PT640143E

PT640143E - Inibidores da sintese de adn derivados de celulas senescentes

Info

Publication number: PT640143E
Application number: PT93901236T
Authority: PT
Inventors: James R Smith; Asao Noda Ph D Kobe Univer Med
Original assignee: Baylor College Medicine
Priority date: 1991-12-16
Filing date: 1992-12-15
Publication date: 2001-09-27
Also published as: US5424400A; CA2125974A1; US5302706A; DK0640143T3; EP0640143A1; AU673992B2; EP0640143A4; CA2125974C; DE69231739T2; EP0640143B1; US5840845A; GR3035905T3; AU3324393A; JPH07502651A; ATE199740T1; WO1993012251A1; DE69231739D1; JP3865766B2; ES2157215T3

Description

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DESCRICÃO

Inibidores da síntese de ADN derivados de células senescentes A ΛΛΠΙΤΛ ΓνΛ ΙΜ\ /ΓΜΤΛ niVIUI I V L>U IIM VLtM I u 0 presente invento está inserido no âmbito da tecnologia de ADN recombinante. O presente invento refere-se a uma sequência de genes e a uma proteína capaz de inibir a síntese de ADN numa célula receptora. O presente invento foi suportado com fundos governamentais. O governo detém alguns direitos sobre o presente invento.

ANTECEDENTES DO INVENTO

As células diplóides humanas, normais, têm um potencial finito para o crescimento proliferativo (Hayflick, L. et al., Exp. Cell Res. 25: 585 (1961); Hayflick, L., Exp. Cell Res. 37: 614 (1965)). De facto, sob condições controladas, as culturas de células humanas in vitro podem proliferar no máximo apenas até cerca de 80 duplicações cumulativas da população. Verificou-se que o potencial proliferativo destas células é uma função do número de vezes que uma célula sofreu duplicação cumulativa da população (Hayflick, L. et al., Exp. Cell Res. 25: 585 (1961); Hayflick, L. et al.. Exp. Cell Res. 37: 614 (1985)). Este potencial é também inversamente proporcional à idade in vivo do dador de células (Martin, G. M., et al.. Lab Invest., 23: 86 (1979); Goldstein, S. et al.. Proc. Natl. Acad. Sei. (USA) 64:155 (1969); Schneider, E.L. Proc. Natl. Acad. Sei. (USA) 73:3584 (1976); LeGuilty, Y. et al., Gereontoloqia 1 9 :303 (1973)).

Diz-se das células que esgotaram o seu potencial para o crescimento proliferativo, que sofreram "senescência". A senescência celular in vitro manifesta-se por alterações morfológicas e é acompanhada pela incapacidade de uma célula responder a factores de crescimento exógenos. A senescência celular representa, portanto, uma perda do potencial proliferativo da célula. Embora tenham sido propostas diversas teorias para explicar o fenómeno da senescência celular in vitro. a evidência experimental sugere que a perda de potencial proliferativo dependente da idade, pode ser uma função de um programa genético (Orgel, L.E., Proc. Natl. Acad. Sei. (USA) 49:517 (1963); De 2 86 476 ΕΡ Ο 640 143/ΡΤ

Mars, R. et al.. Human Genet. 16:87 (1972); M. Buchwald, Mutat. Res. 44:401 (1977); Martin, G.M. et al., Amer. J. Pathol. 74:137 (1974); Smith, J.R. et al.. Mech. Age. Dev. 13:387 (1980); Kirkwood, T.B.L. et al., Theor. Biol. 53:481 (1975).

Estudos in vitro de fusão celular com fibroblastos humanos, demonstraram que o fenótipo quiescente da senescência celular é dominante, em relação ao fenótipo proliferativo (Pereira-Smith, O.M. et al.. Somat. Cell Genet. 8:371 (1982); Norwood, T.H. et al., Proc. Natl. Acad. Sei. (USA) 71:223 (1974); Steib, G.H. et al.. Exp. Cell Res. 130:155 (1979)).

Tem-se obtido informação sobre o fenómeno da senescência a partir de estudos em que as células senescentes e jovens (i.e. não senescentes), foram fundidas para formar heterodicariões. De modo a induzir a senescência nos núcleos "jovens" do heterodicarião (determinada por uma inibição na síntese de ADN), a síntese de proteínas terá que ocorrer na célula senescente antes da fusão (Burmer, G.C. et al., J. Cell. Biol. 94:1 87 (1982); Drescher-Lincoln, C.K. et al., Exp. Cell Res. 144:455 (1983); Burner, G.C. et al., Exp. Cell Res. 145:708 (1983); Drescher-Lincoln, C.K. et al.. Exp. Cell Res. 153:208 (1984).

De igual modo, verificou-se que a micro-injecção de ARNm de fibroblastos senescentes, em fibroblastos jovens inibe, tanto a capacidade das células jovens sintetizarem ADN (Lumpkin, C.K. et al.. Science 232:393 (1986)), como a capacidade das células entrarem na fase S (estacionária) do ciclo celular (Lumpkin , C.K. et al.. Exp. Cell Res. 160:544 (1985)). Alguns investigadores identificaram ARNm únicos que são amplificados em células senescentes in vitro (West, M.D. et al., Exp. Cell Res. 184:138 (1989); Giordano, T. et al., Exp. Cell Res. 1 85:399 (1 989)).

As células endoteliais, diplóides, humanas, representam um tipo de células alternativo para o estudo da senescência celular, dado que estas células mimetizam a senescência celular in vitro (Maciag, T. et al., J. Cell. Biol, 91:420 (1981); Gordon, P.B. et al.. In vitro 1 9:661 (1983); Johnson, A. et al.. Mech Age. Dev. 18:1 (1982); Thornton, S.C. et al.. Science 222:623 (1983); Van Hinsbergh, V.W.M. et al.. Eur. J. Cell Biol. 42:101 (1986); Nichols, W.W. et ah, J. Cell. Phvsiol. 132:453 (1 987)).

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Além disso, as células endoteliais humanas são capazes de expressar uma variedade de fenótipos funcionais e reversíveis. As células endoteliais exibem vários fenótipos de diferenciação quiescentes e não terminais (Folkman J. et al., Nature 288:551 (1980); Maciaq, T. et al.. J. Cell Biol. 94:511 (1982); Madri. J.A. et al.. J. Cell Biol. 97:153 (1983); Montesano, R. J. Cell Biol. 99:1706 (1984); Montesano, R. et al.. J. Cell Phvsiol. 34:460 (1988).

Foi sugerido que a via de diferenciação de células humanas in vitro envolve a indução de quiescência celular, mediada por citóquinas que inibem a proliferação de células endoteliais in vitro, induzida por factores de crescimento (Jay, M. et al., Science 228:882 (1985); Madri, J. A. et al.. In vitro 23:387 (1987); Kubota, Y. et al.. J. Cell Biol. 107:1589 (1988); Ingber, D.E. et al., J. Cell Biol. 107:317 (1989)).

Os inibidores da proliferação de células endoteliais também funcionam como reguladores de eventos de transcrição precoce imediatos, induzidos durante a diferenciação de células endoteliais in vitro. que envolve a formação do fenótipo de células endoteliais tubulares, do tipo capilar (Maciag, T., In: Imp. Adv. Oncol. (De Vita, V.T. et al., eds., J.B. Lippincott. Philadelphia, 42 (1990); Goldgaber, D. et al., Proc. Natl. Acad. Sei. (USA) 86:7606 (1990); Hla, T. et al., Biochem. Biophys. Res. Commun. 167:637 (1990)). Os inibidores da proliferação celular incluem: 1. lnterleucina-1 a (IL-1 a) (Montesano, R. et al., J. Cell. Biol. 99:1706 (1984); Montesano, R. et al.. J. Cell Phvsiol. 122:424 (1985); Maciag, T. et al.. (Science 249:1570-1574 (1990)); 2. Factor de necrose tumoral (Frater-Schroder, M. et al., Proc. Natl.

Acad. Sei. (USA) 84:5277 (1987); Sato, N. et al.. J. Natl. Câncer Inst. 76:1113 (1986); Pber, J.P., Amer. J. Pathol. 133:426 (1988); Shimada, Y. et al.. J. Cell. Phvsiol. 142:31 (1990); 3. Factor β de crescimento de transformação (Baird, A. et al., Biochem.

Bioohvs. Res. Commun. 138:476 (1986); Mullew, G. et al., Proc. Natl.

Acad. Sei. (USA) 84:5600 (1987); Mairi J.A. et al.. J. Cell. Biol. 106:1375 (1988).

86 476 ΕΡ Ο 640 143/ΡΤ 4. Interferão-gama (Friesel, R. et al.. J. Cell Biol. 104:689 (1987);

Tsuruoka, N. et al.. Biochem. Biophvs. Res. Commun 155:429 (1988)) e 5. O promotor tumoral, ácido mirístico de forbol (PMA) (Montesano, R. et al·, Cell 42:469 (1985): Doctrow, S.R. et al.. J. Cell Biol. 104:679 (1987); Montesano, R. et al.. J. Cell Phvsiol. 130:284 (1987); Hoshi, H. et ai.. FASAB J. 2:2797 (1988)).

Em DE-A-3902157 descreve-se a anfirregulina, um factor regulador celular e de crescimento, bifuncional, que inibe a síntese de ADN em células neoplásícas, mas potência o crescimento de algumas células normais.

Em W091/05565 descrevem-se construções de factor β de crescimento e transformação, truncadas, que são capazes de induzir um efeito anti-proliferativo em células epiteliais de mamífero, in vitro.

Em W091/15580 descreve-se um método de tratamento de uma doença de proliferação celular, por administração de cópias de gene activo de um gene regulador de crescimento de acção negativa, a uma célula com proliferação anormal.

Smith et al, J.A.G.S (1987) vol 35 p. 894 descrevem estudos de um gene anti-proliferativo putativo, cujo produto bloqueia a síntese de ADN in vitro. A perspectiva de inverter a senescência e restabelecer o potencial proliferativo de células tem implicações em muitos campos. Muitas das doenças da velhice estão associadas com a perda deste potencial. Também a doença trágica, progeria, que se caracteriza por um envelhecimento acelerado, está associada com a perda do potencial proliferativo das células. A recuperação desta capacidade teria implicações de longo alcance para o tratamento desta doença, de outras desordens relacionadas com a idade e do envelhecimento per se.

Além disso, a recuperação do potencial proliferativo de células em cultura tem utilidade em medicina e na indústria farmacêutica. A capacidade de imortalizar células não transformadas pode ser utilizada para produzir um fornecimento infindo de alguns tecidos e também de produtos celulares. 5 86 476 ΕΡ Ο 640 143/ΡΤ Ο significado da senescência celular tem sido, portanto, analisado desde há vários anos (Smith, J.R., Cellular ageing, In: Monographs in Developmental Bioloqy; Sauer, H. W. (ed,), S. Karger, New York, N.Y. 1_7:193-208 (1984); Smith, J.R. et al. Exper. Gerontol. 24:377-381 (1989), aqui incorporados para referencia), us investigadores têm tentado clonar genes relevantes para a senescência celular. Foi reconhecida uma correlação entre a existência de um inibidor da síntese de ADN e o fenómeno de senescência celular (Spiering, A.l. et al., Exper. Cell Res. 179:1 59-1 67 (1 988); Pereira-Smith, O.M. et al., Exper. Cell Res. 1 60:297-306 (1985); Drescher-Lincoln, C.K. et al., Exper. Cell Res. 1 53:208-217 (1984); Drescher-Lincoln, C.K. et al., Exper. Cell Res. 144:455-462 (1983)). Além disso, foi identificada a abundância relativa de algumas moléculas de ARN associadas com a senescência (Lumpkin, C.K. et al., Science 232:393-395 (1986)). Vários laboratórios utilizaram o método de pesquisa da "subtracção-diferencial", para identificar moléculas de ADNc derivadas de espécies de ARN que estão preferencialmente presentes em células senescentes (Kleinsek, D.A., Age _1_2:55-60 (1989); Giordano, T,. et al.. Exper. Cell Res. 185:399-406 (1989); Sierra, F. et al., Molec. Cell Biol. 9:5610-5616 (1989); Pereira-Smith, O.M. et al., J Cell Biochem. (Suppl 0 (12 parte A)) 193 (1988); Kleinsek, D.A., Smith, J.R. Age 10:125 (1987)).

Num método, designado por pesquisa de "subtracção-diferencial", cria-se um conjunto de moléculas de ADNc a partir de células senescentes e estas são hibridadas com ADNc ou ARN de células em crescimento, de modo a "subtrair" as moléculas de ADNc que são complementares a moléculas de ácido nucleico presentes em células em crescimento. Embora útil, para alguns fins, o método da "substracção-diferencial" tem a desvantagem de não se poder determinar se uma molécula de ADNc associada à senescência está associada à causa da senescência, ou se é produzida como resultado da senescência. De facto, verificou-se que muitas das sequências identificadas deste modo codificam para proteínas da matriz extracelular. É pouco provável que as alterações na expressão destas proteínas provoquem senescência.

