JP2002514043A

JP2002514043A - 内胚葉、心臓、および神経の誘導因子

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Publication number: JP2002514043A
Application number: JP50346798A
Authority: JP
Inventors: ロバーティス、エドワードエム．デ; ボウメスター、テウィス
Original assignee: THE REGENTS OF THE UNIVERSITY OF CARIFORNIA
Current assignee: THE REGENTS OF THE UNIVERSITY OF CARIFORNIA
Priority date: 1996-06-20
Filing date: 1997-06-19
Publication date: 2002-05-14
Also published as: AU723210B2; EP0973391A1; ATE326138T1; WO1997048275A1; CA2258789A1; AU3576597A; DE69735897D1; EP0973391A4; US6133232A; EP0973391B1

Abstract

(57)【要約】新規なタンパク質をそれぞれ「サーベラス」および「ｆｒｚｂ−１」と命名した。サーベラスは、アフリカツメガエル胚の発生の過程で分泌されるペプチドとして発現され、頭部形成体領域に特異的に発現される。この新規な分子は、内胚葉、心臓、および神経組織の誘導活性を有しており、そのことは、これらのおよび他の組織の再生、分化、または修復を必要とする、治療、診断、およ臨床への適用に有用であることを証明するはずである。Ｆｒｚｂ−１は、細胞外空間においてＷｎｔ成長因子に結合することによって作用する、Ｗｎｔファミリーの成長因子の可溶性の拮抗物質である。第三の新規なタンパク質はＰＡＰＣと命名され、胚における背部中胚葉および体節の形成を促進する。

Description

【発明の詳細な説明】内胚葉、心臓、および神経の誘導因子技術分野本発明は、概して成長因子、神経栄養因子、およびそれらの阻害剤に関し、特に、神経、内胚葉、および心臓組織を誘導する活性を有するいくつかの新規な成長因子と、当該因子を含んでいる複合体ならびに組成物と、当該因子のための配列をコードしているDNAおよびRNAに関する。さらに、当該成長因子の一つは、腫瘍抑制遺伝子治療に有用と考えられる。本願は、１９９６年６月２０日出願の米国仮出願第６０／０２０、１５０号の恩典を請求する。本発明は、国立衛生研究所（ＮＩＨ）により授与された、助成金契約番号ＨＤ −２１５０２による政府の援助のもとに行なわれた。政府は本発明において一定の権利を有する。背景技術成長因子は、インビボまたはインビトロにおいて動物細胞の限定された集団の成長に影響を及ぼすが栄養物質ではない、ポリペプチドホルモンのような物質である。組織の成長および分化に関係するタンパク質は、成長を促進または阻害する能力や、分化を促進または阻害する能力を有し得、従って、「成長因子」という概括的な用語にはサイトカイン、栄養因子、およびそれらの阻害剤が含まれる。一般的な神経細胞の死は、中枢ならびに末梢神経系の正常な発生に伴うものである。発生中の末梢の標的組織の研究は、神経細胞死が、限られた量の生存因子（「神経栄養因子」）をめぐるニューロン間の競合の結果であることを示した。これらのうち最も早く同定された神経成長因子（「ＮＧＦ」）は、最も完全に特質が解明されており、ニワトリおよびラットの両者の初期発生の間の交感神経性および神経冠由来の感党ニューロンの生存に必須であることが示されている。神経栄養因子の一つのファミリーはＷｎｔ類であり、それらは背軸誘導活性を有する。ほとんどのＷｎｔタンパク質は細胞表面に結合している。（例えば、So kol等、Science，249，第561‐564頁、1990参照。）アフリカツメガエル胚におけるこのファミリーの一員（Ｘｗｎｔ−８）による胚軸誘導活性は、1991年に、 SmithおよびHarlandによりCell，67，第753‐765頁に記載された。著者等は、紫外線照射により腹側決定されている胚において、背方の発生を奪還するための背方のパターニング（patterning）に関係している、内在性のＲＮＡを同定するための戦略として、ＲＮＡ注入を用いることを記載した。成長および神経栄養因子ファミリーのもう一つの一員は、HarlandおよびSmith により実質的に発見および記載されており、彼等はそれを「ノジン（ｎｏｇｇｉｎ）」と命名した。（Cell，70，第829‐840頁(1992)。）ノジンは、ニュークープ（Nieuwkoop）中心においては母方由来の転写物の力により、またシュペーマンの形成体においては接合子の形成体に特異的な発現を通して、信号物質として機能するための良好な候補である。ノジンの他には、他の分泌された因子類が形成体現象に関係しているであろう。「コルディン（ｃｈｏｒｄｉｎ）」と命名された、アフリカツメガエルのもう一つの遺伝子は、シュペーマンの形成体において発現され始めることと、腹側化された胚において軸発生を完全に救済できることがsasai等により報告された(Ce ll，79，第779‐790頁，1994)。中胚葉を背方化することに加えて、ｃｈｏｒｄｉｎは神経組織を誘導する能力を有しており、その活性は骨形成タンパク質４により拮抗される(Sasai等、Nature，376，第333‐336頁，1995)。従って、アフリカツメガエル胚の背唇またはシュペーマンの形成体は、新規な成長および神経栄養因子類を探すための理想的な組織である。