JPH07502651A - 老化細胞由来ｄｎａ合成阻害因子 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 老化細胞由来ＤＮＡ合成阻害因子 発明の分野 本発明は、組換Ｄ　Ｎ　Ａ技術の分野のものである。本発明は、細胞の能力を老 化させる遺伝子配列およびタンパク質に関する。本発明は、政府基金により援助 されたものである。該政府は本発明について一定の権利を有する。

本出願は、本明細書に引用して組み込まれた米国特許出願０７／８０８．５２３ 号（１９９１年１２月１６日に出願）の一部を継続するものである。

発明の背景 正常なヒト二倍体細胞は、有用の増殖成長能力を有している（ヘイフリック。

■７等、イクスペリメンタル・セル・リサーチ、２５巻、５８５頁（１９６１年 ）、ヘイフリック、し、イクスペリメンタル・セル・リサーチ、３７巻、６１４ 頁（１９６５年））。実際に、イン・ビトロでの制御条件下では、培養ヒト細胞 は最大限に増殖しても約８０累積集団倍加（ｃｕｍｕｌａｔｉｖｅ　ｐｏｐｕｌ ａｔｉｏｎ　ｄｏｕｂｌｉｎｇｓ）まてである。そのような細胞の増殖能力は、 細胞が杆験する累積東団倍加数の関数であることが見い出さ第１た（ヘイフリッ ク、１．。等、イクスペリメンタル・セル・リサーチ、２５巻、５８５頁（１９ ６１年）、ヘイフリック、Ｌ等、イクスペリメンタル・セル・リサーチ、３７巻 、６１４頁（１９８５年））。この能力は、また細胞提供者のイン・ビボ年齢に 反比例している（マーチン、Ｇ、Ｍ等、ラボラトリ−・インベスティゲーンヨン 、２３巻、８６頁（１９７９年）、ゴールドツユタイン、Ｓ等、プロノーディン グ・オフ・ナショナル・アカデミ−・才ブ・ジイエンンイズ（ｔＪ、ｓ、Ａ、） 、６４巻、１５５頁（１９６９年）：ンユナイダー、Ｅ、Ｌ、プロノーディング ・オフ・ナショナル・アカデミ−・オフ・サイエンノイズ（ｔＪ、　Ｓ、　Ａ、 ）　、７３巻、３５８４頁（１９７６年）、レギルテイ、）′等、ケレオントロ ジア、１９巻、３０３頁（１９７３年））。

増殖成長に対するその能力を山猫した細胞は、“老化”してしまったと言われる 。イン・ヒドロての細胞老化は、形態学的変化により示され、かつ外来成長因子 に対する細胞の応答機能減退をけう。従って、細胞老化は、細胞の増殖能力の喪 失を表すものである。イン・ビトロでの細胞老化現象を説明するため、様々な理 論が提案されているが、実験的証拠は、増殖能力の年齢依存性喪失が遺伝子プロ グラムの機能であろうことを修唆している（オーゲル　、１．、Ｉζ、プロノー ディング・オフ・ナショナル・アカデミ−・オフ・サイエンノイズ（Ｌｌ、　Ｓ 、　Ａ、　）、４９巻、５１７頁（１９６３年）、デ・マース、Ｒ等、ヒユーマ ン・フェネティフクス、１６巻、８７頁（１９７２年）１Ｍ　ブンクワルド、ミ ューテーンヨン・リサーチ、・１７１巻、４０１百（１９７７年）、マーチン、 　Ｇ、Ｍ等、アメリカン・ツヤ−ナル・オフ・パソロンー、７４巻、１３７頁（ １９７４年）、スミス、ＪＲ等、１ｌｃｃｈ、　Ａｇｅ、　Ｉ）ｅｖ、１３巻、 ３８７頁（１９８０年）、カークウ’７ト、ＴＢ、Ｌ等、セオリティカル・ノ＼ イオロノー、５３巻、４８１頁（１９７５年））。

イン・ヒドロにおけるヒト繊維芽細胞ての細胞融合研究は、細胞老化の静止状要 撃が、増殖状要撃よりも優勢であることを示している（ペレイラースミス、ＯＭ 等、゛ツマティ・ｌり・セル・フェネティフクス、８巻、７３１頁（１９８２年 ）、ノルウッド、Ｔ、Ｉ＋等、プロノーディング・オフ・ナンヨ→−ル・アカデ ミ−・オフ・サイエンノイズ（じＳ、Ａ、）、７１巻、２２３頁（１９７４年） 、ステイノ、　Ｇ、ｌ＋刃、イクスペリメンタル・セル・リサーチ、１３０巻、 １５５頁（１９７９年））。

老化現象に対する洞察が、老化細胞および若い（即ち、非老化）細胞を融合して 、ヘテロ／カリオン（ｈｅｔｃｒｏｄｉｋａｒｙｏｎｓ）を形成する研究から得 られている。

ヘテロ／カリオンの゛若い”核で老化を引き起こすためには（ＤＮＡ合成の阻害 により判定するとき）、融合する前に、老化細胞てタンノ；り質合成が起こらな （すればならない（バーマー、ＧＣ等、ツヤ−ナル・オフ・セル・／ヅオロノー 、９１巻、１８７頁（１９８２年）、トレノチャーーリンカーン、ＣＫ等、イク スペリメンタル・セル・リサーチ、１７１４巻、１５５頁（１９８３年）、／＼ −マー、Ｇ、Ｃ等、イクスペリメンタル・セル・リサーチ、１４５巻、７０８頁 （１９８３年）、トレ、チャー−１じカーノ、Ｃ，に等、イクスペリメンタル・ セル−リサーチ、１５３巻、２０８頁（１９８４年））。

同様に、老化繊維芽細胞ｍＲＮＡの若い繊維芽細胞へのマイクロイ／ジェクンヨ ンが、若い細胞のＤＮＡ合成能力（ランプキン、Ｃ，に、等、サイエンス、２３ ２巻、３９３頁（１９８６年））と細胞の細胞周期のＳ（静止）期に入る能力の いずれをも阻害することが見い１１１されている（ランプキン、ＣＫ等、イクス ペリメンタル・セル・リサーチ、１６０在、５４４’Ｎ（１９８５年））。研究 者らは、イン・ビ）・口て老化！ｌＩ胞内て増殖されるユニークなｍＲＮ八を同 定した（ウェスト、Ｍ、Ｄ等、イクスペリメンタル・セル・リサーチ、１８４巻 、１３８頁（１９８９年）、ンヨルダハＴ等、イクスペリメンタル・セル・リサ ーチ、１８５巻、３９９頁（１９８９４Ｆ、））。

ヒト二倍体内皮細胞は、これらの細胞がイン・ヒドロて細胞老化を真似すること から、細胞老化研究の代替細胞をを与えるものである（マンアーク、Ｔ等、／ヤ ーナル・オフ・セル・ハイオフノー、９１巻、４２０頁（１９８１年）、ゴート ノ、ＰＢ等、イン・ヒドロ、１９巻、６６１頁（１９８３年）、ジョンソン、Ａ 等、Ｍｅｃｈ　Ａｇｅ、　Ｄｅｖ、１８巻、１頁（１９８２年）；ラーン１−ン 、Ｓ、Ｃ。

等、サイエンス、２２２巻、６２３頁（１９８３年）、ヴアン・ヒンスベルグ。

＼′ＷＭ等、ヨーロピアン・ジャーナル・オフ・セル・バイオロジー、４２巻、 １０１頁（１９８Ｇｔｒ）　、ニコルス、ＷＷ等、ジャーナル・オフ・セル・フ イノオロノー、１３２巻、４５３頁（１９８７年））。

加えて、ヒト内皮細胞は、様々な機能的かつ可逆の表現型を発現する能力がある 。内皮細胞は、幾つかの静止型および非末端分化型を示す（フォークマン、Ｊ等 、ネイチャー、２８８巻、５５１頁（１９８０年）、マンアーク、Ｔ等、ジャー ナル・オフ・セル・ハイオロ／−１９・１巻、５１１百（１９８２年）、マトリ Ｊ　、へ等、ツヤ−ナル・オフ・セル・ノ１イオロシー、９７巻、１５３頁（１ ９８３年）　モンテサ人Ｒ１ツヤーナル・オフ・セル・ノ１イオロンー、９９巻 、１７０６頁（１９８４年）、モ／テ廿ノ、Ｒ等、／ヤーナル・オフ・セル・フ イ７オロノー１３４巻１，４６０頁（１９８８年））。

イア・ヒドロにおけるヒト細胞分化の紅路は、イン・ヒドロての成長因子誘導内 皮細胞増殖を阻害するサイトカイン類により媒介される細胞静止状態の誘導に関 与することが示唆されている（２１４１Ｍ等、サイエンス、２２８巻、８８２頁 （１９８５年）、マトリ、Ｊ、Δ等、イン・ビトロ、２３巻、３８７頁（１９８ ７年）；クボタ、Ｙ等、ジャーナル・オン・セル・バイオロジー、１０７巻、１ ５８９頁（１９８８年）、インタ−フェロン等、ジャーナル・オン・セル・バイ オロジー、１０７巻、３１７頁（１９８９年））。

内皮細胞増殖の阻害因子（１ｎｈｉｂｊ　ｔｏｒｓ）は、イン・ビトロでの内皮 細胞分化中に引き起こされるご（初期の転写事象の調節因子としても機能してお り、キャピラリ一様、管状内皮細胞表現型の形成に関連する（マンアーク、Ｔ等 、インプルーブメント・アンド・アドバンス・オン・オンフロジー、デ・ピーク 、Ｖ、Ｔ、等、出版、Ｊ、Ｂ　リノビンコット　フィラデルフィア、１１２頁（ １９９０年）：ゴールドゲイバー、Ｄ　等、ブロン−ディング・オン・ナショナ ル・アカデミ−・オン・サイエンノイズ（Ｕ、Ｓ、Ａ、）　８６巻、７６０６頁 （１９９０年）：ヘラ。

Ｔ、等、バイオケミカル・アンド・バイオフィジカル・リサーチ・コミュニケー ションズ、１６７巻、６３７頁（１９９０年））。細胞増殖の阻害因子とは以下 のものを含む １　インターロイキン−１ａ（ＩＬ−１ａ）（モンテサハ　Ｒｏ等、ツヤ−ナル ・オン・セル・バイオロジー、９９巻、１７０６頁（１９８４年）、モンテサ人 　Ｒ等、ジャーナル・オン・セル・フイジオフジー、１２２巻、４２４頁（１９ ８５年）、マンアーク、Ｔ等、サイエンス、２４９巻、１５７０−１５７４頁（ １９９０年））。

２、腫瘍壊死因子（フレイター−ツユローダ−１Ｍ等、ブロン−ディング・オン ・ナショナル・アカデミ−・オン・サイエンノイズ（Ｕ、Ｓ、Ａ、）　、８４巻 、５２７７頁（１９８７年）、サトー、Ｎ等、ジャーナル・オン・す／ヨナル・ キャンサー・インステイテユート、７６巻、１１１３頁（１９８６年）、ブハー 　ＪＰｏ、アメリカン・ジャーナル・オン・ノ々ソロノー、１３３巻、４２６頁 （１９８８年）；ノマダ、Ｙ９等、ジャーナル・オン・セル・フィノオフノー、 １４２巻、３１頁（１９９０年））；３　トランスホーミング増殖因子β（ｔｒ ａｎｓｆｏｒｍｉｎｇ　ｇｒｏｗｔｈ　ｆａｃｔｏｒ−β）（ベィルド、Ａ等、 バイオケミカル・アンド・バイオフィジカル・リサーチ・コミュニケーションズ 、１３８巻、４７６頁（１９８６年）；ムリュー、Ｇ。

等、ブロン−ディング・オン・ナショナル・アカデミ−・オン・サイエンノイズ （Ｕ、Ｓ、Ａ、）、８４巻、５６００頁（１９８７年）、マイ９．　Ｊ、Ａ、等 、ジャーナル・オン・セル・バイオロジー、１０６巻、１３７５頁（１９８８年 ））： ４　ガンマ−インターフェロン（フリーセル、１り１等、ジャーナル・オン・セ ル・バイオロジー、１０４巻、６８９頁（１９８７年）：ツルオシ。Ｎ１等、バ イオケミカル・アンド・バイオフィンカル・リサーチ・コミュニケーションズ、 １５５巻、４２９頁（１９８８年））および５、腫瘍プロモーター、ホルボール ミリスチリン酸（ＰＭＡ）（モンテサノ。

Ｒ等、セル、４２巻、４６９頁（１９８５年）、ドクトロウ、Ｓ、Ｒ，等、ジャ ーナル・オン・セル・バイオロジー、１０４巻、６７９頁（１９８７年）、モン テサ人　Ｒ等、ジャーナル・オン・セル・フィノオフジー、１３０巻、２８４頁 （１９８７年）、ホシ、■３等、ＦＡＳＡＢジャーナル、２巻、２７９７頁（１ ９８８年））。

老化を逆行させ、カリ細胞の増殖能力を回復することへの期待は、多くの分野の 努力活動にかかわっている。老齢疾患の多くは、この能力の喪失に関わっている 。加速された加齢を特徴とする悲惨な疾患、早老症（ｐｒｏｇｅｒｉａ）もまた 、細胞の増殖能力の喪失に関連するものである。この能力の回復は、この疾患の 、他の年齢関連疾患の、さらに加齢自身の治療に、広い範囲にわたるかかわりを 持つものである。

加えて、培養細胞の増殖能力の回復は、医薬および製薬工業において利用される 。非形質転換細胞を不滅化する能力を用いれば、ある種の組織、さらには細胞生 産物を無限に供給することも出来る。

従って、細胞老化の重要性は、数年来、高く評価されてきた（スミス、Ｊ、Ｒ， 、セルラー・エイジング、モノグラニス・イン・デベロップメンタル・バイオロ ジー：ソイアー、Ｈ，Ｗ、　（出版）、Ｓ、カーガー、ニュー・ヨーク、Ｎ、　 Ｙ、、１７巻、１９３−２０８頁（１９８４年）ニスミス、Ｊ　Ｒ等、イクスペ リメンタル・ブロントロノー、２４巻、３７７−３８１頁（１９８９年）、本明 細書に参照して組み込んである）。研究者らは、細胞老化に関連した遺伝子をク ローン化することを試みている。ＤＮＡ合成阻害因子（ａｎ　１ｎｈｉｂｉｔｏ ｒ　ｎｆ　１）ＮＡ　５ｙｎｔｈｅｓｉｓ）の存在と細胞老化現象の間の相関関 係が認識されている（スピアリング、Ａ、１．笠、イクスペリメンタル・セル・ リサーチ、１７９巻、１５９−１６７頁（１９８８年）、ペレイラースミス、Ｏ Ｊ１等、イクスペリメンタル・セル・リサーチ、１６０巻、２９７−３０６頁（ １９８５年）：ドレツチャーーリンカーン、Ｃ，Ｋ。

