KR19990007992A - 핵전이성 이식용 세포 조성물 - Google Patents

Abstract

본 발명은 (a) 목적 유전자 서열을 함유하여, 수용개체에 제공될 경우, 목적 유전자 서열의 발현을 유도함으로써 목적 유전자 산물(Ⅰ)의 생성을 유발하는 형질 감염 세포를 함유하는 형질감염 세포 제제 유효량을 수용개체에 제공함을 포함하고, 여기에서 목적 유전자 서열의 발현은 수용개체의 형질감염되지 않은 세포가 생물학적 화합물을 생성하도록 유도하기에 충분한 방법에 의해 유도된, 목적 유전자 산물(Ⅱ)과 결합할 수 있는 하나 이상의 생물학적 화합물의 존재하에 시료를 배양하는 단계, 및 (b) 상기 목적 유전자 산물(Ⅱ)에 결합된 상기 생물학적 화하물의 측정에 의해 상기 목적 유전자 산물(Ⅱ)의 농도를 결정하는 단계를 포함함을 특징으로 하는, 시료중의 목적 유전자 산물(Ⅱ)의 농도를 결정하는 방법을 제공한다.

Description

핵전이성 이식용 세포 조성물

부모로부터 유전되는 질병을 유전병이라 하다. 적어도 1,500개의 인간 질병들이 유전적으로결정되는 것으로 이미 알려져 있다(브이, 에이, 맥커시크가 지은 인간에 있어서의 멘델의 유전 1971년 3판, 볼티모어의 죤스 홉킨스 프레스 발행). 이들 질병의 대부분에 대한 구체적인 분자학적 원인은 아직 밝혀지지 않았다.

그러나, 많은 경우에 질병의 원인이 특정효소의 결핍이라는 것이 확인되었다(브이, 에이. 맥커시크의 Ann. Rev. Genet. 4:1(1970)).

현재, 전적으로 수용될 수 있는 유전자 치료법은 알려져 있지 않다. 인간의 유전 질병은 보통 식이요법(예:페닐케토뇨증의 환자가 페닐알라닌을 기피하는 것), 약물요법(예:통풍과 레쉬 니한(Lesch-Nyhan)중의 요한 축적을 감소시키기 위해 효소 크산틴 옥시다제(xanthine oxidase)의 억제제(즉, 알로퓨리놀)를 사용하는 것), 또는 유전자 산물 교체 요법(예:혈우병 환자에게 인자 Ⅷ을 투여하는 것)에 의해 치료된다.

불행히도, 많은 유전 질병이 아직 상기의 치료요법들에 의한 효과를 보지 못하고 있다. 예를 들면, 아미노산 대사의 유전적 이상은 일반적으로 식이요법으로 잘 조절될 수 없다. 리소좀 효소 결핍과 관련된 축적 질병(storage disease)은 지금까지도 효소 요법에 의해 효과를 볼 수 없었다. 더우기, 상기 요법들중 하나로 조절될 수 있는 질병에서 조차도 질병 억제가 완전한 경우가 드물다.

상기 기술의 결함에 대응하여, 연구자들은 유전질병의 치료에 재결합 DNA 기술(recombinant DNA technology)을 적용하려는 시도를 하고 있다. 이와 같은 유전자 요법은, 병태생리학적 상태를 개선하도록 환자의 게놈(genome)을 의도적으로 변화시키는 내과/외과적 조정(intervention)이라고 광의로 정의할 수 있으며, 생식세포 유전자 요법(germ line gene therapy) 및 체세포 유전자 요법(somatic cell gene therapy)으로 세분할 수 있다. 윤리적인 면으로나 실사상의 면에서나 모두, 생식세포 계통유전자 요법을 사람에게 시도하는 것은 적합하지 못하다. 윤리적인 관점에서 생식세포의 변형은, 아무리 미약할지라도, 장기적으로는 그 결과를 전혀 예측할 수 없게 인간의 차세대들을 변천시킬 것이다. 이와 반대로, 체세포 유전자 요법은 치료받은 개인에게만 영향을 주므로, 새로운 유전자가 유전자 푸울에는 끼어들지 않을 것이다. 실시상의 관점에서, 생식세포계 유전자 전이는 비교적 비효율적이며, 주입된 유전자의 운명은 예측할 수 없으며, 아마 가장 중요한 문제로서, 단일세포 또는 초기 분열배아의(특정 질병에 관한) 장래의 표현형의 결정은 거의 예외없이 불가능할 것이다.

그러나, 체세포 유전자 요법은 인간의 특정 질병의 처지나 치료에 하나의 타당한 접근 방법인 것으로 보인다. 체세포 유전자 전달 방식(delivery system)에서는 환자의 세포를 떼어 내어 시험관내에서(in vitro) 배양하고, 형질 감염(transfect)시켜 재이식한다.

이런 기본적 방식의 변형은 세포 유형과 세포 제공자(반드시 환자일 필요는 없음), 형질감염 방법(transfection protocol) 및 재이식 부위의 선택이 포함되나 이에 한정되지는 않는다. 개체안으로 DNA를 전달하는 수단으로서의 가능성이 있는 여러 기술들이 지금까지 개발되어 왔다. 주지된 기술로서 역전사 바이러스 백터를 들 수 있다(에이취, 바아머스 등 공저, RNA 종양 바이러스, 바이쓰등 편저, 콜드 스프링 하아버 연구소, 뉴욕(1982); 에이취, 바아머스, 싸이언스, 216:812(1982); 알. 리써 등 공저, Am. Rev. Genet. 17:85(1983)). 이 접근방법에서는, 특정 유전자가 삽입된 역전사 바이러스를 개체내로 도입한다. 역전사 바이러스는 RNA안에 그의 유전 정보를 저장하고 있고, 세포안에 들어가서 DNA로 그 정보를 역전사(따라서, 역(retro)라 명명)하며, 이 정보는 숙주 세포의 게놈에 통합되고 발현된다. 실제로, 관심의 대상인 유전자와 역전사 바이러스 게놈의 일부분(역전사 바이러스가 복제할 수 없도록 일부 유전자들은 제거됨)을 포함하는 재조합 역전사 바이러스는 유전공학적 방법을 사용하여 작제된다. 이 인조 바이러스를 사용하여 시험관내에서 골수 세포를 감염시키고, 이 골수세포를 치명적으로 빛을 조사한 수용체 마우스에 정맥주사하여 골수세포가 궁극적으로 골수나 비장으로 이동하여 가도록 한다. 이런 방식으로, 네오마이신 포스포트랜스퍼라제(디. 에이. 윌리암스 등 공저, 네이춰 310:476-481(1984)), 아데노신 디아미나제(adenosine deaminase)(디. 에이. 윌리암스 등 공저, Proc. Natl. Acad. Sc. USA, 83:2566-2570(1986))과 하이포잔틴 포스포리보실트랜스퍼라제(hypoxanthine phosphoribosyltransferase)(에이. 디. 밀러 등 공저, 싸이언스, 225:630-632(1984))를 암호화하는 유전자가 마우스에서 발현된 적이 있다.

과거 몇 년간, 인간에 대한 역전사 바이어스를 이용한 유전자 전달 방식의 시행은 큰 장애, 주로 역전사 바이러스 자체의 성질에 관련된 장애에 직면할 것임이 분명해졌다(엠. 로버트슨, 네이춰 320:213-214(1986), 제이. 엘. 마르크스, 싸이언스 232:824-825(1986)).

첫째로, 인간 세포를 감염시키기 위해 사용되는 역전사 바아어스 백터내에서는, 포유류 유전자의 발현이 이제까지 일반적으로 불가능했다. 이 문제가 해결될 때까지는 조절된 유전자 발현의 문제는 논의될 수 없을 것이다.

둘째로, 역전사 바이러스는 회분식(in batch)으로 골수세포를 감염시키는 데에 사용되므로, 필수적으로 회분내의 모든 세포를 감염시키고, 역전사 바이러스의 숙주 게놈으로의 통합부위가 세포마다 상이하게 된다. 재도입하기 전에 감염세포를 특정화하지 않으므로 유해한 통합의 가능성을 배제할 수 없다.

셋째로, 감염에 사용되는 복제-불능 역전사 바이러스(replication-deficient retrovirus)와 포유류 게놈에 존재하는 내인성 역전사 바이러스 사이의 재조합이 발생한다고 알려져 있으므로(알. 에이. 호커 등 공저, 네이춰 320:275-277(1986)), 숙주 동물에서 만성적 역전사 바이러스성 감염을 일으킬 잠재성이 있다.

넷째로, 골수는 아마도 치료제로 투입되는 많은(대부분은 아닐지라도) 유전자에 대한 최적의 발현부위가 아닐 것이다.

유전자 요법을 위한 또다른 방법은 바이러스성 기법과는 반대로 화학적 기법에 의해 세포내로 DNA를 도입하는 것이다. 이 방법에서 DNA가 인산칼슘-매개 형질감염(calcium phosphate-mediated transfection)에 의해 수용체내로 도입된다.

일반적으로 수용체 세포는 우선 개체에서 떼어져서 도입하려는 유전자가 함유된 DNA 용액의 존재하에서 배양된다. 유전자가 세포내로 도입된 다음, 세포는 다시 개체에게로 돌려보낸다. 현재, 개체에서 떼내어져 처리되고 재도입될 수 있는 세포들은 골수 간세포(bone marrow stem cells)와 피부 섬유아세포(skin fibroblasts)뿐이다(더블유. 에프. 앤더슨, 싸이언스 226:401-409(1984)). 엠. 제이. 클라인 등은 작용성 디하이드로폴레이트 리덕타아제 유전자(dihydrofolate reductase gene)를 마우스의 골수로 전이시키는데 성공한 것을 공개하였다(Nature 284:422(1982)).

현재, 화학적 기법은 저효율이라는 상당한 단점이 있다. 형질감염은 10⁶-10⁷세포중 하나에서만 일어나다고 알려져 있다. 통상 약 10⁷-10⁸세포만이 골수 이식에 의해 개체로부터 얻어질 수 있으므로, 화학적 기법으로는 10-100개의 간세포(stem cells)가 형질감염될 것이다. 더욱이, 그런 세포를 수일 이상 배양해야 하는 어려움은 이 방법에서의 중요한 한계점이다. 현재로서는, 골수 전체 세포수에 비하여 아주 적은 몇개의 변형된 세포의 존재는 치료적 가치가 거의 없다고 생각되고 있다.

유전자 요법의 세번째의 주요한 방법은 미세주사(micro injection)나 전기천공(electroporation)같은 물리적 기술의 이용이다. 미세주사는 분리된 개개의 세포에 DNA를 주사하는 것이다. 이 기술은 극히 효율적이나, 한 번에 한 개 세포만 주사할 수 있다는 단점이 있다. 이 기술은 수정된 마우스의 난자(mouse egg)에 DNA를 도입하는 데에 가장 성공적이었다(제이. 더블유. 고오든 등 공저, 싸이언스 214:1244(1981); 이. 에프. 와그너 등 공저, Proc, Natl. Aced. Sci., USA 78:5016(1981):티. 이. 와그너 등 공저, Proc. Natl. Acad, Sci., USA 78:6376(1981):알. 디. 팔미터 등 공저, 네이춰 300:611(1982)). 알. 이. 햄머 등은 이 기술을 마우스에서 성장 호르몬의 생성 결핍을 부분적으로 고치는데 이용한 적이 있다(네이춰 311:65(1984)). 전기천공은 전류를 이용하여 세포막을 가로질러 직접 DNA를 이송하는 것이다. 이는 B 림프구(lymphocytes)내로 DNA를 전이시키는데 이용된 적이 있다(이. 노이만 등 공저, EMBO J. 1:841(1982)).

요약하면, 다양한 전통적 및 재조합 기술들이 유전 질병의 치료를 위해 제한되었다. 그러나, 현재 단 하나의 기술도 전적으로 만족스럽지는 못한 것 같다. 바이러스 백터를 사용하는 것은 발암 유발의 잠재성 뿐만 아니라 내인성 유전자들의 재배열의 가능성 때문에 문제가 있다. 물리적 기법은 매우 효율적이나, 현재로서는, 합리적인 치료를 제공하기 위해 형질감염되어야 할 다수의 세포들에 적용될 수 없다. 화학적 기법은 미리 대상 개체로부터 추출된 세포내로 DNA를 도입하는 것이다. 현재 이 기술은 골수 세포와 섬유아세포에 국한되고 있으며, 가능성 있는 치료법을 구성하는데 효율적이지 못하다. 이 분야의 상태에 대해서는 티. 프리드만등(싸이언스 175:949-955(1972))과 더블유. 에프. 앤더슨(싸이언스 226:401-409(1984))에 의해 검토되어져 있다.

항체와 같은 결합성 단백질(binding proteins)은 항원(antigens)이나 합텐(haptens) 같은 특정분자들의 농도나 존재를 측정하는데 널리 이용된다. 항원은 그것이 동물에게 도입됐을 때 그것에 결합할 수 있는 항체를 동물이 생성할 수 있게 해주는 분자이다. 반대로 합텐 분자는 항체에 결합할 수 있지만 항체의 생성을 유발할 수는 없다. 항체(에피토프(epitopes)라고 알려진) 분자의 특정 구조 부위를 인식하여 합텐과 항원 모두에 결합한다. 합텐이나 항원분자는 한 개 이상의 에피토프 부위를 가질 수 있다.

항체 제제는 크게 두 가지로 나눌 수 있다. 다클론성 항체 제제(polycional antibody preparaton)는 동물에게 항원을 주사(또는 달리 제공)함으로써 얻는다.

항원 분자의 존재는 항체 생성 세포(antibody-producing cell)를 자극하여 항원의 에피토프에 결합할 수 있는 항체의 종(species)을 생성시킨다. 상이한 항체 생성 세포는 상이한 항체 분자를 생성할 수 있다. 그리하여, 동물에게 항원을 주입하면, 항원 분자의 에피토프의 각각에 결합할 수 있는 항체들을 포함하는 일련의 서로 항체 다른 분자들이 생성된다. 이러한 제제는 서로 다른 항체 생성 세포들로 부터 생성된 항체들을 포함하므로 다클론성(polycleonal)항체 제제라고 한다.