新規な成長および神経栄養因子類は有用な薬剤であり、特に生理学的に活性があり可溶性の形態で用いることが可能であるよう分泌されるものは、これらの因子類、そのレセプター、その配列をコードしているＤＮＡまたはＲＮＡ、およびそのフラグメントが、数多くの治療、臨床、研究、診断、およびドラッグデサインへの応用に有用であるという理由から、有用な薬剤である。発明の開示本発明の一つの局面においては、実質的に精製された形にすることが可能な新規なペプチドの配列が、配列番号Ｎｏ：１によって示される。アフリカツメガエル由来の配列番号Ｎｏ：１は、「サーベラス（ｃｅｒｂｅｒｕｓ）」と命名されており、このペプチドは脊椎動物において発現された場合には、内胚葉、心臓、および神経組織の発生を誘導することができる。発現された結果ｃｅｒｂｅｒｕｓを生じるヌクレオチド配列は、配列番号Ｎｏ：２によって例示される。本発明のペプチドは脊椎動物において、内胚葉、心臓、および神経組織の発生を誘導するがゆえに、数多くの治療、臨床、および診断への応用のために生理学的に活性な形で調製され得るはずである。サーベラスは、シュペーマンの形成体において特異的に発現された分泌シグナル配列を含んでいる分子を捜す間に単離された。サーベラスに加えて、他の二つの新規なｃＤＮＡが同定された。配列番号Ｎｏ：３から推論されるアフリカツメガエル由来のペプチドは、発明者等が早期に「フラズルド（ｆｒａｚｚｌｅｄ）」と命名した、アフリカツメガエル胚において背方化活性を有する３１８個のアミノ酸から成る分泌タンパク質である、新規なタンパク質をコードしている。発明者等は、現在この新規なタンパク質を「ｆｒｚｂ−１」と命名している。ｆｒｚｂ−１の遺伝子は、多くの動物の多くの成体組織において発現されており、三つのｃＤＮＡ（アフリカツメガエル、マウス、およびヒト）が発明者等によりクローン化されている。当該遺伝子の、アフリカツメガエル、マウス、およびヒトのｆｒｚｂ−ｌｃＤＮＡ配列の公式承認番号は、それぞれＵ６８０５９、Ｕ６８０５８、およびＵ６８０５７である。Ｆｒｚｂ−１は、細胞膜を７回貫通するタンパク質をコードしていることが示されており、そのタンパク質がシグナルおよびレセプタータンパク質として作用することが可能であるショウジョウバエの遺伝子ｆｒｉｚｚｌｅｄと、ある程度の配列の類似性を有する(Vinson等、Nature，338，第263‐264頁、1989;V insonおよびAdler，Nature，329，第549‐551頁、1987)。脊椎動物でのＦｒｉｚｚｌｅｄの相同物が単離されており、それらも７つの膜にかかったドメインにより細胞膜に固定されていることがわかっている(Wang等、J.Blol.Chem.，271，第 4468‐4476頁、1996)。Ｆｒｚｂ−１は、完全に可溶性かつ拡散性の分泌タンパク質であり、従って治療用の薬剤として適しているという点で、ｆｒｌｚｚｌｅｄタンパク質とは異なる。発現された結果ｆｒｚｂ−１タンパク質となる、アフリカツメガエルに由来するヌクレオチド配列は、配列番号ＮＯ：４によって例示される。マウスに由来するｆｒｚｂ−１タンパク質は、配列番号ＮＯ：７に示され、一方マウスｆｒｚｂ−１ヌクレオチド配列は、配列番号ＮＯ：８である。ヒトに由来するｆｒｚｂ−１タンパク質は、配列番号ＮＯ：９に例示され、ヒトｆｒｚｂ−１ヌクレオチド配列は、配列番号ＮＯ：１０である。ｆｒＺｂ−１は、インビボにおけるＷｎｔｓの拮抗物質であり、従って、Ｗｎｔタンパク質の過度の発現が癌を引き起こすことから、腫瘍抑制遺伝子としての実用性が見い出されると信じられている。ｆｒＺｂ−１はまた、これと複合体を形成しているｗｎｔタンパク質の可溶化および治療のためのデリバリーに有用な媒体ともいってよい。シグナル配列を含んでいる、単離された最終的なｃＤＮＡは、結果的にはパラキシャルプロトカドヘリン（ＰａｒａｘｉａｌＰｒｏｔｏｃａｄｈｅｒｉｎ）（ＰＡＰＣ）と命名されたペプチドに終わる。ＰＡＰＣのｃＤＮＡは、カドヘリン多重遺伝子ファミリーの分岐した一員である。ＰＡＰＣは、Sano等によって報告されたプロトカドヘリン４３（The EMBO J．，12，第2249‐2256頁、1993）に最も関係している。配列番号ＮＯ：５に示すように、ＰＡＰＣ遺伝子は８９６個アミノ酸の膜貫通タンパク質をコードしており、そのうち１８７個は細胞内ドメインの部分である。ＰＡＰＣは細胞接着分子であり、アフリカツメガエル胚へのＰＡＰＣｍＲＮＡ構成物のマイクロインジェクションにより、ＰＡＰＣが中胚葉の分化に関係する分子として作用することが示唆されている。ＰＡＰＣの細胞外ドメインの可溶型は、アフリカツメガエル胚において筋肉および中胚葉の形成を妨げることができる。アフリカツメガエルのＰＡＰＣをコードしているヌクレオチド配列は、配列番号ＮＯ：６に供されている。ｃｅｒｂｅｒｕｓ、ｆｒｚｂ−１、またはＰＡＰＣか、あるいはそれらのフラグメント（インビトロの方法により合成されてもよい）は、(組み換え体の発現またはインビトロの共有結合による方法により)免疫原性ポリペプチドに融合され、次いでこれを用いて、この新規なタンパク質に対して抗体を高めるために動物に免疫化してもよい。抗体は、免疫化された動物の血清から回収することができる。代りに、モノクローナル抗体を、免疫化した動物の細胞から通常のやり方で調製してもよい。固定化された抗体は、特に（インビトロおよびインビボにおける）診断またはｃｅｒｂｅｒｕｓ、ｆｒｚｂ−１、またはＰＡＰＣの精製に有用である。当該新規のポリペプチドの置換、欠損、または挿入による突然変異体は、インビトロまたは組み換え法により調製されてよく、サーベラス、ｆｒｚｂ−１、またはＰＡＰＣとの交叉反応性についてと、サーベラス拮抗物質または作用活性とについてスクリーニングされしてもよい。