等、イクスペリメンタル・セル・リサーチ、１５３巻、２０８−２１７頁（１９ ８４年）、トレソチャーーリンカーン、ＣＫ等、イクスペリメンタル・セル・リ サーチ、１４４巻、４５５−４６２頁（１９８３年））。更に、ある種の老化関 連ＲＮＡ分子の相対Ｊｌ　（ｒｅｌａｔｉｖｅ　ａｂｕｎｄａｎｃｅ）が同定さ れている（ランプキン。

Ｃ，に等、サイエンス、２３２巻、３９３−３９５頁（１９８６年））。

幾つかの研究室では、“サブトラクレヨンーデイファレンンヤル（ｓｕｂｔｒａ ｃｔｉ。

ｎ−ｄｉ［ｃｒｃｎｔｉａり”スクリーニング法を用いて、老化細胞中で優先的 に存在するＲ　Ｎ　Ａ種に由来するｃＤＮＡ分子を同定している（クラインセ・ ンク、Ｉ）、Ａ、、エイノ、１２巻、５５−６０頁（１９８９年）、ノヨルダノ 、Ｔ３等、イクスペリメンタル・セル・リサーチ、１８５巻、３９９−４０６頁 （１９８９年）；ンエラ　Ｆ等、モレキュラー・アント・セルラー・バイオロジ ー、９巻、５６１０−５６１６頁（１９８９年）、ペレイラースミス、　Ｏ，Ｍ 、等、ジャーナル・オン・セル・バイオケミストリー、（付録０（１２部Ａ）） 、１９３頁（１９８８年）、クライノセック、Ｄ、Ａ、スミス、Ｊ、Ｒ，、エイ ノ、１０巻、１２５頁（１９８７年））。

”サブトラクションーデイフ７レンソヤル（ｓｕｂｔｒａｃｔｉｏｎ−ｄｉｆｆ ｅｒｅｎｔｉａｌ）　”７．クリー二〉りと名付けられた１つの方法ては、ｃＤ ＮＡ分子のプールを老化細胞から作成し、次いて、成長細胞のｃＤＮＡまたはＲ ＮＡとノーイブリダイズして、これらの成長細胞に存在する核酸分子に相補的な ｃＤＮＡ分子を“控除（ｓｕｂｔｒａｃｔｏｕｔどする。゛サブトラクンヨンー デイファレンンヤル”法は、ある目的のＩこめには有用であるけれども、老化関 連ｃＤＮＡ分子が、老化の原因に関わっているのか、それとも老化の結果として 生成したものかを確定できないという難点がある。実際に、この方法で同定され た配列の多くは、細胞外マトリクスのタンパク質をコートすることが見い出され ている。そのようなタンパク質の発現における変化が、老化を引き起こすのでは ないようである。

発明の要約 本発明は、ある部分では、正常ヒト細胞がイン・ビトロで有限の複製能力を示し 、ある回数分裂した後、老化に至るという観察に関係する。細胞が老化すると、 それらは、細胞の大きさの肥大、細胞外マトリクス成分の変化、有糸分裂促進物 質刺激に対する不応答、および成長調節遺伝子発現の機能減退のようないくつか の形態学的および生化学的変化を示す。

本発明は、老化細胞中に生成するＤＮＡ合成阻害因子を同定するものである。

この阻害因子は、老化表現型の発現において重要な役割を果たす。阻害因子をコ ードする遺伝子は、老化綿１１ｆｆｃＤＮＡライブラリーを哺乳類発現ベクター に組み込むことにより同定した。次いで、該ｃＤＮＡライブラリーを若い、サイ クリンク細胞（ｃｙｃｌｉｎｇ　ｃｅｌ＋）内にトランスフェクションし、ＤＮ Ａ合成の開始を抑制するこれらのライブラリーの構成メンバーを同定した。

効率的ＤＥＡＥデキストラン媒介トランスフェクションにより、３種の別々のｃ ＤＮＡクローンにおいて、老化細胞由来の阻害因子（ＳＤＩ）配列と推定される ものの分離が出来た。１種（Ｓｌｌ−１）の発現は細胞老化にして２０倍増加し たのに対し、他のもの（ＳＤＩ−２と５ＤＩ−３）は一定を保った。

要するに、本発明は、機能的なアソセー（ａｓｓａｙ）を用いて、ＤＮＡ合成阻 害因子のクローニングを達成するものである。この方法を応用して組織特異的分 化および腫瘍抑制遺伝子のような、細胞周期の負の調節に関連する他の遺伝子を クローン化することも出来る。この方法を用いて、３種の阻害因子配列がクロー ン化されている。これらの配列の１つ（ＳＤＩ−１）は、細胞老化と密接に関係 しているよってある。

詳細には、本発明は、受容細胞におけるＤＮＡ合成を阻害する能力を持つタンバ ク質をコードする核酸分子を提供するものである。

本発明は、特に、核酸分子がＤＮＡであって、そしてＤＮＡプラスミド（ｐｃＤ ＳＲα△など）に組み込まれるものである、実施態様に関係している。

本発明は、上述の核酸分子が５ＤＩｉであり、それが図５く配列番号１〉で示さ れた配列を有するものである、実施態様にも関係している。

本発明は、核酸分子がＲＮＡである実施態様も包含している。

本発明は、当該ＲＮ　Ａ分子に相補的な配列、および生理学的条件下で該分子を もう一方とハイブリダイズさせるに十分な長さを有する核酸分子（ＤＮＡまたは ＲＮＡのいずれか）にも関係する。

本発明は、また、当該細胞に、受容細胞（および特に腫瘍細胞またはイン・ビト ロ培養ての細胞）におけるＤＮＡ合成を阻害する能力を持つタンパク質をコード する上述の核酸分子の有効量を与えることを含んで成る、ヒト細胞におけるＤＮ Ａ合成を阻害する方法を与えるものである。

本発明は、当該細胞に、受容細胞におけるＤＮＡ合成を阻害する能力を持つタン パク質をコードするＲＮＡ分子に相補的な配列を持ち、かつ生理学的条件下でも う一方とハイブリダイズさせるに十分な長さを持つ核酸分子（ＤＮＡまたはＲＮ Ａのいずれか）の有効量を与えることを含んで成る、静止または老化ヒト細胞に おけるＤＮＡ合成の阻害を抑制する方法を提供するものでもある。特に意図され るのは、細胞が皮膚細胞または損傷または火傷組織に存在する細胞である場合の 実施態様である。本発明は、更にリンパ球、管組織（動脈、小動脈、毛細管、静 脈など）、肝臓、腎臓、心臓および池の筋肉、骨、胛臓などの皮膚以外の組織に おける本発明の薬剤の使用を２図するものである。

図面の簡単な説明 図１は、ｃＤＮＡクローニンクおよび発現ヘクター、ｐｃＤＳＲα△（ＢはＢａ ｍＨ１部位を表す）の構造を示す。

図２は、若い細胞のＤＮＡ合成に対して阻害性のｃｌ）ＮＡクローンを同定する ものである。３本の異なる棒は、独立したトランスフエクンヨン実験を表してお り、＊は、実施されなかったことを示し、負の数は、対照より高い榎識指数を示 す。

図３は、アンチセンスＳＤＩ　ｃＤＮＡトランスフエクノヨンを示す。アンチセ ンスｃＤＮＡ発現プラスミドを作り、若い細胞中にｐＣＭＶβと同時トランスフ ェク、ヨンした。レーン１　対照ｐｃＤｓＲａ△、レーン２・ｐｃＤＳＲα△− ３ＤＩ−１、レーン３°ｐｃＤｓＲα△アンチ５ＤＩ−１、レーン４：ｐｃＤＳ Ｒ（Ｚ△−３ＤＩ−２、レーン５：ｐｃＤＳＲα△−アンチ５ＤＩ−２゜図１は 、細胞加齢中の１１８ＲＮΔからのポリΔ＋ＲＮΔ回収における変化を示す。

図５は、５ｌ）ｌ−１ｃｌ）ＮΔのヌクレオチド配列とアミノ酸配列を与える。

発明の詳細な説明 ■　細胞老化 培養における、ヒト正常二倍体繊維芽細胞の複製的老化は、充分に確立され、か つ広く受け入れられている細胞加齢モデルである（ヘイフリック、Ｌｌ等、イク スペリメンタル・セル・リサーチ、３７巻、６１１−６３６頁（１９６５年）、 ノルウッド、Ｔ、Ｈ，、およびスミス、Ｊ、Ｒ，、ハンドブック・オフ・ザ・バ イオロジー・オフ・エイノング（第２版）Ｃ，ＥフィノチおよびＥ、Ｌ　ノユナ イダー、パン・ノストラノド出版、ニューヨーク、２９０−３　］　１１頁１９ ８５年）、ゴールドツユタイン、Ｓ、サイエンス、２４９巻　１１２９−１１３ ３頁（１９９０年））。有限回数の集団倍加（ｐｏｐｕｌａｔｉｏｎ　ｄｏｕｂ ｌｉｎｇｓ）　ｉ＆、細胞が老化すると、それらは分裂したり太き（て平らな影 響を表したりする能力を失う。この現象の根底にある原因となるメカニズムは、 生化学レベルおよび分子レベルで老化細胞を特徴付ける多くの観察にも拘わらず 、まだ理解されていない。

１次元および２次元タンパク質ゲル分析により、老化細胞に特異的なマーカータ ンパク質はほとんど無いことが明らかにされている（リンカーン、Ｄ、Ｗ等、イ クスペリメンタル・セル・リサーチ、１５４巻、１３６−１４６頁（１９８４年 ）、ランプ　Ｅ等、／ヤーナル・オフ・セル・バイオロジー、１００巻、５４５ −５５１頁（１９８５年）、スコツティー、Ｊ等、ジャーナル・オフ・セル・フ ィ／オフ／−１１３１巻、２１（１２１７頁（１９８７年）、ペイロイテール、 に等、プロノーディング・オフ・ナショナル・アカデミ−・オフ・サイエンノイ ズ・ＵＳＡ、８５巻、５１１２−５１１６頁（１９８８年））。老化細胞を特定 する抗原性決定因子が、原形質膜上に見つ（）られた（ポーター、ＭＢ等、ジャ ーナル・オフ・セル・フィンオフ／−１１４２巻、４２５−４３３頁（］９９９ ０年）、、フィブロネクチンおよびコラゲナーゼなどの細胞外マトリクスの成分 が、老化細胞の中で過剰に発現されることが見い出された（ウェスト、Ｍ、Ｉ） 等、イクスペリメンタル・セル・リサーチ、１８４巻、１３８−１４７頁（１９ ８９年）、クマサキ、Ｔ１等、イクスペリメンタル・セル・リサーチ、１９５巻 、１３−１９頁（１９９１年））。しかしながら、これらの観察と細胞老化との 関連性は明らかでは無い。

最近、幾つかの成長調節遺伝子の発現における変化が明らかにされた。ｃ−ｆｏ ｓｃｄｃ　２、サイクリンＡおよびＢの発現が老化細胞では減少することが見い 出された（セサトリ、Ｔおよびカンピノ、Ｊ　１サイエンス、２４７巻、２０５ −２０９頁（１９９０年））。同様に、老化細胞は、網膜芽腫タンパク質をリン 酸化する能力がないことを明示している（スティン、Ｇ、ｌ＋等、サイエンス、 ２４９巻、６６６−６６９頁（１９９０年））。これらの観察は、これらが全て 成長促進遺伝子発現の低下変化であることから、当該細胞が８期に入る能力の無 いことを強力に説明し得ると思われるが、しかしながら、これらが老化の原因で あるのか、結宅であるのかは明らかではない。

老化を引き起こす役割を持つと思われる遺伝子発現におけるもう］つの付加的な 変化は、若い繊維芽細胞てはなく、老化繊維芽細胞により生成されたＤＮＡ合成 の阻害因子（群）である（スピアリング、Ａ、Ｉ　等、イクスペリメンタル・セ ル・リサーチ、１９５巻、５４］−５４５頁（１９９１年）参＠）。阻害因子（ 群）が存在する証拠は、最初、ヘテロカリオン実験から得られ、その中で老化細 胞は、ヘテロカリオ／の中の若い核内てＤ　Ｎ　Ａ合成の開始を阻害した（ノル ウッド　ＴＨ等、プロノーディング・オフ・ナショナル・アカデミイー・オフ・ サイエン／イス・ＬＩＳＡ、７１巻、２２３１２２３４頁（１９７４年）、ペレ イラースミス、０〜４、およびスミス　Ｊ　Ｒ１ツマティック・セル・ノエ不テ ィンクス、８巻、７３１−−７４２頁（１９８２年））。老化細胞質体と若い細 胞全体を含むサイブリット（ｃｙｂｒｉｄｓ）の研究は、老化細胞中の、表面膜 結合タンパク質のＩ）　Ｎ　Ａ合成阻害因子の存在に対して、更なる支持を与え るものであった（ドレッノヤーーリンカーン、Ｃ，に、、およびスミス、Ｊ、Ｒ ，、イクスペリメンタル・セル・リサーチ、１５３巻、２０８−２１７頁（１９ ８’１年））。このことは、老化細胞由来の表面膜含希が豊富な調製物、または その膜から抽出したタンパク質を若い細胞の培養培地に加えたとき、ＤＮＡ６ｒ ｉ＋ｉを阻害することが見い出されることで直接説明された（ペリラ−スミス、 ｏＭ。等、イクスペリメンタル・セル・リサーチ、１６０巻、２９７−３０６頁 （１９８５年）ニスティン、Ｇ、Ｈｌおよびアドキンス、し、プロノーディング ・オフ・ナショナル・アカデミ−・オフ・サイエン／イス・ＵＳＡ、８３を、９ ０３０−９０３４頁（１９８（３年））。コノ阻害因子の生化学的方法による精 製は、現在までのところ、成功していない。しかシナカラ、マイクロインノエク ノヨン実験では、ＤＮＡ合成阻害性メンセンジャーＲＮＡが非常に多く存在する ことが示さねている（ランプキン、ｃＫ等、サイエンス、２３２巻、３９３−３ ９５頁（１９８６年））。

ＤＮＡ１成阻害囚了（ｆ！Ｔ）をコードする遺伝子（群）のクローン化を試みる ために、機能的スクリーニング法（ａ　ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ　ｓｃｒｅｅｎｉ ｎｇ　ｐｒｃｘ：ｃｄｕｒｃ）が用いられた。

この方法により、若いサイクリング細胞中に導入した場合にＤＮＡ合成阻害活性 を示す３種のｃＤＮＡを分離および同定した。これらの分子は、“老化細胞由来 阻害因子群゛（“ＳＤド）として本明細書に引用している。

ＩＩ　細胞老化の阻害因子群のクローニング本発明の実施に際し、老化ヒト二倍 体繊維腎細胞中に存在するＤＮＡ合成阻害性配列群の分子クローニングのために 有効な方法が好適に用いられる。生物学的に重要な遺伝子群のクローン化を試み る場合そうであるように、その生産物の活性は容易に検出し得るのに、細胞老化 にかがわる所望の遺伝子を精製するのは可能でないこともある。

