DK173137B1 - Anvendelse af celler til fremstilling af et implantat til anvendelse ved genterapi, fremgangsmåde til fremstilling af impla - Google Patents

Description

DK 173137 B1

Den foreliggende opfindelse angår anvendelse af celler til fremstilling af et implantat til anvendelse ved transkaryot genterapi.

Sygdomme, der arves fra et individs foraldre, kendes som genetiske sygdomme. Mindst 1500 forskellige humane sygdomme vides 5 allerede at vare genetisk bestemte (V.A. McKusick, Mendelian Inheritance in Man (Johns Hopkins Press, Baltimore, 3. udgave, 1971). Den specifikke molekylers baggrund for de fleste af disse sygdomme er endnu ikke klarlagt. I mange tilfalde er sygdommens baggrund imidlertid blevet bestemt som varende en 10 specifik enzymmangel (V.A. McKusick, Ann. Rev. Genet. 4:1 (1970)).

I øjeblikket kendes ingen helt acceptabel genterapeutisk metode. Humane genetiske sygdomme behandledes sadvanligvis enten ved hjalp af kostterapi (såsom undgåelse af phenylalanin for 15 så vidt angår personer, der lider af phenylketonuria), ved hjalp af lagemiddelbehandling (såsom anvendelsen af inhibitorer af enzymet xanthinoxidase (dvs. allopurinol) med henblik på reduktion af akkumulationen af urinsyre, der er forbundet ned podagra og Lesch-Nyhansyndromet) eller ved hjalp af gen-^ produkt-erstatningsbehandling (såsom ved administration af faktor VIII til individer, der lider af hamofilia).

Uheldigvis reagerer mange genetiske sygdomme endnu ikke på nogen af de ovenfor navnte behandlinger. F.eks. kan genetiske forstyrrelser af aminosyrestofskifte generelt ikke styres godt 25 ved hjalp af kostbehandling. Akkumulationssygdomme i forbindelse ned lysosomale enzymmangelsygdomme har indtil nu ikke vist sig at reagere på enzymterapi. Selv 1 tilfalde, hvor en sygdom kan bekampes ved hjalp af en af de ovenfor navnte metoder, er endvidere sygdomsbehandling sjaldent perfekt.

30

Som reaktion på manglerne ved de ovenfor navnte metoder hqr * forskere forsøgt at anvende rekombinant DNA-teknik til behand- DK 173137 B1 2 ling af genetiske sygdomme. Sådan genterapi kan bredt defineres som et medicinsk/kirurgisk indgreb, ved hvilket patientens genom med vilje ændres til forbedring af en patofysiologisk tilstand, og som sådan kan udtrykket underopdeles i kønscelle-5 linie-genterapi og somatisk cellegenterapi. På basis af både etiske og praktiske kriterier lader det sig ikke gøre at forsøge kønscellegentejapl på mennesker0¾ fra et etisk perspektiv ville modifikation af kønscellelinien, omend svagt, andre efterfølgende generationer af mennesker med 1angtidsvirknin-10 ger, der ikke fuldstændigt kan forudsiges. Somatisk cellegenterapi ville 1 modsatning dertil kun påvirke det individ, der blev udsat for terapien, og det nye gen ville ikke komme ind 1 genbeholdningen. Fra et praktisk synspunkt er kønscelleliniegenoverførsel relativt ineffektiv, Idet de injicerede geners 15 skæbne ikke kan forudsiges, og måske mest vigtigt er det, med nogle få undtagelser, at det ikke ville være muligt at bestemme den fremtidige fænotype (med hensyn til en given sygdom) af en enkelt celle eller af et fosterkim efter tidlig spaltning.

20 Somatisk cellegenterapi synes imidlertid at være en rimelig løsning til behandling og helbredelse af visse forstyrrelser hos mennesker. I et somatisk cellegen-udleveringssystem fjernes celler fra patienten, dyrkes in vitro, transficeres og reimplanteres. Modifikationer af dette grundlæggende skema 25 indbefatter, men er ikke begrænset til valg af celletypen og celledonoren (Ikke nødvendigvis patienten), transfekt1 onsforskriften og stedet for reimplantation.

Flere metoder er indtil nu blevet udviklet, der virker lovende 30 som middel til at levere DNA til et Individ. En godt beskrevet metode Indebærer anvendelse af retrovirale vektorer (H. Varmus et al., 1: RNA Tumor Viruses, Weiss et al., Udg. (Cold Spring Harbor Laboratory, New York, 1982); H. Varmus, Science 216:812 (1982); Risser et al., Ann. Rev. Genet. 17:65 (1983)). Ved 35 denne løsning Indføres et særligt gen 1 et retrovirus, som derpå indføres 1 et Individ. Retrovlra lagrer deres genetiske information i RNA, og, efter indføring 1 en celle, omvendt DK 173137 B1 3 transkriberer (derfor navnet "retro") denne Information til DNA, som derpå bliver integreret og udtrykt i vmrtscellens genom. I praksis opbygges rekombinant retrovirus indeholdende genet, der er Interesse for, samt en del af det retrovirale 5 genom (nogle retrovirale gener fjernes, så at viruset ikke kan replikere) under anvendelse af gensplejsningsmetoder. Dette kunstige virus anvendes til inficering af marvceller in vitro, og disse celler injiceres intravenøs i dødeligt bestrålede modtagermus, hvor de til sidst finder vej til marven og mil-10 ten. Ved anvendelse af denne løsning er gener, der koder for neomycInphosphotransferase (O.A. Williams et al., Nature, 310:476-481 (1984)), adenosindeaminase (D.A. Williams et al., Proc. Natl. Acad. Sc. USA, 83:2566-2570 (1986)) og hypoxan-thinphosphoribosyltransferase (A.D. Hiller et al.. Science 15 225:630-632 (1984)),' blevet udtrykt i mus.

En anden teknik, hvorved benyttes DNA-konstruktioner omfattende retroviralt DNA, er omhandlet i EP-A-0.161.640. Her cotransformeredes DNA-konstruktioner med en aviær, retroviral, lang terminalgentagelse. (LTR) ligeret til et bovint væksthormongen i dyrkede museceller. Disse celler indkapsledes så i hule fibre egnet til implantation i 20 dyr.

I de sidste få år er det blevet klart, at implementering af retroviralt baserede genleveringssystemer i mennesker vil støde på stor modstand, primert knyttet til egenskaber hos retro-vira som sådanne (M. Robertson, Nature 320:213-214 (1986) og 25 J. L. Marx, J.L., Science 232:824-825 (1986)). For det første har det ikke veret generelt muligt at opnå ekspression af pattedyrgener 1 de retrovirale vektorer, der blev benyttet til inficering af menneskeceller, og indtil dette problem er løst, kan man ikke give sig i kast med reguleret genekspression. For 30 det andet, når retrovira anvendes til portionsvis inficering af marvceller. Inficeres i det vmsentlige enhver celle, og stedet for retroviral integration i vmrtens genom varierer fra celle til celle. Eftersom de inficerede celler ikke er blevet karakteriseret før reintroduktionen, kan muligheden for en DK 173137 B1 4 skadelig intergrationsbegivenhed ikke udelukkes. For det tredje, eftersom rekombination mellem de til infektionen benyttede replikationsmangelfulde retrovira og de endogene retrovira, der findes i pattedyrgenomer, vides at finde sted (R.A. Hock 5 et al., Nature 320:275-277 (1986)), foreligger der en mulighed for initiering af en kronisk retroviral infektion i vmrtsdy-ret. For det fjerde er marv sandsynligvis ikke det optimale ekspressionssted for mange (om ikke de fleste) terapeutisk importerede gener.

10 En artikel af Jean Marx i Science 233:824-825 (1986) med overskriften "Gene Therapy-So Near and Yet So Far" beskriver det aktuelle tekniske niveau for genterapi og konkluderer, at der er behov for konstruktion af nye retrovirale vektorer for at forbedre ekspressionen af fremmede gener ved overførsel til levende dyr.

En alternativ genterapeutisk løsning indebarer indføring af IS DNA i en celle ved hjalp af kemiske metoder i modsatning til virale metoder. Ved denne løsning indføres DNA i en modtagercelle ved hjalp af calciumphosphat-formidlet transfektion. Generelt bliver modtagercellerne først fjernet fra et individ og inkuberet i ncrvarelse af en DNA-opløsning Indeholdende det 20 gen, hvis indføring ønskes. Efter at genet er blevet indført i cellen, føres cellen tilbage til individet. I øjeblikket er de eneste celler, som kan fjernes fra et individ, behandles og derefter genindføres, benmarvsstamceller og hudfibroblaster (W. F. Anderson, Science 226:401-409 (1984). M.J. Cline et al. (Nature 284:422 25 (1982) omhandler vellykket overførsel af et funktionelt dihydrofolatreduktasegen til benmarven i mus.

De nuverende kemiske metoder lider af en betydelig ulempe i form af lav effektivitet. Transfektion. har vist sig kun at finde sted i en ud af 106 eller 107 celler. Eftersom kun ca.

30 107 eller iq8 celler kan opn&s rut 1 nemmssigt fra et individ ved hjmlp af benmarvstransplantation, ville den kemiske teknik betyde, at lo til 100 stamceller ville blive transficeret. Endvidere er vanskeligheden ved dyrkning af sådanne celler i f 5 DK 173137 B1 mere end nogle få dage en betydelig begrensning for denne me-tode. Det antages 1 øjeblikket, at ti 1 stedeverelsen af så få modificerede celler sammenlignet med det samlede antal celler i bennarvspopulationen ville vare af ringe terapeutisk værdi.

5 En tredje vigtig nuværende genterapeutisk løsning indebærer anvendelsen af fysiske metoder, såsom mikroinjektion eller elektroporation. Mikroinjektion indebærer injektion af DNA i isolerede, individuelle celler. Selvom metoden er yderst effektiv, lider den af den ulempe, at kun en celle ad gangen kan 10 injiceres. Metoden har været mest vellykket til indføring af DNA i befrugtede museæg (J.H. Gordon et al.. Science 214:1244 (1984); E.F. Wagner et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 78:5016 (1981); T.E. Wagner et al,,Proc. Natl. Acad. Sci, USA 78:6376 (1981); og R.D. Palmiter et al.. Nature 300:611 (1982)). R.E.

15 Hammer et al., (Nature 311:65 (1984)) benyttede denne metode til delvis ændring af en mus med en defekt i sin væksthormon-produktion. Elektroporation indebærer transport af DNA direkte gennem en cellemembran ved anvendelse af en elektrisk strøm.

Den har været benyttet til overføring af DNA til B. lymfocyt-20 ter (E. Neumann et al., EMBO J. 1:841 (1982)).

Alt i alt har forskellige konventionelle metoder og rekombi-nant metoder været foreslået til behandling af genetiske sygdomme. 1 øjeblikket synes imidlertid ingen enkelt metode at være helt tilfredsstillende. Anvendelsen af virale vektorer 25 lider af deres mulighed for omlejring af endogene gener samt deres mulighed for indføring af carcinogenese. Fysiske metoder er, selvom 'de er meget effektive, 1 øjeblikket uanvendelige til det store antal celler, som nødvendigvis måtte trans-ficeres med henblik på opnåelse af en rimelig terapi. Kemiske 30 procedurer Indebærer indføring af 0ΝΑ i en celle, der forinden var blevet udtaget fra et Individ. I øjeblikket er metoderne begrænset til benmarvsceller og fibrobla^ter, og den er ikke tilstrækkelig effektiv til at udgøre en levedygtig terapi. Situationen på dette område gennemgås af T. Friedman et al., DK 173137 B1 6 (Science 175:949-955) (1972) og W.F. Anderson (Science 226:401-409 (1964)).

Bindende proteiner, såsom antistoffer, anvendes i vid udstrækning til analyse for tilstedeværelsen eller koncentrationen af 5 bestemte molekyler, såsom antigener eller haptener. Et antigen er et molekyle, som ved Indføring i et dyr, får dyret til at producere antistoffer, der er i stand til at binde til det. I modsætning hertil er et haptenmolekyle i stand til at binde til antistoffer, men er ude af stand til at fremkalde produk-10 tion deraf. Antistoffer binder til både haptener og antigener ved at identificere særlige strukturelle regioner (kendt som "ep i toper") i molekylerne. Et hapten- eller antigenmolekyle kan indeholde mere end en epitop region.

Antistofpræparater kan bredt deles i to klasser. Præparater 15 indeholdende polyklonalt antistof opnås ved injektion (eller indføring på anden måde) af et antigenmolekyle i et dyr. Tilstedeværelsen af antigenmolekylet stimulerer antistofproducerende celler til at producere arter af antistoffer, der er i stand til at binde til antigenets epitoper. Forskellige antl-20 stofproducerende celler er i stand til at producere forskellige antistofmolekyler. Indføringen af et antigen i et dyr resulterer i produktion af række forskellige antistofmoleky-ler, som indbefatter antistoffer, der er i stand til at binde til hver af antigenmolekylets epitoper. På grund af at et så-25 dant præparat Indbefatter antistoffer, som blev produceret fra forskellige producentceller, betegnes det som et "polyklonalt" antistofpræparat.

Fortrinlige redegørelser for metoderne og teknikken til fremstilling af polyklonale antistoffer kan findes i Nikrobiology, 30 2. udgave, B.D. Davis et al., Harper & Row, Hew York (1973), side 352-358; og Remington's Pharmaceutical Sciences, 16. udgave, A. Osol, udgivet af Mack Publishing, Easton, Pa. (1980), side 1315-1351.

* 7 DK 173137 B1

Det faktum, at Individuelle antistofproducerende celler er i stand til at producere kun en enkelt antistofart, er meget betydningsfuldt. Sådanne Individuelle celler kan renses ved kloning og sammensmeltes til nedbrydel1ggjorte myelomaceller, S hvorved der produceres en udødeliggjort celle, som er 1 stand til at producere en enkelt antistofart. Sådanne sammensmeltede celler kendes som "hybridoma"-celler, og de antistoffer, som de producerer, kendes som "monoklonale" antistoffer. Procedurerne til fremstilling af monoklonale antistoffer er omhandlet 10 US patentskrift nr. 4.172.124 (H. Koprowski et al.) samt 1 Monoclonal Antibodies, Hybrldomas: A New Dimension In Biological Analyses, R.H. Kennett et al. (Udg.), Plenum Press, New York (1980).

