JPH09509574A - 脊索によって発現されるヘッジホッグ、Ｖｈｈ−１、の脊椎動物相同体をコードするＤＮＡ、及びこれらの使用 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 本発明は、ｖｈｈ−１タンパク質をコードする単離された核酸分子、ｖｈｈ−１タンパク質である単離されたタンパク質、ｖｈｈ−１タンパク質をコードする単離された核酸分子を含有するベクター、このようなベクターを含有する哺乳動物細胞、ｖｈｈ−１タンパク質に向けられた抗体、ｖｈｈ−１タンパク質をコードする核酸分子を検出するのに有効な核酸プローブ、ｖｈｈ−１タンパク質に関連した薬学的組成物、正常又は突然変異ｖｈｈ−１タンパタ質を発現するヒト以外のトランスジェニック動物を提供する。本発明は更に、底板細胞、運動ニューロン、の分化を誘導するための方法、腹側ニューロンを発生させるための方法、ｖｈｈ−１タンパク質に関連した以上を緩和するための治療を提供する。

Description

【発明の詳細な説明】 脊索によって発現されるヘッジホッグ、Ｖｈｈ−１、の脊椎動物相同体を コードするＤＮＡ、及びこれらの使用 この出願は、１９９４年２月２５日にファイルされた米国特許出願第０８／２ ０２，０４０の一部継続出願であり、この内容は、参照文献として本出願の一部 をなす。 ここで開示される発明は、米国立衛生研究所（National Institute of Health ,U.S.）Department of Health and Human Serviesからの、補助金番号ＮＳ−３ ０５３２の下で米国政府の補助でなされた。従って、米国政府は、この発明に一 定の権利を有する。本発明の背景 この出願の全体に渡って、種々の参照文献を括弧内で部分的な表記として参照 する。これらの刊行物の完全な記述は本明細書の最後であって請求の範囲の直前 に見出しうる。これらの刊行物の開示は、本発明が属する分野の状況をより完全 に説明するためにこの出願に参照文献として含まれる。 脊椎動物の胎児において、神経管は、明確な背腹位置で明瞭な細胞タイプとし て表示される。底板細胞は腹部中線で分化し、運動ニューロンは腹側両面領域に 現れ、感覚リレーニューロン、神経冠、及び上衣板は背面に現れる。神経冠内で の細胞パターンの発生は、周囲の組織に由来するシグナルに依存する。この明確 な例は、腹側細胞タイプの発達における軸性中胚葉の影響である。底板細胞、運 動ニューロン、及び他の腹側細胞タイプは、脊索の軸性中胚葉からの誘導シグナ ルを必要とする。脊索がない場合、底板細胞及び運動ニューロンは分化しない（ Placzek et al.，1990b; Bovolenta and Dodd，1991; Clarke et al.，1991; va n Straaten and Hekking，1991; Yamada et al.，1991; Ruiz i Altaba，1992; Goulding et al.，1993; Ruiz i Altaba et al.，1993a; Halpern et al.，1993 ）。逆に、軸索を移植すると底板細胞及び運動ニューロンのin vivo及びin vitr oでの異所 性の分化が誘導される（van Straaten et al.，1988; Placzek et al.，1990b， 1991，1993; Yamada et al.，1991，1993; Ruiz l Altaba，1992; Goulding et al.，1993）。底板細胞はまた、これ自身底板及び運動ニューロン誘導活性の両 方を有する（Yamada et al.，1991，1993; Hatta et al.，1991; Placzek et al .，1993）。in vitroのアッセイで、底板の誘導は、接触媒介シグナルを必要と し、一方、運動ニューロンは拡散性シグナルによって誘導されうるという証拠が 示されている（Yamada et al.，1933; Placzek et al.，1990b，1993）。 底板細胞及び運動ニューロンの分化は、異なったクラスの転写因子の発現に関 連している。底板細胞は、三種類のメンバーの肝細胞核因子ＨＮＦ−３／フォー クヘッド（fork head）遺伝子ファミリー（Weigel and Jackie，1990,Lai et al .，1991）：ピンタラビス（Pintallavis）（ＸＦＫＨ１／ＸＦＤ１／１）、ＨＮ Ｆ−３β、及びＨＮＦ−３α（Dirksen and Jamrich，1992;Knochel et al.，19 92;Ruiz l Altaba and Jessell，1992; Bolce et al.，1993; Monaghan et al. ，1993; Ruiz l Altaba et al.，1993a; Sasaki and Hogan，1993; Strahle et al.，1993）を発現する。ピンタラビス及びＨＮＦ−３βの異所性発現は、神経 管の背面領域の細胞で底板マーカーが現れることに繋がり（Ruiz i Altaba et a l.，1992，1993b;A.R.A．et al.，未発表データ；Sasaki and Hogan，1994）、 このことは、このファミリーのメンバーが底板細胞の運命を特定しうることを示 唆する。運動ニューロンの分化は、ｉｓｌｅｔ−１、即ちＬＩＭホメオボックス 遺伝子ファミリーの発現に関連する（Ericson et al.，1992; Yamada et al.，1 993）。細胞の運命を決定するこれらの可能な機能に加えて、これらの転写因子 は、底板及び運動ニューロンの分化をモニターするための、細胞表面分子を結合 するのに使用されうるマーカーを提供する。 背面神経管での細胞のパターンニングは、昆虫の発育においても顕著な役割を 有している分泌タンパク質の２つのファミリーのメンバーによって制御されるよ うである。形質転換成長因子β（ＲＧＦβ）ファミリーのメンバーであるdorsal in-1は、背面神経管で発現され、in vitroでの神経板の外移植で神経冠細胞の分 化を誘導する（Basler et al.，1993）。ｗｎｔファミリーのメンバーも背面神 経管で発現される（Roelink and Nusse，1991; Nusse and Varmus，1992; Parr et al.，1993）。キイロショウジョウバエ属の各種のハエでは、ＴＧＦβファミ リーのメンバーであるdecapentaplegic（ｄｐｐ）は、キイロショウジョウバエ 属の各種のハエの胎児の胚腹パターン（Ferguson and Anderson 1992参照）、及 び成虫原基内の細胞の分化及びパターンニングを調節する（Spencer et al.，19 82; Posakony et al.，1991; Campbell et al.，1993，Heberlein et al.，1993 ）。同様に、wingless（ｗｇ）、即ちｗｎｔ遺伝子ファミリーのメンバーは、体 節形成及び成虫原基発達の間の細胞の運命を制御する（Morata and Lawrence，1 977; Nusslein-Volhard and Wieschaus，1980; Baker，1988; Martinez-Arias e t al.，1988; Struhl and Basler，1993）。 細胞の個性を特定するのに重要な第三のキイロショウジョウバエ属の各種のハ エの遺伝子は、ヘッジホッグ（hedgehog）（ｈｈ）である（Nusslein-Volhard a nd Wieshaus，1980）。ｈｈは、ｄｐｐ及びｗｇと作用し、分節及び成虫原基の 発達の間に細胞の運命及びパターンニングを調節する（Hidalgo and Imgham，19 90; Ingham，1993; Ma et al.，1933; Heberlein et al.，1993; Basler and St ruhl，1944; Heemskerk and DiNardo，1994）。ｈｈは、分泌経路に含まれる新 規なタンパク質をコードし（Lee et al.，1992; Mohler and Vani，1992; Tabat a et al.，1992; Tashiro et al.，1993）、発生の証拠は、ｈｈがシグナル分子 として作用するという可能性と一致して、ｈｈの機能が細胞自律性でないことを 示している（Mohler，1988; Heberlein et al.，1993; Ma et al.，1993; Basle r and Struhl，1994）。 昆虫の細胞パターンニングにおけるｈｈの重要性は、脊椎動物相同体を調査す るため、及び初期の神経発達の間のこれらの可能な機能を試験することを出願人 に促した。出願人は、ラットから得たｈｈの脊椎動物相同体、ｖｈｈ−１のクロ ーニングをここで開示する。最近の独立の研究で、ｖｈｈ−１に密接に関連し、 神経管及び肢芽での細胞パターンニングを調節するように思われるｈｈの脊椎動 物相同体、ソニックヘッジホッグ（sonic hedgehog）（ｓｈｈ）が同定された（ Echelard et al.，1993; Krauss et al.，1933; Riddle et al.，1933）。ここ で、出願人は、ｖｈｈ−１が腹側神経細胞タイプの誘導に関係するという証拠を 提出する。ｖｈｈ−１は、中線構造（特に、節、軸索、及び底板）で発現され、 この時、これらの細胞は活性を誘導する。ラットｖｈｈ−１遺伝子を発現するＣ ＯＳ細胞は、in vitroでの神経板外移植物において底板及び運動ニューロンの分 化を誘導する。更に、カエル胎児内でのラットｖｈｈ−１遺伝子の広範な発現は 、神経管内で底板マーカーの異所性発現を導く。これらの結果は、脊索内でのｖ ｈｈ−１の発現が、底板細胞、運動ニューロン、及び腹側神経管内の可能な他の 細胞タイプの分化に関係する誘導シグナルをもたらすことを示唆する。本発明の概要 本発明は、脊椎動物のｖｈｈ−１タンパク質をコードする単離された核酸分子 を提供する。本発明の一態様では、該核酸分子はカエルｖｈｈ−１タンパク質を コードする。他の態様では、該核酸分子は哺乳動物ｖｈｈ−１タンパク質をコー ドする。更なる態様では、該核酸分子はラットｖｈｈ−１タンパク質をコードす る。更なる態様では、該核酸分子はヒトｖｈｈ−１タンパク質をコードする。 本発明は、脊椎動物ｖｈｈ−１タンパク質をコードする核酸分子の配列内に含 まれる独特の配列と特異的にハイブリダイズすることができる少なくとも１５の ヌクレオチドの核酸分子を含有する核酸分子を提供する。 本発明はまた、ｖｈｈ−１タンパク質に向けられたモノクローナル抗体及びポ リクローナル抗体を提供する。 本発明は、ｖｈｈ−１タンパク質をコードする単離された核酸分子を含有する ヒト以外のトランスジェニック哺乳動物を提供する。 本発明は、精製された脊椎動物ｖｈｈ−１タンパク質を製造する方法であって 、（ａ）脊椎動物ｖｈｈ−１タンパク質をコードする核酸分子を適切なベクター に挿入すること、（ｂ）生じたベクターを適切なホスト細胞に導入すること、（ ｃ）導入されたホスト細胞を脊椎動物ｖｈｈ−１タンパク質の発現に対して選別 すること、（ｄ）選別された細胞を培養し、ｖｈｈ−１タンパク質を産生するこ と、及び（ｅ）産生されたｖｈｈ−１タンパク質を回収することを具備した方法 を提供する。 本発明は、底板細胞の分化を誘導する方法であって、底板細胞を精製された脊 椎動物ｖｈｈ−１タンパク質と、底板細胞の分化を誘導するのに効果的な濃度で 接触することを具備した方法を提供する。 本発明は、対象の底板細胞の分化を誘導する方法であって、該対象の底板細胞 の分化を誘導するのに効果的な量で、精製された脊椎動物ｖｈｈ−１タンパク質 を該対象に投与することを具備した方法を提供する。 本発明は、運動ニューロンの分化を誘導する方法であって、底板細胞を精製さ れた脊椎動物ｖｈｈ−１タンパク質と、運動ニューロンの分化を有するのに効果 的な濃度で接触することを具備した方法を提供する。 本発明は、対象の運動ニューロンの分化を誘導する方法であって、該対象の運 動ニューロンの分化を誘導するのに効果的な量で精製された脊椎動物ｖｈｈ−１ タンパク質を該対象に投与することを具備した方法を提供する。 本発明は、腹側ニューロンを発生させる方法であって、始原細胞を精製された 脊椎動物ｖｈｈ−１タンパク質と、腹側ニューロンを生じさせるのに効果的な量 で接触させることを具備した方法を提供する。 本発明は、対象の始原細胞から腹側ニューロンを発生させる方法であって、該 対象の始原細胞から腹側ニューロンを発生させるのに効果的な量で精製された脊 椎動物ｖｈｈ−１タンパク質を該対象に投与することを具備した方法を提供する 。 本発明は、脊椎動物ｖｈｈ−１タンパク質及び薬学的に許容しうる担体を含有 する薬学的組成物を提供する。一態様では、ｖｈｈ−１タンパク質はラットタン パク質である。他の態様では、ｖｈｈ−１タンパク質はヒトタンパク質である。 本発明は、未分化前駆体ニューロンから運動ニューロンを発生させるための方 法であって、未分化前駆体ニューロンから運動ニューロンを発生させるのに効果 的なヒトｖｈｈ−１タンパク質を含有する薬学的組成物の所定量を導入すること より成る方法を提供する。運動ニューロンの発生は、急性の神経系損傷又は筋萎 縮性側索硬化症（ＡＬＳ）のような慢性神経退縮性疾患を緩和しうる。 本発明は、急性神経系損傷が特異的な中枢軸索に局在化している場合に、未分 化前駆体ニューロンから運動ニューロンを発生させる方法であって、損傷された 軸索に隣接して局在化する未分化運動ニューロンから運動ニューロンを発生させ るのに効果的な、ヒトｖｈｈ−１タンパク質及び薬学的に許容しうる担体を含有 する薬学的化合物を外科的に移植することを具備した方法を提供する。図面の簡単な説明 図1-1、1-2、1-3 ラットのVhh-1タンパク質に関するDNA配列とそれに対応した推定アミノ酸配列。 図２Ａ及び２Ａ-２ ゼブラフィッシュ及びラットにおけるショウジョウバエHhタンパク質相同体(ゼ ブラフィッシュのZ1 vhhタンパク質、及びラットのR vhhタンパク質)の推定アミ ノ酸配列をショウジョウバエの油タンパク質に対する整列比較。各配列間で全て 等しい残基は太字で記載してある。整列配列の最適化の為に導入した間隔は、点 で示してある。vhh-1配列は国立バイオテクノロジー情報センターの芽球ペプチ ド配列データに登録されているその他のタンパク質とは相同性を示さないが、例 外として、１１３から２１１番目の残基は、ライム病のスピロヘータであるボレ ラ ブルグドルフェリ(Borella burgdorferi)の外部表面タンパク質Ａと３８％ の相同性を示した（Eiffert et．al.，1992）。 図２Ｂ ゼブラフィッシュ及びラットタンパク質の親水性分析（Kyle and Doolitle,1982 ）。タンパク質のアミノ末端は左側である。マイナスの値は、疎水性残基を示す 。アミノ末端の疎水領域は、シグナル配列として機能すると思われる（von Hei- jne,1985）。推定のシグナル配列のすぐ後に続いている開裂部分は、ヘアピン結 合部の必須条件に一致する塩基性領域である（Cardin and Weintraub,1989）。 図３Ａ E9.5ラット胎児中でのvhh-1mRNA発現のin situのハイブリダイゼーションによる 、ラットvhh-1mRNAの限局化。結節（nd）、及び結節の伴流にある、胎児の正中 線上の軸性の中胚葉において標識が検出された。前側が上側である。スケールバ ーは165μmである。 図３Ｂ E10.5ラット胎児におけるvhh-1の限局化を横から見たもの。脊索（［Ｃ-Ｅ］に おけるｎ）、並びにより脊髄の頭側の領域、すなわち後脳（ｈ）、及び中脳（ｍ ）における底板において、vhh-1のmRNA発現がある。腹側の間脳（ｄ）における 細胞もまた、vhh-1のmRNAを高レベルで発現する。更に、背側の中脳の一群の細 胞はvhh-1のmRNAを発現している。腸の内胚葉細胞においても該遺伝子を発現し ている。後の段階において、頭側の終脳の少数の細胞においてもまた、vhh-1mRN Aを発現している（データは掲載せず）。スケールバーは400μmである。 図３Ｃ E10ラット胎児における、神経板及びその周りを取り囲む組織を示す横断面図。v hh-1のmRNA発現は神経板の正中の下にある一群の細胞に集中している。スケール バーは100μmである。 図３Ｄ E10ラット胎児における、神経板及びその周りを取り囲む組織を示す横断面図。v hh-1のmRNA発現は脊索（ｎ）に集中している。スケールバーは100μmである。 図３Ｅ Ｅ11ラットの、脊髄及びその周りを取り囲む組織を示している横断面図。vhh-1 のmRNA発現は、底板（ｆ）及び脊索（ｎ）に対応し、この段階までには神経系の 腹側正中より除かれている、脊髄の腹側正中の細胞で検出される。脊髄の境界を 標識してある。スケールバーは180μmである。 図４Ａ ラットvhh-1を発現するプラスミドを注入されたカエルの胎児の背側神経管にお ける、F-スポンジン及びHNF-3βの異所性発現。CMVプロモータを使ってラットの vhh-1のmRNAを発現している、神経胚期（約１６期）にある、アフリカツメガエ ル胎児横断面図。該ラットvhh-1遺伝子は主として、神経板の半分において検出 される。外側の矢印は神経板の側方部分を表している。略語：npは神経板、ｎ は脊索、ｓは体節を意味する。 図４Ｂ オタマジャクシ期（約34期）にある胎児の側方の側面図で、アンチセンスvhh-1 をコードしたCMVプラスミドを注入した胎児における、F-スポンジンmRNAの発現 パターンを示すもの。F-スポンジンは神経管の腹側正中の底板（fp）、及び脊索 (ｎ)に対して腹側に位置する脊髄腹側（hypochord）（ｈ）で発現する。スケー ルバーは200μmである。 図４Ｃ オタマジャクシ期（約34期）にある胎児の側方の側面図で、センスvhh-1をコー ドしたCMVプラスミドを注入した胎児における、F-スポンジンmRNAの発現パター ンを示すもの。F-スポンジンmRNAの異所性が、背側神経管及び底板の近傍の背側 脳室において検出される（一番目と最後の矢印の頭）。F-スポンジン発現の異所 性は、後側の後脳及び脊髄で起きる。スケールバーは200μmである。 図４Ｄ アンチセンスvhh-1をコードしたCMVプラスミドを注入され、F-スポンジンmRNAの 発現を示している、オタマジャクシ期（約32-36期）にある胎児の横断面図。ア ンチセンスvhh-1をコードしたCMVプラスミドを注入した胎児は、底板（fp）に限 定された、F-スポンジンmRNA発現を示す。スケールバーは10μmである。 図４Ｅ センスvhh-1をコードしたCMVプラスミドを注入され、F-スポンジンmRNAの発現を 示している、オタマジャクシ期（約32-36期）にある胎児の横断面図。センスvhh -1をコードしたCMVプラスミドを注入された胎児でのF-スポンジンの発現の異所 性は、後脳の上衣板細胞で検出される。スケールバーは10μmである。 図４Ｆ センスvhh-1をコードしたCMVプラスミドを注入され、F-スポンジンmRNAの発現を 示している、オタマジャクシ期（約32-36期）にある胎児の横断面図。センスvhh -1をコードしたCMVプラスミドを注入された胎児でのF-スポンジンの発現の異所 性は、脊髄の上衣板細胞で検出される。スケールバーは10μmである。 図４Ｇ アンチセンスvhh-1をコードしたCMVプラスミドを注入され、HNF-3βタンパク質 の発現を示している、オタマジャクシ期（約32-36期）にある胎児の横断面図。 アンチセンスvhh-1をコードしたCMVプラスミドを注入された胎児は、底板（fp） に限定された、HNF-3βタンパク質の発現パターンを示す。スケールバーは10μm である。 図４Ｈ センスvhh-1をコードしたCMVプラスミドを注入され、HNF-3βタンパク質の発現 を示している、オタマジャクシ期（約32-36期）にある胎児の横断面図。HNF-3β タンパク質の、後脳の上衣板における発現の異所性は、vhh-1mRNAを発現する胎 児で検出できる。スケールバーは10μmである。 図４Ｉ センスvhh-1をコードしたCMVプラスミドを注入され、HNF-3βタンパク質の発現 を示している、オタマジャクシ期（約32-36期）にある胎児の横断面図。脊髄の 上衣板でのHNF-3βタンパク質の発現の異所性はvhh-1mRNAを発現する胎児におい て検出される。HNF-3βタンパク質の発現はまた、脊索（ｎ）において非常に低 いレベルで検出される。これら底板標識の異所性発現はまた、背側の中脳におい て検出される（データは示さず）スケールバーは10μmである。 図５Ａ 神経板移植片における、vhh-1による底板分化の誘導。E11ラットの、脊髄の腹側 領域の断面における、FP3抗原の発現パターン。FP3発現は底板細胞（ｆ）に限定 される。脊索（ｎ）は標識されない。スケールバーは35μmである。 図５Ｂ 神経板移植片における、vhh-1による底板分化の誘導。E11ラットの、脊髄の腹側 領域の断面における、FP4抗原の発現パターン。脊髄におけるFP4発現は底板細胞 （ｆ）に限定される。脊索（ｎ）はまた、FP4を発現する。スケールバーは35μm である。 図５Ｃ 神経板移植片における、vhh-1による底板分化の誘導。６期にあるニワトリの脊 索と接触させて96時間増殖させた、ラット神経植物移植片の細胞によるFP3の発 現。スケールバーは45μmである。 図５Ｄ 神経板移植片における、vhh-1による底板分化の誘導。６期にあるニワトリの脊 索と接触させて96時間増殖させた、ラット神経植物移植片の細胞によるFP4の発 現。スケールバーは45μmである。 図５Ｅ 神経板移植片における、vhh-1による底板分化の誘導。センスvhh-1をコードした cDNAで形質転換されたCOS細胞と接触して増殖させた神経板細胞内でのFP3の発現 を示す、位相差顕微鏡写真。神経板移植片とCOS細胞凝集物との接触領域におい て、FP3発現が強く起こる。スケールバーは50μmである。 図５Ｆ 神経板移植片における、vhh-1による底板分化の誘導。センスvhh-1をコードした cDNAで形質転換されたCOS細胞と接触して増殖させた神経板細胞内でのFP3の発現 を示す、蛍光顕微鏡写真。神経板移植片とCOS細胞凝集物との接触領域において 、FP3発現が強く起こる。スケールバーは50μmである。 図５Ｇ 神経板移植片における、vhh-1による底板分化の誘導。センスvhh-1をコードした cDNAで形質転換されたCOS細胞と接触して増殖させた神経板細胞内でのFP4の発現 を示す、位相差顕微鏡写真。FP4発現は、神経板（np）移植片とCOS細胞（ｃ）と の接触領域で検出される。COS細胞と神経板との接合部は点線で示してある。ス ケールバーは60μmである。 図５Ｈ 神経板移植片における、vhh-1による底板分化の誘導。センスvhh-1をコードした cDNAで形質転換されたCOS細胞と接触して増殖させた神経板細胞内でのFP4の発現 を示す、蛍光顕微鏡写真。神経板移植片（np）とCOS細胞(c)との接触領域におい て、FP4発現が検出される。COS細胞と神経板との接合部は点線で示してある。ス ケールバーは60μmである。 図５Ｊ 神経板移植片における、vhh-1による底板分化の誘導。アンチセンスvhh-1をコー ドしたcDNAで形質転換されたCOS細胞と接触して増殖させて、抗-FP3抗体で標識 した神経板移植片。FP3抗原は発現しなかった。スケールバーは60μmである。 図５Ｋ 神経板移植片における、vhh-1による底板分化の誘導。アンチセンスvhh-1をコー ドしたcDNAで形質転換されたCOS細胞と接触して増殖させて、抗-FP4抗体で標識 した神経板移植片。FP4抗原は発現しなかった。スケールバーは60μmである。 図６Ａ 神経移植片における、vhh-1による運動神経の分化誘導。Islet-1⁺運動神経を腹 側 脊髄において発現する、17期のニワトリの脊髄の断面。Islet-1⁺細胞もまた、該 脊髄に隣接して位置する背根神経節で検出される。スケールバーは70μmである 。 図６Ｂ 神経移植片における、vhh-1による運動神経の分化誘導。センスvhh-1をコードし たcDNAで形質転換された単層COS細胞と44時間増殖させた移植片の、位相差顕微 鏡写真。視野はIslet-1⁺細胞を含む３つの移植片を示している。神経板移植片の 下にCOS細胞の核(COS)がみえる。神経板移植片と単層のCOS細胞との間の境界を 示してある。スケールバーは70μmである。 図６Ｃ 神経移植片における、vhh-1による運動神経の分化誘導。センスvhh-1をコードし たcDNAで形質転換された単層COS細胞と44時間増殖させた移植片の、蛍光顕微鏡 写真。視野はIslet-1⁺細胞を含む３つの移植片を示している。神経板移植片の下 にCOS細胞の核(COS)がみえる。神経板移植片と単層のCOS細胞との間の境界を示 してある。スケールバーは70μmである。 図６Ｄ 神経移植片における、vhh-1による運動神経の分化誘導。底板（ｆ）、運動神経 （ｍ）、及び脊索（ｎ）におけるSC1の分布を示す、17期のニワトリの脊髄の断 面。スケールバーは70μmである。 図６Ｅ 神経移植片における、vhh-1による運動神経の分化誘導。vhh-1遺伝子で形質転換 され、SC1に対する抗体で標識されたCOS細胞上で44時間増殖させたニワトリの神 経板移植片の、単一視野の共焦点像。