サーベラスまたはｆｒｚｂ−１はまた、インビトロにおいて、固定化または標識されたタンパク質を調製するため、特にそれらの機能不全の診断のため、またはそれらに対する抗体の親和性利用による精製のため、誘導体化されてよい。当該新規のタンパク質の傑出した応用は、組織置換療法および、ｆｒｚｂ−１がＷｎｔのシグナル化の拮抗物質であることから、腫瘍抑制療法である。ｃｅｒｂｅｒｕｓのレセプターは、新規なシグナル化経路を規定しうる。さらに、ｆｒｚｂ−１は、成長因子のＷｎｔファミリーの新規なメンバーの単離を可能にした。図面の簡単な説明第１図は、第２図のサーベラスのｃＤＮＡクローンからの、アミノ酸配列（配列番号ＮＯ：１）を例示しており；第２図は、アフリカツメガエル由来のサーベラスのｃＤＮＡのクローン（配列番号ＮＯ：２）を例示している。センス鎖は上部（５'から３'の方向）であり、アンチセンス鎖は下の列（反対向き）であり；第３および４図は、アフリカツメガエル由来の完全な長さのｆｒｚｂ−１の、それぞれアミノ酸およびヌクレオチド配列（配列番号ＮＯ：３および４）を示しており；第５および６図は、アフリカツメガエル由来の完全な長さのＰＡＰＣの、それぞれアミノ酸およびヌクレオチド配列（配列番号ＮＯ：５および６）を示しており；第７および８図は、マウス由来の完全な長さのｆｒｚｂ−１の、それぞれアミノ酸およびヌクレオチド配列（配列番号ＮＯ：７および８）を示しており；第９および１０図は、ヒト由来の完全な長さのｆｒｚｂ−１の、それぞれアミノ酸およびヌクレオチド配列（配列番号ＮＯ：９および１０）を示している。発明を実施するための最良の形態本明細書に記載される数個の新規タンパク質及びそのヌクレオチド配列の中で、本発明者らが「サーベラス」と命名したタンパク質は、脊椎動物の新規な内胚葉、心臓及び神経の誘導因子である。本発明において、「サーベラス」というときには、サーベラス分子のフラグメント、誘導体、作用薬、又は拮抗物質の使用をも含むことを意図する。サーベラスは報告されたどの成長因子ともホモロジーを有していないので、強力な生物活性を有する成長因子の新しいファミリーメンバーの基礎となると考えられる。サーベラスは、配列番号：２を用いて単離できる。両生類の形成体は、領域−特異的誘発活性を有するいくつかの細胞集団からなる。形態形成活動に基づいて、３つの非常に異なる細胞集団が形成体の内で区別される。第１は、這うような移動活動をする細胞は退縮し、展開して脊索前方板を形成する。第２は、細胞は集合と伸長活動によって、体幹の脊索の基となる背唇部を経由して退縮する。第３は、退縮が終了し、中外側への挿入運動が継続して後期伸長運動が起こり、尾部脊索と脊索神経ヒンジが形成される。この３つの細胞集団は、それぞれ、頭部、体幹及び尾部形成体に対応する。サーベラス遺伝子は正しい時と場所で発現し、シュペーマンの形成体によって、細胞のシグナリングに関与する。特に、サーベラスは、這うように移動する細胞からなる頭部形成領域で発現する。サーベラス発現領域は将来の前腸に対応し、肝臓及び膵臓原基並びに心臓中胚葉を含む。サーベラス発現はクロディン、ノジン、及び形成体特異的ホメオボックス遺伝子で活性化される。本発明者らの研究は、アフリカツメガエル（ゼノプスレービス）の初期胚を用いて行われた。このカエルの胚は実験に最適である。特に、胚内で領域の差異の発生と維持に関する実験ができるので、これらの組織分化における役割が決定できる。胚の培養が容易なので、分化の非常に早い段階からでも胚にアクセスでき(身体パターンの形成及び分化の前及びその間)、かつ、胚自体が大きい。ノジン及びクロディンを用いる初期の研究もまた、アフリカツメガエルの胚で行われ、そして、予想されたように、脊椎動物間で、高度に保存されていた。アフリカツメガエルを用いた研究に基づく予測がヒトノジンにも当てはまることは、真実であることが証明され、ヒトノジンの遺伝子が容易にクローンニングされた。( アフリカツメガエルに関する研究の記載を参照のこと。クローニングに関する情報は、１９９４年３月１７日に公開されたＰＣＴ出願WO9,405,800、及びこれに基づき、引き続き行われたヒトのクローニングは、又、１９９４年３月１７日に公開されたＰＣＴ出願WO9,405,791に記載されている)。クローニングサーベラス、ｆｒｚｂ−１、及びＰＡＰＣは、シュペーマンの形成体に濃縮されたｃＤＮＡの包括的なスクリーニングによりクローニングされた。サブトラクティブディファレンシャルスクリーニングは、以下のように行なった。簡単に述べると、300個の背唇部及び１０_1/2のステージの腹部周縁ゾーン（ＶＭＺ）移植片からポリＡ⁺ＲＮＡを単離し、第１ストランドのｃＤＮＡ合成後、約７０〜８０％の共通配列を、1500個の半分の腹部原腸胚から調製したビオチニル化したＶＭＺのポリＡ⁺ＲＮＡを用いてサブトラクションにより除去した。ディファレンシャルスクリーニングには、増幅していない、配列させた背唇部のライブラリーの二重フィルター(１５cmプレート当たり2000プラーク、合計80,000クローンのスクリーニング)を放射標識した背唇部ｃＤＮＡ又はＶＭＺｃＤＮＡとハイブリダイズした。仮の形成体特異的クローンを単離し、５’末端からの配列解析及び全体に亘るIn Situハイブリダイゼーションでグループ分けし、ついで、既知の及び新規の背面特異的遺伝子に分類した。ライブラリー（100,000個の個々のファージ）をサーベラスのプローブで再度スクリーニングし、さらに４５個のクローンを単離し、その３１個は、１１個のもとのクローン中で最も長いものと同じサイズを有しており、これらが恐らく、全長ｃＤＮＡであると考えられる。サーベラス、ｆｒｚｂ−１、及びＰＡＰＣの最長のｃＤＮＡ配列を完全に決定した。シュペーマンの形成体の分子の複雑性を研究するために、背面特異的ｃＤＮＡの包括的なディファレンシャルスクリーニングを行なった。方法をデザインして、機能に関して偏りがない多数のｃＤＮＡを同定した。