Forskellen mellem monoklonale og polyklonale antistoffer lig- .

15 ger Ikke i deres individuelle specificitet eller bindingsaffinitet. Begge typer antistofmolekyler udviser mkvlvalent specificitet og bindingsaffinitet over for antigenmolekyler. Pra-parater Indeholdende polyklonale antistoffer omfatter enten en ikke-fraktioneret blanding, eller rensede blandinger af IgG-20 molekyler, af forskellige antistofarter, hvoraf mange er i stand til at binde til forskellige epitoper. I modsmtning hertil indeholder et preparat af monoklonale antistoffer kun en enkelt antistofart. Som følge af, at de er sammensat af en enkelt art, kan prmparater af monoklonale antistoffer (omend 25 ikke nødvendigvis selve antistofferne) have større specificitet end tilfaldet er for et prmparat af polyklonale antistoffer .

Betydningsfuldt er det, at for at fremproducere enten monoklonale eller polyklonale antistoffer er det generelt nødvendigt 30 at udsatte de antistofproducerende celler for betydelige mang-der af antigenet. Generelt er det således nødvendigt at Isolere og rense antigenmolekylerne, før antistofproduktion kan fremkaldes. I praksis er det imidlertid ofte vanskeligt at Isolere og rense bestemte antigenmolekyler. Dette er isår til- DK 173137 B1 8 fjeldet, hvis antigenmolekylerne er hormoner, menbranprotelner eller andre molekyler, der kun foreligger 1 meget lave koncentrationer 1 kildematerialer. I tilfælde af sådanne molekyler er det således ofte vanskeligt eller umuligt at opnå antlstof-5 fer. Der foreligger derfor et behov for en fremgangsmåde til fremstilling af antistoffer, der ikke kræver forudgående isolation eller rensning af antigenmolekylet.

Ifølge én udførelsesfonn af den foreliggende opfindelse anvises der en anvendelse af celler til fremstilling af et implantat til anvendelse ved transkaryot genterapi, hvilket 10 implantat er indrettet til at ændre koncentrationen af et ønsket genprodukt i et modtagerindivid, idet implantatet omfatter celler opnået ved: (a) transficering af et cellepræparat med en gensekvens, der koder for det ønskede genprodukt, men ikke omfatter retroviralt DNA; og (b) screening af de opnåede transficerede celler til udvælgelse af en celle, som besidder 15 de ønskede ekspressionsegenskaber, og kloning af nævnte celle; hvor de klonede celler, når de gives til individet, styrer ekspressionen af den ønskede gensekvens til fremkaldelse af produktion af det ønskede genprodukt, idet gensekvensen, der koder for det ønskede genprodukt, er operativt bundet i de klonede celler til en konstitutiv og/eller regulerbar promotor.

20 Ifølge en yderligere udførelsesform af den foreliggende opfindelse anvises der en anvendelse af celler til fremstilling af et implantat til anvendelse ved transkaryot genterapi, hvilket implantat er indrettet til at ændre koncentrationen af et ønsket genprodukt i et modtagerindivid, idet implantatet omfatter celler opnået ved: (a) transficering af et cellepræparat med en gensekvens, der koder for et effektorgen-25 produkt, men ikke omfatter retroviralt DNA; og (b) screening af de opnåede transficerede celler til udvælgelse af en celle, som besidder de ønskede ekspressionsegenskaber, og kloning af nævnte celle; hvor de klonede celler, når de gives til individet, styrer ekspressionen af en ønsket gensekvens til fremkaldelse af produktion af det ønskede genprodukt, idet gensekvensen, der koder DK 173137 B1 9 for effektorgenproduktet, er operativt bundet i de klonede celler til en konstitutiv og/eller regulerbar promotor.

Forskellige foretrukne træk ved den foreliggende opfindelse fremgår af de afhængige krav, det vil sige i krav 3 til 39.

5 Fig. 1 viser skematisk en udførelsesfora for transkaryot 1a-plantering. Dyrkede celler co-transfIceres med genet af terapeutisk interesse samt et gen, der indkoder en udvalgellg markør. Stabilt transfIcerede celler Identificeres ved deres evne til at udtrykke aarkørgenet, som godtgøres af deres evne 10 til at overleve udvagelsesbehandlingen (celler, der ikke har optaget aarkørgenet, nedbrydes af denne behandling). Individuelle kolonier af stabilt transfIcerede celler formeres derpå og karakteriseres aed hensyn til ekspressionen og reguleringen af genet, der har terapeutisk Interesse. En klonal 11-15 nle aed de ønskede ekspressionsegenskaber indføres derpå 1 en af en rakke forskellige anatomiske lokatloner 1 vartsdyret, der selv karakter isåres aed hensyn til ekspression af genet af interesse.

Fig. 2 viser aangden af humant vaksthoraon, der påvises 1 20 blodstrøaaen hos bus, sob havde fået 1 ntraperltoneale Injektioner af enten forbigående transfIcerede (punkterede linier) eller stabilt transfIcerede (fuldt optrukne linier) celler.

Fig. 3 viser aangden af humant vaksthormon, der findes 1 blodstrøaaen hos mus, soa havde aodtaget enten subkutant transfl-25 cerede celler (fuldt optrukne linier, trekanter) eller havde aodtaget de transfIcerede celler ved hjalp af laplanterlng 1 Indkapslet fora (fuldt optrukken linie, cirkler). Den punkterede linie viser data for transkaryote implantater 1 kapselfora, normaliseret til antallet af Implanterede celler.

30 Fig. 4 viser virkningen af zinkadainistration på niveauerne af vaksthoraon 1 en mus Indeholdende transficerede celler, hvori DK 173137 B1 ΙΟ v*ksthormongenet blev styret ved hjælp af metallothionein-I-promotoren.

Flg. 5 viser påvisningen af musemetalloth1one1n-I/humant væksthormon mRNA 1 transfIcerede celler, der er udvundet fra 5 et Implantat 1 Indkapslet form.

Fig. 6 viser niveauerne af humant vmksthormon som funktion af dagene efter 1mplanter1ng af stabilt transfIcerede celler 1 en modtagermus, som forinden havde modtaget et transkaryot lapi antat.

10 Flg. 7 viser niveauerne af vmksthormoh, der udtrykkes ved hjalp af et transfleeret Implantat i al logene mus (fuldt optrukken linie). Den punkterede linie viser ekspression af væksthormon som resultat af en anden efterfølgende Implante-rlng.

15 Fig. 8 viser afgivelsen af funktionelle Insulingener til normale og diabetiske mus under anvendelse af transkaryot Implan-terlng. Ltk+Ins-cellel1nien blev udvalgt efter co-transfektion med et musemetalloth1onein-I/humant 1 nsul Infusionsgen (Indføjet). Ca. 107 Ltk+Ins-celler blev Injiceret Intraperitonealt 20 1 10 nøgne mus. Musene blev åreladet efter to tiners faste på angivne dage efter transf leering. Serumgiucosenlveauer (fuldt optrukken linie) blev bestemt som anbefalet af fabrikanten (Worthington), og gennemsnitsniveauer er vist tillige med standardfejl som stænger. Gennemsnitlige seruminsulInnlveauer 2^ (punkteret linie) blev bestemt ved at samle serunprøver fra musene og blev udført som anbefalet af fabrikanten (Diagnostic Products).

Fig. 9 viser transkaryote Implantaters evne til at tilvejebringe fysiologisk signifikante Insulinniveauer. TI C3H-mus blev immunundertrykt og injiceret Intraperitonealt som ovenfor beskrevet. Mus blev åreladt efter to timers faste, og serum-glucosenlveauer blev bestemt. Fem af musene udviste forlmngede DK 173137 B1 11 fald i serunglucosenlveauer (fuldt optrukken linie) .og blev til sidst hypoglykæmiske. Serumglucoseniveauer fra en gruppe på fem diabetiske mus, der ikke havde undergået transkaryot implantering, blev målt som en kontrol (punkteret linie).

5 I. Opfindelsens terminologi.

Den foreliggende opfindelse tillader ændring af koncentrationen af et ønsket genprodukt i et modtagerindivid. Denne ændring indebærer indføring af en transficeret celle, der bærer enten en ønsket gensekvens eller en effektorgensekvens, i modtagerindividet. For at blive benyttet ifølge den foreliggende opfindelse skal dén indførte ønskede gensekvens 10 være i stand til at blive udtrykt i modtagerindividet. Fig. 1 viser et skematisk diagram over transkaryot implantering.

"Modtagerindividet", som kan benyttes ifølge den foreliggende opfindelse, indbefatter dyr og mennesker, og udtrykket "modtagermdivid", som heri benyttet refererer til modtageren af den transficerede celle indeholdende det ønskede gen.

15 Ifølge den foreliggende opfindelse er en "transficeret celle" en celle, der er blevet manipuleret med In vitro, så at den indeholder et bestemt gen, hvis eksp'ression i~ et modtagerin-divid ønskes. Hvis således man f.eks. ønsker at udtrykke vmksthormongenet 1 et bestemt individ, så ville man indføre 20 genet for væksthormon i en celle (og derved danne en transficeret celle) på en sådan måde, at cellen ville udtrykke dette gen ved indføring i modtager individet. Selvom det ikke er nødvendigt, vil denne gensekvens typisk vmre identisk med den normale gensekvens hos de arter, hvortil modtagerindividet 25 hører. Hvis man således ønsker at bibringe et dyr yderligere væksthormon, kunne man anvende en transficeret celle, son Indeholdt enten dette dyrs væksthormongen eller, alternativt, en anderledes arts hormongen, når blot det benyttede væksthormongen ville være i stand til at udtrykkes i modtagerindividet.

DK 173137 B1 12

Et modtager individ, som Indeholder en sådan transflceret celle, siges at vare et "transkaryot" modtager Individ. Et trans-karyot dyr afviger vasentligt fra et transgent dyr. I et transgent dyr Indeholder alle dyrets celler en gensekvens, der 5 ikke er naturligt t1l stede i andre dyr tilhørende den samme art. I et transkaryot dyr indeholder kun de indførte trans-flcerede celler en sådan sekvens. Den alt overvejende mengde celler 1 dyret er umndrede. Transgenisk terapi indebarer således andring af et dyrs kimbane på en måde, der andrer det ge-10 netiske Indhold i hver af dyrets celler. I modsatning hertil indebarer transkaryot terapi somatiske celler og andrer ikke det genetiske indhold 1 dyrets celler.

Indføringen af en transflceret celle i et modtager individ omtales heri som "transkaryot implantering".

15 Et "transficeret cellepraparat" er en suspension af celler, som Indeholder mindst en transficeret celle, enten (1) i en fysiologisk acceptabel puffer eller barer, eller (2) 1 en fysiologisk acceptabel beholder. Phosphatpufret saltvand er et eksempel på en sådan egnet barer. Et "transkaryot implantat" 20 er et Implantat, som indeholder mindst en transflceret celle.

Π. Ekspression af (transficerede celler i et modtagerindivid)

Den foreliggende opfindelse stiller et middel til rådighed til at give et modtagerindivid genterapi. En sådan terapi opnås ved hjalp af Indføring af en transficeret celle (der er i stand til at ud-25 trykke en bestemt gensekvens 1 individet). Den specifikke sekvens, eller naturen af den genetiske sekvens, der skal indføres i individet, vil blive valgt afhangigt af det specifikke genprodukt, hvis koncentration 1 modtager individet man ønsker DK 173137 B1 13 at andre. Den Indførte gensekvens kan andre koncentrationen af det ønskede genprodukt ved at vare 1 stand til at udtrykke det ønskede genprodukt (eller en akvlvalent eller mutant fore af det ønskede genprodukt), 1 hvilket tilfalde den Indførte gen-5 sekvens kaldes en "ønsket gensekvens". Den Indførte gensekvens kan alternativt andre koncentrationen af det ønskede genprodukt ved at frembringe ekspressionen af det ønskede genprodukt ved hjalp af de 1kke-transfIcerede (dvs. naturlige) celler 1 modtager Individet, 1 hvilket tilfalde gensekvensen kaldes en 10 "effektorgensekvens". Hvis man således ønskede at andre koncentrationen af vaksthormon, kunne man Indføre genetiske sekvenser, som er 1 stand til direkte at påvirke koncentrationen af veksthormonet, ved at tilvejebringe en transflceret celle, som udtrykker vaksthormon, eller Indirekte ved at fremkalde 15 ekspressionen af vaksthormon ved hjalp af en Ikke-transfIceret celle 1 dyret. På en lignende måde kan ethvert gen, som kan Isoleres og klones, anvendes 1 overensstemmelse med den foreliggende opfindelse.

Udtrykket "ekspression” som heri benyttet refererer til en 20 celles evne t1) at lede transkriptlonen af en genetisk sekvens til mRNA, translationen af mRNA til protein samt sekretionen af proteinet ud af cellen. Sekretion af genprodukter kan finde sted naturligt eller kan opnås ved hjalp af operativ binding af det ønskede gen eller effektorgenet til en sekretlonssig-25 nalssekvens. Ekspression siges at vare "normal", hvis den finder sted i et omfang Inden for accepterede normer for det på-galdende genprodukt 1 en bestemt art, eller hvis omfanget af ekspression er i det vasentiige ekvlvalent med det omfang, der Iagttages 1 ubehandlede Individer tilhørende den samme art som 30 modtagerindividet. "Ikke-normal ekspression" refererer typisk til ekspression, som er mindre end den, der findes 1 normale medlemmer af Individets art, selvom den også kan beskrive overekspression af et bestemt genprodukt. Ekspression anses at vare "fysiologisk signifikant", hvis den resulterer 1 en an- DK 173137 B1 14 drlng 1 modtager Individets fysiologi· Ekspression, der er af så lav en grad, at den ikke har nogen fysiologisk betydning for modtagerindividet, ville således Ikke anses for at vmre fysiologisk signifikant. Omvendt, hvis ekspression påvirker et 5 modtager individs generelle fysiologi« den fysiologisk signifikant, således som udtrykket benyttes heri.