全てのSC1⁺細胞はその核内にIslet-1⁺を発 現する（図５Ｆと比較）。SC1⁺/Islet-1⁺の塊はこれらの移植片では検出されな かった（データは非掲載）。スケールバーは13μmである。 図６Ｆ 神経移植片における、vhh-1による運動神経の分化誘導。vhh-1遺伝子で形質転換 され、Islet-1⁺に対する抗体で標識されたCOS細胞上で44時間増殖させたニワト リの神経板移植片の、単一視野の共焦点像。スケールバーは13μmである。 図６Ｇ アンチセンスvhh-1をコードした遺伝子で形質転換され、抗Islet-1⁺で標識され た、単層のCOS細胞と48時間増殖させた神経板。Islet-1⁺の発現は全く検出され ない。スケールバーは70μmである。 図６Ｈ アンチセンスvhh-1をコードした遺伝子で形質転換され、抗SC-1で標識された、 単層のCOS細胞と48時間増殖させた神経板。SC-1の発現は全く検出されない。ス ケールバーは13μmである。 図７Ａ 後肢芽間葉の細胞はvhh-1をコードしたmRNAを発現し、また神経板移植片におい て底板の分化を誘導することが可能である。vhh-1をコードするmRNAの発現を、 肢芽の後側（ｐ）領域に位置する間葉細胞で示す、E11ラット胎児の後肢の断面 。間葉細胞の前側の領域(ａ)はvhh-1をコードしているmRNAを発現しない。外胚 葉細胞は、vhh-1mRNAを発現しない。スケールバーは、270μmである。 図７Ｂ 後肢芽間葉の細胞はvhh-1をコードしたmRNAを発現し、また神経板移植片におい て底板の分化を誘導することが可能である。ニワトリの後肢間葉と接触させて増 殖させた神経板細胞によるFP3の発現を示す位相差顕微鏡写真。神経板細胞はFP3 を発現する。スケールバーは60μmである。 図７Ｃ 後肢芽間葉の細胞はvhh-1をコードしたmRNAを発現し、また神経板移植片におい て底板の分化を誘導することが可能である。ニワトリの後肢間葉と接触させて増 殖させた神経板細胞によるFP3の発現を示す蛍光顕微鏡写真。神経板細胞はFP3を 発現する。スケールバーは60μmである。 図７Ｄ 神経移植片でのvhh-1による運動神経の分化誘導。ニワトリの後肢芽間葉と接触 させて増殖させた神経板細胞によるFP3の発現を示す位相差顕微鏡写真。FP3の発 現は検出されないスケールバーは60μmである。 図７Ｅ 神経移植片でのvhh-1による運動神経の分化誘導。ニワトリの後肢芽間葉と接触 させて増殖させた神経板細胞によるFP3の発現を示す蛍光顕微鏡写真。FP3の発現 は検出されないスケールバーは60μmである。 図８Ａ vhh-1/shh及びIslet-1⁺は、ニワトリ胎児のの近傍の腹側領域で発現する。 (Ａ)HH期18/19のニワトリ胎児の中枢神経系におけるvhh-1/shh発現の領域を示す 矢状図（影を付けた部分）。点線は軸性レベルを示し、切断面はパネルＢ-Ｋに 示してある。 (Ｂ-Ｋ)中枢神経系の近傍の腹側領域で、vhh-1/shh(藍色)のmRNA、及びIslet-1( 茶色)が発現している領域。 図８Ｂ (Ｂ)底板の腹側正中でのvhh-1/shhの発現と、運動神経の側面でのIslet-1の発現 とを示す尾側菱脳の横行断面図。 図８Ｃ (Ｃ)中脳、間脳、及び終脳の腹側におけるvhh-1/shhの発現を示す、神経管の矢 状断面図。中脳及び頭側の間脳では、Islet-1を発現している細胞は、vhh-1/shh を発現している腹側領域の近傍に位置する。vhh-1/shhの発現は、視神経交差の 頭側にある基底終脳(矢印の頭)で検出され、ここではIslet-1細胞が、vhh-1/shh 発現領域の腹側と頭側に見られる。腹側間脳の最も頭側の部分で、視神経交差に 接しているところに、vhh-1/shhを発現していない領域があることに注意された い。 図８Ｄ (Ｄ)漏斗（i）のレベルでの間脳の中部の横行断面図。vhh-1/shhを発現する細胞 は、二つの両側的な横紋を形成する。Islet-1を発現する細胞は、vhh-1/shh発現 領域の側方端に位置する。Islet-1⁺細胞は、漏斗レベルで腹側正中には存在しな い。ラトケ嚢（ｒ）の腹側領域の細胞は、Islet-1を発現する。 図８Ｅ (Ｅ)HH期13にある頭側間脳において、Islet-1を発現する細胞は、所々にvhh-1/s hhを発現する細胞と混ざっている。二重標識方法では、vhh-1/shhとIslet-1とを この段階で共発現しているかどうかはわからない。 図８Ｆ (Ｆ)vhh-1/shhを腹側正中で発現していることを示す中脳の横行断面図。この段 階では、Islet-1⁺の少数の感覚神経もまた、三叉神経中脳核の背側に検出される 。 図８Ｇ (Ｇ)vhh-1/shh発現領域が正中に対しての側方にまで延出し、Islet-1細胞がvhh- 1/shh発現領域の正中に対しての側方に位置することを示す、(Ｆ)の高倍率像。 図８Ｈ (Ｈ)腹側正中でのvhh-1及びIslet-1の発現を示す頭側間脳のレベルでの横行断 面図。 図８Ｉ (Ｉ)頭側間脳の腹側正中を示す、(Ｈ)の高倍率像。vhh-1/shh及びIslet-1の両方 とも、頭側間脳の正中で発現する。vhh-1/shhは脳室領域で発現するのに対し、I slet-1⁺細胞は基底に位置する。 図８Ｊ (Ｊ)終脳の底でvhh-1/shh及びIslet-1細胞を示す、尾側終脳の横行断面図。 図８Ｋ (Ｋ)（Ｊ）の高倍率像。腹側終脳において、vhh-1/shh及びIslet-1を発現する細 胞は、腹側中枢神経系の尾側領域においてよりもより分散して存在する。終脳の 腹側正中の縫合部における細胞がvhh-1/shhを発現しないことは、首尾一貫した 観察である。ニワトリIslet-2のmRNAを使って、全マウントのin situハイブリダ イゼーションを行った（Tsuchida et al.，1994）。ニワトリIslet-2のmRNAは、 菱脳、中脳、間脳、及び終脳レベルでは発現しておらず、Islet-1抗血清で検出 された免疫反応性はIslet-1タンパク質によるものである（データは非掲載）。 略語： i:漏斗、di:間脳、me:中脳、te:終脳。スケールバーは、B,G,I,Kでは50 μm、C,F,H,Jでは200μm、Dでは100μm、Eでは25μm。 図９Ａ (Ａ)細胞種マーカの発現を示している、HH期18/19のニワトリ胎児の神経管の矢 状断面図。(i)図８での全マウント標識由来の、vhh-1/shh（点を打ってある部分 ）、及びIslet-1(赤)の発現領域の要約図。（ii）Islet-1⁺ニューロンにおける マーカの共発現を示す要約図。菱脳(ｒ)及び中脳(ｍ)において、腹側のIslet-1⁺ ニューロンは、表面免疫グロブリンタンパク質であるSC1（緑）を共発現する。 腹側間脳においては、Lim-1⁺細胞は発現しているが、Islet-1⁺ニューロンは、尾 側部の大部分で存在しない。視床間境界帯（zona limitans interthalamica）に 対 して頭側にある、間脳中部の領域において(Puelles et al.,1987)、また頭側間 脳の腹側正中において、多くのIslet-1⁺ニューロンはLim-1(青い領域)を共発現 する。漏斗（i）の上の、間脳中部の介在領域においては、Islet-1及びLim-1は 別々に発現しているが、混合したニューロンの集合体である（茶色と赤い横紋で 示される領域）。腹側終脳では、Islet-1⁺ニューロン（赤い領域）はSC1もLim-1 も発現しない。簡単にするために、視床間境界帯（zona limitans intertha-lam ica）に対して頭側にある、間脳中部の領域の全背腹範囲を占めている、神経上 皮性のLim-1発現はこの図には示していない。（iii）Nkx2.1タンパク質を発現し ている腹側領域の要約図。小さい矢印は、パネルＢ-Ｊで示した断面の面を示す 。 図９Ｂ (Ｂ)眼球（III）の核の運動神経はIslet-1⁺（赤）とSC1（緑）とを共発現してい ることを示す、間脳の横断面図の腹側の詳細。眼球のニューロンは、もっとも頭 側に位置した、SC1を共発現するIslet-1⁺細胞の集合である。より尾側レベルの 体性内蔵（somatic visceral）及び上腕運動神経もまたSC1を発現する（Simon e t al.，1994も参照のこと）。 図９Ｃ (Ｃ)Islet-1⁺ニューロンがSC1を発現していないことを示す頭側間脳の横断面図 の腹側の詳細。Islet-1を発現しない、より頭側に位置するニューロン由来の(Ｃ )における、SC1で標識した軸索。 図９Ｄ (Ｄ)Nkx2.1をほとんどの細胞で発現していることを示す腹側終脳の横断面図の詳 細。 図９Ｅ、９Ｆ (Ｅ、Ｆ)実質上、すべての未分化神経上皮細胞がLim-1を低レベルで発現してい ること（Ｆ）、及びIslet-1⁺ニューロン（Ｅ、赤）もまた、Lim-1を共発現して いること（（Ｆ）の黄色）を示している、漏斗に対して背側の間脳中部の外側部 の横断面図の詳細（低倍率は図８Ｄを参照のこと）。 図９Ｇ、９Ｈ、９Ｉ (Ｇ、Ｈ、Ｉ)Islet-1⁺ニューロン（I）（赤）がLim-1（H）(緑)を発現している ことを示す頭側間脳の横断面図の腹側の詳細。(I)は(Ｇ)及び(Ｈ)が二重に露出 されて、標識細胞が重なり合っていることを示している。 図９Ｊ (Ｊ)Islet-1(ローダミン)及びLim-1(FITC)の二重露出での黄色の細胞が存在しな いことで、Islet-¹⁺ユーロンがLim-1を発現しないことを示している、腹側終脳 の冠状断面図の腹側の詳細。略語: r:菱脳、m:中脳、d:間脳、t:終脳、i:漏斗 。(Ｂ-Ｊ)に示された断面は、HH期18/19の胎児からのものである。スケールバー は、Ｂでは160μm、Ｃ、Ｅ-Ｉでは25μm、Ｄ、Ｊでは20μmである。 図１０Ａ (Ａ)神経板の異なる体軸方向レベル由来の移植片において、vhh-1/shhはIslet-1⁺ ニューロンを誘導する。（Ａ）全マウントin situハイブリダイゼーションで示 される、HH期６のニワトリ胎児の正中において発現しているvhh-1/shhのmRNA。 このような胎児の断面は、vhh-1/shhのmRNAが神経外胚葉、及びその下の中胚葉 において発現していることを示している（データは非掲載）。in vitroアッセイ で単離した神経板の、前向きの終脳（Ｔ）、間脳（Ｄ）、菱脳（Ｒ）の領域の位 置が示されている。頭部の折り重ね部が上側で、神経外胚葉／外胚葉のおおよそ の境界を─で示してある。点線は、胚盤葉上層のおおよその境界を示している。 Ｂ-Ｍの免疫蛍光顕微鏡写真は、センス又はアンチセンスのvhh-1 cDNAで形質転 換されたCOS細胞上で約65時間培養した移植片を示す。 図10Ｂ及び10Ｃ (Ｂ、Ｃ)アンチセンスvhh-1/shhで形質転換されたCOS細胞上で増殖させた菱脳レ ベルの移植片の断面図。β-チューブリン⁺ニューロンは分化した（Ｃ）にも関わ らず、Islet-1⁺細胞は検出されない（Ｂ）。 図10Ｄ及び10Ｅ (Ｄ、Ｅ)センスvhh-1/shhで形質転換されたCOS細胞上で増殖させた菱脳レベルの 移植片の断面図。数多くのIslet-1⁺細胞が検出され（Ｄ）、実質的にそのすべて でβ-チューブリンを発現している（Ｅ）。 図10Ｆ及び10Ｇ (Ｆ、Ｇ)アンチセンスvhh-1/shhで形質転換されたCOS細胞上で増殖させた間脳レ ベルの移植片の断面図。β-チューブリン⁺ニューロンは存在するのに（Ｇ）、Is let-1⁺細胞は検出されない（Ｆ）。 図10Ｈ及び10Ｉ (Ｈ、Ｉ)センスvhh-1/shhで形質転換されたCOS細胞上で増殖させた間脳レベルの 移植片の断面図。数多くのIslet-1⁺細胞が存在し、これらはβ-チューブリンを 共発現している（Ｉ）。 図10Ｊ及び10Ｋ (Ｊ、Ｋ)アンチセンスvhh-1/shhで形質転換されたCOS細胞上で増殖させた終脳レ ベルの移植片の断面図。β-チューブリン⁺ニューロンは分化したのに（Ｋ）、Is let-1⁺細胞は検出されない（Ｊ）。 図10Ｌ及び10Ｍ (Ｌ、Ｍ)センスvhh-1/shhで形質転換されたCOS細胞上で増殖させた終脳レベルの 移植片の断面図。数多くのIslet-1⁺細胞が存在し（Ｌ）、これらはβ-チューブ リンを共発現している。スケールバーは、Ａでは250μmで、Ｂ-Ｍでは25μmであ る。 図11Ａ及び11Ｂ SC1発現は、神経板の頭側及び尾側レベル由来の移植片においての、vhh-1/shhに よって誘導されたIslet-1⁺細胞を区別する。（Ａ、Ｂ）vhh-1/shhに露出した菱 脳レベルの神経板移植片の断面の免疫蛍光顕微鏡写真。同じ断面の二重標識像に より、Islet-1⁺細胞（Ａ）が、SC1(Ｂ)を発現することを示している。(Ａ)及び( Ｂ)の矢印は、同じ細胞を示す。 図11Ｃ及び11Ｄ (Ｃ、Ｄ)菱脳レベルの移植片の細胞のパッチはSC1(Ｄ)を発現しているが、Islet -1は発現していない（Ｃ）。これらのSC1⁺細胞はFP1を共発現し（データは非掲 載である）、底板細胞であることを示している。 図11Ｅ及び11Ｆ (Ｅ、Ｆ)vhh-1/shhに露出した間脳レベルの神経板移植片の断面を表す免疫蛍光 顕微鏡写真。Islet-1⁺細胞（Ｅ）は SC1を共発現しない（Ｆ）。 図11Ｇ及び11Ｈ (Ｇ、Ｈ)vhh-1/shhに露出した終脳レベルの神経板移植片の断面を表す免疫蛍光 顕微鏡写真。Islet-1⁺細胞（Ｇ）はSC1を共発現しない（Ｈ）。スケールバーは 、Ａ、Ｂ、Ｅ-Ｈでは10μmで、Ｃ、Ｄでは25μmである。 図12Ａ Nkx2.1及びLim-1の発現は、間脳及び終脳レベルの神経板移植片においてvhh-1/s hhによって誘導される腹側のニューロンを区別する。 (Ａ-Ｃ)vhh-1/shhに露出した、異なる軸性レベルからの神経板移植片におけるNk x2.1の発現。（Ａ） 図12Ｂ (Ｂ)vhh-1/shhに露出した間脳レベルの神経板移植片におけるNkx2.1の発現。 図12Ｃ (Ｃ)vhh-1/shhに露出した終脳レベルの神経板移植片におけるNkx2.1の発現。vhh -1/shhに露出しなかった神経板移植片ではNkx2.1の発現は見られなかった（デー タは非掲載である）。 図12Ｄ (Ｄ)Lim-1⁺細胞は、vhh-1/shhに露出しなかった神経板移植片に存在する。 図12Ｅ及び12Ｆ (Ｅ、Ｆ)vhh-1/shhに露出した間脳レベルの移植片において、多くのIslet-1⁺細 胞はLim-1を発現する（Ｆ）。矢印は、Islet-1とLim-1とを共発現する幾つかの 細胞を示す。Islet-1⁺/Lim-1^-、及びIslet-1^-/Lim-1⁺細胞もまた存在することに 注意されたし。 図12Ｇ (Ｇ)vhh-1/shhに露出しなかった、終脳レベルの神経板移植片においては、Lim-1⁺ 細胞は検出されない。 図12Ｈ及び12Ｉ (Ｈ、Ｉ)vhh-1/shhに露出した、終脳レベルの神経板移植片のIslet-1⁺細胞(Ｈ) はLim-1を発現しない(Ｉ)。vhh-1/shhに露出した後においてさえも、終脳レベル の移植片において、Lim-1⁺細胞は存在しないことに注意されたし。同様の結果が 20個の移植片においても得られた。スケールバーは20μmである。 図13Ａ 底板及び頭側間脳正中の細胞は、腹側ニューロンを異なる脳脊髄幹において誘導 するvhh-1/shhの能力を模倣する。 (Ａ)Islet-1⁺ニューロンは底板により、菱脳レベルの神経板移植片において誘導 される。これらの細胞は、SC1を共発現する（データは非掲載である）。 図13Ｂ (Ｂ)菱脳レベルの移植片においては、底板によってNkx2.1は誘導されない。 図13Ｃ (Ｃ)頭側間脳組織は、終脳レベル神経板移植片においてIslet-1⁺細胞（緑）を誘 導する。マウス起源の間脳組織は、抗-ネスチン免疫反応性により表され（赤） 、少数のIslet-1⁺ニューロン（黄色）を含む。誘導された終脳のIslet-1⁺ニュー ロンは、SC1を発現しない（データは非掲載である）。終脳移植片における約10 から20％の細胞はIslet-1を発現した。 図13Ｄ及び13Ｅ (Ｄ、Ｅ)終脳レベルの移植片において、底板組織はIslet-1⁺ニューロン（Ｄ）を 誘導する。これらのニューロンは、SC1を共発現しない（Ｅ）。底板組織はこの 視野には示されていない。 図13Ｆ (Ｆ)終脳レベルの移植片において、底板はNkx2.1⁺細胞を誘導する。スケールバ ーは、Ａ、Ｂでは15μm、Ｃでは30μm、Ｄ、Ｅでは10μm、Ｆでは12μmである。 図14Ｆ 脊索による底板及び運動神経の分化誘導は、細胞接触依存性により区別がつく。 (Ａ)脊索非存在下で36時間増殖させ、HNF-3β、並びにIsl-1及び／もしくはIsl- 2（Isl^-細胞）に向けられた抗体で標識された神経板。HNF3β⁺細胞もIsl⁺細胞も 検出されなかった。 図14Ｂ (Ｂ)脊索存在下で36時間増殖させた神経板（ｎ）。HNF-3β⁺細胞（赤）及びIsl⁺ 細胞（緑）は誘導される。HNF-3⁺細胞は、Isl⁺よりも脊索／神経板接合部により 近いところに位置する。 図14Ｃ (Ｃ)脊索と接触することで、神経板移植片において誘導されたIsl⁺細胞（緑）は 、表面免役グロブリン様タンパク質（赤）を共発現する。Islタンパク質を発現 しないSCl⁺のパッチ（矢印の頭）は底板細胞に対応する（34）。 図14Ｄ (D)脊索との接触はIsl-2⁺細胞（緑）を神経板移植片内で誘導する。HNF-3β⁺細 胞(赤)もまた含まれる。 図14Ｅ (E)脊索との接触によるHNF-3β及びNetrin-1のmRNA誘導のRT-PCR分析。矢印のつ いた下のバンドは、RT-PCR反応の効率の対照のために入れた競合のテンプレート を示す。中間体神経板移植片（［i］）及び脊索（ｎ）は、単独で36時間培養し てもどちらの遺伝子も発現しない。脊索との接触（n+［i］）はHNF3β及びNetri n-1発現を誘導する（上のバンド）。 図14Ｆ (Ｆ)脊索との接触による、Isl-1、Isl-2、及びChATのmRNA誘導のRT-PCR分析。中 間体神経板移植片（［i］）及び脊索(ｎ)は、単独で36時間培養してもIsl-1、Is l-2、及びChATを発現しない。脊索との接触（n+［i］）はこれら全ての遺伝子の 発現を誘導する（上のバンド）。矢印の頭で標識された下のバンドは、RT-PCR反 応の効率の対照のために入れた内部標準を示す。E及びＦの結果は同じ組の実験 のRNAから得た。同様の結果が６つの実験で得られた。 図14Ｇ (Ｇ)核孔フィルタを使って、脊索より分離し、in vitroで36時間増殖させた神経 板移植片は、Isl⁺（緑）を含むが、HNF3β⁺細胞を含まない。 図14Ｈ (Ｈ)神経板移植片に存在し、フィルタ越しに脊索に増殖したIsl⁺細胞（緑）はSC 1(赤)を発現し、これはこの細胞が運動ニューロンであることを示している。SC1⁺ /Isl^-細胞のパッチは検出されなかったが、これは底板の分化が起きないことを 示している。同様の結果が、核孔または透析膜フィルタを使った４つの独立した 実験で得られた。スケールバーはA、Ｃでは20μm、Bでは100μm、D、Ｇでは33μ mである。 図15Ａ Shh/vhh-1を発現するCOS細胞は接触依存性の底板及び拡散性運動ニューロン誘導 活性を呈する。 (Ａ)vhh-1で形質転換したCOS細胞と、36時間接触して増殖させた神経板移植片は 、HNF3β⁺(赤)及びIsl⁺（緑）細胞を含む。二つの細胞群が混ざり合っている。 明かに黄色い細胞は、共焦点における重なり合った二つの異なる核を示す。 図15Ｂ (Ｂ)vhh-1で形質転換したCOS細胞と、接触して増殖させた神経板移植片のIsl⁺ニ ューロン（緑）は、SC1(赤)を発現する。SC1を共発現しないIsl⁺ニューロンはお そらく、新たに分化した運動神経を示している。 図15Ｃ (Ｃ)vhh-1で形質転換したCOS細胞と、接触して増殖させた、中間体神経板におけ る多くのIsl⁺ニューロンは、Isl-2(オレンジ色の細胞)を共発現する。 図15Ｄ (Ｄ)vhh-1で形質転換した、コラーゲンゲル内のCOS細胞より分離し、36時間増殖 させた神経板移植片は、Isl⁺細胞（緑）を含むが、HNF3β細胞（赤）は含まない 。 図15Ｅ (Ｅ)vhh-1で形質転換したCOS細胞より離れて誘導させたIsl⁺ニューロンは、SC1( 赤)を共発現する、運動神経である。 図15Ｆ (Ｆ)オレンジ色に標識された核で示されているように、vhh-1で形質転換したCOS 細胞より離れて誘導させたＩIsl⁺ニューロン（緑）は、Isl-2（赤）を共発現す る。vhh-1で形質転換したCOS細胞と接触させて、またはアンチセンスvhh-1のcDN Aで形質転換したCOS細胞より離れて誘導させた中間体神経板は、HNF3β⁺、Isl-1⁺ 、Isl-2⁺細胞を含まなかった（表２及び非掲載データ）。 図15Ｇ (Ｇ)vhh-1で形質転換したCOS細胞による神経板誘導の、RT-PCRによる分析。HNF3 β及びNetrin-1発現は、vhh-1で形質転換したCOS細胞と接触させて増殖させた神 経板移植片において誘導されるが（レーン1）、アンチセンスvhh-1のcDNAで形質 転換したCOS細胞と接触させて増殖させたとき（レーン2）には誘導されない。HN F3β及びNetrin-1発現は、vhh-1で形質転換したCOS細胞と離れて増殖させた場合 (レーン3)も、アンチセンスvhh-1のcDNAで形質転換したCOS細胞と離れて増殖さ せた場合（レーン4）も誘導されない。同じ実験で、神経板移植片と接触させて 増殖させた脊索は、HNF3β及びNetrin-1の発現を誘導する(レーン5)。 図15Ｈ (Ｈ)vhh-1で形質転換したCOS細胞による運動神経誘導の、RT-PCRによる分析。Is l-1及びChATの発現は、vhh-1で形質転換したCOS細胞と接触させて増殖させ た神経板移植片において誘導される（レーン2）。Isl-1及びChATの発現はまた、 vhh-1ので形質転換したCOS細胞から離れて増殖させた神経板移植片でも誘導され る（レーン3）。Isl-1及びChATの発現は、アンチセンスvhh-1で形質転換したCOS 細胞に露出した神経板移植片では誘導されない（レーン2及び4）。神経板移植片 と接触させて増殖させた脊索は、Isl-1及びChATの両方を誘導する（レーン5）。 パネルＡ-Ｈに示した結果は、６つの異なる実験で繰り返された。スケールバー は、AとDでは16μmで、CとFでは33μmである。 図16Ａ 神経板移植片へのvhh-1の形質転換による、底板及び運動神経の分化の誘導。(Ａ )モック形質転換（^-）移植片ではなく、CMV vhh-1での形質転換（vhh-1）後48時 間に行った、神経板移植片での神経板及び運動神経のマーカ発現のRT-PCR分析。 Isl-1もまた、NT3非存在下で増殖させたvhh-1形質転換の神経板で検出できたが 、低レベルであった（データは非掲載）。おそらく形質転換の実験方法の結果と しての細胞の損傷に起因する高バックグラウンドがあったにも関わらず、HNF3β 及びIslの免役反応性を発現する細胞も検出された（データは非掲載）。 図16Ｂ (Ｂ)CMV vhh-1 cDNAの発現用構築物で形質転換した神経板移植片におけるHNF3β 及びIsl-1の発現の経時変化。（i）この実験では、形質転換後10時間又は20時間 たってもIsl-1とHNF3βは共に発現しなかったが（レーン1と2）、30時間と40時 間とでは検出された（レーン3と4）。Netrin-1及びIsl-2もまた、30時間後以降 に発現した（データは非掲載）。（ii）この実験では、Isl-1の発現は10時間の 段階では明かではなく（レーン1）、22時間目ではじめて検出された（レーン2） 。対照的に、HNF3βの発現は、40時間目には発現したが、22時間後でも24時間後 でも検出されなかった（レーン2と3）。Isl-1の発現が、HNF3βの発現前に、又 は同時発現としておきるという結果は、４つの異なる実験で得られた。更に３つ の実験において、HNF3βの発現は検出されなかったのに、Isl-1の発現は検出さ れた。Isl-1はまたNT3に非存在下で増殖させた、vhh-1形質転換 済みの神経板移植片においても検出された（データは非掲載である。また以下も 参照のこと）。 図17Ａ Shh/vhh-1による、底板及び運動神経の分化の独立した誘導。図は、脊索（濃い 網かけ部分）由来のshh/vhh-1が底板（fp）及び運動神経（MN）の分化を独立し て誘導する、二つの可能な機序を表している。 (Ａ)底板及び運動神経の分化は、自己蛋白質分解（28）によって生じる異なる断 片によって介在される。ヘッジホッグのアミノ末端（Ｎ）の断片は、その大部分 が細胞表面と結合したままであるが、一方、カルボキシ末端（Ｃ）は、自由に拡 散できる（28）。ゆえにこの図では、Nは底板分化の接触依存性誘導を介在する ものとして、また、より長い範囲のCは、運動神経の接触非依存性誘導を介在す るものとして描かれている。 図17Ｂ (Ｂ)底板及び運動神経の分化は、shh/vhh-1の同じ分子種による、異なる濃度に よって介在される。脊索のすぐ上部にある神経板細胞は、底板に分化するため、 図は高濃度のshh/vhh-1（→）が底板の分化誘導に必要であることを示している 。より低いshh/vhh-1の濃度（--→）は、底板の分化とは独立に運動神経の分化 を開始させる。 図18Ａ、18Ｂ、18Ｃ vhh-1、ピンタラビス、グースコイド、及びHNF3βに関する、胎児の正中発現。 