このような遺伝子配列を同定するために構想さ第１得る１つの方法は、老化細胞 由来ｃＤＮＡライブラリーのディファレンノヤル（ｄＨｆｅｒｅｎｔｊａｌ）ま たはサブトラクティブ（ｓｕｂｔｒａｃｔｉｖｅ）スクリーニングを用いること てあろう。この方法は、ヴエルナー症候群中者由来の細胞において過剰発現され るｃＤＮＡ分子を同定するのに用いられている（ムラ人　Ｓ等、モレキュラー・ セル・バイオロジー、１１巻、３９０５−３９１４頁（１９９１年８月））。ヴ エルナー症候群は、希に遺伝する疾病である。それは早軌加齢（ｐｒｅｍａｔｕ ｒｅ　ａｇｉｎｇ）により特徴付けられている。自然の加齢とヴエルナー症候群 との関連性は知られていない。

不運にも、このようなスクリーニングは、老化ＩＴｌ胞の特定には重要であるけ れども、老化の重要なｌｆｆ１因ではない、多数の遺伝子を同定するだろう。更 に、全長ｃＤＮＡのクローニングにおける技術的な制約が、これらの方法により クローン化される遺伝子群の機能決定を困轄にしている。これらの理由から、こ のようなディファレノノヤル法は、老化関連遺伝子配列群を同定するには、一般 的に適切でもなく、また最も望ましい方法でもない。

反対に、発現スクリーニングは、このような老化関連遺伝子配列群の好ましい同 定および分離方法を与えるものである。このスクリーニング法ては、クローン化 した遺伝子を受容細胞において発現する能力を有するベクター内てｃＤＮＡを直 接クローン化する。こうして、ＤＮＡ合成における何等かの阻害に対して直接受 容細胞をスクリーニングすることが出来る。

発現スクリーニングにおいて、最も重要な段階は、ｃＤＮＡの合成である。酵素 は、夾雑物がないように、注立深く選択されるべきである。ｃＤＮＡ合或は、満 足の行く結果（即ち、正確な逆転写および十分な長さの転写サイズ）が得られる ことを確実にするために、好ましくは数回繰り返される。最終的に、ｃ　ＤＮＡ 生産物は、好ましくは、断片になったり早すぎて終了したｃＤＮＡ生産物を除去 するために、サイズ画分される。二本鎖ｃＤＮＡ生産物は、次いで、大きさに基 づく両分、即ち、０．５−２．０．２．０−４．５．４．５−１０ｋｂ画分に好 適に分けられる。膜結合タンパク質の多くが、相対的に高い分子量を有するとい う推定のもとに、２−４．５ｋｂ　ｃＤＮＡ画分を用いて、ｃＤＮＡライブラリ ーを作成した。ｃＤＮＡ群は適切な発現ベクター、好ましくはｌ）　ＣＤ　Ｓ　 Ｒα△の中に挿入され、挿入された配列群は若い細胞内で高レベルで転写され得 る。

最も好ましいトランスフェクション法は、ＤＥＡＥデキストラン媒介トランスフ エクノヨンであり、高い割合で若いサイクリング細胞を一時的に発現させる条件 下で行われる。トランスフェクション頻度は、実験毎に変化するため、ｃＤＮＡ ブールプラスミドを、ｐＣＭＶβ（β−ガラクトンダーゼをコードする）などの マーカープラスミドと一緒にトランスフェクションし、櫻識指数をβ−ガラクト ノダーゼ陽性細胞のみてアッセイした。一般に、トランスフェクションした遺伝 子群の同時発現は、トランスフェクション・コンピテントな細胞が多くのプラス ミドを受け入れることから、かなり高い。この簡単な同時トランスフェクンヨン 法は、細胞外ＤＮＡを発現する細胞におけるＤＮＡ合成の評価を可能にした。

同時トランスフェクションされるプラスミド量は、パイロット試験から決定され た。トランスフェクション頻度と加えたプラスミドの量との間の相互関係は、マ ーカープラスミドを用いて試験され、最大効率は、プラスミド１１００−５００ ｎの範囲で得られる。この結果を考虜に入れて、好ましくはｃＤＮＡライブラリ ーを、各プールが５種の独立したプラスミドクローンを含む小さいプールに分け た。次いて、ｐｃＭｖβ約１１００ｎとｃＤＮＡプラスミド約４０（ｌｏｇとで 同時トランスフェクションを行う。これらのパラメーターは、マーカープラスミ ドのトランスフェクション頻度を低減すること無く、β−ガラクトノダーゼ陽性 細胞におけるｃＤＮＡの同時発現を最大にすることが見い出された。

スクリーニングの第２ラウンド後、ＤＮＡ合成の強力な阻害を示した単一のプラ スミドを、第１ラウンドスクリーニングの時に陽性と判断されたプールからうま く分離することが出来た（図２）。図２では、第１ラウンドスクリーニングにお いて陽性を示したｃＤＮＡプールを個々のプラスミドに分け、再びトランスフェ クションした。各ｃＤＮＡプール（Ａ、ＢおよびＣ）について、プラスミドＮ。

１ないし５は、それぞれ単一プラスミドトランスフエクノヨンの結果を示してい る。プールＢては、Ｎｏ、１プラスミドは、単なる空のベクターであることが分 かった。プラスミドの阻害性活性は、好ましくは、核マイクロインノエクンヨン 実験により、更に確かめられる。このような実験は、分離されたプラスミドがＤ ＮＡ合成を阻害する能力を持つ配列群を含むことの、より直接的な証拠を与える ものである。

ＩＩＩ　本発明の分子およびそれらの使用本発明は、ＤＮＡ合成を阻害するかま たは可能にするいずれかの様々な化学薬剤の使用を意図するものである。このよ うな薬剤は、（１）オリゴヌクレオチド、Ｃ２）ｎＡｆｍ合タンパク質、または （３）オリゴヌクレオチドまたは核酸結合分子のいずれかの構造によく似た構造 の化合物（即ち、“ペプチドもどき“剤）であり得る。

本発明の薬剤は、活性細胞におけるＤＮＡ合成の阻害を誘導するか、または老化 または静止細胞における、このような阻害を抑制するかのいずれかの能力を持つ ものであり、それらは、広範囲の治療および応用に用いられ得る。

従って、１つの実施態様では、本発明は、受容細胞におけるＤＮＡ合成を阻害す る能力を有するＣＤＮＡ分子を、機能的な（即ち、発現可能な）形で分離する方 法を与えるものである。このような“ＳＤド核酸分子、同じ（それらがコートす るタンパク質、およびそれらのペプチドもどき類似体は、受容細胞における老化 または静止状態の誘導時に、用いる。このような誘導は、早老症（〕（ダム。

Ａ　Ｊ　、アーカイブス・オフ・デルマドロン−１１２５巻、５４０頁（１９８ ９年）、バーマー、Ｌ等、オルソペデイノクス、１１巻、７６３頁（１９８８年 ）、マーチン、Ｇ、Ｍ、ナショナル・キャノサー・インステイチュート・モノグ ラフ、６０巻、２１１頁（１９８２年））：年齢関連疾患（マーチン、Ｇ、Ｍ、 ゲノム、３１巻、３９０頁（１９８９年）：ロー、Ｄ、Ａ、、クリニカル・ゲリ アトリ・ノクス・メゾイノイン、６巻、３１９頁（１９９０年）、ムーラディア ン、Ａ、Ｄ、、／ヤーナル・オフ・アメリカン・ゲリアトリックス・ソサイエテ イー、３６巻、８３１頁（１９８８年）、アルパート、Ｊ、Ｓ、アメリカン・ン ヤーナル・オフ・カルディオフノー、６５巻、２３ｊ頁（１９９０年））、アル ツノ＼イマー病（テリー、Ｒ，Ｄ、モノグラフ・オフ・バノロノー、３２巻、４ １頁（１９９０年）７コスクール、Ｂ等、フ〒−マコサ力イアトリー、２３巻、 ８５頁（］　９９９０年）座力症およびカヘキ／−（ウェルプリー、Ｒ，１３、 ケリアトリノクス、４５巻、２６百（１９９０年））、または迅速な細胞増殖が 望ましくないような疾患または症状の処置に、望ましい。この関係で、本発明の 薬剤を治療的に用いて、腫瘍または腫瘍原細胞の迅速な増殖を抑制することが出 来る。従って、本発明は、癌を処置するための治療を提供するものである。

ＳＤＩ核酸分子の配列は、静止および老化に関連するＤＮＡ合成の阻害を抑制す るのに用いられ得るタンパク質分子を帰結および同定することを可能にする。

このような分子のアミノ酸配列は、核酸分子のヌクレオチド配列とそれがコード するタンパク質のアミノ酸配列との間の知られている関係から容易に導き出すこ とが出来る。本発明は、明らかにされたＳＤＩ核酸分子の転写および翻訳により 合成されるタンパク質およびポリペプチド分子を包含している。

本発明により意図されている付加的な種類の分子は、ＳＤＩ配列から発現される タンパク質の機能とよく似たタンパク質または他の分子（即ち、ペプチドもどき 類似体）を含んで成る。

これらおよび他の類似体は、例えば、本発明の試薬のＤＮＡ合成を誘導または抑 制解除する能力を活用することにより容易に同定され得、これらの工程を逆にす ることが出来る薬剤を同定することにも用いられる。故に、例えば、細胞をＳＤ Ｉオリゴヌクレオチドと疑似アンタゴニスト化合物のいずれもが存在する中でイ ンキュベートすることもある。その細胞を追跡して、化合物がＤＮＡ合成を阻害 するＳＤＩオリゴヌクレオチドの能力を低減出来るかどうかを測定するのである 。従って、本発明は、アンチセンスオリゴヌクレオチドのアンタゴニストを同定 することが出来る“スクリーニングアッセイ”を包含する。逆に言えば、細胞を ＳＤＩアンチセンスオリゴヌクレオチドと疑似アンタゴニスト化合物のいずれも が存在する中でインキュベートすることもある。細胞を追跡して、その化合物が ＤＮＡ合成を抑制解除するアンチセンスオリゴヌクレオチドの能力を低減出来る かどうかを測定するのである。従って、本発明は、アンチセンスオリゴヌクレオ チドのアンタゴニストを同定することが出来る“スクリーニングアッセイ”を包 含する。同様の方法て、これらの薬剤のアゴニストを代替的に同定することも可 能である。

このようなスクリーニングアッセイの使用により同定され得るアゴニスト化合物 の中には、不妊を引き起こすために使用してもよい化合物がある。同様に、この アンセイは、組織再生または血管新生を抑制するかまたは引き起こすいずれかの 能力を持つ化合物の同定を可能にするであろう。このような化合物は、癌の処置 に有用であり得る。

タンパク質およびポリペプチドの発現時および望ましい類似体の定義付は時にそ れらを使用するのに加えて、本発明のＳＤＩ核酸分子は、ＳＤＩ核酸分子に結合 し、その活性を阻害するなどの能力を持つアンチセンス核酸分子を生産するのに 用いることが出来る。特に好ましいのは、このような薬剤がアンチセンスオリゴ ヌクレオチドである場合である。

一般に、”アンチセンスオリゴヌクレオチド”は、その配列がターゲットのｍＲ ＮＡ分子（またはそれに対応する遺伝子）の配列に相補的である核酸（ＤＮＡま たはＲＮ　Ａのいずれか）であり、ｍ　ＲＮ　Ａ分子（または遺伝子）に結合す るか、またはハイブリダイズし、それによって、ｍＲＮＡ分子の遺伝子産物への 翻訳を損なう（即ち、弱めたり、妨げたりする）能力を持つものである。アンチ センスオリゴヌクレオチドとして働くには、核酸分子はターゲットｍＲＮへの翻 訳を媒介するターゲットｍＲＮＡ分子（または遺伝子）の部分と結合するか、ま たはハイブリダイズする能力を持たなければならない。アンチセンスオリゴヌク レオチドは、ヨーロッパ特許出願公開番号２６３．７４０　；　３３５．４５１ 　＋および３２９．８８２と、ＰＣＴ公開番号Ｗ０９０１００６２４に開示され ており、これらはすべて、本明細書に参照として組み込んである。

本発明は、特に、ＳＤＩ遺伝子産物をコードするｍＲＮＡまたはｃＤＮＡ分子に 結合するか、またはハイブリダイズする能力を持つようなアンチセンスオリゴヌ クレオチドに関係する。

従って、本発明の一聾様ては、ＳＤＩ　ｍＲＮＡ転写物の翻訳を特異的に遮断す るようにデザインされたアンチセンスオリゴヌクレオチドを用いて、受容老化細 胞におけるＤＮＡ合成の阻害を抑制解除することが出来る。

アンチ−３ＤＩアンチセンスオリゴヌクレオチドがこれらの目櫟を達成し得るよ うな１一つの方法は、ＳＤＩ　ｍＲＮＡの翻訳開始領域の配列で、しかもＳＤＩ 遺伝子のｍＲＮＡ転写物にハイブリダイズ出来るのに充分な長さの配列に相補的 な配列を持つことによるものである。このようなオリゴマーの大きさは、この目 的に効果的な任意の長さであることが出来る。好ましくは、アンチセンスオリゴ ヌクレオチドは、約１０−３０ヌクレオチドの長さであり、最も好ましくは、約 １５−２４ヌクレオチドの長さであるだろう。

代替法として、短すぎて、生理学的、イン・ビボ条件下で、ＳＤＩ’ｍＲＮＡに 安定にハイブリダイズ出来ない長さのアンチセンスオリゴヌクレオチドを用いる こともある。このようなオリゴヌクレオチドは、長さにして約６−１０またはそ れ以上のヌクレオチドであることもある。本発明に従って用いられるためには、 このようなオリゴヌクレオチドは、好ましくはＳＤＩコード化ｍＲＮＡの翻訳領 域座に結合させるように修飾されている。このような修飾分子の例には、抗体（ または抗体フラグメ／ト）に結合させたオリゴヌクレオチド、または−末鎖ＳＤ ＩｍＲＮＡ分子に結合出来る他のりガント（例えば、トリメチルソラリン、８− メトキノソラリンなどの、二価架橋剤など）がある。

二価架橋剤（ソラリン、例えば、トリメチルソラリンまたは８−メトキンソラリ ン）付加物の１つの反応基に結合させたアンチ−３ＤＩアンチセンスオリゴヌク レオチドは、３５０−４２０ｎｍＵＶ光で活性化してＳＤＩ　ｍＲＮＡ１：架橋 する能力を持ってあろう。従って、このような光強度を調節する（ＵＶランプの ワット数を変える、細胞とランプの間の距離を広げる等による）ことにより、ア ンチセンスオリゴヌクレオチドと細胞のＳＤＩ　ｍＲＮＡとの間の結合程度をコ ントロールする場合もある。これにより、順次、受容細胞におけるＳＤＩ遺伝子 発現の減弱の程度をコントロールすることもまた可能になる。