For at frembringe genekspression er det nødvendigt, at de strukturelle sekvenser af det ønskede gen eller effektorgenet operativt knyttes til en promotorreglon. En promotorregion er 10 en DNA-sekvens, der genkendes af den transfieerede celle som et sted, på hvilket transkriptlonen af en gensekvens skal begynde. En gensekvens siges at vare operativt knyttet til en promotorregion, hvis bindingen er ti 1strakkelig til at muliggøre transkription af gensekvenserne som følge af tilstedevs-15 reisen af promotorregionen. I en udførelsesform for den foreliggende opfindelse indføres de ønskede DNA-sekvenser eller effektor-ONA-sekvenserne i den transfieerede celle knyttet til deres normale og naturlige promotorregioner. Sådanne trans-fieerede celler er i stand til at producere produktet af det 20 ønskede gen eller effektorgenet under genets normale regulerende styring. Alternativt er det i en foretrukken udførelsesforn muligt at knytte en bestemt ønsket gensekvens eller ef-fektorgensekvens til en promotorreglon, hvormed den normalt ikke er associeret. Enhyer promotor, der er 1 stand til at 25 fungere 1 den transfIeerede celle, kan således operativt knyttes til den ønskede gensekvens eller effektorgensekvensen og anvendes til ekspression af genet i den transkaryote celle.

(Den tidligere ansøgning WO 88/01296 beskriver en nyttig teknik til vurdering af pro-motere ved anvendelse af en forbigående transficeringsbestemmelse).

DK 173137 B1 15

Promotorregionen kan enten være konstitutiv eller regulerbar. Til de foretrukne regulerbare promotorregioner, som kan anvendes, hører musemetallothionem-proaotorr'eglonen. Denne promotorregion leder transkription af operativt tilknyttede genetiske sekvenser som direkte reaktion 5 på koncentrationen af visse tungmetaller (zink eller cadmium) eller glucocorticoider. Ved administration af sådanne ioner til modtager individet kan man således styre ekspressionsgraden af de operativt tilknyttede gensekvenser.

Alternativt kan der anvendes promotorregioner, som kan regu-10 leres ved hjalp af temperatur (såsom Orosophila-varmechokpro-motoren), sukkerarter (såsom gal-4-gmrpromotoren), dobbeltstrenget RNA, etc.

Anvendeligheden af genterapi rakker ud over behandlingen af klassiske genetiske forstyrrelser, de nedarvede sygdomme for-15 årsaget af et manglende eller mutant gen, som resulterer 1 et fravarende eller afvigende proteinprodukt. En rakke forskellige patofysiologiske tilstande kan behandles ved afgivelse af et specifikt protein, eksempelvis ved anvendelse af genterapi til diabetes. Selvom både diabetes af typerne X og II kan have 20 en genetisk komponent, er selve insulingenet i langt de fleste tilfalde upåvirket. Til denne kategori hører også forskellige midlertidige indgreb, der ikke er rettet mod udskiftningen af et defekt gen. Vavsplasminogenaktivator, som er ret vanskelig at producere i store mangder, bliver f.eks. i øjeblikket vur- 75 M deret til behandling af patienter, som har lidt af nylige myo- cardiale infarkter. Celler udtaget fra en sådan patient kunne bringes til at udtrykke vævsplasminogenaktivator og reimplanteres, hvorved muligheden for efterfølgende livstruende koageldannelse reduceres. På lignende måde kan transkaryot implantering anvendes til afgivelse af et produkt, som er beregnet til at 30 nedbryde visse ondartetheder. Transkaryot impiafitering kan benyttes til opnåelse af midlertidig terapi af ofre med traumatiske læsioner eller forbrændinger.

DK 173137 B1 16

Flere tr*k er ønskelige ved en genterapi, som benytter trans-karyot Implentering: I) de transficerede celler bør vare fuldt karakteriseret før implantering i patienten; II) genet eller generne bør blive afgivet effektivt, og den ønskede grad af 5 reguleret ekspression bør blive opnået; III) det bør vare muligt at anvende celler hidrørende fra forskellige vav til transfektion og til reimplantering af dem på forskellige anatomiske lokat ioner afhangigt af kliniske overvejelser; IV) det bør vare muligt at påvise, måle og måske modulere funktionen 10 af de transficerede celler efter implantering; V) de implanterede celler bør vare opbygget således, at de kan nedbrydes fuldstandigt eller om nødvendigt inaktiveres på ethvert tidspunkt efter inplanterlng; VI) systemet skal have tydelig terapeutiske fordele og må ikke udsatte patienten eller populatio-15 nen for unødig risiko. Som ovenfor anført kan denne andring tilføre et modtager individ et nyt gen, som ikke tidligere havde varet til stede 1 modtager individets genom. I et sådant tilfalde ville modtagerindividet for første gang vare 1 stand til at udtrykke den indførte gensekvens. Alternativt anvises 20 Ifølge den foreliggende opfindelse et middel til forøgelse af genekspressionsgraden 1 modtagerindividet.

III. Anvendelse af transkaryot implantering til opnåelse af genterapi.

25

Den foreliggende' opfindelse angår et middel til andring af genekspressionsgraden 1 et modtagerindivid. Denne andring kan enten forøge eller formindske genekspression.

30 Genekspression kan forøges ved at tilføre modtagerindividet en transflceret celle, son Indeholder et gen, der er 1 det va-sentllge identisk eller akvivalent med det gen 1 modtager individet, hvis forstarkede ekspression ønskes. Ekspressionen af et sådant gen ved hjalp af den transfIcerede celle forårsager 35 derved en stigning 1 koncentrationen af det ønskede genprodukt 1 modtagerindividet. Som ovenfor benyttet er et "akvivalent gen” et gen, der minder om modtager individets gen, men som DK 173137 B1 17 hidrører fra en anderledes art. Genet for kvægvæksthormon ville f.eks, være ækvivalent ned det hunane væksthomongen. Et "identisk gen" er et gen, som 1 det væsentlige svarer til den gensekvens, der normalt og naturligt findes 1 modtagerindivi-5 det. En "ækvivalent" eller "identisk" gensekvens kan være enten en "ønsket" gensekvens eller en "effektorgensekvens".

Det er muligt at forøge genekspression ifølge den foreliggende opfindelse ved at tilføre modtager individet en transflceret 10 celle, som Indeholder en "effektorgensekvens" (dvs. en sekvens, der frembringer reguleringen af et gen, hvis forøgede ekspression ønskes). Ekspressionsgraden af et bestemt gen 1 et modtagerindivid kan således f.eks. forøges ved at tilføre Individet en transflceret celle, som udtrykker et gen, hvis pro-15 dukt stimulerer den endogene ekspression af en anden, ønsket gensekvens 1 modtagerindivldet. F.eks. kunne genekspression forøges ved at tilføre et modtager Individ en transflceret celle, som udtrykker et gen, hvis produkt fik Individet til at udsondre forøgede mængder væksthormon.

20

Den foreliggende opfindelse kan også anvendes til formindskelse af genekspressionsgraden 1 et modtager individ. En formindskelse 1 genekspression kan opnås ved at tilføre modtagerindividet en transflceret celle, som udtrykker en effektorgen-25 sekvens, hvis produkt undertrykker ekspressionen af et endogent gen 1 modtager 1ndlvidet. Ved at tilføre en transflceret celle, som undertrykker et gen, hvis produkt undertrykker væksthormonekspression (dvs. somatostatin), kunne man således f.eks. begrænse mængden af endogen ekspression af vmksthormon-30 genet 1 et modtagerindivid. Alternativt kunne man opnå en formindskelse 1 genekspression ved at tilføre modtagerindividet en transflceret celle, som udtrykte et genprodukt, der generede den normale aktivitet eller funktion af et bestemt gen.

F.eks. kunne den transficerede celle frembringe et genprodukt, 35 som er 1 stand til at danne kompleks med et bestemt endogent genprodukt og derved forringe dette genprodukts aktivitet.

DK 173137 B1 18

En yderligere vej til enten at forøge eller formindske geneks-genekspresslon i et modtagerindivid indebarer anvendelse af en transficeret celle til endring af den fysiologisk signifikante koncentration af det ønskede genprodukt i modtagerindividet.

6 En sådan transficeret celle kan udtrykke et mutant arveanlag i enten (1) genet, hvis ekspression man ønsker at andre, eller (2) et gen, hvis ekspression påvirker ekspressionsgraden af gensekvensen, som har interesse. Et middel til forøgelse af ekspressionsgraden af vaksthormongenet ville således f.eks.

10 vare at tilføre modtager 1ndivldet en transficeret celle, der udtrykte et mutant arveanlag 1 vaksthormongenet, som er 1 stand til at producere et mutant vaksthormon med forøget aktivitet. Ved at tilføre modtager individet en transficeret celle, som er 1 stand til at producere et mutant humant vaksthormon-15 produkt (med betydelig svakket aktivitet), ville man på lignende måde formindske antallet af vaksthormonreceptormoleky-ler, der står til rådighed til pardannelse med modtagerindividets endogene, normale vaksthormon. En sådan forekomst ville vare 1 det vasentiige akvivalent med formindskelse af mangden 20 af endogent vaksthormon og ville resultere 1 en formindskelse af den fysiologiske virkning af den endogene genekspression.

Det vil forstås, at den ønskede gensekvens, der findes i den transficerede celle, kan hidrøre enten fra modtager individet 25 selv, fra et dyr af samme art son modtagerindividet, fra et dyr af en anden art eller også kan vare et syntetisk gen. Ved valg af kilde for den transfIcerede celles ønskede gensekvens eller effektorgensekvens er det vigtigt at overveje, hvorvidt den transfIcerede celles udtrykte genprodukt ville blive op-30 fattet som et antigen 1 modtager!ndivldet. Por at undgå enhver Immunologisk afvisning af den transficerede celles udtrykte produkt er det således ønskeligt at opnå den ønskede gense-vens eller effektorgensekvensen fra en art, der er nart beslagtet med arten af det pågaldende Individ, og det foretrak-35 kes at opnå denne sekvens fra et dyr tilhørende samme art som modtagerindividet. Det er aest foretrukket at anvende en gensekvens, der blev opnået fra selve modtager individet. Den o 19 DK 173137 B1 eventuelle antlgenicitet af den af den transkaryote celle udtrykte gensekvens kan let bestemmes ved at fastslå, hvorvidt seraene fra modtagerindividet har eller kan påvirkes til at have antistoffer, som er 1 stand til specifikt at reagere med 5 det udtrykte genprodukt. Metoder til bestemmelse af et proteins antigenicitet er almindeligt kendte af fagmanden på området.

IV. Anvendelse af transkaryote implantater til fremkaldelse af 10 produktion af biologiske forbindelser i et modtager indi vid.

En udførelsesform for opfindelsen indebarer anvendelse af transficerede celler til fremkaldelse af produktion af en bio-15 logisk forbindelse ved hjalp af de ikke-transficerede celler, som normalt findes 1 et modtager individ. Eksempler på biologiske forbindelser, der kan produceres 1 overensstemmelse aed denne udførelsesform, Indbefatter antistoffer, cellulare re-ceptornolekyler, hormoner, enzymer, etc. Ved Implantering af Z0 en bestemt transficeret celle, der er 1 stand til at udtrykke en "effektiv mangde" af et bestemt ønsket genprodukt, er det muligt at fremkalde syntese af et andet bestemt genprodukt (ved hjalp af modtager individets Ikke-transficerede celler). Udtrykket "effektiv mangde" skal referere til et ekspresslons-25 omfang, der er fysiologisk signifikant. Hvis således en effektiv mangde af et hormongen udtrykkes i et modtagerindivid, vil hormonniveauet vare højt nok til at have en påviselig effekt på individets fysiologi. Hvis en effektiv mangde af et antigent stof udtrykkes 1 et modtager Individ, vil mangden af stof-30 fet vare høj nok til at fremkalde antistofproduktion. Hvis således f.eks. den transfIcerede celle udtrykker et antigen, vil modtagerindividet blive bragt til at producere antistoffer, der er 1 stand til at binde dertil. Alternativt, hvis den transficerede celle udtrykker et ikke-antigent hormon eller 35 hormonale receptorer, vil modtager 1ndivldets Ikke-transficerede celler blive bragt til at producere hormonale receptormolekyler eller hormonmolekyler via fysiologiske standardmekanis mer.

DK 173137 B1 20

Vigtigt er det, at den ovenfor beskrevne udførelsesform for den foreliggende opfindelse muliggør udvinding af biologiske forbindelser, der er produceret som reaktion på tilstedeværelsen af den transficerede celles ekspressionsprodukt uden først 5 at skulle rense ekspressionsproduktmolekylet. I øjeblikket kan specifikke polyklonale antistoffer med høj affinitet f.eks. kun produceres ved tilførsel af betydelige mængder renset antigen. På grund af vanskeligheden ved at rense antigenmolekylerne er produktionen af polyklonale antistoffer ofte en over-10 ordentlig vanskelig opgave. 1 modsætning hertil er det hyppigt en simpel sag at Isolere et gen, som Indkoder antigenet af Interesse. Ved Indføring af et sådant gen 1 en celle er det muligt at producere en transfIceret celle, der udtrykker antigenet. Denne ekspression fører på sin side til produktion af 15 antistoffer ved hjælp af modtager Individet, hvilke antistoffer er 1 stand til specifikt at binde 111 det udtrykte antigen.

Den foreliggende opfindelse angår derfor et middel til produktion af polyklonale antistoffer, som afhjælper det eksisterende behov for rensede antigenmolekyler.

20

Betydningsfuldt er det, at det udtrykte antigen Ikke behøver at være fremstillet af et Intakt og helt gen. Det kan alternativt være ekspressionsproduktet af et "genfragment". Et "genfragment" er en DNA-sekvens, som, når den er udtrykt, resulte-25 rer 1 produktion af et polypeptid, som kun omfatter et fragment af et Intakt og helt gen. Hvis man f.eks. ønskede at fremkalde produktion af antistoffer, der er 1 stand til at genkende et hormon, ville det ikke være nødvendigt at benytte en transflceret celle, som udtrykte det fuldstændige hormon-30 molekyle. Et alternativ kan anvendes (dvs. en celle Indeholdende et genfragment af hormonmolekylegenet).