다클론성 항체 제조방법과 기술에 대한 우수한 개관은 하퍼 앤드 로우 출판사에서 나온 비. 디. 데이비스(B. D. Davis) 저, 마이크로바이올로지 제2판의 352-358 페이지와 매크 퍼블리싱 출판사에서 나온 에이. 오솔(a. Osol)의 레밍톤스 파마슈티칼 사이언시스 제16판의 1315-1351 페이지에서 찾아볼 수 있다.

각 항체 생성 세포가 단지 한 종류의 항체만을 생성할 수 있다는 사실은 매우 중요하다. 그런 각개 세포는 클론으로 정제되어 죽지않는(immortalized) 골수종 세포(myeloma cells)에 융합될 수 있으며, 그 결과 단일 항체 종(species)을 생성할 수 있는 죽지 않는 세포를 생성할 수도 있다. 이런 융합세포는 하이브리도마(hybridoma)세포라 하며, 이것이 생성하는 항체를 단일클론성(monoclonal) 항체라고 한다. 단일클론성 항체를 생성하는 과정은 미합중국 특허 제4,172,124호(에이취. 코프로브스키 등)와 플레넘 프레스에서 알. 에이취. 케네트 등의 공저로 나온 단일클론성 항체, 하이브리도마; 생물학적 분석에 있어서의 새로운 차원에 기술되어 있다.

단일클론성 항체와 다클론성 항체간의 차이는 각각 특이성이나 결합 친화력에 있지 않다. 두 유형의 항체 분자는 모두 항원에 대한 동일한 특이성과 결합친화력을 갖는다. 다클론성 항체 제제는, 대다수가 다른 에피토프에 결합할 수 있는 상이한 항체 종들인 IgG 분자들의 분획되지 않는(unfractionated) 혼합물 또는 정제된 혼합물로 이루어진다. 반대로, 단일클론성 항체 제제는 단일 항체 종만을 함유한다. 단일클론성 항체 제제는 단일 종으로 이루어져 있으므로, 그 제제는(반드시 항체 자체가 그렇지는 않더라도) 다클론성 항체 제제보다 더 큰 특이성을 가질 수 있다.

중요한 사항으로서, 단일클론성 항체 또는 다클론성 항체의 생성을 위해서, 항체 생성 세포에 대하여 상당한 양의 항원을 제공하는 것이 일반적으로 필요하다. 그래서, 일반적으로, 항체 생성을 유발하기 전에 항원 분자를 분리 정제할 필요가 있다. 그러나, 실제로는 특정 항원 분자를 분리 정제하기란 종종 어렵다. 항원 분자가 호르몬, 세포막 단백, 또는 기타 원료 물질에 매우 저농도로 존재하는 분자일 경우, 특히 그러하다. 그래서, 이런 분자들에 대해서는 항체를 얻기가 매우 어렵거나 불가능하다. 그리하여, 항원 분자의 사전 분리 또는 정제를 필요로 하지 않는 항체의 생성 방법이 필요하다.

[발명의 요약]

본 발명은 수용개체내의 목적 유전자 산물의 농도를 변화시키지는 방법을 제공한다.

본 발명은 또한 수용개체의 특정 유전자 발현에 있어서 발생할 수 있는 결핍을 보충하거나, 수용개체의 특정 유전자 발현을 증가시키거나 검소시키는 수단을 제공한다.

상세하게 설명하면, 본 발명은 목적 유전자 서열을 함유하는 수용개체에 제공되면 목적 유전자 서열의 발현을 유도함으로써 목적 유전자 산물의 생성을 유발하는 하나 이상의 형질감염 세포를 함유하는 형질감염 세포 제제를 수용개체에 제공함을 특징으로 하는, 수용개체에서의 목적 유전자 산물의 농도를 변화시키는 방법을 제공한다.

또한, 본 발명은 유도자(effector) 유전자 서열을 함유하여 수용개체에 제공되면 유도자 유전자 서열의 발현을 유도함으로써 목적 유전자 산물의 생성을 유발하는 하나 이상의 형질감염 세포를 함유하는 형질감염 세포 제제를 수용개체에 제공함을 특징으로 하는, 수용개체에서의 목적 유전자 산물의 농도를 변화시키는 방법을 제공한다.

또한, 본 발명은 목적 유전자 서열을 함유하여 수용개체에 제공되면 목적 유전자 서열의 발현을 유도함으로써 목적 유전자 산물(Ⅰ)의 생성을 유발하고 목적 유전자의 발현이 수용개체의 형질감염되지 않은 세포가 생물학적 화합물을 생성하도록 유도하기에 충분한 하나 이상의 형질감염 세포를 함유하는 형질감염 세포 제제를 수용개체에 제공함을 특징으로 하는, 생물학적 화합물의 생성을 유도하는 방법에 관한 것이다.

또한, 본 발명은 다음 단계(a) 및 (b)를 포함함을 특징으로 하는 목적 유전자 산물(Ⅱ)의 농도 결정 방법에 관한 것이다.

(a) 목적 유전자 서열을 함유하여 수용개체에 제공되면 목적 유전자 서열의 발현을 유도함으로써 목적 유전자 산물(Ⅰ)의 생성을 유발하고 목적 유전자 서열의 발현이 수용개체의 형질 감염되지 않은 세포가 생물학적 화합물을 생성하도록 유도하기에 충분한 형질감염 세포를 함유하는 형질감염 세포 제제 유효량을 수용개체에 제공함을 포함하는 방법에 의해 유도된, 목적 유전자 산물(Ⅱ)에 결합할 수 있는 생물학적 화합물의 존재하에 시료를 배양하는 단계.

(b) 목적 유전자 산물(Ⅱ)와 결합한 생물학적 화합물의 양을 측정함으로써 목적 유전자 서열의 농도를 결정하는 단계.

또한, 본 발명은 다음 단계 (a) 및 (b)를 포함함을 특징으로 하는 시료중 목적 유전자 산물(Ⅱ)의 농도를 결정하는 방법을 포함한다:

(a) 목적 유전자 산물(Ⅱ)와 결합할 수 있는 두 개의 상이한 생물학적 화합물의 존재하에 표본을 배양하는 단계(상기 두 개의 생물학적 화합물중 적어도 하나는 목적 유전자 서열을 함유하여, 수용개체에 제공되면 목적 유전자 서열의 발현을 유도함으로써 목적 유전자 산물(Ⅰ)의 생성을 유발하고 목적 유전자 서열의 발현이 수용개체의 형질감염되지 않은 세포가 생물학적 화합물을 생성하도록 유도하기에 충분한 형질감염 세포를 함유하는 형질감염세포 유효량을 수용개체에 제공함을 포함하는 방법에 의해 유도됨)

(b) 목적 유전자 산물(Ⅱ)과 결합한 생물학적 화합물의 양을 측정함으로써 목적 유전자 산물(Ⅱ)의 농도를 결정하는 단계.

본 발명은 또한 다음의 단계(a), (b) 및 (c)를 포함함을 특징으로 하는 면역 억제 활성을 갖는 약제(agent)를 평가하기 위한 방법을 포함한다.

(a) 항원을 발현시키는 형질감염 세포 제제를 수용개체에 도입하는 단계.

(b) 평가 대상 약제를 수용개체에 투여하는 단계.

(c) 약제의 투여가 항원에 결합할 수 있는 항체를 생성하는 수용개체의 능력에 영향을 미쳤는지의 여부를 결정하는 단계.

본 발명은 또한 형질감염 세포를 포하함을 특징으로 하는 이식체를 포함한다.

본 발명은 유전공학적으로 처리된 세포를 수용개체안으로 도입하는 것을 포함하여 유전자 발현수준을 변화시키는 기술과 관련된 것이다. 본 발명은 더아가 그러한 세포에 의해 생성되는 화합물, 특히 항체, 및 그 화합물의 용도에 관련된 것이다.

도 1은 핵전이성 이식의 실시태양을 나타내는 개요도이다. 배양된 세포들은 치료법적으로 관심있는 유전자 및 선택성 표시자(selectable marker)를 발현하는 유전자와 함께 공동 형질감염(co-transfected)된다. 안정적 형질감염 세포(stably transfected cell)는 선택 섭생(selection regimen)에서 살아남는 능력에 의해 입증되는, 표시자 유전자를 발현시킬 능력에 의해 동정된다(표시자 유전자가 들어가지 않은 세포는 이 선택 섭생에 의해 괴멸된다). 안정적 형질감염 세포의 각 집락을 증식시키고 치료학적으로 관심있는 유전자의 발현과 조절에 대해 특성 연구를 한다. 목적하는 발현 특성을 갖는 클론주(clonal line)는 다시 관심있는 유전자의 발현에 대해 특성 연구된 숙주 동물내의 다양한 해부학적 위치중 하나로 도입된다.

도 2는 일시적 형질감염 세포(transiently transfected cell)(점선) 또는 안정적 형질감염 세포(실선)의 복강내 주사를 받은 마우스의 혈류(blood stream)에서 검출된 인간 성장 호르몬의 양을 나타낸다.

도 3은 피하 형질감염 세포(subcutaneous transfected cells)(실선, 삼각형) 또는 피막하 이식(subcapsular implantaion)(실선, 원)으로 형질감염 세포를 받은 마우스의 혈류에 존재하는 인간 성장 호르몬의 양을 나타낸다. 점선은 피막하 핵전이성 이식체(subcapsular transkaryotic implants)에 대한 자료를 이식된 세포수로 정규화한(normalized) 값을 나타낸다.

도 4는 성장 호르몬 유전자 메탈로티오네인-Ⅰ 프로모터(metallothionein-Ⅰ promoter)에 의해 조저되는 형질감염 세포를 갖고 있는 마우스내의 성장 호르몬의 수준에 대한 아연 투여의 효과를 보여준다.

도 5는 피막하 이식체로 부터 회수된 형질감염 세포에서 마우스 메탈로티오네인-Ⅰ/인간 성장 호르몬 mRNA의 검출을 보여준다.

도 6은 미리 핵전이성 이식체를 받은 수용개체 마우스내의 안정적 형질감염 세포의 이식후 날짜의 함수로서 인간 성장 호르몬의 수준을 보여주다.

도 7은 이질 유전자성 마우스(allogeneic mice)에서 형질감염 이식체에 의해 발현된 성장 호르몬의 수준(실선)을 보여준다. 점선은 뒤이은 2차 이식후의 성장 호르몬의 발현을 나타낸다.

도 8은 작용성 인슐린 유전자(functional insulin genes)를 정상 마우스와 당뇨병 마우스에 핵전이성 인식을 이용하여 전달한 것을 보여준다. Ltk⁺Ins 세포주는 마우스 메탈로티오네인-Ⅰ/인간 인슐린 융합 유전자(human insulin fusion gene)(초기(inset)) 공동-형질감염한 후 선택되었다. 약 10⁷개의 Ltk⁺Ins 세포를 10마리의 누드 마우스에 복강내 주사하였다. 마우스는 형질감염후 지시된 날에 2시간 단식시킨 후 채혈했다. 혈당량(실선)은 제조업자(워딩톤, Worthington)가 추천한 대로 결정되었고 평균과 표준편차선이 도시되어 있다. 평균 혈자 인슐린 수준(점선)은 마우스로부터 혈청표본을 모아 결정하였고, 제조업자(다이아그노스틱 프로덕츠, Dignostic Products)가 추천한 대로 시행되었다.

도 9는 핵전이 이식이 인슐린을 생리학적으로 의미있는 수준으로 공급할 수 있는 능력을 보여준다. 10마리 C3H 마우스가 면역억제되고 상기한 바와 같이, 복강내 주사를 받았다. 마우스의 2시간 단식 후 채혈하여 혈당량을 검사했다. 5 마리의 마우스는 혈당량이 지속적으로 감소됨을 보였고(실선), 궁극적으로 저혈당증이 되었다. 핵전이성 이식을 하지 않은 5마리의 당뇨병 마우스군의 혈당량은 대조군으로서 측정했다(점선).

본 발명의 조성물과 방법은 두가지 다른 방식으로 이용될 수 있다. 첫 번째 태양에서, 그 조성물과 방법의 목적은 수용개체에 유전자 요법을 제공하는 것이다. 두 번째 태양에서, 조성물과 방법의 목적은 형질감염 세포에 의해 생사된 화합물의 존재에 반응하여 수용개체가 특이적 생물학적 화합물을 생성하도록 유도하는 것이다.

Ⅰ. 본 발명의 용어

본 발명은 수용개체에서 목적 유전자 산물의 농도 변화를 일으키게 하기 위한 새로운 방법을 제공한다. 이런 변화는 목적 유전자 서열 또는 유도자 유전자 서열중 하나를 수용개체안으로 전달하는 형질감염 세포의 도입을 포함한다. 본 발명에 맞게 이용되기 위해서는, 도입된 목적 유전자 서열이 수용개체에서 발현될 수 있어야 한다. 도 1은 핵전이성 이식의 개요도이다.

본 발명을 적용할 수 있는 수용개체는 인간 뿐만 아니라 동물들을 포함하는 것으로서, 여기에 쓰이는 수용개체라는 용어는 목적하는 유전자를 함유하는 형질감염 세포의 수용체를 말한다.

본 발명에 있어서, 형질감염 세포는 시험관에 처리됨으로써 수용개체에서의 발현이 요구되는 특정 유전자를 갖고 있는 세포를 말한다. 그래서, 예를 들면, 특정 개체에서 성장 호르몬 유전자를 발현시킬 필요가 있으면, 수용 개체에 도입되면 성장 호르몬 유전자를 세포가 발현시키도록 그 세포내로 성장 호르몬 유전자를 도입한다(그에 따라 형질감염 세포를 형성한다).