全てのパネルは、ノマルスキー像を示し、（Ａ、Ｅ、Ｊ-Ｍ、Ｏ、Ｑ）は全マウ ントin situハイブリダイゼーション、（Ｆ−Ｉ、Ｎ、Ｐ）はアンチセンスvhh-1 のRNAプローブで標識した組織切片、（Ｂ、Ｅ、Ｉ）はアンチセンスのピンタラ ビスRNAプローブ、（Ｃ）はグースコイドのRNAプローブ、（Ｏ、Ｐ）はHNF3βに 向けられた抗体のものである。 (Ａ-Ｃ)初期の（10期）の原腸胚におけるvhh-1（Ａ）、ピンタラビス（Ｂ）、 及びグースコイド（Ｃ）の発現。初期の腹側原口のふち（dbp）、又はピンタラ ビス及びグースコイドを発現する形成体領域（Ａ）からのmRNAが存在していない ことに注目されたい。パネルは腹側部を上にした（Ａ、Ｃ）、または少し右にし た(Ｂ)植物極から見た図である。 図18Ｄ及び18Ｅ (Ｄ、Ｅ)vhh-1は脊索（n）の細胞で、脊索が形成されるにつれて発現するが、原 口近くの尾部の芽領域になるところでは存在していない（bp,D）。一方、ピンタ ラビスは脊索中で発現しており、その中には原口近くの細胞が含まれる（E）。v hh-1及びピンタラビスはともに、全索（prechordal）板（a:前側、p:後側）にお いて発現している。パネルは後側を左側にした腹側図を示す。 図18Ｆ、18Ｇ、18Ｈ、及び18Ｉ アンチセンスvhh-1 RNAのプローブ（F-H）、またはアンチセンスのピンタラビス RNAプローブ（I）の全マウントにより標識した、原腸胚及び神経胚期にある胎児 の正中領域の横断面図。初期の原腸期（約11期、Ｆ）では、vhh-1の発現は脊索( n)では検出されるが、神経板（np）細胞では検出されない。脊索内ではvhh-1の 発現は主として、神経板の下部にある腹側の細胞に集中する。後期の原腸胚期( 約12.5から13期、Ｇ)では、脊索内でのvhh-1の発現は、高レベルで多くの腹側細 胞内で検出され、神経板の表面（s）ではなく深部（d）の細胞で検出される(Sch roeder,1970)。初期の神経胚期（約15期）においてvhh-1は、脊索（n）上に三角 形を形成する、中程度の深部（md）の神経板細胞で発現するが、近くの中間深部 （id）や中間表面（ms）の細胞では発現しない（H）。脊索での発現レベルは非 常に低い。神経管の閉鎖（約20期）に続いて、vhh-1の発現はまだmd細胞に限定 される（データは非掲載である）。より成長した胎児（約24期以降）では、mdと ms細胞は神経幹の腹側正中で混ざりあい、vhh-1の発現は底板の全ての腹側正中 細胞（約36期、N）で検出される。ピンタラビスのmRNAもまた、神経板の深部（d ）の細胞で検出されるが、神経板の表面（s）の細胞（I）、及び脊索の下部にあ って脊髄腹側（hypochord）を形成する、正中内胚葉の細胞（en）では検出さ れない。（Ｆ、Ｇ）でのvhh-1と比較して、ピンタラビスの発現が、脊索で均一 に分布することに注目されたい。s:体節。全てのパネルでは、腹側が上である。 図18Ｊ、18Ｋ、18Ｌ、及び18Ｍ （Ｊ-Ｍ）神経胚（15期、Ｊ）、尾部の芽（約20期、及び約26期、それぞれＫ及 びＬ）、及びオタマジャクシ期（約36期、Ｍ）の胎児における全マウント標識に よる、vhh-1のmRNAの発現。初期の神経胚期（約15期、Ｊ）において、vhh-1は底 板（fp）、前索板中胚葉（pp）、及び近くの前側内胚葉で、高レベルで発現され るが、一方、脊索（n）でのその発現は、初期よりもより低い。脊索においては 、前側から後側の領域へと、vhh-1のmRNAの漸進的喪失があることが分かる。vhh -1はまた、前索板に重なり合った前脳の腹側の細胞で発現する。初期の尾部芽期 （約20期、K）においては、vhh-1は後脳及び中脳（m）の底板、並びに間脳(d)及 び前脳の下にある前脳板中胚葉（pp）で高レベルで検出される。vhh-1のmRNAも また、前脳板に対して前側にある、咽頭の内胚葉（pe）で検出される。脊索（n ）及び終脳（t）では、発現は検出されない。vhh-1を腹側間脳で発現する細胞と 、vhh-1を腹側終脳で発現しない細胞との間の鮮明な境界に注意されたし。後期 の尾部芽期（約26期、Ｌ）では、vhh-1はまだ底板(fp)及び腹側間脳(vd)の正中 線細胞で発現しているが、終脳（t）では発現していない。vhh-1の発現は脊索（ n）では検出できないが、前索板及び前側内胚葉（en）においては残存している 。脳が分化するにつれて、より外側の領域にある後側間脳で発現が起きる（Ｌ、 無標識矢印）。外側間脳での発現は、広い両側的横紋からなる。vhh-1の発現は また、終脳（t）に対して腹側で、結合腺に対して背側の、嗅板（op）に対応し た前側位においても見られる。 vhh-1のmRNAの発現はオタマジャクシ（約36期、M）の、底板（fp）全体、腹側- 後側間脳領域、及び広い両側的間脳（d）の横紋において、高レベルで検出され る。より後の段階（40期以降）では、発現は腹側終脳の少数の細胞群において検 出される（データは非掲載である）。vhh-1はオタマジャクシ期において、脊索( n)で再発現される。尾部芽（tb）はvhh-1を発現しないが、脊髄腹側（脊索に対 して腹側にある）を形成する細胞、脊索、及び底板において、これらが尾部芽 を離れてすぐに発現は検出される（データは非掲載である）。頭部では、えらの 内胚葉（ge）、及び終脳（t）の近傍の前鼻領域においてvhh-1は広く発現される 。より後の段階では（約51期）、vhh-1の発現はまた、後肢芽の後側間葉、並び に底板及び視床下部の領域を含む脳の種々の領域において検出される（データは 非掲載である）。全てのパネルは背側側を上にし、前側末端を左にした、外側図 を示している。 図18Ｏ オタマジャクシ期（約36期）の胎児のHNF3βタンパク質の発現。HNF3βの発現は 核で起きる。中枢神経系内では、HNF3βを発現する細胞が、中脳（m）の腹側正 中底板（fp）、後脳、及び脊髄に見られる。頭側間脳（d）の腹側領域、及び終 脳(t)においては、HNF3βは発現していない。しかしながら、vhh-1（L、M）やF- スポンジン（Ruiz i Altaba et al.，1993a）の様に、HNF3βの発現は後側間脳( Ｏにおける無標識の矢印)にある、大きな核を有した、より外側の細胞（おそら くニューロン）で検出される。HNF3βはまた、えら及び前腸（foregut）のへこ みに並ぶ後側内胚葉細胞、並びにより低いレベルの後側内胚葉細胞において、発 現される（データは非掲載である）。HNF3βタンパク質及びmRNAの発現（Ruiz i Altaba et al.，1993b）は、一致する。数字はロンボメアを意味する。ロンボ メア４は鼻小胞の近くに位置する。パネルは腹側を上側にし、後側末端を左にし た外側図を示す。 図18Ｎ及び18Ｐ (Ｎ、Ｐ)脊髄（sc）の底板（fp）においてvhh-1(n)及びHNF3β(p)の発現を示す オタマジャクシ期（約36期）の胎児の組織学的断面。HNF3βではなくvhh-1はま た、脊索（n）全体で高レベルで発現している。HNF3βを発現している細胞は底 板、腹側脳室領域すぐ近く（P、Ruiz i Altaba et al.，1993a、bも参照された し）、及びvhh-1（N）やF-スポンジン（Ruiz i Altaba et al.，1993a）のよう なその他の底板マーカを発現しない領域において検出される。後脳内では、HNF3 βの発現は著しいロンボメアの多様性を示す。ロンボメア３及び５のHNF3 βは底板細胞のみに発現されるのに対し、一方ロンボメア2、4、及び６では、発 現は近くの脳室細胞にまでのびる（Ｏ及び非掲載データ）。これらの、HNF3βを 発現した非底板細胞の出現は、神経管細胞から底板への応答が喪失した後に起き る可能性がある。腹側は上側である。 図18Ｑ （Ｑ）オタマジャクシ期（約36期）の外嚢胚（exogastrulae）におけるvhh-1の 発現。完全な外嚢胚においては、vhh-1のmRNAは、初期の脊索（n）及び前索板( データ非掲載)、並びに後期のえら（ge）の内胚葉を含む、脊索及び後側内胚葉 において発現する。脊髄腹側においても発現は検出される（データは非掲載）。 一つの例において、vhh-1の発現が、神経外胚葉（ne）を含む外胚葉嚢で検出さ れた。このパネルは外胚葉及び内胚葉の両方の前側を右側にした外側図を示す。 vhh-1のセンスRNAプローブによるin situハイブリダイゼーションでは、特異的 な標識は何も得られなかった（データは非掲載）。スケールバーは、Ａ-Ｃ、Ｅ 、及びＭでは500μm、Ｄ、Ｊ、及びＬでは450μm、Ｆ-Ｉでは80μm、Ｋ及びＮで は300μm、Ｐでは150μm、Ｑでは70μmである。 図19Ａ、19Ｂ、及び19Ｃ 注入したプラスミドからの、vhh-1及びHNF3βの、よく広がった異所性発現。(Ａ )注入したプラスミドからのvhh-1のmRNAの発現（方法を参照されたし）。 Ａ）カエルvhh-1を注入され、初期の原腸胚（約11.5期）で分析されたカエルの 胎児において、vhh-1のmRNAの異所性が高レベルで背側（d）外胚葉細胞内の大き なパッチで検出される。Ｂ）同様に、ラットのvhh-1プラスミドを注入したラッ トの、後期原腸胚-初期神経胚期(約12.5から15期)の胎児におけるvhh-1mRNAの発 現は、神経内胚葉（矢印）で検出される。オタマジャクシ期（約38期）では、ラ ットのvhh-1mRNAはモザイク状に検出される。 図19Ｄ、19Ｅ、及び19Ｆ HNF3βプラスミドを注入した後のHNF3βタンパク質の発現。 (Ｄ)原腸胚期（約12期）にある胎児の神経性及び非神経性外胚葉の大型のパッチ における、核内HNF3βタンパク質の発現。 (Ｅ)外胚葉における、標識された細胞(矢印)の優勢な局在化を示している、(Ｄ) と同様な組織学的断面。下部にある中胚葉での発現は、散らばった単一の細胞に 集中する。内在性のHNF3β遺伝子は、内胚葉及び外胚葉細胞でこれらの段階では 転写されない（Ruiz i Altaba et al.，1993 b）。 (Ｆ)オタマジャクシ期（約36期）では、HNF3βタンパク質はvhh-1で見られたよ うに、内胚葉及び底板（fp）で内在性遺伝子が発現するのに加えて、モザイク状 のパターンで検出される。しかし、HNF3βの発現はしばしば、腹側後脳（dh）に おいて高レベルで検出される（表6。）これに対する一つの説明は、内在性のHNF 3βがプラスミドによるHNF3β発現で、背側神経管で活性化するという可能性で ある（本文参照）。矢印は、発現領域を示す。v:腹側のＡ、Ｃ、Ｆ）は、前側を 上にした（Ａ）、または左にした（Ｃ、Ｆ）外側図を示す。（Ｄ）は前側を上に した背側図である。（Ｂ）の殆どの胎児、及び（Ｅ）の断面図では、背側が上で ある。スケールバーは、Ａ、Ｄ、及びＦでは680μm、Ｂでは1.5mm、Ｃでは、450 μm、Ｅでは100μmである。 図20Ａ、20Ｂ、20Ｃ vhh-1の広範囲の発現は、HNF3βの異所性発現を誘導する。 (Ａ-Ｃ)抗-HNF3β抗体で標識した、オタマジャクシ期（Ａでは約28期、Ｂ及びＣ では約36期）にある注入済み胎児の脳の外側図。HNF3βの内在性発現は、底板（ fp）で検出される。番号は、ノマルスキー光学下での境界線の存在によって同定 されるロンボメア、及びHNF3βの発現の腹側領域の多様性を意味する（図18Ｏを 参照されたし）。外胚葉底板マーカ発現の制限もまた、後脳で見られる。形態学 的に可視のロンボメアの境界との関係における、HNF3β細胞の位置の比較により 、好ましい異所性の発現が、耳小胞の反対に位置する、ロンボメア４の背側領域 で起きるが、ロンボメア３及び５の近くでは起きないことが明かになる。この、 奇数対偶数のロンボメアにおける、HNF3発現における異所性の偏りは、これら二 つのロンボメアが偶数番号のロンボメアにはない性質を有しているという 証拠と一致する（Lumsden and Keynes,1989;Bradley,et al.,1992;Winning and Sargent,1994）。 図20Ｄ、20Ｅ、及び20Ｆ （Ｄ、Ｅ、Ｆ）脊索（n）と重なり合う底板（fp）及び近傍の細胞における、内 在性のHNF3βタンパク質発現、並びに異所性発現が上衣板（rp）(E、E)を含む腹 側正中領域、及び近傍の腹側翼板領域に制限されていることとを示す、（Ｂ、Ｃ ）におけるものと匹敵した、胎児の組織学的断面図。枝分かれしたニューロコエ ル(neuorocoel)はしばしば、腹側細胞におけるHNF3βの異所性発現と関連して検 出される（Ｅ）。異所性発現はまた、耳小胞（ov）、及び耳小胞と腹側神経管と の間において検出される（Ｆ）。耳小胞内では、最も高い発現は後期のオタマジ ャクシ期の背側領域で検出されるのに対し、一方、初期では発現は、耳原基全体 で均一に検出される。（Ａ-Ｃ）は前側端を左に、（Ｄ-Ｆ）は腹側を上にした外 側図を示す。耳小胞における細胞は、異所性のHNF3βを発現するが、vhh-1は発 現せず、表皮の細胞は異所性のvhh-1を発現するが、HNF3β⁺は発現しない（Ｄ、 Ｆ及び非掲載データ）。このことは、脊椎動物のヘッジホッグ（hedgehog）と翼 -ら旋遺伝子との間の分子相互作用の側面が、非神経組織において存在すること を示唆している。矢印の先は異所性発現の場所を示している。スケールバーは、 Ａ及びＢでは400μm、Ｃでは200μm、Ｄ及びＥでは75μm、Ｆでは100μmである 。 図21Ａ 広がったラットvhh-1の発現は、カエルvhh-1の発現の異所性を誘導する。(Ａ)ラ ット-vhh-1プラスミドを注入した後の、後期原腸胚期（約13期）における、カエ ルvhh-1の発現。内在性発現は、原口（bp）に対して前側にある脊索（n）におい て検出される。異所性発現はまた、2、3の分散した細胞においても検出される（ 本文参照）。 図21Ｂ及び21Ｃ (Ｂ、Ｃ)ラットvhh-1が広範囲で発現した後の、カエルvhh-1のオタマジャクシ期 （約36期）の胎児における発現。底板（fp）及び脊索（n）における内在性発現 に加えて、後脳及び脊髄の腹側領域において（Ｂ、Ｃ）、また前側脊髄の連続的 Ｄ-Ｖ横紋において（Ｅ）、異所性発現が検出される。神経管の全てのＤ-Ｖの範 囲に添った発現部位は、一つ又はそれ以上の、腹側に制限された異所性発現部位 を示している胎児のみで検出された。 図21Ｄ、21Ｅ、21Ｆ (Ｄ-Ｆ)底板（fp）における正常な発現、異所性vhh-1発現の腹側制限（Ｄ、Ｆ） 、及び極度の形成異常を示している内側中隔における発現を示している、オタマ ジャクシ期の胎児の神経管の組織学的断面図（（Ｂ、Ｃ）に匹敵）。これらの欠 損は尾部芽期において、オタマジャクシ期におけるよりも、より顕著である。枝 分かれしたニューロコエル（neurocoel）（bne）はしばしば、腹側正中領域にお けるvhh-1異所性発現に関連している（Ｆ）。ラットのvhh-1の注入後に検出され る、カエルvhh-1の腹側異所性発現は、残渣プラスミドによるラットvhh-1のmRNA との交差ハイブリダイゼーションによるものではないらしいが、これは、この発 現が腹側に制限されることが期待されないためである。（Ａ）は前側末端を上部 左側にした腹側図を示す。Ｂ、Ｃ）は前側末端を左にした外側図を示す。(Ｄ、 Ｆ)では、腹側がうえである。矢印の先は、異所性発現の場所を示している。ス ケールバーはＡ-Ｃでは600μm、Ｄ-Ｆでは75μmである。 図22Ａ、及び22Ｂ HNF3βの広い発現はvhh-1及びF-スポンジンを誘導する。(Ａ、Ｂ)HNF3βプラス ミドを注入した、オタマジャクシ期（約36期）の胎児におけるvhh-1のmRNA発現 。内在性発現は、底板（fp）、脊索（n）、間脳（d）、及び前側内胚葉において 検出される。異所性発現は、背側後脳、中脳、及び間脳の、領域で（Ａ）、及び 背側脊髄で（Ｂ）検出される。後脳のＡ-Ｐ軸にそった、異所性vhh-1発現の制限 に関する分析は、in situハイブリダイゼーション用に胎児を処理した後で、ロ ンボメアの境界を識別することの難しさのため行わなか った。 図22Ｃ (Ｃ)背側神経管でのHNF3βタンパク質発現を示す、HNF3βプラスミドを注入した 、オタマジャクシ期（約36期）の胎児の組織学的断面図（図19Ｆと同様）。内在 性発現は、背側底板（fp）の細胞において検出される。 図22Ｄ (Ｄ)腹側間脳の脳室領域において、内在性vhh-1発現をしていることを示してい る、HNF3βプラスミドを注入した、オタマジャクシ期（約36期）の胎児の間脳の 組織学的断面図（（Ａ）に示したものと同様）。異所性発現は背側脳室細胞で検 出される。 図22Ｅ及び22Ｆ (Ｅ、Ｆ)正常なオタマジャクシ期（約36期）の胎児（Ｅ）、及びHNFβプラスミ ドを注入した同胞胎児（Ｆ）の底板（fp）における、F-スポンジンの発現。異所 性発現は背側脳室領域における異所性発現。ov:耳小胞。Ａ、Ｂ）は前側末端を 左にした外側図を示す。（Ｃ-Ｆ）においては、背側が上である。矢印の先は、 異所性発現の箇所を示すスケールバーは、Ａでは580μm、Ｂでは1mm、Ｃ-Ｆでは 75μmである。 図23Ａ底板マーカの正常、及び異所性の発現、及び底板分化で示唆された分子相 互作用の要約。 (Ａ)ピンタラビス及びvhh-1の、神経板期（左）、並びにHNF3β、vhh-1、及びF- スポンジンの神経管期（右）における正常な発現の要約。 図23Ｂ (Ｂ)ピンタラビス及びvhh-1の、神経板期（左）、並びにHNF3β、vhh-1、及びF- スポンジンの神経管期（右）における、注入済み胎児での正常な発現の要約。 異所性発現はHNF3βまたはvhh-1の広い発現により誘導され、神経管期の背側領 域、及び脳室領域に優先的に検出される。そのほかの詳細については、本文、及 び表６を参照されたい。 図23Ｃ (Ｃ)神経板（左）及び神経管（右）の神経細胞の、vhh-1またはHNF3βの広い発 現に対しての応答能力（+）及び応答不能（-）についての要約。 図23Ｄ (Ｄ)底板細胞の誘導及び分化に関わる分子相互作用モデル。vhh-1が介在する細 胞内の信号伝達は、白ぬきの矢印で描かれている。翼-ら旋転写因子芽介在する 細胞内相互作用は、黒塗りの矢印で描かれている。純一発生誘導による、神経板 での底板の広がりの限界は、途切れたダッシュの矢印で示されている。詳しくは 本文を参照されたし。 図24 (Ａ)における底板マーカ発現の異所性を位置づけることを示している、オタマジ ャクシ期（約36期）の胎児の後脳の切断面の概要図。示された異なる領域はまた 、中脳及び脊髄を代表しているが、背側翼板に位置する全ての部位は、後脳に記 録されている。全ての場合において上衣板は、この領域には神経管内に少数の細 胞を含むのに、発現の主要な部位であることに注意されたい。異なる領域（例え ば、DAPとVZ）で、vhh-1とHNF3βの異所性が起きることは、明かではない。注入 したプラスミドの、背側外胚葉での発現が、近くの神経管（RP及びDAP）の細胞 に対して異なった影響を与えるは可能である。vhh-1を発現するが、HNF3βを発 現しない外胚葉細胞は、vhh-1のみが細胞間で作用できるので、近くの神経管細 胞に影響することが期待されるかも知れない。RPは上衣板、DAPは上衣板のすぐ 近くの背側翼板、AP+BPは翼基板より最も背側領域を取り除いた部分と、翼板、V Zは脳室領域、Vは底板の近くの腹側領域で、FPは底板である。本発明の詳細な説明 本発明は、脊椎動物ｖｈｈ−１タンパク質をコードする単離されたＤＮＡ分子 を提供する。ここで使用される「単離された核酸分子」の語は、天然に存在しな い核酸分子、即ち本来存在しない分子を意味する。このような単離された核酸分 子の例は、脊椎動物ｖｈｈ−１タンパク質をコードする単離されたｃＤＮＡ又は ゲノムＤＮＡ分子である。本発明は、脊椎動物ｖｈｈ−１タンパク質をコードす る単離された核酸分子であって、該核酸分子がＤＮＡ分子であるものを提供する 。本発明は更に、脊椎動物ｖｈｈ−１タンパク質をコードする単離されたＤＮＡ 分子であって、該ＤＮＡ分子がｃＤＮＡ分子であるものを提供する。 一態様では、該核酸分子はカエルｖｈｈ−１タンパク質をコードする。他の態 様では、該核酸分子は哺乳動物ｖｈｈ−１タンパク質をコードする。 哺乳動物ｖｈｈ−１タンパク質をコードする核酸分子の好ましい態様は、ラッ トｖｈｈ−１タンパク質をコードする核酸分子である。このような分子は、図１ −１、１−２及び１−３（配列認識番号１）に示されるコード配列と同じである か、又は実質的に同じであるコード配列を有しうる。 脊椎動物ｖｈｈ−１タンパク質をコードする単離された核酸分子の他の好まし い態様はヒトｖｈｈ−１タンパク質をコードする核酸分子である。本発明は、脊 椎動物ｖｈｈ−１タンパク質をコードする単離された核酸分子であって、該単離 された核酸分子がヒトｖｈｈ−１タンパク質をコードするものを提供する。 本発明は更に、ヒトｖｈｈ−１タンパク質をコードする単離された核酸分子で あって、該核酸分子がＤＮＡであるものを提供する。 脊椎動物ｖｈｈ−１タンパク質を単離する１つの方法は、哺乳動物ゲノムライ ブラリーを、当分野で周知の方法を用いて、天然又は人工的にデザインしたＤＮ Ａプローブでプローブすることである。本発明の一態様では、ラットｖｈｈ−１ タンパク質及びこれらをコードする核酸分子がラットｃＤＮＡライブラリーから 単離される。ラットｖｈｈ−１タンパク質をコードするＤＮＡ及びｃＤＮＡ分子 は、以下で更に詳細に説明される方法により、相補的ゲノムＤＮＡ、ｃＤＮＡ又 はＲＮＡをヒト又は他の動物源から得るため、又はｃＤＮＡ若しくはゲノムライ ブラリーのスクリーニングによって関連したｃＤＮＡ若しくはゲノムクローンを 単離するために使用される。単離されたクローンの５’非翻訳領域からの転写制 御要素、並びに単離された遺伝子の３’及び５’非翻訳領域からの他の安定、プ ロセッシング、転写、翻訳及び組織特異性決定領域がこれによって得られる。 ラットｖｈｈ−１遺伝子のヒト相同体は、上記のラットｖｈｈ−１プローブ、 及びゲノム若しくはｃＤＮＡライブラリーの相同スクリーニング又はＰＣＲ増幅 技術のような当業者に周知のクローニング技術を用いて単離される。ｖｈｈ−１ 遺伝子は、より月日の経た胎児の肺で発現される。従って、ヒトｖｈｈ−１遺伝 子をクローニングする好ましい方法には、ヒトクローンを得るためのクロンテッ ク（clontech）ヒト胎児肺ｃＤＮＡライブラリーをスクリーニングすることが含 まれる。ラットｖｈｈ−１は、ひよこ又はカエルｖｈｈ−１遺伝子を同定するた めに使用され（以下のカエル遺伝子データを参照）、従って、ヒトｖｈｈ−１遺 伝子を同定するために十分に維持される。 本発明は、脊椎動物ｖｈｈ−１タンパク質をコードする核酸分子を含有するベ クターを提供する。該ベクターの例は、バクテリオファージ（ラムダファージを 含むがこれに限定されない。）のようなウイルス、動物ウイルス（バキュロウイ ルス、ワクシニアウイルス、ヘルペスウイルス、及びネズミ白血病ウイルスを含 むがこれに限定されない。）、コスミド、プラスミド及び当分野で周知の他の組 換えベクターがある。核酸分子は、当業者に周知の方法でベクターゲノムに挿入 される。これらのベクターを得るためには、挿入物及びベクターＤＮＡを両方と も制限酵素にさらし、両分子上に塩基がお互いに対を形成する相補性末端を創生 し、次いでリガーゼでお互いを結紮する。この他の方法として、リンカーを、ベ クターＤＮＡ内の制限部位に対応する挿入ＤＮＡに結紮し、次いでこれをこの部 位で切断する制限酵素で消化する。他の手段も、当業者に公知である。 本発明は、脊椎動物ｖｈｈ−１タンパク質をコードする単離された核酸分子を 含有するベクターを含有するプラスミドを提供する。このようなプラスミドの例 は、図１−１、１−２及び１−３（配列認識番号１）に示されるコード配列と同 一又は実質的に同一のコード配列を有するｃＤＮＡを含有するプラスミド、及び ＡＴＣＣアクセス番号７５６８６として寄託されたクローンｐＭＴ２１ ２ｈｈ ＃７と称されるプラスミド及びＡＴＣＣアクセス番号７５６８５として寄託され たクローンｃｍｖ ｖｈｈ ＃７と称されるプラスミドである。 発現ベクターは、バクテリア細胞、酵母細胞、昆虫細胞、ツメガエル属のカエ ルの卵母細胞又は哺乳動物細胞であって、更に必要に応じてバクテリア、酵母、 昆虫、カエル又は哺乳動物細胞内で挿入された遺伝子に必要な調節要素と結合さ れたもの内での発現に適合されうる。図１−１、１−２及び１−３に示されるコ ード配列と実質的に同一であるコード配列を有するＤＮＡは、先に議論した方法 又は当業者に公知の他の方法を用いて発現のためのベクターに挿入されうる。発 現に必要な調節要素には、ＲＮＡポリメラーゼと結合するプロモーター配列及び リボソーム結合のための転写開始配列が含まれる。例えば、バクテリア発現ベク ターには、ｌａｃプロモーターのようなプロモーター及び転写開始のためのシャ イン−ダルガルノ（Shine-Dalgarno）配列及び開始コドンＡＵＧが含まれる。同 様に、真核生物発現ベクターには、組換え遺伝子に外科的に結合された、ＲＮＡ ポリメラーゼII、下流ポリアデニル化シグナル、開始コドンＡＵＧ、及びリボソ ームの脱離のための終止コドンに対する異質性又は同質性プロモーターが含まれ る。更に、バキュロウイルスＡｃＭＮＰＶのような昆虫発現ベクターは、ウイル スの多角体遺伝子に対する強力なウイルス発現シグナルを用い、組換え遺伝子の 転写を推進する。組換えｖｈｈ−１遺伝子に外科的に結合された卵母細胞での発 現のための調節要素を含有するこのようなプラスミドの１つの例は、ｃｍｖ ｖ ｈｈ ＃７と称されるプラスミドであり、これはＡＴＣＣアクセス番号７５６８ ５として寄託された。