一般に、アンチセンスオリゴマーは、ＳＤＩ遺伝子のヌクレオチド配列に従って 調製され、最も好ましくは、５ＤＩ−１のヌクレオチド配列（図５）に従って調 製される。

アンチセンスオリゴヌクレオチドの配列は、生成するオリゴヌクレオチドが、上 記したＳＤＩ　ｍＲＮＡ、ｃＤＮＡまたはＳＤＩ遺伝子自身のいずれかの上記翻 訳座に結合するかまたはハイブリダイズする能力を持つことを前提として、１つ またはそれ以上の部分に、１つまたはそれ以上のヌクレオチドの挿入、置換、欠 失を含み得る。

本発明のアンチセンスオリゴヌクレオチドを合成するには、当業者に知られてい るどの方法も用い得る（サメチク等、プロノーディング・オフ・ナショナル・ア カデミ−・オフ・サイエンノイズ（Ｕ、Ｓ、　Ａ、　）、８３巻、４１４３頁（ １９８６年）、グソトチャイルト等、プロノーディング・オフ・す７ヨナル・ア カデミ−・オフ・サイエンノイズ（Ｕ、　Ｓ、△　）、８５巻、５５０７頁（１ ９８８年）、ウィックストロム等、ブロン−ディング・オフ・ナショナル・アカ デミ−・オフ・サイエンノイズ（Ｕ、Ｓ　Δ）８５巻、１０２８頁、ホルト、Ｊ 、Ｔ。

等、モレキュラー・セル・オフ・バイオフノー、８巻、５）６３頁（１９８８年 ）、ゲルウィルン、Ａ、Ｍ等、サイエンス、２４２巻、１３０３頁（１９８８年 ）、アンフすツノ、Ｇ等、プロ／−ディング・オフ・す／ヨナル・アカデミ−・ オフ・サイエンノイズ（Ｕ、Ｓ、Ａ）　、８６巻、３３７９頁（１９８９年）、 へ・ンカー、Ｄ等、ＥＬｉＢＯ／ヤーナル、８巻、３６７９頁（１９８９年）、 引例はすべて、参照として本明細書に組み込んである）。自動核酸合成機をこの 目的のために用い得る。加えて、いかなる配列の所望のヌクレオチドも、カスタ ムメ−１・分子の商業的供給業苦から人手出来る。

最も好ましくは、本発明のアンチセンスオリゴヌクレオチドは固相“ホスホアミ ダイト合成′を用いて調製してもよい。該合成は、オリゴヌクレオチドの３′− ヒドロキシル末端になるヌクレオチドて誘導された固体支持体に結合させｔこ伸 長ヌクレオ千ト鎖を用いて行オ〕れる。該方法は、その５°−ヒドロキシル基が （好ましくは、５’−ＤＮｊＴ（ンメトキ／トリチル）基で）保護されており、 そのアミノ基かへンソイＪし基（ノドノンおよびアデノノンのアミン基のｔこめ ）まｔこ：まイノブチリル基（グアノシンを保護するため）のいずれかで保護さ れているモノマー単位を用いるＤＮＡの循環合成を含む。このすな誘導体の製造 方法は、当業者には、よく翔られている。

本発明のアンチセンスおよび他の阻害剤は、さもなければ一時的な増殖性生存能 力しかもてない価値ある細胞型（−次組織培養細胞等）に永遠性を与えるｔコめ に用い得る。従って、これらは、器官または組織移植片または移植植物１こ関し て、研究のために、多数の細胞の蓄積を可能、もしくは助長したりするのに用い 得る。

それ故に、一実施態様では、本発明の薬剤を器官または組織培養方法と共に用い て、当該方法を促進させることもある。

使用することにより生理学的条件が変わるのであれば、その使用は治療的と言わ れている。非治療的使用というのは、使用者の外観を変えるものである。

本発明の薬剤は、例えば皮膚の調子、色、質感等、またはリンパ球、血管（動脈 、小動脈、毛細血管、静脈など）、肝臓、腎臓、心臓および他の筋肉、骨、０臓 などの細胞、組織または器官の再生における、加齢の効果を妨げることなどの治 療または非冶療目的のために局所的に、または組織的に用い得る。本発明の薬剤 は、そのような細胞、１■織または器官を若返らせるのに用いｉＪる。従って、 これらは、医薬等に用いることが出来、それらの医薬等は例えば、アンチセンス オリゴヌクレオチｌ−またはそれと同等の物、および好ましくは、適切な溶媒に 溶解させた脂肪親和性キャリアーまたは添１ｘ＋物を含んで成るものであり得る 。このような溶媒は、例えば、水−エタノール混合物（１０％ないし３０％ｖ　 ／　ｖまたはもっと多くのエタノールを含有する）であっても良い。このような 製剤は、０００１％ないし１００ものアンチセンスオリゴヌクレオチドを含有し 得る。適切なキャリアー、添加剤および溶媒は、レミントンズ・ファーマノニー ティカル・サイエンノイズ（第１６版、オソル、Ａ出版、マンク、イーストン・ ベンノルバニア（１９８０年））、この文献は、本明細書に参考として組み込ん である）に記載されている。

本発明のアンチセンスおよび他の阻害剤分子が細胞増殖を刺激する能力を有する ことから、それらを用いて、火傷、または外科手術後の損傷治癒、回復を促進し たり、萎縮した組織等を修復したりすることも可能である。このような実施態様 のために、これらの薬剤は、抗生物質、抗菌剤などと共に、局所投与または全身 投与用に処方されることもある。

このような本発明のアンチセンスおよび他の阻害剤分子は、ヒトまたは動物にお ける精母細目包の増殖または卵母細胞の成熟を刺激するのに用い得る。従って、 本発明のＴ；剤は、受容者の受精能力を増進するために使用され得る。

本発明の分子は、受容小者に遺伝子治療を施すために用いても良い。一実施態様 では、中老由来の細胞または組織をψ者から除去し、活発な成長状態を回復させ るのに充分な条件下、本発明の分子で処理する。この使用の好ましい一態様では 、個人（例えば、エイズ中音などのように免疫損傷しこ個人（１龍聞ｅ　ｃｏｍ ｐｒｏｍｉｓｃｄ　１ｎｄｉｖｉｄｕａｌ）または、リンパ球の提供者として働 （１，免疫能力の十分な個人（ｉｗｕｎｅ−ｃｏｍｐＣｔｅｎｔ　１ｎｄｉｖｉ ｄｕａｌ）など）のリンパ球を脱離し、アンチセンスＳＤＩ核酸で処理すること が出来る。これらの分子の投与は、リンパ球を抑制解除するであろう。投与後、 リンパ球は小者に再び導入され、感染と戦う能力が増強される。

本発明の分子は、特に、疾病または組織変性のための動物モデルの創製および／ または研究に使用するのに適している。従って、本発明の分子を用いて、異常な 加齢または細胞変性により特徴付けられる動物モデルのエフェクター（ｅｆｆｅ ｃｔｏｒ）を研究すること力咄来る。同様に、ＳＤＩ分子（例えば、適切な調節 配列と連結させて、受容細胞におけるそれらの発現を可能にさせたもの）を投与 して、加齢および組織変性の動物モデルを創製するのに用いても良い。

ｒｖ　投与方法 本発明の薬物は、医薬的に有用な組成物を調製する知られた方法に従って製剤化 でき、該方法により、これらの材料、またはそれらの機能的誘導体が医薬的に許 容され得るキャリヤー媒体と絹み合わせて混和物とされる３、適切な媒体および 他のヒトタンパク質、例えば、ヒト血清アルブミンを含む、それらの製剤は、例 えば、レミントンズ・ファーマノニーティカル・サイエンノイズ（第１６版、オ ソル、Ａ出版、マノク、イーストン、ペンシルバニア（１９８０年））に記載さ れている。効果的な投与に適した医薬的に許容され得る組成物を形成させるため には、当該組成物は、有効量のアンチセンスオリゴヌクレオチド、またはその均 等物、またはそれらの機能的誘導体を適量のキャリヤー媒体と共に含有するであ ろう。

更なる製薬方法を用いて、作用の持続期間を制御し得る。アンチセンスオリゴヌ クレオチド、またはその均等物、またはそれらの機能的誘導体を複合（ｃｏｍｐ ｌｅＸ）または吸収するポリマーを用いることにより、放出制御製剤を完成でき る。

放出制御するために、適切な高分子（例えば、ポリエステル類、ポリアミノ酸類 、ポリヒニル、ピロリドン、エチレンビニルアセテート、メチルセルロース、カ ルホキツメチルセルロース、またはプロタミン、サルフェート）と高分子の濃度 、同じく組み込み方法を選択することによって、制御された放出を実行できる。

制御放出製剤により、作用持続期間を制御するもう一つの可能な方法は、アンチ センスオリゴヌクレオチド、またはその均等物、またはそれらの機能的誘導体を 、ポリエステル類、ポリアミノ酸類、ハイドロゲル類、ポリ（乳酸）またはエチ レンビニルアセテートコポリマー類などのポリマー物質の粒子に組み込むことで ある。代替法として、これらの薬物をポリマー粒子に組み込む代わりに、これら の物質を、例えば、コアセルベーンジン技術、または、界面重合により調製され たマイクロカプセル類、例えば、ヒドロキノメチルセルロースまたはゼラチン− マイクロカプセル類およびポリ（メチルメタクリレート）マイクロカプセル類そ れぞれの中に、またはコロイド状薬剤放出システム、例えば、リポソーム類、ア ルブミンミクロスフェア類、ミクロエマルション類、ナノ粒子類、およびナノカ プセル類、またはマイクロエマルション類中に封じ込む（ｅｎｔｒａｐ）ことが 可能である。このような技術は、レミントンズ・ファーマシューティカル・サイ エンノイズ（１９８０年）に開示されている。

本発明の組成物は、注射、迅速な屯滴、鼻咽喉吸収（鼻咽喉内に）、皮膚吸収に よる非経口的投与または経口投与用に製剤化されることも出来る。これに代えて 、該組成物を筋肉内没勾または静脈内投与してもよい。非経口投与のための組成 物は、滅菌水溶液または非水溶液、セ濁液、および乳液を含んでいる。非水性溶 媒の例は、プロピレングリコール、ポリエチレングリコール、オリーブ浦などの 植物油、およびオレイン酸エチルなどの注射可能な有機エステル類である。担体 、添加剤または閉鎖包帯を用いて、組織浸透性を増大させたり、抗原吸収を増強 させたり出来る。経口投与のための液体投薬形態は、一般にこの液体投薬形態を 含有するリポソーム溶液を含んで成ることもある。Ｖ濁状リポソームに適切な形 態は、乳液、せ濁液、溶液、シロップ、およびエリキンルを含み、当技術分野で 通常用いられる精製水などの不活性希釈剤を含有する。不活性希釈剤の他にも、 このような組成物は、湿潤剤、乳化剤および懸濁剤または甘味料、香味＃１、着 色料、または芳香料も含み得る。

組成物は、その投与に受容中音が耐え得る場合、“医薬的に許容され得る”と言 われる。投与される量が生理学的に有意義である場合、そのような薬物は、“治 療的に有効量”て投与されると言われる。薬物は、その存在が、結果として受容 中音の生理機能における検出可能な変化を生じる場合、生理学的に有意義である 。

一般に、有効量の組成物を与えるために必要とされる投薬量は、受容者の年齢、 体調、性別、および疾病の程度、あるとしても当技術分野の通常の技術者により 調整され得る他の変化物、などの要因に依存して変化する。

本発明の組成物の有効量は、用量または適用当たり０．０１−１．　ＯＯＯｍｇ ／ｍｌで変化し得るが、より少なくまたはより多く用いても良い。

以上、本発明を一般的に記載してきたが、以下の実施例を参考にすることにより 、より容易に理解されるであろう。それらの実施例は、特記したものを除き、例 示のために提供したものであり、本発明の限定を意図するものではない。

実施例１ ｃＤＮＡライブラリーの創製 ｃＤＮＡライブラリーは、細胞系ＨＣＡ　２などの正常ヒト新生児包皮繊維芽細 胞由来のＲＮ　Ａを用いて得られた。これを行うためには、細胞を、１０％胎児 ウノ血清（ＧｒＢＣＯまたはハイクローン）を補った、均衡のとれたアール塩溶 液またはハンクス塩溶液のいずれかを含む最小必須成分培地で成育させた。細胞 を培養し、それらのイン・ヒドロでの寿命を、以下参考として組み込んであるス ミス、Ｊ、Ｒ，、およびブラウンシュバイゲル、に、１．、ジャーナル・オフ・ セル・フィノオフノー、９８巻、５９７−６０１頁（１９７９年）に記載されて いる条件下て測定した。静止細胞は、細胞が集密的（ｃｏｎｆｌｕｅｎｔ）にな る前に、正常培養培地を、０５％血清を含む培養培地に変えることにより作成さ れた。該細胞は、低血清培養で３週間まで維持された。

全細胞ＲＮＡをグアニノウムチオンアネート／ＣｓＣ１法（ガルガー、Ｓ、Ｊ、 等、バイオケミカル・アンド・バイオフィジカル・リサーチ・コミュニケーノヨ ンズ、１１７巻、８３５−８４２頁（１９８３年））か、またはグアニジウムチ オシアネート／フェノール法（コムジンスキー、Ｐおよびサツキ、Ｎ９、アナリ ティカル・バイオケミストリー、１６２巻、１５６−１５９頁（１９８７年）　 、ＲＮＡゾルＢ１バイオテックス・ラボラトリ−・インコーホレイテッド、テキ サス）のいずれかにより分離した。ポリＡ＋ＲＮＡはオリゴ（ｄ　Ｔ）セルロー スカラムクロマトグラフィー（コラボレイティブ・リサーチ、マサチューセッツ ）により分離した。

上記したように、老化細胞から得られたポリＡ＋ＲＮＡ　１０＋＋ｇは、提供者 （ＢＲＬ、ＭＡＤ）の教示に従いＲＮアーゼＨ−／ＭＭＬＶ逆転写酵素を用いる ことにより、二本鎖ｃＤＮＡ群に転換させ、Ｔ４ポリメラーゼ処理により平滑末 端にした。二本鎖ｃＤＮＡ調製物群は、アガロースゲル電気泳動によりイズ画分 され、発現ベクターに挿入するために、２−４．５ｋｂの両分を分離した。

この目的に用いられる発現ベクターは、３．４ｋｂプラスミドであり、ｐｃＤＳ Ｒα△と呼称されるものである（図１）。プラスミドｐｃＤＳＲαへは、プラス ミドｐｃＤＳＲα２９６の誘導体であり、オカヤマーバーグＳＶ４０プロモータ ーとＩ−Ｉ　Ｔ　Ｌ　”ｉ’　−１由来のＬ　Ｔ　Ｒを含む（タケベ、Ｙ等、モ レキュラー・セル・バイオロジー、８巻、４６６−／１７２頁（１９８８年）； Ｍヨシダ博士（キャノサー・インスティテユート・オフ・ツヤパン）により提供 された）。プラスミドｐｃＤｓＲα△は、ｐ　ｃ　Ｄ　Ｓ　Ｒ２９６からＰｓｔ ｌ−Ｋｐｎｌフラグメントの３３６塩基対（ｂｐ）セグメントを除き、それをｐ ｕｃ１９由来のＰｓｔｌ−Ｋｐｎｌフラグメントの２８塩基対に置き換えること により形成された。生じたプラスミド（ｐｃｌ）ＳＲα△）は、クローニングベ クターおよび発現ヘクターとして用いられた。