전형적으로, 반드시 그럴 필요는 없지만, 이런 유전자 서열은 수용개체가 속한 종(species)의 정상적 유전자 서열과 동일하다. 그리하여, 동물에게 추가적 성장 호르몬을 제공할 필요가 있으면, 그 동물의 성장 호르몬 유전자를 갖는 형질감염 세포, 또는 대체물로서, 그 수용개체에서 발현될 수 있는 다른 종의 호르몬 유전자를 갖는 형질감염 세포를 사용할 수 있다.

이러한 형질감염 세포를 갖는 수용개체를 핵전이성 수용개체라고 말한다.

핵전이 동물은 유전자 전이(transgenic) 동물과는 본질적으로 다르다. 유전자 전이 동물에서는 모든 세포가 동일한 종의 다른 동물에서 자연적으로는 나타나지 않는 유전자 서열을 갖는다. 핵전이 동물에서는 형질감염된 세포만이 그런 서열을 가지며, 동물 세포의 거의 대부분은 변화가 없다. 그러므로, 유전자 전이 요법은 각 동물세포의 유전자 정보를 변화시키는 방식으로 동물의 생식세포 계통(germ line)을 변화시킨다. 반대로, 핵전이 요법은 체세포에 관한 것이므로 동물세포의 유전자 정보를 변화시키지는 않는다.

수용개체로의 형질감염 세포 도입을 여기서는 핵전이성 이식이라고 언급한다.

형질감염 세포 제제는, 적어도 한 개의 형질감염 세포를 포함하는, (1) 생리학적으로 허용되는 완충용액이나 담체중의 세포의 현탁액 또는 (2) 생리학적으로 허용되는 용기안에 있는 세포의 현탁액이다. 인산염 완충 식염수는 그런 적합한 담체의 한 예이다. 핵전이성 이식체는 적어도 한 개의 형질감염 세포를 갖고 있는 이식체이다.

Ⅱ. 수용개체내의 형질감염 세포의 발현

본 발명은 수용개체에 유전자 치료법을 제공하는 방법을 제공하다. 그런 유전자 치료법은(수용개체내에서 특정 유전자 배열을 발현시킬 수 있는) 형질감염 세포의 도입을 통해 실현된다. 수용개체내에 도입되는 유전자 서열의 특정 서열 또는 성질은 농도를 변화시키고자 하는 수용개체내의 구체적인 유전자 산물에 따라 선택된다. 도입되는 유전자 서열은 목적 유전자 산물(또는, 이의 동등하거나 돌연변이된 형태)을 발현시킴으로써 목적 유전자 산물의 농도를 변화시킬 수 있다. 이 경우, 도입되는 유전자 서열을 목적 유전자 서열이라 부르기로 한다.

또한, 목적 유전자 서열은 수용개체의 형질감염되지 않은(즉, 원래의) 세포에 의한 목적 유전자 산물의 발현을 유도함으로써 목적 유전자 산물의 농도를 변화시킬 수도 있다. 이 경우, 유전자 서열은 유도자 유전자 서열로 부른다. 그리하여, 만약 성장 호르몬의 농도를 변화시키기를 원한다면, 성장 호르몬 발현하는 형질감염 세포를 제공하여 성장 호르몬의 농도 변화를 직접 초래할 수 있는 유전자 서열을 도입하거나, 동물의 형질감염 되지 않은 세포에 의한 성장 호르몬의 발현을 유도함으로써 성장 호르몬 농도에 간접적으로 영향을 줄 수 있는 유전적 서열을 도입할 수 있다. 단리하여 클론화할 수 있는 한 어떤 유전자라도 본 발명에 사용될 수 있다.

여기에서 사용되는 발현(expression)이라는 용어는 유전자 서열의 mRNA로의 전사(transcription), mRNA의 단백질로의 번역(translation) 및 세포로부터의 단백질의 분비를 유도하는 세포의 능력을 일컫는다. 유전자 산물의 분비는 자연적으로 일어나거나 분비신호서열에 목적 유전자 또는 유도자 유전자를 작동가능하게 연결함으로써 달성할 수 있다. 발현은 특정 종(specie) 안에서 특정 유전자 산물에 대해 채택된 기준내의 수준으로 일어나거나 발현의 수준이 수용개체와 같은 종의 비처리 개체에서 관찰되는 발현 수준과 본질적으로 동등하다면 정상이라고 말한다. 비정상 발현은 특정 유전자 산물의 과잉 발현을 의미하기도 하지만, 전형적으로는 대상 종(subject's species)의 정상적 구성원에서 관찰되는 것보다 낮은 발현을 의미한다. 발현이 수용개체의 생리학적 변화를 가져오면, 생리적으로 의미있는이라고 간주한다. 따라서, 수용개체에 어떤 생리적 유의성도 갖지 않을 정도로 낮은 발현은 생리학적으로 의미있다고 여겨지지 않을 것이다. 반대로, 발현이 수용개체의 전반적 생리에 영향을 준다면, 그것은 본원에 사용되는 용어대로 생리적으로 의미 있다.

유전자 발현을 일으키기 위해, 목적 유전자 또는 유도자 유전자의 구조적 서열은 프로모터 부위에 작동가능하게 연결될 필요가 있다. 프로모터 부위는 유전자 서열의 전자개시 부위로 형질감염 세포에 의해 인식되는 DNA 서열이다. 유전자 서열은 유전자 서열이 프로모터 부위의 존재로 인해 전사되기에 충분하게 연결되면, 프로모터 부위에 작동가능하게 연결되었다고 말한다. 본 발명의 한 실시예에서 목적 또는 유전자 DNA 서열은 그들의 정상적인 본래의 프로모터 부위에 연결되어 형질감염 세포안으로 도입된다. 이런 형질감염 세포는 그 유전자의 정상적 조절 제어하에 목적 유전자 또는 유도자 유전자의 산물을 생성시킬 수 있다. 또한, 보다 바람직한 실시태양으로서, 특정한 목적 유전자 서열이나 유도자 유전자 서열과 정상적으로는 관계없는 프로모터 부위에 서열을 연결할 수 있다. 그리하여, 형질감염 세포안에서 작용할 수 있는 한 어떤 프로모터라도 목적 유전자 또는 유도자 유전자 서열에 작동가능하게 연결될 수 있고 핵전이 세포내에서의 유전자 발현에 이용될 수 있다.

프로모터 부위는 구조성일 수 있다(즉, 특정 조건에 반응해서만 계속적으로 유전자를 발현할 수 있고 그렇지 않으면 실질적으로 그런 발현을 촉진할 수 없음). 바람직하한 조절가능한 촉진자 부위로서 사용될 수 있는 것 중에 마우스의 메탈로티오닌 프로모터 부위가 있다. 이 프로모터 부위는 특정 중금속(예:아연 또는 카드뮴)이나 글루코코티코이드(glucocorticoids)의 농도에 직접 반응하여 작동가능하게 연결된 유전자 서열의 전사를 유도한다. 그리하여, 그런 이온을 수용개체에 투여함으로써 작동가능하게 연결된 유전자 서열의 발현 수준을 조절할 수 있다.

다른 방볍으로서, 온도(드로소필라 열충격 프로모터(Drosophila heat shock promotor), 당류(효모 gal-4 프로모터), 이중쇄(double-stranded) RNA 등에 의해 조절될 수 있는 프로모터 부위를 사용할 수도 있다.

유전자 요법의 유용성은 전통적인 유전적 질병, 즉, 단백질 생산이 없거나 비정상적인 유전자 손실이나 변이에 의한 선천적 질병의 치료에 그치지 않는다. 다양한 병태생리학적 상태는, 당뇨병에 대한 유전자 요법의 적용에 의해 예시된 것처럼, 특정 단백질의 전달에 의해 치료될 수 있다. 제Ⅰ형, 제Ⅱ형의 당뇨병 모두 유전적 요소(component)을 갖고는 있으나, 대부분의 경우 인슐린 유전자 자체에는 영향이 없다. 또한, 결함 유전자의 대체가 아닌, 다양한 일시적 간섭이 이 범주에 속한다. 예를 들면, 대량 생산하기 매우 어려운, 조직 플라즈미노겐 활성인자(tissue plasminogen activator)는 경색증을 근래에 겪은 환자의 치료를 위해 현재 평가중에 있다. 그런 환자로부터 얻어진 세포는 조직 플라즈미노겐 활성인자를 발현하도록 조작되고 재이식되어 생명을 위협하는 혈병(clot)의 형성 가능성을 감소시킬 수 있다. 유사하게, 핵전이성 이식은 특정 악성 종양을 파괴하도록 고안된 생성물을 전달하는데 이용될 수 있다. 핵전이성 이식은 외상이나 화상 환자에게 일시적인 치료법으로 제공될 수도 있다.

핵전이성 이식을 이용하는 유전자 요법에서 다음의 몇가지 특성이 바람직하다.

Ⅰ) 형질감염 세포는 환자에게 이식되기 전에 그 특성연구(charateritation)가 되어야 한다.

Ⅱ) 유전자는 효과적으로 전달되어야 하고, 조절된 발현이 목적하는 수준으로 이루어져야 한다.

Ⅲ) 상이한 조직으로부터의 세포를 형질감염을 위해 사용할 수 있어야 하고 이를 임상학적 고려에 따라 상이한 해부학적 부위에 재이식할 수 있어야 한다.

Ⅳ) 이식후의 형질감염 세포의 기능을 탐지, 추척 및 가능하다면 조절할 수 있어야 한다;

Ⅴ) 이식된 세포는 필요하다면 이식후 언제라도 완전히 파괴하거나 불활성화할 수 있도록 조작되어야 한다;

Ⅵ) 시스템은 명백한 치료적 이점을 가져야 하며 환자나 그의 집단(population)을 부당한 위험에 처하게 하지 않아야 한다.

상기한 바와 같이, 이런 변경은 수용개체의 게놈안에 종전에 존재하지 않던 새로운 유전자를 수용개체에게 제공할 수도 있다. 이런 경우, 수용개체는, 처음으로, 도입된 유전자 서열을 발현할 수 있을 것이다. 또한, 본 발명은 수용개체내에의 유전자 발현 수준을 상승시키는 수단을 제공한다.

Ⅲ. 유전자 요법을 제공하기 위한 핵전이성 이식의 용도

본 발명은 수용개체내의 유전자 발현 수준을 변화시키는 수단을 제공한다. 이 변경은 유전자 발현을 증가시키거나 감소시킬 수 있다.

유전자 발현은 발현 증가가 요구되는 수용개체의 유전자와 본질적으로 동일하거나 동등한 유전자를 갖고 있는 형질감염 세포를 수용개체에게 제공함으로써 증가될 수 있다. 형질감염 세포에 의한 그러한 유전자의 발현은 수용개체내의 목적 유전자 산물의 농도를 증가시키는 원인이 된다. 동등한 유전자라는 것은 수용개체의 유전자와는 비슷한 유전자이지만 다른 종에서 얻어지는 것을 말한다. 예를 들면, 소의 성장 호르몬에 대한 유전자는 인간의 성장호르몬 유전자와 동등한 것이다. 동일한 유전자는 수용개체내에 정상적으로 그리고 자연적으로 존재하는 유전자 서열과 실질적으로 유사한 유전자이다. 동등한 또는 동일한 유전자 서열은 목적 유전자 서열이나 유도자 유전자 서열중 하나일 수 있다.

본 발명에서는, 유도자 유전자 서열(즉, 증가된 발현이 요구되는 유전자의 조절에 영향을 미치는 유전자 서열)을 갖고 있는 형질감염 세포를 수용개체에게 제공하여 유전자 발현을 증가시킬 수도 있다. 그래서, 예를 들면, 그 산물이 수용개체내에 제2의 목적 유전자 서열의 체내 발현을 자극하는 유전자를 발현하는 형질감염 세포를 수용개체에게 제공함으로써 수용개체내의 특정 유전자의 발현 수준이 증가될 수도 있다. 예를 들면, 그 산물이 상승된 수준의 성장 호르몬을 분비하도록 수용개체를 유도하는 유전자를 발현하는 형질감염 세포을 수용개체에게 제공함으로써 유전자 발현을 증가시킬 수 있다.

본 발명은 또한 수용개체내의 유전자 발현 수준을 감소시키기 위해 이용될 수 있다. 유전자 발현의 감소는 그 산물이 수용개체내에서 체내 유전자의 발현을 저해하는 유도자 유전자 서열을 발현하는 형질감염 세포를 수용개체에게 제공함으로써 이룰 수 있다. 그래서, 예를 들면, 성장 호르몬 발현을 저해하는 생성물(예, 소마토스타틴(somatostatin))을 생성하는 유전자를 발현하는 형질감염 세포를 제공하므로써, 수용개체내의 성장 호르몬의 체내 발현 수준을 제하할 수 있다. 또한, 특정 유전자의 정상적 활성이나 작용을 방해하는 유전자 산물을 발현하는 형질감염 세포를 수용개체에게 제공함으로써 유전자 발현을 감소시킬 수 있다. 예를 들면, 형질감염 세포는 특정 체내 유전자 산물과 결합할 수 있는 유전자 산물을 제공하여 그 유전자 산물의 활성을 약화시킬 수 있다.

수용체내의 유전자의 발현을 증가시키거나 감소시키는 추가적 방법은 수용개체내에서 목적 유전자 산물의 생리학적으로 의미있는 농도를 변화시키기 위해 형질감염 세포를 이용하는 것이다. 그런 형질감염 세포는, (1) 발현의 변화를 목적하는 유전자 또는 (2) 그 발현이 관심있는 유전자 서열의 발현 수준에 영향을 주는 유전자 중 하나의 돌연변이된 대립형질(allele)을 발현할 수도 이다. 그래서, 예를 들면, 성장 호르몬 유전자의 발현 수준을 증가시키는 하나의 수단은 돌연변이되어 활성이 증가된 성장호르몬을 생성할 수 있는 성장 호르몬 유전자의 돌연변이 대립형질을 발현하는 형질감염 세포를 수용개체에 제공하는 것일 수 있다. 유사하게는 돌연변이된 인간 성장 호르몬 생성물(상당한 손상이 활성을 갖는)을 생성할 수 있는 형질감염 세포를 수용개체에 제공함으로써, 수용개체의 체내의 정상적 성장 호르몬과 결합할 수 있는 성장 호르몬 수용체 분자의 수를 감소시킬 수 있다. 이것은 체내 성장 호르몬의 수준을 감소시키는 것과 본질적으로 동등한 것이며, 체내 유전자 발현의 생리적 영향의 감소라는 결과를 나타낼 것이다.