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ΕΡ Ο 640 143/ΡΤ SUMÁRIO DO INVENTO Ο presente invento refere-se, em parte, à observação do facto de as células humanas normais exibirem um potencial replicativo limitado in vitro, tornando-se senescentes após um certo número de divisões. À medida que as células se vão tornando senescentes, vão apresentando algumas alterações morfológicas e bioquímicas, tais como um aumento do tamanho da célula, alterações nos componentes da matriz extracelular, não responderem à estimulação com mitogénios e incapacidade de expressar genes regulados pelo crescimento. O presente invento identifica um inibidor da síntese de ADN que é produzido em células senescentes. Este inibidor desempenha um papel crucial na expressão do fenótipo senescente. O gene que codifica para o inibidor foi identificado por incorporação de uma biblioteca de ADNc de células senescentes num vector de expressão de mamífero. A biblioteca de ADNc foi em seguida transfectada em células jovens, em ciclização, para identificar quais os membros da biblioteca que suprimiam a iniciação da síntese de ADN.

Uma transfecção eficiente mediada por DEAE-dextrano permitiu isolar sequências do inibidor putativo derivado de células senescentes (SDI), em três clones de ADNc distintos. A expressão de um destes (SDI-1) aumentou 20 vezes na senescência celular, enquanto que a de outros (SDI-2 e SDI-3) permaneceu constante.

Em resumo, com presente invento obtém-se a clonagem de um inibidor da síntese de ADN, utilizando um teste funcional. Este método pode ser aplicado para clonar outros genes envolvidos na regulação negativa do ciclo celular, tais como genes de diferenciação específica de tecido e da supressão tumoral. Utilizando este método, clonaram-se três sequências de inibidor. Uma destas sequências (SDI-1) parece estar estreitamente relacionada com a senescência celular.

Em pormenor, o invento proporciona uma molécula de ácido nucleico que codifica para uma proteína capaz de inibir a síntese de ADN numa célula receptora, em que a proteína é SDI-1 com a sequência de aminoácidos de SEQ ID No. 2. 7 86 476 ΕΡ Ο 640 143/ΡΤ Ο invento refere-se, em particular, à concretização em que a molécula de ácido nucleico é ADN, e é incorporada num plasmídeo de ADN (como pcDSRaA). O invento refere-se também a concretizações em que a molécula de ácido nucleico acima referida é SDI-1 e tem a sequência apresentada na figura 5 <SEQ ID 1 >. O invento inclui também a concretização em que a molécula de ácido nucleico é ARN. O presente invento refere-se também a uma molécula de ácido nucleico (quer ADN, quer ARN) com uma sequência complementar a esta molécula de ARN e com um comprimento suficiente para permitir que as moléculas hibridem umas com as outras, sob condições fisiológicas. O invento proporciona também um método para inibir a síntese de ADN numa célula humana que compreende fornecer à célula uma quantidade eficaz da molécula de ácido nucleico acima referida, que codifica para uma proteína capaz de inibir a síntese de ADN (e especialmente em que a célula é uma célula de tumor, ou uma célula em cultura in vitro). O invento proporciona também um método para desreprimir uma inibição da síntese de ADN numa célula humana quiescente, ou senescente, que compreende proporcionar à célula uma quantidade eficaz de uma molécula de ácido nucleico (quer de ADN, quer de ARN) com uma sequência complementar a uma molécula de ARN que codifica para uma proteína capaz de inibir a síntese de ADN numa célula receptora e com um tamanho suficiente para permitir que as moléculas hibridem umas com as outras, sob condições fisiológicas. É contemplada em particular, uma concretização em que a célula é uma célula de pele, ou uma célula presente num tecido ferido, ou queimado. O invento contempla ainda a utilização de agentes do presente invento em outros tecidos além da pele, como linfócitos, tecido vascular (tal como artérias, arteríolas, capilares, veias, etc.), fígado, rim, coração e outros músculos, osso, baço, etc. 8 86 476 ΕΡ Ο 640 143/ΡΤ

DESCRIÇÃO SUMÁRIA DAS FIGURAS A figura 1 mostra a estrutura do vector de clonagem e expressão de ADNc, o pcDSRaA (B representa o local de BamHI). A Figura 2 identifica os clones de ADNc inibidores da síntese de ADN em células jovens. As três barras diferentes representam experiências de transfecção independentes, * indica não realizado, um número negativo indica índices de marcação superiores aos controlos. A figura 3 mostra a transfecção de ADNc de SDI anti-sentido. Os plasmídeos de expressão de ADNc anti-sentido foram produzidos e cotransfectados com pCMVp em células jovens. Pista 1: pcDSRaA controlo; Pista 2: pcDSRctA-SDI, Pista 3: pcDSRaA anti-SDI-1, controlo, Pista 4: pcDSRocA-SDI-2, Pista 5: pcDSRccA-antiSDI-2. A Figura 4 mostra as alterações na recuperação de ARN poliA+ a partir do ARN total, durante o envelhecimento celular. A Figura 5 proporciona as sequências de nucleótidos e de aminoácidos do ADNc de SDI-1.

DESCRIÇÃO PORMENORIZADA DO INVENTO I. Senescência celular A senescência replicativa de fibroblastos diplóides humanos, normais, em cultura, é um modelo bem estabelecido e amplamente aceite, do envelhecimento celular (Hayflick, L. Exp. Cell Res. 37:611-636 (1965); Norwood, T.H. e Smith, J.R., In: Handbook of the Bioloqy of Aqinq (2a ed) C.E. Finch e E.L. Schneider, eds. Van Nostrand, New York pp. 291-311 (1985); Goldstein, S., Science 249:1 1 29-11 33 (1990)). Após um número limitado de duplicações da população, à medida que as células se tornam senescentes, elas perdem a capacidade de se dividir e apresentam uma morfologia grande e achatada. Os mecanismos que estão na base deste fenómeno não são ainda compreendidos, apesar das muitas observações que caracterizam as células senescentes aos níveis bioquímicos e moleculares. 9 86 476 ΕΡ Ο 640 143/ΡΤ

As análises em gel de proteínas, numa e duas dimensões, revelaram que há poucas proteínas marcadoras, específicas de células senescentes (Lincoln, D.W. et al., Exp. Cell Res. 154:136-146 (1984); Wang, E.( J. Cell Biol. 100:545-551 (1985); Scottie, J. et al.. J. Cell Phvsiol. 131:210-217 (1987); Bayreuther, K. et al., Proc. Natl. Acad. Sei. USA 85:51 12-5116 (1988)). Os determinantes antigénicos que especificam as células senescentes foram encontrados na membrana plasmática (Porter, M.B. et al.. J. Cell Phvsiol. 1 42:425-433 (1990)). Verificou-se que os componentes da matriz extracelular, como a fibronectina e a colagenase, são sobre-expressos em células senescentes (West, M.D. et al., Exp. Cell Res. 184:138-147 (1989); Kumazaki, T. et al., Exp. Cell Res. 195:13-19 (1991)). No entanto, a relevância destas observações para a senescência celular não é clara.

Recentemente, foram identificadas alterações na expressão de vários genes regulados pelo crescimento. Verificou-se que a expressão de c-fos, cdc2, ciclina A e B, é danificada nas células senescentes (Seshadri, T. e Campisi, J., Science 247:205-209 (1990)). Igualmente, as células senescentes evidenciam uma incapacidade para fosforilar a proteína do retinoblastoma (Stein, G.H. et al.. Science 249:666-669 (1990)). Estas observações poderiam explicar potencialmente a incapacidade das células entrarem na fase S, uma vez que são todas alterações prejudiciais da expressão de genes promotores do crescimento, no entanto, não é claro se são a causa, ou o resultado da senescência.

Uma alteração adicional na expressão genética que poderá ter um papel causal na senescência é o inibidor(es) da síntese de ADN produzido pelos fibroblastos senescentes, mas não pelos jovens (veja-se, Spiering, A.l. et al.. Exper. Cell Res. 195:541 -545 (1991). As evidências para a existência de inibidor(es) foram primeiro obtidas a partir de experiências de heterocarião, em que as células senescentes inibiram a iniciação da síntese de ADN em núcleos jovens, no heterocarião (Norwood, T.H., et al.. Proc, Natl. Acad. Sei. USA 71:2231-2234 (1974); Pereira-smith, O.M. e Smith, J.R., Somat. Cell Genet. 8:731-742 (1982)).

Estudos com cíbridos ("cybrids"), envolvendo citoplastos senescentes e células jovens totais, deram um novo suporte à presença de um inibidor proteico da síntese de ADN, associado à superfície da membrana, em células 10 86 476 ΕΡ Ο 640 143/ΡΤ senescentes (Dresher-Lincoln, C.K. e Smith, J.R., Exp. Cell Res. 153:208-217 (1984)). Isto foi demonstrado directamente, quando se verificou que preparações enriquecidas com superfícies de membranas de células senescentes, ou proteínas extraídas das membranas, inibiam a síntese de ADN, quando adicionadas ao meio de cultura de células jovens (Pereira-smith, O.M. et al., Exp. Cell. Res. 1 60:297-306 (1985); Stein, G.H. e Atkins, L. Proc. Natl. Acad. Sei. USA 83:9030-9034 (1986)). A purificação desse inibidor por métodos bioquímicos não tem tido sucesso, até à data. No entanto, em experiências de micro-injecção, foi demonstrada a presença de uma quantidade elevada de ARN mensageiro inibidor da síntese de ADN (Lumpkin, C.K. et al., Science 232:393-395 (1986)).

De modo a tentar clonar o(s) gene(s) que codifica(m) para o(s) inibidor(es) da síntese de ADN, utilizou-se um processo de pesquisa funcional. Este método conduziu ao isolamento e identificação de três espécies de ADNc que exibem actividade inibidora da síntese de ADN quando introduzidas em células jovens em ciclização. Estas moléculas são aqui designadas como "inibidores derivados de células senescentes" ("SDI"). II. Clonagem de inibidores de senescência celular

Na prática do presente invento, utiliza-se, de preferência, um método eficaz para a clonagem molecular das sequências inibitórias da síntese de ADN presentes em fibroblastos diplóides, humanos, senescentes. Tal como é muitas vezes o caso, quando se tenta clonar genes biologicamente importantes poderá não ser possível purificar um gene desejado, responsável pela senescência celular, mesmo apesar da actividade dos seus produtos poder ser facilmente detectada.

Um método que pode ser considerado para a identificação de uma sequência de genes deste tipo, seria a utilização de uma pesquisa diferencial ou subtractiva de uma biblioteca de ADNc, derivado a partir de células senescentes. Este método tem sido utilizado para identificar moléculas de ADNc que são sobre-expressas em células de pacientes com o síndrome de Werner (Murano, S. et al.. Molec. Cell. Biol. 11:3905-3914 (Agosto 1991). O síndrome de Werner é uma desordem hereditária rara. Caracteriza-se por um 11 86 476 ΕΡ Ο 640 143/ΡΤ ner envelhecimento prematuro. Desconhece-se a relevância do síndrome de para o envelhecimento natural.

Infelizmente, estas pesquisas irão identificar um número de genes que, embora importantes para a caracterização de células senescentes, não seriam primeiramente responsáveis pela senescência. Além disso, as limitações técnicas na clonagem de ADNc de comprimento completo tornam difícil a determinação da função dos genes clonados, por estes métodos. Por estes motivos, estes métodos diferenciais não são, nem geralmente adequados, nem o método mais desejável para identificar sequências de genes relacionados com a senescência.

Pelo contrário, a pesquisa de expressão proporciona um método preferido para a identificação e isolamento destas sequências de genes relacionados com a senescência. Neste método de pesquisa, o ADNc é clonado directamente num vector que é capaz de expressar o gene clonado numa célula receptora. As células receptoras podem assim ser directamente pesquisadas, quanto a qualquer inibição da síntese de ADN.

Na pesquisa de expressão, o passo mais importante é a síntese de ADNc. As enzimas deverão ser cuidadosamente seleccionadas para serem isentas de impurezas. A síntese de ADNc é preferencialmente repetida várias vezes, para assegurar a obtenção de resultados satisfatórios (i.e. transcrição inversa fiel e tamanho completo do transcrito). Por fim, os produtos de ADNc são, de preferência, fraccionados por tamanho, para eliminar produtos de ADNc fragmentados e prematuramente terminados. Os produtos de ADNc de cadeia dupla são então preferencialmente divididos em fracções baseadas no tamanho, i.e. fracções de 0,5-2,0, 2,0-4,5 e 4,5-10 kb. A fracção de ADNc de 2-4,5 kb foi utilizada para construir uma biblioteca de ADNc, com o pressuposto de que muitas proteínas associadas à membrana têm um peso molecular relativamente elevado. Os ADNc são inseridos num vector de expressão adequado, de preferência pcDSRaA, no qual as sequências inseridas podem ser transcritas a níveis elevados, em células jovens. O processo de transfecção mais preferido é a transfecção mediada por DEAE-dextrano, realizada sob condições que permitem a expressão transiente numa percentagem elevada de células jovens em ciclização. Uma vez que as 12 86 476 ΕΡ Ο 640 143/ΡΤ frequências de transfecção podem variar de experiência para experiência, os plasmídeos do conjunto de ANDc foram transfectados juntamente com um plasmídeo marcador, como o pCMN/β (que codifica para a β-galactosidase) e o índice de marcação foi testado apenas em células positivas para a β-galactosidase. Em geral, a coexpressão de genes transfectados é bastante elevada, uma vez que a transfecção de células competentes irá aceitar plasmídeos múltiplos. Este método simples de cotransfecção permitiu a avaliação da síntese de ADN em células que expressam ADN exógeno. A quantidade de plasmídeos a ser cotransfectados foi determinada a partir de experiências piloto. Quando a correlação entre a frequência de transfecção e a quantidade de plasmídeo adicionado é analisada utilizando um plasmídeo marcador, obtém-se a eficiência máxima numa gama de 100-500 ng de plasmídeo. Tendo em conta este resultado, a biblioteca de ADNc é dividida de preferência em pequenos conjuntos, em que cada conjunto contém cinco clones de plasmídeo independentes. Em seguida a cotransfecção é realizada com aproximadamente 100 ng de ρΟΜνβ e aproximadamente 400 ng de plasmídeo de ADNc. Verificou-se que estes çparâmetros maximizam a coexpressão de ADNc em células positivas para a β-galactosidase, sem decréscimo da frequência de transfecção do plasmídeo marcador.