プラスミドｐ５Ｖ２ｃａｌ　（ゴーマン、Ｃ９等、モレキュラー・セル・バイオ ロジー、２巻、］００４４００５１頁１９８２年））は、グレンチェン・ダーリ ントン博士（テキサス・チルドレンズ・ホスピタル）により与えられた。ｐｃＤ ヘクター（オカヤマ、１（およびハーグ、Ｐ１モレキュラー・セル・バイオロジ ー、３巻、２８０−２８９頁（１９８３年））は、１１オ力ヤマ博士（日本、大 阪大学）により与えられたもので、該プラスミドは、ＳＶ／ＩＯプロモーターと Ｓ〜′１１０ポリＡ／グナルの間に挿入されたクロラムフェニコールアセチルト ランスフェラーゼ（−ＣＡＴ”　）遺伝子をイ１する。ｐｃＤｓＲα△−ｃａｔ は、Ｉ（ｉｎｄｌｌｌ−３ｍａｌ消化ＳＲαプロモーターフラグメントのＱ　８ ｋｂをＨｉｎｄｌＩＴ消化ｐＳＶＯｃａｔに、２段階の連結反応を経て、挿入す ることにより、ｐｃＤＳＲα△から構築された。ｃ　Ｉ）　Ｎ　Ａライブラリー の効率良い発現スクリーニングを可能にするためには、非常に強力なプロモータ ーが望まれていた。数種の哺乳類発現ベクター（若い細胞内にトランスフェクシ ョンされたｐＳＶ２ｃａ　ｔ、ｐｃＤ−ｃａ［およびｐｃＤＳＲα△−ｃ　ａ　 ｔ　）の分析から、ＳＲαプロモーターが若いサイクリング細胞におけるＣＡＴ 遺伝子の発現を高効率で推進することが見い出された。これらのプラスミドの相 対的なＣＡＴ活性は、各反応に用いられるタンパク’Ｉｆｆｆｉに対して欅準化 することにより、計算された。転写効率は、ＳＶ４０初期遺伝子プロモーターを 利用する在来のｐ　Ｓ　’、：　２プロモーターよりも約２０倍高かつｔこ。

ｐＣＭＶβは、ヒトサイトメカトロウィルス前初期遺伝子（ｉＩＩｌｍｅｄｉａ ｔｅ　ｅａｒｌｙｇｅｎｅ）プロモーターにより駆動されるＥ、コリβ−ガラク トンダーゼ遺伝子を搭載している（マノクグレコール、ＧＲ４およびキャスヶイ 、Ｃ，Ｔ、、ヌクレイツク・ア／ノズ・リサーチ、１７巻、２３６５頁（１９８ ９年）、テキサス、ベイラー・カレノ／・オフ・メディノン、グランド・マツク グレゴール博士により提供された）。プラスミドｐ　１３４４０は、ヒトβ−ア クチン配列の４４３ｂｐを搭載している（ナカノマーイイノマ、Ｓ等、プロノー ディング・オフ・ナショナル・アカデミ−・オフ・サイエンノイズ、８２巻、６ １３３−６１３７頁（１９８５年）１日本、大阪大学、コーゾー・マキノ博士に より提供された）。プラスミドｐＨｃＧＡＰ（ツす、Ｊ、Ｙ、等、ヌクレイツク ・アノソズ・リサーチ、１３巻、２４８５−２５０２　（１９８５年））は、ヒ トのグリセルアルデヒド３ホスフエートデヒトロケナーゼ（ＧＡｒ’ＤＨ）ｃＤ ＮＡの全長を運ぶものであり、メリーラント、口・ノクヒイル、アメリカン・タ イプ・カルチャー・コレクションから得られた。

ｃＤＮＡアンチセンス発現のため、ｃＤＮＡフラグメントの全長をＢａｍＨｌ消 化により、当初クローン化したｐｃＤＳＲα△ベクターから摘出し、逆向きに、 連結させた。

アカロースケルから回収したｃＤＮＡ１￥Ｔを直接、子牛腸アルカリホスファタ ーゼ処理したｐｃＤＳＲα△のＳｍａ１部位に挿入し、Ｅ　コリＭＣ１０６１ま たはＤＩ（ｉに形質転換した。アンビノリ／耐性コロニーを無作為に釣り、プラ スミドの大きさを測定した。これらの１順は、２−４．５ｋｂ　ｃＤＮＡの挿入 が、試験されたプラスミドの９０パ一セント以上で起こるようになるまで繰り返 された。

次いて、各Ｅコリのコロニーをっま楊枝で釣り、５コロニーを集めて１つのＣＤ ＮＡブールにした。４００以上のＣＤＮＡブールを調製し、９６ウエルのミクロ タイタープレート内で生育させ、１１１％グリセロール中に一７０℃で保存した 。

Ｄ　Ｎ　Ａ分離のために、各ＤＮＡプール由来のＥコリを２００ｍ１中に培養し 、標準方法のエチ／ウムブロマイド／ＣｓＣ］超遠心分離（カルカー、Ｓ、Ｊ、 等、バイオケミカル・アンド・バイオフィンカル・リサーチ・コミュニケー／ヨ ン、１１７巻、８３５−８４２頁（１９８３年））に１回または２回かけて処理 し、続いて、ＴＥ（１０ｍＭ）リスｐｌ＋８．０．１ｍＭＥＩ）Ｔ△）溶液に対 して透析した。

実施例２ Ｄ　Ｅ　、＝〜Ｅ−デキストラン媒介ｌ・ランスフェクノヨンおよび一時的発現 スクリーニング 若い、勺イクリング繊維芽細胞（ｃｙｃｌｉｎｇ　ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔ　ｃｅ ｌｌｓ）を、トランスフェク／ヨン前１８時間に、ウェル当たり０．９１．２Ｘ ］０’の密度で６ウ工ル組織培養プレートまたは３５ｍｍ組織培養皿に接種した 。トランスフェクションは、以下に記載のように微修飾して本明細書に参考とし て組み込んであるクレン、ＢＲ１ガイド・トウ・モレキュラー・クローニング・ テクニークス・メソッズ・イン・エンザイモロノー、Ｓ、ｌ−、ヘルカーおよび Ａ、Ｒキメル出版、アカデミツク・プレス、６８４−７０４頁（１９８７年）、 に記載されているようにして行っｔこ。

各トランスフェクションのために、ｐＣＭ■β１１００ｎとｃＤＮΔＤＮＡプー ル由来ｇをｆｄｏし、ホスフェート緩衝化塩水ＣＰ　ＢＳ　）溶液１９ＯＬｌ＋ に懸濁し、１０ｍｇ、’ｍｌの１つＥＡＥ−デキストラン（ファルマノア、分子 １１５００．０００）］、Ｏｕ１を加えた。クローニングベクタープラスミド、 ｐｃＤＳＲα△の４００頁ｇを対照として、ｐＣＭ〜′βと共に用いたー細胞を ＰＢＳて１度洗浄した後、ＤＮＡ溶液を加え、細胞をＣＯ＋インキュヘーター内 で３７℃で４５分間までインキュベートした１次いて、６４ｚＭクロロキン（ノ クマ、ミズーリ）を含む血清入り細胞培養培地の２ｍｌを直接加え、更に２５時 間インキュベートシた。クロロキン処理後、トラノスフエクンヨン混へ物を除き 、細胞を血清入り細胞培養培地中１００６７メチルスルホキシドで、２分間処理 した。細胞をその後、血清入りの新しい細胞培養培地に戻し、インキュベートし て、トランスフェクションしたＤＮＡを発現させた、 トラノスフエク／ヨン後１８時間で、’＋１−壬ミ、ン０．３ｐＣｉ　／ｍｌを 加え、更に４８時間インキュヘ−ノヨンを続けた１、２５％グルタルアルデヒド 溶液２５１１１を培養培地に加えることにより、細胞を固定し、室温で５分間イ ンキュベートし、続いて、ＰＢＳて３回ｔいした。洗浄後、直ちに、細胞をＸ− ｇａ１反応混合物（１０ｍＭＫＣＩを含有する０、１Ｍリン酸ナトリウム緩ｉＩ ｉ液（ｐ＋＋７．５）に溶解しノこ１　ｍＶＭｇＣ］　２、３ｍ１ｌＫ４　［Ｆ ｃ（ＣＮ）ａ］　、　３ｍＭＫｔ　［Ｆｃ（ＣＮ）ｏ］　、　Ｏ，］　％トｊｌ 　トンｘ−１ｎｏ、および］　ｍ１ＪＸ　−ｇａｌ　）　”’Ｃ１２０分間マチ 処理Ｌ、細胞ヲ明青色に染色させた。Ｘ−ｇａｌ染色後、細胞を水で洗浄し、乾 燥して、コダソクＮＴＢ核トラノクエマルノヨ＞　（Ｋｏｄａｋ　ＮＴｎ　ｎｕ ｃｌｅａｒ　ｔｒａｃｋ　ｃｍｕｌｓｉｏｎ）（コダンク、ニューヨーク）を用 いるオートラ７オグラフイーにか（すた。次いて、Ｘ　−ｇａｌ陽性細胞におけ るＩ）　Ｎ　Ａ合成活性を測定した。ＤＮＡ合成の阻害パーセントは、式対照プ ラスミドをトランス　ｃＤＮＡプラスミドをトランスフェクションした　−　フ ェクンヨンした灯明プラスミドをトランスフェクションした青色細胞中の櫻識核 ％ を用いて計算された。

候補となるＣＤＮＡブールを個々のｃ　Ｄ　Ｎ　Ａ群に分け、特定のＤＮＡ合成 阻害ＣＤＮＡ配列群を同定するために、更にスクリーニングにかけた。

若いサイクリング細胞の核マイクロインンエク／ヨンは、（ランプキン、ＣＫ等 、モレキュラー・セル・バイオロジー、６巻、２９９０−２９９３頁（１９８６ 年）、参照として本明細書に組み込んである）に記載されているようにして行っ た。要約すれば１．）、０００−１０．０００細胞を３５開組織培養皿の２２ｍ ｍ四方の１．７チ／クレこ格子状カバーカラス（ｓｑｕａｒｅｅｔｃｈｅｄ　ｇ ｒｉｄ　ｃｏｖｅｒｓｌｉｐｓ）（ヘルフ）上にプレートシた。３日または４日 後、核マイクロイン／エクノヨンを、Ｉ）　ＣＭ　Ｖβ＋ｃＤＮＡプラスミドま たはｐ　ｃ　ｘｖ　ｖβ＋ｐｃｌ）ＳＲａ△（対照として働く）のいずれかを用 いて、最小３００細抱について行った。プラスミドをそれぞれ５０ｎｇ／＊Ｉの 濃度て同時マイクロインノエクンヨンした。マイクロイン／エクノヨン後１８時 間で、細胞を３１１−チミジンで２４時間標識し、固定し、Ｘ−ｇａｌて染色し 、オートラジオグラフィーにかけた。ＤＮＡ合成の阻害パーセントは、上記のよ うに計算した。

総ＲＮＡのうち５μｇまたはポリＡ＋ＲＮＡ１μｇのいずれかを用いて、ノーザ ンプロット分析を行った。該１＜ＮΔは、ホルムアルデヒド−アガロースゲル」 二の電気泳動によりサイズ画分され、本明細書に参照として組み込んであるマニ アチス。

］゛等、モレキュラー・クローニング、ア・ラボラトリ−・マニュアル；コール ド・スプリング・ハーバ−・ラホラトリー、コールド・スプリング・Ｉ＼−バー 、ニューヨーク（１９８２年）に記載されているように、ナイロン膜（ＩＣＮ： バイオトランス、前のポール・バイオダインΔ）に移された。放射性活性プロー ブをランダム・プライマー法により調製し、プロットは、マニアチス、Ｔ等、モ レキュラー・クローニング　ア・ラホラトリー・マニュアル：コールド・スプリ ング・バーバー・ラボラトリ−、コールド・スプリング・バーバー、ニューヨー ク（１９８２年）に記載されているように、ハイブリダイスした。

ノーサンブロノ）・分析により、ＳＤＩの細胞転写物の大きさは５ｌ）ＩｃＤＮ Ａの大きさに矛盾していないということが明らかにした。このことは、首尾良く 発現スクリーニングを行うには、全長ｃＤＮＡをベクターへ挿入する必要がある ことから、千恕されるものであった。

β−アクチンまたはグリセルアルデヒドホスフェートデヒドロケナーゼ（ＧＡＰ 　Ｄ　Ｉ（）プローブとの再ハイブリダイセーノヨノのために、使用説明書に従 って、フィルターを標識プローブから繰り退し剥がした。そのデータは、アンビ ス・ランオアナリティノク・スキャンニング・システム（Ａｍｂｉｓ　Ｒａｄｉ ｏａｎａｌシ′ｔｉｃ　５ｃａｎ口１ｎｇ　Ｓｙｓｔｅｍ）により正確にＪられ た。

ＣＡＴ活性のアッセイは、以下のように測定されｊン若いサイクリング細胞を３ ５ｍｍ皿に接種し、上記のようにプラスミド５００ｎｇをトランスフエクノヨン した。トランスフエクノぢン後２４時間で、細胞を皿からこすり集め、ＣＡＴア ッセイをゴーマン（ゴーマン、Ｃ５ＤＮＡクローニング、ア・プラクティカル・ アプローチ、ＩＲＬ出版、オノクスフオート、イギリス、１、４３−１６４頁（ １９８５年）、本明細書に参考として組み込んである）により記載されているよ うにして行った。

実施例３ 老化細胞由来のＤＮＡ合成阻害因子群（ＳＤＩ）のｃＤＮＡクローニング二本鎖 ｃＤＮｃＤＮＡ群細胞由来ポリ八＋ＲＮΔから合成され、若い細胞において細胞 質にマイクロインンエクンヨンした場合、ＤＮＡ合成を阻害することが示されて いる（ランプキン、Ｃ，に、等、サイエンス、２３２巻、３９３−３９５頁（１ ９８６年））。二のｃＤＮＡ群は、サイズ画分され、ｐｃＤＳＲα△に挿入され た。生じたＥ、コリ　クローン群は、小プール群に分けた。高効率トランスフエ クノヨンにおいてさえ、実験毎に頻度が変わるため、各プール由来のプラスミド をトランスフェク／ヨノマーカーブラスミド、ｐＣＭＶβと共に、同時トランス フエクノヨンし、これにより、特定的にトランスフエクノヨン細胞の標識指数の 測定が可能になった。マーカープラスミドのトランスフェクンヨン頻度は、３０ −９０％の範囲であった。約２００のｃＤＮＡブールをスクリーニングし、５回 トランスフエクノヨンを繰り返した後、４プールがＤＮＡ合成阻害活性に対して 陽性のままであった一候補となるプール群は、次いで、個々のプラスミドに分け 、更にスクリーニングした。