형질감염 세포내의 목적 유전자 서열은 수용개체 자체이거나, 수용개체와 동일한 종의 동물 또는 다른 종의 동물에서 유래한 것일 수도 있고, 합성 유전자일 수도 있다. 형질감염 세포의 목적 또는 유도자 유전자 서열의 출처를 선택하는데 있어서, 형질감염 세포의 발현된 유전자 산물의 수용개체내에서 항원으로 인식되는지 여부를 고려하는 것이 중요하다. 그래서, 형질감염 세포에 의해 발현되는 유전자 산물에 면역학적 거부를 가능성을 배제하기 위해, 대상 개체의 종과 밀접히 관계있는 종으로부터 목적 또는 유도자 유전자 서열을 얻는 것이 바람직하며, 수용개체와 같은 종의 동물로부터 유전자 서열을 얻는 것이 좋다. 수용개체 자체로부터 얻은 유전자 서열을 사용하는 것이 가장 좋다. 핵전이 세포에 의해 발현되는 유전자 서열이 가질 수 있는 항원성(antigenicity)은 수용개체의 혈청이 발현된 유전자 산물과 특이하게 반응할 수 있는 항체를 갖거나, 갖도록 초회항원자극될(primed) 수 있는지를 확인함으로써 쉽게 알 수 있다. 단백질의 항원성을 결정하는 기술은 이 분야의 통상의 기술로서 널리 알려져 있다.

Ⅳ. 수용개체내에 생물학적 화합물의 생성을 유도하는 핵전이 이식체의 용도

본 발명의 또하나의 태양은 형질감염 세포를 사용하여, 수용개체내에 정상적으로 존재하는 형질되지 않은 세포에 의한 생물학적 화합물의 생성을 유도하는 것을 포함한다.

본 태양에 따라 생성되는 생물학적 화합물의 예로는 항체, 세포수용체 분자들, 호르몬, 효소 등이 있다. 유효량의 특정한 목적 유전자 산물을 발현할 수 있는 특정한 형질감염 세포를 이식함으로써(수용개체의 형질감염되지 않은 세포에 의한) 제2의 특정한 유전자 산물의 합성을 유도할 수 있다. 유효량이라는 용어는 생리학적으로 의미있는 -또는 유의한- 발현의 양을 일컫는다. 그래서, 만약 유효량의 호르몬 유전자가 수용개체내에서 발현된다면, 호르몬의 수준은 수용개체의 생리 현상에 검출될만한 효과를 갖기에 충분할 만큼 높아질 것이다. 만약 유효량의 항원성 물질이 수용개체내에서 발현된다면, 그 항원성 물질의 수준은 항체 생성을 유도할 만큼 충분히 높을 것이다. 그래서, 예를 들면, 형질감염 세포가 항원을 발현한다면 수용개체는 그것에 결합할 수 있는 항체를 생성하도록 유도될 것이다. 그외에 만약 형질감염 세포가 비항원성 호르몬이나 호르몬 수용체(receptor)를 발현한다면, 대상 수용개체의 형질감염되지 않은 세포는 표준 생리기전(standard physiological mechanism)을 통해 호르몬 수용체나 호르몬 분자를 생성하도록 유도될 것이다.

중요하게도, 상기한 본 발명의 태양은 발현 산물 분자를 먼저 강제할 필요없이, 형질감염 세포의 발현 산물의 존재에 반응하여 생성된 생물학적 화합물을 수득할 수 있게 한다. 예를 들면, 현재 높은 친화력의 특이성을 갖는 다클론성 항체는 상당한 양의 정제된 항원을 공급해줌으로써 생성될 수 있다. 빈번하게, 항원 분자를 정제하는 어려움 때문에 다클론성 항체의 생성은 과도하게 어려운 일이다. 반대로, 관심있는 항원을 암호화하는 유전자를 분리하는 것은 간단하다. 그런 유전자를 세포내로 도입함으로써 그 항원을 발현하는 형질감염 세포를 생성할 수 있다. 이 발현은, 후속적으로, 발현된 항원에 특이적으로 결합할 수 있는 항체를 대하여 수용개체가 생성할 수 있게 한다.

그리하여, 본 발명의 항원 분자를 정제할 필요없이 다클론성 항체를 생성하는 방법을 제공한다.

중요한 것은, 발현된 항원은 하나의 본래의, 완전한 유전자의 생성물일 필요는 없다는 것이다. 달리 말하면, 그것은 유전자 단편(gene fragment)의 발현 산물일 수도 있다. 유전자 단편은, 발현되었을 때 하나의 본래의 완전한(anintact and entire) 유전자의 단편만을 포함하는 폴리펩티드 생성물을 생성시키는 DNA 서열을 말한다. 예를 들면, 호르몬을 인식할 수 있는 항체의 생성을 유도하기를 원한다면, 완전한 호르몬 분자를 발현하는 형질감염 세포를 사용할 필요는 없고, 그 대신 호르몬 분자에 대한 유전자 단면을 포함하는 세포를 사용할 수도 있다.

항체 생성을 유도하는 유전자 단편을 사용할 수 있다는 것은 이 분야에 있어서 상당한 진보를 제공한다. 이 방법은 유전자 산물 또는 완전한 유전자가 분리되지 않을 경우, 유전자를 클로닝하는데 유리하게 이용될 수 있다. 또한, 이 방법은 면역반응진단학과 면역요법에서 상당히 중요한, 부위-특이적(regional-specific) 다클론성 항체를 분리할 수 있게 해 준다.

Ⅴ. 본 발명에 의한 항체의 용도

형질감염 세포내에서 발현된 목적 유전자 산물은 면역억제요법(immunosuppressive theraphy)을 사용하지 않는 한, 흔히 수용체에 대해 항원성(즉, 항체의 발현을 유도할 수 있는)일 것이다. 하나의 유전자 산물이 에피토프를 갖고 있다면 그것은 항원성이 있다(즉, 하나의 항원이다).

에피토프란, 수용개체에 의해 인식되고, 수용개체의 유도된 항체와 결합할 수 있는, 분자의 부분을 말한다. 항원은 한 개나 그 이상의 에피포트를 포함할 수 있다.

본 발명을 이용함으로써 두 개의 다른 유형의 항체 분자를 생성할 수 있는데, 다클론성 항체와 부위-특이적 다클론성 항체가 그것이다. 다클론성 항체는 완전한(즉, 전체의, 또는 본래의) 유전자 산물의 존재에 반응하여 수용개체에서 생성되는 것이다.

부위-특이적 다클론성 항체는 완전한 유전자 산물의 단편의 존재에 반응하여 수용개체에서 생성되는 것이다. 예를 들면, 인간 인슐린 단백질이 면역능력이 있는 마우스내에서 발현된다면, 그 마우스는 인슐린 에피토프에 결합할 수 있는 한 세트의 다클론성 항체들을 생성할 것이다. 일반적으로, 각 특정 항체는 오직 한개의 인슐린 에피토프에 결합할 수 있지만, 다클론성 항체의 세트는 상이한 각각의 인슐린 에피토프에 결합할 수 있는 항체들을 포함한다. 반대로, 인간 인슐린 단백질의 절반부분만을 마우스에서 발현시킨다면, 그 마우스는 발현된 인슐린 단편에 있는 에피토프에만 결합할 수 있는 한 세트의 다클론성 항체를 생성할 것이다. 그런 항체는 비록 발현된 단편에 대한 다클론성 항체이지만, 완전한 인슐린 분자에 대해서는 부위-특이적 다클론성 항체이다.

요약하면, 만약 다클론성 항체의 시료가 완전한 유전자 산물에 천연으로 존재하는 에피토프의 일부에만 결합할 수 있다면, 그 항체는 그 완전한 유전자 산물에 대한 부위-특이적 다클론성 항체이다. 그러나, 항원 에피토프 모두에 시료중에 존재하는 항체가 결합한다면 그 시료는 그 항원에 대한 다클론성 항체를 갖고 있는 것이다. 본 발명에 따라, 완전한 유전자 산물과 결합할 수 있는 부위-특이적 항체를 함유하는 항혈청으로 부터 얻어지거나 그 항혈청중에 존재한다면,그 완전한 유전자 산물과 결합할 수 있는 항체를 부위 특이적 항체라고 한다.

본 발명의 형질감염 세포는 완전한 항원의 유전자 서열이나 완전한 항원의 하나의 단편의 유전자 서열을 갖고 있으므로, 다클론성 항체나 부위-특이적 다클론성 항체를 생성하는 핵전이 수용개체를 만드는데 이용될 수도 있다. 이들 항체는, 종래의 어떤 면역검정법에도 유용하다. 본 발명의 부위-특이적 다클론성 항체는 단일클론성 항체가 사용되었던 종래의 어떤 면역 검정에서도 이용될 수 있다. 하나의 실시태양에서, 항체는 이미 잘 알려진 종래의 표지 기술을 사용하여 검출가능하도록 표지될 수 있다. 그러므로, 이런 결합 분자들(binding modecules)은 예를들어,³H,¹²⁵I,¹³¹I,³⁵S와 가은 방사성 동위원소들을 이용하여 방사능 표지(radio-labeled)될 수도 있다.

항체는 또한 형광 표지, 효소 표지, 자유 라디칼 표지 또는 박테리오파아지 표지 등 이 분야에 잘 알려진 방식으로 표지될 수도 있다.

전형적 형광 표지물로서는 플루오레세인 이소티오시아네이트(fluorescein isothiocyanate), 로다민(rhodamine), 피코에리트린(phycoerythrin), 피코시아닌(phycocyanin), 알피코시아닌(alphycocyanin), 텍사스 레드(Texas red)가 있다.

적절한 효소 표지물로서는 알칼린 포스파타제, 유레아제, 베타갈락토시다제, 글루코스-6-포스페이트 디하이드로게나제, 말레이트 디하이드로제나제, 퍼옥시다제가 있다.

효소 면역 검정의 두가지 기본적 방식에는 ELISA(enzyme-linked immunosorbent assay)와 EMIT(enzyme-multipled immunoassay)로 알려진 균일효소 면역검정법(homogeneous enzyme immuoassay)이 있다. 이 ELISA 시스템에서, 분리는 예를 들어, 고체상(solid phase)에 결합된 항체를 이용하여 수행될 수 있다.

EMIT 시스템은 추적자-항체 결합물내의 효소를 불활성화에 의존하며, 따라서 활성은 분리단계가 필요없이 측정될 수 있다.

추가적으로, 화학 발광 화합물들이 표지물로서 사용될 수도 있다. 전형적 화학 발광 화합물들에는 루미놀, 이소루미놀, 방향성 아크리디니움 에스테르, 이미다졸, 아크리디니움 염 및 옥살레이트 에스테르가 있다. 유사한 것으로서, 생물학적 발광 화합물들에는 루시페린, 루시페라제 및 아쿠오린이 있다.

일단 표지화되면, 결합 분자는 검출, 즉 이 분야에 잘 알려진 방법에 의해 면역학적 상대물(immunologic counterparts)을 확인 및/또는 정량하는데 이용될 수 있다. 그래서, 본 발명에서 검출(detect)이라는 용어는 분자나 작용 그룹(functional group)의 존재를 확인하고 또한 정량하는 것을 포함한다.

방사성 면역검정(RIA)에 대해서는 티. 에스. 워크 등이 저술한 분자 생물학에 있어서의 생화학과 실험실 기술(Laboratory Techniques and Biochemistry in Molecular Biology(1987년, 뉴욕의 노쓰 홀랜드 퍼블리싱 캄파니 발행)에 잘 설명되어 있고, 특히 이 책의 방사능 면역 검정 및 그와 관련된 기술의 소개(An Introduction to Radioimmune Assay and Related Techniques, 티. 챠드 등 공저)라는 제목의 장이 특히 참고할 만하다.

본 발명의 다클론성 항체(및, 특히 부위-특이적 다클론성 항체)는, 또한, 2 부위(2-site) 또는 샌드위치로 알려진 면역 측정 검정법에 이용될 수 있다. 전형적 면역측정 검정에서는, 일정량의 표지되지 않은 항체를 시료 용액에 불용성인 고체 지지체에 결합시키고, 표지를 갖고 있는 가용성 항체를 일정량 가해서, 고체 지지체상의 항체, 항원 및 표지된 항체간에 형성된 3원의 복합체(ternary complex)를 검출 및/또는 정량한다.

전형적 면역측정 검정법에는 시료와 고체상을 접촉시켜 고체상에 결합된 항체가 2원의 고체상 항체-항원 복합체를 형성하게 함으로써 시료로부터 항체를 추출해내는 전방(forward) 검정법이 포함된다. 적절한 배양기간후에 미반응 항원(만일 있다면)을 포함하는 액체 시료의 잔류물을 제거하기 위해 고체 지지체를 세척하고, 다시 미지량의 표지된 항체가 있는 용액과 접촉시킨다. 표지되지 않은 항체에 의해 고체 지지체에 결합된 항원과 표지된 항체가 복합체를 이루도록 허용하는 두 번째 배양기간 후에, 미반응의 표지된 항체를 제거하기 위해 두 번째로 고체 지지체를 세척한다.