Huligheden for at benytte et genfragment til fremkaldelse af antistofprodukt ion tilvejebringer et betydeligt fremskridt på 35 området. Proceduren kan fordelagtigt anvendes til kloning af gener, selv når hverken genproduktet eller genet 1 fuld længde er blevet Isoleret. Metoden muliggør også Isolation af region- specifikke polyklonale antistoffer, der er af betydelig vig tighed Inden for Immunodlagnostik og Immunoterapl.

DK 173137 B1 21 V. Anvendelse af transkaryote transplantater til fremkaldelse af produktion af antistof· 5 ferne.

Oet ønskede genprodukt, udtrykt i en transflceret celle, vil neget hyppigt vcre "antlgenlsk" over for modtager individet (dvs. 1 stand til at fremkalde ekspression af antistoffer), 10 med mindre immunundertrykkende terapi foreskrives. Et genprodukt er antlgenlsk (dvs. er et antigen), hvis det Indeholder en "epitop". En "epitop" er den del af et molekyle, som genkendes af modtagerindividet, og hvortil de af modtagerindividet frembragte antistoffer kan binde. Et antigen kan vcre sam-15 mensat af en eller af mere end en epitop.

Anvendelsen Ifølge den foreliggende opfindelse muliggør produktion af to forskellige typer antistofmolekyler s "polyklonale antistoffer" og "region-specifikke polyklonale antlstof-20 fer". "Polyklonale antistoffer" produceres af et individ son reaktion på tilstedevcrelsen af produktet af et fuldstcndigt (dvs. helt eller naturligt) gen. "Region-spedfikke polyklonale antistoffer" produceres af et Individ son reaktion p& tilstedevcrelsen af et fragment af et fuldstcndigt genprodukt.

25 Hvis f.eks. det hunane Insulinprotein var udtrykt 1 en Immuno-konpetent mus, ville musen producere et set polyklonale antistoffer, der er 1 stand til at binde til insul inepitoperne. Selvom hvert enkelt antistof generelt ville vcre 1 stand til at binde til kun en insulInepitop, ville settet Indbefatte 30 antistoffer, der er 1 stand til at binde til hver af de forskellige insulinepltoper. Hvis derimod kun halvdelen af det hunane Insulinprotein var udtrykt i musen, ville musen producere et set polyklonale antistoffer, der er 1 stand til at binde kun de insulinepitoper, der findes på det udtrykte insu-35 Unfragment. Selvom sådanne antistoffer er "polyklonale antistoffer" i relation til det udtrykte fragment, er de "regionspecifikke polyklonale antistoffer" 1 relation til det fuld-stendige insulinnolekyle.

22 DK 173137 B1

Sammenfattet forholder det sig således, at hvis en prøve af polyklonale antistoffer er 1 stand til at binde til kun nogle af de på et fuldstændigt genprodukt naturligt tilstedeværende epltoper, da er antistofferne region-specifikke polyklonale 5 antistoffer i relation til det fuldstændige genprodukt. Hvis alle et antigens epltoper kan bindes af de 1 prøven tilstedeværende antistoffer, da Indeholder prøven alternativt polyklonale antistoffer med hensyn til dette antigen. Ifølge den foreliggende opfindelse siges et antistof, der er 1 stand til at 10 binde til et fuldstændigt genprodukt, at være et regionspecifikt antistof, hvis det hidrører fra eller er til stede 1 antisera, som indeholdt region-specifikke antistoffer, der er 1 stand til at binde til det fuldstændige genprodukt.

15 De transficerede celler Ifølge den foreliggende opfindelse kan indeholde enten gensekvensen af et helt antigen eller en gensekvens af et fragment af et helt antigen, og de kan således anvendes til produktion af transkaryote modtagere, der producerer enten polyklonale antistoffer eller region-specifikke 20 polyklonale antistoffer. Disse antistoffer kan anvendes til en hvilken som helst af immunoanalyserne, hvori antistoffer hidtil har været benyttet. De region-specifikke polyklonale antistoffer ifølge opfindelsen kan anvendes 1 enhver immunoanaly-se, hvori monoklonale antistoffer hidtil har varet benyttet. I 25 en udførelsesform er antistofferne påviseligt mærkede, idet der benyttes konventionel mærkningsteknik, der er velkendt på området. De bindende molekyler kan således radiomarkes under anvendelse af f.eks. radioaktive isotoper, såsom 3H, l25I, 1311 og 35S.

30

Antistofferne kan også mærkes under anvendelse af fluorescerende mærker, enzymmærker, fri radikal-mærker eller bakterio-fag-mærker under anvendelse af metoder, der er velkendte på området.

Typiske fluorescerende mærker indbefatter fluorescelnisothio-cyanat, rhodamin, phycoerythrin, phycocyanin, alphycocyanln og Texas-rødt.

35 DK 173137 B1 23

Egnede enzymer indbefatter alkalisk phosphatase, urease, β-ga-1actosidase, glucose-6-phosphatdehydrogenase, malatdehydroge-nase og peroxidase.

5 To hovedtyper af enzymimmunoanalyser er den enzymbundne immu-nosorbentanalyse (ELISA) og den homogene enzyniamunoanalyse, der også kendes som enzym-nultipled immunoassay (EMIT). I ELI-SA-systemet kan separationer opnås, f.eks. ved anvendelse af antistoffer, der er koblet til en fast fase. EMIT-systemet 10 beror på deaktivering af enzymet i sporstof-antistof-konplek- set. Aktiviteten kan således måles uden behov for et separationstrin.

Endvidere kan chemiluminescerende forbindelser benyttes som 15 marker. Typiske chemiluminescerende forbindelser indbefatter luminol, isoluminol, aromatiske acridiniumestere, Imidazoler, acridiniumsalte samt oxalatestere. På lignende måde indbefatter bioluminescerende forbindelser luciferin, luciferase og aequorin.

20 Når det bindende molekyle er blevet amrket, kan det anvendes til påvisning, dvs. til identifikation og/eller kvantificering af immunologe modstykker under anvendelse af metoder, der er velkendte på området. Ifølge den foreliggende opfindelse ind-25 befatter udtrykket "påvise" således identifikation af tilste-devcrelsen af molekylet eller den funktionelle gruppe og indbefatter også kvantificering af samme.

En god beskrivelse af en radioimmunanalyse (PIA) kan findas i 30 Laboratory Techniques and Biochemistry in Molecular Biology, T.S. Work et al., idet der ismr henvises til kapitlet med overskriften "An Introduction to Radioimmune Assay and Related Techniques", af T. Chard, North Holland Publishing Company,

New York, New York (1978), hvis indhold medtages heri ved hen-35 visningen dertil.

De polyklonale antistoffer (og ismr de region-specifikke poly-klonale antistoffer) ifølge den foreliggende opfindelse kan DK 173137 B1 24 også tilpasses til anvendelse 1 en immunometrisk analyse, der også kendes som "2-site"- eller "sandwich"-analyser. I en typisk immunometrisk analyse bindes en mangde umarket antistof til en fast barer, der er uopløselig 1 vasken, som undersøges, 5 og en mangde af et opløseligt antistof, som barer et marke, der muliggør påvisning og/eller kvantificering af et ternart kompleks, som er dannet mellem fast fase-antistof, antigen og market antistof, tilsattes.

10 Typiske 1mmunometr1 ske analyser Indbefatter "forward"-analy-ser, ved hvilke antistoffet, som er bundet til den faste fase, først bringes 1 kontakt ned prøven, der undersøges, til ekstraktion af antistoffet fra prøven ved dannelse af et blnart fast fase-antistof/antigen-kompleks. Efter en passende Inkuba-15 tionstid vaskes den faste barer til fjernelse af resten af vaskeprøven indbefattet eventuelt uomsat antigen og bringes derpå 1 kontakt ned opløsningen Indeholdende en ukendt mangde market antistof. Efter en anden inkubationstid til at gøre det muligt for det narkede antistof at danne kompleks med antige-20 net, der er bundet til den faste barer ved hjalp af det ikke-markede antistof, vaskes den faste barer en anden gang til fjernelse af det uomsatte markede antistof. Denne type "for-ward"-sandwichanalyse kan vare en simpel "ja/nej"-analyse til bestemmelse af, hvorvidt antigen er til stede eller kan dannes 25 kvantitativt, ved sammenligning af målingen af market antistof med den måling, der er opnået for en standardprøve indeholdende kendte mangder antigen. Disse "2-s1ten- eller "sandwich"-analyser er beskrevet af Wide på siderne 199-206 i "Radioimmune Assay Method", udgivet af Kirkham and Hunter, E. & S.

30 Livingstone, Edinburgh, 1970.

I en anden type "sandw1ch"-analyse, som også kan anvendes 1 forbindelse med antigenerne ifølge den foreliggende opfindelse, anvendes de såkaldte "samtidige" og "omvendte” analyser.

35 En samtidig analyse indebarer et enkelt inkubationstrin, eftersom antistoffet, der er bundet til den faste barer samt market antistof begge sattes til market, der undersøges på DK 173137 B1 25 samme tidspunkt. Efter at inkubationen er afsluttet, vaskes den faste barer til fjernelse af resten af vcskeprøven samt ikke-kompleksdannet mmrket antistof. TiIstedeverelsen af mmr-ket antistof i forbindelse med den faste berer bestemmes der-* 5 på, således som det ville ske ved en konventionel "forward"-sandwichanalyse.

Ved den omvendte analyse benyttes trinvis tilsmtning af først en opløsning af mmrket antistof til vmskeprøven efterfulgt af 10 tilsmtning af ikke-mmrket antistof, der er bundet til en fast bmrer, efter passende inkubationstid. Efter en anden inkubation vaskes den faste fase på konventionel måde til at befri den for resten af prøven, der undersøges, samt opløsningen af uoasat mmrket antistof. Bestemmelsen af mmrket antistof i for-15 bindelse ned en fast bmrer sker derpå som ved den samtidige analyse og "forward"-analysen.

Son forklaret ovenfor krmver de immunometriske analyser for antigen, at det pågmldende bindende molekyle er mmrket med et 20 "rapportør-molekyle". Disse rapportør-molekyler eller mmrker, således som ovenfor identificeret, er konventionelle og velkendte på området. Ved udøvelsen af den foreliggende opfindelse er enzymmmrker en foretrukken udførelsesform. Intet enkelt enzym er ideelt til anvendelse som et mmrke ved enhver tmnke-25 lig immunometrisk analyse. I stedet skal man bestemme, hvilket enzym, der er egnet til et bestemt analysesystem. Vigtige kriterier for valget af enzymer er omsmtningsantallet af det rene enzym (antallet af substratmolekyler, der omdannes til produkt per enzymsted per tidsenhed), enzymprmparatets renhed, påvis-30 ningsfølsomheden af dets produkt, lethed og hastighed af en-zymreaktionens påvisning, fravmr af generende faktorer eller af enzymlignende aktivitet 1 test-fluidummet, stabiliteten af enzymet og dets konjugat, tilgmngeligheden af og prisen på enzymet og dets konjugat eller lignende. Indbefattet blandt 35 enzymerne, der benyttes som mmrker ved de immunometriske analyser Ifølge den foreliggende opfindelse, er peberrodsperoxi-dase, alkalisk phosphatase, Ø-D-galactosidase, urease, gluco- DK 173137 B1 26 seoxidase, glycomylase, kulsyreanhydrase, acetylcholinesterase, lysozym, malatdehydrogenase og glucose-6-phosphatdehydro-genase. Urease hører til de foretrukne enzymmerker, isår på grund af chromogene pH-indikatorer, som gør dets aktivitet let 5 synlig for det ubevæbnede øje.

Antistofferne Ifølge den foreliggende opfindelse kan merkes under anvendelse af metoder, der er velkendte på området. Typiske metoder er beskrevet af J. H. Kennedy et al., Clin.

10 Chim. Acta 70:1-31 (1976) og A.H.W.M. Schuurs et al., Clin.

Chim. Acta 81:1-40 (1977). Koblingsmetoder omtalt 1 sldstnmvn-te er glutaraldehydmetoden, perjodatmetoden, dimaleimidmetoden og m-maleimldobenzyl-N-hydroxysuccInlmldestermetoden. Alle disse metoder medtages heri ved henvisningen dertil.

15 VI. Fremstilling af de transficerede celler dl anvendelse ved den foreliggende opfindelse

En transkaryot celle produceres ved hjmlp af in vitro indføring af yderligere genetiske sekvenser 1 en celle (fig. 1).

20 Hvis sådanne sekvenser integrerer 1 den transficerede celles kromosom eller er 1 stand til at replikere som ekstrakromoso-male plasmider, kan cellen erhverve den permanente evne til at lede ekspressionen af den Indførte genetiske sekvens. En sådan celle siges at vmre "stabilt transficeret". Eftersom sådanne 25 celler erhverver den permanente evne til at udtrykke den indførte genetiske sekvens, ville det vere at foretrmkke at benytte stabilt transficerede celler i situationer, hvor man ønskede at give modtagerindividet en forlanget evne til at producere det ønskede genprodukt eller effektorgenproduktet.

30

Det er også muligt at anvende transficerede celler, hvori de ønskede gensekvenser eller effektorgensekvenser ikke er integreret 1 cellens kromosom eller Ikke repllkeres ekstrakromaso-malt. Sådanne celler bevarer kun forbigående evnen til at ud-35 trykke de ønskede gensekvenser. Celler, som har genetiske sekvenser, der kun forbigående vil udtrykke de ønskede gensekvenser, betegnes "forbigående transficerede". Graden af en DK 173137 B1 27 sådan forbigående ekspression kan forøges ved at give den transficerede celle yderligere eksemplarer af den ønskede gensekvens eller af effektorgensekvensen. Selvom stabilt trans-ficerede celler således er i stand til at udtrykke den ønskede 5 gensekvens eller effektorgensekvensen i et lengere tidsrum end forbigående transficerede celler, er både forbigående og stabilt transficerede celler 1 stand til at udtrykke sådanne sekvenser i betydelig grad. Hvis antallet af eksemplarer af en gensekvens, der kan indføres i en celle (forbigående transfek-10 t1on)| overstiger antallet af eksemplarer, der kan bibeholdes stabilt, ville i virkeligheden de forbigående transficerede celler udvise en højere ekspressionsgrad end tilfaldet er for stabilt inficerede celler. Det foretrækkes således at anvende forbigående transficerede celler i individet, enten når man 15 ønsker at ekspressionen skal vare af kort varighed, eller når man ønsker at tilvejebringe en ekspressionsgrad, son er forskellig fra den, der kan opnås ved anvendelse af stabilt transficerede celler.