３つの別個の陽性プラスミドクローンが得られた。ｃＤＮＡブールＡでは、１つ のプラスミド、２番のみが、強力なりＮＡ合成阻害活性を示した。同様に、プー ルＢおよびＣては、１つのｃＤＮＡクローンのみが阻害を引き起こした。挿入さ れたｃＤＮＡの大きさは、それぞれ２．１ｋｂ、　１．２ｋｂおよび２．７ｋｂ であった。

これらのｃＤＮＡ配列は、老化細胞由来の阻害因子として、それぞれ５ＤＩ−１ ，５ＤＩ−２，５ＤＩ−３と呼称されている。

５ＤＩ−１ｃＤＮＡクローン（配列番号１）のヌクレオチド配列、および５ＤＩ −１のアミノ酸配列（配列番号２）が、決定されている。５ＤＩ−１について本 明細書に表したｃＤＮΔ配列は、ＵＳ特＋ｌ「出願番号０７／８０８．５２３に 記載されているものとは、２８６位に列挙されていないＧを有する点、および１ ８４３−１８４４位の配列がＧＣてはなくＣＧである点て異なっている。今回開 示した配列は、その分離と特徴がＵＳ特許出願番号０７／８０８．５２３に記載 されているｐｃｌ）　Ｓ　Ｒａ△−３ＤＩ−１プラスミドの再配列化により、得 られたものである。ｐｃＤＳＲα△−３ＤＩ−］ププラストで形質転換されたＥ コリ　Ｄ１１５は、１９９２年１０月１０、アメリカ合衆国、メリーランド、口 ・ツクヒルのアメリカン・タイプ・カルチャー・コレクシヨンに寄託されており 、受託吊号＾ＴＣＣ６’；）　０８　］が与えられている。

実施例１４ 若いサイクリング細胞への５ｔ）Ｉ配列群マイクロイノノエクンヨンＳＤＩ配列 群の機能活性を立証するために、マイクロインノエクノヨンを行った。５ＤＩ− １または５ＤＩ−２のいずれかを搭載したプラスミドをマーカープラスミドと共 に、若いサイクリング細胞の核内へ同時マイクロインノエクノヨンした。生じた 青色細胞の標識指数を測定した（表１）。これらのプラスミドは、若い細胞のＤ ＮＡ合成に強力な阻害活性を示した。対照実験のために、空のベクターを、マー カープラスミドと共に、同時マイクロインノエクンヨンした。これは、標識指数 を非イン／エクノヨン１１１１胞と比べた場合、わずかに阻害を引き起こしてお り、トランスフエクノヨン実験では観察される現象でもある。５ｌ）Ｉ−３のマ イクロイ、ノエクノヨノは、阻害活性が５ＤＩ−１および５ＤＩ−２トランスフ ェクション実験よりも低かったため、行わなかった。

実施例５ アンチセンスＤＮＡトランスフェク／ヨン阻害活性が配列指向特異的であるかど うかを試験するために、Ｓ　Ｄ　Ｉ−１および５ＤＩ−２配列のアンチセンス発 現ベクターを構築した。いずれの配列もＢａｌＲ８１部位を欠いていたこと、ま た、Ｂａｌｌ１−１１部位は、ｃＤＮＡの両方の末端に存在した（１′；！１１ ）ことから、これらの配列は、容易に摘出され、反対方向に再連結された。アン チセンス配列のトランスフェクションは、結果的に若い細胞におけるＤＮＡ？ｉ 成を阻害しなかった（図３）。加えて、何等増大も観察されなかった。

その結果は、明らかに、ＳＤＩ活性の配列指向特異性を示しており、また、ｃＤ ＮＡ配列群によりコードされる特異的遺伝子産物群の存在を示唆している。

実施例６ 細胞老イヒ中のＳＤＩｍＲＮＡの発現 細胞老化中のＳＤＩｍＲＮＡ発現における変化を調べるために、若い細胞および 老化細胞由来の総ＲＮＡを３２Ｐ−標識ＳＤＩ　ｃＤＮＡプローブとハイブリダ イズさせた。この５ＤＩ−１プローブは、２．１ｋｂ細胞転写物とハイブリダイ スし、５Ｄｉ２は１．４ｋｂ転写物とハイブリダイズし、Ｓ　Ｉ）　Ｉ　−３は ２．５ｋｂ転写物とハイブリダイスした（表２）Ｃ，表２は、若い細胞（Ｙ）と 老化細胞（Ｓ）におけるＳＤＩ遺伝子発現の総ＲＮ　Ａノーイン定量分析値を与 えるものである。

若い細胞および老化細胞由来の総ＲＮＡの各５μｇをＳＤＩプローブとハイブリ ダイズさせた。フィルターは、繰り返し、放射性活性プローブから剥がして、内 部対照としてプローブと再ハイブリダイスさせた。各紙＃１におけるＳＤＩ　ｍ ＲＮＡの相対量は、同じフィルター上に検出されるＧＡＰＤＨｆｆｌと、ＳＤＩ ／ＧＡＰＤＨの相対量により標準化された。

細胞老化中、５ＤＩ−１情報は約３倍増加したが、一方５ＤＩ−２および５ＤＩ −３情報は３倍減少した。同じフィルターをβ−アクチンと再ハイブリダイズさ せ、次いて内部対照としてＧ　Ａ　Ｐ　Ｄ　ｔ（プローブと再ハイブリダイズさ せた。その結果は、いずれの対昭遺伝子の発現も細胞老化中に、約３倍減少した ことを示していた。以前の研究では、細胞老化中β−アクチン発現が２−３倍減 少することが観察されている（クマサキ、Ｔ０等、イクスペリメンタル・セル・ リサーチ、１９５巻、１３−１９頁（１９９１年）：センヤドリ、Ｔ、およびキ ャンピン。

Ｊｌ、サイエンス、２４７巻、２０５−２０９頁（１，９９０年）、ファース、 Ｊ。

Ｊｌ、ジャーナル・オフ・プロントロ／−１４６巻、Ｂ１２２−１．２４頁（１ ９９１年））。老化細胞においてβ−アクチンおよびＧＡＰＤＨ遺伝子の発現が いずれも減少したことから、ノーイン分析用にポリＡ十ＲＮＡを使用することに なった。ポリＡ＋ＲＮＡを、表２で用いられた総細胞ＲＮＡ調製物から分離し、 ＳＤｌ　ｃＤＮＡとハイブリダイズさせ、続いてβ−アクチンおよびＧ　Ａ　Ｐ 　Ｄ　Ｈそれぞれとプローブした（表３）。表３は、若い細胞（Ｙ）と老化細胞 （Ｓ）におけるＳＤＩ遺伝子発現のポリＡ十ＲＮＡノーザン分析の結果を開示す るものである。

若い細胞と老化細胞由来のポリＡ＋ＲＮＡの各１μｇを分析に用いた。各試料に おけるＳＤＩ　ｍＲＮＡの相対量は表２のように計算した。

その結果は、明らかに、β−アクチンとＧＡＰＤＨの両方の発現は、それらをｍ ＲＮＡに基づき比較した場合、以前の観察に一致して、若い細胞と老化細胞とて 等しいことを示した。ＳＤＩ遺伝子発現をｍＲＮＡレベルで比較した場合、ＳＤ Ｉ−１ｍＲＮＡは、老化細胞では１１倍増加し、それに対し、５ＤＩ−２および ５Ｄ１３の発現は、イン・ヒドロでの寿命を通して一定に保たれた（表３）。

この結果は、Ｓ　Ｌ）　Ｉ　−１が老化細胞特異的Ｉ）　Ｎ　Ａ合成阻害因子て あり、それに対し、５Ｄ１２と５１）ｌ−３は、細門包サイクル調節に関係する より一般的な阻害因子であることがほぼ間違いないと思われる。

実施例７ 細物老化中のポリ、へＲＮＡ含量の変化ポリ、へ＋ＲＮ　Ａ　、／−サン分析対 紀ＲＮＡノーザン分析の結果が定量的に異なるという観察は、総ＲＮ　Ａ調製物 中のポリ、Ａ　＋　ＲＮ　Ａ含量が、細胞老化中に変化したのかも知れないこと を示した。この仮説を試験するために、細胞を連続的に培養し、Ｋ　ＲＮ　Ａを 異なる集団倍加レベルで集めた。ポリＡ十ＲＮＡは、各試料から分離された、 結果は明らかにポリＡ　＋　ＲＮ　Ａ含量が細胞老化中に次第に減少したことを 示していた（図、１）。図・１ては、細胞を連続的に培養し、総ＲＮＡを集めた 。ポリＡ−１−ＲＮＡＪｊ’Ｊ＜Ｎへ％を培養齢（イノ・ヒドロでの寿命終了％ ）に対してプロットした。を化細胞は、非常に若い細胞と比較した場合、３−・ １倍少ないポリＡ＋Ｒ＼へを有していた。し、かじながら、細飽当たりの総ＲＮ ＡＡ量を計算した場合、老化細胞は、若い細胞より１．３　１．５倍多く有して いた（クリストファロ、■。

Ｊ　およびクリチェフスキー、Ｄ、メディカル・イクスベリンンス、１９巻、３ １３−３２０頁（１９６９年）参照）。

５ＤＩ−１情報が継代培芥中、次第に増加するのがどうが、また、迅速な増加が 、イン・ヒドロでの寿命の終了する間際に起こるのがどうかを判定するために、 異集団倍加での培養物由来のポリＡ＋ＲＮΔをｆｆ２ｐ標識５ＤＩ−１プローブ とハイブリダイズさせた。この分析から、５ＤＩ−１発現は、培養物が老化する につれて増加し、最期の数パーセント中に大きく変化することが明らかになった （表・１）。表４は、細胞加齢過程中のＳｌ］−１ｍＲＮＡの蓄積を示している 。異集団倍加の細胞由来のポリＡ＋ＲＮＡの各１ｐｇを５Ｄ１１プローブとハイ ブリダイズさせた。各試料中のＳＤＩ−１ｍＲＮＡ相対量は、表２と同様に３１ 算した。

静止中の５ＤＩ−１発現における変化もまた調べた。若い静止細胞を０．５％胎 児ウノ血清ＣＦＢＳ）　含有培地中に、３週間まで保持した。総ＲＮＡを３週集 め、５ＤＩ−１プローブとハイブリダイズするＲＮＡ量を分析した。５ＤＩ−１ 情報は、細胞静止中顕著に増加した（表５）。表５は、細胞静止中のＳＤＩ−１ ｍＲＮＡの蓄積を示している。０５％ＦＢＳ含有培地で１．２．３週間培養した 若い細胞から得られたｕＲＮＡの各４ｕｇを、５ＤＩ−１プローブとハイブリダ イズさせた。５ＤＩ−１ｍＲＮＡの相対量は、表２と同様に計算した（０１０％ ＦＢＳ培地での対間培養）。その結果をＧ　Ａ　Ｐ　Ｄ　８発現に対して標準化 すると、５ＤＩ−１発現は、２週間後、１０％ＦＢＳ培地における灯明分配培養 の値と比較して低血清培地で１８倍増加したことが見い出された。

ｍＲＮＡ対総ＲＮＡの細胞表現（ｃｅｌｌｕｌａｒ　ｒｅｐｒｅｓｅｎｔａｔｉ ｏｎ）が、細胞老化中に変化することが見い出されｔこ事実は、重要である。イ ン・ビトロでの加齢の過程中に、細胞当たりの総ＲＮへが僅かに増加するにも拘 わらず、ｍＲＮＡ６Ｊは、次第に減少することが分かった（図４）。この現象は 、細胞加齢の過程中、全遺伝子発現が次第に低下することを示しており、また、 ノーザンプロット分析を総ＲＮＡて行った場合に、老化細胞においてβ−アクチ ンとＧ　Ａ　Ｐ　Ｄ　１−１遺伝子の発現が低下したことを説明するものである （表２）。しかしながら、若い細胞と老化細胞の間のこれらのハウスキーピング 遺伝子（ｈｏｕｓｅｋｃｅｐｉｎｇ　ｇｅｎｅｓ）の発現レベルは、ノーザンブ ロソト分析をポリＡ＋ＲＮＡて行った場合では、はとんど一定であった（表３） 。この分析により、５ＤＩ−１情報は、老化細胞において強力に発現し、５ＤＩ −２および５ＤＩ−３遺伝子はイン・ビトロでの寿命を通して変化無く発現する ことが明らかになった。

実施例８ ＳＩ）ｌ−１遺伝子 ５ＤＩ−１遺伝子は、老化細胞特異的ＤＮＡ合成阻害因子をコードする。この遺 伝子の発現増加は、細胞がそれらの最終の数分裂開に入った時に起こる（表４） 。

発現動態は、老化細胞の表現型発現とよく相関している。５ＤＩ−１遺伝子発現 もまた、若い細胞を血清欠乏により静止させ、分裂しないようにした後に、増加 することが見い出された。この結果は、老化と同じく細胞静止のＤＮＡ合成阻害 においてもこの遺伝子が関与することを示している。血清成長因子の欠乏により 静止状態にされた細胞が、老化細胞由来の阻害因子と同様の特徴を持つＤＮＡ合 成阻害因子を生産することが示されている（ペレイラースミス、　Ｏ，Ｍ、等、 イクスペリメンタル・セル・リサーチ、１６０巻、２９７−３０６頁（１９８５ 年）、スティン、Ｇ、Ｈおよびアドキンス、！−８、プロン−ディング・オフ・ ナショナル・アカデミ−・オフ・サイエンンイズ・ＵＳＡ、８３巻、９０３０１ ０３４頁（１９８６年））。

５ＤＩ−１発現が老化中および静止＋４］のいずれもで増加するという事実は、 それがＤＮＡａｆｆｌ阻害因了であることを不している（スミス、Ｊ、Ｒ，、ツ ヤ−ナル・オフ・ゲロノトロ／−１４５在、ｒ３３２−３５頁（１９９０年）　 ；　本明ｍＦｎ：参照して組み込んである）。あるいは、５ＤＩ−１配列群は、 最近マウス細胞からクローン化された成長停止に特異的な遺伝子群と関係がある かも知れない（ンユナイダー、Ｃ等、セル、５４巻、７８７−７９３頁（１９８ ８年）：マンフィオレンチ、Ｇ等、モレキュラー・セル・バイオロジー、１０巻 、２９２４−２９３０頁（１９９０年））。

実施例９ ＳＤＩ−１遺伝子生産物の発現 ２種の異なる細菌性発現系において発現された５ｒ）Ｉ−１ｃＤＮＡを、イン・ ビトロで転写させ、２種の異なるイン・ビトロ系で翻訳させた。２種の細菌性発 現系は、十分雫の５ＤＩｉタンパク質を得る確率を最大限にするために用いた。