이런 방식의 전방 샌드위치형 검정에 의해 항원이 존재하는지 여부를 알아보기 위한 단순한 긍정/부정(yes/no)의 검정을 하거나 이미 양을 알고 있는 항원을 갖고 있는 표준 시료에 대해 얻어진 양(measure)과 표지된 항체의 양을 비교함으로써 정량적 검정을 할 수 있다. 2-부위 또는 샌드위치 검정에 대하여는 1970년 커크햄(Kirknam) 및 헌터(Hunter)에 의해 편집된 방사능 면역 검정법(Radioimmune Assay Method)의 199-206 면에서 와이드(Wide)가 기술하고 있다.

본 발명의 항원에 역시 유용한 다른 방식의 샌드위치 검정에는, 소위 동시적(simultaneous) 그리고 역전적(reverse) 검정이 쓰인다. 동시적 검정은, 고체지지체에 결합된 항체와 표지된 항체가 모두 동시에 시료에 가해짐으로써, 단일 배양단계(single incubation step)를 거친다. 배양이 완료된 후, 결합되지 않은(uncomplex) 표지 항체와 액체 시료의 잔류물을 제거하기 위해 고체 지지체를 세척한다. 고체 지지체와 결합한 표지 항체의 존재는 통상의 전방 샌드위치 검정에 있어서와 마찬가지로 결정된다.

역전적(reverse) 검정에서는, 표지된 항체의 용액을 액체 시료에 먼저 가하고 다으므로 적당한 배양기간후 고체지지체에 결합된 비표지 항체를 가하는 단계적 방법이 사용된다. 2차 배양후 고체상은 시료의 잔류물과 미반응 표시 항체 용액을 제거하기 위해 통상적 방식으로 세척된다. 고체 지지체와 결합한 표지 항체는 동시적 검정과 전방 검정에서 처러 검색된다.

상기한 바와 같이, 항체에 대한 면역측정 검정은 특정 결합 분자를 보고분자(reporter molecule)로 표지되는 것을 필요로 한다. 이들 보고 분자 또는 표지물은 상기한 바와 같이 통상적인 것이며, 이 분야에 잘 알려져 있다.

본 발명의 실시예에 있어서, 효소 표지는 하나의 바람직한 태양이다. 모든 면역측정 검정에서 표지로 사용될 수 있는 이상적인 효소는 하나도 없다. 대신에 어떤 효소가 특정 검정계에 적당한가를 결정해야 한다. 효소 선택에서의 중요한 기준은 순수 효소의 전환수(trunover number, 단위시간에 효소 부위당 생성물로 바뀌는 기질의 분자수), 효소제제의 순도, 그 생성물 탐지의 감도, 효소반응 탐지의 용이도와 신속성, 검액내에 효소와 유사한 활성 또는 방해요소의 존재, 효소와 그 결합체(conjugate)의 안정성, 효소와 그 결합체의 입수가능성과 가격 등이다. 본 발명의 면역측정 검정에서 표지으로 사용되는 효소에는 고추냉이 퍼옥시다제, 알칸린포스파타제, 베타-디-갈락토시다제, 유레아제, 글루코스 옥시다제, 글리코밀라제, 카보닉 안하이드라제, 아세틸콜린 에스테라제, 리소자임, 말레이트 디하이드로게나제, 글루코스-6-포스페이트 디하이드로게나제가 포함된다. 유레아제는 선호되는 효소 표지중의 하나인데, 그 이유는 특히 육안으로 쉽게 그 활성을 볼 수 있게 색소를 생성하는 pH 지시약 때문이다.

본 발명의 항체는 이 분야에 잘 알려진 방법으로 표지할 수 있다. 전형적 방법은 제이. 에취. 케네디 등(Clin. Chim. Acta 70:1-31(1976))과 에이. 에취. 더블유. 엠. 슈르스 등(Clin. Chim. Acta 81:40(1977))에 의해 기술되어 있다. 슈르스 등의 글에 언급된 결합기술(coupling technics)에는 글루타르알데히드법, 페리오데이트법, 디말레이미드법, m-말레이미도벤질-N-하이드록시숙신이미드 에스테르법이 있다. 이들 방법은 모두 본원에 인용삽입된다.

Ⅵ. 본 발명에 의한 형질감염 세포의 생성

핵전이성 세포는 추가적 유전자 서열을 세포내로 시험관 도입함으로써 생성된다(도 1). 만약 그런 서열이 형질감염 세포의 염색체에 통합되거나 염색체의 플라스미드로서 복제될 수 있다면, 그 세포는 도입된 유전자 서열의 발현을 일으키는 영구적인 능력을 획득하게 된다. 그런 세포를 안정적으로 형질감염된 것이라 한다. 그런 세포는 도입된 유전자 서열을 발현할 영구적 능력을 획득하므로, 목적 또는 유도자 유전자 산물을 생성하는 장기적인 능력을 수용개체에 부여하려는 경우에는 안정적 형질감염 세포를 사용하는 것이 바람직한 것이다.

목적 또는 유도자 유전자 서열이 세포의 염색체에 통합되지 않았거나 염색체 외적으로 복제되지 않는 형질감염 세포를 이용할 수도 있다. 그런 세포는 목적 유전자 서열을 발현할 능력을 일시적으로만 유지한다. 일시적으로만 목적 유전자 서열을 발현할 유전자 서열을 갖는 세포를 일시적으로 형질감염된것이라고 한다.

그러한 일시적 발현의 수준은 형질감염 세포에게 목적 또는 유도자 유전자 서열의 복사체들을 추가적으로 가해줌으로써 증가시킬 수 있다. 그래서, 안정적 형질감염 세포가 일시적 형질감염 세포보다 오랜 기간동안 목적 또는 유도자 유전자 배열을 발현할 수 있지만, 일시적 또는 안정적 형질감염 세포가 모두 상당한 수준까지 그런 서열을 발현할 수 있다. 실제로, 만약 세포내에 도입될 수 있는(일시적 형질감염) 유전자 서열의 복사체의 수가 안정하게 유지될 수 있는 복사체 수를 초과한다면, 일시적 형질감염 세포는 안정적 형질감염 세포보다 더 높은 수준의 발현을 나타낼 것이다. 그래서, 단기간의 발현을 원하거나, 안정적 형질감염 세포를 사용하여 얻을 수 있는 것과는 다른 발현수준을 원하거나 어느 한 경우에는, 수용개체에 일시적 형질감염 세포를 사용하는 것이 바람직하다.

안정한 형질감염 세포를 얻는 데에는 엠. 위글러 등이 기술한 방법(Cell 11:223(1977))을 사용할 수 있다. 이 방법에 따르면(목적 또는 유도자 유전자 서열을 포함하고 있는) DNA의 현탁액을 인산칼슘을 이용하여 작은 침전물들로 복합체화시킨다. 이들 침전물은 37℃의 조직배양용 접시에서 자라고 있는 단층세포에 가해진다.

목적 또는 유도자 유전자 배열은 세포와 함께 배양되기 앞서 플라스미드상으로 분리하고 클로닝되는 것이 바람직하다. 또한, 각각 다른 유전자 서열을 갖고 있는 분획되지 않은 플라스미드 집합을 갖는 세포를 배양하거나, 목적 또는 유도자 유전자 배열만을 갖는 세포를 배양하는 것도 가능하다.

만약 비분획된 플라스미드가 사용된다면 그 결과로 만들어진 형질감염 세포들 중에서 목적 유전자 서열을 가지고 있고 이를 발현하는 세포를 선별하는 것이 바람직하다. 그리고 나서, 그런 세포는 수용개체내로 도입되기 전에 먼저 공지의 통상적인 방법으로 다른 형질감염 세포로부터 정제되는 것이 바람직하다. 세포배양에 대한 기술은 알. 아이. 후레슈니의 동물세포의 배양, 기초기술의 매뉴얼(Culture of Animal Cells, A Manual of Basic Technique)(Aln R. Liss, Inc., Ny, p. 55-78(1983))과 케이. 제이. 램버트 등의 동물세포 생물공학(Animal Cell Biotechnology, Vol. 1, Spier, R. E., et al., Eds., Academic Press, NY, pp. 86-122(1985))에 자세히 밝혀져 있다; 이 문헌은 본원에 인용 삽입된다.

안정적으로 형질감염 세포를 확인하기 위해서는, 일반적으로 형질감염 세포의 전체 배양물에서 형질감염 세포만을 선별하거나 선택할 필요가 있다. 그래서, 세포에게 선택적인 성질을 부여할 수 있는 제2의 유전자 서열을 가진 형질감염 세포를 공동-형질감염시키는 것이 바람직하다. 이러한 제2의 유전자 서열은 분리된 분자상에 있을 수도 있고 또는 목적 유전자 서열을 갖는 분자에 연결될 수도 있다. 이 제2의 서열이 부여하는 선택성으로서는 G418에 대해서와 같은 약물내성, 하이포크산틴 또는 8-아자구아니딘 같은 대사체 존재시나 티미딘 같은 뉴클레오티드의 부재시에 성장할 수 있는 능력을 예로 들 수 있다. 티미딘 키나제 유전자 발현에 결함이 있는 형질감염 세포 및 제2의 선택적 유전자 서열로서 헤르페스 심플렉스 바이러스의 티미닌 카나제 유전자를 사용하는 것이 바람직하다. 선택성의 안정한 발현을 보이는 형질감염 세포는 그것이 또한 목적 유전자 서열을 발현하는지 검사된다. 이 검사는 그런 발현 결과 생기는 단백질 사물에 대한 검정에 의해 이루어진다. 물론 사용되는 특정 검정방법은 단백질 산물의 성질과 기능에 따라 다양하다.

안정적 또는 일시적 형질감염 반응을 실시하는 과정은 이 분야에 잘 알려져 있다(예:에프. 파스로우 등이 저술한 Gene 38:227-232(1985); 제이. 코프치크 등이 저술한 DNA 4; 23-31(1985); 엠. 에이. 로파타 등이 저술한 Nucleic Acid Research 12:5707-5717(1984); 에이. 긴흥 등이 저술한 Mol, Cell Biol, 2:1628-1632(1982)). 이들 문헌은 모두 본원에 인용 삽입된다.

일시적 형질감염 실험에서는, 5×10⁵내지 5×10⁶세포에게 목적 또는 유도자 유전자 서열을 갖는 DNA 10 내지 50μg을 제공하는 것이 바람직하다. 안정적 형질감염 실험에서는 5×10⁵내지 5×10⁶세포에게 목적 또는 유도자 유전자 서열을 갖는 DNA 1 내지 20μg을 제공하는 것이 바람직하다. 만약, 선택성을 부여하는 유전자 서열이 목적 유전자 서열을 갖고 있는 분자와 동일한 분자에 있지 않다면, 그것을 세포에게 별도로 제공해야 한다. 그런 경우, 5×10⁵내지 5×10⁶수용체 세포당 이 유전자 배열 1.0 내지 100μg을 제공하는 것이 바람직하다.

형질감염후 형질감염 세포를 증식시킨 후, 각 수용개체 당 10⁵내지 10¹⁰형질감염 세포를 제공하는 것이 바람직하다. 수용개체내에 도입되는 세포수는 목적 또는 유도자 유전자 산물의 발현, 그 산물의 전환, 그리고 원하는 정도의 생리학적 활성을 얻는데 필요한 산물의 양과 같은 기준에 따라 결정될 것이다.

본 발명의 형질감염 세포는 복강로 도입함으로써, 또는 피부하(즉, 피하나 근하로)로, 피부내로, 근육내로 도입함으로써, 또는, 더 바람직하게는, 신장을 둘러싼 피막내로 피막하의 이식체를 도입함으로써 수용개체에 도입된다. 두개골내이식체, 또는 간장내, 정맥내, 복강내, 페장내, 안구내, 고환내 또는 내장내 등의 도입방법이 더 있을 수 있다. 주사나 이식(즉, 세포가 도입부위로부터 분산하거나 이동할 수 있는 능력을 저해하는 물질에 둘러싸여 있는 경우)중 하나로 도입을 할 수 있다. 바람직한 실시태양에서의 이식체는 수용체로부터 용이하게 얻을 수 있고 연구될 수 있는 신장 피막하, 또는 그와 유사한 이식체이다.

본 발명은, 세포가 (1) 도입된 유전자 서열을 받아들여 발현할 수 있고 (2) 시험관내에서 배양되어 수용개체내로 재도입될 수 있는 한, 많은 다양한 조직에서 얻은 핵전이성 세포로 실시될 수 있다. 예를 들면, 본 발명은 섬유아세포, 근세포, 간세포(hepatocyte), 신장피막세포, 내피세포, 장외피세포, 뇌하수체세포 등을 사용하여 실시될 수 있다. 본 발명은 주세포(primary cell)나, 형질감염 세포중 어느 하나를 사용하여 실시될 수 있다. 바람직한 세포 유형은 마우스의 L 세포, 신장피막세포, AtT-20 세포들이 있다. 그러나, 형질감염 세포로는 섬유아세포를 사용하는 것이 가장 바람직하다. 핵전이성 세포에 대한 수용개체의 면역학적 반응을 일으킬 가능성을 최소화하려면, 수용개체의 종(species)에 밀접히 관련된 종으로부터의 세포를 사용하는 것이 바람직하며 수용개체와 동종에서의 세포를 사용하는 것이 좋다. 면역학적 반응을 피하려면, 본래 수용개체 자체로부터 얻어진 세포를 사용하는 것이 가장 좋다. 다른 방법으로는, 면역억제제(예:덱사메타손 또는 항-흉선세포 항혈청)를 핵전이성 이식체에 대한 수용개체의 거부반응이나 파괴반응을 억제하거나 약화시키기에 충분한 용량으로 수용개체에 투여할 수 있다. 그러나, 반약 면역반응을 유발(예:항체의 생성을 유발)시키기를 바란다면, 동일 종이나 다른 종이의 안정적 또는 일시적 형질감염 세포를 갖고 있는 핵전이성 이식체를 도입할 수 있다.