表１に示すように、５個の既知のｃＤＮＡと５個の新規なｃＤＮＡが単離された。そのうちの３個（それぞれ、サーベラス、ｆｒｚｂ−１、及びＰＡＰＣを発現した）は、分泌シグナル配列を有していた。最も多かった背面特異的ｃＤＮＡはコルディン（ｃｈｄ）であり、７０個単離された。２番目に多かったｃＤＮＡは１１個あり、（多数の頭を有する神話の守護犬にちなんで）サーベラスと名付けた。サーベラスｃＤＮＡは、分泌タンパク質をコードすると推定され、２７０個のアミノ酸と、アミノ末端に疎水性のシグナル配列とカルボキシ末端にシステインリッチな領域を有する(図１)。サーベラスは、アフリカツメガエル胚の、前腸予定領域を含む、頭部形成体領域で特異的に発現する。アフリカツメガエルの原腸胚の背面部で多量に見出されるｍＲＮＡは、サーベラスと名付けた新規な推定分泌タンパク質を発現した。サーベラスｍＲＮＡはアフリカツメガエル胚で強力な誘導活性を有し、異所性の頭を形成する。他の形成体特異的因子と異なって、サーベラスは中胚葉を背面化しないが、その代わり、体幹一尾部中胚葉の阻害剤である。サーベラスは背唇部の深層部の前縁を含む原腸胚の最も前部ドメインで発現される。この領域は、前腸及び中腸の内胚葉となる。サーベラスは、セメント腺、嗅覚原基、キュープロスの眼、前脳、及び重複した心臓と肝臓（前腸誘導体）の形成を促進する。膵臓もこの前腸に由来するため、サーベラスは肝臓に加えて膵臓も誘導するようである。サーベラスの発現パターン及び誘導活性は、以前無視されていた胚、将来の前腸内胚葉の領域が胚の前頭領域の誘発に役割を担っていることを示唆する。図１に戻って、アフリカツメガエルのサーベラスは、胚発生の間、一過的に発現する分泌タンパク質と推定されるタンパク質をコードする。アフリカツメガエルのサーベラスの推定アミノ酸配列を示す。シグナルペプチド配列及びカルボキシ末端の９つのシステイン残基は、太字で示す。推定Ｎ−結合グリコシル化部位は下線で示す。データベース検索によると、サーベラスタンパク質は哺乳動物のＤａｎタンパク質にだけ限られた相同性を有している。Ｄａｎは、ＤＮＡ結合タンパク質と考えられる腫瘍抑制剤である可能性がある。サーベラスはパイオニアタンパク質と思われる。なぜなら、そのアミノ酸配列及びその９つのシステイン残基の配置はデータベース（NCBI-GenBankリリース93 .0）の他のタンパク質と有意に類似しているものはなかったからである。２番目に多い背面特異的ｃＤＮＡは新規な推定分泌因子をコードすると結論した。これは細胞分化において活性な成長因子の新しいファミリーメンバーの基礎となる。サーベラスは前部形成体ドメインの境界を定めるサーベラスｍＲＮＡは未受精卵では低レベルで発現され、接合体転写物が初期原腸胚で蓄積され始める。発現は原隅胚及び初期神経胚の間継続し、神経胚形成の間に急激に減少する。重要なことは、サーベラスの発現はｃｈｄの発現開始約１時間後に開始することであり、サーベラスはｃｈｄシグナルの下流で働き得ることが示唆されている。全体に亘るin situハイブリダイゼーションで、発現は、卵黄の内中胚葉細胞で開始することがわかった。この細胞は形成体の深層に位置する。サーベラスドメインは、形成体細胞の最も前部の前縁を含んでおり、外側の中胚葉内に広がっている。前縁は、その中央線で肝臓、膵臓となり、中頃が前腸となり、より後方の領域は、後の発達段階で心臓の中胚葉となる。図２は、アフリカツメガエルのサーベラスのｃＤＮＡの全長配列を示す。この全く新しい分子の生理学的性質が示され、再生、分化、組織の修復、その傷の修復、神経細胞の再生又は移植、心筋分化の補足、膵臓及び肝臓の分化、が必要とされる治療、診断、医療への応用に有用であることが示された。また、他の、細胞分化のプロセスが誘発されるべき場合の応用にも有用である。本発明者らが発見した第二の、新規な分泌タンパク質は、ｆｒｚｂ−１と呼ばれており、アフリカツメガエル卵母細胞へのマイクロインジェクションの実験で分泌タンパク質であることが示された。従って、このタンパク質は、ショウジョウバエ及び脊椎動物の細かく縮れた（frizzled）タンパク質の細胞外ドメインに関連して、天然の可溶性形態を提供する。後者のタンパク質は最初のトランスメンブランドメインの前に停止コドンを導入することにより、可溶性形態に変換できることを提案する。ｆｒｚｂ−１及び細かく縮れたタンパク質のシステインリッチな領域は、Ｗｎｔタンパク質と全体的な構造相同性があるが、これは、相同性検索プログラム（Gribskov，Meth．Enzymol.,183，pp 146-159,1990）を用いて決定された。これによって、ｆｒｚｂ−１が、細胞外空間で、Ｗｎｔ成長因子と直接作用できるという興味ある可能性がもたらされた。これは、アフリカツメガエルの胚にマイクロインジェクションしたとき、ｆｒｚｂ−１構築物は適度な背面化活性を有しており、大きくなった脳及び頭部と短くなった体幹を有する胚の形成を導くことが、本発明者らにより発見されたからである。Ｘｗｎｔ−８を必要とする身体の筋肉の分化は阻害された。ｆｒｚｂ−１の場合、これがＷｎｔ −８の阻害剤として作用し得るという魅力的な仮説が構造的相同性によって示唆された。なお、Ｗｎｔ−８は成長因子であり、アフリカツメガエル胚で腹部化活性を有する(Christian及びMoon，GenesDev.，7，pp13-28,1993)。本発明者らは、ｆｒｚｂ−１はＸｗｎｔ−８及びＷｎｔ−１と相互作用し得ることを示し、成長因子のＷｎｔファミリーの他のメンバーとも相互作用し得ることが期待される。哺乳動物においては、Ｗｎｔには少なくとも１５のメンバーが存在する。