このようなベクターは、市販品として得られるか、又は当 分野で周知の方法、例えば一般的にベクターを構築するための先に示された方法 によって開示された配列から組み立てられる。発現ベクターは、ｖｈｈ−１タン パク質を発現する細胞を産生するのに使用される。このような細胞の幾つかの使 用が以下でより詳細に開示される。 寄託は、アメリカンタイプカルチャーコレクション(ＡＴＣＣ)、１２３０１ パークローンドライブ、ロックビル、メリーランド２０８５２に、ｐＭＴ２１ ２ｈｈ ＃７及びｃｍｖ ｖｈｈ ＃７プラスミドの両方について１９９４年２ 月２４日になされた。この２つの寄託は、特許手続上の微生物の寄託の国際的承 認に関するブダペスト条約の規定に従い、及びこれを満たしてＡＴＣＣになされ た。 プラスミド、ｐＭＴ２１ ２ｈｈ ＃７は、全コード領域、及び３’及び５’ の両非翻訳領域をプラスミドｐＭＴ２１のＸｈｏＩ部位に含有するラットｖｈｈ −１遺伝子の２．６キロベースのフラグメントをクローニングすることによって 産生される。この２．６キロベースはＸｈｏＩ消化によって再生されうる。 プラスミド、ｃｍｖ ｖｈｈ ＃７も、全コード領域、及び、３’及び５’の 両方の非翻訳領域を有するラットｖｈｈ−１遺伝子の２．６キロベースのフラグ メントを含有する。２．６キロベースのＸｈｏＩ挿入物は、ＸｈｏＩ部位が破壊 されるようにＳａｌＩ部位にクローニングされる。この挿入物は、上流ＣＭＶプ ロモーター及びＨｏｘ２．６エンハンサーを通り、更に上流の制御下にある。挿 入物からの下流は、０．８キロベースのＳＶ４０のポリＡ部位であり、次にヒグ ロマイシン（hygromycin）遺伝子（ＰＧＫ ＨＹＧ）に結合される。ＮｏｔＩ消 化物は、プラスミドを直線状にするであろう。 本発明は、脊椎動物ｖｈｈ−１タンパク質をコードする発現プラスミドを含有 する哺乳動物細胞を提供する。本発明はまた、哺乳動物ｖｈｈ−１タンパク質を コードする発現プラスミドを含有する哺乳動物細胞を提供する。本発明は更に、 脊椎動物ｖｈｈ−１タンパク質をコードする発現ベクターを含有するＣｏｓ細胞 を提供する。 多数の哺乳動物細胞を宿主細胞として使用しうる。これにはマウス繊維芽細胞 ＮＩＨ３Ｔ３、ＣＨＯ細胞、ＨｅＬａ細胞、Ｃｏｓ細胞、及び２９３細胞が含ま れるが、これらに限定されない。先に開示したようにプラスミドの発現は、リン 酸カルシウム沈殿法のような当分野で周知の方法によって哺乳動物細胞に形質導 入するために使用されるか、又はさもなければ、ｖｈｈ−１タンパク質をコード するＤＮＡが、例えばマイクロインジェクションによって哺乳動物細胞に導入さ れ、脊椎動物ｖｈｈ−１タンパク質をコードするＤＮＡ、例えばｃＤＮＡ又はプ ラスミドを含有する哺乳動物細胞を得ることができる。 本発明は、脊椎動物ｖｈｈ−１タンパク質及びその非コード３’及び５’ヌク レオチドをコードする遺伝子を含有する核酸分子の配列内に含まれる独特の配列 と特異的にハイブリダイズできる少なくとも１５のヌクレオチドの核酸分子を含 有する核酸分子プローブを提供する。 ここで使用される「特異的にハイブリダイズする」という語句は、それ自身に 相補的な核酸配列を認識し、且つ相補的塩基対間の水素結合を介して二重螺旋セ グメントを形成する核酸分子の能力を意味する。ここで使用される「独特の配列 」は、脊椎動物ｖｈｈ−１蛋白質をコードする核酸分子にのみ特異的な配列であ る。核酸プローブ技術は当業者に周知であり、この者は、このようなプローブが 長さを大きく変化し得、放射性同位元素又は蛍光色素のような検出可能な標識で 標識され、該プローブの検出を促進することを容易に認識するであろう。脊椎動 物ｖｈｈ−１タンパク質をコードする核酸分子の検出は、対応するｖｈｈ−１タ ンパク質の発現のレベルが変化する何れかの疾患過程に対する診断試験として有 効である。ＤＮＡプローブ分子は、全て当分野の周知の方法を用いて、脊椎動物 ｖｈｈ−１タンパク質又はこれらのフラグメントをコードするＤＮＡ分子を、プ ラスミド又はバクテリオファージのような適切なベクターへ挿入し、次いで適切 なバクテリアホスト細胞に挿入し、ＤＮＡプローブを複製し、採取することによ って産生される。例えば、ＤＮＡは、フェノール又はエタノールを用いて細胞溶 解物から抽出され得、ベクターへのＤＮＡの挿入部位に対応する制限酵素で消化 され（先に議論したとおり。）、電気泳動にかけられ、得られたゲルを切り出す 。このようなＤＮＡ分子の例は、図１−１、１−２及び１−３に示されている。 該プローブは、「in situ」でのハイブリダイゼーションに有効であるか、又は この遺伝子ファミリーを発現する組織を局在化するために有効であるか、又はこ れらの遺伝子又は種々の生物学的組織内のこれらのｍＲＮＡの存在に対する他の ハイブリダイゼーションアッセイに有効である。加えて、脊椎動物ｖｈｈ−１タ ンパク質をコードするＤＮＡ分子の配列に相補的な合成されたオリゴヌクレオチ ド（ＤＮＡ合成機で製造される。）は、この遺伝子、その結合されたｍＲＮＡ、 又はゲノム若しくはｃＤＮＡライブラリーの相同性スクリーニングによるか、又 はポリメラーゼ連鎖反応のような増幅技術の使用による関連した遺伝子の単離に 対するプローブとして有効である。 脊椎動物ｖｈｈ−１タンパク質の核酸分子プローブの好ましい態様は、ＤＮＡ 分子プローブである。 本発明は、精製された脊椎動物ｖｈｈ−１タンパク質を提供する。一態様では 、 精製されたｖｈｈ−１タンパク質は、カエルｖｈｈ−１タンパク質である。他の 態様では、精製されたｖｈｈ−１タンパク質は、哺乳動物タンパク質である。更 なる態様では、精製されたｖｈｈ−１タンパク質は、ラットタンパク質である。 更なる態様では、精製されたｖｈｈ−１タンパク質はヒトタンパク質である。 本発明は更に、脊椎動物ｖｈｈ−１タンパク質の精製された独特のポリペプチ ドフラグメントを提供する。 ここで使用される「独特のポリペプチドフラグメント」の語は、図１−１、１ −２及び１−３（配列認識番号２）に示される何れかの独特のアミノ酸配列と同 様のアミノ酸配列を持つ何れかのポリペプチドを包含する。脊椎動物ｖｈｈ−１ タンパク質の単離されたポリペプチドフラグメントを得る１つの手段は、商業的 に利用しうるペプチダーゼで単離されたｖｈｈ−１タンパク質を処理し、次いで 当業者に周知の方法を用いてポリペプチドフラグメントを分離することである。 ポリペプチドフラグメントは、免疫応答を誘導し、これに引き続くポリペプチド フラグメント及び可能な完全なポリペプチドに対する抗体を生じさせるのに使用 される抗原としてしばしば有用である。 ここで使用される「精製されたタンパク質」の語は、他の細胞成分を含まない タンパク質分子を包含することを意図している。精製されたｖｈｈ−１タンパク 質を得るための１つの手段は、当業者に周知の方法を用いて、バクテリア、酵母 、昆虫、又は哺乳動物細胞のような適切なホスト内でｖｈｈ−１タンパク質をコ ードするＤＮＡを発現し、該ＤＮＡがこのようなホスト内で発現された後に、当 業者に周知の方法を用いて再度ｖｈｈ−１タンパク質を回収することである。ｖ ｈｈ−１タンパク質はまた、ｖｈｈ−１タンパク質を発現する細胞、特に、以下 で更に詳細に説明する発現ベクターで形質導入された細胞から単離されうる。 本発明は、脊椎動物ｖｈｈ−１タンパク質に向けられたモノクローナル抗体を 提供する。 本発明は更に、脊椎動物ｖｈｈ−１タンパク質のエピトープに向けられ、脊椎 動物ｖｈｈ−１タンパク質のエピトープに対するアミノ酸配列と実質的に同じア ミノ酸配列を有するモノクローナル抗体を提供する。 本発明は更に、モノクローナル抗体であって、該モノクローナル抗体がカエル ｖｈｈ−１タンパク質に向けられているものを提供する。 本発明は更に、モノクローナル抗体であって、該モノクローナル抗体がラット ｖｈｈ−１タンパク質に向けられているものを提供する。 本発明は更に、モノクローナル抗体であって、該モノクローナル抗体が哺乳動 物ｖｈｈ−１タンパク質に向けられているものを提供する。 本発明は更に、モノクローナル抗体であって、該モノクローナル抗体がヒトｖ ｈｈ−１タンパク質に向けられているものを提供する。 脊椎動物ｖｈｈ−１タンパク質に向けられたモノクローナル抗体は、例えば細 胞表面に存在する脊椎動物ｖｈｈ−１タンパク質のエピトープ（このエピトープ は、図１−１、１−２及び１−３に示されたアミノ酸配列を含む脊椎動物ｖｈｈ −１タンパク質の細胞表面エピトープに対するアミノ酸配列と実質的に同じであ るアミノ酸配列を有する。）に向けられたモノクローナル抗体を包含する。アミ ノ酸配列は、これらが結合するタンパク質に疎水性又は親水性領域をこれらが生 じうるかどうかを決定するために当業者に周知の方法で分析されうる。細胞膜タ ンパク質の場合には、疎水性領域は、細胞膜を形成する脂質二重層に挿入された タンパク質の一部を形成することが知られており、一方、親水性領域は、水性環 境下で細胞表面に位置する。従って、図１−１、１−２及び１−３に示された親 水性アミノ酸配列に対する抗体は、説明したように脊椎動物ｖｈｈ−１タンパク 質の表面エピトープに結合するであろう。脊椎動物ｖｈｈ−１タンパク質に向け られた抗体は、血清誘導でありうるか、又はモノクローナルであり得、当分野で 周知の方法を用いて調製される。例えば、モノクローナル抗体は、免疫化された 動物から得た抗体産生Ｂ細胞をミエローマ細胞と融合し、所望の抗体を産生する 得られたハイブリドーマ細胞系を選別することによるハイブリドーマ技術を用い て調製される。ＮＩＨ３Ｔ３細胞又は２９３細胞のような細胞は、このような抗 体を生じる免疫源として使用される。さもなければ、合成ペプチドを、商業的に 利用できる機械と図１−１、１−２及び１−３に示されるアミノ酸配列を用いて 調製しうる。 更に別の方法として、ｃＤＮＡ又はこれらのフラグメントのようなＤＮＡをク ローン化し、発現し、得られたポリペプチドを回収し、免疫源として使用する。 これらの抗体は、単離されたＤＮＡによってコードされる脊椎動物ｖｈｈ−１の 存在を検出すること、又は生きた動物、ヒト、又は動物若しくはヒトから単離さ れた生物学的組織若しくは液体内のｖｈｈ−１タンパク質の機能を阻害するため に有用である。 本発明は、脊椎動物ｖｈｈ−１タンパク質に向けられたポリクローナル抗体を 提供する。 脊椎動物ｖｈｈ−１タンパク質の生理学的及び挙動的役割を解明する動物モデ ル系は、ｖｈｈ−１タンパク質の発現が増加若しくは減少されているか、又は発 現されたｖｈｈ−１タンパク質のアミノ酸配列が変化されているトランスジェニ ック動物を種々の技術で創生することによってもたらされる。これらの技術の例 には、以下のものが含まれるがこれに限定されない。１）ラットｖｈｈ−１若し くはこれらの遺伝子の相同性動物バージョンをコードするＤＮＡの正常若しくは 変異化体、特にｖｈｈ−１遺伝子のヒト相同体を、マイクロインジェクション法 、レトロウイルス感染又は当業者に周知の他の手段によって適切な受精胚に挿入 し、これによってトランスジェニック動物を作製すること（Hogan B．et al．Ma nipu-lating the Mouse embryo，A Laboratory Manual，Cold Spring Harbor La boratory(1986)）、又は２）トランスジェニック動物内で、生来の遺伝子座を突 然変異若しくは正常なこれらの遺伝子のヒト若しくは動物バージョンで相同性組 換えを行い(Capecchi M.R.Science 244:1288-1292(1989)，Zimmer,A and Gruss, P.Nature338:150-153(1989))、これらのｖｈｈ−１タンパク質の発現又は構造の 調節を変化すること。相同性組換えの技術は、当分野で周知である。これは、生 来の遺伝子を挿入された遺伝子で置き換える。従って、ｖｈｈ−１タンパク質を コードする生来の遺伝子を発現することはできないが、例えば突然変異ｖｈｈ− １タンパク質をコードする挿入された突然変異遺伝子を発現することができる動 物であって、該動物のゲノム内の天然のｖｈｈ−１遺伝子を組換えによって置き 換え、ｖｈｈ−１タンパク質の過小発現を起こすものを作成するのに有効である 。マイクロインジェクション法は、ゲノムに遺伝子を付加するが、これらを除去 することができない。従って、これ自身を発現し、ｖｈｈ−１タンパク質が加え られ、ｖｈｈ−１タンパク質を過剰に発現する動物を作成するのに有効である。 本発明は、脊椎動物ｖｈｈ−１タンパク質をコードする単離されたＤＮＡ分子 を含有するヒト以外のトランスジェニック哺乳動物を提供する。 トランスジェニック哺乳動物（例としてマウスが挙げられる。）を作成するた めの有用な１つの手段は以下の通りである。メスのマウスを交尾させ、得られた 受精卵をこれらの卵管から切開して取り出す。該卵をＭ２培地（Hogan B．et al .Manipurating the Mouse Embryo，A Laboratory Manual，Cold Spring Harbor Laboratory(1986)）のような適切な培地に保存する。脊椎動物ｖｈｈ−１タンパ ク質をコードするＤＮＡ又はｃＤＮＡを、当分野で公知の方法によってベクター （先に説明したプラスミドｐＭＴ２１ ２ｈｈ ＃７のようなもの。）から精製 する。誘導可能なプロモーターを該ＤＮＡのコード領域と融合し、導入遺伝子の 発現を調節する手段を提供する。これとは別に、又はこれに加えて、組織特異性 調節要素をコード領域と融合し、導入遺伝子の組織特異的発現を可能にする。適 切に緩衝された溶液中で、ＤＮＡをマイクロインジェクション針（これはピペッ ト引き延ばし機（pipet puller）を用いてキャピラリー管から作成されうる。） 内に置き、注入される卵を窪みのあるスライドに置く。この針を前核に挿入し、 ＤＮＡ溶液を注入する。次に、注入された卵を偽妊娠マウス（これは、妊娠を維 持するように適切なホルモンで刺激されたマウスであるが、実際には妊娠してい ないものである。）の卵管に移す。ここで、これは子宮に移行し、着床し、出産 日まで発育される。上述したように、マイクロインジェクション法は、卵細胞に ＤＮＡを挿入するためのみの方法ではなく、ここでは実験の目的のためのみに使 用される。 ｖｈｈ−１タンパク質に特異的な医薬の正常な作用は、ｖｈｈ−１タンパク質 をまねるか、活性化するか、又は阻害することであるから、上記のトランスジェ ニック動物モデル系は、このような医薬が利用可能になる前であってもｖｈｈ− １タンパク質の活性をまねるか、又は変化することに向けられた医薬の生物学的 活性を試験するために有用である。これらの動物モデル系は、ラットｖｈｈ−１ タンパク質をまねるか、活性化するか、又は阻害する医薬の治療への応用の可能 性を、生来のｖｈｈ−１遺伝子又は導入遺伝子の減少又は増加された発現を伴う トランスジェニック動物で観測される異常を緩和することによって予言又は評価 するために有効である。従って、ｖｈｈ−１タンパク質に特異的な医薬の生物学 的活性をこのような医薬が利用できるようになる前に評価するモデル系がもたら される。ｖｈｈ−１タンパク質を過剰に又は過小に生じるトランスジェニック動 物は、ｖｈｈ−１タンパク質の過剰又は過小産生が治療に有効であるかどうかを これらの生理学的状態によって示す。従って、トランスジェニックモデル系に基 づく薬物作用を評価することが有効となる。従って、ｖｈｈ−１タンパク質を過 小発現する動物は、ｖｈｈ−１を含有する薬学的化合物の作用が実際に治療に有 効であるかどうかを研究する試験系として有効である。他の使用は、過剰発現が 異常につながることが見いだされているならば、ｖｈｈ−１タンパク質に対する 拮抗剤として作用する医薬が開発に値することが示されることであり、見込みの ある治療への応用がこれらの動物系によって発見される場合には、ｖｈｈ−１タ ンパク質の活性化又は阻害が、脊椎動物ｖｈｈ−１タンパク質に向けられた作用 薬又は拮抗剤を製造することによって、又はｖｈｈ−１タンパク質の活性を増加 又は減少する何れかの方法によって治療的に達成されることである。 本発明は、ラットｖｈｈ−１タンパク質をコードする単離されたＤＮＡ分子を 含有するヒト以外のトランスジェニック哺乳動物を提供する。 本発明は更に、脊椎動物ｖｈｈ−１をコードする単離されたＤＮＡを含有する ヒト以外のトランスジェニック哺乳動物であって、脊椎動物ｖｈｈ−１タンパク 質をコードするＤＮＡが更に組織特異的調節要素を含有するものを提供する。 本発明は、ヒトｖｈｈ−１タンパタ質をコードする単離されたＤＮＡ分子を含 有するヒト以外のトランスジェニック哺乳動物を提供する。 本発明は、種々のレベルの脊椎動物ｖｈｈ−１タンパク質を発現する生理学的 効果を決定するための方法であって、異なった量の脊椎動物ｖｈｈ−１タンパク 質を各々発現するヒト以外のトランスジェニック哺乳動物のパネルを作成するこ とを具備する方法を提供する。このような動物は、異なった量のラットｖｈｈ− １タンパク質を、トランスジェニック動物が発育される卵母細胞に導入すること によって製造されうる。 本発明は、精製された脊椎動物ｖｈｈ−１タンパク質を製造する方法であって 、（ａ）脊椎動物ｖｈｈ−１タンパク質をコードする核酸分子を適切なベクター に 挿入すること、(ｂ)適切なホスト細胞に得られたベクターを導入すること、(ｃ) 導入されたホスト細胞を脊椎動物ｖｈｈ−１タンパク質の発現に対して選別する こと、（ｄ）選別された細胞を培養し、ｖｈｈ−１タンパク質を産生すること、 （ｅ）産生されたｖｈｈ−１タンパク質を回収することを具備した方法を提供す る。 本発明は更に、精製された、カエル、哺乳動物、ラット及びヒトｖｈｈ−１タ ンパク質を産生する上記方法を提供する。 ｖｈｈ−１タンパク質を産生するためのこれらの方法には、当分野で周知の方 法が含まれる。例えば、カエル、ラット又はヒトｖｈｈ−１タンパク質をコード する単離された核酸分子は、発現ベクターのような適切なベクターに挿入される 。バクテリア細胞、又は酵母細胞のような真核生物細胞、又は昆虫細胞のような 適切なホスト細胞が該ベクターで形質導入される。脊椎動物タンパク質は、親和 性精製又はクロマトグラフィー又は他の当分野で周知の方法によって培養培地か ら単離される。 本発明は、底板細胞の分化を誘導する方法であって、底板細胞の分化を誘導す るのに効果的な濃度で、底板細胞を精製された脊椎動物ｖｈｈ−１タンパク質と 接触することを具備した方法を提供する。 本発明は、対象内の底板細胞の分化を誘導する方法であって、該対象内の底板 細胞の分化を誘導するのに効果的な量で、該対象に精製された脊椎動物ｖｈｈ− １タンパク質を投与することを具備した方法を提供する。 本発明は、運動ニューロンの分化を誘導する方法であって、運動ニューロンの 分化を誘導するのに効果的な濃度で底板細胞を精製された脊椎動物ｖｈｈ−１タ ンパク質と接触させることを具備した方法を提供する。 本発明は、対象内の運動ニューロンの分化を誘導する方法であって、該対象内 の運動ニューロンの分化を誘導するのに効果的な量で精製された脊椎動物ｖｈｈ −１タンパク質を該対象に投与することを具備した方法を提供する。 本発明は、腹側ニューロンを発生させる方法であって、腹側ニューロンを発生 させるのに効果的な濃度で始原細胞を精製された脊椎動物ｖｈｈ−１タンパク質 と接触させることを具備した方法を提供する。 本発明は、対象内の始原細胞から腹側ニューロンを発生させる方法であって、 該対象内の始原細胞から腹側ニューロンを発生させるのに効果的な量で精製され た脊椎動物ｖｈｈ−１タンパク質を該対象に投与することを具備した方法を提供 する。 本発明は、効果的な量の脊椎動物ｖｈｈ−１タンパク質及び薬学的に許容しう る担体を含有する薬学的組成物を提供する。 本発明は、効果的な量の哺乳動物ｖｈｈ−１タンパク質及び薬学的に許容しう る担体を含有する薬学的組成物を提供する。 本発明は、効果的な量のヒトｖｈｈ−１タンパク質及び薬学的に許容しうる担 体を含有する薬学的組成物を提供する。 ここで使用される「薬学的に許容しうる担体」の語は、リン酸で緩衝された生 理食塩水溶液、水、及び、油／水若しくは水／油エマルジョンのようなエマルジ ョン、及び種々のタイプの湿潤剤のような何れかの標準的な薬学的担体を包含す る。一度、候補の医薬が、個々の投与経路、例えば経口若しくは注射により十分 に生体で利用できることが示され（適切な治療濃度が作用部位で十分な時間維持 され、所望の治療の恩恵が受けられなければならない。）、非毒性であり、適切 な疾患モデルで治療に効果があることが示されれば、その医薬は、適切な固体又 は液体製剤として該医薬を生体で利用できるようにするために決定された投与経 路で患者に投与され、所望の治療の恩恵を獲得することができる。 薬学的組成物をｖｈｈ−１タンパク質作用部位に輸送することは、複雑な問題 を提供する。ｖｈｈ−１は、未分化運動ニューロン前駆体細胞を運動ニューロン に分化することを誘導する。急性の神経系損傷又は慢性神経退縮性疾患に関連し た異常を緩和する目的で運動ニューロンを調節するには、中枢神経系（ＣＮＳ） に存在する運動ニューロン前駆体細胞を分化する必要があるので、ｖｈｈ−１タ ンパク質の作用を変化させるｖｈｈ−１前駆体又は医薬又は物質を含有する薬学 的化合物が該ＣＮＳに運ばれなければならない。ｖｈｈ−１は、血液−脳関門を 通過しない。従って、これを含有する薬学的組成物は、大脳内に与えられるか、 ＣＮＳ内に外科的に移植されるか、又は血液−脳関門を通過できる担体分子（例 えば、トランスフェリン）と複合体形成されなければならない。神経栄養性因子 （neurotrophic factor）、ＮＧＦは、ＣＮＳにＮＧＦを一貫して輸送すること を可能にする機械ポンプ装置によって脳に長期的に注入される（Koliatos et al ．1991及びOlsen et al．1992）。特異的な中枢軸索に関係する急性の神経系損 傷の場合には、公知の生物分解しうるポリマーマトリクッスにｖｈｈ−１を含有 した放出のゆっくりした移植体が、損傷した軸索に隣接した運動ニューロン前駆 体細胞から運動ニューロンを再生するのに効果的な損傷した軸索の部位に外科的 に移植されうる。他の神経栄養性因子、ＮＧＦは、コリン作用性ニューロンの退 縮を防止するような方法でうまく移植される（Hoffman et al．1990及びMaysing er et al.1992）。損傷した軸索の近隣にｖｈｈ−１源を移植する他の方法では 、増殖をすることができず、更にＣＮＳの浸透を避けるためにカプセル化された 細胞であって、このような細胞がヒトｖｈｈ−１遺伝子をコードするプラスミド を含有し、従ってｖｈｈ−１を発現するものの形質導入が必要である。Aebische rら（1991）は、カプセル化された成長因子産生細胞を移植し、うまく脳組織の 浸透を回避した。神経栄養性因子は、該因子をＣＮＳに移送する担体分子にうま く複合体形成された。このような例の１つは、神経栄養性因子をＣＮＳに輸送す るのに効果的な担体分子、即ちモノクローナル抗−トランスフェリン受容体抗体 に複合体形成されたＮＧＦである（Friden et al．1993）。 本発明は、１以上の正常に機能する運動ニューロンの欠如に伴う異常に悩まさ れているヒト患者を治療するための方法であって、ヒト内の未分化運動ニューロ ン前駆体細胞から運動ニューロンを発生させるのに効果的なヒトｖｈｈ−１タン パク質及び薬学的に許容しうる担体の所定量を含有した薬学的組成物の所定量を 導入し、これによって１以上の正常に機能する運動ニューロンの欠如に伴う異常 に悩まされているヒト患者を治療することを具備した方法を提供する。 本発明は、１以上の正常に機能する運動ニューロンの欠如に付随した異常に悩 まされているヒト患者を治療するための方法であって、ヒト内の未分化運動ニュ ーロン前駆体細胞から運動ニューロンを発生させるのに効果的なヒトｖｈｈ−１ タンパク質及び薬学的に許容しうる担体の所定量を含有した薬学的組成物の所定 量を導入し、これによって１以上の正常に機能する運動ニューロンの欠如に伴う 異常に悩まされているヒト患者を治療することを具備した方法を提供する。 本発明は、神経退縮性疾患に悩まされているヒト患者を治療するための方法で あって、ヒト内の未分化運動ニューロン前駆体細胞から運動ニューロンを発生さ せるのに効果的なヒトｖｈｈ−１タンパク質及び薬学的に許容しうる担体の所定 量を含有した薬学的組成物の所定量を導入し、これによって神経退縮性疾患に悩 まされているヒト患者を治療することを具備した方法を提供する。 本発明は、慢性神経退縮性疾患が、筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）である神経 退縮性疾患に悩まされているヒト患者を治療する方法であって、ヒト内の未分化 運動ニューロン前駆体細胞から運動ニューロンを発生させるのに効果的なヒトｖ ｈｈ−１タンパク質及び薬学的に許容しうる担体の所定量を含有した薬学的組成 物の所定量を導入し、これによって筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）に悩まされて いるヒト患者を治療することを具備した方法を提供する。 急性の神経系損傷に悩まされているヒト患者を治療する方法は、ヒト内の未分 化運動ニューロン前駆体細胞から運動ニューロンを発生させるのに効果的なヒト ｖｈｈ−１タンパク質及び薬学的に許容しうる担体の所定量を含有した薬学的組 成物の所定量を導入し、これによって急性の神経系損傷に悩まされているヒト患 者を治療することを具備する。 