低下と平行して総イン
シュリン濃度は移植前の約17uIU/mlから約60uIU/mlに上
昇した。総インシュリン分析のプロインシュリンとの交
差反応性は20％にすぎないので、これらの動物における
実際のプロインシュリン濃度はこれらの測定に反映され
た濃度よりもかなり高いであろう。これらの結果はトラ
ンスカリオチック移植を、マウスにおける機能的なイン
シュリン遺伝子の伝達および血糖値の低下に使用できる
ことを示している。
実施例10 糖尿病の治療へのトランスカリオチック移植
の利用 糖尿病治療へのトランスカリオチック移植適用の可能
性のモデル実験を糖尿病マウスにLtk-Ins細胞を腹腔内
注射して行った。化学的な糖尿病動物を得るために、C3
Hマウスをストレプトゾトシン（8mg/マウス）で処理
し、（２時間絶食）血清中グルコース濃度を約10および
15日後に測定した。この研究の目的から、腹腔時の血清
グルコース濃度が400mg％またはそれ以上であればその
マウスは糖尿病と判断し、そのようなマウス10匹にLtk-
Ins細胞を腹腔内注入した。家兎抗マウス胸腺細胞血清
およびデキサメサゾンを用いてマウスを免疫抑制した。
移植後１週間以内に、５匹のマウスに劇的な血糖値の低
下が認められた（第９図、実線）。移植後２週間までに
これらの糖尿病マウスは正常の血糖値を回復した。残る
５匹のマウスは、一過性の血糖値の低下を示すか、全く
低下を示さないかのいずれかであり、免疫抑制が必ずし
も個々のマウスに等しく有効とは限らないことを示唆し
ていた（データは記載されていない）。糖尿病マウス対
照は血糖値の低下を示さなかった（第９図、破線）。５
匹の反応した動物群で血糖値は低下し続け、最終的には
これらの糖尿病マウスはトランスカリオチック移植で誘
導された低血糖症によって死亡した。
幾つかの疾患は糖尿病よりも扱い易いことが分かって
おり、糖尿病の遺伝子治療の処方を検索することによ
り、供給されたタンパク質を厳密に刻々（分−分）調節
することが必須でないような症状の治療法が得られる。
例えば、血友病は、遺伝子工学的に操作された細胞によ
って欠損された凝結因子を供給することで治療し得る。
恐らく、因子の濃度範囲およびそれを産生するために用
いる細胞のタイプは糖尿病治療における場合厳格ではな
い。
実施例11 ポリクローナル抗体の取得のためのトランス
カリオチック移植の使用 ヒト成長ホルモンに対する抗体は以下のようにして製
造された。セルデンら［Selden,R.,Molec.Cell Biol.,
6:3173〜3179（1986）］のDEAE−デキストラントランス
フェクション法により約２×107のマウスLtk-細胞をpXG
H5で一時的にトランスフェクトした。トランスフェクシ
ョンの４日後、細胞を洗浄し、トリプシン処理し、C3H
マウスの腹腔に移植した。この処理を２週間後に繰り返
し、動物から毎週採血してELISA用の試料を得た。
実験前にはマウスは検出可能なヒト成長ホルモンに対
する抗体を含有していなかった。一時的トランスフェク
ト細胞投与後２週間以内に５匹のマウスについて抗−hG
H力価（ELISAにより）の平均値は1600に達した。最初の
注射から15日経過後、動物に一時トランスフェクト細胞
の第２投与を与え、その２週間後（即ち、最初の注射か
ら27日後）には平均力価は38,000であった。５匹のマウ
ス全部が抗hGH抗体を産生し、個々の力価は12,800から1
02,400に達した。動物を追加の細胞処理任付さなけれ
ば、抗hGH抗体の力価は徐々に低下し、最初の注射後68
日目までに力価は約4,000であることが認められた。
上記のプロトコールの幾つかの変法も成功裏に用い得
る。例えば、安定なトランスフェクト細胞を（一時的ト
ランスフェクト細胞の代わりに）用いることができる。
トランスフェクトされたLtk-細胞はマウス、モルモッ
ト、およびウサギにおける抗体産生に用いられた。ヒト
成長ホルモン、ヒト成長ホルモン異変体、インシュリン
についての抗体も産生され、プロインシュリン細胞、例
えばAtT−20細胞を別法として用いることもできる。
実施例12 トランスカリオチック移植におけるAtT−20
細胞の使用 AtT−20細胞系統はLAF1マウスの自発性腫瘍から導か