さらに、Ｗｎｔ類と相互作用し得ることが最近の研究によって示唆されているが、それは、無羽根（winglessウイングレス）の下流で作用する乱雑な（dishevelled ）遺伝子は、ショウジョウバエの縮れをもたらす突然変異と遺伝子的に強い相互作用を有しているからである(Krasnowら、Development,121,pp4095-4102,1995) 。この可能性はさらに深く検討された（Leynsら、Cell,88,pp747-756,３月21日, 1997）が、それは、タンパク質のＷｎｔファミリーの可溶性拮抗物質は治療的価値が非常に高いと考えられるからである。実施例１及び２は、Ｘｗｎｔ−８のｆｒｚｂ−１への結合による拮抗作用を示す実験を示す。脊椎動物における縮れたタンパク質の相同体が単離され、それらも、７つの膜スパニングドメインによって細胞膜に固定される(Wangら、J.Biol.Chem.,271,pp 4468-4476,1996)。Ｆｒｚｂ−１は、縮れたタンパク質とは、完全に可溶性の、拡散し得る分泌タンパク質であるという点で異なり、従って、治療剤として好適である。ヌクレオチド配列は、発現されるとｆｒｚｂ−１タンパク質となり、配列番号：４に示される。配列番号：４は、アフリカツメガエルにおける相同体に対応するが、それをBL AST検索に用いて（及びマウスｆｒｚｂ−１のクローニングによって）収集して、全成熟ヒトｆｒｚｂ−１タンパク質配列、配列番号：９を組み立てることができた。事実、ヒトｆｒｚｂ−１は、ジーンバンクから入手可能な６個の発現配列タグ（ＥＳＴ）にコードされていた。ヒトｆｒｚｂ−１配列は、このＥＳＴの５ ’から３’の方向にオーバーラップさせて、組み立てた。ＥＳＴは、以下のジーンバンクの番号を有している：H18848、R63748、W38677、W44760、H38379、及び N71244。これらの配列の機能はまだ同定されていないが、ヒトｆｒｚｂ−１はアフリカツメガエルｆｒｚｂ−１について記載されたと同様の、細胞分化の機能を有すると考え、かつ提案する。ヒトｆｒｚｂ−１のヌクレオチド配列は、配列番号：１０に示される。マウスｆｒｚｂ−１タンパク質及びヌクレオチド配列は、それぞれ、配列番号７及び８に示される。特に、ｆｒｚｂ−１は、ヒトガン細胞の遺伝子治療に有用であることが証明されると考える。この急速に発展している分野で、ひとつのアプローチはアンチセンス配列を発現するベクターを導入し、優勢なオンコジーン及び成長因子レセプターの発現をブロックすることである。他のアプローチは、細胞を形質転換することなく、ヒト細胞内で、調節された様式で複製できるエピゾームのベクターを作成することである。後者(ヒト遺伝子治療のためのエピゾーム発現ベクター系) の例は、発明者Cooperの、1997年４月29日に発行された米国特許第5,624,820号を参照のこと。現在、遺伝子治療はヒト腫瘍抑制遺伝子の使用を含む。例えば、1996年２月13 日に発行された米国特許第5,491,064号には、染色体１１上に位置する腫瘍抑制遺伝子が、その遺伝子の発現が欠失又は変化したガンの遺伝子治療に潜在的に有用であると記載されている。Ｆｒｚｂ−１は、染色体２ｑ31-33にマップされており、２ｑ31-33の１コピー及び２ｑアームの１コピーの欠失は、肺ガン、結隅直腸ガン、及び神経芽腫を非常に招きやすいことが観察されている。これにより、この２ｑアームが腫瘍抑制遺伝子を有していると考えられる。ｆｒｚｂは腫瘍抑制遺伝子と考えられ、腫瘍抑制への応用に有用である。サーベラス及びｆｒｚｂ−１の薬学的（生物学的活性）性質から、多数の応用例が考えられる。例えば、サーベラス及びｆｒｚｂ−１ｃＤＮＡは、診断用具として有用である (セルラインにおけるタンパク質のアッセイへの抗体の使用、又はＰＣＲ実験に用いるプライマーとしてオリゴヌクレオチドを使用し、このオリゴヌクレオチドプライマーに類似する配列を有する配列の増幅、及び、本新規タンパク質の存在量の決定)。サーベラスは、もちろん、それ自身のレセプターを経由して標的細胞に作用する。サーベラスは、それゆえ、このレセプターを単離する鍵を提供し得る。多くのレセプターは細胞性オンコジーンに変異するので、サーベラスレセプターは、特定の腫瘍タイプに対する診断用プローブとして有用であることが示される。このように、サーベラスを複合体のリガンドとして考えるとすれば、本発明の複合体は、サーベラスに結合する抗体、サーベラスに由来するペプチドに結合する抗体、レセプターに結合するサーベラス、又はサーベラスに由来しそのレセプターあるいは他の因子に結合するペプチドを含む。サーベラスの突然変異の形態は、より強力な作用薬または拮抗物質のいずれかであるが、臨床上有用であると考えられる。これらのサーベラス複合体及びその結合タンパク質パートナーの、多数の応用への使用が見出されるであろう。本発明の実施は、オリゴヌクレオチド構築物の使用を含む。この構築物はサーベラス配列又はｆｒｚｂ−１をコードする配列とプロモーター配列とが哺乳動物発現ベクター及びウイルス発現ベクターに作動可能に結合している。発現及びクローニングベクターは、１又はそれ以上の選択された宿主細胞中でベクターを複製させるヌクレオチド配列を含んでいる。一般的に、クローニングベクター中では、この配列は、宿主染色体とは独立してベクターを複製させる配列であり、複製開始点又は自己複製配列を有している。周知のプラスミドｐＢＲ３２２は、ほとんどのグラム陰性細菌に好適であり、酵母の２μプラスミド開始点及び他の種々のウイルス開始点（ＳＶ４０、ポリオーマ、アデノウイルス、ＶＳＶ又はＢＰＶ）は、哺乳動物細胞のクローニングベクターとして用いられる。発現及びクローニングベクターは、選択遺伝子（選択マーカーともいう）を含むべきである。典型的には、ベクターで形質転換された宿主細胞が生存する又は生育するために必要なタンパク質をコードする遺伝子である。この遺伝子が存在することにより、ベクターを含まないどの宿主細胞も形質転換宿主以上に生育できず、繁殖しない。