急性の神経系損傷が特異的な中枢軸索に局在化されている急性の神経系損傷に 悩まされている患者を治療する方法は、ヒト内の損傷された軸索に隣接して位置 する未分化の運動ニューロン前駆体細胞から運動ニューロンを発生させるのに効 果的なヒトｖｈｈ−１タンパク質及び薬学的に許容しうる担体を含有した薬学的 組成物の所定量を外科的に移植し、これによって特異的な中枢軸索に位置する急 性の中枢神経系損傷を緩和することを具備する。 ｖｈｈ−１タンパク質としてデザインされた神経栄養性因子の分子構造を解明 することは、新たな神経栄養性因子を理解する上で重要なステップである。この 開示では、単離、アミノ酸配列、ｖｈｈ−１タンパク質をコードするラット脳か らのｃＤＮＡクローンの機能的発現を報告する。ラットｖｈｈ−１タンパク質の 構造及び機能を分析することで、急性の神経系損傷又は筋萎縮性側索硬化症（Ａ ＬＳ）のような慢性神経退縮性疾患の治療に有効な医薬の開発のための可能なモ デルが提供される。 特に、本発明は、ラットｖｈｈ−１タンパク質をコードするｃＤＮＡクローン の初めての単離に関する。脊椎動物ｖｈｈ−１遺伝子は、胎児の制限部位、特に 脊索及び底板（これらの２つの細胞グループは底板及び運動ニューロンを含めた 腹側細胞タイプを誘導することが示されている。）で発現される。このｖｈｈ− １タンパク質に対する脊椎動物遺伝子は、胎児内での運動ニューロン及び底板の 発育分化を含めたｖｈｈ−１の役割を解明するためにin vivo及びin vitroで特 徴化される。ｖｈｈ−１タンパク質は、中枢神経系の退縮性疾患、特に運動ニュ ーロンの退縮の治療に有効であるようであり、運動機能不全を起こす多くの臨床 疾患の治療にも有効でありうる。加えて、ラットｖｈｈ−１タンパク質は、ＣＯ Ｓ細胞をプラスミドｐＭＴ２１ ２ｈｈ ＃７で形質導入することによってＣＯ Ｓ細胞で発現される。 本発明は、以下の実験の詳細を参照することによってよりよく理解されるであ ろうが、当業者は、詳述された特有の実験が例示のみであること、及び、ここで 開示され、それ以後の請求の範囲で定義される本発明を制限することを意味しな いことを容易に認識するであろう。実験の詳細 動物 ゼブラフィッシュ（Zebrafish）の胚をウメア（Umea）大学（スエーデン）微 生物学科でコロニーから得た。妊娠した雌のラット（ヒルトップ（Hilltop）） を帝王切開により出産させ、体節の数に応じて段階分けを行なった。白色レグホ ン鶏の受精卵を、SPAFAS，Incorporated（ノーウィッチ（Norwich）、コネチカ ット）から得た。ニワトリの胚をHamburgerとHamilton(1951)に従って段階分け した。カエル（アメリカツノガエル（Xenopus laovis））の卵と胚を飼育し、Ni euwkoopとFaber(1957)およびRuiz i Altaba（1993）に従って段階分けした。ｈｈに関連した脊椎動物遺伝子の単離 受精後９〜１６時間後のλＺＡＰＩＩゼブラフィッシュライブラリーのプラー ク（10⁴）を厳密度の低い条件下でキイロショウジョウバエ（Drosophila）ｈｈ ｃＤＮＡ（J．Mohlerより提供された）と、ｈｈ配列（Leeら、1992）を鋳型とし て用いてポリメラーゼチェイン反応により産生したＤＮＡ断片でスクリーニング した。２セットのポリメラーゼチェイン反応プライマーを使用した：５’−ＧＡ ＧＧＡＴＴＧＧＧＴＣＧＴＣＡＴＡＧＧ−３’（キイロショウジョウバエ（Dros ophila）ｈｈ ｃＤＮＡ中の652〜671位）と５’−ＣＴＴＣＡＡＧＧＡＴＴＣＣ ＡＴＣＴＣＡＡ−３’（1799〜1818位）；５’−ＡＧＣＴＧＧＧＡＣＧＡＧＧＡ ＣＴＡＣＣＡＴＣ−３’（945〜966位）と５’−ＴＧＧＧＡＡＣＴＧＡＴＣＧＡ ＣＧＡＡＴＣＴＧ−３’（1147〜1128位）。第２のプライマーセットで単離した クローンをサブクローニングし、両方の鎖についてジデオキシ鎖停止法（Sanger ら、1977）により配列決定した。ＤＮＡと誘導されたアミノ酸配列を、Genusソ フトウェアパッケージを用いてVAXコンピューターで解析した。 ｈｈ関連ｃＤＮＡクローンを同定するために、ｐＭＴ２１中のラットＥ１３フ ロアプラークｃＤＮＡライブラリーの約2.5×10⁵コロニーを、ＨＭミックス（５ ×デンハルト溶液、10％デキストラン硫酸、２×ＳＳＣ、２×ＳＳＰＥ、0.5％ ＳＤＳ、および50μg/ml変性ニシン精子ＤＮＡ）中のゼブラフィッシュｖｈｈ− １プローブと60℃でスクリーニングした。ハイブリダイズするクローンからのＸ ｈｏＩｃＤＮＡ挿入体をpBluescriptIIＫＳ（−）中でサブクローニングし、両 方の 鎖についてジデオキシ鎖停止法（Sangerら、1977）により配列決定した。配列解 析と編集は、ＧＣＧソフトウェアを用いてVAXコンピューターで行なった。in Situハイブリダイゼーション 基本的にHarland(1991)とKraussら(1991)の記載したジゴキシゲニン標識プロ ーブに若干の改良(Ruiz l Altabaら、1993b)を加えて、そして凍結切片について はSchaeren-WiemersとGerfin-Moser(1993)の記載した方法により、ｍＲＮＡ発現 のホールマウント（Whole-mount）in Situハイブリダイゼーション解析を行なっ た。各種について使用したプローブは、コード部域と非コード部域を含有した。 対照ハイブリダイゼーションは、蛋白の遺伝子に対するセンス鎖プローブとアン チセンスプローブを含有した。カエルのＦ−スポンジン遺伝子(Ruiz i Altabaら 、1993b)をＨｉｎｄIIIで消化後Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼで転写して、アンチセ ンスプローブを作成した。ＣＯＳ細胞中のｖｈｈ−１の発現 ＣＯＳ細胞を90％コンフルエンスになるまで一晩培養し、ダルベッコー改変イ ーグル培地（ＤＭＥＭ）中の12μg/mlリポフェクトアミノ試薬（ギブコビーアー ルエル（GIBCO BRL））で35mmシャーレあたり１μgのＤＮＡでトランスフェクシ ョンした。５時間後細胞を洗浄し、10％ＦＣＳを含有するＤＭＥＭ中で18時間イ ンキュベートした。次に培地を、10％ＦＣＳを含有する新鮮なＤＭＥＭと交換し 、細胞を24〜48時間インキュベートした。トランスフェクションの24時間後、Ｃ ＯＳ細胞を酵素を含まない解離培地（特に、メヂア社（Media，Incorporated） ）で解離させ、はく離させて、10％ＦＣＳ含有ＯｐｔｉＭＥＭに再懸濁した。20 0〜400個の細胞を含む20μｌの１滴を組織培養プレートのフタからしたたらせる ことにより凝集物を作成した。24時間後、細胞凝集物をラットの神経板外植片と 接触させた。神経板外植片培養物 ラット神経板組織を、Placzekら(1990a，1993)が記載するようにＥ９〜Ｅ１０ 胚（将来15〜19体節のレベルで）の神経板の中間および背側部域から単離した。 すでに記載されている（Yamadaら、1993）ようにHamburger-Hamiltonステージ10 のニワトリの胚からニワトリ神経板組織を切開した。位置決定処理後、ステージ ６のニワトリの胚から脊索外植片を単離した。ラットの神経板外植片を３次元コ ラーゲンゲル中に包埋し、記載された（Tessier-Lavigneら、1988；Placzekら、 1993）ように培養した。ＣＯＳ細胞凝集物の周りに神経板外植片を包んで結合体 を作成し、接触を最大にした。 Yamadaら(1993)が使用したものの約３分の１のサイズのニワトリの中間神経板 外植片を、35mmの組織培養シャーレ中で44時間増殖させた対照またはＣＯＳ細胞 の単層の上に置いた。コラーゲンゲルのクッションを外植片の上に置いて外植片 培養物の位置と接触を保持し、すでに記載された（yamadaら、1993）ように44時 間培養した。肢芽外植片培養物 ｓｈｈ（Riddleら、1993）を発現した部域に対応し、ＺＰＡ活性（HoniとSumm erbail、1985）を有すると定義されたHamburger-Hamiltonステージ20の胚の間充 織から、ニワトリの肢芽組織を切開し、隣接する外胚葉を後肢組織から切開した 。同様の大きさの外植片を前肢組織から切開した。外植片を記載されている（Pl aczekら、1993）ように処理した。ラットの組織を、肢芽外植片の間充織層と外 胚葉層の間にはさむが、または間充織層に向かいあわせた。カエルの胚中のｖｈｈ−１の発現 １または２細胞ステージのアメリカツノガエル（X．laevis）の胚に、超コイ ルプラスミドＤＮＡに注入した。すべての場合で、神経系（DaleとSlack、1987 ）を含む、外胚葉性派生物が発生するように運命付けられた動物の半球に注入し た。注入したプラスミド中のセンスまたはアンチセンス配置のｖｖｈ−１ｃＤＮ Ａは、Ｈｏｘ−Ｂ４部域Ａエンハンサー成分（Whitnigら、1991）を含有するＣ ＭＶプロモーターに発現される。部域Ａ成分は、組織の特異性や下流の遺伝子の 発現レベルに影響を与えない（A.R.A.，H.R.，AND T.M.J.，未発表データ）。注 入したプラスミドからのｖｖｈ−１転写体の発現は、アンチセンスＲＮＡプロー ブを用いるホールマウント（Whole-mount）in Situハイブリダイゼーションによ り追跡した。免疫細胞化学 カエルＨＮＦ−３８蛋白に対するラット抗体を、ホールマウント（Whole-moun t）標識法（Dentら、1989；Patelら、1989）について、１：5000〜１：8000倍希 釈で使用した。モノクローナル抗体（ＭＡｂ）６Ｇ３（マウスＩｇＧ）を用いて ＦＰ３が検出され、ＭＡｂ Ｋ１／２Ｅ７（マウスＩｇＧ１；Placzekら、1993） を用いてＦＰ４が検出された。１：1000に希釈したウサギ抗−アイレット（isle t）−１抗体（Thorら、1991；Korzhら、1993）とＭＡｂ ４Ｄ５（マウスＩｇＧ 、ラット島（islet）−１融合蛋白に対してS．Mortonにより作成された；Thore ら、1991）を用いて、アイレット−１が検出された。H．Tanakaにより提供され たＭＡｂにより、ＳＣ１蛋白が検出された。同じ外植片中のＦＰ３とＦＰ４の同 定のために、連続的な切片をＦＰ３とＦＰ４に対する抗体で標識した。実験結果 キイロショウジョウバエ（Drosophila）ｈｈ遺伝子の脊椎動物同族体の単離と性 状解析 キイロショウジョウバエ（Drosophila）ｈｈ遺伝子の脊椎動物同族体を単離す るために、ゼブラフィッシュとラットの胚ｃＤＮＡライブラリーを、キイロショ ウジョウバエから得られたポリメラーゼチェイン反応断片でスクリーニングした 。受精後９〜16時間のゼブラフィッシュ胚ライブラリーから単離された５つのク ローンは、２つの異なるｈｈ−関連ｃＤＮＡをコードし、その１つをここに記載 する。最も長いｖｈｈ−１ｃＤＮＡは、418アミノ酸の蛋白をコードする１本の 長い読みとり枠を有する2.6kb挿入体を含有した（図２Ａ−１と２Ａ−２）。ゼ ブラフィッシュｖｖｈ−１ｍＲＮＡ発現は、主に中線構造（特に、脊索と底板） に限定された。ゼブラフィッシュｖｈｈ−１ｃＤＮＡを用いて、胚日13（Ｅ１３ ）のラットの底板ｃＤＮＡライブラリーをスクリーニングした。0.8〜2.7kbの大 きさの挿入体を有する、16個のｃＤＮＡクローンが単離された。これらの各ｃＤ ＮＡクローンの部分的配列決定により、これらが同じ遺伝子に由来することが明 らかになった。2.7ｋｂの１つのクローンの配列決定により、437アミノ酸の蛋白 を予測させる１本の長い読みとり枠が明らかになった。 ラットｖｈｈ−１ｃＤＮＡは、ゼブラフィッシュｖｈｈ−１に対して71％、マ ウスｓｈｈ（Echelardら、1993）に対して94％、ｓｈｈ（Riddleら、1993）に対 して82％、そしてキイロショウジョウバエｈｈ（図２Ａ−１および２Ａ−２）に 対して47％の同一性を有する蛋白をコードする。残基437〜466（ハエのｈｈ配列 と並べた残基：図２Ａ−１と２Ａ−２）にわたるＣ−末端の部域を除いてゼブラ フィッシュｓｈｈ（Kraussら、1993）の配列。ゼブラフィッシュｖｈｈ−１は分 岐の部域で、Beachyと共同研究者により単離されたｚｈｈＥ蛋白と同一である（ P．Beachy、私信）。脊椎動物とハエの蛋白の間の最大の保存はＮＨ₂−末端の20 0アミノ酸にわたって存在する。ゼブラフィッシュとラットのｖｈｈ−１蛋白と もに、シグナル配列として作用する可能性のある疎水性ＮＨ₂−末端を含有し（ 図２Ｂ）、処理される蛋白が分泌されることを示唆している。ゼブラフィッシュ とラットのｖｈｈ−１遺伝子および的ニワトリのｓｈｈ遺伝子の配列と発現パタ ーンの類似性は、これらが同族体であることを示唆している。胚発生の間のｖｈｈ−１遺伝子の発現 ゼブラフィッシュとラットのｖｈｈ−１遺伝子の発現パターンは同様であり、 本出願人はここでラット遺伝子の発現のみを示す。出願人は、Ｅ９で原腸形成し ているラット胚中のｖｈｈ−１ｍＲＮＡ発現を測定した。この時ｖｈｈ−１ｍＲ ＮＡは、結節および退行する結節の後に生成した軸中胚葉細胞に見いだされた（ 図３Ａ）。ｖｈｈ−１ｍＲＮＡ発現は中線中胚様細胞で持続しながら脊索に分化 していき（図３Ｂと３Ｃ）、Ｅ１５までこの構造で検出され、最後のステージを 調べた（図３Ｄと３Ｅ）。神経板と新たにクローン化された神経管の細胞は、ｖ ｈｈ−１ｍＲＮＡを発現しない（図３Ｃと３Ｄ）。しかし脊髄の頭側部域の底板 細胞はＥ１０．５までに遺伝子を発現し（図３Ｂ）、まもなく頭側から尾側まで のすべてのレベルでｖｈｈ−１ｍＲＮＡが検出され、少なくともＥ１５まで持続 した（図３Ｅ）。脊髄と後脳では、他のラット底板マーカーとの比較（データは 示していない、Placzekら、1993；Ruiz i Altabaラット、1993）から評価すると 、ｖｈｈ−１ｍＲＮＡの発現は底板に限定されていた。前脳では、ｖｈｈ−１発 現はさらに横に腹側の間脳にも存在し、漏斗状器官のレベルで腹側の中線には存 在しなかった（データは示していない）。間脳内では、ｖｈｈ−１ｍＲＮＡの発 現は背中側に延長しており、腹側視床と背中側視床の境界に延長している（デー タは示していない）。間脳の頭側では、ｖｈｈ−１発現は成長している視床の部 域に腹側に検出される。ｖｈｈ−１ｍＲＮＡの脊髄側の発現の唯一の背中側の 部位は、Ｅ１０．５で最初に検出される中脳の根元の一群の細胞である（図３Ｂ ）。 ｖｈｈ−１ｍＲＮＡは、Ｅ１０．５〜Ｅ１５のラット胚の２つの追加部域に検 出された。初期消化管の腹側に位置する内胚葉細胞は、ｖｈｈ−１ｍＲＮＡを発 現した（図３Ｂ）。内胚葉由来の組織中の遺伝子発現の強度は、発生の後期ステ ージで増加し、Ｅ１５〜Ｅ１５までに消化管と肺の上皮で高レベルで発現される （データは示していない）。ｖｈｈ−１ｍＲＮＡはまた、Ｅ１１〜Ｅ１４の成長 している肢芽の後部間充織細胞中で発現され(図７Ａを参照)、これは極性化活性 帯（ＺＰＡ）として定義される部域に対応する。 底板誘導活性を有する細胞群である結節、脊索および底板におけるｖｈｈ−１ の発現は、この遺伝子が底板誘導活性をコードする可能性を上昇させ、この遺伝 子が底板誘導性分子をコードする可能性を上昇させる。以下の項で、我々は腹側 神経細胞の分化に及ぼすｖｈｈ−１のインビボおよびインビトロの効果を説明す る。カエル胚中のｖｈｈ−１遺伝子の異所性発現は、背側神経管中の底板分化を引き 起こす 本出願人は、成長している胚中のｖｈｈ−１遺伝子の異所性発現の結果を追跡 した。ｖｈｈ−１の異所性発現は、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）プロモータ ーの支配下のラットｖｈｈ−１ｃＤＮＡを含有するプラスミドベクターを注入し て行なった。神経板ステージ（ステージ13〜17）で、ラットｖｈｈ−１ｍＲＮＡ は、主に前方上皮と神経板（試験した11個の胚のうちの11）の部域に存在する広 い範囲の細胞で発現された。しかしオタマジャクシのステージ（ステージ32〜38 ）までに、ｖｈｈ−１ｍＲＮＡはモザイク様になり、より小さい群の細胞に検出 された（データは示していない）。注入した胚のうち31％（試験した74のうち23 ）は、神経管中のｖｈｈ−１の異所性発現を示した。神経板と神経管内で、ＣＭ Ｖに支配されるラットｖｈｈ−１遺伝子の脊髄側の発現のドメイン中の一貫した 制限は存在しなかった（図４Ａ；データは示していない）。 本出願人は２つの底板マーカーを追跡することによりｖｈｈ−１ＲＮＡの広範 な発現が異所の底板細胞の分化を引き起こすか否かを測定し、細胞接着分子Ｆ− スポンジン（klarら、1992；Ruiz l Altabaら、1993a）（図４Ｂと４Ｄ）と転写 因子ＨＮＦ−３β（153のうち19）を底板以外の部域で検出した（図４Ｃ、４Ｅ 、４Ｆ、４Ｈおよび４ｌ）。両マーカーの異所性発現は、中脳、後脳、および脊 髄レベルで検出されたが、前脳部域には検出されなかった（図４Ｅ、４Ｆ、４Ｈ および４ｌ）。アンチセンス配向でｖｈｈ−１ｃＤＮＡの発現を指令するプラス ミドを注入した胚は、異所性Ｆ−スポンジン発現が著しく低下しており（２％、 198のうち４）、そして異所性ＨＮＲ−３β細胞は検出されなかった（53のうち ０）。従って成長しているカエルの胚のラットｖｈｈ−１の広範な発現は、底板 マーカーの異所性誘導を引き起こす。ＨＮＦ−３βとＦ−スポンジンＲＮＡの異 所性発現が前脳を除く軸策のすべての頭尾（rostrocaudal）レベルで観察された が、異所性マーカー発現の主要な場所は上衣板の中または近くの背側中線の細胞 中であった（図４Ｃ、４Ｅ、４Ｆ、４Ｈおよび４ｌ）。いくつかの胚では、異所 性底板マーカーの発現の部域中の神経管の形態は異常であり、神経管中で著しく 収縮またはひだが見られた（データは示していない）。ｖｈｈ−１によりインビトロで誘導される底板の分化 腹側神経細胞を誘導するｖｈｈ−１の能力をより直接的に試験するために、本 出願人はラット底板（Placzekら、1993）とニワトリの運動ニューロン（Yamada ら、1993）分化の確立されたインビトロ測定法を用いた。 底板分化を検出するために、本出願人はインビトロで培養したラット神経板外 植片の底板抗原ＦＰ３とＦＰ４（図５Ａと５Ｂ）の誘導を追跡した。脊索と底板 は、Ｅ９〜Ｅ１０のラット神経板組織と接触させて増殖させた時、ＦＰ３とＦＰ ４の発現を誘導する（図５Ｃと５ｄ）（Placzekら、1993）。センスまたはアン チセンス配向で全長ｖｈｈ−１ｃＤＮＡを含有する発現ベクターは、一時的にＣ ＯＳ細胞にトランスフェクションされた。約25％のＣＯＳ細胞はｖｈｈ−１ＲＡ Ｎを発現した（データは示していない）。 センスｖｈｈ−１ｃＤＮＡを発現するＣＯＳ細胞に接触して増殖させた神経板 外植片のうち、70％はＦＰ３を発現し47％はＦＰ４を発現した（図５Ｅ〜５Ｈ； 表１）。脊索による底板の誘導のように、必ずしもすべてのＦＰ３を発現する外 植片がＦＰ４を発現しなかった。これはインビボのＦＰ４の後期発現を反映して いるかも知れない（Ｐlaczekら、1993）。神経板外植片内のＦＰ３とＦＰ４発現 の ドメインは、脊索により誘導されるものと同様の大きさであり、標識した細胞は ＣＯＳ細胞凝集物と神経板外植片の結合部の近くに位置していた。従ってｖｈｈ −１による底板の誘導は局所的であり、おそらく接触依存性の過程であろう。こ れと一致して、ｖｈｈ−１がトランスフェクションしたＣＯＳ細胞からの培地は 、単独で増殖させた神経板外植片に添加した時、ＦＰ３またはＦＰ４を誘導しな かった（データは示していない）。しかしｖｈｈ−１活性が培地まで拡散してい くか否かはまだ決定されていない。アンチセンスｖｈｈ−１ｃＤＮＡでトランス フェクションした細胞に接触して増殖した神経板外植片は、ＦＰ３またはＦＰ４ を発現しなかった（図５Ｊと５Ｋ；表１）。 これらの結果の最も単純な説明は、ｖｈｈ−１蛋白がＣＯＳ細胞から分泌され 、神経板細胞と相互作用して、直接底板分化を引き起こすということである。し かし、ＣＯＳ細胞中のｖｈｈ−１の発現が、底板誘導に介在する明確な因子の合 成を誘導する可能性がある。さらに、ＣＯＳ細胞はｖｈｈ−１と協働して作用す る付属因子を提供するため、これらの結果は、ｖｈｈ−１蛋白は底板分化を誘導 するのに充分か否かを解決していない。ｖｈｈ−１によりインビトロで誘導される運動神経分化 脊索からのシグナルは底板細胞とともに運動ニューロンの分化を誘導できるこ との証拠を、インビトロ試験は提供した（Yamadaら、1993）。従って脊索中のｖ ｈｈ−１の発現は、運動ニューロンもｖｈｈ−１により誘導されるかという問題 を提起する。 ｖｈｈ−１が運動ニューロンを誘導できるか否かを測定するために、本出願人 は、運動ニューロン分化が性状解析されているニワトリの神経板外植片を使用し た（表１；Yamadaら、1993）。運動ニューロンは、２つのマーカー、ＬＩＭホメ オドメイン蛋白アイレット−１（Thorら、1991；Ericsonら、1992）（図６Ａ） と免疫グロブリン様蛋白ＳＣ１（TanakaとObata、1994）の同時発現により同定 される（図６Ｄ）。センスまたはアンチセンスｖｈｈ−１発現プラスミドでトラ ンスフェクションしたＣＯＳ細胞の単層上で、中間神経板外植片（Yamadaら、19 93）を44時間増殖させた。センスｃＤＮＡを発現するＣＯＳ細胞上で増殖させた 神経板は、平均83個のアイレット−１’細胞を含有した（図６Ｂと６Ｃ；表１） が、 アンチセンスｖｈｈ−１ｃＤＮＡでトランスフェクションしたＣＯＳ細胞上で増 殖させた外植片は、最大１個のアイレット−１細胞を発現したのみである（図６ Ｇ、表１、運動ニューロン誘導）。免疫蛍光標識と共焦点イメージングにより、 多くのアイレット−１’細胞がその表面にＳＣ１を発現する（図６Ｅと６Ｆ）（ ｎ＝27外植片）ことが明らかになり、運動ニューロンとしてのその本体が確認さ れた。センスｖｈｈ−１ｃＤＮＡでトランスフェクションしたＣＯＳ細胞により 調整した培地は、中間神経板外植片中でアイレット−１’細胞を誘導しなかった （データは示していない）。 ニワトリ神経板外植片中の底板分化のあいまいなマーカーは入手できないため 、本出願人は、ｖｈｈ−１に応答してニワトリ神経板外植片中でも底板分化が起 きるか否かを測定できなかった。 これらをまとめると、これらのインビトロ測定法は、ｖｈｈ−１を発現するＣ ＯＳ細胞は底板細胞と運動ニューロンの両方を誘導できる証拠を提供するが、運 動ニューロン誘導がｖｈｈ−１に対する直接の応答であるか否かは不明である。 底板分化は後部肢芽細胞によりインビトロで誘導される 結節、脊索および底板は、底板分化を誘導し（Placzekら、191、1993）、成長 しているニワトリ肢芽の足指の複製を誘発するＺＰＡの能力を模倣することもで きる（HornbruchとWolpert、1986；Wagnerら、1990、StokerとCarison、1990；H oganら、1992）。ＺＰＡ部域のｖｈｈ−１の発現（図３、図７Ａ参照）は、ＺＰ Ａは、底板分化を誘導する中線細胞の能力を模倣することができるか否かという 問題を提起する。これを試験するために、本出願人は、インビトロでラット神経 板外植片中の底板分化を誘導するＺＰＡの能力を測定した。後肢間充織のＺＰＡ 部域（HonigとSummerbell、1985）を、隣接する先端外胚葉とともに単離して、 インビトロでＺＰＡ活性を維持する因子を得た（Andersonら、1993；VogelとTic kle、1993；Niswanderら、1993）。後肢間充織と外胚葉と接触させて増殖させた 神経板外植片のうち、73％はＦＰ３を発現し45％はＦＰ４を示した（表１、底板 誘導；図７Ｂと７Ｃ）。これに対して、前肢間充織と外胚葉と接触させて増殖さ せた神経板外植片はＦＰ３またはＦＰ４を発現しなかった（図７Ｄと７Ｅ；表１ 、底板誘導）。間充織の非存在下で後肢外胚葉と接触させて増殖させた神経板外 植片はＦＰ３またはＦＰ４を誘導しなかった（データは示していない）。これら の結果は、ｖｈｈ−１発現は細胞に底板誘導活性を与えるという考えを指示する 。実験的考察 神経管内の腹側の細胞の分化は、脊索に由来するシグナルに支配される。本出 願人は、キイロショウジョウバエｈｈ遺伝子の同族体であるｖｈｈ−１を同定し た。ｖｈｈ−１は中線中胚様と神経細胞中（結節、脊索、および底板）で発現さ れる。カエル胚でのｖｈｈ−１遺伝子の広範な発現は、異所性底板分化を引き起 こし、ｖｈｈ−１を発現するＣＯＳ細胞は、インビトロで神経板外植片中で底板 と運動ニューロン分化を誘導することができる。我々の結果は、脊索によるｖｈ ｈ−１の発現は、かぶさっている神経板細胞中の底板の誘導と運動ニューロン分 化に関与することを示唆している。底板と運動ニューロン分化におけるｖｈｈ−１の関与 インビトロの試験により、脊索の明確な２つの活性（接触介在底板誘導活性と 拡散性の運動ニューロン誘導活性）の証拠が得られた（Placzekら、1990a、1990 b、1993；Yamadaら、1993）。両方の活性ともに、脊索による誘導の後に底板に より得られる。我々の結果は、底板誘導はｖｈｈ−１に対する直接の応答として 起きることの証拠を提供する。さらに、脊索誘導シグナルのように、ｖｈｈ−１ による底板誘導は局所的事象であり、接触介在性である。 ｖｈｈ−１は底板細胞とともに運動ニューロンを誘導するが、我々の結果は、 これが直接的であり、ｖｈｈ−１が脊索や底板調整培地中に存在する拡散性の運 動ニューロン誘導活性があるか否かを解決していない。