20 Til opnåelse af stabilt transficerede celler kan man benytte metoden ifølge N. Wigler et al., (Cell 11:223 (1977)). Ifølge denne metode bringes en suspension af ONA (indeholdende de ønskede gensekvenser eller effektorgensekvenser) til at danne kompleks 1 små prccipitater under anvendelse af calciumphos-25 phat. Disse precipitater sattes til et monolag af celler, soa vokser 1 en vavskulturskål ved 37*C.

Den ønskede gensekvens eller effektorgensekvensen bliver fortrinsvis isoleret og klonet på et plasmid før den inkuberes 30 sammen med cellerne. Det er imidlertid også muligt at inkubere cellerne sammen med en ikke-fraktioneret samling af plasmider, som hver indeholder en anderledes gensekvens, eller alene sammen med den ønskede gensekvens eller effektorgensekvensen.

Hvis ikke-fraktionerede plasmider anvendes, er det ønskeligt at sortere eller screene de resulterende transficerede celler for at finde frem til en celle, som indeholder og udtrykker de ønskede gensekvenser. En sådan celle ville derpå fortrinsvis blive renset DK 173137 B1 28 for de øvrige transficerede celler ved hjalp af kendte og almindeligt benyttede metoder før indføring i modtager individet. Metoder til celledyrkning er i vidt omfang omtalt af R.I. Freshney (In: Culture of Animal Cells, A Manual of Basic Tech-5 nique) (Aln R. Liss, Inc. NY, side 55-78 (1983)) og K.J. Lambert et al., (In: Animal Cell Biotechnology, bind l, R.E. Spier et a!., Udg., Academic Press, NY, side 86-122 (1985)), hvilke litteratursteder medtages heri ved henvisningen dertil.

10 Hed henblik på at Identificere stabilt transficerede celler er det generelt nødvendigt at sortere eller udvclge sådanne celler fra en total kultur af transfIcerede celler. Det er således ønskeligt at co-transficere den transfIcerede celle med en anden gensekvens, der er 1 stand til at bibringe cellen en 15 udvmlgelig egenskab. Denne anden sekvens kan findes enten på et separat molekyle eller kan vare knyttet til molekylet, der har de ønskede gensekvenser. Den af denne anden sekvens bibragte udvelgelige egenskab kan f.eks. vare legemiddel modstandsevne, såsoa over for 0418, eller evnen til at vokse 1 20 narverelse af metabolitter, såsom hypoxanthin eller 8-azagua-nidin, eller 1 narvarelse af nukleotider, såsom thymidin. Det foretrakkes at anvende en transficeret celle, som er mangelfuld 1 henseende til ekspressionen af thymidinkinasegenet, og som den anden, udvalgelige gensekvens at anvende thymidinkina-25 segenet i Herpes simplex-virus. En transflceret celle, der udviser stabil ekspression som den udvelgelige egenskab, undersøges for at bestemme, hvorvidt den også udtrykker de ønskede gensekvenser. Denne undersøgelse foretages ved at analysere for det proteinprodukt, der resulterer af en sådan eks-30 pression. Den pågaldende benyttede analyse vil selvsagt variere afhenglgt af proteinproduktets natur og funktion.

Procedurer til udførelse af stabile eller forbigående trans-fektionsreaktioner er velkendte på området (F. Pasleau et al., 35 Gene 38:227-232 (1985); J. Kopchick et al., DNA 4:23-31 (1985); M.A. Lopata et al., Nucleic Acid Research 12:5707-5717 (1984); og A. Gynheung et al.. Mol. Cell. Biol. 2:1628-1632 DK 173137 B1 29 (1982), hvilke litteratursteder alle medtages heri ved henvisningen dertil).

Ved udførelse af forsøg med forbigående transfektion foretræk-5 kes det at forsyne mellem S x 105 og 5 x 10® celler med mellem 10 og 50 μς DNA indeholdende de ønskede genetiske sekvenser eller effektor-genetiske sekvenser. Ved stabile transfektions-forsøg foretrækkes det at give mellem 5 x 105 og 5 x 10® mellem 1 og 20 Mg ONA indeholdende de ønskede gensekvenser eller 10 effektorgensekvenser. Hvis gensekvensen, som bibringer den udvelgelige egenskab, ikke findes på det samme molekyle som det, der indeholder den ønskede gensekvens, må den gives separat til cellerne. I et sådant tilfalde foretrækkes det at tilføre mellem 1,0 og 100 M9 af denne genetiske sekvens per 5 1® x 10® til 5 x 10® modtagerceller. Efter transfektion foretrækkes det at lade de transficerede celler formere sig og derpå at tilføre hvert modtagerindivid mellem 10® og lol° celler. Antallet af 1 modtageren Indførte celler vil blive bestemt på basis af sådanne kriterier som ekspressionen af det ønskede 20 genprodukt eller effektorgenets produkt, omsætningen af produktet samt mængden af produkt, der kræves til den ønskede grad af fysiologisk aktivitet.

De transficerede celler ifølge den foreliggende opfindelse kan 25 indføres 1 et modtager individ enten ved indføring 1 individets peritoneale hulhed eller subdermalt (dvs. subkutant eller sub-muskulært), intradermalt, intramuskulært eller fortrinsvis ved indføring af et subkapsulært implantat 1 kapslen, der omgiver nyren. Indføring kan yderligere ske ved implantering 1 kraniet 30 eller ved hjælp af intrahepatiske, intravenøse, intraperlto-neale, intrapulmonære, intraokulære eller intratestikulære midler eller via indvoldene. Indføring kan enten gennemføres ved injektion eller ved implantering, dvs. når cellerne er omsluttet af et materiale, der begrænser deres evne til at 35 diffundere eller migrere fra indføringsstedet. Ifølge en fore-trukken udførelsesforn er implantatet et renalt subkapsulært eller lignende implantat, der let kan udtages af modtageren og undersøges.

DK 173137 B1 30

Den foreliggende opfindelse kan praktiseres med en transkaryot celle hidrørende fra et stort antal forskellige vev, når blot cellen (1) er i stand til at modtage og udtrykke de indførte gensekvenser, og (2) dyrkes in vitro og genindføres i modta-5 gerindividet. F.eks. kan den foreliggende opfindelse praktiseres under anvendelse af fibroblaster, myocyter, hepatocyter, nyrekapselceller, endothelceller, epitelceller fra taraen, hypofyseceller, etc. Opfindelsen kan praktiseres under anvendelse af enten primåre celler eller transficerede celler. Fo-10 retrukne celletyper Indbefatter L-celler fra nus, nyrekapsel-celler og AtT-20-celler. Det er Imidlertid mest foretrukket som den transficerede celle at benytte en fibroblastcelle.

Hvis man ønsker at minimere enhver mulig immunologisk reaktion hos aodtagerlndlvldet på den transkaryote celle, er det ønske-15 ligt at benytte en celle fra en art, som er nert beslegtet ned modtager individets art, og det foretrekkes at benytte en celle fra den samme art som modtagerlndividet. For at undgå en Immunologisk reaktion er det mest foretrukket at benytte en celle, som oprindeligt blev opnået fra modtagerindividet selv. Et 20 immunoundertrykkende legemiddel (såsom dexamethasom eller an-tithymocytantisera) kan alternativt administreres til modta-gerindivldet 1 en dosis, der er tilstrækkelig til at hindre eller svekke modtagerindividets afvisning eller nedbrydning af det transkaryote Implantat. Hvis man alternativt ønsker at 25 fremkalde en Immunologisk reaktion (f.eks. for at fremkalde produktion af et antistof), kunne man Indføre et transkaryot implantat indeholdende enten stabilt eller forbigående trans-flcerede celler af enten den samme art eller af en anderledes art.

30

Den foreliggende opfindelse begynder således med In vitro- dyrkning af en vevskulturcelle eller en primer celle fra et organeksplantat. En ønsket gensekvens eller en effektorgensek-vens Inkuberes derpå 1 nerverelse af cellen under betingelser, 35 som muliggør dens adsorption ind 1 cellen. Den resulterende transficerede celle kan derpå Indføres 1 et modtagerindivid ved hjelp af en hvilken som helst af en rakke forskellige aid- DK 173137 B1 31 ler. Når først den er Inden 1 modtageri ndlvldet, kan den transfIcerede celles In vi tro-1ndførte gensekvenser derpå udtrykkes og forsyne modtagerlndlvldet ned det ønskede genprodukt .

5 X de efterfølgende eksempler er der blevet benyttet transflce-rede celler, som udtrykker humant vaksthormon eller Insulin.

Det vil forstås, at den foreliggende opfindelse Ikke er be-grmnset til anvendelse af sådanne transfIcerede celler, aen 10 tvartlmod omfatter anvendelsen af en hvilken som helst trans-flceret celle, der er 1 stand til at udtrykke ethvert gen 1 et modtagerindivid. Eksempler på andre gener, som alternativt kunne have været benyttet, Indbefatter gener for hormoner, enzymer, antistoffer og lignende.

15

Selvom flbroblastcellerne og hypofysecellerne, der er benyttet 1 de efterfølgende eksempler, Ikke hidrørte fra de pågaldende mus, der tjente som modtagerindivider, er det endvidere alternativt muligt at benytte transfIcerede celler, der hidrører 20 fra modtager Individet selv. De nedenfor viste forsøg angiver, at flere steder for 1mplanter1ng af gensplejsede celler er tilfredsstillende og muliggør den kraftige funktion af sådanne celler efter overførsel til modtagerindividerne.

25 Anvendelsen af humant væksthormon har praktisk betydning 1 den henseende, at væksten af de pågældende modtagermus, der modtager subkapsulære Implantater af transfIcerede celler, viste sig at vokse hurtigere end kontrolmus 1 mindst syv dage efter Implentering. Administrationen af transfIcerede celler resul-30 terede således 1 en fysiologisk signifikant ekspressionsgrad. Sådanne Implantater kan anvendes til fremme af hurtig vækst af nyfødte dyr (det kan vare nødvendigt at bringe dyrene til at tolerere de transfIcerede celler med henblik på at undgå Immu-noundertrykkende terapi). Ekspressionen af Insulin viste sig 35 på lignende måde at være fysiologisk signifikant.

Efter at opfindelsen nu er blevet generelt beskrevet, vil den bedre forstås med henvisning til visse specifikke eksempler, 32 DK 173137 B1 EKSEMPEL_1 5 Dannelse af transficerede celler indeholdende det human» vgksthormongen A. Dannelse af forbioAende transficerede celler 10 Dyrkede Ltk*-musefibroblaster blev inkuberet sammen ned plasmid pXGH5 under betingelser, der er tilstrnkkelige til at muliggøre dets optagelse 1 fibroblastcellerne. Plasmid pXGH5, som er et derivat af plasmid pOGH, indeholder det humane vmksthormongen sammensmeltet med musemetallothionein-I 15 (mMT-I)-promotorregionen. Dette plasmid er beskrevet i den samtidig verserende US patentansøgning nr. 896.483. Plasmid pOGH er deponeret i The American Type Culture Collection, Rockville, Maryland, under accessionsnummeret ATTC 67180. Plasmidtransfektion blev foretaget 1 overensstemmelse med 20 metoden ifølge M. Lopata et al.

B. Dannelse af stabilt transf icerede celler

Med henblik på produktion af stabilt transficerede celler blev 25 Ltk"(thymidinkinase-manglende)-musefibroblaster co-transf icaret med plasmid pXGH5 og Herpes simplex-virusthymidinkinasege-net, og HAT-resistente cellelinier blev analyseret for ekspression af humant vmksthormon. Stabil transfektion blev foretaget i overensstemmelse med metoden ifølge M. Higier et al.

30 (Cell 11:223 (1977)). En cellelinie, der viste sig at frem bringe ekspression af humant veksthormon, blev betegnet Ltk+GH.

35 DK 173137 B1 33 EKSEMPEL 2

Intraner!toneal Implanterlng af forbigående transfIcerede cellar 5 Forbigående transfIcerede celler blev opnået som beskrevet 1 eksempel 1A. Fire dage efter transfektlon med pXGH5 DNA blev Ltk“-modtagercellerne typslnlseret, pelleteret, resuspenderet 1 phosphatpufret saltvand og Intraperltonealt Injiceret 1 en gruppe på ti C3H-mus. Disse mus tilhørte den samme stamme som 10 den oprindelige donor af den dyrkede Ltk“-cellel1n1e. Ca. 2 x 107 celler blev Indført 1 hvert dyr.. I løbet af 3 timer efter 1mplanter1ng forekom humant væksthormon 1 modtagermusenes se-run. Middelserumnlveauet var 63,1 mg/ml. Serumniveauer af humant væksthormon begyndte at falde 1 løbet af den næste dag 15 (middelniveau 45,1 mg/ml), og hormonet var knap nok påviseligt (middelniveau 0,6 mg/ml) 4 dage efter Implanterlng. Resultaterne af dette forsøg er vist i f1g. 2 (stiplet linie). Forsøget viser, at transkaryot Implanterlng af forbigående trans-flcerede celler kan afgive et proteinprodukt til modtagermus' 20 serum 1 ca. fire dage efter Implanterlng (svarende til dagene 5-8 efter transfektlon). De Implanterede celler ophører med at producere humant væksthormon, fordi modtageren har visse midler til fjernelse eller Inaktivering af cellerne.

25 EKSEMPEL 3

Intraoeritoneal Implanterlng af stabilt transfIcerede celler

Stabilt transfIcerede celler blev fremstillet som beskrevet 1 eksempel IB. Celler fra cellelinien Ltk+GH blev Intraperlto-30 nealt Indført 1 en gruppe på ti C3H-mus, son derpå blev åreladt med henblik på bestemmelser af humant væksthormon 1 serum på forskellige tidspunkter efter Implanterlng. Resultaterne af dette forsøg er vist 1 f1g. 2 (fuldt optrukken linie). Den funktionelle Integritet af de Implanterede celler kunne deles 35 1 tre faser ved disse forsøg. Lige som ned de forbigående transfIcerede celler Ifølge eksempel 2 blev humant væksthormon 1 serum påvist 1 løbet af tre dage efter Implanterlng og faldt DK 173137 B1 34 hurtigt i de neste to dage ("traumafase"). Niveauer af humant væksthormon i serum steg derpå drastisk indtil dag 7 ("akkli-mationsdage")f og de faldt derpå til knap nok påviselige ni* veauer på dag 15 ("eliminationsfase").