Após o segundo ciclo de pesquisa, os plasmídeos simples que apresentaram uma inibição forte da síntese de ADN podem ser isolados com sucesso a partir do conjunto com teste positivo durante o primeiro ciclo de pesquisa (figura 2). Na Figura 2, os conjuntos de ADNc que deram positivo no primeiro ciclo de pesquisa foram divididos em plasmídeos individuais e transfectados mais uma vez. Para cada conjunto de ADNc (A, B e C), os plasmídeos No. 1 a 5 representam o resultado de cada transfecção de plasmídeo. No conjunto B, verificou-se que o plasmídeo No. 1 era apenas o vector vazio. As actividades inibitórias dos plasmídeos são preferencialmente confirmadas também por experiências de micro-injecção nuclear. Estas experiências proporcionam uma evidência mais directa, de que os plasmídeos isolados contêm sequências capazes de inibir a síntese de ADN. 13 86 476 ΕΡ Ο 640 143/ΡΤ III. Moléculas do presente invento e suas utilizações. O presente invento contempla a utilização de qualquer um de uma variedade de agentes químicos, ou para inibir ou para permitir a síntese de ADN. Estes agentes podem ser: (1) um oligonucleótido, (2) uma proteína de ligação a um ácido nucleico, ou (3) um composto cuja estrutura mimetiza a de um oligonucleótido ou de uma molécula de ligação a um ácido nucleico (i.e. um agente "peptidomimético").

Os agentes do presente invento são capazes quer de induzir a inibição da síntese de ADN em células activas, quer de suprimir esta inibição em células senescentes, ou quiescentes, podendo ser utilizados numa vasta gama de terapias e aplicações.

Assim, numa concretização, o presente invento proporciona um meio para o isolamento de moléculas de ADNc, na forma funcional (i.e. expressável), que são capazes de inibir a síntese de ADN em células receptoras. Estas moléculas de ácido nucleico "SDI", bem como as proteínas que codificam, e os seus análogos peptidomiméticos, têm utilidade na indução de um estado senescente, ou quiescente, numa célula receptora. Esta indução é desejável no tratamento de progeria (Badame, A.J., Arch. Dermatol. 125:540 (1989); Hamer, L. et al., Orthoped. JJ_:763 (1988); Martin, G.M., Natl. Canc. Inst. Monoqr. 60:241 (1982)); desordens relacionadas com a idade (Martin, G.M., Genome 3J_:390 (1989); Roe, D.A., Clin. Geriatr. Med. 6:319 (1990); Mooradian, A.D., J. Amer. Geriat. Soe. 36:831 (1988); Alpert, J.S., Amer, J. Cardiol. 65:23j (1990)); doença de Alzheimer (Terry, R.D., Monoqr. Pathol. 32:41 (1990); Costall, B. et al.. Pharmacopsvchiatrv 23:85 (1990)), astenia e caquéxia (Verdery, R.B., Geriatrics 45:26 (1990)), ou doenças, ou condições em que a proliferação celular rápida é indesejável. A este respeito, os agentes do presente invento podem ser utilizados terapeuticamente, para suprimir a proliferação rápida de células tumorais, ou tumorigénicas. Deste modo, o presente invento proporciona uma terapia para o tratamento do cancro. A sequência das moléculas de ácido nucleico de SDI permite atribuir e identificar moléculas de proteína que podem ser utilizadas para suprimir a inibição da síntese de ADN, associada à quiescência e à senescência. A sequência de aminoácidos destas moléculas pode ser facilmente derivada, a 14 86 476 ΕΡ Ο 640 143/ΡΤ partir da relação conhecida entre a sequência nucleotídica de uma molécula de ácido nucleico e a sequência de ácido nucleico da proteína que codifica. O presente invento inclui as moléculas de proteína e de polipéptido que seriam sintetizadas através da transcrição e tradução das moléculas de ácido nucleico de SDI descritas.

Uma outra classe de moléculas contemplada pelo presente invento, compreende proteínas ou outras moléculas (i.e. análogos peptidomiméticos) que mimetizam a função das proteínas expressas a partir de sequências SDI.

Estes e outros análogos podem ser facilmente identificados, por exemplo, explorando a capacidade dos agentes do presente invento induzirem ou desreprimirem a síntese de ADN, podem ser utilizados para identificar agentes capazes de inverter estes processos. Assim, por exemplo, podem-se incubar células na presença de ambos, um oligonucleótido SDI e um composto que se suspeita ser um antagonista. As células seriam monitorizadas de modo a determinar se o composto é capaz de prejudicar a capacidade do oligonucleótido SDI inibir a síntese de ADN. Assim, o presente invento inclui um "teste de pesquisa" capaz de identificar antagonistas dos oligonucleótidos SDI. Ao invés disso, podem-se incubar as células na presença de ambos, um oligonucleótido SDI anti-sentido e um composto que se suspeita ser antagonista. As células seriam monitorizadas de modo a determinar se o composto é capaz de prejudicar a capacidade do oligonucleótido anti-sentido desreprimir a síntese de ADN. Assim, o presente invento inclui um "teste de pesquisa" capaz de identificar antagonistas dos oligonucleótidos anti-sentido. De um modo semelhante, os agonistas destes agentes podem alternativamente ser identificados.

De entre os compostos agonistas que podem ser identificados por utilização de um teste de pesquisa deste tipo, salientam-se os compostos que podem ser utilizados para induzir infertilidade. Igualmente, o teste irá permitir a identificação de compostos capazes de suprimir, ou de induzir a regeneração ou vascularização de tecidos. Estes compostos podem ser úteis no tratamento do cancro.

Além da sua utilização na expressão de proteínas e polipéptidos e na definição de análogos desejáveis, as moléculas de ácido nucleico SDI do 15 86 476 ΕΡ Ο 640 143/ΡΤ presente invento podem ser utilizadas para produzir moléculas de ácido nucleico anti-sentido, capazes de se ligar a uma molécula de ácido nucleico SDI e inibir a sua actividade, etc. Um agente deste tipo particularmente preferido, é um oligonucleótido anti-sentido.

Em geral, um "oligonucleótido anti-sentido" é um ácido nucleico (quer ADN, quer ARN) cuja sequência é complementar à sequência de uma molécula de ARNm alvo (ou ao seu gene correspondente), de modo que é capaz de se ligar, ou hibridar, com a molécula de ARNm (ou com o gene), prejudicando (i.e. atenuando ou prevenindo) desse modo, a tradução da molécula de ARNm num produto génico. A fim de actuar como oligonucleótido anti-sentido, a molécula de ácido nucleico deverá ser capaz de se ligar, ou hibridar, com a porção da molécula alvo de ARNm (ou gene) que medeia a tradução do ARNm alvo. Os oligonucleótidos anti-sentido são descritos nos pedidos de patente europeia com os Nos de publicação 263 740; 335 451 e 329 882 e na publicação PCT N°. W090/00624. O presente invento refere-se, em particular, aos oligonucleótidos anti-sentido que são capazes de se ligar ou hibridar com moléculas de ARNm ou ADNc, que codificam para um produto génico SDI.

Assim, numa concretização do presente invento, pode-se utilizar um oligonucleótido anti-sentido que é concebido para bloquear especificamente a tradução de um transcrito de ARNm SDI, para desreprimir a inibição da síntese de ADN numa célula senescente receptora.

Uma forma de um oligonucleótido anti-sentido anti-SDI atingir estes objectivos é possuindo uma sequência complementar à da região de iniciação da tradução de um ARNm de SDI e de comprimento suficiente para ser capaz de hibridar com o transcrito de ARNm de um gene de SDI. O tamanho de um oligómero deste tipo pode ser qualquer comprimento que seja eficaz para este fim. De preferência, o oligonucleótido anti-sentido terá cerca de 10-30 nucleótidos de comprimento, mais preferencialmente cerca de 15-24 nucleótidos de comprimento.

Alternativamente, podem-se utilizar oligonucleótidos anti-sentido, com um comprimento demasiado curto para serem capazes de hibridar de forma estável 16 86 476 ΕΡ Ο 640 143/ΡΤ com um ARNm de SDI, sob condições fisiológicas in vivo. Este oligonucleótido pode ter desde cerca de 6-10, ou mais nucleótidos de comprimento. Para ser utilizado de acordo com o presente invento, este oligonucleótido é de preferência modificado, para permitir a sua ligação a um locus da região de tradução de um AHNm que codifica para SDI. Exemplos destas moléculas modificadas incluem oligonucleótídos ligados a um anticorpo (ou fragmento de anticorpo), ou outro ligando (tal como um agente de reticulação bivalente (como por exemplo, trimetilpsoralina, 8-metoxipsoralina, etc.) capaz de se ligar a moléculas de ARNm de SDI de cadeia simples.

Um oligonucleótido anti-sentido anti-SDI, ligado a um grupo reactivo de um agente de reticulação bivalente (como a psoralina) (por exemplo, trimetilpsoralina, ou 8-metoxipsoralina) seria capaz de reticulação com um ARNm de SDI, por activação com luz UV a 350-420 nm. Assim, regulando a intensidade desta luz (por exemplo variando a potência da lâmpada de UV, aumentando a distância entre as células e a lâmpada, etc), pode-se controlar a extensão de ligação entre o oligonucleótido anti-sentido e o ARNm de SDI de uma célula. Isto, por sua vez, permite controlar o nível de atenuação da expressão do gene de SDI, numa célula receptora.

Em geral, o oligómero anti-sentido é preparado de acordo com a sequência nucleotídica de um gene de SDI e mais preferencialmente de acordo com a sequência nucleotídica de SDI-1 (Figura 5). A sequência do oligonucleótido anti-sentido pode conter uma ou mais inserções, substituições ou deleçÕes de um ou mais nucleótidos, desde que o oligonucleótido resultante seja capaz de se ligar ou hibridar com o locus de tradução acima descrito, quer de um ARNm, ADNc de SDI, ou um próprio gene de SDI.

Podem-se utilizar quaisquer meios conhecidos na arte para sintetizar os oligonucleótídos anti-sentido do presente invento (Zamechik et al.. Proc. Natl. Acad. Sei. (USA) 83:4143 (1986); Goodchild et al.. Proc. Natl. Acad. Sei. (USA) 85:5507 (1988); Wickstrom et al.. Proc. Natl. Acad. Sei. (USA) 85:1028; Holt, J.T. et al., Mol. Cell Biol. 8:963 (1988; Gerwirtz, A.M. et al.. Science 242:1303 (1988; Anfossi, G. et al., Proc. Natl. Acad. Sei. (USA) 86:3379 (1989); Becker, D. et al., EMBO J. 8:3679 (1989). Podem-se utilizar 17 86 476 ΕΡ Ο 640 143/ΡΤ sintetizadores automáticos de ácidos nucleicos para este fim. Além disso, os nucleótidos desejados de qualquer sequência podem ser obtidos a partir de qualquer fornecedor comercial destas moléculas.

Mais preferencialmente, os oligonucleótidos anti-sentido do presente invento podem ser preparados utilizando a "síntese do fosforamidito" em fase sólida. A síntese é realizada com a cadeia de nucleótidos crescente ligada a um suporte sólido, derivatizado com o nucleótido que será a extremidade 3'-hidroxilo do oligonucleótido. O método envolve a síntese cíclica de ADN, utilizando unidades monoméricas cujo grupo 5'-hidroxilo está bloqueado (de preferência com um grupo 5'-DMT (dimetoxitritilo)), e cujos grupos amino estão bloqueados ou com um grupo benzoílo (para os grupos amino da citosina e da adenosina), ou com um grupo isobutirilo (para proteger a guanosina). Os métodos para a produção destes derivados são bem conhecidos na arte.

Podem-se utilizar moléculas anti-sentido e outras moléculas inibidoras do presente invento para imortalizar tipos de células valiosos (tais como células de cultura de tecidos primárias, etc.) que teriam, de outro modo, um período transiente de viabilidade proliferativa. Podem assim ser utilizadas para investigação, ou para permitir, ou facilitar a acumulação de grandes números de células, por exemplo para enxertos ou transplantes de órgãos, ou tecidos. Numa concretização, os agentes do presente invento podem, portanto, ser utilizados em conjunção com métodos para a cultura de órgãos ou tecidos, para facilitar estes métodos.

Diz-se que uma utilização é terapêutica se altera uma condição fisiológica. Uma utilização não terapêutica é aquela que altera a aparência de um utilizador.