ｖｈｈ−１は底板の分化 を誘導できるため、誘導された底板は、ｖｈｈ−１とは異なる運動ニューロン誘 導因子を分泌できるであろう。ｖｈｈ−１を分泌する細胞による調整培地中にｖ ｈｈ−１が存在するか否かも不明である。キイロショウジョウバエにおいてｈｈ は非自律的に作用（Mohlerら、1988）し、ｈｈ（または、ｈｈ機能の下流のメデ ィエーター）は、細胞数個の直径に距離にわたって作用する（Ingham、1993；He berleinら、1993；Maら、1993；HeemskerkとDinardo、1994；BasierとStruhl、1 994）。これに一致して、ｈｈ蛋白はｈｈｍＲＮＡ発現のドメインを越えて検出 されている（Taylerら、1993）。 脊索によるｖｈｈ−１の初期の発現は、その底板と運動ニューロン誘導活性と 同時である。しかし、胚の成長の後期にも脊索によるｖｈｈ−１の発現が持続す ることは、脊索は、インビトロで底板を誘導する活性を急速に喪失するというイ ンビトロの試験（Placzekら、1990a、1990b、1993）とは異なる。この差異は、 ｖｈｈ−１の活性を阻害する脊索因子の発現、または必要なコファクターの発現 の喪失の開始を反映しているかも知れない。ラットにおいて、底板細胞によるｖ ｈｈ−１発現は、まず神経管が閉じてから検出され、これは底板細胞が底板と運 動ニューロン誘導活性を獲得する時期と一致する（Placzekら、1993；Yamadaら 、1993）。この時までに、神経板中の細胞は、さらなるニューロン分化を開始さ せたシグナルに曝されるようである（Yamadaら、1993）。従って、底板によるｖ ｈｈ−１発現が、運動ニューロン分化の開始に関与している可能性は低い。しか し、後期に発生する運動ニューロン（HollydayとHamburger、1977）が、分化の ために底板由来のｖｈｈ−１に依存することはあり得る。底板中のｖｈｈ−１の 第２の機能は、神経管の成長とともに底板に追加の細胞を呼び集めることに関与 してい る可能性はある（Placzekら、1993）。底板分化の経路 神経管中で異所性ＨＮＦ−３βを誘導するｖｈｈ−１の能力は、底板の正常の 成長に関与する工程に関係があるかも知れない。ピンタラビス（Pintallavis） とＨＮＦ−３βは、結節、脊索および底板中で発現される（Ruiz l AltabaとJes sell、1992;Monaghanら、1993;SasakiとHogan、1993;Ruiz l Altabaら、1993b） 。底板による両遺伝子の発現は、脊索からの誘導性シグナルに依存（Ruiz l Alt abaら、1992；A.R.A.，MT.，J.D.，AND T.M.J.、未公表データ）し、発現は他の 底板性の前に起きる。 ピンタラビス（Pintallavis）とＨＮＦ−３βの広範な発現は、背側神経管中 での底板マーカーの発現を誘導（Ruiz l Altabaら、1993a；A.R.A.ら、未公表デ ータ；SasakiとHogan、1994）し、これはＨＮＦ−３βとピンタラビス（Pintall avis）が、神経板の中線の細胞中の底板の運命を規定するのに関与していること を示唆する。従ってｖｈｈ−１によるＨＮＦ−３βの誘導は、ｖｈｈ−１自身や Ｆ−スポンジンのような遺伝子の転写を含む底板分化のプログラムを開始する脊 索の能力を模倣するようである。底板分化のために条件 カエル胚中のラットｖｈｈ−１の広範な発現は、インビボで異所性の底板分化 を誘導する。ニワトリとゼブラフィッシュｓｈｈ遺伝子は、底板マーカーを誘導 することが証明されたが、これは中脳部域においてのみである（Echelardら、19 93；Kraussら、1993）。我々のインビボ試験は、底板マーカーの異所性発現はま た、後脳および脊髄レベルで得られるが、前脳では得られないことを明白に示し ている。前脳における異所性底板マーカーの欠如は、脊索が神経板の前部部域で 底板分化を誘導できないことを示すインビトロ試験と一致する（Placzekら、199 3）。 カエル胚中のｖｈｈ−１の広範な発現は、インビボで異所性底板分化を誘導す る。ニワトリとゼブラフィッシュｓｈｈ遺伝子もまた、中脳部域のみであるが底 板マーカーを誘導することが証明された（Echelardら、1993；Kraussら、1993） 。我々のインビトロ試験は、底板マーカーの異所性発現はまた、後脳および脊髄 レ ベルで得られるが、前脳では得られないことを明白に示している。前脳における 異所性底板マーカーの欠如は、脊索が神経板の前部部域で底板分化を誘導できな いことを示すインビトロ試験と一致する（Placzekら、1993）。 ｖｈｈ−１の広範な発現は、前脳への尾の方向の軸策のすべてのレベルで異所 性底板分化を誘導するが、本出願人は、異所性底板マーカーは主に、神経管の背 側に見いだされることを観察した。しかし脊索移植片は、神経管内のすべての背 から腹部までの位置で底板分化を誘導することができる（van Straatenら、1988 ；Yamadaら、1991）。すなわちインビボで脊索は、ｖｈｈ−１のみには応答しな い神経管の部域で底板分化を誘導できる。ｖｈｈ−１と脊索に対する神経管応答 の観察された差異は、脊索とｖｈｈ−１発現プラスミドに与えられるｖｈｈ−１ レベルの定量的な差異に起因するかも知れない。あるいは、脊索は追加的なシグ ナル分子（その機能の１つは、底板の運命の決定におけるピンタラビス（Pintal lavis）とＨＮＦ−３βを協働する転写因子の発現を制御することである）を提 供するかも知れない。ｖｈｈ−１発現と、神経管と肢極性化活性の交換性 結節、脊索、底板および後肢間充織におけるｖｈｈ−１の発現は、これらの細 胞群がシグナル性を共有できる分子的基礎を与える（JessellとDodd、1992;Ruiz l AltabaとJessell、1993）。成長しているニワトリの肢芽へのハンゼン結節、 脊索または底板の移植は、ＺＰＡの足指複製を模倣する機能を誘発する（Hornbr uchとWolpert、1986；Wagnerら、1990；StokerとCarlson、1990；Hoganら、1992 ）。この結果は、ＺＰＡが底板分化を誘導できることを示す。さらに、結節、脊 索、底板およびＺＰＡの共通のシグナル性は、レチノイド活性よりｖｈｈ−１発 現のパターンに、より密接に相関するようである（TallerとEichele、1987；Ros santら、1991；Wagnerら、1992）。肢と神経のパターン化は共通の基礎を有する という考えの追加的支持は、ニワトリのｓｈｈは肢芽の前部部域で発現される時 、ＺＰＡ活性を模倣できることを示す最近の試験により与えられる（Riddleら、 1993）。従って、結節、脊索、および底板のｖｈｈ−１遺伝子の発現は、足指の 複製を引き起こすＺＰＡの活性を模倣するこれらの中線細胞群の基礎となる可能 性がある。反対にｖｈｈ−１の発現は、底板分化を誘導するＺＰＡの能力の基礎 となるかも 知れない。細胞パターンの分泌された制御物質としてのＨｈ−関連ＴＧＣβとＷｎｔ蛋白 キイロショウジョウバエにおいて、ｄｐｐ、ｗｇ、およびｈｈは、胚と幼虫の 成長における細胞の運命とパターンを制御する。脊椎動物においては、ＴＧＦβ とｗｎｔ遺伝子ファミリーのメンバーが、神経成長の間の細胞分化を制御する。 ｗｎｔ−１遺伝子は、中脳および前方後脳成長に必要である（McMahonとBradely 、1990；ThomasとCapecchi、1990）。またＴＧＦβファミリーのメンバーである dorsalin-1は神経板外植片のインビトロでの背側細胞の分化を促進する（Blaser ら、1993）。我々の結果は、ｖｈｈ−１はまた、脊椎動物の明確な細胞パターン 化に寄与し、神経管の腹側部域の明確な細胞を誘導することを示唆する。すなわ ちdorsalin-1は背側に、そしてｖｈｈ−１は腹側に、神経管の背腹軸に沿って、 シグナルを極性化するかも知れない。 第２シリーズの実験 脊椎動物のハリネズミ関連遺伝子のｖｈｈ−１／ｓｏｎｉｃ ｈｅｄｇｅｈｏ ｇは、前脳を含む神経管の頭尾軸の全長にわたる腹側ドメイン中で発現される。 本出願人はここで、ｖｈｈ−１／ｓｈｈは神経板の将来前脳になるべき部域に由 来する外植片中の腹側神経細胞の分化を誘導することを示す。神経板の間脳およ び終脳レベルの両方から得られる外植片で誘導されるニューロンは、ＬＩＭホメ オドメイン蛋白を発現するが、これらのニューロンは、前脳のこれらの２つの亜 分画で産生される腹側ニューロンと一致する明確な性質を有する。これらの結果 は、神経板の尾レベルでのニューロン分化の以前の研究結果とともに、単一の誘 導性分子であるｖｈｈ−１／ｓｈｈが、胚中枢神経系の頭尾軸の全長にわたって 明確な腹側神経細胞の誘導を仲介することを示唆する。 脊椎動物の胚では、神経系のパターン化は、神経前駆細胞の運命を指令するよ うに、短い距離で作用する誘導性シグナルにより開始される。神経管内で産生さ れる細胞の複雑なパターンは、神経板内の頭尾軸の異なる位置で細胞に部域的性 質を与え（Doniachら、1992；Ruiz l Altaba、1992；Papalopulu、1994）、神経 管の背腹軸に沿って細胞の本体を規定するシグナルが関与する（JessellとDodd 、1992；Baslerら、1993；Smith、1993）と考えられている。従って神経前駆細 胞の運命は、神経管の頭尾軸と背腹軸に沿った位置に依存する。 神経管の背腹軸に沿った細胞の分化を制御する機序は、軸策の尾側のレベルで 詳細に検討された。脊髄では、腹側の細胞の分化は、脊索の軸方向の中胚様細胞 からかぶさる神経板細胞に伝達されるシグナルにより開始され、腹側中線に沿っ た底板細胞の分化を、そして神経管内の横方向には運動ニューロンの分化を誘導 する（van Straatenら、1988；Placzekら、1990；1991；Yamadaら、1991；Gooul dingら、1993）。後のステージで、底板細胞により同様または同一のシグナル性 が獲得される（Hattaら、1991；Yamadaら、1991；Placzekら、1993）。脊索およ び底板由来のシグナルに応答して産生される腹側神経細胞の特異的な性質は、頭 尾軸に沿ったニューロン前駆細胞の起源の位置により規定されるようである。例 えば、セロトニン作動性のニューロンは、頭側菱脳のレベルで中線由来シグナル により誘導され（Yamadaら、1991）、ドーパミン作動性ニューロンは中脳のレベ ルで誘導される（Hynesら、1995）。 軸策の尾側のレベルで、キイロショウジョウバエ遺伝子ｈｅｄｇｅｈｏｇにコ ード（Nusslein-VohardとWieschaus 1980；Leeら、1992）にコードされる分泌 される糖蛋白の脊椎動物同族体、ｖｈｈ−１／ｓｈｈｈｅｄｇｅｈｏｇ（ｓｈｈ ）は、腹側の細胞の誘導に関係があるとされている。ｖｈｈ−１／ｓｈｈは、こ れらの２つの細胞群がその誘導活性を示す時、脊索と底板により発現される（Ri ddle、1993；Kraussら、1993；Echelardら、1993；Changら、1994；Roelinkら、 1994）。さらに神経板をｖｈｈ−１／ｓｈｈに曝すと、底板細胞以外に運動ニュ ーロンの分化が起き（Roelinkら、1994）、ｖｈｈ−１／ｓｈｈが軸策の尾側の レベルで腹側ニューロンの誘導に参加していることを示唆している。 胚前脳のほとんどのレベルで、脊索と底板は欠如しており（Kingsbury、1930 ；PuellesとRubenstein、1993）、腹側ニューロンの分化を引き起こす誘導性シ グナルの本体もその起源も確立されていない。ゼブラフィッシュの突然変異体で あるｃｙｃｌｏｐｓ（Hataら、1991）の研究は、胚の間脳の腹側中線の細胞が、 間脳のパターン化にある役割を果たしている証拠を提供した（Hataら、1994；Ma cdonaldら、1994）。ｖｈｈ−１／ｓｈｈは胚前脳腹側中線で細胞により発現さ れ（Echelardら、1993；Kraussら、1993；Changら、1994；Roelinkら、1994）、 この遺伝子が前脳および軸策中のさらに尾側のレベルでニューロン本体の規定に 参加している可能性を示している。 この問題を検討するために、本出願人は、前脳の間脳および終脳亜分画で産生 される腹側ニューロン細胞の同定を可能にする転写因子と他の分子マーカーをま ず規定した。次に本出願人は、これらのマーカーを用いて、前脳になることを運 命付けられた神経板のレベルから得られた外植片中の明確な腹側ニューロンクラ スの分化を誘導するｖｈｈ−１／ｓｈｈの能力を検討した。本出願人の結果は、 ｖｈｈ−１／ｓｈｈは、神経管のより尾側のレベルの運動ニューロンを誘導する のに加えて、前脳で普通に見られる腹側ニューロン細胞を誘導することを示す。 これらの知見は、単一の誘導性分子であるｖｈｈ−１／ｓｈｈが、軸策の頭尾軸 の全長に沿って腹側神経細胞の誘導に関与していることを示唆する。これらはま た、ｖｈｈ−１／ｓｈｈにより誘導され得る腹側ニューロン細胞の範囲は、神経 板内の細胞の頭尾軸中の特徴の限定により規定されることを示す。実験結果 ｖｈｈ−１／ｓｈｈおよびアイレット−１は胚ＣＮＳの隣接腹側ドメインを占め る 胚前脳のパターン化におけるｖｈｈ−１／ｓｈｈの関与の調査を開始するため に、腹側前脳ニューロンの初期マーカーを同定することが必要であった。軸策の 尾側レベルで、運動ニューロンは、その分化が脊索と底板に提供される誘導性シ グナルに依存する１つの優れたクラスを構成する（Yamadaら、1991、1993）。分 化している運動ニューロンの最も初期のマーカーはアイレット−１であり（Karl ssonら、1990）、運動ニューロン前駆体として発現されるＬＩＭホメオドメイン 蛋白は細胞サイクルから離れる（Ericsonら、1992；Korzhら、1993；Inoueら、1 993；Tshuchidaら、1994）。運動ニューロンは前脳には存在しないが、アイレッ ト−１は成人の前脳中で腹側ニューロンにより発現される（Thorら、1991）。こ の観察結果から本出願人は、アイレット−１の胚発現が、前脳および軸策のより 尾側のレベルで腹側ニューロン細胞の分化の初期マーカーを与えるか否かを調べ た。 従って本出願人は、ニワトリの胚の神経系におけるアイレット−１の発現パタ ーンを調べ、これをｖｈｈ−１／ｓｈｈと比較した。Hamburger-Hamilton（ＨＨ ）ステージ18で、アイレット−１⁺細胞は神経管の頭尾軸に沿って、不連続なド メインで見いだされた。各アイレット−１細胞群は、ｖｈｈ−１／ｓｈｈの発現 ドメインに接触していた（図８、要約については図９Ａｉを参照）。脊髄、菱脳 、および中脳において、ｖｈｈ−１／ｓｈｈは、腹側中線で底板細胞により発現 され（図８Ｂ、Ｆ、Ｇ、およびデータは示していない）、そしてアイレット−１ は底板に対して横に位置する細胞により発現される（図８Ｂ、Ｆ、Ｇ、およびデ ータは示していない）。漏斗状器官のレベルの中脳（midiencephalon）では、ｖ ｈｈ−１／ｓｈｈは腹側中線では発現されないが、より横に位置していた（図８ Ａ、Ｄ）。アイレット−１⁺細胞はまた、腹側中線から除外されたが、ｖｈｈ− １／ｓｈｈ発現のゾーンのすぐ横に位置していた（図８Ｄ）。頭側間脳では、ｖ ｈｈ−１／ｓｈｈは神経管の腹側中線で発現され、脳室ゾーンに限定された（図 ８Ｅ、 Ｈ、Ｉ）。この部域内に、アイレット−１⁺細胞はまた、ｖｈｈ−１／ｓｈｈの 発現ドメインにすぐ隣接する、中線に位置していた。終脳では、ｖｈｈ−１／ｓ ｈｈ発現のゾーンはまた、神経管の腹側中線に広がっていた（図８Ｊ、Ｋ）。ア イレット−１⁺細胞はまた、腹側に限定され、ｖｈｈ−１／ｓｈｈを発現する細 胞と混ざり合っていた（図８Ｋ）。これらの結果は、アイレット−１発現が前脳 および神経管のより尾側レベルで腹側細胞を規定することを示す。 軸策のすべてのレベルで（終脳は除く）、ｖｈｈ−１／ｓｈｈの発現はアイレ ット−１⁺細胞の分化に先行した。ｖｈｈ−１／ｓｈｈの発現は、ＨＨステージ ６で予測される中脳レベルで神経管の中線の細胞で検出された（図１０Ａ；およ びデータは示していない）。ＨＨステージ６と10の間で、ｖｈｈ−１／ｓｈｈの 中線発現は、頭側には間脳に、そして尾側には菱脳や脊髄に延長していた（デー タは示していない）。脊髄、菱脳、中脳および間脳レベルでのアイレット−１発 現の開始は、ＨＨステージ13と15の間で起き（図８Ｅ；Ericsonら、1992；Tshuc hidaら、1994；およびデータは示していない）、同様のレベルでｖｈｈ−１／ｓ ｈｈ発現の開始後18〜24時間に起きた。しかし腹側の終脳では、ｖｈｈ−１／ｓ ｈｈの発現は、後期ＨＨステージ17まで、頭側間脳の腹側中線細胞中で遺伝子が 最初に発現されるまで検出されず（データは示していない）、アイレット−１発 現の開始と一致した。異なる軸レベルでアイレット−１を発現する細胞は、明確な性質を有するニュー ロンである 軸策の異なる頭尾軸レベルで検出される腹側アイレット−１⁺細胞がニューロ ンか否かを決定するために、本出願人はアイレット−１とニューロン特異的マー カーであるβ−チューブリンおよびｃｙｎ−１に対する抗体を用いて２重標識免 疫細胞化学を行なった。すべての軸レベルで、アイレット−１⁺細胞は、β−チ ューブリンおよび／またはｃｙｎ−１を発現し、これらがニューロンであること が確認された（データは示していない）すべてのアイレット−１⁺細胞はニュー ロンであるが、異なる頭から尾へのレベルでこれらの性質は明確であった。ＳＣ１発現は運動ニューロンとしてのアイレット−１⁺ニューロンを規定する 菱脳と中脳において、アイレット−１⁺ニューロンの位置は、体性、内蔵およ び 上腕運動核の位置に一致した。これらのレベルでアイレット−１⁺ニューロンは 、脊髄運動ニューロン（Yamadaら、1991；Ericsonら）と同様に免疫グロブリン 様表面蛋白ＳＣ１（図９Ａｉｉ、Ｂ、およびデータは示していない）を発現した 。最も頭側の群のニューロンは中脳で産生され（Simonら、1994）、従って胚の 間脳や終脳に存在するアイレット−１⁺ニューロンは、運動ニューロンを生じに くい。これと一致して、間脳や終脳のアイレット−１⁺ニューロンはＳＣ１を発 現しなかった（図９Ｃ、およびデータは示していない、また表３を参照）。Ｎｋｘ２．１発現は腹側前脳細胞を規定する ：間脳や終脳部域に見いだされる細 胞をより尾側にある細胞から区別するためのマーカーを同定するために、本出願 人はホメオドメイン含有蛋白Ｎｋｘ２．１の発現パターンを調べた。マウス胚に おいて、ｖｈｈ−１／ｓｈｈの部域と重複する腹側ドメインで神経管の将来の間 脳および終脳レベルでＮｋｓ２．１ｍＲＮＡが発現されたが、菱脳および脊髄レ ベルではこの遺伝子は発現されなかった（Lazzaroら、1991；Priceら、1992；Ru bensteinら、1994）。ＨＨステージ14〜18で調べたニワトリ胚では、中央および 頭側間脳および終脳の広い腹側ドメインで、Ｎｋｘ２．１に対する抗体は細胞を 標識した（図９Ａiii、Ｄ、およびデータは示していない）。Ｎｋｘ２．１細胞 は、菱脳または脊髄中で検出されなかった（図９Ａiii、およびデータは示して いない）。間脳におけるＮｋｘ２．１の発現はＨＨステージ９で起き、終脳では ＨＨステージ13／14で起きた（データは示していない）。腹側前脳におけるＮｋ ｘ２．１の発現は一過性であり、ＨＨステージ19〜20までにＮｋｘ２．１⁺細胞 の数は著しく減少した（データは示していない）。このため、Ｎｋｘ２．１と発 現する細胞とアイレット−１を発現する細胞の重複の程度を正確に測定すること はできなかった。しかしＨＨステージ18で調べた時、約10％のＮｋｘ２．１⁺細 胞はアイレット−１を同時発現した（データは示していない）。すなわち、Ｎｋ ｘ２．１の発現は、主に腹側前脳細胞のマーカーとして作用するが、Ｎｋｘ２． １とアイレット−１の同時発現は、間脳や終脳で産生されるアイレット−１ニュ ーロンを尾側のレベルで見いだされるものと区別するのに使用できる。ＬＩｍ−１発現は間脳細胞と終脳細胞を区別する： 間脳に見いだされるアイレッ ト−１⁺ニューロンを終脳にあるものから区別するためのマーカーを同定するた め に、本出願人はホメオドメイン含有蛋白Ｌｉｍ−１の発現を調べた（Tairaら、1 992）。マウス胚の前脳において、Ｌｉｍ−１ｍＲＮＡはほとんど間脳に限定さ れている（Barnesら、1994；Fujiiら、1994）。ＨＨステージ14〜18で調べたニ ワトリ胚では、Ｌｉｍ−１に対する抗体（Tsuchisaら、1994）は、マウスのＬｉ ｍ−１ｍＲＮＡについて説明したものと同様のパターンで間脳中に細胞を検出し た（図９Ａiiを参照）。これらの段階で終脳にはＬｉｍ−１⁺細胞は検出されな かった（図９Ａ、およびデータは示していない）。次に本出願人は、ＨＨステー ジ14〜18の間脳におけるＬｉｍ−１⁺細胞とアイレット−１⁺ニューロンの関係を 調べた。間脳中央（間脳の他の場所ではない）において、Ｌｉｍ−１は神経上皮 細胞により発現された（図９Ａii、Ｆ）。この軸レベルで、Ｌｉｍ−１⁺ニュー ロンも存在し、さらにアイレット−１⁺ニューロンの大部分はＬｉｍ−１を発現 した（図９Ｅ、Ｆ）。頭側の間脳では、Ｌｉｍ−１は、アイレット−１を発現し た腹側中線ニューロンと同じ集団中で発現された（図９Ｇ−１）。間脳の介在部 域で、Ｌｉｍ−１⁺ニューロンはまた、アイレット−１⁺ニューロンとは異なるが 混ざり合う集団中に存在した（図９Ａii）。終脳では、アイレット−１⁺ニュー ロンはＬｉｍ−１を発現しなかった（図９Ｊ）。すなわち、Ｌｉｍ−１発現は間 脳細胞を終脳細胞から区別する。さらに、Ｌｉｍ−１はすべての間脳アイレット −１⁺ニューロンのマーカーではないが、そのアイレット−１との同時発現は、 アイレット−１⁺前脳ニューロンの起源が間脳であることを示す。ｖｈｈ−１／ｓｈｈは神経板の将来の前脳部域でアイレット−１⁺ニューロンを 誘導する 神経管の規定された頭尾ドメインを生じる神経板の部域から外植片を単離する ために、本出願人は、ＨＨステージ６のニワトリ胚の神経板の大まかな原基分布 図を作成した（実験方法を参照）。次にこの地図をガイドとして、軸策の以下の ３つの異なるレベルで神経板の側面部域から、外植片を単離した：ｉ）終脳を生 じる予定のレベル（図10Ａの［Ｔ］）；ii）間脳を生じる予定のレベル（図10Ａ の［Ｄ］）；iii）菱脳を生じる予定のレベル（図10Ａの［Ｒ］）。次に本出願 人は、前述のマーカーを用いて、ｖｈｈ−１／ｓｈｈは、神経板の将来の前脳レ ベルから得られる外植片中の腹側ニューロンの分化をより尾側のレベルからと同 様 に誘導するか否かを調べた。 本出願人は、まずｖｈｈ−１／ｓｈｈの非存在下で増殖させた終脳、間脳およ び菱脳レベルから得られる神経板外植片中の細胞によるアイレット−１の発現を 調べた。神経板外植片は、アンチセンスｖｈｈ−１ｃＤＮＡでトランスフェクシ ョンしたＣＯＳ細胞の存在下でインビトロで60〜66時間増殖させた。これらの条 件下で、すべての３つの軸レベルから得られた外植片中の細胞は、神経マーカー β−チューブリンを発現したが、アイレット−１⁺細胞は検出されなかった（図1 0、Ｂ、Ｃ、Ｆ、Ｇ、Ｊ、Ｋ）。これに対して、センスｖｈｈ−１／ｓｈｈｃＤ ＮＡでトランスフェクションしたＣＯＳ細胞上で増殖させた時、無数のアイレッ ト−１⁺細胞が、神経板の３つの軸レベルのそれぞれから得られた外植片中で誘 導された（図10Ｄ，Ｅ、Ｈ，Ｉ、Ｌ、Ｍ、表２）。３つの軸レベルから得られた 誘導された外植片中のアイレット−１⁺ニューロンの比率は、著しく異なってい た。終脳レベルの外植片では、ｖｈｈ−１／ｓｈｈに曝された細胞の96％はアイ レット−１を発現した（表２）が、間脳レベル外植片のわずかに35％と菱脳レベ ル外植片のわずかに39％がアイレット−１を発現した（表２）。 ＨＨステージ６のニワトリ胚の終脳、間脳および菱脳レベルから単離した神経板 外植片を、センスまたはアンチセンス配向のｖｈｈ−１発現作成体でトランスフ ェクションしたＣＯＳ細胞と接触させて60〜66時間培養し、アイレット−１を発 現するホールマウント（Whole-mount）免疫組織化学により測定した。外植片を 切断し、各断片の標識細胞の数を数えて、ｖｈｈ−１／ｓｈｈ誘導外植片中のア イレット−１⁺細胞とＬｉｍ−１⁺細胞の比率を測定した。外植片中の細胞の総数 は、ＤＡＰＩ核染色を用いて測定した。解析した外植片の数は、角括弧内に示す 。ｖｈｈ−１／ｓｈｈに誘導されるアイレット−１⁺ニューロンは明確な軸性を有 する 異なる軸レベルから得られる神経板外植片中の細胞の頭尾軸性を評価するため に、特に誘導されたアイレット−１⁺ニューロンの本体を規定するために、本出 願人は、ＳＣ１、ｋｘ２．１およびＬｉｍ−１の発現を調べた。ＳＣ１発現 ：神経板外植片は、アンチセンスｖｈｈ−１／ｓｈｈ ｃＤＮＡでト ランスフェクションしたＣＯＳ細胞上で増殖させた時、ＳＣ１を発現しなかった （表３）。ｖｈｈ−１／ｓｈｈに曝された菱脳レベル外植片では、アイレット− １⁺ニューロンはＳＣ１を発現し（図11、Ａ、Ｂ）、これらの細胞が運動ニュー ロンであることを示していた。しかし、アイレット−１⁺ニューロンは、菱脳外 植片中でｖｈｈ−１／ｓｈｈにより誘導されるＳＣ１⁺細胞のわずかに約50％を 占めるのみであった。残りのアイレット−１^-／ＳＣ１⁺細胞（図11Ｃ、Ｄ）は、 ＦＰ１マーカーを発現し（データは示していない）、これらが底板細胞であるこ とを示していた（Yamadaら、1991）。