典型的な選択遺伝子は以下のタンパク質をコードする：(ａ) 抗生物質あるいは他の毒素、例えば、アンピシリン、ネオマイシン、メトトレキセートもしくはテトラサイクリンに対して耐性を付与する：(ｂ)栄養要求性を補足する。哺乳動物の適切な選択マーカーの例はジヒドロフォレートレダクターゼ(ＤＨＦＲ)又はチミジンキナーゼである。このようなマーカーにより、サーベラス核酸を取り込むコンピテントな細胞が確認できる。哺乳動物細胞の形質転換体を選択圧力下におくと、形質転換体だけがそのマーカーを取り込むことによつて適応し、生存する。形質転換体培地中の選択薬剤濃度を連続的に変化させる条件下で培養することにより選択圧力がかけられる。増幅は、組換え細胞が継続的に生育する間、染色体中において生育に必須のタンパク質をより多く生産するために要求される遺伝子がタンデムに反復されるプロセスである。それゆえ、増加したＤＮＡからの合成で、サーベラス又はｆｒｚｂ−１の合成量が増加する。例えば、ＤＨＦＲ選択遺伝子で形質転換された細胞は、まず、ＤＨＦＲの競合的拮抗物質であるメトトレキセート（Ｍｔｘ）を含有する培地ですべての形質転換体を培養することにより同定される。この場合、適切な宿主細胞は、ＤＨＦＲ活性を欠損しているチャイニーズハムスター卵巣細胞（ＣＨＯ）セルラインである。この細胞は、Urlaub及びChasln，Proc．Nat．Acad．Sci.，77，4216（1980 ）に記載のように調製し、増殖される。形質転換細胞は、次に、Ｍｔｘのレベルが増加した条件に曝される。これにより、ＤＨＦＲ遺伝子の多コピー合成が導かれ、これに付随して発現ベクターを含む他のＤＮＡ、例えば、サーベラスまたはｆｒｚｂ−１をコードする遺伝子が多コピーとなる。あるいは、サーベラスまたはｆｒｚｂ−１をコードする遺伝子とアミノグリコシド３’フォスフォトランスフェラーゼ（ＡＰＨ）タンパク質をコードするＤＮＡを有する発現ベクターで形質転換した宿主細胞を、アミノグリコシド系抗生物質、例えばカナマイシン又はネオマイシン又はＧ４１８を含む培地で細胞を生育させて選択する。真核細胞は通常、内因性のＡＰＨ活性を発現しないので、一般的にはｎｅｏ抵抗性遺伝子と言われるＡＰＨタンパク質をコードする遺伝子が、広範囲の真核宿主細胞に主な選択マーカーとして用いられ、ベクターによって形質転換された細胞が容易に同定される。発現ベクターは、クローニングベクターと違って、プロモーターを含有しなければならない。このプロモーターは宿主生物に認識され、サーベラス核酸に作動可能に結合している。プロモーターは翻訳されない配列であり、構造遺伝子の開始コドンから上流（一般的に、約100から1000ｂｐの範囲内）に位置し、そのコントロールの下、転写及び翻訳をコントロールする。プロモーターは、典型的には、誘導性及び構成性の、２つのクラスに分類される。誘導的プロモーターは、そのコントロールの下、培養条件のある変化、例えば栄養素の存在又は非存在、又は温度変化に対応して、ＤＮＡの転写レベルの増加を開始する。この場合、宿主細胞となり得る種々の細胞により認識される多数のプロモーターは公知である。これらのプロモーターはサーベラスをコードするＤＮＡに作動可能に結合されているが、これは、このプロモーターをオリジンの遺伝子から制限酵素消化で取り出し、サーベラスまたはｆｒｚｂ−１の開始コドンの５’側に挿入して作成される。核酸は、他の核酸配列と機能的な関係になるように置かれたときに、作動可能に結合している。例えば、プレ配列又は分泌リーダー配列のＤＮＡがポリペプチドのＤＮＡに作動可能に結合しているのは、ボリペプチドの分泌に関与するプレタンパク質として発現される場合であり；また、プロモーター又はエンハンサーがコード配列に作動可能に結合しているのは、その配列の転写に影響を与える場合であり、；あるいはリボゾーム結合部位がコード配列に作動可能に結合しているのは、翻訳が進行するように配置されている場合である。一般的に作動可能に結合したとは、結合したＤＮＡ配列が連続し、分泌リーダーの場合には、連続的であり、読み取り枠にある場合である。結合は、適切な制限部位における結合で行われる。もし、そのような部位がない場合には、合成オリゴヌクレオチドアダプターあるいはリンカーを、常法により、使用する。哺乳動物宿主細胞におけるタンパク質をコードするＤＮＡの転写は、プロモーターでコントロールされる。このプロモーターは、ウイルスのゲノム、例えば、ポリオーマ、サイトメガロウイルス、アデノウイルス、レトロウイルス、Ｂ型肝炎ウイルス、及び最も好ましくは、シミアンウイルス４０（ＳＶ４０）のゲノムから、又は、ヘテロな哺乳動物プロモーター、例えばアクチンプロモーターである。もちろん、宿主細胞又は関連する種からのプロモーターもまた本発明には有用である。サーベラス又はｆｒｚｂ−１は、細胞培養、例えば内胚葉、心臓及び神経細胞のインビトロでの培養に使用する培地の成分として明らかに有用である。サーベラス及びｆｒｚｂ−１は、肝臓、膵臓、心臓、及び神経細胞の生育を強化し、又は誘発する薬剤としての用途、例えば、組織置換療法があると考えられる。単離された最後のｃＤＮＡはシグナル配列を有しており、パラキシャルプロトカドヘリン（ＰＡＰＣ）と名付けたペプチドとなる。ＰＡＰＣのｃＤＮＡはカドヘリン多重遺伝子ファミリーから分かれたメンバーである。ＰＡＰＣが最も関連するのはプロトカドヘリン４３であり、Sanoら、The EMBOJ.，12,pp2249-2256， 1993により報告されている。配列番号：５に示されるように、ＰＡＰＣ遣伝子はトランスメンブレンタンパク質をコードしている。このタンパク質は、896個のアミノ酸を有し、その187個は、細胞内ドメインの一部である。