그래서, 본 발명은 조직배양 세포나 장기 적출물(organ explant)로부터 주세포(primary cell)를 시험관에서 배양하는 것으로 시작된다. 목적 또는 유도자 유전자 서열은 그것이 세포내로 흡수될 수 있는 조건하에서 세포와 함께 배양된다. 생성된 형질감염 세포는 다양한 방식으로 수용개체내로 도입될 수 있다. 일단 수용개체안으로 들어간 형질감염 세포는 시험관 도입된 유전자 서열을 발현시켜 수용개체에게 목적 유전자 산물을 제공할 수 있다.

하기한 실시예들에서, 인간 성장 호르몬이나 인슐린을 발현하는 형질감염 세포가 사용되었다. 본 발명은 그런 형질감염 세포의 사용에 국한되지 아니하며, 수용개체에서 유전자를 발현할 수 있는 한, 어떤 형질감염 세포의 용도도 포괄하는 것으로 이해되어야 할 것이다. 대체하여 사용될 수 있는 다른 유전자의 예로서는 호르몬, 효소, 항체 등의 유전자 등을 둘 수 있다.

추가하여, 하기 실시예에서 사용된 섬유아세포와 뇌하수체세포는 수용개체로 사용되는 특정 마우스로부터 얻어진 것은 아니다. 하지만, 수용개체 자체로부터 얻은 형질감염 세포를 사용할 수도 있다. 하기 실시예들은 유전적으로 처리된 세포의 이식을 위해 여러 부위가 만족스러운 것을 보여주며, 상기 세포들이 수용개체내로 이동한 후 활발한 작용을 유지하도록 허용하는 것을 보여준다.

인간 성장 호르몬의 사용은, 형질감염 세포의 피막하 이식체를 받는 수용개체인 마우스의 성장이 이식후 적어도 7일 동안 대조군 마우스에 비해 더욱 빠른 것으로 발견되었다는 데에 실질적 중요성을 갖는다. 그리하여, 형질감염 세포의 투여는 생리적으로 의미있는 발현 수준을 가져왔다. 이런 이식체는 신생 동물의 빠른 성장을 촉진하는데 이용될 수 있다(면역억제 요법을 쓰지 않기 위해 동물을 형질감염 세포에 대해 내성을 갖도록 할(tolerize)필요가 이다). 마찬가지로, 생리적으로 의미있는 인슐린의 발현이 있었음이 밝혀졌다.

이제까지 본 발명을 일반적으로 기술하였고, 본 발명은 실시예를 참고함으로써 보다 잘 이해될 것이다. 그러나 실시예는 설명의 목적으로만 여기에 포함된 것이며, 명기되지 않는 한, 본 발명의 범위를 제한하려는 의도는 아니다.

[실시예 1]

인간 성장 호르몬 유전자를 가지는 형질감염 세포의 형성

A. 일시적 형질감염 세포의 형성

배양된 쥐의 LtK^-섬유아세포를 플라스미드 pXGH5와 함께, 그것이 섬유아세포로 삽입되기 용이한 상태에서 배양했다. 플라스미드 p0GH 유도체인 플라스미드 pXGH5는 마우스의 메탈로티오네인-Ⅰ(mMT-Ⅰ) 프로모터 촉진자 부위에 융합된 인간 성장 호르몬을 포함한다. 이 플라스미드는 미합중국 특허출원 제896,483호에 기술되어 있다. 플라스미드 p0GH는 메릴랜드 록크빌에 있는 아메리카 시료 배양균 수집소(American Type Culture collection)에 기탁번호 ATTC 67180으로 기탁되어 있다. 플라스미드 형질감염은 엠. 로파타 등이 기술한 방법에 의하여 행해졌다.

B. 안정적 형질감염 세포의 생성

안정적 형질감염 세포를 생성시키기 위해, 쥐의 LtK^-섬유아세포(티미딘 키나제 결핍)는 플라스미드 pXGH5와 헤르페스 심프렉스 바이러스의 티미닌 키나제 유전자와 함께 공동-형질전환시키고, HAT-내성 세포주를 인간 성장 호르몬 발현에 대해 분석하였다. 안정적 형질전환은 엠. 위글러 등이 기술한 방법(Cell 11:223(1977))에 따라 행해졌다. 인간 성장호르몬을 생성하는 것으로 발견된 세포주를 LtK⁺GH라고 명명했다.

[실시예 2]

일시적 형질전환 세포의 복강내 이식

일시적 형질감염 세포를 실시예 1A에서 설명한 바와 같은 방법으로 얻었다. pXGH5 DNA로 형질감염시키고 4일후 수용체인 LtK^-세포를 트립신으로 처리하고 펠레트화시킨 후 인산 완충액에 재현탁시켜 10마리의 C3H 마우스에 복강내 주사하였다. 이 마우스들은 배양된 LtK^-세포주의 초기 제공자와 같은 혈통이었다. 대략 2×10⁷세포가 각각 동물에 도입되었다. 이식후 3시간 이내에 인간 성장 호르몬이 수용개체인 마우스의 혈장에 나타났다. 평균혈장치는 63.1mg/ml이다. 혈장 인간 성장 호르몬치는 다음날 동안 감소하기 시작했으며(평균치=45.1mg/ml), 이식후 4일 무렵에는 거의 측정할 수 없었다(평균치=0.6mg/ml) 이 실험의 결과는 제2도(점선)에 나타나 있다. 이 실험은 일시적 형질감염 세포의 핵전이성 이식물이 이식후 대략 4일 동안(형질감염 5-8일간에 해당) 수용개체인 마우스의 혈장에 단백질 생성물을 전달할 수 있다는 것을 나타낸다. 이식된 세포는 수용개체가 그 세포를 제거하거나 불활성화시키는 어떤 수단을 가지기 때문에 인간 성장 호르몬의 생성을 중지한다.

[실시예 3]

안정적 형질감염 세포의 복강내 이식

안정적 형질감염 세포를 실시예에 1B에서 설명한 것과 같은 방법으로 제조하였다. 세포계열 LtK^-GH의 세포들을 일군의 C3H 마우스의 10마리에 복강내 주입하고, 이어서 이식후, 여러번 혈장 인간 성장 호르몬을 측정하기 위해서 채혈하였다. 이 실험의 결과는 제2도(실선)에 나타나 있다. 이식 세포의 작용특성(functional integrity)은 이 실험에서 3기(three phase)로 나눌 수 있다. 실시예 2의 일시적 형질감염 세포에서 처럼, 혈장 인간 성장 홀몬은 이식후 3시간 내에 측정가능하고, 다음 이틀 동안 빠르게 감소했다(트라우마기). 혈장 인간 성장 호르몬치는 7일까지 극적으로 증가하고(순응기) 그리고 나서 15일 무렴에는 거의 측정할 수 없는 정도로 감소했다(제거기).

일시적 형질감염 세포와 안정적 형질감염 세포의 이식을 비교한 결과, 이식 후 초기에는 세포사멸의 결과로 인간 성장 호르몬 발현이 중지되는 것을 시사해주며, 그 이유는 아마도 세포 취급중 여러 가지 손상효과 및 복강내의 여러 가지 성장조건에 기인하는 것으로 추측된다. 안정적 형질감염 세포는 이러한 초기 충격으로부터 확보되었지만, 일시적 형질감염 세포는 회복되지 않았는데, 그 이유는 아마도 일시적 형지감염 기술에서 사용된 조작이 더 추가적인 트리우마를 겪게 된 세포의 생존을 위태롭게 했기 때문일 것이다. 순응기에서는, 살아남는 세포가 인간 성장 호르몬 생성에서 보이는 것처럼 번성한다. 7일후의 인간 성장 호르몬치의 감소는 보다 오래 살아남는 이식 세포의 선천적인 생존 무능력보다는 이식체에 대한 수용체의 반응에 대부분 기인하는 것으로 보인다.

[실시예 4]

형질감염 세포의 발현과 수명에 대한 인식 위치의 효과

형질감염 세포의 발현과 수명에 대한 이식 위치의 효과를 결정하기 위해, 실시예 1B와 같은 방법으로 얻어진 안정적 형질감염 세포를 C3H 마우스의 여러 위치로 피하 이식시켰다. 한 마리에 대략 2×10⁷세포가 주입되었다. 이 실험의 결과는 제3도에 나타나 있다. 피하 이식된 형실제포가 10일까지 동안 인간 성장 호르몬을 생성하는 것이 밝혀졌다(도 3, 실선, 삼각형). 혈청 인간 성장 호르몬치는 이식후 1일부터 점진적으로 감소하며 복강내 이식에서 나타난 순응기는 피하 이식에서 나타나지 않았다. 유사한 패턴이 신장피막하에 이식된 세포에서 발견되었다(제3도, 실선, 원형). 그 점선은 이식된 세포의 수로 피막하 이식체들을 정규화한(normalized) 결과를 나타낸다. 이 실험에서 3×10⁶세포가 각 동물에게 주입되었다. 이식후 7일, 이식체는 혈장 성장 호르몬을 거의 생성시키지 않았다. 피하 이식된 이식체를 채취하여 구조화학적 연구에 사용하였다. 인간 성장 호르몬에 대해 양성으로 염색된 세포가 피막하 이식체에 존재하는 것이 발견되었으며, 신장실질의 형태는 정상적인 것으로 발견되었다. 대조군으로서, 형질감염되지 않은 LtK^-세포도 피막하 이식하였다. 이들 세포의 운명은 피막하로 이식된 형질감염 세포와 동일하였다.

여러 가지 요소들이 체내의 다양한 부위에서 인간 성장 호르몬을 생성하는 이식세포의 능력의 차이에 관여했을 것이다. 이식 부위의 관류(profusion)가 세포에 필수영양분을 공급하고 세포의 생존능력과 순환계내로 들어가는 인간 성장 호르몬의 양 모두에 영향을 주었을 것이다. 세포가 받는 정수압도 또한 이식 세포의 기능 발휘에 영향을 줄 것이다. 예를 들면, 신장피막하 세포는 복강내의 것보다 높은 정수압을 받을 것으로 예상된다. 세포는 어떤 위치에서는 더 잘 부착할 수 있었을 수도 있고, 마지막으로, 면역계 세포에 의한 이식체 대한 감시의 정도가 생성된 인간 성장 호르몬의 양에 영향을 주었을 것이다.

[실시예 5]

이식 세포의 상태

상기한 바와 같이, 플라스미드 pXGH5는 마우스 메탈로티오네인-Ⅰ 프로모터를 가지고 있다. 이식된 세포가 그들의 국소적 환경에 반응할 만큼 충분히 건강한가를 측정하기 위해, 인간 성장 호르몬을 더 높은 수준으로 발현하게 하는 아연의 능력을 측정하였다. 실시예 1B에서 기술대로 제조한 안정적 형질감염 세포를 마우스의 복강내로 이식했는데 이중 몇 마리에 대해서 식수 안에 76mM의 ZnSO₄를 넣었다. 아연으로 처리된 동물은 비처리군보다 혈청내에서 10배 이상 높게 인간 성장 호르몬을 발현했다. 이 실험의 결과는 제4도에 나타나 있다. 이러한 유도실험은 메탈로티오네인 융합 유전자에 대하여 이미 보고된 결과(피. 에프. 시알르 등이 쓴, Molec. Cell Biol. 5:1480-1488(1985); 알. 에프. 셀덴 등이 쓴, Molec. Cell Biol. 6:3173-179(1986))와 필적하며, 세포들이 복강내 환경에서 반응성을 유지함을 나타냈다. 더욱이, 피막하 이식체에서 얻어진 세포에서 취한 RNA는 정확한 mMT-Ⅰ/인간 성장 호르몬 융합 mRNA를 가지고 있었다(제5도). 종합해 볼 때 이들 결과는 이식 세포가 건강하고 예측대로 행동하고 있음을 시사한다. 실제상 중요한 것은 일단 동물내에 자리잡은 세포가 계속하여 외부수단에 의해 조절될 수 있다는 사실이다. 이 결과는 임상적 환경에서 목적 또는 유도자 유전자 산물의 발현이 약리학적 간섭을 받을 수 있음을 강력히 시사한다.

인간 성장 호르몬이 수용개체의 혈청에서 검출될 때마다 형질감염 세포의 존재를 검출할 수 있었다. 예를 들면, 이식후 1일부터 7일 동안 인간 성장 호르몬 생성 세포를 신장피막하에서 볼 수 있었다(육안 또는 광학현미경으로). 혈청 인간 성장 호르몬이 사라진 때, 이식 세포는 더 이상 검출되지 않았다. 일단 성장호르몬이 혈청에서 사라지면 결코 재출현이 없었다. 부가하여, 피막하 이식체를 받은 신장이 인간 성장 호르몬을 (핵전이성 이식체를 통해) 발현하는 마우스로부터 제거됐을 때, 그런 발현의 모든 흔적이 신장제거수술 수 수시간 내에 사라져다. 형질감염 세포는 또한 복강내와 피하 이식 부위에 국한되어 남아있는 것으로 보인다. 이런 발견은 인간 성장 호르몬 발현의 정지는 이식 세포가 파괴된 결과임을 나타냈다.