第一の発現系では、５ＤＩ−１タンパク質は、グルタチオンｓ−トランスフエラ ーセ融合タンパク質として、細菌培養物のリットル当たり５−１０μｇの収率で 発現した。組換えタンパク質をトロンビンで切断し、精製して、数個の余分なア ミノ酸を持つ５ＤＩ−１タンパク質を得ることが出来た。第二の発現系では、精 製を助けるために６ヒスチジンアミノ末端部（ｔｅｒｍｉｎａｌ　ｔａｇ）を利 用した。この組換えタンパク質は、更に手を加えること無く、使用できる。いず れの系でも、純粋なタンパク質調製物を分離可能であった。

この実験の過程ては、イン・ヒドロでの転写および翻訳系を用いて、５Ｄｌ−１ ｃＤＮＡの核酸配列から演鐸される転写解読枠（ｏｐｅｎ　ｒｅａｄｉｎｇ　ｆ ｒａｍｅ）を確認した。５ＤＩｉタンパク質の計算による分子量は、約１６．０ ００ダルトンである。イン・ヒドロで合成されたタンパク質は、ＳＤＳ　ＰＡＧ Ｅにより、約２１．０００ダルトンの相対移動度で移動する。この小さな違いは 、５ＤＩ−１の保かに異常な電荷またはフンホーメーンヨンが原因であり得る。

細菌的に発現したタンパク質の部分的なアミノ酸配列は、転写解読枠を立証する ものであった（配列番号２）。

細菌的に発現したタンパク質は、無傷の天然タンパク質に対するポリクローナル 抗血清およびモノクローナル抗体を発生させるために用いられた。このような抗 体は、５ＤＩ−１タンパク質および５ＤＩ−１タンパク質複合体（ｃｏｍｐｌｅ ｘ）の免疫沈降において、合成ペプチドから生産された抗血清よりも効果的であ り得る。予備的な免疫細胞化学研究は、１　：　２０．０００希釈てのウェスタ ン・トランスファ（ａ　ｗｅｓｔｅｒｎ　ｔｒａｎｓｆｅｒ）て融合タンパク質 と強力に反応する最も高親和性の抗血清（抗血清ナンバー５５）を用いて、５Ｄ Ｉ−１タンパク質が、分裂中の若い細胞と比較して老化細胞において相対的に豊 富であることを示唆した。老化細胞において、その位置は、核周囲であるように 見えるのに対し、若い細胞では、核内に位置した少量の５ＤＩ−１タンパク質で あるように見える。特異的に染色させるには、検出可能なレベルの５ＤＩ−１ｍ ＲＮＡを発現しない細胞（ＴＥ８５）の固定化細駒申層に対する抗血清を前辺て 吸収する必要があった。当該細胞は、・１％パラホルムアルデヒド、次にメタノ ールで固定した。

通常、低レベルで遺伝子を発現する細胞において引き起こされたＳＤＩ−１ｍ　 ＲＮ　Ａの発現から生じる細胞表現型を研究し、アンチセンス５ＤＩ−１構築物 の効果を調べるためには、５ＤＩ−１遺伝子が誘導プロモーターの制御下、安定 に調整される細胞ラインを得ることが望ましい。この目標のために、メタロチオ ニア・プロモーターの制御下、５ＤＩ−１を含有する機能的ベクターを構築した 。

二の構築物を若い増殖コンピテント細胞にトランスフエクノヨンした後、１００ ｑｌｌ塩化亜鉛と２ａＭ塩化カドミウムの存在下でインキユヘーノヨンして、Ｄ ＮＡ合成の開始を約５０９６まで阻害した。金属の不存在下では、ＤＮＡ合成の 阻害は無かった、対間ベクター（ｐｃＤＳＲα）と共にトランスフェクションし 、金属の存在下で成長させた細胞は、金属の不存在下で成長させた同じプラスミ ドと共にトランスフェクノヨノした細胞の約９０％のＤＮＡ合成能力を有するこ とが見い出さ第１ていることから、観察された阻害活性は、金属毒性が原因では ない。

５ＤＩ−１で観察された阻害効果が発現を駆動するために用いられた特定のプロ モーターの性質に関連していないことを示すために、他のプロモーターから発現 された、５ＤＩ−１のＤＮＡ合成阻害能力を調査した。それ故に、若い増殖性ヒ ト繊維芽細胞をＣＭＶ−β−ｇａｌおよびＣＭＶ−３ＤＩ−１と共に同時トラン スフエクノヨンした。ＣＭＶ−β−ｇａｌと細胞のトランスフエクノヨンは、Ｄ ＮＡ合成にほとんど影響しなかったが、一方、ＣＭＶ−３ＤＩ−１は、これらの 特定の実験におけるｐ　ｃ　Ｉ）　Ｓ　Ｒａベクターての５ＤＩ−１よりも効果 的でさえあった。

ＳＶ４０ラーノＴ抗原は、老化細胞を誘導してＤＮＡを合成させる能力がある。

それ故に、５ＤＩ−１の阻害作用が、Ｔ抗原の発現により克服され得るがどうか を決定することは、興味深いものであった。更に、５ＤＩ−１の作用が細胞にお ける一般的な代謝不均衡の誘導のせいてはないことを決定することが望まれてい た。もし、そうであれば、誰もラージＴ抗原がその効果と拮抗するとは予想しな いであろう。これらの理由により、細胞を、５ＤＩ−１ｃＤＮＡ、およびＴ抗原 がその中てＣＭＶプロモーターにより駆動されるベクターと共に同時ｉ・ランス フエクノヨンした。このような同時トランスフェクンヨン実験により、５ＤＩ− １の阻害活性は、ＳＶ４０ラー／Ｔ抗原の同時発現により大幅に破壊されること が明らかになった。

一時的トランスフエクノヨンアッセイ（Ｔｒａｎｓｉｅｎｔ　ｔｒａｎｓｆｅｃ ｔｉｏｎ　ａｓｓａｙｓ）は、追加のヒト正常繊維芽細胞細胞ライン（新生児包 皮細胞ライン（Ｃ３Ｃ３０３））および〜ＶＩ３８イモータル細胞ライン（ｉｍ ｍｏｒｔａｌ　ｃｅｌｌ　１ｉｎｅ）を用いて実施し、５ＤＩ−１の大部分の阻 害効果の普遍性を判定した。いずれの場合でも、かなりの阻害（４０−５０％） が観察された。更に、５ＤＩ−１は、ＳＶ４０形質転換細駒ラインうＭ６３９ま たはヘラ細胞（く２ｏ％）だけてなくＳＵＳＭＩ　（４０％）を阻害することが 分かった。ここまでの結果は、ヘラ細胞および５Ｖ４Ｑウイルスで形質転換され た細胞が老化細胞と融合することによって阻害されないという、ヘテロカリオン 実験から得られた以前の結果と一致している。このことは、５ＤＩ−１が、老化 細胞において以前に検出された阻害因子と同様の挙動をすることの更なる証拠を 与えるものである。

実施例１０ ＳＤＩ−１遺伝子のサザン分析 ５ＤＩ−１の不存在または不活性が不定分裂に対する４種の相補グループのいず れかにおける細胞不滅性の要因なのかどうかを判定するために、染色体ＤＮＡと ｍＲＮＡを４種のグループを代表する細胞ラインから調べた。サザン分析により 、ＥｃｏＲＩでの消化後、予想された５および１０ｋｂバンドが明らかになった 。

それ故に、これらの細胞ラインの５ＤＩ−１遺伝子中では大きな欠失または転位 は全く起っていない。ノーサン分析により、ＳＤＩ−１ｍＲＮＡは、相補グルー プＢおよびＣに割り当てられている細胞ライン中においては、少量かまたは存在 しないことが測定された。５ＤＩ−１は、相補グループＡおよびＤを代表する細 胞ラインにおいては、より高いレベルで存在した。この結果は、細胞ラインが細 胞老化をのがれ得るような機構の一部が、活性５ＤＩ−１遺伝子の充分なレベル を発現する能力の欠損によることを示唆している。

当該発明は、それらの特定の実施聾様に関連して記載されているが、それは更に 修飾出来、またこの出願は、一般に、当該発明の原理に従い、また当該発明が属 する技術分野の公知または慣用の範囲に属するような、および以上に述べた本質 的な特徴に適用され得るような、更に添付の請求範囲に従うような、本開示から の発展を含む、当該発明のどのような変形、使用または適用にも及ぶことを意ス していると理解されるてあろう。

配列表 （１）　一般的情報。

（１）　特許出願人、ベイラ町カレッジ・オフ・メディシン（ｉｌ）　発明の名 称　老化細胞由来ＤＮＡ合成阻害因子（Ｊ　配列の数　２ （ｔｖ）　連絡先 （Ａ）　名宛人　ヴアイル、ゴッチャル・アンド・メンジェス（Ｂ）　４リ　エ ヌ・ダブリュー、エル・ストリート、１６１５番地（Ｅ）　国・アメリカ合衆国 （Ｆ）　ＺＪＶ：２００３６ （Ｖ）　コンピューター解読書式・ （Ａ）　媒体型　フロッピー・ディスク（Ｂ）　コンビ、−ター　ＪＢＭＰＣコ ンパティプル（Ｃ）　ｔベレ−テ４　ング・ノステＬ：　ＰＣ−ＤＯ３／ＭＳ− ＤＯ８（Ｄ）　ソフトウェア　ＰａｔｅｎＬＩｎ　Ｒｅ１ｅａｓｅ　＃１．　Ｑ ＳＶｅｒｓｉｏｎ　＃１．２５（ｖｉ）　本出願のデータ （Ａ）　出願番号・ （Ｂ）　出願日・ （Ｃ）　分類。

（憾）　優先権出願データ （Ａ）　出願番号：　ＵＳ　０７／８０８．５２３（Ｂ）　出願日＋１９９１年 １２月１６日（ｖｊ）　弁理士／代理人情報 （Ａ）　氏名・オイエルバッハ、ンエ７　リ−、フイ（Ｂ）　ｕｉｉ番号：　３ ２．６８０ （Ｃ）　参ｆｆｌ、４！理１：２２５−１０２−ＣＩＰ（ｉｘ）　Ｎ話連絡先情 報 （Ａｌ　電話番号　（２０２）６８２−７０３３（Ｂ）　フ７７クス番号　（２ ０２）８５７−０９３９（２）　配列番号１の情報 （１）　配９りの特徴 （Ａ）　長さ　２１０６塩基対 （Ｂ）　型　核酸 （Ｃ）　鎖の数　−末鎖 （Ｄ）　トポロ／−直鎖状 （ｉｉ）　ｋ列の種類　ｃ　Ｄ　Ｎ　Ａ（ｉｉｉ）　ハイポセティカル　Ｎ。

（ｉｖ）　アンチセンス゛Ｎ。

（ｖｉ）　起源 （Ａ）生物名　ホモ・サピエンス （Ｂ）細胞の種類、老化ヒト細胞 （■）　直接の起源 （へ）ライブラリー名　老化細胞由来ｃＤＮＡライブラリー（Ｂ）クローン名　 ５ＤＩ−１ （Ｘ］）　配列　配列番号１ 弱＾ｃｘｃ’ｒｃ’ｒｃ　ＡＧＧＧＴＣＧＡＡＡ　ＡＣＭＣＧＧＣＡＧ　ＡＣＣ ＡＧＣＡＴｌｆｆＡ　ｅＡｃＡ’ｒ’！ＴＣＴＡ　ＣＣＡＣsＣＣＡＡＡ　５４ ０ Ｃ’Ｇ（ＣＣＧＣＴＧＡτＣ’ＴＴＣＴＣＣＡＡ　ＧＡ図ＡＡＧＣＣＣＴｋｋＴ ＣＣＭＣＣＣ＾ＣＡＧＧＡＡＧＣＣ’ｒＧｃＡＧτＣＣＴＧ@６００ ＡＡＡＡＡＡ２１０６ （２）　配列番号２の情報 （１）　配列の特徴 （Ａ）　長さ　１６４アミノ酸 （Ｂ）　型　アミノ酸 （Ｄ）　トポロジー　直鎖状 （■）　配列の種類　タンパク質 （ｉｉ）　ハイポセティカル　Ｎｏ （ｉｖ）　アンチセンス　Ｎｏ （ｖｉ）　起源： （Ａ）生物名・ホモ・サピエンス （Ｂ）ストレイン　５ＤＩ−１ （ｖｉ）　直接の起源 （Ａ）ライブラリー名　老化細胞由来ｃＤＮＡライブラリー（ｉ）　配列・配列 番号２ ＡＬａ　Ｃｙｓ　入ｒｇ　入ｘｑ　ｔａｕ　Ｐｈ＠　ＱＬｙ　ｐｒｏ　Ｖａｌ　 Ａｌｐ　Ｓ＠ｒ　ＧＬｕ　Ｇｉｎ　Ｌａｕ　Ｓ＠ｒ　Ａｒ９Ａｓｐ　Ｃｙｌｌ　 Ａｌｐ　ＡＬａ　ＴＡｕ　Ｍａｔ　Ａｌａ　Ｇｌｙ　Ｃｙｍ　Ｉｌｅ　Ｇｉｎ　 ＧＬｕ　ＡＬａ　入ｒｇ　ＧＬｕ　入ｘ■ で’Ｐ　入＠ｎ　ｉ’ｈ＊　Ａｓｐ　ｔｈｅ　Ｖａｌ　テｈｒ　（ｌｕ　Ｔｈｒ 　Ｐｒｏ　ＴＡｕ　Ｇｌｕ　Ｇｌｙ　Ａｓｐ　Ｐｈ・　Ａｌ■ ｓｏ　ｓｓ　ｓ。

τｒｐ　Ｇｌｕ　ｋｒｑ　Ｖａｌ　ｋｘｑ　Ｇｌｙ　Ｌｓｕ　Ｇｌｙ　Ｌａｕ　 Ｐｒｏ　ＬＹ＃　Ｌａｕ　Ｔｙｒ　Ｌａｕ　Ｐｒｏ　Ｔｈｒ６５　７０　７５　 ＢＯ Ｇｌｙ　Ｐｒｏ　Ａｒｑ　入ｘｑ　Ｇｌｙ　入ｘｑ　入−ｐ　ＧＬｕ　Ｌａｕ　 Ｃ１ｙ　Ｃ１ｙ　Ｃ１ｙ　入ｒｑ　入ｒｇ　Ｐｒｏ　ＧＬｙ丁ｈｒ　５＊ｒ　Ｐ ｒｏ　ＡＬａ　Ｌｓｕ　ｆ、ｅｕ　Ｇｉｎ　ＧＬｙ　Ｔｈｒ　ＡＬａ　Ｇｌｕ　 ＧＬｕ　Ａｓｐ　ＦＩＬｍ　ＶａＬ　Ａ唐■ ｌｏｏ　１０５　１１０ Ｌ＠ｕ　Ｓ＠Ｉ−Ｌ＠ＬＩ　Ｓｓｒ　Ｃｙ−Ｔｈｒ　Ｌ＠１１　Ｖａｔ　Ｐｒｏ 　入ｒｇ　５ｅａｔ　ＧＬｙ　Ｃ１ｕ　Ｇｉｎ　ＡＬａ　Ｇkｕ Ｇｌｙ　Ｓｓｒ　Ｐｒｏ　ＧＬｙ　Ｇｌｙ　Ｐｒｏ　Ｇｌｙ　Ａｓｐ　Ｓｅ【　 Ｇｉｎ　ＧＬｙ　ｋｔｑ　ＬＹ＠　入ｒｇ　Ａｒｇ　Ｇ１ｎＬＹ＠　ｋｒｑ　Ｌ Ｙ＠　Ｐｒ。