5

En sammenligning mellem implanteringer af forbigående og stabilt transficerede celler antyder, at 1 løbet af de første dage efter implantering standser ekspression af humant vekst-hormon som resultat af celledød, formodentlig som følge af en 10 kombination af de skadende virkninger af håndtering af celler og af vckstbetingelserne 1 bughinden. De stabilt transfIcerede celler kom sig over dette indledningsvise chok, men de forbigående transfIcerede celler gjorde det ikke, muligvis som følge af manipulationerne 1 forbindelse med den forbigående 15 transfektionsteknlk, som satte overlevelsen af celler, der blev udsat for yderligere trauma, på spil. Under akklimations-fasen trives de overlevende celler, således som afspejlet af produktionen af humant veksthormon. Faldet i niveauer af humant veksthormon efter den syvende dag skyldtes aest sandsyn-20 ligt modtagerens reaktion på Implantatet fremfor en iboende manglende evne hos de transplanterede celler til at overleve lengere.

EKSEMPEL 4 25 Imolanter1nosstedets virkning på de transficerede cellers eks pression oa levet ids længde

Med henblik på at bestemme virkningen af implanteringsstedet på transficerede cellers ekspression og levetidslengde blev 30 stabilt transficerede celler, der var opnået som beskrevet 1 eksempel 18, subkutant implanteret på forskellige steder 1 C3H-nus. Ca. 2 x 10? celler blev indført per dyr. Resultaterne af dette forsøg er vist i fig. 3. Subkutant implanterede transficerede celler viste sig at producere humant veksthormon 35 1 op til 10 dage (fig. 3, fuldt optrukken linie, trekanter).

Serumniveauer af humant veksthormon faldt til stadighed fra dag 1 efter implantering, og akklimationsfasen, der bemærkedes 35 DK 173137 B1 1 forbindelse ned intraperi toneal implantering, blev ikke set i forbindelse med subkutan implantering. Et lignende mønster viste sig for celler, der blev implanteret under den renale kapsel (fig. 3, fuldt optrukken linie, cirkler). De punkterede 5 linier viser resultaterne for de subkapsulere implantater, normaliseret til antallet af implanterede celler. Ved dette forsøg blev 3 x 106 celler inficeret ind i hvert dyr. På dag 7 efter implantering producerede disse implantater kun lidt serumvmksthornon. De subkutane implantater blev fjernet og 10 benyttet til histokemiske undersøgelser. Celler, der farver positivt for humant vcksthormon, viste sig at have vmret til stede inden i det subkapsulare implantat, og morphologien af den renale praenchyma viste sig at have veret normal. Som en kontrol for den eventuelle rolle af humant væksthormon og 15 overlevelsen af implanterede celler blev ikke-transficerede Ltk~-celler implanteret subkapsulert. Disse cellers skæbne var identisk med den skæbne, der overgik de subkapsulert implanterede transfIcerede celler.

20 Flere faktorer kan have spillet en rolle for den forskellige evne hos de implanterede celler til produktion af humant væksthormon på forskellige steder i legemet. Implantatstedets opløselighed kunne have forsynet cellen med vitale næringsstoffer og påvirket både cellernes levedygtighed og mængden af 25 humant væksthormon, der optages 1 kredsløbssystemet. Det hydrostatiske tryk, som cellerne blev udsat for, kunne også have påvirket implantatets funktion. Celler under den renale kapsel befinder sig f.eks. formodentlig under betydeligt højere hydrostatisk tryk end cellerne 1 bughinden. Cellerne kan have 30 vedhæftet bedre på visse steder, og endelig kan den relative overlevelse af implantatet ved hjalp af Immunsystemets celler have påvirket mængden af produceret humant væksthormon.

35 DK 173137 B1 36

EKSEMPEL S

Den implanterede celles tilstand

Som ovenfor beskrevét -Indeholder plasmidet pXGHS musemetallo-5 thionein-I-promotoren. For at bestemme, hvorvidt de implante-rede celler var tilstrækkelig sunde til at reagere på deres lokale miljø, blev 2inks evne til at fremkalde højere ekspressionsgrader af humant væksthormon bestemt. Stabilt transfice-rede celler, der var fremstillet som beskrevet i eksempel IB, 10 blev implanteret intraperi tonealt i mus, hvoraf nogle fik tilført 76 mM ZnS0| i deres drikkevand. De med zink behandlede dyr udtrykte 10 gange mere humant væksthormon 1 deres serum end dyrene uden nogen behandling. Resultaterne af dette forsøg er vist 1 fig, 4. Denne induktion kunne sidestilles med hidtil 15 omtalte resultater for metallothionein-fusionsgener (P.F. Searie et al., Molec. Cell. Biol. 5:1480-1468 (1985); og R.F. Selden et al., Molec. Cell. Biol. 6:3173-3179 (1986)) og indikerede, at cellerne vedblev at reagere 1 det Intraperitoneale miljø. RNA fremstillet ud fra celler, der var udvundet fra 20 subkapsulare implantater, Indeholdt endvidere det korrekte mMT-I/humant veksthormon-fusions-mRNA (fig. 5). Taget tilsammen antyder disse resultater kraftigt, at de implanterede celler var sunde og opførte sig på forudsigelig måde. Af betydelig vigtighed er det faktum, at cellerne, når først de er på 25 plads 1 dyret, stadig kunne moduleres ved hjalp af ydre midler. Dette resultat antyder kraftigt, at ved en klinisk indstilling kunne ekspressionen af et ønsket genprodukt eller af et effektorgenprodukt moduleres ved farmakologisk indgreb.

30 Når som helst humant væksthormon blev påvist 1 et modtagerin-divlds serum, var det muligt at påvise tilstedeværelsen af transfIcerede celler. Fra dag 1 til 7 efter implanterlng kunne f.eks. celler, der producerer humant væksthormon, gøres synlige (enten med det ubevæbnede øje eller ved hjælp af lysmi-35 kroskopi) under renalkapslen. På det tidspunkt, hvor serummets humane væksthormon forsvandt, var de implanterede celler ikke længere påviselige. Når først humant væksthormon var forsvun- DK 173137 B1 37 det fra serummet, viste det sig aldrig at forekomme igen. Hvis nyren, der modtog det subkapsulmre implantat, blev fjernet fra en mus, som udtrykker humant vcksthormon (via et transkaryot implantat), forsvandt endvidere alle spor af en sådan ekspres* 5 sion i løbet af flere timer efter nephrectomien. De transfice-rede celler viste sig også at forblive lokaliseret på stedet for intraperitoneal og subkutan implantering. Disse konstateringer angav, at ophøret af ekspression af humant vcksthormon resulterede af de implanterede cellers nedbrydning.

10 EKSEMPEL 6

Immunsvstemets rolle ved transkarvot imolantering

Eftersom serumniveauer af humant vcksthormon faldt stejlt mel-15 lem 7 og 15 dage efter intraperitoneal implantering, syntes det muligt, at denne elimineringsfase blev formidlet af immunsystemet. Som et første trin i undersøgelsen af immunsystemets potentielle rolle ved transkaryot implantering, blev seks C3H-mus (af de ti i eksempel 2 omtalte mus), som forinden hav-20 de modtaget intraperitoneale implantater af stabilt transfi-cerede celler, udsat for stabilt transficerede celler. Efter først at vare udsat for de nye transficerede celler, fortsatte mønsteret af ekspression 1 disse mus i 15 dage (fig. 6, fuldt optrukne linier), men efter den anden udscttelse derfor, kunne 25 niveauer af humant vcksthormon knap nok påvises på dag 7 og var fravmrende på dag 9 (fig. 6, punkteret linie). Serumprofilen af humant vcksthormon i de genudsatte mus manglede også akklimationsfasen. Disse resultater stemte overens med en anamnestisk reaktion hos vmrtsmusene mod de transficerede cel-30 ler. Selvom de transficerede oprindeligt hidrørte fra C3H-»us, er det sandsynligt, at enten cellerne eller musene har undergået en vis genetisk mndring i løbet af nmsten fire tiår efter at cellelinien oprindeligt blev dannet, og derfor er de ikke lengere fuldt syngeniske ned hinanden. Når helt allogene mus 35 (C57BL/5; der representerer både H-2- og ikke-H-2-bestemte uforligeligheder) modtog transficerede celler intraperito-nealt, mindede deres mønstre for ekspression af humant vekst- 38 DK 173137 B1 hormon om mønsteret hos gen-udsatte C3H-mus {fig. 7, fuldt optrukken linie). Efter en anden udsattelse kunne Intet humant vmksthormon påvises 1 de allogene modtagere efter dag 4 (fig.

7, punkteret linie). Disse forsøg antydede, at den primåre 5 årsag til ophør af ekspression af humant vsksthormon efter intraperitoneal implantering var celledød som følge af vertens immunsystem.

EKSEMPEL 7 10 Forlmnoelse af implantatets funktionelle levetid

Hvis de transficerede celler nedbrydes ved transplantatafvisning, bør immunoundertrykkelse forlange Implantatets funktionelle levetid. Med henblik på at teste denne hypotese blev 15 mus, der havde modtaget stabilt transficerede transkaryote implantater, underkastet tre forskellige immunoundertrykkende behandlinger: kanin anti-musthymocytserum (C.A. Baldamus et al., Immunol. 110:1532-1541 (1973), dexamethason og en kombination af de to. TransfIcerede celler, der udtrykte humant 20 vmksthormon, blev implanteret intraperitonealt 1 C3H-mus, som derpå blev immunoundertrykt og målt for humant vmksthormon 1 serum. Mus, som havde modtaget anti-musthymocytserum (0,25 ml Indgivet per mus på dag -1, 1, 0, +1 og -3 med hensyn til implantering, udviste højere serumniveauer af humant vmksthormon 25 og udtrykte humant vmksthormon 1 ca. 2 uger Imngere end til-fmldet var for ubehandlede mus (tabel 1). Dexamethason-behand-lede mus udviste også forhøjet og forlmnget ekspression, idet humant vmksthormon 1 serum kunne påvises indtil 48 dage efter implantering.

30 35 DK 173137 B1 39

Tabel i. Virkninger af Immunoundertrykkelse på XP-celler

Dage efter Ingen immuno- Anti-lymfocyt- laplantering undertrykkelse serum Dexamethason 5 1 74,1 ± 3,8 89,7 4 18,6 94,8 4 9,2 2 31,5 i 5,4 86,6 4 10,5 3 84,7 i 20,4 4 80,0 4 11,4 54,3 4 14,2 10 5 173,1 i 34,6 7 107,5 ± 21,6 160,8 ± 75,4 8 til 10 24,3 i 2,1 38,3 i 5,4 99,3 ± 48,0 12 til 13 7,4 4 2,1 28,3 ± 5,6 32,0 * 15,1 15 til 17 1,5 t 0,7 28,8 ± 7,5 28,3 ± 18,1 15 21 --- 13,9 ± 3,7 28,0 4 13,6 27 --- 10,4 4 6,6 13,9 ± 6,9 34 --- —- 17,3 ± 11,7 41 --- --- 7,5 4 6,1 48 --- --- 2.7 4 2,2 20 55 --- --- ---

Til mus, der modtog dobbelt immunoundertrykkelse, administreredes anti-musthymocytserum og dexamethason som ovenfor beskrevet. Disse mus udtrykte humant veksthormon i mere end 3 25 måneder (tabel II). I ca. 20% af gruppen steg niveauerne af humant veksthormon til ca. 500 mg/al. Så høje serumniveauer af humant veksthormon i et udstrakt tidsrum viste sig ofte at vere dødelige over for musene. Ved laparotomi fandtes store samlinger af transficerede celler, der dannede plaque af nyt 30 vev fordelt i vidt omfang på mange peritoneale overflader. Synlige celler viste sig også at vcre suspenderet 1 ascites-vesken.

Den endelige død blandt disse mus blev Ikke forårsaget af den 35 forøgede peritoneale cellemasse, eftersom ca. 20% af C3H-kon-trolmusene, der fik Injiceret ikke-transficerede fibroblast-celler, udviste lignende celleformerIng. Kontrol musene overle- DK 173137 B1 40 vede imidlertid 1 mere end 100 dage efter implantering. Døden blandt musene, der modtog det transkaryote implantat, skyldtes således sandsynligvis de ekstremt høje serumniveauer af væksthormon .

5

Tabel II. Virkninger af dobbelt immunoundertrykkelse

Dage efter Intraperitonealt Subkapsulært

implantering ALS ♦ DEX ALS * DEX

10 1 9,4 i 2,9 25,8 1 4,5 2 2,9 t 0,8 11,4 t 1,6 4 5,8 ± 1,7 17,5 ± 2,2 7 7,5 t 3,6 19,4 ± 2,4 15 10 9,6 ± 3,9 53,4 i 16,2 13 43,7 ± 19,3 26,2 ± 7,2 16 22,0 t 8,5 7,5 i 2,1 21 18,3 t 7,5 6,1 ± 1,7 28 14,1 i 5,9 12,2 t 6,5 20 35 13,1 t 6,9 9,2 ± 2,8 42 9,7 ± 4,9 9,7 ± 5,0 50 12,2 t 6,4 7,4 ± 4,6 58 8,6 t 4,1 2,7 ± 1,8 66 144,2 i 84,4 4,0 t 2,6 25 73 132,2 i 105,8 3,7 ± 2,4 80 31,7 l 24,0 3,0 * 2,4 87 16,9 i 13,8 4,0 ± 3,3 94 14,0 i 11,5 6,2 ± 4,3 30 EKSEMPEL 8

Subkapsulære implantaters overlevelse i immunundertrvkte mus

Med henblik på at bestemme, hvorvidt immunoundertrykkelse ville føre til forlanget ekspression af humant væksthormon ved 35 hjælp af et subkapsulært implantats transficerede celler, blev mus, der havde modtaget et sådant implantat under nyrekapslen, behandlet ned en kombination af rotte, anti-ausethymocytserum DK 173137 B1 41 og dexamethason, og niveauerne af ekspression af hunant vækst-hormon blev målt. Serumniveauer af humant væksthormon toppede efter ca. 10 dage efter implanterlng, faldt 1 løbet af de næste seks dage og forblev derpå på et niveau på ca. 5-10 mg/ml 1 5 mere end to måneder. Selvom dexamethason blev administreret til disse mus 1 en uge efter Implantering af Intraperitoneale eller subkapsulære celler, tillod dets virkninger Implantatet at overleve 1 flere uger efter ophøret af dexamethasonadmini-stration. Det er muligt, at den endelige nedbrydning af cello lerne stod 1 forbindelse med en dexamethason-føl som begivenhed, der forekom tidligt efter implantering. Denne begivenhed kunne Ikke være den eneste, der var Involveret 1 nedbrydningen, fordi de transficerede celler til sidst nedbrydes, når C3H-mus blev behandlet kontinuert med dexamethason alene.