ＰＡＰＣは細胞接着分子であり、ＰＡＰＣｍＲＮＡ構築物をアフリカツメガエル胚にマイクロインジェクションしたとき、ＰＡＰＣは中胚葉の分化に作用することが示唆された。アフリカツメガエルのＰＡＰＣをコードするヌクレオチド配列は配列番号：６に記載されている。本新規タンパク質の治療用組成物は、所望の純度を有するポリペプチドと、必要に応じて生理学的に受容可能なキャリアー、賦形剤あるいは安定剤とを混合して、例えば、凍結乾燥ケーキ、又は、水溶液の形態へ調製されて保存される。受容可能なキャリアー、賦形剤あるいは安定剤は、受容者に用いる用量及び濃度で毒性がなく、リン酸、クエン酸及び他の有機酸の緩衝液；アスコルビン酸を含む抗酸化剤；低分子量（約１０残基より少ない）ポリペプチド；血清アルブミン、ゼラチン、又は免疫グロブリン等のタンパク質：を含む。グリシン、グルタミン、アスパラギン、アルギニン又はリジン；グルコース、マンノース、あるいはデキストリンを含む単糖類、二糖類、及び他の炭化水素；ＥＤＴＡ等のキレート剤；マンニトール又はソルビトール等の糖アルコール；ナトリウム等の塩形成性対イオン；及び／又はツイーン、プルロニック、またはＰＥＧ等の非イオン性界面活性剤：等の他の成分もまた、含まれ得る。本新規タンパク質に対するポリクローナル抗体は、一般的には、サーベラス又はｆｒｚｂ−１とアジュバンドとを複数回の皮下（ｓｃ）又は腹腔（ｉｐ）注入して、動物内で引き起こされる。これらのタンパク質、あるいは標的アミノ酸配列を含むフラグメントをタンパク質と結合するのは、有益である。このタンパク質は、免疫される種で免疫原性を有するタンパク質、例えば、キーホールリンペットヘモシアニン、血清アルブミン、牛サイログロブリン、又は大豆トリプシンインヒビターであり、結合には、二官能性又は誘導化剤、例えば、マレイミドベンゾイルスルフオスクシンイミドエステル(システイン残基を介する結合)、N-ヒドロキシスクシンイミド(リジン残基を介して)、グルタルアルデヒド、コハク酸無水物、SOCl₂、又はＲ¹Ｎ=Ｃ=ＮＲを用いる。動物を免疫原性結合物あるいは誘導体を免疫化するが、１ｍｇまたは１μｇの結合物（ウサギ又はネズミのそれぞれ）と、３倍量のフロイント完全アジュバントとを混合して、溶液を多数部位で皮内注入する。一カ月後、フロイント完全アジュバント中の、もとの１／５から１／１０量の結合物をその動物の皮下に多数部位でブーストする。７から１４日後に動物から採血し、血清の抗−サーベラスタイターをアッセイする。タイターがプラトーに達するまで動物をブーストする。好適には、動物を同じサーベラスまたはｆｒｚｂ−１ポリペプチドの結合物でブーストするが、異なるタンパク質及び／又は異なる架橋結合剤を介して結合してもよい。結合物はまた、組換え細胞培養で融合タンパク質として、作成され得る。又、ミョウバン等の凝集剤を用いて、免疫反応を強化できる。モノクローナル抗体は、免疫した動物から脾臓細胞を回収し、常法、例えば、ミエローマ細胞との融合、あるいは、ＥＢウイルスを用いる形質転換で不死細胞化し、所望の抗体を発現するクローンをスクリーニングする。抗体は、サーベラス、ｆｒｚｂ−１、あるいはＰＡＰＣ、あるいはこれらの抗体の診断アッセイ及びファミリーメンバーを同定するのに有用である。レセプター結合アッセイの一つの態様においては、選択したサーベラスファミリーの複数のメンバーのすべてと結合する抗体組成物を不溶性マトリックス上に不溶化する。テストサンプルを不溶化抗体組成物と接触させて、すべてのサーベラスファミリーメンバーを吸着させ、次いで不溶化したファミリーメンバーをそれぞれのメンバーに特異的な複数の抗体と接触させる。それぞれの抗体は、個々に予め決定したファミリーメンバーに対する特異性、例えば別個の発蛍光団等による唯一のラベルにより、同定可能である。それぞれの唯一のラベルの存在及び／又は量を決定することにより、それぞれのファミリーメンバーの相対比率と量を測定することができる。抗体はまた、組換え細胞培養物あるいは天然の採取源から本新規タンパク質をアフィニティ精製するのに有用である。他の成長因子と検出できる程度に交差反応しない抗体を用いて、これらの他のファミリーメンバーを含まないタンパク質が精製される。実施例１ｆｒｚｂ−１はＸｗｎｔ−８と非細胞的に自律的に拮抗するｆｒｚｂ−１が、注入された細胞による分泌の後にＸｗｎｔ−８によって引き起こされる二次軸と拮抗することができるかどうかを調べるために、一つの実験計画を用いた。例えば、ｆｒｚｂ−１のｍＲＮＡを８細胞胚の４つの動物割球のそれぞれに注入し、続いて１６ないし３２細胞期に、Ｘｗｎｔ−８のｍＲＮＡを植物腹側割球に単回注入した。二回の独立した実験において、発明者等は、ｆｒｚｂ−１のみの注入（ｎ＝１３）は、すべての胚においてセメント腺の拡張を伴う穏やかな背方化を引き起こすことと、Ｘｗｎｔ−８のみの注入（ｎ＝５３）は、６７％の胚において完全な二次軸を誘導することを見い出した。しかしながら、ｆｒｚｂ−１の動物極への注入は、Ｘｗｎｔ−８によって誘導される完全な軸の形成を阻止し（ｎ＝２７）、残りの１４％の胚にごく弱い二次軸を残したにすぎない。二重に注入された胚は、ｆｒｚｂ−１のｍＲＮＡのみの注入によって引き起こされるセメント腺拡張の表現型を保持していた。両ｍＲＮＡは分泌タンパク質をコードしており、異なる細胞にマイクロインジェクトされていることから、発明者等は、ｆｒｚｂ−１およびＸｗｎｔ−８の拮抗効果は、これらのタンパク質が分泌された後に細胞外の空間において起こるものと結論する。実施例２膜に結合したＷｎｔ−１はｆｒｚｂ−１を結合させるｆｒｚｂ−１とＷｎｔの間の可能な相互作用を研究するため、第一の工程はＣＭＶ（サイトメガロウイルス）プロモーターにより駆動されるアフリカツメガエルのｆｒｚｂ−１構成物に、ＨＡエピトープのタグを挿入することであった。