れ、十分に特性化された脳下垂体細胞系統である。これ
らの細胞をXGH5（mMT−I/hGH融合遺伝子を含有するプラ
スミド）およびpKONEO（薬物G418に対する耐性をコード
している遺伝子を含有するプラスミド）でトランスフェ
クトした。安定にトランスフェクトされた細胞のクロー
ナルライン、（AtT−20（meo＋）F6と命名）を以後の分
析のために選択した。この細胞系統は有意量のhGHを発
現し、この細胞はその分泌手段を保持しているので、hG
Hの約2/3が分泌され、残る1/3は分泌顆粒中に残存保持
された。
LAF1マウスの腹腔に約５×106細胞を注射し、血清hGH
濃度の測定のためにこれらのマウスから移植後ほぼ１週
間隔で採血した。移植後最初の数日間、血清中hGH濃度
はかなり低かった（１−3ng/ml）。続く１カ月間、これ
らの濃度は徐々に上昇し、約10ng/mlに達した。
AtT−20（neo＋）F6細胞を用いるhGH発現のパターン
はLtk＋GH細胞（実施例11）を用いた場合のそれと全く
異なっていることは注目に値する。この相異を臨床面で
有利に利用することができる:a.細胞型が異なると性質
も異なる。例えば、AtT−20細胞は環状AMP類似体に反応
してhGHを分泌する。b.細胞型が異なるとトランスカリ
オチック動物内での行動が異なる、即ち、タイムコー
ス、レベル、発現の寿命（長さ）が異なる。
安定的にヒトインシュリンを発現しているAtT−20細
胞を用いて同様の研究を行った。pHINT5（マウスメタロ
チオネイン−I/ヒトインシュリン融合遺伝子）を含有す
る安定なトランスフェクト細胞のクローナルラインを調
製した。ATT−20（neO＋）10aと命名されたこの細胞系
統は適切にプロセッシングされたインシュリンを培地に
分泌した（pHINT5分泌プロインシュリンでトランスフェ
クトされたＬ細胞と対照的に）。ヌードマウスの腹腔に
移植すると、血糖値はpHINT5含有Ｌ細胞と殆んど同様に
減少し、血清中ヒトインシュリン濃度の増加が認められ
た。
実施例13 トランスフェクト細胞調製物の使用による領
域特異的ポリクローナル抗体の生産 タンパク質分子のアミノ末端フラグメントを発現する
トランスフェクト細胞を上記のごとくにして調製し、受
容対象に移植した。受容対象には免疫抑制剤を投与しな
かった。トランスフェクト細胞はタンパク質のアミノ末
端フラグメントを発現した。受容対象内にこのフラグメ
ントが存在することで対象内の非トランスフェクト細胞
による発現したアミノ末端タンパクフラグメントに対す
るポリクローナル抗体の産生を誘発することができる。
このようなポリクローナル抗体は領域特異的である（即
ち、発現されたアミノ末端フラグメント上に存在するエ
ピトープとのみ結合し得る）。
上記と同じタンパク質分子のカルボキシ末端フラグメ
ントをコードしている遺伝子フラグメントを単離し、タ
ンパク質分子のカルボキシ末端フラグメントの生産に用
いる。この細胞を用いて調製物を調製し、受容対象に移
植する。トランスフェクトされた細胞によるカルボキシ
末端フラグメントの発現により受容対象のトランスフェ
クトされていない細胞による、発現されたタンパク質分
子のカルボキシ末端フラグメント上に存在するエピトー
プと特異的に結合し得るポリクローナル抗体の産生が誘
導される。これらのポリクローナル抗体は領域特異的で
ある。
実施例14 ポリクローナルイムノアッセイ 実施例12記載の領域特異的ポリクローナル抗体を様々
に異なるイムノアッセイに用いることができる。例え
ば、タンパク質分子のアミノ末端フラグメントを認識し
得るポリクローナル抗体を固体支持体に結合させること
ができる。実施例12のタンパク質分子を含有する可能性
のある試料を、試料中の任意のタンパク質がポリクロー
ナル抗体と結合するのに十分な時間、固体支持体と一緒
にインキュベートする。タンパク質分子のカルボキシマ
ッタンを認識し得る実施例12記載のポリクローナル抗体
を検出可能に標識し、固体支持体と試料の存在下でイン
キュベートする。カルボキシ末端特異的ポリクローナル
抗体が存在する任意のタンパク質分子（試料中に遊離し
た、または固体支持体と結合した）に結合するのに十分