Os agentes do presente invento podem ser utilizados tópica, ou sistemicamente para um fim terapêutico ou não terapêutico, como, por exemplo, para contrariar os efeitos do envelhecimento, por exemplo, no tom, cor, textura da pele, etc., ou na degeneração das células, tecido ou órgãos, como linfócitos, tecido vascular (tal como artérias, arteríolas, capilares, veias, etc.), fígado, rim, coração e outros músculos, osso, baço, etc. Os agentes do presente invento podem ser utilizados para rejuvenescer estas células, tecidos ou órgãos. Assim, podem ser utilizados em fármacos, e semelhantes, que 18 86 476 ΕΡ Ο 640 143/ΡΤ podem compreender, por exemplo, um oligonucleótido anti-sentido, ou um seu equivalente, e um transportador ou adjuvante lipofílico, de preferência dissolvido num solvente adequado. Este solvente pode ser, por exemplo, uma mistura de água-etanol (contendo 10% a 30% v/v ou mais de etanol). Estas preparações podem conter 000,1% a 1,0% do oligonucleótido anti-sentido. Os transportadores, adjuvantes e solventes adequados, estão descritos em Remington's Pharmaceutical Sciences (16a ed., Osol, A., Ed., Mack, Easton PA (1980).

Uma vez que as moléculas anti-sentido e outras moléculas inibidoras do presente invento são capazes de estimular a proliferação celular, estas podem ser utilizadas para promover a cura de feridas, a recuperação de queimaduras ou após cirurgia, ou para recuperar tecido atrofiado, etc. Para esta concretização, estes agentes podem ser formulados com antibióticos, agentes anti-fúngicos ou semelhantes, para administração tópica ou sistémica.

Estas moléculas anti-sentido e outras moléculas inibidoras, do presente invento podem ser utilizadas para estimular a proliferação de espermatócitos, ou a maturação de oócitos em humanos, ou animais. Assim, os agentes do presente invento podem ser utilizados para aumentar a fertilidade de um receptor.

As moléculas do presente invento podem ser utilizadas para proporcionar uma terapia génica a pacientes receptores. Numa concretização, as células, ou tecido de um paciente podem ser removidos do paciente e tratados com uma molécula do presente invento, sob condições suficientes para permitir o restabelecimento de um estado de crescimento activo. Numa concretização preferida desta utilização, podem-se remover linfócitos de um indivíduo (como por exemplo um indivíduo imunocomprometido, como um paciente com SIDA, etc., ou um indivíduo imunocompetente, que servirá como dador de linfócitos) e tratar com ácidos nucleicos SDI, anti-sentido. A administração destas moléculas irá desreprimir os linfócitos. Após a administração, os linfócitos são introduzidos de novo no paciente e têm uma capacidade aumentada para combater a infecção.

As moléculas do presente invento são particularmente adequadas para utilização na criação e/ou estudo de modelos animais de doença e degeneração 19 86 476 ΕΡ Ο 640 143/ΡΤ de tecidos. Assim, as moléculas do presente invento podem ser utilizadas para estudar efectores de um modelo animal, que se caracteriza por um envelhecimento anormal, ou degeneração celular. De modo semelhante, a administração das moléculas SDI (ligadas, por exemplo a sequências reguladoras adequadas, de modo a permitir a sua expressão numa célula receptora) pode ser utilizada para criar modelos animais de envelhecimento e degeneração de tecidos. IV. Métodos de administração

Os agentes do presente invento podem ser formulados de acordo com métodos conhecidos, para preparar composições farmaceuticamente úteis, em que estes materiais, ou os seus derivados funcionais, são combinados em mistura com um veículo transportador farmaceuticamente aceitável. Os veículos adequados e a sua formulação, incluindo outras proteínas humanas, e.g. albumina de soro humano, são descritos, por exemplo, em Remington's Pharmaceutical Sciences (16a ed., Osol, A. Ed., Mack, Easton PA (1980)). De modo a formar uma composição farmaceuticamente aceitável, adequada para uma administração eficaz, estas composições irão conter uma quantidade eficaz de um oligonucleótido anti-sentido, ou um seu equivalente, ou seus derivados funcionais, juntamente com uma quantidade adequada de veículo transportador.

Podem-se utilizar outros métodos farmacêuticos para controlar a duração da acção. As preparações de libertação controlada podem ser conseguidas através da utilização de polímeros para complexar ou absorver um oligonucleótido anti-sentido, ou um seu equivalente ou derivados funcionais destes. O fornecimento controlado pode ser realizado seleccionado macromoléculas adequadas (por exemplo poliésteres, poliaminoácidos, polivinilpirrolidona, acetato de etilenovinilo, metilcelulose, carboximetilcelulose, ou sulfato de protamina) e a concentração das macromoléculas, bem como os métodos de incorporação, de modo a controlar a libertação. Outro método possível para controlar a duração da acção por meio de preparações de libertação controlada, é incorporar um oligonucleótido anti-sentido, ou o seu equivalente, ou derivados funcionais destes, em partículas de um material polimérico, como poliésteres, poliaminoácidos, hidrogeles, poli(ácido láctico) ou copolímeros de acetato de etilenovinilo. Alternativamente, em vez de incorporar estes agentes nas partículas poliméricas, é possível, por exemplo, aprisionar 86 476 ΕΡ Ο 640 143/ΡΤ 20

estes materiais em microcápsulas preparadas, por exemplo, por técnicas de coacervação, ou por polimerização interfacial, por exemplo, microcápsulas de hidroximetilcelulose ou de gelatina e microcápsulas de poli(metilmetacilato), respectivamente, ou em sistemas coloidais de fornecimento de drogas, por exerriplu, lipubsumas, microesferas de albumina, microemulsões, nanopartículas e nanocápsulas, ou em macroemulsões. Estas técnicas são descritas em Remington's Pharmaceutical Sciences (1980).

As composições do presente invento podem também ser formuladas para administração parentérica por injecção, infusão rápida, absorção nasofaríngica (intranasofaríngica), absorção dérmica, ou oralmente. As composições podem ser administradas, alternativamente, intramuscular ou intravenosamente. As composições para administração parentérica incluem soluções, suspensões e emulsões, aquosas ou não aquosas, estéreis. Exemplos de solventes não aquosos incluem propilenoglicol, polietilenoglicol, óleos vegetais, como azeite e ésteres orgânicos injectáveis, como o oleato de etilo. Podem-se utilizar transportadores, adjuvantes ou pensos oclusivos para aumentar a permeabilidade tecidular e aumentar a absorção de antigénios. As formas de dosagem líquidas para administração oral podem compreender, geralmente, uma solução de lipossomas contendo a forma de dosagem líquida. As formas adequadas para suspender lipossomas incluem emulsões, suspensões, soluções, xaropes e elixires contendo diluentes inertes, vulgarmente utilizados na arte, como água purificada. Além dos diluentes inertes, estas composições podem incluir também agentes molhantes, agentes emulsionantes e de suspensão ou edulcorantes, aromatizantes, corantes ou perfumantes.

Diz-se que uma composição é "farmacologicamente aceitável", se a sua administração pode ser tolerada por um paciente receptor. Diz-se que um agente é administrado numa "quantidade terapeuticamente eficaz", se a quantidade administrada é fisiologicamente significativa. Um agente é fisiologicamente significativo se a sua presença resulta numa alteração detectável na fisiologia de um paciente receptor.

Geraimente, a dosagem necessária para proporcionar uma quantidade eficaz de uma composição irá variar, dependendo de factores como a idade, a condição, o sexo do receptor e a extensão da doença, se existente, e outras variáveis, que podem ser ajustadas por qualquer perito na arte.

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As quantidades eficazes das composições do invento podem variar desde 0,01-1 000 mg/ml por dose, ou aplicação, embora se possam utilizar quantidades menores ou maiores.

Tendo sido feita uma descrição geral do invento, o mesmo será mais facilmente compreendido com referência aos exemplos que se seguem, que são fornecidos a título ilustrativo, não pretendendo limitar o presente invento, salvo se especificado. EXEMPLO 1 CRIAÇÃO DA BIBLIOTECA DE ADNc

Obteve-se uma biblioteca de ADNc utilizando ARN de fibroblastos de prepúcio de recém-nascidos humanos, normais, tal como a linha celular HCA2. Para isso, as células foram crescidas em meio essencial mínimo, com solução salina equilibrada de Earle, ou de Hank, suplementada com soro fetal de bovino a 10% (GIBCO ou Hyclone). Fez-se a cultura das células e o seu período de vida in vitro foi determinado, sob as condições descritas em Smith, J.R. e Braunschweiger, K.I., J. Cell Physiol. 98:597-601 (1979). Produziram-se células quiescentes substituindo o meio de cultura normal, por meio de cultura contendo 0,5% de soro, antes das células se tornarem confluentes. As células foram mantidas em cultura com baixo teor de soro, durante até 3 semanas. O ARN celular total foi isolado, ou pelo método do tiocianato de guanidínio/CsCI (Garger, S.J. et al., Biochem. Biophys. Res. Commun 1 1 7:835-842 (1983)), ou por um método de tiocianato de guanidínio/fenol (Chomczynski, P. e Sacchi, N., Anal. Biochem. 162:156-159 (1987), RNAzol B, Biotecx Lab. Inc. TX). Isolou-se ARN poli A+ por cromatografia em coluna de oligo(dT)celulose (Collaborative Res. MA).

Converteram-se 10 ,ug do ARN poli A + derivado a partir de células senescentes, como descrito acima, em ADNc de cadeia dupla, utilizando RNase HVtranscriptase inversa MMLV, de acordo com as instruções do fabricante (BRL, MAD) e as extremidades foram tornadas lisas por tratamento com polimerase de T4. As preparações de ADNc de cadeia dupla foram fraccionadas

86 476 ΕΡ Ο 640 143/ΡΤ 22 de acordo com ο tamanho, por electroforese em gel de agarose e a fracção de 2-4,5 kb foi isolada, para inserção num vector de expressão. O vector de expressão utilizado para este fim foi o plasmídeo de 3,4 kb, designado por pcDSRaA (Hgura 1). O plasmídeo pcDSRaA é um derivado do plasmídeo pcDSRa296, o qual inclui o promotor Okayama-Berg de SV40 e o LTR de HTLV-1 (Takebe, Y. et al,, Mol. Cell. Biol. 8:466-472 (1988); fornecido pelo Dr. M. Yoshida (Inst. do cancro do Japão)). O plasmídeo pcDSRaA foi formado, removendo um segmento de 336 pares de bases (pb) do fragmento Pst1-Kpn1 de pcDSRa296 e substituindo-o por 28 pb de um fragmento Pst1-Kpn1 de pUC19. O plasmídeo resultante (pcDSRaA) foi utilizado como vector de clonagem e de expressão. O plasmídeo pSV2cat (Gorman, C. et al.. Mol. Cell. Biol. 2:1044-1051 (1982)) foi fornecido pelo Dr. Gretchen Darlington (Texas Children's Hospital). O vector pcD (Okayama, H. e Berg., P., Mol. Cell. Biol. 3:280-289 (1983) foi fornecido pelo Dr. H. Okayama (Universidade de Osaka, Japão); o plasmídeo tem o gene de cloranfenicol acetiltransferase ("CAT") inserido entre o promotor de SV40 e o sinal poli A de SV40. 0 pcDSRaA-cat foi construído a partir de pcDSRaA, pela inserção de 0,8 Kb de um fragmento do promotor SRa digerido com Hindlll-Smal em pSVOcat digerido com Hindlll, por meio de uma ligação em dois passos. Era desejado um promotor muito forte, de modo a permitir uma pesquisa de expressão eficiente da biblioteca de ANDc. A partir de uma análise de vários vectores de expressão de mamífero (pSV2cat, pcD-cat e pcDSRaA-cat, transfectados em células jovens), verificou-se que o promotor SRa conduz a expressão do gene CAT com uma eficiência elevada em células jovens em ciclização. As actividades de CAT relativas destes plasmídeos foram calculadas por normalização da quantidade de proteína utilizada para cada reacção. A eficiência transcricional era cerca de 20 vezes maior do que a do promotor pSV2 convencional, que utiliza o promotor de genes precoces de SV40.

O pCMVp transporta o gene de β-galactosidase de E. coli, comandado pelo promotor do gene precoce, imediato, do citomegalovírus humano (MacGregor, G.R. e Caskey, C.T., Nucleic Acids Res. 1_7:2365 (1989); fornecido pelo Dr. Grant MacGregor, Baylor College of Medicine, TX). O

plasmídeo ρβ440, que transporta 443 pb da sequência da β-actina humana (Nakajima-lijima, S. et al.. Proc. Natl. Acad. Sei. 82:6133-6137 (1985); fornecido pelo Dr. Kozo Makino, Universidade de Osaka, Japão). O plasmídeo pHcGAP (Tso, J.Y. et al.. Nucleic Acids Res. _1_3:2485-2502 (1985)), que transporta um ADNc de tamanho completo da gliceraldeído-3-fosfato-desidrogenase (GADPH), foi obtido da American Type Culture Collection, Rockville, MD.

Para a expressão anti-sentido de ADNc, excisaram-se fragmentos de ADNc de comprimento completo, do vector pcDSRaA originalmente clonado, por digestão com BamHI, e fez-se nova ligação no sentido inverso.