[실시예 6]

핵전이성 이식에서 면역계의 역할

혈청 인간 성장 호르몬 수준이 복강내 이식후 7 내지 15일 사이에 급격히 떨어진 것으로 보아, 이 제거기는 면역계에 의해 매개되었을 것으로 보였다. 핵전이성 이식에서 면역계의 잠재적 역할을 고찰하는 첫단계로 실시예 2에서 거론된 10마리 마우스 중 사전에 안정적 형질감염 세포의 복강내 이식체를 받았던 6마리의 C3H 마우스에 대하여 안정적 형질감염 세포를 다시 투여하였다. 새로운 형질감염 세포를 처음 받았을 때 이들 마우스에서 인간 성장 호르몬 발현 패턴은 15일 동안 지속 되었으나(도 6, 실선), 두 번째 시도후 인간 성장 호르몬치는 7일에는 거의 검출한 수 없었고 9일에는 없었다(도 6, 점선). 재시도한 마우스의 혈청 인간 성장 호르몬의 농도 추이에서는 또한 순응기가 없었다. 이러한 결과들은 형질감염 세포에 대한 숙주 마우스의 병력학적(anamestic) 반응과 일치한다. 혈질세포들이 원래 C3H 마우스에서 얻어진 것이지만, 이 세포수가 원래 확립된 이래 거의 40년이 지나면서 어떤 유전적 변화가 세포나 마우스에게서 일어난 것으로 보이며, 따라서, 그들은 더 이상 서로 완전히 동질 유전자성(synegeneic)이 아니다. 명백히 이질 유전자성(allogeneic)인 마우스(C57BL/6:H-2 및 비-H-2로 결정된 비화합성(incompatibilities)을 모두 나타냄)가 복강내로 형질감염 세포를 받았을 때, 그들이 인간 성장 호르몬을 발현하는 양상은 재시도된 C3H 마우스에서 나타나는 것과 유사했다(도 7, 실선). 2번째 시도후, 이질 유전자성 수용개체에서는 4일째에 인간 성장 호르몬이 검출되지 않았다(도 7, 점선). 이들 실험은 복강내 이식후 인간 성장 호르몬 발현 정지의 일차적 원인이 숙주의 면역계로 인한 세포의 사멸이라는 것을 시사했다.

[실시예 7]

이식체의 작용기간 연장

형질감염 세포가 이식 조직 거부반응(transplant rejection)에 의해 파괴된다면 면역억제가 이식체의 작용기간을 연장해야 할 것이다. 이러한 가정을 시험하기 위해, 안정적 형질감염 핵전이성 이식체를 받은 마우스에 대해 3가지의 다른 면역억제 섭생을 시켰는데, 토끼의 항-마우스(anti-mouse) 흉선세포 혈청(ALS)(씨. 에이. 발다무스 등이 쓴, 면역학, 110:1532-1541(1973)), 덱사메타손(DEX), 그리고 이들의 조합이 그것이다. 인간 성장 호르몬을 발현하는 형질감염 세포를 C3H 마우스에게로 복강내로 이식시킨 다음 면역억제를 하고, 혈청 인간 성장 호르몬을 추적했다. 항-마우스 흉선세포 혈청을 받은(이식일자 기준으로 -1, 1, 0, +1, +3일로 마우스로 한마리 당 0.25ml 씩 투여) 마우스는 비처리군보다 더 높은 혈청 인간 성장 호르몬치를 보였고, 약 2주 더 길게 인간 성장 호르몬을 발현했다(표 Ⅰ). 덱사메타손 처리를 한 마우스도 또한 이식후 48일까지 혈청 인간 성장 호르몬을 검출할 수 있을 정도로 발현이 증가되고 연장되는 것으로 나타났다.

[표 Ⅰ]

복강내 이식 세포에 대한 면역억제 효과

이원적 면역억제를 받는 마우스에 대하여, 항-마우스 흉선세포 혈청과 덱사메타손의 위에 기술한 대로 투여했다. 이들 마우스는 3개월 이상 인간 성장 호르몬을 발현했다(표 Ⅱ). 이 그룹의 약 20%는 인간 성장 호르몬의 농도가 약 500mg/ml까지 상승했다. 연장된 기간 동안 그렇게 높은 혈청 인간 성장 호르몬 수준을 보이는 것은 흔히 마우스에게 치명적임이 증명되었다. 많은 복강 표면위에 널리 퍼진 새로운 조직 반점(tissue plague)들이 형질감염 세포의 많은 집단에서 형성됨이 개복술에 의해 관찰되었다. 생존력이 있는 세포들이 복수에서도 현탁되어 있는 채로 발견되었다.

이들 마우스가 궁극적으로 죽는 것은 복강 세포 양이 증가하기 때문이 아니었는데, 왜냐하면 형질감염되지 않은 섬유아세포를 주사한 대조군의 C3H 마우스의 약 20%도 비슷한 세포증식을 보였기 때문이다. 그러나, 대조군의 마우스는 이식후 100일 이상 생존했다. 그러므로, 핵전이성 이식체를 받은 마우스의 죽음은 아마 성장 호르몬의 극도로 높은 혈청 수준에 기인하는 것 같았다.

[표 Ⅱ]

이원적 면역억제의 효과

[실시예 8]

면역억제된 마우스에서의 피막하 이식체의 생존

면역억제가 피막하 이식체인 형질세포에 의한 인간 성장 호르몬의 발현을 연장시키는가를 알아보기 위해 신장피막하에 그런 이식체를 받은 마우스를 래트의 항-마우스 흉선세포 혈청과 덱사메타손의 혼합물로 처리하여, 인간 성장 호르몬의 발현 수준을 추적했다. 혈청 인간 성장 호르몬치는 이식후 약 10일 후에 최고점에 도달했고, 그 다음 6일동안 감소하여 2개월 이상 약 5 내지 10mg/ml의 수준을 유지했다. 데사메타손이 이들 마우스에게 복강내 또는 피막하 세포 이식 후 1주일간 투여되었는데, 그 결과 이식체가 덱사메타손 투여중지후 수주동안 생존하였다. 세포의 궁극적인 파괴는 이식후 곧 발생한 덱사메타손 과민반응과 관련된 것일 가능성이 있다. 이러한 과민반응이 세포의 파괴를 일으키는 단지 하나의 요인일 수는 없는데, C3H 마우스를 계속적으로 덱사메타손만으로 처리한 경우, 형질감염 세포가 결국은 파괴되기 때문에 그러하다.

[실시예 9]

핵전이성 이식체에 의한 인간 인슐린 생성

마우스 LtK^-세포를 인간 프리프로인슐린(preproinsuilin) mRNA를 발현하게 만들어진 융합유전자로 티미딘 키나제 유전자와 함께 형질감염시켰다. 그러한 융합유전자와 함께 형질감염시켰을 때, 마우스 LtK^-세포는 프로인슐린(proinsulin)을 분비하지만 성숙한(mature) 인슐린을 생성할 수 없다. 여러 개의 인간 인슐린 융합유저자를 갖고, 인간 인슐린 mRNA를 합성하여 인간 프로인슐린을 분비하는 하나의 클론주(LtK⁺Ins라 칭함)를 좀 더 심화된 분석을 하기 위해 선택했다.

면역억제의 필요성을 제거하기 위해 누드 마우스가 LtK⁺Ins 세포에 대한 수용개체로 사용되었다. 약 10⁷세포들이 10마리 마우스 각각에 복강내 주사되었고(두시간 단식후) 혈청 시료를 한주일에 2, 3번 취했다(제8도). 이식후 거의 일주일 동안 혈당 수준이 이식전 값에 머물렀다. (160mg% +/-표준오차 10mg%). 1 내지 2주 사이에 혈당 수준이 급격히 떨어지고(77mg% +/-4mg%까지) 그 수준은 실험기간동안 낮게 유지됐다. 이러한 도포당 수준의 허락과 평행하게, 전체 인슐린 수준은 이식전 수치인 약 17uIU/ml에서 거의 60uIU/ml까지 뚜렷하게 상승했다. 전체 인슐린 검정은 프로인슐린과 단지 20%의 교차-반응성을 가지므로, 이들 동물에서 실제적 프로인슐린 수준은 측정에서 나타난 것 보다 매우 높은 것이다. 이 결과들은 핵전이성 이식이 작용성 인슐린 유전자를 전달하여 마우스에게 혈당치를 낮추는데 이용될 수 있음을 나타낸다.

[실시예 10]

당뇨병 치료를 위한 핵전이성 이식의 이용

당뇨병을 치료하는데 있어 핵전이성 이식을 적용할 가능성은 당뇨병 마우스에게 LtK⁺Ins 세포를 복강내 주사한 효과를 추적함을써 형상화되었다(modelled). 화학적으로 당뇨병성 동물을 얻기 위해, 한 마리당 8mg의 스트렙토조토신(streptozotocin)으로 C3H 마우스를 처리하고, 약 10 내지 15일 후에(2시간 단식 후) 혈당치를 측정했다. 이 연구를 목적으로 단식 혈당치가 400mg%나 그 이상이면 마우스가 당뇨병인 것으로 생각하였고, 이들 마우스 10마리에게 LtK⁺Ins 세포를 복강내로 주사하였다. 이 C3H 마우스는 토끼 항-마우스 흉선세포 혈청과 덱사메타손을 사용하여 면역을 억제했다. 이식후 1주내에 5마리의 마우스에게서 급격한 혈당 수준의 감소가 나타났다(제9도, 실선). 이식후 2주까지는 정상 혈당(normoglycemia)으로 이들 당뇨병성 마우스가 회복되었다. 나머지 5마리 마우스는 혈당치가 순차적으로 낮아지거나 전혀 감소하지 않았는데, 이는 면역억제가 모든 마우스에서 동일하게 효과를 내지 않음을 시사한 것이다(자료 미첨부). 대조군 당뇨병 쥐에서는 혈당치의 감소가 없었다(도 9, 점선). 5마리의 반응성 동물군에서는 계속적으로 떨어져, 궁국적으로는 핵전이성 이식으로 유도된 저혈당증으로 죽었다.

어떤 질병은 당뇨병보다 다루기 용이한 것으로 판명될 수 있으므로, 상기 당뇨병 유전자 요법의 대한 연구결과는, 전달되는 단백질이 엄격한 시간적인 조절이 필요가 없는 경우에도 응용가능할 것이다. 예를 들면, 혈우병은 손실된 응고 인자가 유전적으로 조작된 세포에 의해 제공된다면, 치료될 수 있을 것이다. 아마도, 그러한 치료에 있어서 유전적으로 조작된 세포의 제조에 사용되는 세포의 유형과 인자(factor)의 농도범위 등의 요건은 당뇨병의 치료의 경우에 비해 덜 엄격할 것이다.

[실시예 11]

다클론성 항체를 얻기 위한 핵전이성 이식의 이용

인간 성장 호르몬에 대한 항체를 다음과 같이 생성시켰다:

약 2×10⁷개의 마우스 LtK^-세포를 알. 셀덴 등(Molec. Cell Biol 6:3173-3179(1986)의 DEAE-덱스트란 형질감염 방식을 이용하여 pXGH5로 일시적 형질감염시켰다. 형질감염 후 4일째에 세포를 세척하여, 트립신 처리하고 C3H 마우스의 복강내로 이식했다. 상기 처리는 2주후에 반복했고, 동물은, ELISA용 시료를 얻기 위해 매주 채혈했다. 실험전에는, 마우스는 인간 성장 호르몬에 대한 항체가 검출되지 않았다. 일시적 형질감염 세포의 투여 2주내에(ELISA에 의한) 항-hGH 역가는 5마리 마우스에 평균 1,600이었다. 첫주사후 15일에 동물은 일시적 형질감염 세포를 2번째 주사 받았고, 약 2주 후의(즉, 첫 주사후 27일에)평균 역가는 38,000이었다. 5마리 마우스 모두가 항-hGH 항체를 생성하였고, 각각의 역가는 12,800에서 102,400까지 범위이었다. 동물들이 추가적 세포로 처리되지 않는 한, 한-hGH 역가는 점차로 떨어져 첫 주사후 68일에는 약 4,000인 것으로 나타났다.

상기한 방법의 여러 변형이 성공적으로 사용될 수도 있다. 예를 들면, 안정적 형질감염 세포(일시적 형질감염 세포 대신)를 이용할 수도 있다. 형질감염된 LtK^-세포는 마우스, 기니아 피그 및 토끼에서 항체를 생성하는데 이용할 수 있다. 항체는 또한 인간 성장 호르몬, 인간 성장 호르몬 변종, 인슐린 및 프로인슐린에 대해서도 생성될 수 있고, AtT-20 세포 등을 대신 사용할 수도 있다.

[실시예 12]

핵전이성 이식에의 AtT-20세포의 이용

AtT-20 세포주는 LAF1 마우스의 자생종양에서 얻은 특징이 잘 알려진 뇌하수체 종양세포주이다. 이들 세포를 pXGH5(mMT-I/hGH 융합 유전자를 갖는 플라스미드) 및 pKONEO (약물 G418에 내성 발현 유전자를 갖는 플라스미드)로 형질감염시켰다. AtT-20(neo⁺) F6로 명명한 안정적 형질감염 세포의 클론주를 좀 더 분석하기 위해 선택하였다. 이 클론주는 상당한 양의 hGH를 발현하였고, 이 세포는 분비기구를 보유하고 있으므로 hGH의 약 2/3가 분비되고, 나머지 1/3은 과립 상태로 저장된다.

약 5×10⁶개의 세포가 LAF1 마우스에게 복강내로 주사되었고, 이들 마우스로부터 이식후 1주일 간격으로 혈청 hGH 수준을 측정하기 위해 채혈하였다. 이식후 처음 이삼일 동안 혈청 hGH수준은 비교적 낮았다(1 내지 3ng/ml). 다음 1달에 걸쳐서 점차 증가해서 약 10mg/ml에 도달했다.

AtT-20(neo⁺) F6 세포를 사용한 hGH 발현 패턴은 LtK⁺GH세포를 사용한(실시예 11) 경우와 아주 다르다는 것은 알아둘만 하다. 다음에 기술된 이런 차이들은 임상의학자들에게 유리하게 이용될 수 있다:

a. 세포들은 종류에 따라 다른 성질을 가진다. 예를 들면 AtT-20 세포는 싸이클릭 AMP 유사체에 반응하여 hGH를 분비한다.

b. 세포들은 핵전이 동물에서 발현의 시간적 추이, 수준 및 수명 등에 있어서 종류에 따라 다른 양태를 보인다.

비슷한 연구가 인간 인슐린을 안정하게 발현하는 AtT-20 세포로도 행해졌다. pHINT5(마우스 메탈로티오네인-I/인간 인슐린 융합 유전자)와 pKONEO를 갖고 있는 안정적 형질감염 세포의 클론주가 제조되었다. AtT-20(neo⁺)10a로 명명된 이 클론주는 배지내로 적절히 처리된 인슐린을 분비한다(반대로, pHIN5로 형질감염된 L 세포는 프로인슐린을 분비한다). 누드 마우스에게 복강내 이식했을 때 혈당치는 pHINT5를 함유하는 L 세포와 거의 동일하게 감소하고, 혈청 인간 인슐린 수준은 증가함을 보였다.