な時間の後、固体支持体に結合した検出可能の標識され
たポリクローナル抗体の量を測定する。結合したカルボ
キシ末端特異的ポリクローナル抗体は試料中のタンパク
質濃度と正比例する。
当業者にとっては自明のことであるが、上記の領域特
異的ポリクローナル抗体を広範囲に及ぶイムノアッセイ
に使用することができ（即ち、ホモジーニアス、ヘテロ
ジーニアス等々）、本発明はそのような使用をも包含す
ることを意図している。一般に、本発明のポリクローナ
ル抗体は既存のモノクローナル抗体イムノアッセイに適
用することができる。
実施例15 トランスカリオチック移植を用いたハイブリ
ドーマの生産 実施例１−４のいずれかに記載の方法で特定の遺伝子
産物を発現するトランスカリオチック細胞を製造し、受
容体動物に導入する。受容体動物内の発現された所望の
遺伝子産物の存在はこれらの発現された所望の遺伝子産
物と結合し得る抗体を産生する、抗体産生細胞の発現お
よび増殖を刺激する。受容体動物の膵細胞を得、当業者
既知の方法［例えば、ゲルハードらの方法（Gerhard,Eu
r.J.Immunol.,5:720−725（1975））参照］により培養
する。次いで、コプロフスキーら（米国特許No.4,172,1
24）またはコーラー［Kohler,Nature,256:495−497'197
5）］の方法に従って摘出した膵細胞を骨髄腫細胞と融
合させ、所望の遺伝子産物と結合し得るモノクローナル
抗体を産性し得るハイブリドーマ細胞を製造する。
上記のハイブリドーマ細胞の製造方法は抗源分子を必
要とする動物の免疫法に比較して、実質上、幾つかの利
点を有する。上記の新規な方法は抗原分子の最初の精製
を必要としないので、かかる精製が実際的でない場合で
もそれを用いることができる。
上記の方法は所望のモノクローナル抗体を産生する得
られたハイブリドーマ細胞のスクリーニングを容易にす
るために用いることができる。従来のハイブリドーマ技
術では生産したハイブリドーマ細胞をスクリーニングし
て所望のエピトープに対する抗体を産生するハイブリド
ーマ細胞を同定しなければならない。本発明によれば、
抗原遺伝子のフラグメントのみを含有する（従って、抗
原遺伝子のフラグメントのみを産生し得る）トランスカ
リオチック細胞を導入することで、回避することができ
る。トランスカリオチック細胞によって発現されるべき
遺伝子フラグメントを予め選択することによりハイブリ
ドーマ集団の多様化を制限することが可能である。
実施例16 免疫抑制物質の同定のためのトランスカリオ
チック移植の使用 トランスカリオチック移植実験において移植された細
胞と宿主動物がシンジェニックでない場合には免疫能
（免疫コンピーテント）宿主細胞は移植された細胞の拒
否反応を起こすであろう。この拒否反応は、移植された
細胞の産物、好ましくはhGHの分析により監視すること
ができる。しかしながら、トランスカリオチック動物が
免疫を抑制されている場合には、免疫抑制療法に依存し
て拒否反応は遅延、または阻止される。換言すると、血
清中hGH発現の濃度と長さを監視することにより、免疫
抑制療法を定量的に評価することができる。この方法を
用いてシクロスポリン、シクロホスファミド、デキサメ
サドン、家兎抗マウス胸腺細胞抗血清、および抗マウス
胸腺細胞モノクローナル抗体等の幾つかの免疫抑制剤を
研究した。この方法は平易かつ定量的な、現行の免疫抑
制評価法の別法である。
本明細書では、本発明の特定の態様について記載した
が、本発明はさらに改変することができ、また本出願は
一般に、発明の基本思想に従っており、また以下に示す
本願の特許請求の範囲に含まれる前記の基本的な特徴の
応用であり、発明の関与する技術分野において既知また
は通常の実施とされる範囲内での本願の開示内容の発展
を含む、任意の変異、使用、または適用をも包含するこ
とを意図していることは理解されるであろう。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (56)参考文献 特表 昭56−501628（ＪＰ，Ａ) 米国特許4497796（ＵＳ，Ａ) 欧州公開198474（ＥＰ，Ａ１) Ｓｃｉｅｎｃｅ，Ｖｏｌ．232, （1986） Ｐ．824−825