Os ADNc recuperados do gel de agarose foram inseridos directamente num local Smal de pcDSRaA, tratado com fosfatase alcalina de intestino de vitela e transformados em E. coli MC1061 ou DH-1. As colónias resistentes a ampicilina foram seleccionadas ao acaso e determinaram-se os tamanhos dos plasmídeos. Estes procedimentos foram repetidos até se obterem inserções de ANDc de 2-4,5 kb em mais de 90 por cento dos plasmídeos testados. Em seguida, cada colónia de E. coli foi seleccionada com palitos e combinaram-se 5 colónias, formando um conjunto de ADNc. Prepararam-se mais de 400 conjuntos de ADNc, cresceram-se em placas de microtítulo de 96 poços e armazenaram-se em glicerol a 14%, a -70°C. Para o isolamento de ADN, fez-se a cultura de E. coli de cada conjunto de ADNc em 200 ml e tratou-se pelos métodos convencionais de ultracentrifugação em brometo de etídio/CsCI (Garger, S.J. et al.. Biochem. Biophvs. Res Commun 1 17:835-842 (1983)) uma ou duas vezes, seguido de diálise contra solução de TE (Tris 10 mM, pH 8,0, EDTA 1 mM). EXEMPLO 2

TRANSFECÇÃO MEDIADA POR DEAE-DEXTRANO E PESQUISA DE EXPRESSÃO TRANSIENTE

Semearam-se células de fibroblastos jovens, em ciclização, a uma densidade de 0,9-1,2 x 105 por poço em placas de cultura de tecidos de 6 poços, ou placas de cultura de tecidos de 35 mm, 18 h antes da transfecção. A transfecção foi realizada como descrito por Cullen, B.R., ln:Guide to Molecular Cloninq Techniques. Methods in Enzvmoloqy. S.L. Berger e A.R. Kimmel (ed.)

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Academic Press, ρρ. 684-704 (1987), com modificações menores, como descrito a seguir.

Para cada transfecção, misturaram-se 100 ng de pCMVp e 400 ng de um conjunto de ADKic e suspendeu-se em 1 90 μΙ de solução salina tamponada com fosfato (PBS) e adicionaram-se 10 μΙ de DEAE-dextrano 10 mg/ml (Pharmacia, PM 500 000). Utilizaram-se 400 ng do plasmídeo vector de clonagem, pcDSRaA, utilizando o pCMN/β como controlo. Após lavagem das células com PBS, uma vez, adicionaram-se soluções de ADN e incubaram-se as células durante até 45 minutos, a 37°C, num incubador de C02. Em seguida, adicionaram-se directamente 2 ml de um meio de cultura de células com soro, contendo cloroquina 64 μΜ (Sigma, MO) e incubou-se por mais 2,5 h. Após o tratamento com cloroquina, a mistura de transfecção foi removida e as células foram tratadas com dimetilsulfóxido a 10%, num meio de cultura com soro, durante 2 min. As células foram recolocadas em meio de cultura fresco com soro e incubadas, para permitir a expressão do ADN transfectado. 18 h após a transfecção, adicionaram-se 0,5 pCi/ml de 3H-timidina e a incubação foi continuada por mais 48 h. As células foram fixadas por adição de 25 μΙ de solução de gluteraldeído a 25% ao meio de cultura e incubou-se durante 5 min à temperatura ambiente, seguido de três lavagens com PBS. Imediatamente após a lavagem, as células foram tratadas com a mistura reaccional de X-gal (MgCI2 1 mM, K4[Fe(CN)6] 3 mM, K3[Fe(CN)6] 3 mM, Triton X-100 (marca registada) a 0,1% e X-gal 1 mM dissolvido em tampão fosfato de sódio 0,1 M (pH 7,5), contendo KCI 10 mM) durante 20 min, para permitir que as células corassem de azulclaro. Após a coloração com X-gal, as células foram lavadas com água, secas e processadas para autorradiografia utilizando uma emulsão de vestígio nuclear NTB Kodak (Kodak, NY). A actividade de síntese de ADN em células positivas para X-gal foi então determinada. A percentagem de inibição da síntese de ADN foi calculada utilizando a fórmula: % núcleos marcados em células % núcleos marcados em células azuis nas quais foram transfectados azuis nas quais foram transfectados os plasmídeos de controlo os plasmídeos de ADNc _X 100 % núcleos marcados em células azuis, nas quais foram transfectados plasmídeos de controlo 25 86 476 ΕΡ Ο 640 143/ΡΤ

Os conjuntos de ADNc candidatos foram divididos em ADNc individuais e pesquisados ainda para a identificação das sequências de ADNc específicas, inibidoras da síntese de ADN. A micro-injecção nuclear de células jovens, em ciclização, foi realizada como descrito em (Lumpkin, C.K. et al., Mol. Cell. Biol., 6:2990-2993 (1986)). Em resumo, plaquearam-se 5 000-10 000 células em lamelas quadradas, de 22 mm, com uma grelha traçada (Bellco), em placas de cultura de tecidos de 35 mm. Três ou quatro dias mais tarde, realizaram-se micro-injecções nucleares num mínimo de 300 células, utilizando ou plasmídeo pCMN/β + ADNc, ou pCMX/β + pcDSRaA (que serviu de controlo). Os plasmídeos foram conjuntamente micro-injectados a uma concentração de 50 ng/μΙ cada. 18 horas após a micro-injecção, as células foram marcadas com 3H-timidina durante 24 h, fixadas, coradas com X-gal e processadas para autorradiografia. A percentagem de inibição da síntese de ADN foi calculada como acima.

Fez-se uma análise de manchas de Northern utilizando 5 pg de ARN total ou 1 pg de ARN poli A +. O ARN foi fraccionado de acordo com o tamanho por electroforese em geles de formaldeído-agarose e transferido para membranas de nylon (ICN; Biotrans, anteriormente Pall Biodyne A), como descrito em Maniatis, T. et al.. Molecular Cloning: A laboratory Manual; Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, New York (1982). Prepararam-se sondas radioactivas pelo método do iniciador aleatório e as manchas foram hibridadas como descrito em Maniatis, T. et al.. Molecular Cloning: A Laboratory Manual; Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, New York (1982).

As análises de manchas de Northern revelaram que os tamanhos dos transcritos celulares dos SDI eram compatíveis com os tamanhos dos ADNc de SDI. Isto era esperado uma vez que uma pesquisa da expressão com sucesso requer inserções de ADNc de tamanho completo no vector.

Para nova hibridação com a sonda de β-actina ou gliceraldeído-fosfato-desidrogenase (GADPH), removeram-se repetidamente dos filtros as sondas marcadas, de acordo com as instruções do fabricante. Os dados foram quantificados por um sistema de varrimento radioanalítico Ambis. 26 26

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Um teste da actividade de CAT foi determinado como se segue: Semearam-se células jovens, em ciclização, em placas de 35 mm e transfectaram-se 500 ng de plasmídeo, como acima descrito. 24 h após a transfecção, as células foram raspadas das placas e realizou-se o teste de CAT como descrito por Gorman (Gorman, C., In: DNA Cloning, A praticai Approach. IRL Press, Oxford, England, pp. 143-164 (1985). EXEMPLO 3

CLONAGEM DE ADNc DOS INIBIDORES DE SÍNTESE DE ADN DERIVADOS DE CÉLULAS SENESCENTES (SDI)

Sintetizaram-se ADNc de cadeia dupla a partir de ARN poli A+ derivado de células senescentes, que se verificou inibirem a síntese de ADN em células jovens, quando micro-injectados no citoplasma (Lumpkin, C.K. et al, Science 232:393-395 (1986). Os ADNc foram fraccionados de acordo com o tamanho e inseridos em pcDSRaA. Os clones de E. coli resultantes foram divididos em pequenos conjuntos. Os plasmídeos de cada conjunto foram cotransfectados com o plasmídeo marcador de transfecção, o pCIV/ΐνβ, que permitiu a determinação do índice de marcação das células transfectadas especificamente, uma vez que mesmo a uma eficiência de transfecção elevada, as frequências variaram de experiência para experiência. As frequências de transfecção do plasmídeo marcador variavam entre 30-90%. Pesquisaram-se cerca de 200 conjuntos de ADNc e quatro conjuntos permaneceram positivos para a actividade inibidora da síntese de ADN, após cinco transfecções repetidas. Os conjuntos candidatos foram então divididos em plasmídeos individuais e novamente pesquisados.

Obtiveram-se três clones de plasmídeos positivos, independentes. No conjunto de ADNc A, apenas um plasmídeo, o No. 2, exibiu uma actividade forte de inibidor de síntese de ADN. De modo semelhante, nos conjuntos B e C, apenas um clone de ADNc provocou inibição. O tamanho dos ADNc inseridos era de 2,1 kb, 1,2 kb e 2,7 kb, respectivamente. Estas sequências de ADNc foram designadas como inibidores derivados de células senescentes, SDI-1, SDI-2 e SDI-3, respectivamente.

Determinou-se a sequência nucleotídica do clone de ADNc, de SDI-1 (SEQ ID N0:1) e a sequência de aminoácidos de SDI-1 (SEQ ID NO:2). A 27 27

86 476 ΕΡ Ο 640 143/ΡΤ sequência de ADNc aqui apresentada para SDI-1 difere das descritas no pedido de patente US com o no. de série 07/808 523, na medida em que possui um G não referido, na posição 286 e tem a sequência CG em vez de GC, na posição 1843-1844. A sequência aqui descrita foi obtida através de uma nova GcqusnciõÇaC; do plasmídeo pcDSKaA-SDI-1, cujo isolamento e características foram descritos no pedido de patente US com o n°. de série 07/808 523. A E. coli DH5 transformada com o plasmídeo pcDSRaA-SDI-1 foi depositada na American Type Culture Collection, Rockville, Maryland, EUA, em 1 de Outubro de 1 992 e foi-lhe atribuído o número de acesso ATCC 69081. EXEMPLO 4

MICROINJECÇÃO DE SEQUÊNCIAS DE SDI EM CÉLULAS JOVENS, EM

CICLIZAÇÃO

De modo a verificar a actividade funcional das sequências SDI, realizaram-se micro-injecções. Um plasmídeo transportando, ou SDI-1 ou SDI-2, foi conjuntamente micro-injectado com o plasmídeo marcador nos núcleos de células jovens, em ciclização. Determinou-se o índice de marcação das células azuis resultantes (Tabela 1). Estes plasmídeos mostraram uma actividade inibidora forte da síntese de ADN de células jovens. Para as experiências de controlo, o vector vazio foi conjuntamente micro-injectado com o plasmídeo marcador. Este provocou uma ligeira inibição quando o índice de marcação foi comparado com células não injectadas, um fenómeno também observado em experiências de transfecção. As micro-injecções com SDI-3 não foram realizadas porque a actividade inibitória era inferior à de experiências de transfecção com SD-I e SD-2.

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* Este é ο número de células que expressam níveis detectáveis de β-galactosidase. A concentração de cada ADN era 50 pg/ml. 29 29

86 476 ΕΡ Ο 640 143/ΡΤ EXEMPLO 5

TRANSFECÇÃO DE ADN ANTI-SENTIDO

De modo a analisar se há algumas actividades inibitórias que sejam específicas aa orientação da sequência, construíram-se vectores de expressão anti-sentido das sequências SDI-1 e SDI-2. Uma vez que nenhuma das sequências possuía locais BamHI e dado que os locais BamHI estavam presentes em ambas as extremidades do ADNc (Figura 1), as sequências foram facilmente excisadas e novamente ligadas na orientação oposta. A transfecção de sequências anti-sentido não resultou em nenhuma inibição da síntese de ADN em células jovens (Figura 3). Além disso, não se observou nenhuma melhoria. Os resultados indicam claramente a especificidade da orientação da sequência da actividade de SDI e sugerem a presença de produtos de genes específicos codificados pelas sequências de ADNc. EXEMPLO 6

EXPRESSÃO DE ARNm de SDI DURANTE A SENESCÊNCIA CELULAR

Para avaliar as alterações na expressão de ARNm de SDI durante a senescência celular, hibridou-se ARN total de células jovens e senescentes com sondas de ADNc de SDI marcadas com 32P. A sonda de SDI-1 hibridou com um transcrito celular de 2,1 kb, a de SDI-2 hibridou com um transcrito de 1,4 kb e a de SDI-3 hibridou com um transcrito de 2,5 kb (Tabela 2). A tabela 2 proporciona uma quantificação da análise de Northern de ARN total da expressão de genes de SDI em células jovens (Y) e senescentes (S). Hibridaram-se 5 pg cada de ARN total de células jovens e senescentes com sondas SDI. A sonda radioactiva foi repetidamente removida dos filtros e novamente hibridada com as sondas para os controlos internos. A quantidade relativa de ARNm de SDI em cada amostra foi normalizada pela quantidade de GADPH detectada no mesmo filtro e pela quantidade relativa de SDI/GADPH.