15 EKSEMPEL 9

Produktion af hunant insulin ved hlælo af et transkarvot

Implantat 20 Ltk’-museceller blev transficeret ned et thynidinklnasegen og et fusionsgen, der er beregnet til ekspression af et humant præprolnsulIn messenger-RNA. Efter transfektion med sådanne fusionsgener udsondrer Ltk'museceller 1 væsentligt grad proin-sulln, men er ude af stand til at producere fuldt udviklet 25 Insulin. En klonal linie (betegnet ltk4Xns), som Indeholdt flere humane 1 nsul Infusionsgener, syntetiserede humant Insulin messenger-RNA og udsondrede humant prolnsulln, blev valgt til yderligere analyser.

30 For at omgå behovet for immunoundertrykkeise blev nøgne mus benyttet som modtagere af Ltk+Ins-cellerne. Ca. 107 celler blev intraper1 tonealt Injiceret 1 hver af 10 mus, og serumprøver (efter to timers faste) blev opnået to til tre gange om ugen (fig. 8). I næsten en uge efter Implantering forblev se-35 rumglucoseniveauer på værdier før Implantering (160 mg* * standardfejl på 10 mg%), Et stejlt fald 1 glucosenlveauer lagttoges mellem ugerne 1 og 2 (til 77 mg* t 4 mg*), og ni- DK 173137 B1 42 veauerne forblev lave under resten af forsøget. Parallelt »ed dette fald 1 glucoseniveauer steg de totale Insulinniveauer mærkbart fra værdier før Inplanterlng på ca. 17 uIU/»l til næsten 60 ulU/ml. Eftersom den samlede Insulinanalyse har kun S 20¾ krydsreaktivitet aed proinsulin, kan de virkelige proin-sullnniveauer 1 disse dyr være signifikant højere end de niveauer, der afspejles ved disse målinger. Disse resultater angiver, at transkaryot Implanterlng kan anvendes til tilførsel af funktionelle Insulingener og til reduktion af serumglu-10 coseniveauer 1 mus.

EKSEMPEL 10

Anvendelse af transkaryot Implanterlng til behandling af diabetes 15

Den potentielle anvendelse af transkaryot implanterlng til behandling af diabetes blev udformet ved måling af virkningen af intraperitonealt injicerede Ltk+Ins-celler på diabetiske mus. Ned henblik på opnåelse af kemisk diabetiske nus blev 20 C3H-mus behandlet ned streptozotocin (8 mg/aus), og serumglu-coseniveauer (efter faste i to timer) blev målt ca. 10 og 15 dage senere. Til den foreliggende undersøgelses formål blev en mus betragtet som værende diabetisk, hvis dens serumglucoseni-veau efter faste var 400 mg* eller større, og 10 af disse mus 25 modtog intraperitoneale injektioner af Ltk+Ins-celler. C3H-nu-sene blev immunoundertrykt ved anvendelse af kanin anti-muse-thymocytserum og dexamethason. I løbet af en uge efter implan-tering iagttoges et dramatisk fald i serumgiucoseniveauer i 5 af musene (fig. 9, fuldt optrukken linie). To uger efter im-30 plantering var normoglycemia genoprettet i disse diabetiske mus. 0e resterende 5 mus udviste enten et forbigående fald i serumglucoseniveauer eller slet intet fald, hvilket antyder, at immunoundertrykkelse ikke var lige effektivt for hver mus (data ikke vist). Diabetiske kontrolmus (fig. 9, punkteret 35 linie) viste ingen reduktion i serumglucoseniveauer. Serumglu-cosenlveauer fortsatte med at falde 1 gruppen af fen reagerende dyr, og til sidst bukkede disse diabetiske mus under for hypoglycemia fremkaldt af transkaryot implanterlng.

DK 173137 B1 43

Nogle sygdomme kan vise sig at vmre lettere at behandle end diabetes, og det er muligt, at søgningen efter en forskrift for diabetisk genterapi kan fere til behandlinger af lidelser, hvor tmt ml nut-ti1-ninut-regulerlng af det tilførte protein 5 Ikke er vmsentllg. Hemophilia kunne f.eks. behandles, hvis den manglende klumpedannelsesfaktor kunne tilvejebringes ved hjmlp af gensplejsede celler. Formodentlig er kravene til koncentrationsintervallet for denne faktor og den til produktion deraf benyttede celletype mindre strenge end kravene til be-10 handling af diabetes.

EKSEMPEL 11

Anvendelse af transkarvot implantering til .opnåelse af polvklonale antistoffejl 15

Antistoffer mod humant vmksthormon blev produceret som følger:

Ca. 2 x 107 Ltk'-museceller blev forbigående transficeret med pXQHS under anvendelse af DEAE-dextrantransfektionforskriften ifølge R. Selden et al. (Molec. Cell. Biol. 6:3173-3179 20 (1986)). Fire dage efter transfektion blev cellerne vasket, trypslniseret og intraperitonealt implanteret i C3H-mus. Denne behandling blev gentaget efter to uger, og dyrene blev ugentlig Åreladet til opnAelse af prøver til ELISA-analyser.

25 Forud for forsøget indeholdt musene ingen påviselige antistoffer mod humant vmksthormon. I løbet af to uger fra administrationen af de forbigående transficerede celler var anti-hGH-tlteren (ifølge ELISA) i gennemsnit 1600 for de fen mus. Femten dage efter den første injektion modtog dyrene en anden 30 dosis af forbigående transficerede celler, og ca. 2 uger sene re (dvs. dag 27 efter den første Injektion) var gennemsnitsti-teren 38.000. Alle fem mus producerede anti-hGH-antlstoffer, og de individuelle tltere lå 1 Intervallet fra 12.800 til 102.400. Med mindre dyrene blev behandlet med yderligere cel- 35 ler, faldt anti-h6H-titerne gradvis, og 68 dage efter første injektion viste de sig at vmre ca. 4000.

DK 173137 B1 44

Flere varianter af den ovenfor beskrevne forskrift kan anvendes »ed held. F.eks. kan stabilt transficerede (i stedet for forbigående transficerede) celler anvendes. De transficerede Ltk"-celler har varet benyttet til fremstilling af antistoffer 5 1 mus, marsvin og kaniner. Antistoffer er også blevet produ ceret mod humant vcksthormon, den humane vaksthormonvariant. Insulin, og proinsulinceller, såsom AtT-20-celler, kan alternativt anvendes.

10 EKSEMPEL 12

Anvendelse af AtT-20-celler til transkarvot imolanterino

AtT-20-cellelinien er en velkarakteriseret hypofysetumorcelle-linie, der blev opnået fra en spontan tumor fra en LAFl-mus.

15 Disse celler blev transflceret med pXGH5 (et plasmid indeholdende mMT-I/hGH-fusionsgenet) og pKONEO (et plasmid indeholdende et gen, som indkoder modstandsevne mod lagemidlet G418).

En klonal linie af stabilt transfIcerede celler, betegnet AtT-20 (neo+) F6, blev valgt til yderligere analyser. Denne 20 linie udtrykte signifikante mangder hGH, og eftersom denne celle har bevaret sit sekretionsapparat, udsondres ca. to tredjedele af hGH-mangden, og den resterende ene tredjedel lagres i små sekretionskorn.

25 Ca. 5 x 10* celler blev injiceret intraperitonealt i LAFl-mus, og disse mus blev åreladt med ca. ugentlige mellemrum efter implantering med henblik på bestemmelse af hGH-serumniveuaer.

I løbet af de første få dage efter implantering var hGH-serum-niveauerne relativt lave (1 til 3 ng/ml). I løbet af den naste 30 måned steg disse niveauer gradvis og nåede op på ca. 10 ng/ml.

Det er vard at bemarke, at mønsteret af hGH-ekspression ved anvendelse af AtT-20(neo+)F6-celler var helt forskellig fra det mønster, der fandtes ved anvendelse af Ltk+GH-cellerne 35 (eksempel 11). Denne forskel kan anvendes til klinikerens fordel: a. Forskellige celletyper har forskellige egenskaber.

AtT-20-cellerne udsondrer f.eks. hGH som reaktion på cykliske DK 173137 B1 45 AMP-analoger. b. Forskellige celletyper udviser forskellig opførsel 1 de transkaryote dyr, dvs. tidsforløb, niveau, eks-pressionsvarighed.

5 Lignende undersøgelser har også vmret udført ned AtT-20-cel-ler, der stabilt udtrykker humant insulin. En klonal linie af stabilt transficerede celler indeholdende pHINTS (et musenetal lothionein-I/humant insulin-fusionsgen), og pKONEO er blevet fremstillet. Denne linie kaldes AtT-20 (neo+)lOa og ud-10 sondrer passende oparbejdet insulin i mediet [i modsctning hertil udsondrer L-celler, der er transficeret ned pHINT5, proinsulin]. Efter intraperi toneal inplantering i nøgne nus falder serunglucoseniveauer stort set på samne aåde son set i forbindelse ned de pHINTS-holdige L-celler, og serunniveauer 15 af humant insulin viste sig at stige.

EKSEMPEL 13

Produktion af renion-specifikke polyklonale antistoffec_ved anvendelse af transfIcerede celleprnparater 20

Transficerede celler, der udtrykker det terminale aminofrag-nent af et proteimolekyle, fremstilles son tidligere beskrevet og inplanteres i et modtager!ndivid. Ingen inmunounder-trykkende midler gives til modtager individet. Den transficere-25 de celle udtrykker det terminale aminofragment af proteinet. Tilstedevarelsen af dette fragment i modtagerindividet får individets ikke-transficerede celler til at producere polyklonale antistoffer, der er i stand til specifikt at binde til det udtrykte amino-terminåle proteinfragment. Disse polyklo-30 nåle antistoffer er regionspecifikke (dvs. i stand til kun at binde epitoper, der findes på det udtrykte amino-terminåle fragment).

Et genfragnent, som indkoder det terminale carboxyfragment af 35 det samme proteinmolekyle som ovenfor beskrevet, isoleres og benyttes til fremstilling af en transficeret celle, der er i stand til at udtrykke det terminale carboxyfragment af pro- DK 173137 Bl 46 teinmolekylet. Et praparat fremstilles under anvendelse af denne celle og implanteres i et modtager Individ. Ekspressionen af det carboxy-terminale fragment ved hjalp af den transfice-rede celle får de ikke-transficerede celler i modtagerindivi -5 det til at producere polyklonale antistoffer, som er 1 stand til specifikt at binde til epitoper, som findes på det terminale carboxyfragment af det udtrykte proteinmolekyle. Disse polyklonale antistoffer er regionspecifikke.

10 EKSEMPEL 14

Polyklonale immunoanalvser

De i eksempel 12 beskrevne regionspecifikke polyklonale antistoffer kan benyttes til en rakke forskellige aminoanalyser.

15 F.eks. kan det polyklonale antistof, som er i stand til at genkende det terminale aminofragment af proteinmolekylet, bindes til en fast barer. En prøve, som eventuelt indeholder pro-teinmolekylet ifølge eksempel 12, inkuberes 1 narvarelse af den faste barer 1 et tilstrakkeligt tidsrum til at lade et-20 hvert 1 prøven tilstedevarende proteinmolekyle binde til de bundne polyklonale antistoffer. De 1 eksempel 12 beskrevne polyklonale antistoffer, som er i stand til at genkende pro-teinmolekylets carboxyterminal, bliver påviseligt market og Inkuberet 1 narvarelse af den faste barer og prøven. Efter et 25 tilstrakkeligt tidsrum til at muliggøre binding af de carboxy-terminal-specifikke polyklonale antistoffer til ethvert til stedevarende proteinmolekyle (enten frit 1 prøven eller bundet til den faste barer), måles mangden af påviseligt market poly-klonalt antistof, som er bundet til den faste barer. Mangden 30 af bundet carboxy-terainal-specifikt polyklonalt antistof er direkte proportional med proteinmolekylekoncentrationen 1 prøven .

Son det umiddelbart vil fremgå for fagmanden på området, kan 35 de ovenfor beskrevne regionspecifikke polyklonale antistoffer anvendes til en lang rakke forskellige inmunoanalyser (dvs. homogene, heterogene, etc.), og en sådan anvendelse tilsigtes 47 DK 173137 B1 at høre ind under den foreliggende opfindelse. Generelt kan enhver eksisterende monoklonalt antistof-inraunoanalyse tilpasses til anvendelse af de polyklonale antistoffer ifølge den foreliggende opfindelse.

5

EKSEMPEL H

Produktion af hvbridomaer under anvendelse af transkarvot implanterlna 10 Transkaryote celler, som udtrykker et bestemt genprodukt, produceres og indføres 1 et modtagerdyr ved hjælp af metoderne Ifølge ethvert af eksemplerne 1-4. Tilstedeværelsen af det udtrykte ønskede genprodukt i modtagerdyret stimulerer ekspressionen og formeringen af de antistofproducerende celler, 15 som producerer et antistof, der er 1 stand til at binde til det udtrykte ønskede genprodukt. Modtagerdyrets splenocyter fjernes og dyrkes ved hjmlp af i og for sig kendte procedurer (se f.eks. metoden ifølge Gerhard et al., Eur. J. Immunol. 5:720-725 (1975)). De fjernede splenocyter lader man derpft 20 sammensmelte til myelomaceller i overensstemmelse med metoden Ifølge Koprowski et al. (US patentskrift nr. 4.172. 124) eller Ifølge Kohier et al. (Nature 256:495-497 (1975)) med henblik på at producere hybridomaceller, som producerer et monoklonalt antistof, der er i stand til at binde til det ønskede genpro-25 dukt.