Claims (16)

    (57)【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】（ａ）所望の遺伝子産物をコードする、レ
    トロウイルスDNAを含まない遺伝子配列で、体細胞をイ
    ンビトロで形質転換し、 （ｂ）所望の発現能を有する細胞を選択するため、得ら
    れた形質転換細胞をインビトロでスクリーニングし、 （ｃ）該選択された細胞をインビトロでクローニングす
    る ことにより得られらクローン化された細胞を含む、所望
    の遺伝子産物の受容対象内濃度を変化させるための組成
    物であって、該受容対象が動物である組成物。
  2. 【請求項２】体細胞がヒト細胞である、請求項１記載の
    組成物。
  3. 【請求項３】ヒト細胞が繊維芽細胞、筋細胞、肝細胞、
    腎被膜細胞、腸内皮細胞、上皮細胞、下垂体細胞からな
    る群より選択されるものである、請求項２記載の組成
    物。
  4. 【請求項４】所望の遺伝子産物をコードする遺伝子がホ
    ルモン、酵素、または受容体をコードするものである、
    請求項２記載の組成物。
  5. 【請求項５】所望の遺伝子産物をコードする遺伝子がヒ
    ト成長ホルモンをコードするものである、請求項２記載
    の組成物。
  6. 【請求項６】所望の遺伝子産物をコードする遺伝子がヒ
    トインシュリンをコードするものである、請求項２記載
    の組成物。
  7. 【請求項７】体細胞が、カルシウムリン酸法、マイクロ
    インジェクション法、エレクトロポレーション法、融合
    法、またはDEAEデキストラン法によりインビトロで形質
    転換されることを特徴とする、請求項２記載の組成物。
  8. 【請求項８】形質転換細胞が、受容対象と同一の種の動
    物に由来するものである、請求項２記載の組成物。
  9. 【請求項９】（ａ）エフェクター遺伝子産物をコードす
    る、レトロウイルスDNAを含まない遺伝子配列で、体細
    胞をインビトロで形質転換し、 （ｂ）所望の発現能を有する細胞を選択するため、得ら
    れた形質転換細胞をインビトロでスクリーニングし、 （ｃ）該選択された細胞をインビトロでクローニングす
    る ことにより得られらクローン化された細胞を含む、所望
    の遺伝子産物の受容対象内濃度を変化させるための組成
    物であって、該受容対象が動物であり、得られたクロー
    ン化された細胞がインビボでエフェクター遺伝子産物を
    発現するものである、組成物。
  10. 【請求項１０】体細胞がヒト細胞である、請求の範囲９
    記載の組成物。
  11. 【請求項１１】ヒト細胞が繊維芽細胞、筋細胞、肝細
    胞、腎被膜細胞、腸内皮細胞、上皮細胞、下垂体細胞か
    らなる群より選択されるものである、請求項10記載の組
    成物。
  12. 【請求項１２】エフェクター遺伝子産物をコードする遺
    伝子がホルモン、酵素、または受容体をコードするもの
    である、請求項10記載の組成物。
  13. 【請求項１３】エフェクター遺伝子産物をコードする遺
    伝子がヒト成長ホルモンをコードするものである、請求
    項10記載の組成物。
  14. 【請求項１４】エフェクター遺伝子産物をコードする遺
    伝子がヒトインシュリンをコードするものである、請求
    項10記載の組成物。
  15. 【請求項１５】体細胞が、カルシウムリン酸法、マイク
    ロインジェクション法、エレクトロポレーション法、融
    合法、またはDEAEデキストラン法によりインビトロで形
    質転換されることを特徴とする、請求項10記載の組成
    物。
  16. 【請求項１６】形質転換細胞が、受容対象と同一の種の
    動物に由来するものである、請求項10記載の組成物。
JP63504046A 1987-05-01 1988-05-02 トランスカリオチック移植 Expired - Lifetime JP2802634B2 (ja)