％早ＩＴ＋１ ％呈田 ９６ＶＮＨ＋Ｖ（＋ｋＣＤＶＮ’ｄｎ Ｉｔ　ｃｃｔ　ｇｃｃ　ｇａｏ　ｇｔｃ　ｃｉｇｔ　ｔｃｃ　ｔｔｇ　ｔｇｇ　 αｇｃ　ｃｇｇ　（１９Ｃｔｇｇ　ｇｃｇ　ｃｇｇ　αｔ【 ５Ｂ６＋　ｃｏｇ　ｃｃｔ　ｇｃｎ　ｇｔｃ　ｃｔｇ　９（ＩＱ　ｇｃｇ　ｃｇ ｎ　ｇｇｇ　ｃｃｔ　ｃｒｓａ　Ｑ９９　（：ＣＣｇｃｔ　モ狽■ ６１１　：　ｃｌｌｔ　ｃｔｔ　ｃｔｇ　ｃｃｔ　ｔｏｇ　ｔｃｔ　ｃαｇ　ｔ ｔｔ　ｇｔｇ　ｔｇｔ　ｃｔｔ　ｎｏｔ　ｔｌｌｔ　ｔｎｔ@ｔｔｇ ６７６；　ｔｇｔ　ｔｔｔ　Ｑｃｔ　ｔｔα１１（ＬＣ：　ｃｈｃｃ　ｔｃｃ　 ｔｃｎ　ｔｇｔ　αｃαｔｃｃ　ｃｃｔ　ｇｇｃ　ｃｇｃ　モモ■ ７２１　＋　ｃｔｇ　ｃｃｃ　ＣＣＣ（Ｌ９Ｃｃｔｃ　ｔｇｇ　ｃＱｔ　ｔｃｈ ｇ　ａｎｔ　ｔａ’ｃ　ｔｔａ　ａａｃ　ａｃｈａ　ＱＱＣ狽獅■ ７６６＋　ｇｃｇ　ｇｔｔ　ｇａｏ　ｔｇｃｉ　ｇｎｇ　ｇｔｔ　ｃｃｔ　（Ｌ （１９ｎｇｔ　ｇｃｔ　ｇｇｇ　ｃＱｔ　ｔｔｔ　ｔｕｔ　狽狽■ ８１１＋　ｎｔｇ　ααａ　ｔＬｌｃ　ｔｕｔ　ｔｔｎ　ＱＱ９　ｃｃｔ　ｃｃ ｔ　ｃａｉ　ｃｃｃ　ｇｔｇ　ｔｔｃ　ｔｃｃ　ｔｔｔ　ｔモ■ ８５６＋　ｔｃｔ　ｃｔｃ　ｃｃｇ　ｇα９　ｇｔｔ　（ｌｉｌ１９　ｔ９９９ Ｃ（−９９Ｃ且ｃ　ｃｔｇ　ｃｃａｇｃｔ　Ｑｃｔ　ｔｃｃ９０１＋　ｔｃｃ　 ｔｃｃ　ｃｃａ　Ｃ且　９モｃ　ｃｇｃ　ｔｇｇ　ｇｔｇ　ｇｔａ　ｃｃｃ　ｔ ｃｔ　ｇｇα　９９９　９ｔ９　ｔ９９９４６＋　ｃｔｃ　ｃｔｔ　ｃｃｃ　Ｑ ｔｃ　ｇｃｔ　ｇｔｃ　αＣα　ｇｇｃ　ｇｇｔ　ｆａｔ　ｇａｏ　αｔｔ　ｃ αｃ　ｃｃｃ　ｃｔ■ ９９し　ｔｃｃ　ｔｇｇ　ＱＣＣＬ　ｃｔｃ　αｇｏ　ｃｃｔ　ｇＩ１１αｔｔ ｃ　ｔｔｔ　ｔｔｃ　ｃｔｔｔ　ｔｇｃ　９（ＩＱ　ｇｔｃ@ａαｃ １０］６＋　ａｇｏ　ｔｇｇ　ｃａｒ＋且９（Ｌ（ｌ　ｇｇｇ　ｇｃｃ　ｔｃａ 　ｃｃｇ　ｏｇｔ　ｇｇｇ　ｇｇｃ　ａｔｃ　ｃｔｃ　ａａ■ ｌｏ（１１＋　ａａｃ　ｔｔｔ　ｇｇａ　ｇｔｃ　ｃｃｃ　ｔｃｎ　ｃｃｔ　ｃ ｃｔ　ｃｔｏ　ａｇｇ　ｔｔｇ　ｇｇｃ　ａｇｇ　ｇｔｇ　P１ｃｃ １１２６＋　ｃｔｇ　ａａｇ　ｔｇｎ　ｇｃｏ　ＣＱ（ｌ　ｃｃｔ　Ｑ９９　ｇ ｃｔ　ｇａｇ　ｃｔｇ　ｇｇｇ　ＱＣＣｔｇｇ　ｔａｃ　ｃmｔ １１７１Ｉｃｃｔ　ｇｇｃ　ｔｃｔ　ｔｇａ　ｔａｃ　ｃｃｃ　ｃｃｔ　ｃｔｇ 　ｔｃｔ　ｔｇｔ　９αａ　、ｇｇｃ　（Ｌ１２　ｇｇｇ　iＬＱ９ １２１６＋　ｇｔｇ　ｇｇｇ　ｔｃｃ　ｔｇｇ　ＣＱＣ［１９（１ｃｃａ　ｃｃ ｃ　ｃｇｃ　ｃｔｇ　ｃｃｃ　ｔｃｕ　ｔｇｇ　ｃｃｃ　ｃ狽■ １２６１＋　ｔｇａ　ｃｃｔ　ｇｃｎ　ｃｔｇ　ｇｇｇ　ａｇｃ　ｃｃｇ　ｔｃ ｔ　ｃａｇ　ｔｇｔ　ｔｇｎ　ｇｃｃ　ｔｔｔ　ｔｃｃ　ｃ狽■ ｌ］０６＋　ｔｔｔ　ｇｇｃ　ｔｃｃ　ｃｃｔ　ｇｔｃｉ　ｃｃｔ　ｔｔｔ　ｇ ｎｇ　ｇｎｇ　ｃｃｃ　ｃａｇ　ｃｔｎ　ｃｃｃ　ｔｔｃ　狽狽■ １３５１　ｔｃｃ　ＣＱＣｔｇｇ　ｇ己ｃｔｇ　ｃａａ　ｔｔｃ　ｃｃｃ　ｔｃ ｔ　ｇｃｔ　ｇｃｔ　ｇｔｃ　ｃｃｔ　ｃｃｃ　ｃｃｔ１３９６＋　ｔｇｔ　ｃ ｃｔ　ｔｔｃ　ｃｃｔ　ｔｃａ　ｇｔＩｌｃｃｃ　ｔｃｔ　ｃｎｇ　ｃｔｃ　ｃ ｎｇ　ｇｔｇ　ｇｃｔ　ｃｔｇ　ｗ■■ １４４し　ｔｇｃ　ｃｔｇ　ｔｃｃ　ＣＱＣＣＣＣｃｃｓｃ　ｃｃｃ　ｃｃ＞ｇ 　ｃｔｃ　ａｎｔ　９９（Ｌ　ｃｔｇ　ｇａａ　ｇｇｇ　ｇ≠■ Ｌ４８６＋　ｇｇｇ　ａｃａ　ｃｗｃ　ｎｃｌｇ　（Ｉｎ２　ｎａｇ　ｇｇｃ　 ｔｉｃｃ　ｃｔｎ　ｇｔｔ　ｃｔｕ　ｃｃｔ　ＣＱ９　ｇｃ氏@ｇｃｔ １５］Ｉ　Ｉ　ｃａａ　ｇｃｃ＞　ｇｃｇ　Ｌｌｌｃｃ　ｇｃｃ　ｃｃｃ　ｔｃ ｃ　ｔｃｔ　ｎｇｃ　ｔｇｔ　ｇｇｇ　ｇｇｔ　ｇｃｉｇ　■■煤@ｃｃｃ １５７６＋　ｏｔｇ　ｔｇｇ　ｔｇｇ　ｃｃｉｃ　ｃｉｇｇ　ｃｃｃ　ｃｃｔ　 ｔｇｎ　ｇｔｇ　ｇｇｇ　ｔｔｏ　ｔｃｔ　ｃｔｇ　ｔｇｔ@ｔａｇ １６２し　ｇｇｇ　ｔ（１ｔ　ｎｔｇ　ｎｔｇ　ｇｇｇ　９Ｑ９　ｔａｇ　ｎｔ ｃ　ｔｔｔ　ｃｔａ　ｇｇａｇｇｇ　ｎｇｎ　ｃａｃ　ｔｇ■ １６６６＋　ｃｃｃ　ｃｔｃ　ａａａ　ｔｃｇ　ｔｃｃ　ＣＬ９Ｃ９Ｑｌ：　ｃ ｔｔ　ｃｃｔ　ｃａｔ　ｒｃｎ　ｃｃｃ　ｃａｔ　ｃｃｃ　狽モ■ ｌＧ、５Ｃ １７１１＋　Ｃ（Ｑ　ｇｔｔ　ａｃｔ　ｔｇｃ　ａｃｔ　ｔｔｇ　ｎｔｔ　ｎｇ ｃ　ｎｇｃ　（１９Ｑ　ａｃａ　ａｇｇ　ａｇｔ　ＣＱ（］@ｃｉｃａ １７５６＋　ｔｔｔ　ｔＱｎ　ｇｅｔ　ｇｇｔ　ｇｇｃ　ｎｇｔ　（１９Ｑ　ｇ ｇｃ　ｔｃｔ　９９Ｑ　ＣＱ９　ｇｇｃ　ｎｔｇ　ｃｃｎ　モ■■ ｌＢＯｌ＋　ｇｇｇ　ｃｔ、＝　ｎｔｕ　ｔｇｇ　ｇｇｃ　ｔｇｇ　ｇａｇ　ｔ ａｇ　ｔｔｇ　ｔｃｔ　ｔｔｃ　ｃｔｇ　ｇｃａ　ｃｉａ　≠モ■ １８４６Ｉｔｔｇ　ｃｇｃ　ｃｃｃ　ｔｇｇ　（Ｌ（１９ｃａｃ　ｔｇｎ　ａｇ ｔ　ｇｃｔ　ｔａｇ　ｔｇｔ　ｃｔｃｔ　ｔｇｇ　ｎｇｔ　獅狽■ １Ｂ９１＋ｇｇｇ　ｇｔｃ　ｔｇｏ　ｃｃｃ　ｃααα〔αｃｃｔ　ｔｃｃαｇ ｃ　ｔｃｃ　ｔｇｔαｃｔｃαｔαｃｔｇ　ｇｃｃ１９”１６＋　ｔｇｇ　ａｃ ｔ　ｇｔｔ　ｔｔｃ　ｔｃｔ　ｃ−ｇｇ　ｃｔｃ　ｃｃｃ　ａｔｇ　ｔｇｔ　ｃ ｃｔ　ｇｇｔ　ｔｃｃ　ｃｇｔ@ｔｔｃ １９８１　＋　ｔｃｃ　ａｃｃ　ｔａｇ　ａｃｔ　ｇｔＱｃｈｈｃ　ｃｔｃ　ｔ ｃｇ　ｎｇｇ　ｇｃｎ　ｇｇｇ　ａｃｃ　ｃ＞ｃｎ　ｃｃｃ@ｔｇｔ ２０２６ｔ　ｈｃｔ　ｇｔｔ　ｃｔｇ　ｔｇｔ　ｃｔｔ　ｔｃｃｃ　ｃｎｇ　ｃ ｔｃ　ｃｔｃ　ｃｃｎ　ｃａａ　ｔｇｃ　ｔｇｎ　ｔｕｔ　■モ■ ２０７１　＋　ｇｃＬｌｇｇｔ　ｇｃｔ　ｃａａ　ｔＱｎ　αｃｇ　ａｔｔ　ｃ ｔｔ　ｎｇｔ　９（Ｌｌｌ　ａａａ　αａａＦＩＧ、５Ｄ フロントページの続き （８１）指定国　ＥＰ（ＡＴ、ＢＥ、ＣＨ，ＤＥ。

ＤＫ、ＥＳ、ＦＲ，ＧＢ、ＧＲ，ＩＥ、ＩＴ、ＬＵ、ＭＣ，ＮＬ、ＰＴ、ＳＥ） 、ＡＵ、ＣＡ、ＪＰ

Claims (15)

【特許請求の範囲】
1. １．受容細胞におけるＤＮＡ合成を阻害する能力のあるタンパク質をコードする 核酸分子。
2. ２．該分子がＤＮＡであり、かつＤＮＡプラスミドに組み込まれている、請求の 範囲１項記載の核酸分子。
3. ３．該分子かＳＤ１−１である、請求の範囲２項記載の核酸分子。
4. ４．該分子が図５＜配列番号１＞で示される配列を有する、請求の範囲２項記載 の核酸分子。
5. ５．該プラスミドがｐｃＤＳＲαΔである、請求の範囲３項記載の核酸分子。
6. ６．該分子がＲＮＡである、請求の範囲１項記載の核酸分子。
7. ７．請求の範囲６項記載のＲＮＡ分子に相補的な配列と、該分子を生理学的条件 下でもう一方とハイブリダイズさせるのに十分な長さを有する核酸分子。
8. ８．ＲＮＡ分子である、請求の範囲７項記載の核酸分子。
9. ９．ＤＮＡ分子である、請求の範囲７項記載の核酸分子。
10. １０．受容細胞におけるＤＮＡ合成を阻害する能力を有するタンパク質をコード する核酸分子の有効量をヒト細胞に与えることを含んで成る、ヒト細胞における ＤＮＡ合成を阻害する方法。
11. １１．該細胞が腫瘍細胞である、請求の範囲１０項記載の方法。
12. １２．該細胞がイン・ビトロ培養における細胞である、請求の範囲１０項記載の 方法。
13. １３．受容細胞におけるＤＮＡ合成を阻害する能力を有するタンパク質をコード するＲＮＡ分子に相補的な配列を有し、該核酸分子および該ＲＮＡ分子を生理学 的条件下でもう一方とハイブリダイズさせるのに十分な長さを有する核酸分子の 有効量をヒト細胞に与えることを含んで成る、静止または老化ヒト細胞における ＤＮＡ合成の阻害を抑制解除させる方法。
14. １４．該細胞が皮膚細胞である、請求の範囲１３項記載の方法。
15. １５．該細胞か損傷または火傷組織に存在する、請求の範囲１３項記載の方法。