[실시예 13]

형질감염 세포 제제를 이용한 부위-특이적 다클론성 항체의 생성

단백질 분자의 아미노 말단의 단편을 발현하는 형질감염 세포를 상기한 대로 제조하여 수용개체에 이식하였다. 수용개체에게 면역억제제는 제공되지 않았다. 상기 형질감염된 세포는 단백질의 아미노 말단 단편을 발현한다. 수용개체내에서의 이 단편의 존재는 이에 특이적으로 결합할 수 있는 다클론성 항체를 수용개체의 형질감염되지 않은 세포가 생성되도록 유도한다. 이들 다클론성 항체는 부위-특이적이다(즉, 발현된 아미노 말단 단편 상에 있는 에피토프에만 결합할 수 있다).

상기한 바와 같이, 동일 단백질 분자의 카복시 말단 단편을 발현할 수 있는 유전자 단편을 분리하여 단백질 분자의 카복시 말단 단편을 발현할 수 있는 형질감염 세포를 생성시켰다. 이 세포를 사용하여 만들어진 제제를 수용개체내로 이식시켰다. 형질감염된 세포에 의한 카복시 말단 단편의 발현은 형질감염되지 않은 세포가 발현된 단백질 분자의 카복시 말단 단편상의 에피토프에 특이적으로 결합할 수 있는 다클론성 항체를 생성하도록 유도하다. 이들 다클론성 항체는 부위 특이적이다.

[실시예 14]

다클론성 면역 검정

실시예 13에서 기술한 부위-특이적 다클론성 항체는 여러 가지 면역검정에 사용될 수 있다. 예를 들면, 단백질 분자의 아미노 말단 단편을 인식할 수 있는 다클론성 항체는 고체 지지체에 결합될 수 있다. 실시예 13의 단백질 분자를 갖고 있을 가능성이 있는 시료를 고체 지지체 존재하에 시료안에 존재하는 단백질이 상기 다클론성 항체에 결합하기에 충분한 시간동안 배양한다. 단백질 분자의 카복실기 말단을 인식할 수 있는 실시예 13의 다클론성 항체를 검출할 수 있게 표지하고 고체 지지체와 시료 존재하에 배양시킨다. 존재하는 단백질이(시료중에서 비결합 상태이거나 고체지지체에 결합한) 카복시 말단 특이적 다클론성 항체가 결합하기에 충분한 시간이 지난 후, 고체 지지체에 결합된 검출할 수 있게 표지된 다클론성 항체의 양을 측정한다. 결합된 카복시 말단-특이적 다클론성 항체의 양은 시료안의 단백질 분자 농도에 직접적으로 비례한다.

이 분야에 있어서 통상의 기술을 가진 사람에게 병백하듯이, 상기한 부위-특이적 다클론성 항체는 매우 다양한 다른 면역검정(예:균일, 불균일 등)에 이용될 수 있으며, 그런 이용은 본 발명의 범주에 포함되어야 하는 것이다. 일반적으로, 현행 단일클론성 항체 면역검정법은 어느 것이나 본 발명의 다클론성 항체의 이용에 채택될 수 있을 것이다.

[실시예 15]

핵전이성 이식을 이용한 하이브리도마의 생성

특정 유전자 사물을 발현하는 핵전이성 세포를 실시예 1 내지 4의 방법으로 생성시키고, 수용개체 동물에게 도입시킨다. 수용개체 동물내의 발현된 목적 유전자 산물의 존재는 발현된 목적 유전자 산물에 결합할 수 있는 항체를 생성하는 항체생성 세포가 발현하고 증식하도록 자극한다. 수용개체 동물의 비장세포(splenocytes)를 떼어내어 이 분야에 공지된 과정에 따라 배양한다(게르하르드 등의 Eur. J. Immunol. 5:720-725(1975) 참조). 떼어낸 비장세포는 다시 코프로브스키 등(미합중국 특허 제4,172,124호)이나 콜러 등 (Nature 256:495-497(1975))의 방법에 따라, 목적하는 유전자 산물에 결합할 수 있는 단일클론성 항체를 생성하는 하이브리도마(hybridoma) 세포를 생성시키기 위해, 골수종 세포(myeloma cell)에 융합시킨다.

상기한 하이브리도마 세포 생성 방법은 항원 분자를 필요로 하는 동물의 면역성 부여 방법에 비해 여러 유익한 점이 있다. 상기한 새로운 방법은 항원 분자의 초기 정제(initial purification)를 필요로 하지 않으므로 그런 정제를 실시할 수 없는 상황에서 이용할 수 있다.

상기 방법은 목적하는 단일클론성 항체를 생성하는 세포들에 대하여 하이브리도마 세포를 선별하는 것을 용이하게 하는데 이용될 수 있다. 전통적 하이브리도마 기술에서 생성된 하이브리도마 세포는 필요한 에피토프에 대한 항체를 생성하는 것들을 확인하기 위해 선별되어야 하다. 그러나, 항원 유전자의 단편만을 함유하는(그리하여, 항원 분자의 단편만을 생성할 수 있는) 핵전이성 세포를 수용개체 동물내에 도입함으로써 본 발명에서는 상기와 같은 선별 작업이 필요없게 된다. 핵전이 세포에 의해 발현되는 유전자 단편을 미리 선택함으로써 하이브리도마 집단의 다양성을 제한할 수 있게 된다.

[실시예 16]

면역억제제를 확인하기 핵전이성 이식의 용이

만약 핵전이성 이식 실험에서 이식된 세포와 숙주 동물이 동물 유전자성이 아니라면, 면역능을 갖는 숙주는 이식된 세포를 거부하는 반응을 일으킬 것이다.

이 거부반응을 이식된 세포의 생성물, 바람직하게는 hGH에 대해 검정하여 추적할 수 있다. 그러나, 핵전이성 동물이 면역 억제되었을 때, 이 거부반응은 면역억제 처방의 효력에 따라 지연되거나 방지될 것이다. 달리 말하면, 면역억제 처방은 혈청 hGH 발현 수준과 기간을 측정함으로써 정량적으로 평가할 수 있다. 이 방법을 이용하여 몇가지 면역억제제가 연구되었는데 싸이클로스포린(cyclosporin), 싸이클로포스파미드(cyclophsphamide), 덱사메타손, 토끼 항-마우스 흉선세포 항혈청(rabbit anti-mouse thymocyte antiserum), 및 항-마우스 흉선세포 단일클로날 항체 등이 그것이다. 이 기술은 면역억제를 평가하는 현행 방법에 비해 간단하고 정량적인 대안이다.

본 발명을 특정 실시예와 관련하여 설명하였지만, 이에 제한됨이 없이 발명의 범위 내에서의 변경이 가능함을 이해해야 한다. 일반적으로, 본 발명의 원리에 따라 본 발명이 속한 기술분야에서 공지되었거나 통상적인 실시범위내에서 첨부된 특허청구범위의 기술내용으로 부터 본 발명의 수정, 사용 또는 개작을 비롯한 변형도 본 특허출원에 의해 보호받아야 한다.

Claims (14)

1. (a) 목적 유전자 서열을 함유하여, 수용개체에 제공될 경우, 목적 유전자 서열의 발현을 유도함으로써 목적 유전자 산물(Ⅰ)의 생성을 유발하는 형질감염 세포를 함유하는 형질감염 세포 제제 유효량을 수용개체에 제공함을 포함하고, 여기에서 목적 유전자 서열의 발현은 수용개체의 형질감염되지 않은 세포가 생물학적 화합물을 생성하도록 유도하기에 충분한 방법에 의해 유도된, 목적 유전자 산물(Ⅱ)와 결합할 수 있는 하나 이상의 생물학적 화합물의 존재하에 시료를 배양하는 단계, 및

   (b) 상기 목적 유전자 산물(Ⅱ)에 결합된 상기 생물학적 화합물의 측정에 의해 상기 목적 유전자 산물(Ⅱ)의 농도를 결정하는 단계를 포함함을 특징으로 하는, 시료중의 목적 유전자 산물(Ⅱ)의 농도를 결정하는 방법.
2. 제1항에 있어서,

   상기 유전자 산물(Ⅰ)과 상기 유전자 산물(Ⅱ)가 동일하고, 상기 생물학적 화합물은 항체인, 시료중의 목적 유전자 산물(Ⅱ)의 농도를 결정하는 방법.
3. 제1항에 있어서,

   상기 유전자 산물(Ⅰ)이 상기 유전자 산물(Ⅱ)의 한 단편이고, 상기 생물학적 화합물은 상기 유전자 산물(Ⅱ)에 대해 부위-특이적 항체인, 시료인 목적 유전자 산물(Ⅱ)의 농도를 결정하는 방법.
4. (a) 두 개중 하나 이상의 생물학적 화합물이, 목적 유전자 서열을 함유하여 수용개체에 제공될 경우 목적 유전자 서열의 발현을 유도함으로써 목적 유전자 산물(Ⅰ)의 생성을 유발하는 형질감염 세포를 함유하는 형질감염 세포제제 유효량을 수용개체에 제공함을 포함하고, 여기에서 목적 유전자 서열의 발현은 수용개체의 형질감염되지 않은 세포가 생물학적 화합물을 생성하도록 유도하기에 충분한 방법에 의해 유도된, 목적 유전자 산물(Ⅱ)와 결합할 수 있는 두 개 이상의 상이한 생물학적 화합물의 존재하에 시료를 배양하는 단계, 및

   (b) 상기 목적 유전자 산물(Ⅱ)에 결합된 상기 생물학적 화합물의 양을 측정함으로써 상기 목적 유전자 산물(Ⅱ)의 농도를 결정하는 단계를 포함함을 특징으로 하는, 시료중 목적 유전자 산물(Ⅱ)의 농도를 결정하는 방법.
5. 제4항에 있어서,

   상기 유전자 산물(Ⅰ)과 상기 유전자 산물(Ⅱ)가 동일하고, 상기 생물학적 화합물중 한 개 이상은 항체인, 시료중 유전자 산물(Ⅱ)의 농도를 결정하는 방법.
6. 제5항에 있어서,

   상기 유전자 산물(Ⅰ)의 상기 유전자 산물(Ⅱ)의 한 단편이고 상기 생물학적 화합물중 한 개 이상은 상기 유전자 산물(Ⅱ)에 대하여 부위-특이적 항체인, 시료중 목적 유전자 산물(Ⅱ)의 농도를 결정하는 방법.
7. 항원 유전자 서열을 함유하여, 수용개체에 제공될 경우, 항원 유전자 서열의 발현을 유도함으로써 항원의 생성을 유발하는 형질감염 세포를 하나 이상 함유하는 형질 감염 세포 제제 유효량을 수용개체에 제공함을 포함하고, 여기에서 상기 항원 유전자 서열의 발현은 수용개체의 형질감염되지 않은 세포가 상기 항원에 대한 항체를 생성하도록 유도하기에 충분한 방법에 의해 유도된 항체.
8. 완전한 항원의 단편 유전자 서열을 함유하여, 수용개체에 제공될 경우, 상기 완전한 항원의 단편 유전자 서열의 발현을 유도함으로써 완전한 항원의 단편 생성을 유발하는 형질감염 세포를 하나 이상 함유하는 형질감염 세포 제제 유효량을 수용개체에 제공함을 포함하고, 여기에서 상기 완전한 항원의 단편 유전자 서열의 발현은 수용개체의 형질감염되지 않은 세포가 상기 완전한 항원에 대한 부위-특이적 항체를 생성하도록 유도하기에 충분한 방법에 의해 유도된 부위-특이적 항체.
9. (a) 항원 유전자 서열을 함유하여, 수용개체에 제공될 경우, 항원 유전자 서열의 발현을 유도함으로써 항원의 생성을 유발하는 형질 감염세포를 하나 이상 함유하는 형질감염 세포 제제를 수용개체내로 도입하는 단계,

   (b) 상기 수용개체에 면역 억제 활성을 갖는 평가 대상 약제(agent)를 투여하는 단계, 및,

   (c) 상기의 약제의 투여가 상기 항원과 결합할 수 있는 항체를 생성하는 수용개체의 능력에 영향을 주었는지를 결정하는 단계를 포함함을 특징으로 하는 면역억제제 활성을 갖는 약제의 평가 방법.
10. (a) 항원 또는 이의 단편의 유전자 서열을 함유하여, 수용개체에 제공될 경우, 항원 또는 이의 단편의 유전자 서열의 발현을 유도함으로써 항원 또는 이의 단편의 생성을 유발하는 형질감염 세포를 함유하는 형질감염 세포 제제 유효량을 수용개체에 제공함을 포함하고, 여기에서, 상기 항원 또는 이의 단편의 유전자 서열의 발현은 수용개체의 형질감염되지 않은 세포가 항체 또는 부위-특이적 항체를 생성하도록 유도하기에 충분한 방법에 의해 항체 또는 부위-특이적 항체의 생성을 유도하는 단계,

    (b) 상기 항체 또는 부위-특이적 항체를 생성할 수 있는 세포를 상기 수용개체로터 떼어내는 단계, 및

    (c) 상기 단계(b)의 세포와 죽지 않는 골수종 세포 사이에 하이브리도마를 형성시켜 상기 항체 또는 부위-특이적 항체를 생산하는 단계를 포함함을 특징으로 하는, 단일클론성 항체를 생산하는 방법.
11. 형질감염 세포를 포함함을 특징으로 하는 이식체.
12. 제11항에 있어서,

    상기 이식체가 피막하(subcapsular) 이식체인, 이식체.
13. 제12항에 있어서,

    상기 이식체가 복강내 이식체인, 이식체.
14. 제11항의 이식체를 포함하는 핵전이성의 인간을 제외한 동물.