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US4471987A 1987-05-01 1987-05-01
US44,719 1987-05-01

Publications (2)

Publication Number Publication Date
JPH02503265A JPH02503265A (ja) 1990-10-11
JP2802634B2 true JP2802634B2 (ja) 1998-09-24

Family

ID=21933950

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
JP63504046A Expired - Lifetime JP2802634B2 (ja) 1987-05-01 1988-05-02 トランスカリオチック移植

Country Status (12)

Country Link
EP (2) EP0761233A3 (ja)
JP (1) JP2802634B2 (ja)
KR (1) KR0181933B1 (ja)
AT (1) ATE145558T1 (ja)
AU (1) AU632457B2 (ja)
CA (1) CA1341356C (ja)
DE (1) DE3855681T2 (ja)
ES (1) ES2094720T3 (ja)
FI (1) FI895140A0 (ja)
GR (1) GR3022071T3 (ja)
PT (1) PT87363B (ja)
WO (1) WO1988008306A1 (ja)

Families Citing this family (20)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
ATE68013T1 (de) * 1985-07-05 1991-10-15 Whitehead Biomedical Inst Expression von fremdem genetischem material in epithelzellen.
DE3681738D1 (ja) * 1986-10-15 1991-10-31 Battelle Memorial Institute, Carouge, Genf/Geneve, Ch
US6048729A (en) * 1987-05-01 2000-04-11 Transkaryotic Therapies, Inc. In vivo protein production and delivery system for gene therapy
US5650148A (en) * 1988-12-15 1997-07-22 The Regents Of The University Of California Method of grafting genetically modified cells to treat defects, disease or damage of the central nervous system
US6054288A (en) * 1991-11-05 2000-04-25 Transkaryotic Therapies, Inc. In vivo protein production and delivery system for gene therapy
US6692737B1 (en) 1991-11-05 2004-02-17 Transkaryotic Therapies, Inc. In vivo protein production and delivery system for gene therapy
NZ245015A (en) * 1991-11-05 1995-12-21 Transkaryotic Therapies Inc Delivery of human growth hormone through the administration of transfected cell lines encoding human growth hormone, which are physically protected from host immune response; the transfected cells and their production
US5968502A (en) * 1991-11-05 1999-10-19 Transkaryotic Therapies, Inc. Protein production and protein delivery
US6063630A (en) 1991-11-05 2000-05-16 Transkaryotic Therapies, Inc. Targeted introduction of DNA into primary or secondary cells and their use for gene therapy
US6270989B1 (en) 1991-11-05 2001-08-07 Transkaryotic Therapies, Inc. Protein production and delivery
US5641670A (en) * 1991-11-05 1997-06-24 Transkaryotic Therapies, Inc. Protein production and protein delivery
US6670178B1 (en) 1992-07-10 2003-12-30 Transkaryotic Therapies, Inc. In Vivo production and delivery of insulinotropin for gene therapy
US6531124B1 (en) 1992-07-10 2003-03-11 Transkaryotic Therapies, Inc. In vivo production and delivery of insulinotropin for gene therapy
US5591625A (en) * 1993-11-24 1997-01-07 Case Western Reserve University Transduced mesenchymal stem cells
IL113052A0 (en) 1994-03-23 1995-06-29 Rhone Poulenc Rorer Sa Recombinant viruses, their preparation and their use in gene therapy
AU695618B2 (en) * 1994-04-11 1998-08-20 Baylor College Of Medicine Compositions and methods for gene therapy to treat disease
US6485721B1 (en) * 1994-04-25 2002-11-26 Research Development Corporation Of Japan Biologically active substance-secreting hybrid gel
US7923250B2 (en) 1997-07-30 2011-04-12 Warsaw Orthopedic, Inc. Methods of expressing LIM mineralization protein in non-osseous cells
US6300127B1 (en) 1997-07-30 2001-10-09 Emory University Bone mineralization proteins, DNA, vectors, expression systems
CA2667890C (en) 2006-10-31 2015-01-27 Surmodics Pharmaceuticals, Inc. Spheronized polymer particles

Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4497796A (en) 1980-03-26 1985-02-05 The Regents Of The University Of California Gene transfer in intact mammals

Family Cites Families (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
DE2942780A1 (de) * 1979-10-23 1981-05-21 Max-Planck-Gesellschaft zur Förderung der Wissenschaften e.V., 3400 Göttingen Eukaryotische zellen, eukaryotische protoplasten und vielzellige eukaryotische lebende organismen mit einem gehalt an durch lipidvesikel eingebrachter dna, verfahren zu ihrer herstellung von gen-produkten, zur immunisierung und zur behebung genetisch bedingter defekte
US4686098A (en) * 1984-05-14 1987-08-11 Merck & Co., Inc. Encapsulated mouse cells transformed with avian retrovirus-bovine growth hormone DNA, and a method of administering BGH in vivo
WO1986000922A1 (en) * 1984-07-30 1986-02-13 The Salk Institute For Biological Studies Retroviral gene transfer vectors
FI861417A0 (fi) * 1985-04-15 1986-04-01 Endotronics Inc Hepatitis b ytantigen framstaelld med rekombinant-dna-teknik, vaccin, diagnostiskt medel och cellinjer samt foerfaranden foer framstaellning daerav.
ATE68013T1 (de) * 1985-07-05 1991-10-15 Whitehead Biomedical Inst Expression von fremdem genetischem material in epithelzellen.
WO1988001296A1 (en) * 1986-08-14 1988-02-25 The General Hospital Corporation Assay for promoter activity

Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4497796A (en) 1980-03-26 1985-02-05 The Regents Of The University Of California Gene transfer in intact mammals

Non-Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
Ｓｃｉｅｎｃｅ，Ｖｏｌ．２３２，（１９８６） Ｐ．８２４−８２５

Also Published As

Publication number Publication date
PT87363A (pt) 1989-05-31
FI895140A0 (fi) 1989-10-30
PT87363B (pt) 1993-11-30
EP0761233A2 (en) 1997-03-12
ES2094720T3 (es) 1997-02-01
KR890701114A (ko) 1989-12-19
CA1341356C (en) 2002-04-09
AU632457B2 (en) 1993-01-07
JPH02503265A (ja) 1990-10-11
GR3022071T3 (en) 1997-03-31
EP0289034A2 (en) 1988-11-02
EP0761233A3 (en) 1998-07-29
DE3855681D1 (de) 1997-01-09
EP0289034B1 (en) 1996-11-27
KR0181933B1 (ko) 1999-05-01
EP0289034A3 (en) 1990-01-17
ATE145558T1 (de) 1996-12-15
DE3855681T2 (de) 1997-05-28
AU1716088A (en) 1988-12-02
WO1988008306A1 (en) 1988-11-03

Similar Documents

Publication Publication Date Title
JP2802634B2 (ja) トランスカリオチック移植
JP3220752B2 (ja) Ｍｔｓ−１遺伝子により転移性癌の診断
JP3394040B2 (ja) ナトリウム排泄増加性蛋白質受容体ｂの組成物および合成法および使用法
JP2001522241A (ja) 診断方法および試薬
US6210960B1 (en) Nucleic acid encoding a transcription factor, IDX-1
JPH06508688A (ja) グルコースに反応してインシュリンを産生する遺伝子工学的に処理された細胞に関する方法と組成物
JP2007291114A (ja) 膵島新生に関与するｉｎｇａｐタンパク質
JPH06508030A (ja) ヒトすい島グルタミン酸デカルボキシラーゼ自己抗原のクローニング及び発現
JP2002514043A (ja) 内胚葉、心臓、および神経の誘導因子
AU2006200374B2 (en) Modulation of T cell differentiation for the treatment of T helper cell mediated diseases
CN110499328A (zh) 一种tim3人源化小鼠模型的构建方法及其应用
JP2003180381A (ja) 免疫関連疾患の治療のための組成物と方法
JPH10210982A (ja) 新規なタンパク質
US20040248257A1 (en) SPEX compositions and methods of use
US7094400B1 (en) Transkaryotic implantation
JPH06506115A (ja) 新規ベータインテグリンサブユニット
KR19990007992A (ko) 핵전이성 이식용 세포 조성물
DK173137B1 (da) Anvendelse af celler til fremstilling af et implantat til anvendelse ved genterapi, fremgangsmåde til fremstilling af impla
WO2001046415A1 (fr) Polypeptides de type tachykinine et utilisation associee
JP2003527831A (ja) エンドゼピン様ポリペプチドおよびエンドゼピン様ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド
JP2003116560A (ja) 新規なポリペプチド及びそれをコードするポリヌクレオチド
WO2006118313A1 (ja) 新規ポリペプチドおよびその用途
JP2000502248A (ja) 平滑筋細胞由来の移動因子
WO2004024760A1 (ja) 新規タンパク質およびそのｄｎａ
JP2003325187A (ja) 新規タンパク質、そのｄｎａおよびその用途

Legal Events

Date Code Title Description
R250 Receipt of annual fees

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250

R250 Receipt of annual fees

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250

R250 Receipt of annual fees

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250

FPAY Renewal fee payment (event date is renewal date of database)

Free format text: PAYMENT UNTIL: 20080717

Year of fee payment: 10

EXPY Cancellation because of completion of term