Ｆｒｚｂ１−ＨＡを、アフリカツメガエル胚におけるｍＲＮＡのマイクロインジェクション分析法により検査し、生物学的に活性があることを見い出した。一時的にトランスフェクトされた細胞からの調節された培地は、１０μｇ／ｍｌまでのＦｒｚｂ１−ＨＡを含んでいた(ＨＡをタグした標準タンパク質を用いたウエスタンブロットで定量した)。２９３個の細胞の一時的なトランスフェクションは、ウィングレス（ｗｉｎｇｌｅｓｓ）とフリズルド（ｆｒｉｚｚｌｅｄ）タンパク質の間の相互作用を説明する手段となった。発明者等はそこで、Ｗｎｔ−１がＣＤ８のアミノ末端で融合している構成物を利用し、細胞外の区分に露出している生物学的に活性のあるＷｎｔ−１を含んでいる膜貫通タンパク質を作成した。Ｗｎｔ１ＣＤ８ｃＤＮＡ構成物（H．Varmus博士（NIH）の寛大な贈与による）を、ｐｃＤＮＡ（インビトロジェン(Invitrogen)）ベクターにサブクローニングし、２９３個の細胞にトランスフェクトした。Ｆｒｚｂ１−ＨＡ調節培地と共にインキュベート（３７℃一晩）した後、強く標識された細胞を免疫蛍光により観察した。ネガティブコントロールとしては、無関係な分泌タンパク質である、アフリカツメガエルのコルディン(chordin)の１２０個のアミノ酸を含んでいる構成物を用いた。この構成物のトランスフェクションは、均一および点状の両細胞外マトリックスに対するＦｒｘｂ１−ＨＡの結合のバックグラウンドを示す。Ｗｎｔ１ＣＤ８の、ｐｃＤＮＡ −ＬａｃＺとのコトランスフェクションは、トランスフェクトした細胞がＦｒｚｂ１−ＨＡおよびＬａｃＺについてポジティブに染まることを示した。Ｗｎｔ１ＣＤ８はＣＤ８分子全体を含むため、ＣＤ８ｃＤＮＡをさらなるネガティブコントロールとして用いた。ＬａｃＺおよび完全な長さのＣＥ８でトランスフェクトした後、Ｆｒｚｂ１−ＨＡはトランスフェクトした細胞に結合できない。発明者等の実験はほとんど３７℃において行なったが、Ｆｒｚｂ１−ＨＡ調節培地では、４℃２時間のインキュベーションの後に、Ｗｎｔ１ＣＤ８でトランスフェクトした細胞を染色した。Ｗｎｔ１ＣＤ８でトランスフェクトした細胞に対する、Ｆｒｚｂ−１の結合を生化学的に定量する試みは、おそらくは細胞外マトリックスへの結合のせいである、対照の培養物への高いバックグラウンド結合のため失敗に終わった。従って、発明者等は、Ｆｒｚｂ−１／Ｗｎｔ−１相互作用の親和性のＫ_Dを推定することができなかった。しかしながら、Ｆｒｚｂ１−ＨＡを含んでいるコンディションドメディウムの連続的な希釈を行なった場合には（２．５ｘ１０^-7〜１．２５ｘ１０^-10Mの範囲）、Ｗｎｔ１ＣＤ８でトランスフェクトした細胞の染色が、すべての濃度において見られた。発明者等は、Ｗｎｔとｆｒｚｂ−１との間の直接的な結合の生化学的証拠を提供することはできなかったが、この細胞生物学的分析法は、Ｆｒｚｂ１−ＨＡが直接または間接的に、細胞膜上のＷｎｔ−１に１０^-10Mの領域で結合することができることを示している。前文には、好ましい特別の態様をもって本発明について記述してきたが、この記述および実施例は説明を意図したものであり、添付の請求の範囲によって規定される本発明の範囲を限定するものではないことを理解されたい。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (81)指定国ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＡＵ，ＣＡ，ＪＰ (72)発明者ボウメスター、テウィスアメリカ合衆国 90024 カリフォルニア州ロスアンジェルスレバリングアヴェニュー 827 アパートメント 708

Claims

【特許請求の範囲】１．生理学的に活性型であることを特徴とし、配列番号ＮＯ：２のＤＮＡにコードされたアミノ酸配列を含んでいる、実質的に純粋なタンパク質。２．神経栄養、成長、または分化因子活性を有する、請求の範囲第１項記載のタンパク質。３．請求の範囲第１項記載のタンパク質と、前記ペプチドが混合される生理学上許容される担体とを含んで成る組成物。４．タンパク質をコードしている配列と、これに機能的に連結された発現ベクターとを含んで成り、前記タンパク質が神経栄養、成長、または分化因子活性を有し、かつ配列番号ＮＯ：２から発現され得ることを特徴とするオリゴヌクレオチド構成物。５．発現ベクターが哺乳類またはウイルスの発現ベクターである、請求の範囲第４項記載の構成物。６．生理学的に活性型であることを特徴とし、配列番号ＮＯ：４、配列番号Ｎ０：８、または配列番号ＮＯ：１０のＤＮＡにコードされたアミノ酸配列を含んでいる、実質的に純粋なタンパク質。７．神経栄養、成長、または分化因子活性を有する、請求の範囲第６項記載のタンパク質。８．請求の範囲第６項記載のタンパク質と、前記タンパク質が混合される生理学上許容される担体とを含んで成る組成物。９．タンパク質をコードしている配列と、これに機能的に連結された発現ベクターとを含んで成り、前記タンパク質が神経栄養、成長、または分化因子活性を有し、かつ配列番号ＮＯ：４、配列番号ＮＯ：８、または配列番号ＮＯ：１０から発現され得ることを特徴とするオリゴヌクレオチド構成物。１０．前記タンパク質が可溶性の形で発現可能である、請求の範囲第９項記載の構成物。１１．前記発現ベクターが哺乳類またはウイルスの発現ベクターである、請求の範囲第９項記載の構成物。１２．少なくとも一つのＷｎｔタンパク質と複合している実質的に純粋なｆｒｚｂ−１タンパク質を含んで成る複合体。１３．生理学的に活性型であることを特徴とし、配列番号ＮＯ：６のＤＮＡにコードされたアミノ酸配列を含んでいる、実質的に純粋なタンパク質。１４．中胚葉を分化させる活性を有する請求の範囲第１３項記載のタンパク質。１５．請求の範囲第１３項記載のタンパク質と、前記タンパク質が混合される生理学上許容される担体とを含んで成る組成物。