間脳および終脳レベル外植片では、ｖｈｈ −１／ｓｈｈに曝すことにより誘導されるアイレット−１⁺ニューロンは、ＳＣ １を同時発現せず（図11、Ｅ、Ｆ、Ｊ、Ｉ）、これらが運動ニューロンでないこ との証拠を提供した。ＦＰＩの発現により規定される底板細胞は、ｖｈｈ−１／ ｓｈｈに曝された間脳または終脳レベル外植片中に検出されなかた（データは示 していない）。 センスまたはアンチセンス配向のｖｈｈ−１発現作成体でトランスフェクション したＣＯＳ細胞と接触させて60〜66時間増殖させた神経板外植片の解析。（-） は0.5％未満、（+）は５〜35％、（++）は35〜80％、（+++）は＞90％の細胞が 、マーカーを発現したことを示し、n.d.は測定しなかったことを示す。各ケース で結果は、30以上の外植片から得られた。Ｎｋｘ２．１発現 ：神経板外植片は、アンチセンスｖｈｈ−１／ｓｈｈｃＤＮＡ でトランスフェクションしたＣＯＳ細胞上で増殖させた時、Ｎｋｘ２．１を発現 しなかった（表３）。さらに、Ｎｋｘ２．１⁺細胞は、ｖｈｈ−１／ｓｈｈに曝 された菱脳レベルの外植片では検出されなかった（図12Ａ）が、誘導された間脳 および終脳レベルの外植片は、Ｎｋｘ２．１⁺細胞を含有し（図12Ｂ、Ｃ）、60 〜66時間後インビトロで５〜10％の細胞はアイレット−１を同時発現した（デー タは示していない）。Ｌｉｍ−１発現 ：Ｌｉｍ−１⁺細胞は菱脳（表３）および間脳（図12Ｄ）で検出 されたが、アンチセンスｖｈｈ−１ｃＤＮＡでトランスフェクションしたＣＯＳ 細胞で増殖させた終脳（図12Ｇ）レベルの外植片では発現されなかった。ｖｈｈ −１／ｓｈｈに曝された間脳レベルの外植片では、アイレット−１⁺ニューロン の22％がＬｉｍ−１を発現し（図12、Ｅ、Ｆ、表２）、従って表現型では間脳に 特徴的なニューロンに対応する（図９Ａii）。これに対して、菱脳と終脳レベル の両方で、ｖｈｈ−１／ｓｈｈにより誘導されたアイレット−１⁺ニューロンは Ｌｉｍ−１を発現しなかった（図12、Ｈ、Ｉ、表２）。 これをまとめると、これらのインビトロの実験は、ｖｈｈ−１／ｓｈｈは神経 板の将来の前脳部域で腹側ニューロン細胞を誘導し、これらのニューロンは、間 脳と終脳の両方で腹側に産生される明確なクラスの腹側ニューロンに適したマー カー組合せを発現することを、示している。底板と中線頭側の間脳細胞はｖｈｈ−１／ｓｈｈの誘導作用を模倣する 上記の結果は、ＣＯＳ細胞中で発現されるｖｈｈ−１／ｓｈｈの誘導活性は、 インビボで腹側ニューロンの誘導に関与するとされている神経細胞群の活性とは 異なる可能性を残している。従って本出願人は、ｖｈｈ−１／ｓｈｈに対する神 経板外植片の応答が、関連する可能性のあるｖｈｈ−１／ｓｈｈのニューロン源 により模倣されるか否かを測定した。本出願人は、脊髄、菱脳および中脳レベル で腹側細胞の誘導に関与するとされているｖｈｈ−１／ｓｈｈの供給源としてニ ワトリ底板の活性を測定した（図８）。底板組織は、菱脳レベル神経板外植片で アイレット−１⁺ニューロンを誘導し（図13Ａ）、これらのニューロンはＳＣ１ を同時発現した（データは示していない）。Ｎｋｘ２．１⁺細胞は、菱脳レベル 外植 片で底板組織により誘導されなかった（図13Ｂ）。すなわち、底板の誘導活性は 、ＣＯＳ細胞で発現されるｖｈｈ−１／ｓｈｈの活性と同様であった。 本出願人はまた、間脳（Hattaら、1994）および終脳（実験的考察を参照）の パターン化に関与するかも知れないｖｈｈ−１／ｓｈｈのニューロン起源として ｖｈｈ−１／ｓｈｈ（図８）を発現する、頭側間脳の腹側中線の細胞の活性を測 定した。頭側間脳自身の中線はアイレット−１⁺ニューロンを発現するため、中 線間脳誘導組織がＥ11マウス胚から得られ、中間フォラメント蛋白であるネスチ ン（nestin）（Dahlstrandら、1992）を用いて、マウス誘導組織を規定した。中 線頭側間脳組織は、終脳レベルの外植片でアイレット−１⁺／ＳＣ１^-ニューロン とＮｋｘ２．１⁺細胞を誘導した（図13Ｃ、およびデータは示していない）。こ れに対して、ｖｈｈ−１／ｓｈｈを発現しない部域（図８、９Ａｉ、Echelardら 、1993）である漏斗状器官のレベルで単離された腹側中線間脳組織は、これらの 外植片でアイレット−１⁺細胞を誘導しなかった（データは示していない）。 最後に本出願人は、ｖｈｈ−１／ｓｈｈのニューロン組織供給源の誘導活性は 、その頭尾軸の位置によって異なるか否かを試験した。底板組織、ｖｈｈ−１／ ｓｈｈの尾側供給源および終脳レベル神経板外植片の間で結合体を作成した。底 板組織は、終脳レベルの神経板外植片でアイレット−１⁺／ＳＣ１⁺細胞（図13Ｄ 、Ｅ）およびＮｋｘ２．１⁺細胞（図13Ｆ）を誘導するのに有効であった。さら にアイレット−１⁺ニューロンはＬｉｍ−１を発現せず（データは示していない ）、これが特徴的な終脳性表現型を有することを示している。すなわち、ｖｈｈ −１／ｓｈｈのニューロン供給源により誘導される腹側ニューロンの特異的性質 は、神経板細胞の応答性で頭側制限に依存するようであり、誘導組織の起源の軸 レベルには依存しないようである。実験的考察 キイロショウジョウバエｈｅｄｇｅｈｏｇ遺伝子の脊椎動物同族体であるｖｈ ｈ−１／ｓｈｈは、脊索と底板により発現され、運動ニューロン分化を誘導する これら２つの中線細胞群の能力を模倣する（Roelinkら、1994）。従ってｖｈｈ −１／ｓｈｈは、軸策の尾側レベルで腹側ニューロンの誘導に関与するとされて いる。本試験および以前の解析は、ｖｈｈ−１／ｓｈｈが、底板に頭側の間脳の 部 域でおよび腹側終脳で細胞により発現されることを示し（Echelardら、1993；Kr aussら、1993；Changら、1994；Roelinkら、1994）、ｖｈｈ−１／ｓｈｈも前脳 中の腹側ニューロンの誘導に参加しているか否かという問題を提起している。 本出願人は、ｖｈｈ−１／ｓｈｈは、通常は前脳のこれら２つの亜分画を生じ る神経板の部域の間脳と終脳に特徴的な、腹側ニューロン細胞の分化を誘導する ことを見いだした。神経管の尾側レベルの運動ニューロン分化の初期マーカーで ある、ＬＩＭホメオドメイン蛋白アイレット−１はまた、これらの腹側間脳およ び終脳ニューロンの分化の初期に、ｖｈｈ−１／ｓｈｈにより誘導される。しか しアイレット−１⁺ニューロンは、神経板内の細胞の起源の軸レベルにより制限 されるような、明確な部域性を有する。従って、単一の誘導分子であるｖｈｈ− １／ｓｈｈは、神経管の頭尾軸の全長に沿って、腹側ニューロン細胞の分化と多 様化に参加して、あらかじめ決定された頭尾軸の神経板細胞に作用しているかも 知れない。 本試験の１つの限界は、ｖｈｈ−１／ｓｈｈにより誘導される胚前脳の最終的 な本体と機能は不明であることである。成人の前脳では、アイレット−１は、不 明確帯（zone incerta）内の視交差上核と視床下部の弓状核、小葉視床網状核、 および基底終脳ニューロンにより発現される（Thorら、1991）。従って、これら の腹側前脳の核中のニューロンは、神経板の将来の前脳レベルでｖｈｈ−１／ｓ ｈｈにより誘導されるアイレット−１⁺ニューロンの成熟した誘導体である可能 性がある。腹側ニューロンの直接のインデューサーとしてのｖｈｈ−１／ｓｈｈ 脊髄および菱脳レベルから得られた神経板外植片において、ｖｈｈ−１／ｓｈ ｈは運動ニューロンを誘導する（図10、11；Roelinkら、1994）。底板細胞もま たこれらの条件下で誘導されるため、この観察結果は、運動ニューロン分化は直 接ｖｈｈ−１／ｓｈｈ活性の結果か、または別の底板由来の誘導性物質の作用の 結果であるかという問題を解決してはいない。間脳レベルの外植片では、約35％ のみの細胞が、アイレット−１⁺ニューロンに分化するように誘導され、特殊化 した中線シグナル性を有する間脳細胞もこれらの外植片中で誘導される可能性が ある。すなわち、間脳レベルおよびより尾側のレベルで、ｖｈｈ−１／ｓｈｈは 、腹側 ニューロンの産生を引き起こす明確な中線由来因子の産生を誘導するかも知れな い。これに対して、終脳レベルの神経板外植片では、ｖｈｈ−１／ｓｈｈは事実 上すべての細胞を、終脳性を有するアイレット−１⁺ニューロンに分化させた。 この結果は、特殊化した中線細胞の誘導とは独立の、神経板細胞に及ぼす作用に より、ｖｈｈ−１／ｓｈｈが腹側ニューロンを誘導することができることの大き な証拠である。神経板細胞の頭尾性における初期制限 神経板と神経管内の頭から尾への頭尾性および背腹性は、独立のパターン化系 により制御されることの証拠を与えた（Doniachら、1992；Ruiz i Altaba、1992 ；JessellとDodd、1992；Smith、1993）。神経細胞の初期頭尾性は、神経管の背 腹軸に沿った細胞本体の規定の前に確立されるようである（Roach、1945；Jacob son、1964；Simonら、1995）。本出願人のインビトロの結果はこの考えを支持し 、さらに神経板ステージで規定された神経細胞の頭尾性は、インビトロでｖｈｈ −１／ｓｈｈにより仲介される腹側化シグナルの非存在下および存在下の両方で 維持されることを示す。すなわち、神経板内の頭尾軸の異なる位置にある細胞の 可能性の初期のおよび安定な限定は、細胞をｖｈｈ−１／ｓｈｈに曝した時産生 される腹側ニューロン細胞の範囲を規定するようである。 神経板細胞の初期頭尾性を確立するシグナルは同定されていない。しかし、い くつかの脊椎動物種での研究は、これらのシグナルの作用は神経管を、頭尾軸に 沿って、不連続なドメインまたはセグメントにさらに分割するという証拠を与え た（Vaage、1969；FigdorとStern、1993；LumsdenとKeynes 1989）。これらの セグメントドメインの多くまたはすべては、転写因子の発現の境界に一致する（ Rubensteinら、1994；Macdonaldら、1994；Papalopulu、1994）。従って、神経 板細胞の将来の運命の本質的制限は、神経管のセグメント亜分画を後に明らかに する転写因子の初期および部域的発現により確立される。腹側ニューロン作成のためのホメオボックス遺伝子発現と共通のプログラム 神経管の頭尾軸に沿って多くの異なる位置で生成される腹側ニューロン細胞に おけるアイレット−１の検出は、この遺伝子の発現が特定のクラスの腹側ニュー ロンの生成より腹側性のニューロンの分化に、より密接に関連していることを示 唆している。しかし菱脳および中脳レベルで、セロトニン作用性およびドパミン 作用性ニューロンの分化は、脊索と底板により誘導されるが、これらのニューロ ンはアイレット−１を発現しない（Yamadaら、1991；Hynesら、1995および本出 願人の未公表データ）。従ってアイレット−１発現が腹側ニューロン分化の顕著 なマーカーであるが、その発現は必ずしも、脊索−および底板−由来シグナルに 依存する腹側ニューロン細胞の生成には関連していない。 しかし、多くの別個のクラスの腹側ニューロンによりアイレット−１が発現さ れることは、ｖｈｈ−１／ｓｈｈに対する神経板細胞の応答の成分は、頭尾軸に 沿って保存されているかも知れないことを示唆する。これを支持するように、ホ メオボックス遺伝子のＮｋｘ２ファミリーのメンバー（特にＮｋｘ２．１とＮｋ ｘ２．２）は、ｖｈｈ−１／ｓｈｈと密接に重複するドメインで、すべての頭尾 軸のレベルで腹側ニューロンで発現される（Priceら、1992；Lazzaroら、1991； Rubensteinら、1994）。さらに、前脳レベルでＮｋｘ２．１の発現は、ｖｈｈ− １／ｓｈｈにより誘導される。すなわち、Ｎｋｘ２．１とアイレット−１ホメオ ドメイン蛋白は、その頭尾軸の位置には独立に、神経板細胞中で活性化される共 通のｖｈｈ−１／ｓｈｈ応答プログラムの成分であるかも知れない。インビボで腹側ニューロンを誘導するシグナルの供給源 頭側間脳の底板と腹側中線の細胞は、インビボで腹側ニューロンの誘導に関与 しているシグナルの神経供給源の可能性がある。しかし、脊索と前脊索板はｖｈ ｈ−１／ｓｈｈを発現し（Riddle、1993；Echelardら、1993；Kraussら、1993； Roelinkら、1994）、従って腹側ニューロン細胞の誘導に参加しているかも知れ ない。確かに、脊髄レベルの運動ニューロンの分化のインビトロ試験は、最初期 に発生の運動ニューロンの誘導を起こすシグナルは脊索に由来し、底板はより大 きなステージでのみ運動ニューロンの分化に顕著な役割を果たすという証拠を与 えた（Yamadaら、1993）。 しかし、終脳の底で生じる神経板の部域は、決して前脊索板中胚様に接触しな いため、終脳レベルで腹側ニューロンの誘導は、軸中胚様からのシグナルに依存 する可能性は低い（CoulyとLa Doualn、1987；Placzek，M.、未公表データ）。 さらに腹側前脳のアイレット−１⁺ニューロンは、ＨＨステージ14まで規定され ない （Muhr、未公表データ）。終脳アイレット−１⁺ニューロンまたはその前駆体が 、頭側間脳から終脳に移動することは可能である。あるいは、神経組織は、腹側 ニューロン終脳のアイレット−１⁺ニューロンの誘導に関与するｖｈｈ−１／ｓ ｈｈの供給源であるかも知れない。しかし、ｖｈｈ−１／ｓｈｈはＨＨステージ 17〜18（終脳アイレット−１⁺ニューロンの発出現に一致する）まで終脳の底の 細胞により発現されないため、この神経供給源は、終脳自身に由来する可能性は 小さい。 頭側間脳の腹側中線の細胞は、ＨＨステージ９でｖｈｈ−１／ｓｈｈを発現す るため、これらは腹側終脳のアイレット−１⁺ニューロンを誘導するシグナルの 供給源であるかも知れない。これに一致して、インビトロ試験は、ｖｈｈ−１／ ｓｈｈを発現する中線頭側間脳細胞は、神経板の終脳部域でアイレット−１ニュ ーロンを誘導することができることを示している。頭側間脳細胞は、ｖｈｈ−１ ／ｓｈｈと協働する他の因子を分泌して、終脳の底で生成される腹側細胞の数と 多様性を規定することは可能である。これは、ｖｈｈ−１／ｓｈｈは、アイレッ ト−１⁺ニューロンに分化するように終脳神経板外植片のほとんどすべての細胞 を誘導するインビトロの結果、および終脳の腹側中線でアイレット−１⁺ニュー ロンのまばらな分散を示すインビボの結果との差異の理由かも知れない。あるい は、ＣＯＳ細胞でのｖｈｈ−１／ｓｈｈの発現は、インビボやインビトロで頭側 間脳細胞により提供されるよりも高いレベルのインデューサーに、終脳神経板外 植片を曝す可能性がある。内因性間脳インデューサーとは独立に、これらの観察 結果は、腹側終脳のニューロンの分化は、通常頭側間脳の中線細胞により平面的 に提供されるシグナルに依存することを示唆している。 これらをまとめると、これらの試験は、胚中枢神経系の頭尾軸全長に沿った腹 側ニューロンタイプの誘導にｖｈｈ−１／ｓｈｈが関与していることを示す。異 なる軸レベルで腹側に位置した前駆体から得られる神経変性疾患で欠失している 、いくつかの顕著なクラスのニューロンには、脊髄レベルの運動ニューロン、中 脳レベルのドパミン作用性ニューロン、そして終脳レベルの線状および基底前脳 ニューロンがある。ｖｈｈ−１／ｓｈｈは胚発生の間の前駆体細胞の腹側ニュー ロンの運命を指令するらしいため、この蛋白は成人に存在するニューロン前駆体 に対して同様の活性を及ぼしているかも知れず（ReynoldsとWeiss、1992）、従 って 神経変性疾患で欠失している腹側ニューロンのクラスで中枢神経系を再度占めて いるかも知れない。実験方法 動物 白色レグホーンニワトリの受精卵を、アグリセラ（Agrisera）ＡＢ（スエーデ ン）から入手した。ニワトリ胚は、Hamburger-Hamilton（1951）に従って段階分 けした。定期交配したマウス胚（Ｃ５７／ｂ１）は、ウメア（Umea）大学の動物 施設から得た。神経板原基分布図 先端の径の細いガラスのマイクロピペットに、Ｄｉ−Ｉ（１，１’−ジオクタ デシル−３，３，３’，３’−テトラメチルインド−カルボシアニンパークロレ ート）（モレキュラー・プローブズ（Molecular Probes）；ＤＭＳＯ中2.5mg/ml ）を充填した。１〜５nlのＤｉ−Ｉを、自動微量注入装置を用いて、Hamburger- Hamiltonステージ６のニワトリ胚の神経板の規定された部域に注入した。Hambur ger-Hamiltonステージ10/11またはステージ15まで、胚を成長させた。Ｄｉ−Ｉ 標識細胞の位置を、位相差および蛍光法を用いてマッピングし、CoulyとLe Doua rin（1987）の原基分布図と比較するか、または形態的目標を用いて評価した。in Situハイブリダイゼーションと免疫組織化学 基本的に記載された方法（Schaeren-WiemersとGerfin-Moser、1993）で、1.7k bのジゴキシゲン−標識ニワトリｖｈｈ−１／ｓｈｈリボプローブ（riboprobe） （T．Lints とJ．Dodd、未公表データ）を用いて、凍結切片のｍＲＮＡ発現のin Situハイブリダイゼーション解析を行なった。in Situハイブリダイゼーション 用に処理した切片を、0.1％トリトンＸ-100（ＴＢＳＴ）を含有するトリス緩衝 化生理食塩水で４×10分間洗浄し、10％正常ヤギ血清を含有するＴＢＳＴでブロ ックし、一次ウサギ抗アイレット−１抗体（１：250）で22℃で一晩インキュベ ートした。記載された（Thorら、1991）方法で、インキュベート時間を２倍にし て、スライドをグリセロールベースのマウンティング培地を用いて、アビジン／ ビオチン複合体を用いて、アイレット−１を検出した。記載された（Francisら 、1994）ように、ホールマウント（Whole-mount）in Situハイブリダイゼーショ ンを行 なった。 ウザギおよび抗アイレット−１抗体（Thorら、1991；Ericsonら、1992）また はＭＡｂ ４Ｄ５（Roelinkら、1994）を用いてアイレット−１を検出した。Ｌｉ ｍ−１（Tairaら、1992）は、Ｌｉｍ−２（Tsuchidaら、1994）も検出するＭＡ ｂ ４Ｆ２で検出した。in Situハイブリダイゼーション試験は、胚前脳における Ｌｉｍ−１とＬｉｍ−２の発現パターンが同様であることを示している（データ は示していない）。従って、本出願人は、Ｌｉｍ−１および／またはＬｉｍ−２ が、ＭＡｂ ４Ｆ２で標識した各細胞により発現されるか否かを決定できない。 これは、異なる前脳レベルでアイレット−１⁺ニューロンを区別する抗体の使用 に影響しない。ＳＣ１糖蛋白はＭＡｂ ＳＣ１（TanakとObata、1984）で検出さ れ、ホメオドメイン蛋白Ｎｋｘ２．１はウサギおよび抗Ｎｋｘ２．１抗体（Lazz aroら、1991）で、底板マーカーＦＰ１はＭＡｂ ＦＰ１（Yamadaら、1993）で、 抗ネスチンは抗血清１２９／１３０（Dahlstrand、1992）で、抗アセチル化β− チューブリンはモノクローナル抗体Ｔ６７９３（シグマ（Sigma）免疫化学品） そしてニューロン細胞質は抗ｃｙｎ−１抗体（S.B．Mortonとt．Jessell、未公 表データ）で検出した。外稙片中のアイレット−１とＬｉｍ−１細胞の数は、外 植片を切断し、各５個目の画分の標識細胞を数えて求めた。これらの切片の細胞 の総数は、核標識ＤＡＰＩ（ベーリンガー・マンハイム（Boehringer Mannheim ））により測定した。使用した他のマーカーは、記載された（Yamadaら、1993） ホールマウント（Whole-mount）免疫組織化学により解析した。神経板外植片の単離と培養 卵は、湿潤孵卵器中で38℃でインキュベートした。Hamburger-Hamiltonステー ジ６の胚は、ディスペース（dispase）溶液（Boehringer Mannheim、Ｌ15中２/m l）で22℃で４分間インキュベートし、５％熱不活性化胎児牛血清含有Ｌ15に４ ℃で移した。胚をＬ−15で３回洗浄し、神経組織を付着性の中胚様と内胚様から 分離した。終脳、間脳および菱脳と推定される部域に対応する神経板外植片を、 タングステン針を用いて分離した。Hamburger-Hamiltonステージ25のニワトリ胚 からの底板を、すでに記載された（Yamadaら、1993）ように単離した。ｖｈｈ− １／ｓｈｈを発現する中線頭側の間脳組織（Echelardら、1993）を、Ｅ11マウス 胚から分離した。神経板外植片を、Ｎ２−補足物、ヒトフィブロネクチン（５μ g/ml、およびペニシリン／ストレプトマイシン（培地と添加物はギブコービーア ールエル（GIBCO-BRL）社から得た）と補足したＯＰＴＩＭＥＭ−１ 600μl中の ３次元コラーゲンゲル中のＣＯＳ細胞凝集物、底板断片、または間脳組織と接触 させて、60〜66時間培養した。ＣＯＳ細胞中のラットｖｈｈ−１の発現 ＣＯＳ細胞を90％のコンフルエンスになるまで増殖させ、ダルベッコー改変イ ーグル培地（ＤＭＥＭ）中12μg/mlのリポフェクタミン試薬（ギブコービーアー ルエル（GIBCO-BRL）を有する35mmのシャーレ当たり１μgのＤＮＡでトランスフ ェクションした。５時間インキュベート後、培地を10％ＦＣＳ含有ＤＭＥＭと交 換し、細胞をさらに18時間インキュベートした。次にＣＯＳ細胞を、２mMＥＤＴ Ａ含有ＰＢＳを用いて解離させ、ペレット化し、10％ＦＣＳと抗生物質を含有す るＤＭＥＭに再懸濁した。すでに記載された（Roelinkら、1994）組織培養プレ ートのフタの上に約1000個の細胞を含有する20μlの１滴をしたたらせるように して細胞凝集物を作成した。24時間後、凝集物をＯＰＴＩＭＥＭ−１で洗浄し、 ニワトリ神経板外植片と接触させた。 第３実験シリーズ 脊椎が発生する間、神経管の腹側よりの半分における細胞の種類の生成は、脊 索の軸性中胚葉細胞（1-6）が供給する信号に依存する。脊索は、神経管の腹側 正中の底板細胞を誘導する接触依存性信号、及び底板分化とは独立した運動神経 の誘導の源であることがわかる（2、7、8、9）。底板細胞は、これらの誘導性活 性の両方を結果的に取得する（5、7、9）。ショウジョウバエの遺伝子ヘッジホ ッグ（hedgehog）がコードする分泌性糖タンパク質の脊椎動物の相同体である、 ソニックヘッジホッグ（Sonic hedgehog）の(shh)/vhh-1は、脊索及び底板によ って、これら正中細胞群が誘導活性を呈する時に、発現される（12-16）。Shh/v hh-1はin vivoでの神経管（13-15）、及びin vitroでの神経板移植片（15）にお いての、異所性の底板分化を誘導することができ、これは通常、底板分化におい てShh/vhh-1が関わることを示唆している。しかしながら運動神経を誘導する、 脊索及び底板由来の拡散性因子は、不明のままである。運動神経は、shh/vhh-1 を発現する細胞と接触させて増殖させた神経板移植片において誘導される（15） が、これはこの移植片において誘導される底板細胞によって分泌される、別個の 因子の活性を反映している。出願人らは本願で、i)shh／vhh-1で形質転換したCO S細胞は、底板が分化すること無しで神経板移植片の運動神経を誘導するのに十 分な拡散性活性を獲得することと、ii)shh／vhh-1自身は、神経板移植片の細胞 に作用して、独立に運動神経及び底板の細胞を誘導することができることとを示 している。これらの結果は、脊索の供給するshh／vhh-1が通常、脊椎動物の胎児 の神経管において、底板細胞同様、運動神経の分化を開始することを示唆してい る。 底板及び運動神経の分化は、免疫細胞化学的方法及び逆転写-PCR（RT-PCR）法 により、ハンバーガーハミルトン（HH）期10のニワトリ胎児の中間領域由来の移 植片において調査した（8）。底板分化は主に、翼状ら旋（winged helix）転写 因子であるHNF3βの発現で調査した（表４）。HNF3βはin vivoでの底板分化の 初期のマーカであり、またタンパク質合成が起きない時にも起きることから、in vitroでの神経板細胞でのその転写は、脊索由来の信号への直接応答である（17 ）。更に、神経管におけるHNF3βの誤発現は異所性底板細胞を引き起こす起こす のに十分であり、それによってこれは、神経管の背側領域の近傍の腹側ニューロ ンを誘導することが可能である（19）。故にHNF3βの発現は、底板分化に関する 、初期の、信頼のある 指標を提供する。底板分化の独立マーカとして、出願人らは化学遊走物質である Netrin-1のmRNA発現をモニターしている（表４）。運動神経の分化は、LIMホメ オドメインである、Isl-1及びIsl-2の発現（21）、SC1のIsl-1及びIsl-2との共 発現、ならびにIsl-1、Isl-2、及びコリンアセチルトランスフェラーゼ（ChAT） のmRNAの発現によりモニターしている（表４）。 in vitroで単独で36時間増殖させた神経板移植片（8）は、底板及び運動神経 のマーカを発現しなかった（図14Ａ、Ｅ、Ｆ、及び表5Ａ）。対照的に脊索と36 時間接触させて増殖させた神経板移植片は、HNF3βのmRNA及びタンパク質、なら びにNetrin-1のmRNAを発現し（図14Ｂ、Ｄ、Ｅ）、これより底板細胞の分化を示 している。同じ移植片は、SC1との組み合わせで、Isl-1及び／またはIsl-を発現 する細胞（Isl+細胞）（図14Ｂ、Ｃ、Ｄ、Ｆ）、ならびにIsl-LIsl-2、及びChAT のmRNAを発現する細胞（図14Ｅ）を含んでいたが、これは運動神経の分化を示し ている。