Tabela 2: Quantificação da análise de Northern ATRIBUTO SDI-1 SDI-2 SDI-3 Y S Y s ; y S Quantidade relativa de SDI 1,0 3,3 1,0 0,31 1,0 0,31 Quantidade relativa de GADPH 1,0 0,37 1,0 0,36 1,0 0,38 Quantidade relativa de SDI/GADPH 1,0 9,3 1,0 0,86 1,0 0,82 30 30

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Durante a senescência celular, a mensagem de SDI-1 aumentou cerca de 3 vezes, enquanto que as mensagens de SDI-2 e SDI-3 decresceram 3 vezes. Os mesmos filtros foram novamente hibridados com uma β-actina e em seguida com uma sonda de GADPH, como controlos internos. Os resultados demonstraram que a expressão de ambos os genes de controlo diminuiu em cerca de 3 vezes durante a senescência celular. Em estudos anteriores, observou-se um decréscimo de 2-3 vezes na expressão de β-actina durante a senescência celular (Kumazaki, T. et al., Exp. Cell Res. 195:13-19 (1991); Seshadri, T. e Campisi, J., Science 247:205-209 (1990); Furth, J.J., vh Gerontol. 46:B122-124 (1991)). A expressão diminuída de ambos os genes, de β-actina e GADPH, em células senescentes levou à utilização de ARN poli A + para a análise de Northern. Isolou-se ARN poli A + a partir de preparações de ARN celular total utilizadas na tabela 2 e hibridou-se com ADNc de SDI, seguido de sondagem com β-actina e GADPH, respectivamente (Tabela 3). A tabela 3 mostra os resultados de uma análise de Northern de ARN poli A + da expressão do gene de SDI em células jovens (Y) e senescentes (S). Utilizou-se para as análises 1 μg de cada ARN poli A+ de células jovens e senescentes. A quantidade relativa de ARNm de SDI em cada amostra foi calculada como para a tabela 2. I Tabela 3: Quantificação da análise de Northern i_;_ — ATRIBUTO SDI-1 SDI-2 SDI-3 Y S Y s Y S Quantidade relativa de GADPH 1,0 0,83 1,0 0,87 1,0 0,87 Quantidade relativa de SDI/GADPH 1,0 11,4 1,0 1,0 1,0 1,0

Os resultados indicaram claramente que a expressão de ambos, a β-actina e o GAPDH, era igual em células jovens e senescentes, quando comparadas com base no ARNm, o que é consistente com observações anteriores. Quando a expressão do gene de SDI foi comparada ao nível do ARNm, o ARNm de SDI-1 aumentou 11 vezes nas células senescentes, enquanto que a expressão de SDI-2 e SDI-3 permaneceu constante ao longo do tempo de vida in vitro (Tabela 3). Este resultado sugere que o SDI-1 é um inibidor de síntese de ADN específico de células senescentes, enquanto que o SDI-2 e SDI-3 são muito provavelmente inibidores mais gerais, envolvidos na regulação do ciclo celular.

86 476 ΕΡ Ο 640 143/ΡΤ 31 EXEMPLO 7

ALTERAÇÕES DO TEOR DE ARN POLI A DURANTE A SENESCÊNCIA CELULAR A observação de que os resultados das análises de Northern de ARN total versus ARN poli A+ eram quantitativamente diferentes, indicou que o teor de ARN poli A+ nas preparações de ARN total se pode alterar durante a senescência celular. Para testar esta hipótese, as células foram cultivadas em série e o ARN total foi recolhido a diferentes níveis de duplicação da população. Isolou-se o ARN poli A+ de cada amostra. O resultado indicou claramente que o teor de ARN poli A + decresceu gradualmente durante a senescência celular (Figura 4). Na Figura 4, as células foram cultivadas em série e recolheu-se o ARN total. Fez-se um gráfico do ARN poli A+ : % de ARN total em função da idade da cultura (% do tempo de vida in vitro completado). As células senescentes tinham 3-4 vezes menos ARN poli A +, quando comparadas com células muito jovens. No entanto, quando o teor de ARN total por células era calculado, as células senescentes tinham 1,3-1,5 vezes mais do que as células jovens (veja-se, Cristofalo, V.J. e Kritchevsky, D., Med. Exp. 19:313-320 (1969)).

De modo a determinar se a mensagem de SDI-1 aumentava gradualmente durante a subcultura, ou se ocorria um aumento rápido perto do fim do tempo de vida in vitro, hibridou-se o ARN poli A+ de culturas a diferentes duplicações de população com a sonda de SDI-1 marcada com 32P. Esta análise revelou que a expressão de SDI-1 aumentava, à medida que as culturas se tornavam senescentes, ocorrendo uma maior alteração durante as poucas passagens finais (Tabela 4). A tabela 4 mostra a acumulação de ARNm de SDI-1 durante o processo de envelhecimento celular. Hibridou-se 1 μg de cada ARN poli A+ de células de diferentes duplicações de população com a sonda de SDI-1. A quantidade relativa de ARNm de SDI-1 em cada amostra foi calculada como na tabela 2.

Tabela 4: Quantificação da % de tempo de vida completada ATRIBUTO 24% 37% 46% 66% 78% ! 88% 100% Quantidade relativa de GADPH 1,0 1,6 1,5 1,3 1,4 i 1,3 0,9 Quantidade relativa de SDI/GADPH 1,0 2,2 2,1 4,0 3,5 ; 6,2 20,5

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Também se analisaram as alterações na expressão de SDI-1 durante a quiescência. Células quiescentes, jovens, foram mantidas em meio contendo soro fetal de bovino (FBS) a 0,5%, durante três semanas. O ARN total foi recolhido a cada semana e a quantidade de ARN que híbrida com a sonda de SDI-1 foi analisada. A mensagem de SDI-1 aumentou significativamente durante a quiescência celular (Tabela 5). A tabela 5 mostra a acumulação de ARNm de SDI-1 durante a quiescência celular. Hibridaram-se 4 Lig cada de ARN total obtido a partir de células jovens cultivadas com meio contendo FBS a 0,5% durante 1, 2, 3 semanas, com a sonda de SDI-1. A quantidade relativa de ARNm de SDI-1 foi calculada como para a tabela 2 (C: cultura de controlo com meio com FBS a 10%). Quando o resultado foi normalizado para a expressão de GADPH, verificou-se que a expressão de SDI-1 aumentou 18 vezes após duas semanas em meio com baixo teor de soro, em comparação com uma cultura em divisão de controlo, em meio com FBS a 10%.

Tabela 5: acumulação de ARNm de SDI-1 durante a quiescência celular ATRIBUTO C 1 sem 2 sem 3 sem Quantidade relativa de GADPH 1,0 0,72 0,88 0,37 Quantidade relativa de SDI/GADPH 1,0 12,2 18,4 14,9 O facto de se verificar que a representação celular de ARNm vs ARN total varia durante a senescência celular é significativo. Durante o processo de envelhecimento in vitro. verificou-se que o teor de ARNm decresce gradualmente (Figura 4), apesar do ligeiro aumento do ARN total por célula. Este fenómeno indica que há um declínio gradual das expressões globais de genes durante o processo de envelhecimento celular e explica a menor expressão dos genes de β-actina e GADPH em células senescentes, quando a análise de manchas de Northern foi realizada com ARN total (Tabela 2). No entanto, os níveis de expressão destes genes de manutenção eram quase constantes, quando a análise de manchas de Northern era realizada com ARN poli A+ (Tabela 3). Esta análise revelou a expressão forte da mensagem de SDI-1 em células senescentes e a expressão inalterada dos genes de SDI-2 e 3 ao longo do período de vida in vitro.

/ 86 476 ΕΡ Ο 640 143/ΡΤ 33 EXEMPLO 8 Ο GENE DE SDI-1 Ο gene de SDI-1 codifica para um inibidor da síntese de ADN específico de células senescentes. Ocorreu expressão aumentada deste gene quando as células entraram nas suas poucas divisões finais (Tabela 4). A cinética da expressão correlacionava-se bem com a expressão fenotípica das células senescentes. Também se verificou que a expressão do gene de SDI-1 aumentava depois das células jovens se tornarem quiescentes e não divisíveis, por privação de soro (Tabela 5). Este resultado demonstra o envolvimento deste gene na inibição da síntese de ADN da quiescência celular, bem como da senescência. Verificou-se que as células tornadas quiescentes por privação de factores de crescimento do soro produzem um inibidor da síntese de ADN com características semelhantes às do inibidor de células senescentes (Pereira-Smith, O.M. et al.. Exp. Cell Res. 160:297-306 (1985); Stein, G.H. e Atkins, L., Proc. Natl. Acad. Sei. USA 83:9030-9034 (1986)). O facto de a expressão de SDI-1 aumentar durante, quer a senescência, quer a quiescência, indica que este é um inibidor da síntese de ADN (Smith, J.R., J. Gerontol. 45:B32-35 (1990). Alternativamente, as sequências de SDI-1 podem ser relacionadas com os genes específicos de paragem de crescimento, recentemente clonados a partir de células de ratinho (Schneider, C. et al., Cell 54:787-793 (1988); Manfioletti, G. et al.. Mol. Cell Biol. 10:2924-2930 (1990)). EXEMPLO 9 EXPRESSÃO DO PRODUTO DO GENE DE SDI-1

O ADNc de SDI-1 foi expresso em dois sistemas de expressão bacterianos diferentes, foi transcrito in vitro e traduzido em dois sistemas diferentes in vitro. Utilizaram-se dois sistemas de expressão bacterianos para maximizar a probabilidade de obter quantidades suficientes de proteína SDI-1. No primeiro sistema de expressão, a proteína SDI-1 foi expressa como uma proteína de fusão glutationa-S-transferase com rendimentos de 5-10 ug por litro de cultura bacteriana. Foi possível clivar a proteína recombinante com trombina e purificá-la de modo a obter uma proteína SDI-1, com alguns aminoácidos extra. No segundo sistema de expressão, utilizou-se um sinal de 6 histidinas no 34 34

86 476 ΕΡ Ο 640 143/ΡΤ terminal amino, de modo a auxiliar a purificação. Esta proteína recombinante pode ser utilizada sem posterior modificação. Ambos os sistemas permitiram o isolamento de preparações puras de proteína.

No decurso desta experiência, os sistemas de transcrição e tradução in vitro foram utilizados para confirmar a estrutura de leitura aberta deduzida a partir da sequência de ácido nucleico do ADNc de SDI-1. O peso molecular calculado da proteína SDI-1 é de aproximadamente 16 000 daltons. A proteína sintetizada in vitro migra por SDS-PAGE, com uma mobilidade relativa de aproximadamente 21 000 daltons. Esta pequena diferença pode ser devida a uma carga ou conformação ligeiramente invulgar da proteína SDI-1. Uma sequência parcial de aminoácidos da proteína expressa em bactérias confirmou a estrutura de leitura aberta (SEQ ID NO:2).

As proteínas expressas em bactérias foram utilizadas para produzir antisoros policlonais e anticorpos monoclonais contra a proteína nativa intacta. Estes anticorpos podem ser mais eficazes na imunoprecipitação da proteína SDI-1 e complexos de proteína SDI-1, do que os antisoros produzidos a partir de péptidos sintéticos. Estudos imunocitoquímicos preliminares, utilizando um antisoro de afinidade mais elevada (antisoro #55), que reagiu fortemente com a proteína de fusão numa transferência de Western, a uma diluição de 1:20 000, sugeriram que a proteína SDI-1 era relativamente abundante em células senescentes, em comparação com células jovens em divisão. Em células senescentes, a localização parece ser perinuclear, enquanto que em células jovens parece haver uma pequena quantidade de proteína SDI-1 localizada no núcleo. De modo a obter uma coloração específica, foi necessário pré-absorver o antisoro contra uma monocamada de células fixas, que não expressam níveis detectáveis de ARNm de SDI-1 (TE85). As células foram fixadas com paraformaldeído a 4%, seguido de metanol.

De modo a estudar o fenótipo celular resultante da expressão induzida de ARNm de SDI-1, em células que normalmente expressam o gene a níveis baixos e para examinar o efeito de construções de SDI-1 anti-sentido, é desejável obter linhas celulares em que o gene de SDI-1 esteja integrado de forma estável, sob controlo de um promotor inductível. Para este objectivo, construiu-se um vector funcional contendo SDI-1 sob o controlo do promotor de metalotionina. Após a transfecção desta construção em células jovens competentes para proliferação

35 35

86 476 ΕΡ Ο 640 143/ΡΤ e incubação na presença de cloreto de zinco 100 μΜ e cloreto de cádmio 2 μΜ, a iniciação da síntese de ADN foi inibida em cerca de 50%. Na ausência de metais, não houve inibição da síntese de ADN. A actividade inibitória observada não é devida à toxicidade de metais, uma vez que se verificou que as células transfectadas com o vector de controlo (pcDSRa) e crescidas na presença de metais tinham aproximadamente 90% da capacidade de síntese de ADN, das células transfectadas com o mesmo plasmídeo, crescidas na ausência de metais.