Den ovenfor beskrevne metode til produktion af hybridomaceller frembyder flere betydelige fordele i forhold til metoder til immunisering af dyr, der krmver antigenmolekyler. Den ovenfor 30 beskrevne nye metode krmver ikke indlednigsvis rensning af antigenmolekylet og muliggør således dets anvendelse i de situationer, hvor en sådan rensning ikke er praktisk gennemførlig.

35 Den ovenfor beskrevne fremgangsmåde kan benyttes til at lette sorteringen af resulterende hybridomaceller til opnåelse af de celler, der producerer ønskede monoklonale antistoffer. Ved DK 173137 B1 48 konventionel hybridomateknik skal de hybridiserede hybridoma-celler sorteres ned henblik på at identificere de celler, son producerer antistof mod en ønsket epitop. En sådan sortering kan undgås ifølge den foreliggende opfindelse, ved at der i 5 modtagerdyret indføres transkaryote celler, so® kun indeholder et fragment af antigen-genet (og således er i stand til kun at producere et fragment af antigennolekylet). Ved hjclp af for-ududvalgelse af genfragmentet, som skal udtrykkes ved hjmip af den transkaryote celle, er det muligt at begrmnse forskellig-10 artetheden af hybridomapopulationen.

EKSEMPEL 16

Anvendelse af transkarvot implanterina til identifikation af immunoundertrvkkende stoffer 15

Hvis de implanterede celler og vmrtsdyrene ved et transkaryot implanteringsforsøg ikke er syngenetiske, vil den iaounokoa-petente vert forårsage afstødning af de Implanterede celler. Denne afstødning kan måles ved at analysere for et produkt af 20 de implanterede celler, fortrinsvis hGH. Når det transkaryote dyr immunoundertrykkes, vil denne afstødning Imidlertid blive forsinket eller hindret, afhcngigt af effektiviteten af den immunoundertrykkende behandling. Med andre ord kan den immu-noundertrykkende behandling vurderes kvantitativt ved måling 25 af niveauerne og varigheden af hGH-ekspression 1 serum. Under anvendelse af denne løsning er flere Immunoundertrykkende stoffer blevet undersøgt Indbefattende cyklosporin, cyklophos-phamid, dexamethason, kanin anti-mus thyaocytantiserum og anti-mus thymoeyt-monoklonale antistoffer. Denne metode er et di-30 rekte og kvantitativt alternativ til nuvmrende metoder til vurdering af immunoundertrykkelse.

Selvom opfindelsen er blevet beskrevet i forbindelse med specifikke udførelsesforaer derfor, vil det forstås, at den kan 35 gøres til genstand for yderligere modifikationer, og den foreliggende beskrivelse tilsigtes at dakke hvilke som helst varianter, anvendelser eller tilpasninger af opfindelsen, som ge- 49 DK 173137 B1 nerelt følger opfindelsens principper, og son indbefatter sådanne afvigelser fra den foreliggende opfindelse, som hører ind under kendt eller sadvanlig praksis inden for det område, som opfindelsen vedrører, og som kan benyttes til de vasent-5 lige trak 1 det foregående, der er angivet som følger inden for rammerne af de følgende krav.

10 15 20 25 30 35

Claims (39)

50 DK 173137 Bl

1. Anvendelse af celler til fremstilling af et implantat til anvendelse ved transkaryot genterapi, hvilket implantat er indrettet til at ændre koncentrationen af et ønsket genpro- 5 dukt i et modtagerindivid, idet implantatet omfatter celler opnået ved: (a) transficering af et cellepræparat med en gensekvens, der koder for det ønskede genprodukt, men ikke omfatter retroviralt DNA; og (b) screening af de opnåede transficerede celler til udvælgelse af en celle, som besidder de ønskede ekspressionsegenskaber, og kloning af nævnte celle; hvor de klonede 10 celler, når de gives til individet, styrer ekspressionen af den ønskede gensekvens til fremkaldelse af produktion af det ønskede genprodukt, idet gensekvensen, der koder for det ønskede genprodukt, er operativt bundet i de klonede celler til en konstitutiv og/eller regulerbar promotor,

2. Anvendelse af celler til fremstilling af et implantat til anvendelse ved transkaryot 15 genterapi, hvilket implantat er indrettet til at andre koncentrationen af et ønsket genprodukt i et modtagerindivid, idet implantatet omfatter celler opnået ved: (a) transficering af et cellepræparat med en gensekvens, der koder for et effektorgen-produkt, men ikke omfatter retroviralt PNAj og (b) screening af de opnåede transficerede celler til udvælgelse af en celle, som besidder 20 de ønskede ekspressionsegenskaber, og kloning af nævnte celle; hvor de klonede celler, når de gives til individet, styrer ekspressionen af en ønsket gensekvens til fremkaldelse af produktion af det ønskede genprodukt, idet gensekvensen, der koder for effektorgenproduktet, er operativt bundet i de klonede celler til en konstitutiv og/eller regulerbar promotor. DK 173137 B1 51

3. Anvendelse ifølge et hvilket som helst af de foregående krav, hvor den udvalgte, transficerede celle oprindeligt er opnået fra et påtænkt modtagerindivid.

4. Anvendelse ifølge et hvilket som helst af de foregående krav, hvor cellepræparatet i trin (a) omfatter primære celler.

5. Anvendelse ifølge et hvilket som helst af de foregående krav, hvor ekspressionen af den ønskede gensekvens eller effektorgensekvensen ved tilstedeværelsen i et modtagerindivid forsyner modtagerindividet med et genprodukt, som ikke forud er blevet udtrykt af individet.

6. Anvendelse ifølge krav 5, hvor den udtrykte, ønskede gensekvens eller effektorgen-10 sekvens er ækvivalent med eller identisk med et naturligt gen hos et påtænkt modtagerindivid.

7. Anvendelse ifølge et hvilket som helst af de foregående krav, hvor ekspressionen af den ønskede gensekvens eller effektorgensekvens ved tilstedeværelse i et modtagerindivid fremkalder en forøgelse af ekspressionsniveauet hos et gen, som normalt udtrykkes 15 af individet

8. Anvendelse ifølge krav 7, hvor ekspressionen af den ønskede gensekvens eller effektorgensekvens ved tilstedeværelse i et modtagerindivid kompenserer for en genekspressionsmangel i modtagerindividet

9. Anvendelse ifølge et hvilket som helst af kravene 1-6, hvor ekspressionen af den 20 ønskede gensekvens eller effektorgensekvens veiTBlstedéværelse i et modtagerindivid fremkalder et fald i ekspressionsniveauet hos et gen, som normalt udtrykkes af individet DK 173137 B1 52

10. Anvendelse ifølge krav 9, hvor ekspressionen aF'den ønskede gensekvens eller effektorgensekvens ved tilstedeværelse i et modtagerindivid kompenserer for et uforholdsmæssigt stort genekspressionsniveau i modtagerindividet.

11. Anvendelse ifølge et hvilket som helst af de foregående krav, hvor implantatet er 5 egnet til at blive givet til modtagerindividet ved subkapsulær, subdennal, intradermal, subkutan, intravenøs, intraperitoneal, intrakraniel, mtrahepatisfc, retroperitoneal, intra-muskulær, intrapulmonær, intraokulær eller intråtestikulær implantation eller som in-trasplanchinicusimplantation.

12. Anvendelse ifølge krav 11, hvor implantatet er egent til at blive givet til modtagerin-10 dividet ved subkapsulær eller subdermal implantation.

13. Anvendelse ifølge et hvilket som helst af kravene 1-11, hvor implantatet er et intra-peritonealt implantat.

14. Anvendelse ifølge et hvilket som helst af de foregående krav, hvor cellerne omfatter humanceller.

15. Anvendelse ifølge krav 14, hvor cellerne er fibroblaster eller hypofyseceller.

16. Anvendelse ifølge et hvilket som helst af de foregående krav, hvor implantatet omfatter celler og en fysiologisk acceptabel puffer.

17. Transkaryot, ikke-humant dyr omfattende et implantat som beskrevet i et hvilket som helst af kravene 1 til 16. DK 173137 B1 53

18. Fremgangsmåde til fremstilling af et implantat som beskrevet i krav 1, omfattende: (a) transficering af et cellepræparat med én pnseTcvéins,“dér Tcoder fof déT ønskede ‘ genprodukt, men ikke omfatter retroviralt DNA; og (b) screening af de opnåede transficerede celler til udvælgelse af en celle, som besidder 5 de ønskede ekspressionsegenskaber, og kloning af nævnte celle; hvor de klonede celler, når de gives til et modtagerindivid, styrer ekspressionen af den ønskede gensekvens til fremkaldelse af produktion af et ønsket genprodukt, idet gensekvensen, der koder for det ønskede genprodukt, ér operativt bundet i de klonede celler til en konstitutiv og/eller regulerbar promotor.

19. Fremgangsmåde til fremstilling af et implantat som beskrevet i krav 2, omfattende: (a) transficering af et cellepræparat med en gensekvens, der koder for et effektorgen-produkt, men ikke omfatter retroviralt DMA; og (b) screening af de opnåede klonede, transficerede celler til udvælgelse af en celle, som besidder ønskede ekspressionsegenskaber, og kloning af nævnte celle; hvor de 15 klonede celler, når de gives til et modtagerindivid, styrer ekspressionen af den ønskede gensekvens til fremkaldelse af produktion af det ønskede genprodukt, idet gensekvensen, der koder for det ønskede genproduktet, er operativt bundet i de klonede celler til en konstitutiv og/eller regulerbar promotor.

20. Fremgangsmåde ifølge krav 18 eller krav 19, hvor cellen, som er udvalgt ved 20 screening, oprindeligt er opnået fra en påtænkt modtager af implantatet.

21. Fremgangsmåde ifølge et hvilket som helsLaf-kravene. .11L20, hvor cellepræparatet i trin (a) omfatter primære celler. DK 173137 B1 54

22. Fremgangsmåde ifølge et hvilket som helst af kravene 18-21, hvor ekspressionen af den ønskede gensekvens eller effektorgensekvens ved tilstedeværelse i et modtagerindivid forsyner modtagerindividet med et genprodukt, som ikke forud er "Blevet udtrykt af individet.

23. Fremgangsmåde ifølge krav 22, hvor den ønskede gensekvens eller effektorgensekvens er ækvivalent med eller identisk med et natuFITgtgen hos et påtænkt modtagerindivid.

24. Fremgangsmåde ifølge et hvilket som helst af kravene 18-23, hvor ekspressionen af den ønskede gensekvens eller effektorgensekvens ved tilstedeværelse i et modtagerra- 10 divid fremkalder en forøgelse af ekspressionsniveauet hos et gen, som normalt udtrykkes af individet

25. Fremgangsmåde ifølge krav 24, hvor ekspressionen af den ønskede gensekvens eller effektorgensekvens ved tilstedeværelse i et modtagerindivid kompenserer for en genekspressionsmangel i modtagerindividet.

26. Fremgangsmåde ifølge et hvilket som helst af kravene 18-23, hvor ekspressionen af den ønskede gensekvens eller effektorgensekvens véd tilstedeværelse i et modtager-individ fremkalder et fald i ekspressionsniveauet hos et gen, som normalt udtrykkes af individet.

27. Fremgangsmåde ifølge krav 26, hvor ekspressionen af den ønskede gens elevens"eller 20 effektorgensekvens ved tilstedeværelse i et modtagerindivid kompenserer for et uforholdsmæssigt stort genekspressionsniveau i modtagerindividet.

28. Fremgangsmåde ifølge et hvilket som helst aflcravene 18-27, hvor ekspressionen af den ønskede gensekvens eller effektergensékvéns ved tilstedeværelse i et modtagerindivid er fysiologisk signifikant. DK 173137 B1 55

29. Fremgangsmåde ifølge et hvilket som helst af kravene 18-28, hvor implantatet er egnet til at blive givet til et modtagerindivid ved subkapsulær, subdermal, intradermal, subkutan, intravenøs, intraperitoneal, intrakfan]'éT,TntraEépåtisk, retroperitoneal’ intra-muskulær, intrapulmonær, intraokulær eller intratestikulær implantation eller in- 5 trasplanchinicusimplantation.

30. Fremgangsmåde ifølge krav 29, hvor implantatet er egnet til at blive givet til et modtagerindivid ved subkapsulær eller subdermal implantation.

31. Fremgangsmåde ifølge et hvilket som helst af kravene 18-30, hvor implantatet er et subkapsulært eller intraperitonealt implantat.

32. Fremgangsmåde ifølge et hvilket som helst af kravene 18-31, hvor cellerne omfatter humanceller.

33. Fremgangsmåde ifølge krav 21, hvor cellerne er fibroblast- eller hypofyseceller.

34. Fremgangsmåde ifølge et hvilket som helst af kravene 18-33, hvor implantatet omfatter celler og en fysiologisk acceptabel puffer.

35. Anvendelse ifølge krav 1 eller 2, hvor implantatet er egnet til at fremkalde produktion af en biologisk forbindelse i et modtagerindivid, hvor implantatcelleme, når de gives til individet, styrer ekspressionen af den ønskede gensekvens, hvorved produktionen af et ønsket genprodukt (I) fremkaldes, idet ekspressionen af den ønskede gensekvens er tilstrækkelig til at bringe et modtagerindivid til at frembringe den biologiske 20 forbindelse.

36. Anvendelse ifølge krav 35, hvor det biologiske molekyle er i stand til at binde til det ønskede genprodukt. DK 173137 B1 56

37. Anvendelse ifølge krav 35 eller 36, hvor det ønskede genprodukt er et antigen og den biologiske forbindelse er et antistof.

38. Anvendelse ifølge krav 35 eller 36, hvor det ønskede genprodukt er et fragment af et fuldstændigt genprodukt, og den biologiske forbindelse er et region-specifikt antistof 5 med hensyn til det fuldstændige genprodukt.

39. Anvendelse ifølge krav 37 eller 38, hvor den biologiske forbindelse er et monoklo-nalt antistof.