De modo a demonstrar que os efeitos inibitórios observados com SDI-1 não estavam relacionados com a natureza do promotor específico utilizado para dirigir a expressão, analisou-se a capacidade do SDI-1, expresso a partir de outros promotores, para inibir a síntese de ADN. Fez-se portanto a cotransfecção de fibroblastos humanos, jovens, em proliferação, com CMV-p-gal e CMV-SDI-1. A transfecção de células com ΟΜν-β-gal teve pouco efeito na síntese de ADN, enquanto que o CMV-SDI-1 era ainda mais eficaz do que o SDI-1 no vector pcDSRa, nestas experiências particulares. O antigénio T grande de SV40 é capaz de induzir células senescentes a sintetizar ADN. Era, portanto, de interesse, determinar se a acção inibitória de SDI-1 poderia ser ultrapassada pela expressão do antigénio T. Além disso, era desejável determinar que a acção de ADI-1 não era devida à indução de um desequilíbrio metabólico geral nas células. Se fosse este o caso, não seria de esperar que o antigénio T grande antagonizasse este efeito. Por estes motivos, as células foram cotransfectadas com ADNc de SDI-1 e vectores em que o antigénio T era dirigido pelo promotor de CMV. Estas experiências de cotransfecção revelaram que a actividade inibitória do SDI-1 foi grandemente eliminada pela coexpressão do antigénio T grande de SV40.

Realizaram-se testes de transfecção transiente utilizando uma linha celular adicional, de fibroblastos humanos normais (linha celular de prepúcio de recém-nascido (CSC303) e a linha celular imortal WI38, de modo a determinar o carácter geral do efeito inibitório de SDI-1. Em ambos os casos, observou-se uma inibição significativa (40-50%). Além disso, verificou-se que o SDI-1 inibiu o SUSMI (40%) mas não uma linha celular transformada com SV40, GM639, ou células HeLa (< 20%). Os resultados obtidos até agora são consistentes com os resultados anteriores, obtidos a partir de experiências de heterocarião,

em que as células HeLa e as células transformadas com o vírus SV40 não foram inibidas por fusão com células senescentes. Isto proporciona mais evidências de que o SDI-1 se comporta como o inibidor previamente detectado em células senescentes. EXEMPLO 10 ANÁLISES DE SOUTHERN DO GENE DE SDI-1

De modo a determinar se a ausência ou inactividade do SDI-1 era responsável pela imortalidade celular em qualquer de quatro grupos de complementação para uma divisão infinita, analisou-se ARNm e ADN genómico de linhas celulares representativas dos quatro grupos. A análise de Southern revelou as bandas de 5 e 10 kb esperadas, após digestão com Eco RI. Assim, não ocorreram deleções ou rearranjos significativos no gene de SDI-1 nestas linhas celulares. Por análise Northern, determinou-se que o ARNm de SDI-1 era menor, ou estava ausente nas linhas celulares que foram atribuídas aos grupos de complementação B e C. 0 SDI-1 estava presente a níveis mais elevados em linhas celulares representativas dos grupos de complementação A e D. Estes resultados sugerem que parte do mecanismo pelo qual as linhas celulares poderão ter escapado à senescência celular é através da perda de capacidade para expressar níveis suficientes de gene de SDI-1 activo.

Embora o invento tenha sido descrito em relação a concretizações específicas, deve entender-se que o mesmo pode ter outras modificações e que este pedido pretende cobrir quaisquer variações, utilizações ou adaptações do invento, seguindo, em geral, os princípios do invento e incluindo as alterações da presente descrição, que estejam inseridas na prática conhecida, ou usual na arte a que pertence o invento e tal como se podem aplicar às características essenciais acima descritas e incluídas no âmbito das reivindicações em anexo.

86 476 ΕΡ Ο 640 143/ΡΤ 37

LISTAGEM DE SEQUENCIA

(1) INFORMAÇÃO GERAL (i) REQUERENTE: BAYLOR COLLEGE OF MEDICINE. !N!D‘iDOnE3 DA SiNTESE uc mun utMÍVAUUS Ut /;;\ "γιίγι ii r\ r\r\ im\ /γμτγ\. (11/ I · I l_V> V 11« V LM I W.

CÉLULAS SENESCENTES (iii) NUMERO DE SEQUÊNCIAS: 2

(iv) MORADA PARA CORRESPONDÊNCIA

(A) DESTINATÁRIO: WEIL, GOTSHAL & MANGES (B) RUA: 1615 L STREET, N.W.

(C) CIDADE: WASHINGTON (D) ESTADO: D.C.

(E) PAÍS: EUA (F) CÓDIGO POSTAL (ZIP): 20036 (v) FORMA LEGÍVEL EM COMPUTADOR: (A) TIPO DE MEIO: disquete

(B) COMPUTADOR: PC compatível com IBM

(C) SISTEMA OPERATIVO: PC-DOS/MS-DOS (D) SUPORTE LÓGICO: Patentln Release #1.0, versão # 1.25 (vi) DADOS DO PRESENTE PEDIDO: (A) NÚMERO DO PEDIDO: (B) DATA DE APRESENTAÇÃO: (C) CLASSIFICAÇÃO: (vi) DADOS DE PEDIDOS ANTERIORES: (A) NÚMERO DO PEDIDO: US 07/808,523 (B) DATA DE APRESENTAÇÃO: 16-DEZ-1991 (viii) INFORMAÇÃO SOBRE MANDATÁRIO/AGENTE: (A) NOME: AUERBACH, JEFFREY I. (B) NÚMERO DE REGISTO: 32,680

(C) NÚMERO DE REFERÊNCIA/ENTRADA: 225-102-CIP

(ix) INFORMAÇÃO PARA TELECOMUNICAÇÕES (A) TELEFONE (202) 682-7033 (B) TELEFAX: (202) 857-0939 (2) INFORMAÇÃO PARA SEQ ID NO: 1

(Í) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA (A) COMPRIMENTO: 2106 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) TIPO DE CADEIA: simples (D) TOPOLOGIA: linear (ii) TIPO DE MOLÉCULA: ADNc 38 86 476 ΕΡ Ο 640 143/ΡΤ

(iii) HIPOTÉTICO: NÃO

(iv) ANTI-SENTIDO: NÃO (vi) FONTE ORIGINAL: (Aí nRfíAMiÇMO- Home Escisnc

(B) TIPO DE CÉLULA: CÉLULAS HUMANAS SENESCENTES (vii) FONTE IMEDIATA:

(A) BIBLIOTECA: BIBLIOTECA DE ADNc DERIVADA DE CÉLULAS SENESCENTES (B) CLONE: SDI-1 (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO.1: CCTGCCGAAG TCAGTTCCTT GTGGAGCCGG AGCTGGGCGC GGATTCGCCG AGGCACCGAG 60 GCACTCAGAG GAGGCGCCAT GTCAGAACCG GCTGGGGATG TCCGTGAGAA CCCATGCGGC 120 AGCAAGGCCT GCCGCCGCCT CTTCGGCCCA CTGGACAGCG AGCAGCTGAG CCGCGACTGT 180 GATGCGCTAA TGCCCGCCTG CATCCACCAG GCCCCTCAGC GATGGAACTT CGACTTTGTC 240 ACCGAGACAC CACTGGAGGG TGACTTCGCC TGGGAGCGTG TGCGGGGCCT TGGCCTGCCC 300 AACC7CTACC TTCCCACGGG GCCCCGGCGA GGCCGGGATG AGTTGGGAGG AGGCAGGCGG 360 CCTGGCACCT CACCTGCTCT GC7GCAGGGG ACAGCAGAGG AAGACCATGT GGACCTGTCA 420 CTCTCTTCTA CCCTTCTCCC TCSC7CAGGG GAGCAGGCZG AAGGGTCCCC AGGTGGACCT 480 GGAGAC7C7C AGGGTCCAAA ACGGCGGCAG ACCAGCATGA CAGATTTCTA CCAC7CCAAA S40 CGCCGGC7GA TCTTCTCCAA GACCAACCCC 7AATCCGCCC ACAGGAAGCC TGCACTCCTG 600 GAAGCGCGAG GGCCTCAAAG GCCCGCTCTA CATCTTCTGC CTTAGTCTCA GTTTGTGTGT 660 CTTAATTATT ATTTGTGT7T TAATTTAAAC ACCTCCTCAT GTACATACCC TCGCCGCCCC 720 C7GCCCCCCA GCCTCTGGCA TTACAATTAT TTAAACAAAA AC7AGGCGGT TGAATGAGAG 780 GTTCCTAAGA GTCCTCGCCA TTTTTATTTT ATGAAATACT ATTTAAACCC TCCTCATCCC 840 GTGTTCTCCT TTTCCTCTCT CCCCGACGTT GCGTGGGCCG GCTTCATGCC AGC7ACTTCC 900 TCCTCCCCAC TTGTCCGCTG GGTGGTACCC TCTGGAGGGG TCTCCCTCCT TCCCATCCC7 960 GTCACAGGCG GTTATGAAAT TCACCCCCTT TCCTGGACAC TCAGACCTGA ATTCTTTTTC 1020 ATTTGAGAAG TAAACAGATG GCACTTTGAA GGGGCCTCAC CCACTGCGGG CATCATCAAA 1080 AACTTTGCAC TCCCCTCACC TCCTC7AAGG T7GGGGAGGG TGACCCTGAA GTCAGCACAC 1140 CCTAGGGC7G ASCTGGGGAC CTGGTACCCT CCTGGCTCTT GATACCCCCC TCTGTCTTGT 1200 CAAGGCACCC CGAAGGTCCG GTCCTGGAGC AGACCACCCC GCC7GCCC7C ATCGCCCCTC 1260 TGACCTGCAC TCGGGAGCCC GTCTCAGTGT TCACCCTTTT CCCTCTTTGG CTCCCCTGTA 1320 CCTTTTGAGG AGCCCCAGCT ACCCTTCTTC TCCAGCTGCC CTCTGCAATT CCCC7CTCCT 1380 GCXCTCCCTC CCCCTTGtCC TTTCCCTTCA GTACCCTCTC AGCTCCAGGT GGCTCTGAGG 1440 TGCCTGTCCC ACCCCCACCC CCAGCTCAAT GGACTGGAAG GCGAAGGCAC ACACAAGAAG 1500 AAGGGCACCC TAGTTCTACC TCACCCACCT CAACCAGCGA CCCCCCCCTC CTCTAGCTGT 1560

CCCCCTTGAG TGGCCTTATC TCTGTGTTAG CCAGCCACAC ACTGCCCCCT CAAATCGTCC CCAGTTCATT GCACTTTGAT TAGCAGCGGA ACTAGAGGCT ATGGACAGGC CATGCCACCT TTCCTGGCAC TAACGTTGAG CCCCTGGAGG OGGGTCTGAC CCCAAACACC TTCCACCTCC CGGCTCCCCA TGTGTCCTGG TTCCCGTTTC CGCACCACAC CCTGTACTGT TCTCTCTCTT GCAGGTGCTC AATAAACGAT TCTTAGTGAA 1620 1680 1740 1800 1860 1920 1980 2040 2100 2106 86 476 ΕΡ Ο 640 143/ΡΤ 39 GGGGGTGAGG gtcccatgtc gtgccacagc GGCTATATGA TCCGGGAGTA GATCTTTCTA AGCCACCTTC CTCATCCACC CCATCCCTCC ACAAGCACTC AGACATTTTA ACATGCTCCC GGGCTCATAT GCGGCTGGGA GTAGTTGTCT CACTGAAGTG CTTAGTGTAC TTGCAGTATT TGTAACATAC TGGCCTGGAC TGTTTTCTCT TCCACCTAGA CTCTAAACCT CTCGAGGCCA TCACAGCTCC TCCCACAATC CTGATATACA ΛΑΑΑΑΑ (2) INFORMAÇÃO PARA SEQ ID NO: 2

(i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA (A) COMPRIMENTO: 164 aminoácidos (B) TIPO: aminoácido (D) TOPOLOGIA: linear (ii) TIPO DE MOLÉCULA: proteína

(iii) HIPOTÉTICO: NÃO

(iv) ANTI-SENTIDO: NÃO (vi) FONTE ORIGINAL: (A) ORGANISMO: Homo sapiens (B) ESTIRPE: SDI-1 (vii) FONTE IMEDIATA: (A) BIBLIOTECA: Biblioteca de ADNc derivada de células senescentes

40 86 476 ΕΡ Ο 640 143/ΡΤ (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO.2:

Met 1 Ser Glu Pro Ala 5 Gly Aap Vai Arg Cln 10 Asn Pro Cye Gly Ser 15 Lye Ala Cy· Arg Arg 20 Leu Phe Gly Pro Vai 25 Aap Ser Glu Gin Leu 30 ser Arg Aap Cye Aep 35 Ala Leu Met Ala Gly 40 Cya Ile Gin Glu Ala 45 Arg Glu Arg Trp Aon 50 Phe Aap Phe Vai Thr 55 Glu Thr Pro Leu Glu 60 Gly Aap Phe Ala Trp 65 Glu Arg vai Arg Gly 70 Leu Gly Leu Pro Lya 75 Leu Tyr Leu Pro Thr 30 Gly Pro Arg Arg Gly 85 Arg Aap Glu Leu Gly 90 Gly Gly Arg Arg Pro 95 Gly Thr Ser Pro Ala 100 Leu Leu Gin Gly Thr 105 Ala Glu Glu Aap Hia 110 Vai Aap Leu Ser Leu 115 Ser Cye Thr Leu Vai 120 Pro Arg Ser Gly Glu 125 Gin Ala Glu Gly Ser 130 Pro Gly Gly Pro Gly 135 Aep Ser Gin Gly Arg 140 Lya Arg Arg Gin Thr 145 Ser Met Thr Aap Phe 150 Tyr Hia Ser Lya Arg 155 Arg Leu Ile Phe Ser 160

Lya Arg Lya Pro 86 476 ΕΡ Ο 640 143/ΡΤ 41

LISTAGEM DE SEQUÊNCIA

(1) INFORMAÇÃO GERAL (i) REQUERENTE: (A) NOME: Baylor College of Medicine (B) RUA: One Baylor Plaza (C) CIDADE: Houston (D) ESTADO: Texas

(E) PAÍS: EUA (F) CÓDIGO POSTAL (ZIP): 77030 (ii) TÍTULO DO INVENTO: Inibidores da síntese de ADN derivados de células senescentes (iii) NÚMERO DE SEQUÊNCIAS: 2 (iv) FORMA LEGÍVEL EM COMPUTADOR: (A) TIPO DE MEIO: disquete

(B) COMPUTADOR: PC compatível com IBM

(C) SISTEMA OPERATIVO: PC-DOS/MS-DOS (D) SOFTWARE: Patentln Release #1.0, versão # 1.25 (EPO) (v) DADOS DO PRESENTE PEDIDO: (A) NÚMERO DO PEDIDO: EP 93901236.5 (vi) DADOS DE PEDIDOS ANTERIORES: (A) NÚMERO DO PEDIDO: US 07/808,523 (B) DATA DE DEPÓSITO: 16-DEZ-1991 (vi) DADOS DE PEDIDOS ANTERIORES: (A) NÚMERO DO PEDIDO: US 970,462 (B) DATA DE DEPÓSITO: 02-NOV-1 992 (2) INFORMAÇÃO PARA SEQ ID NO: 1

(i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA (A) COMPRIMENTO: 2106 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) TIPO DE CADEIA: simples (D) TOPOLOGIA: linear (ii) TIPO DE MOLÉCULA: ADNc

(iii) HIPOTÉTICO: NÃO

(iv) ANTI-SENTIDO: NÃO (vi) FONTE ORIGINAL: (A) ORGANISMO: Homo sapiens

(B) TIPO DE CÉLULA: CÉLULAS HUMANAS SENESCENTES

86 476 ΕΡ Ο 640 143/ΡΤ 42 (vii) FONTE IMEDIATA:

(A) BIBLIOTECA: BIBLIOTECA DE ADNc DERIVADA DE CÉLULAS SENESCENTES (B) CLONE: SDI-1 (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO.1: CCTGCCGAAC TCAGTTCCTT GTGGAGCCGG AGCTGCGCGC GuATTCGCCC AGCCACCGAG so GCACTCAGAG GAGGCGCCAT GTCAGAACCG GCTGGGGATG TCCGTCAGAA CCCATGCGGC 120 AGCAAGGCCT GCCGCCGCCT CTTCGGCCCA GTGGACAGCG AGCAGCTGAG CCGCGACTGT 180 GATGCGCTAA TGGCGGGCTG CATCCAGGAG GCCCGTGAGC GATGGAACTT CGACTTTGTC 240 ACCGACACAC CACTGGAGCG TGACTTCGCC TGGGAGCGTG TGCGGGGCCT TGG CCTGCCC 300 AAGCTCTACC TTCCCACGGG GCCCCGGCGA GGCCGGGATG AGTTGGGAGG AGGCAGGCGG 360 CCTGGCACCT CACCTGCTCT GCTGCAGGGG ACAGCACAGG AACACCATGT GGACCTGTCA 420 CTGTCTTGTA CCCTTGTGCC TCCCTCAGGG GAGCAGGCTG AAGGGTCCCC AGGTGGACCT 480 GGAGACTCTC AGGGTCGAAA ACGGCGGCAG ACCAGCATGA CAGATTTCTA CCACTCCAAA 540 CCCCCCCTGA TCTTCTCCAA CAGGAACCCC TAATCCGCCC ACACGAAGCC TGCAGTCCTC 600 GAAGCGCGAG GGCCTCAAAG GCCCGCTCTA CATCTTCTGC CTTAGTCTCA GTTTGTGTGT 660 CTTAATTATT ATTTGTGTTT TAATTTAAAC ACCTCCTCAT GTACATACCC TGGCCGCCCC 720 CTGCCCCCCA GCCTCTGGCA TTAGAATTAT TTAAACAAAA AC7ACCCCGT TCAATCACAG 780 GTTCCTAAGA GTGCTGGGCA TTTTTATTTT ATGAAATACT ATTTAAAGCC TCCTCATCCC 840 GTGTTCTCCT TTTCCTC7C? CCCGGAGGTT GGGTGGGCGG GC77CATGCC AGCTACTTCC 900 TCCTCCCCAC TTGTCCGCTG GCTGGTACCC TC7GCAGCGG TGTGGCTCC7 TCCCATCGCT 960 r 86 476ΕΡ Ο 640 143/ΡΤ 43 *

GTCACAGGCG

ATTTGAGAAG

AACTTTGGAG

CCTAGGGCTG

GAAGGCAGGG

TGACCTGCAC

CCTTTTGAGG

GCTGTCCCTC

TGCCTGTCCC

AAGGGCACCC

GGGGGTGAGG

GGGTATATGA

AGCGACCTTC

ACAAGGAGTC

GGGCTCATAT

CACTGAAGTG

TGTAACATAC

TCCACCTAGA

TCACAGCTCC ΑΑΑΑΑΑ

GTTATGAAAT

TAAACAGATG

TCCCCTCACC

AGCTGGGGAC

GGAAGGTGGG

TGGGCAGCCC

AGCCCCAGCT

CCCCTTGTCC

ACCCCCACCC

TAGTTCTACC

GTCCCATGTG

TGGGGGAGTA

CTCATCCACC

ACACATTTTA

GGGGCTGGGA

CTTAGTGTAC

TCCCCTCGAC

CTGTAAACCT

TCCCACAATC

TCACCCCCTT

GCACTTTGAA

TCCTCTAAGG

CTGGTACCCT

GTCCTGGAGC

GTCTCAGTGT

ACCCTTCTTC

TTTCCCTTCA

CCAGCTCAAT

TCAGGCAGCT

GTGGCACAGG

GATCTTTCTA

CCATCCCTCC

AGATGGTGGC

GTAGTTGTCT

TTGGAGTATT

TGTTTTCTCT

CTCGAGGGCA

CTGATATACA

TCCTGGACAC

GGGGCCTCAC

TTCGGCAGGG

CCTGGCTCTT

AGACCACCCC

TGAGCCTTTT

TCCAGCTGGG

GTACCCTCTC

GGACTGGAAG

CAAGCAGC3A

CCCCCTTGAG

GGAGGGAGAC

CCAGTTCATT

AGTAGAGGCT

TTCCTGGCAC

GGGG7CTGAC

CGGCTCCCCA

GGGACCACAC

GCAGCTGCTC

TCAGACCTGA CGAGTGGGGG TGACCCTGAA GATACCCCCC GCCTGCCCTC CCCTCTTTGG CTCTGCAATT AGCTCCAGGT GGGAAGGGAC GCGCCCCCTC 7GGGGTTATC ACTGGCCCCT GCACTTTGAT A7GGACAGGG TAACGTTGAG CCCAAACACC 7GTGTCCTCG GCTGTACTGT AATAAACGAT

ATTCTTTTTC CAXCATCAAA GTGAGCACAG TCTGTCTTGT ATGGCCCCTC CTCCCCTGTA CCCCTCTGCT GCCTCTGAGG ACACAAGAAG CTCTAGCTG7 TCTGTGTTAG CAAATCGTCC TAGCAGCGGA CATGCCACGT CCCCTGGAGG 7TCCAGCTCC TTCCCGTTTC TCTGTGTCTT TCTTAGTGAA 1020 iueu 1140 1200 1260 1320 1380 1440 1500 1560 1620 1680 1740 1800 1860 1920 1980 2040 2100 2106 «4 «4

86 476 ΕΡ Ο 640 143/ΡΤ 44 (2) INFORMAÇÃO PARA SEQ ID NO: 2

(i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA (A) COMPRIMENTO: 164 aminoácidos (5) TiFG; aiimiuáuiuu (D) TOPOLOGIA: linear (ii) TIPO DE MOLÉCULA: proteína

(iii) HIPOTÉTICO: NÃO

(iv) ANTI-SENTIDO: NÃO (vi) FONTE ORIGINAL: (A) ORGANISMO: Homo sapiens (B) ESTIRPE: SDI-1 (vii) FONTE IMEDIATA: (A) BIBLIOTECA: Biblioteca de ADNc derivada de células senescentes (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO.2:

Met Ser Glu Pro Ala Gly Asp Vai Arç Gin Asπ ?ro Cys Giy Ser Lys 1 S 10 15

Ala Cya Arg Arg Leu Phe Gly Pro Vai Asp Ser Glu Gin Leu Ser Arg 20 15 30

Asp Cys Asp Ala Leu Her Ala Gly Cys lie Gin Glu Ala Arg Glu Arg 35 40 45

Trp Asn Phe Asp Phe Vai Thr Glu Thr Pro Leu Glu Gly Asp Phe Ala 50 55 60

Trp Glu Arg Vai Arg Gly Leu Gly Leu ?ro Lys Leu Tyr Leu Pro Thr 65 70 75 80

Gly Pro Arg Arg Gly Arg Asp Glu Leu Gly Gly Gly Arg Arg Pro Gly 85 ?0 95

Thr Ser Pro Ala Leu Leu Gin Gly Thr Ala Glu Glu Asp His Vai Asp 105 110 100 45

A

86 476EP 0 640 143/PT

Leu Ser Leu Ser Cys Thr Leu Vai Pro Arg Ser Gly Glu Gin Ala Glu 115 120 125 Gly ser Pro Gly Gly Pro Gly Asp Ser Gin Gly Arq Lys Arg Arg Gin 130 135 140 Thr Ser Met Thr Asp Phe Tyr His Ser Lya Xrç Arg Leu tle Phe Ser 145 ISO ;ss 160

Lya Arg Lys Pro

Lisboa, ÍL JUN. 2001

Por BAYLOR COLLEGE OF MEDICINE - O AGENTE OFICIAL -

Eng.° ANTÓNIO JOÁO DA CUNHA FERREIRA Ag. 0(. Pr. Ind·Rua das Flores, 74.4,° 1200-195 LISBOA

Claims

11. Molécula de ácido nucleico que codifica para uma proteína capaz de inibir a síntese de ADN numa célula receptora, em que a referida proteína é SDI-1 mm a <5flnijsn/;ja rjo aminoácidcc SEQ 'D Mo. 2.

2. Molécula de ácido nucleico de acordo com a reivindicação 1, em que a referida molécula tem a sequência SEQ ID No.1 ou a sua região que codifica para SDl-1.

3. Molécula de ácido nucleico de acordo com a reivindicação 1 ou a reivindicação 2, em que a referida molécula é ADN e está incorporada num plasmídeo de ADN.

4. Molécula de ácido nucleico de acordo com a reivindicação 3, em que o referido plasmídeo é pcDSRaA, apresentado na figura 1, em que B representa um local BamH1.

5. Molécula de ácido nucleico de acordo com a reivindicação 1, em que a referida molécula é ARN.

6. Molécula de ácido nucleico com uma sequência complementar à molécula de ARN de acordo com a reivindicação 5 e de cerca de 10 a 30 nucleótidos de comprimento, suficiente para permitir que as referidas moléculas hibridem umas com as outras, sob condições fisiológicas.

7. Molécula de ácido nucleico de acordo com a reivindicação 6, que é uma molécula de ARN.

8. Molécula de ácido nucleico de acordo com a reivindicação 6 que é uma molécula de ADN.

9. Método para inibir a síntese de ADN numa célula humana em cultura in vitro, método que compreende proporcionar à referida célula uma quantidade eficaz de uma molécula de ácido nucleico de acordo com a reivindicação 1.

86 476 ΕΡ Ο 640 143/ΡΤ

o adjunto

Eng.° ANTÓNIO JOÃO DA CUNHA FERREIRA Ag. Of. Pr. Ind. Rua das Flores, 74-4.® 1200-195 LISBOA

2/2

10. Molécula de ácido nucleico de acordo com a reivindicação 1, para utilização no tratamento de cancro.

11. Molécula de ácido nucleico de acordo com a reivindicação 6, para utilização no tratamento do envelhecimento, feridas e tecidn queimado.

12. Molécula de ácido nucleico para utilização de acordo com a reivindicação 11, em que o referido tecido é tecido de pele.

13. Composição farmacêutica compreendendo uma molécula de ácido nucleico de acordo com a reivindicação 1 ou a reivindicação 6.

14. Proteína capaz de inibir a síntese de ADN numa célula receptora, tendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID No. 2.

15. Utilização de uma proteína de acordo com a reivindicação 14, no fabrico de um medicamento para a inibição da síntese de ADN numa célula receptora. 6. Molécula de ácido nucleico de acordo com a reivindicação 1 ou 2, em que a molécula é incorporada num vector de expressão de mamífero.

17. Molécula de ácido nucleico de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 4, ou 16, para utilização no tratamento de doenças ou condições em que a proliferação celular rápida é indesejável. Lisboa, tl JLt 2001 Por BAYLOR COLLEGE OF MEDICINE - O AGENTE OFICIAL -