運動神経及び底板を誘導する脊索の活性を実験的に分離するために、出 願人らは脊索と神経板移植片との間の接触を、膜フィルタをそれらの間に置くこ とで防いだ。Isl+のニューロンの数で調べるとあまり効率はよくないものの（表 5Ａ）、接触しないときには脊索は運動神経の分化を誘導した（図14Ｇ、Ｈ）。 神経板移植片は脊索（Ａ）またはvhh-1で形質転換したCOS細胞（Ｂ）と、接触 させて（+で示してある）またはコラーゲンゲルの膜フィルタで分離して（／／ で示してある）36時間増殖させた。値は平均±標準偏差である。 一方、24時間（データは非掲載）または36時間（図14Ｇ、表5Ａ）で、HNF3β 発現がないことより、脊索はフィルタ越しの底板分化を誘導しなかった。これら の結果は、脊索由来の拡散性因子が底板分化の非存在下で、同じ神経板移植片に おいて、運動神経を誘導しないということを示す、以前からの観察を伸長する。 shh／vhh-1が、脊索の接触依存性及び拡散性の活性を模倣するかどうかを確か めるために、出願人らは、ラットのshh相同体であるvhh-1をコードしている、セ ンス またはアンチセンスのcDNA構築物で形質転換されたCOS細胞と接触させて、また は分離して、神経板移植片を36時間増殖させた（15）。センスvhh-1で形質転換 されたCOS細胞と接触させて増殖させた神経板移植片は、HNF3β（図15Ａ、Ｇレ ーン1、表4）及びNetrin-1（図15Ｇレーン1）の発現で調べると底板細胞を含ん でいて、またIsl⁺／SC1⁺ニューロン（図15Ａ、Ｂ、Ｃ）、ならびにIsl-1及びChA T（図15Ｈレーン1）で調べると運動神経を含んでいた。センスvhh-1で形質転換 されたCOS細胞と接触させずに増殖させた神経板移植片は、HNF3β（図15Ｄ、Ｇ レーン3）も、Netrln-1(図15Ｇレーン3)も発現しなかった。対照的に、運動神経 の分化は、Isl＋/SC1+ニューロンの発現（図15Ｄ、Ｅ、Ｆ、表5B）ならびにIsl- 1及びChATの発現（図15Ｈレーン1）で調べると、接触しないときでも誘導された 。センスvhh-1で形質転換されたCOS細胞と接触させずに増殖させた神経板移植片 は、HNF3β（図15Ｄ、Ｇレーン3）もNetrin-1（図15Ｇレーン3）も発現しなかっ た。vhh-1を形質転換したCOS細胞の培養上清は、神経板移植片における底板及び 運動神経の分化を誘導しなかった（15）。この実験では、vhh-1で形質転換したC OS細胞から離れて増殖させた神経板移植片における運動神経の分化は、shh／vhh -1のより高濃度、又は定常的な供給により生じる可能性がある。アンチセンスの vhh-1で形質転換されたCOS細胞はいかなる条件下でも、運動神経の分化を誘導し なかった（図15Ｇ、Ｈレーン2及び4、ならびに非掲載データ）。よってvhh-1の 発現は、接触依存性底板誘導活性、及び底板分化を引き起こさない拡散性の運動 神経誘導活性を、COS細胞にあたえる。これらの結果の一番もっともらしい説明 は、shh／vhh-1自身がこの両方の活性を介在するということである。拡散型のsh h／vhh-1は体節板中胚葉におけるPax-1発現の導入に関わることが示唆されてい る（22）。 shh／vhh-1自身が運動神経の分化を誘導することができるかどうかを確かめる ために、出願人らはvhh-1発現用構築物を直接神経板移植片内の細胞に形質転換 した。vhh-1の形質転換後48時間でアッセイした神経板移植片は、HNF3β、Netri n-1、Isl-1、及びIsl-2を発現した（図16Ａ）。故にshh／vhh-1は、神経板移植 片における底板及び運動神経の分化を誘導するのに十分である。vhh-1で形質転 換した神経板移植片における運動神経の誘導が、底板分化とは独立して起きるか どうかを調べるために、出願人らはHNF3β及びIsl-1の発現の経時変化を分析し た。vhh-1で形質転換された神経板移植片でのIsl-1の発現は、約22時間後に初め て検出され、特定の実 験に依存して、HNF3βに先行して（図16Ｂii）、または同時に（図16Ｂi）、起 きた。故に、vhh-1で形質転換された神経板移植片における運動神経の分化は、 底板分化に先だって、または同調して起きる。それゆえに、shh／vhh-1は神経板 細胞に作用して運動神経の分化を、底板細胞の先行した分化を要求しないような 方法で、誘導することがわかる（15）。ニワトリの胎児を使った以前の研究で、 神経板の外側領域の細胞が、脊索からの運動神経誘導性信号に、底板細胞の分化 に先だって露出されることが示されている（８）。vhh-1で形質転換された神経 板移植片における運動神経マーカの初期の発現は、この信号がshh／vhh-1である ことの証拠を提供する。 以上をまとめると、出願人らの結果は、脊索の接触依存性の底板細胞分化誘導 、及び拡散性因子を経由する運動神経分化誘導の能力は、shh／vhh-1の独立した 活性に起因することを示唆している。出願人らは、Hedgehogの広範囲パターン活 性の仲介因子としてのdpp及びwgが、ショウジョウバエの成虫原基上皮に関わる というモデル（23-25）と同様の方法で、shh／vhh-1による運動神経の誘導が、 別個の分泌性因子である神経板細胞による合成に関わっているということを排除 していない。しかしながら神経管においては、dpp（BMPタンパク質）、及びwg（ wntタンパク質）の脊椎動物の相同体は、背方化作用（26、27）を有し、それゆ えに更に、shh／vhh-1の腹方化作用の仲介因子として作用しそうにない。 shh／vhh-1が底板細胞及び運動神経の分化を誘導する機構は不明である。ショ ウジョウバエ及び脊椎動物のヘッジホッグタンパク質は自己タンパタ質分解を行 い、細胞表面に結合しているアミノ末端断片（N）及び自由に拡散可能なカルボ キシ末端断片（C）を生成する（28）。故に底板及び運動神経の分化の誘導は、 プロセッシングを受けた、shh／vhh-1のN及びC断片にある別個の生物学的活性に よる可能性がある（図17Ａ）。もう一方の可能性としては、底板及び運動神経の 行く末は、TGB-β関連タンパク質が、脊椎動物の胎児での中胚葉組織のパターン 化において提唱されたのと同様の方法（29-31）で、単一のshh／vhh-1断片の異 なる濃度（図17Ｂ）で特定されるということである。 実験材料及び実験方法 中間神経板移植片を、以前に記載された様にして（8）、ハンバーガーハミル トン期（36、HH）10にあるニワトリの尾側領域から解体して得た。脊索移植片は 、 dispase処理の後、HH期10のニワトリ胎児の尾側領域から解剖して得た。脊索と 神経板移植片との間の接合体をコラーゲンゲル内に調整した。必要であれば、脊 索と神経板移植片は、核孔ポリカルボネート（孔径0.1μm、COSTAR）、または透 析膜（Spectrum、Spectra/Por membrane分子量カットオフ：50,000）フィルタを 使って分離した。移植片は以前記載された（8）培養液中で増殖させた。 神経マーカの検出：HNF3βはウサギの抗体を使用して検出され（18、19）、Is l-タンパク質は、Islet-1及びIslet-2の両方を認識する抗体、またはIsl-1特異 性もしくはIsl-2特異性のモノクローナル抗体で検出された（20、34）（Morton ，S.,未発表データ）。SC1糖タンパク質が、MAb SC1を使って検出された（35） 。神経板移植片は、4℃の4％のパラホルムアルデヒドで1-2時間固定し、4℃のリ ン酸緩衝塩液（pH7.4）で1-2時間洗浄した。移植片を一次抗体と4℃で一晩イン キュベーションし、次にFITCがコンジュゲートしたヤギ抗-マウスIgG（Boehring er Mannheim）またはテキサスレッドがコンジュゲートしたヤギ抗-ウサギIgG（M olecular Probes）と、22℃で1-2時間インキュベーションした。この移植片を洗 浄し、50％グリセロール：50％0.1Ｍ炭酸塩緩衝液（pH9.0）（0.4mg/mlのパラフ ェニレンジアミン含有）でスライドにマウントした。移植片を、エピ蛍光（epif luorescence）光学系を備えたZeiss Axiophot顕微鏡を使って調べた。移植片の 光学的切片化はBio-Rad MRC-500共焦点顕微鏡で行った。 競合的ＰＣＲ分析：以前（8）と基本的に同様にしてRT-PCR分析を行った。全R NAを、5μgのグリコーゲンを担体として、コラーゲンゲルで培養した移植片10か ら20より抽出した（37）。競合的PCRの内部標準は、増幅する配列内にある2-300 塩基対の欠損（HNF3β、Isl-1において）、または挿入（Isl-2、Netrin-1、ChAT において）により行った。プラスミドDNAを線状化して、in vitroでの転写を行 ってセンス方向のRNAを調製した。100fgの競合性テンプレートRNAを、各試料の 全RNAに加え、MoMLV-RT（Gibco BRL）を使って逆転写させた。それぞれの反応生 成物の10分の1を、各クローンで欠損または挿入した部位をはさむ特異的プライ マを使ったPCRの供した。 それぞれのPCRサイクルは、94℃で1分、54℃で1分、72℃で1分であった。Isl- 2、Isl-1、HNF3β、及びNetrin-1に対しては22サイクル実行し、ChATに対しては 20サイクル実行した。PCR産物は、³²ｐで標識したDNAプローブを使い、サザンブ ロットハイブリダイゼーションで検出した。組織由来のバンドが内部標準の上に なるようにブロットを整列させた。組織由来のPCRバンドのサイズは、HNF3βが5 10塩基対、Netrin-1が232塩基対、Isl-1が427塩基対、Isl-2が304塩基対、ChAT が283塩基対である。 COS細胞の形質転換：センスまたはアンチセンスvhh-1発現プラスミドの形質転 換を以前に記載された方法（15）で行った。簡単にいうと、ダルベッコ改変イー グル培地（DMEM）（1％のグルタミン添加済み）中の、１μgのDNA及び12μg/ml のリポフェクチン（GIBCO BRL）とを、35mm培養皿内で80-90％コンフルエントな COS細胞に与えた。5時間のインキュベーション後、培地を10％ウシ血清添加済み のDMEMと交換することで、形質転換反応を終結させた。インキュベーションアッ セイは36時間のインキュベーション後に行った。vhh-1で形質転換されたCOS細胞 による、底板細胞及び運動神経の誘導のため、中間神経板移植片を形質転換済み COS細胞の単層培養物上に置き、コラーゲンゲル中に埋め込み、36時間F12/N3培 地中で培養した。トランスフィルタアッセイの準備のために、重合化コラーゲン ゲル、核孔ポリカルボネートフィルタ、または透析膜を使って、中間神経板移植 片をCOS細胞から分離した（図14の説明）。 神経板の形質転換：CMV-またはRSV-LTRに基づくvhh-1の発現プラスミドを、リ ポフェクチン（GIBCO BRL）を使って直接、中間神経板移植片に形質転換した。4 00ngのDNA、及び2μgのリポフェクチンを100μｌのF12/N3と混合し、神経板移植 片に加えた。移植片を5時間インキュベーションし、以前記載されたように（8） コラーゲ ンゲルで洗浄、培養を行った。vhh-1で形質転換された移植片の実験において、2 8サイクルの増幅を、組織由来cDNA産物の1/100に対して使った。形質転換に供し た神経板移植片の生存度は、障害があった（データは非掲載）。よって出願人ら は、培養液に底板又は運動神経を誘導する活性はないが（図14Ａ、及び非掲載デ ータ）、解離した神経管培養中で分化する運動神経の数を増加させる（38）、ニ ュートロフィン3（neutrophin 3）（NT3;10ng/ml:Genetech Inc.）を補った。 第四実験シリーズ 脊椎動物ヘッジホッグ（ハリネズミ）族の細胞内シグナル分子およびウイング ヘリックス(winged-helix；翼カタツムリ)族の転写因子は、底板の発生に関係し てきた。出願人は、脊椎動物ヘッジホッグ遺伝子ｖｈｈ−１（ソニックハリネズ ミ、ｓｈｈ）およびウイングヘリックス遺伝子ＨＮＦ−３βを、カエルの胚の神 経板および神経管中で誤発現させた結果を調べた。これらの遺伝子のどちらかが 誤発現しても、異所性位置において底板分化が誘導される。しかしながら、ｖｈ ｈ−１およびＨＮＦ−３βの両方に反応する異所性底板誘導は、時間的空間的に 限られていた。神経板ステージでは、異所性底板分化は認められなかった。神経 管が閉じた後、異所性底板分化が認められたが、それは神経管の背方領域に著し く限られていた。ウイングヘリックスおよび脊椎動物ヘッジホッグ遺伝子のin-v ivoにおける底板分化を誘導する能力は、それ故、底板分化の時と場所を特定す る別のシグナルによって抑制される。序論 脊椎動物の胚の正中線の細胞は、オーガナイズ・センターとして働き、中胚葉 および神経細胞の分化のパターンを制御する局所シグナルを与える。脊策の軸策 中胚葉細胞は、神経管の背腹方向（Ｄ−Ｖ）軸に沿って派生する細胞型のパター ンに影響を与える。ひよこ胚において、脊策の移植片は、神経管における異所性 位置において底板細胞および運動ニューロンの分化を誘導できる(van Straaten et al.，1988; Placzek et al.，1990; Yamada et al，1991，1993)．逆に、脊 策除去は、底板細胞および運動ニューロンの分化を防ぐ（van Straaten and Hek king，1991; Placzek et al.，1990; yamada et al.，1991，Ericson et al.，1 992; Goulding et al.，1993,しかしArtinger and Bronner-Fraser，1993も参照 のこと）。ネズミにおいては、脊策を除去する変異が、底板および運動ニューロ ンの分化を防ぐ(Bovolenta and Dodd 1991; Ang and Rossant，1994; Weinstein et al.，1994)。同様に、カエルの胚では、脊策形成が阻止される(Clarke et a l.，1991)ならば、または脊策が神経外胚葉から距離をおいて発生する（Ruiz i Altaba，1994)ならば、底板細胞および運動ニューロンの分化は阻止される。オ ー ガナイザー領域および底板は、脊策の誘導作用を模倣する(Wagner et al.; Yama da et al.，1991，1993; Hatta et al.，1991; Placzek et al.，1993)ので、こ れら３つの正中線細胞グループによって発現されるシグナル分子が保存される可 能性が惹起される(Ruiz i Altaba and Jessell，1993)。 底板発生に関与すると思われる細胞内シグナル分子および転写因子が確認され ている。ショウジョウバエ遺伝子hedgehogの脊椎動物の相同体、vhh-1/shhは分 泌蛋白と思われるものをコードし、オーガナイザー領域、脊策および底板の細胞 によって、これらの細胞群がその誘導活性を示した時に発現される(Riddle et a l.，1993; Krauss et al.，1993; Echelard et al.，1993; Roelink et al.，19 94)。同３つの細胞群はまた、ＤＮＡ結合転写因子のウイングヘリックス(HNF-3/ forkhead)族のメンバー(Lai et al.，1990; Weigel and Jackle，1990; Clark e t al.，1993): すなわち、ピンタラビス(Pintallavis)（XFKH1、またはXFD1/1' としても知られる），HNF-3β（axialとしても知られる）、HNF-3α（XFKH2とし ても知られる）を発現する(Ruiz i Altaba and Jessell，1992; Dirksen and Ja mrich，1992; Knochel et al.，1992; Ruiz i Altaba et al.，1993b; Bolce et al;.，1993; Sasaki and Hogan，1993; Ang et al.，1993; Monoghan et al.， 1993; Strahle et al.，1993)。カエル胚において、ピンタラビス(Pintallavis) は、嚢胚ステージにおける哺乳類ＨＮＦー３βの機能的な相同体であるようだ； すなわち、ピンタラビス(Pintallavis)は、オーガナイザー、脊策および底板中 で、一次的に発現されるが、一方、ＨＮＦー３βは、神経胚ステージになるまで 、現われない。 脊椎動物ヘッジホッグ(hedgehog)およびウイングヘリックス(winged-helix)の 遺伝子は神経パターニングに関与しているという証拠が、これらの遺伝子の誤発 現後の神経管における細胞分化を分析して得られた。マウス、カエルまたはゼブ ラフィッシュの胚においてｖｈｈ−１／ｓｈｈが誤発現されると、神経管におけ る底板マーカーがin vivo異所性発現(Echelard et al.，1993; Krauss et al.， 1993; Roelink at al.，1994)され、ＣＯＳ細胞におけるｖｈｈ−１の発現が、 底板および運動ニューロンの分化をラットおよびひよこの神経板外植片において in vitroで誘導する(Roelink et al.，1994)。カエル胚におけるピンタラビス (Pintallavis)が誤発現すると、神経管の背方領域において底板マーカーを出現 させることになり、背方の感覚ニューロンの数を減らすことにもなる(Ruiz i Al taba and Jessell，1992; Ruiz i Altaba et al.，1993a)。同様に、中脳全体に わたってＨＮＦ−３βを発現するトランスジェニック・マウスは、底板マーカー を異所性的に発現する(Sasaki and Hogan，1994)。さらに、ＨＮＦ−３β遺伝子 が標的変異によって不活性化されているマウスは、結節発生を乱し、脊策を欠き 、底板細胞および運動ニューロンの欠損を示す(Weinstein et al.，1994; Ang a snd Rossant，1994)。これらの結果によって、脊椎動物のヘッジホッグ(hedgeho g)遺伝子ｖｈｈ−１／ｓｈｈおよびウイングヘリックス(winged-helix)転写因子 族のメンバーが正中線発生運命の特定および軸策正中線細胞群による神経管のパ ターニングに関与する事が示唆される。脊椎動物hedgehogおよびwinged-helix遺 伝子が正中線神経板および神経管細胞中で通常に作用するメカニズムを解明する には、底板分化を引き起こす際のその遺伝子の能力を決定する事が必要である。 この問題に向けて、出願人は平行して、カエルの胚のin vivoにおける神経細胞 パターニングにおけるｖｈｈ−１／ｓｈｈおよびＨＮＦ−３βの作用を分析した 。出願人は、ここにｖｈｈ−１およびＨＮＦ−３βの各々が、他の遺伝子の発現 を活性化でき、また両遺伝子が神経管において異所性底板分化を引き起こす事が 可能である事を示す。しかしながら、出願人は、ｖｈｈ−１およびＨＮＦ−３β の異所性底板細胞を誘導する能力については、時間的また空間的に顕著な抑制が ある事を発見した。これらの知見によって、ｖｈｈ−１、ピンタラビス(Pintall avis)、およびＨＮＦ−３βのin vivoでの底板分化を促進する能力が、別の因子 によって抑制される事が示唆される。実験結果 カエルｖｈｈ−１の単離および発現のパターン カエル胚における内因性ｖｈｈ−１遺伝子の規制されない発現の影響を調査す るために、出願人は、数個のアフリカツメカエルlaevis vhh-1 cDNAsをクローン 化（実験方法参照）した。そのうちひとつの、〜１．４ｋｂの読み取り枠を含み 、ｖｈｈ−１／ｓｈｈ遺伝子と７０％の同一性を持つ蛋白コードするものは(Gen b ank 承認番号 L35248)、他の脊椎動物種中でも確認される。 初期カエル胚におけるｖｈｈ−１の発現パターンを、in situハイブリダイゼ ーションで分析し、ウイングヘリックス(winged-helix)遺伝子のピンタラビス(P intallavis)およびＨＮＦ−３βの発現パターンとホメオボックス遺伝子のグー スコイド(goosecoid)と比較した。カエル胚におけるｖｈｈ−１ｍＲＮＡの発現 が、初期嚢胚ステージ（ステージ１０＋）で、原口背唇の正中領域内の細胞で最 初に発見され（図１８Ａ、ステージ１０および図示せず）、ピンタラビス(Pinta lavis)およびグースコイド(goosecoid)の発現の後生じた(図１８Ｂ，Ｃ；Cho et al.，1991; Dirksen and Jamrich，1992; Ruiz i Altaba and Jessell，1992) 。嚢胚（ステージ１１ー１３）期では、ｖｈｈ−１発現が、原口背唇付近の後背 方領域を除く脊策前方板および脊策中で認められた（図１８Ｄ）。これらのステ ージでは、ｖｈｈ−１の脊策での発現が、腹方よりも背方側で高かった（図１８ Ｆ、Ｇ）。これと対照的に、ピンタラビス(Pintalavis)，brachyury Xlim-1 Xno t mRNAsの発現は一定していた(図１８Ｉ；Smith et al.，1991; Ruiz i Altaba and Jessell，1992; Taira et al.，1992; von Dassow et al.，1993)．嚢胚ス テージでは、ピンタラビス(Pintalavis)も、脊策前方で発現された（図１８Ｅ） 。初期神経胚ステージ（〜ステージ１５）までには、脊策におけるｖｈｈ−１の レベルは、ビンタラビス(Pintalavis)発現における低下(Ruiz i Altaba and Jes sel1，1992)と平行して、著しく低下した(図１８Ｈ，Ｊ)。初期神経管ステージ( ステージ２０ー２６)では、脊策におけるｖｈｈ−１の発現は、わずかかまたは 全くみられなかったが、尾部発芽ステージ（図１８Ｋ，Ｌ）までは、脊策前方板 における発現は、高度に持続されていた。オタマジャクシステージで、低レベル のＨＮＦ−３βが認められる時に、ｖｈｈ−１は脊策で（ステージ〜３６）；図 １８Ｍ，Ｎ）一時的に再発現された（図１８Ｏ；Roelink et al.，1994，および 図示せず）。 ｖｈｈ−１の神経発現は、全腹背（ＡーＰ）に沿ってまず認められた。その後 、吻状尾部(rostrocaudal)，正中溝(median deep)（ｍｄ）の軸策（図１８Ｊ） で認められたが、正中表面（ｍｓ）細胞では認められなかった（Schroeder 1970 ， 〜ステージ１２ー１５、図１８Ｇ，Ｈ）。ｖｈｈ−１発現の開始は、ピンタラビ ス(Pintalavis)の発現開始後に生じた（図１８Ｆ、Ｇ、Ｉを比較の事）。初期尾 部発芽ステージ（ステージ〜２４）から先、ｖｈｈ−１は、中脳、後脳、および 脊椎の腹正中線において全底板細胞で発現された（ステージ〜３６、図１８Ｍ、 Ｎ）。底板でのｖｈｈ−１の発現は、ステージ〜５１、つまり調査した最後のス テージまでは、高度に持続された（図示せず）。オタマジャクシ・ステージでは 、底板細胞は、ｖｈｈ−１およびＨＮＦ−３β（図１８Ｍ−Ｐ）の両者を発現し た。しかしながら、ＨＮＦ−３β(図１８Ｐ；Ruiz i Altaba et al.，1993bも参 照の事)とは異なり、底板に直に隣接する脳室帯細胞中では、ｖｈｈ−１は発現 されなかった（図１８Ｎ）。 将来の前脳となる部分では、ｖｈｈ−１が神経胚ステージ（〜ステージ１５） の、最初は間脳腹方正中線で、まず認められた（図１８Ｊおよび図示せず）。尾 部発芽ステージでは、ｖｈｈ−１は、腹方間脳全体（図１８Ｋ）で、尾部領域の 、より背方側（図１８Ｌ、Ｍの非標識矢印）にわたって発現され、ＨＮＦ−３β の発現(図１８Ｏの非標識矢印；Ruiz i．Altaba et al.，1993b)と平行していた 。尾部発芽後期からオタマジャクシ・ステージ（ステージ〜２８ー４１）までに は、中間脳におけるｖｈｈ−１の発現は、腹方正中線ではもはや認められず、そ のかわり、より腹方部位を占めていた（図１０Ｌ，Ｍおよび図示せず）。吻状間 脳(rostral diencephalon)の大半では、ｖｈｈ−１の腹方正中線発現が持続して おり（図１８Ｍ）およびｖｈｈ−１発現の新部位が、腹方終脳細胞中で認められ た。これはステージ４１より始まった（図示せず）。 ｖｈｈ−１もまた、他種におけるｖｈｈ−１／ｓｈｈの発現パターンに一致し て(Riddle et al.，1993; Eschelard et al.，1993; Krauses et al.，1993; Ro elink et al.，1994)、前および後内胚葉、ハイポコード(hypochord)、臭覚プラ コード、心臓後部腹方細胞（図１８Ｌ，Ｍおよび図示せず）、および四肢発芽の 後間葉（図示せず）で発現された。 外腹腸胚におけるｖｈｈ−１の神経系発現の欠損 底板によるｖｈｈ−１の発現は（図、１８Ｈ，Ｎ）、正中線細胞におけるｖｈ ｈ−１の発現が脊策による誘導に依存している事を示唆している。これを調べる ために、脊策が神経内胚葉から距離をおいて発生する完全な外腹腸胚を、ｖｈｈ −１発現について分析した。完全な外腹腸胚（ステージ〜１５および〜３６）に おいては、ｖｈｈ−１は、脊策および前内胚葉細胞で認められたが、神経外胚葉 では認められなかった（図１８Ｑおよび表示せず）。正中線神経細胞によるｖｈ ｈ−１発現は、それ故、軸策中胚葉からのシグナルに依存しているようであり、 これは、底板細胞におけるピンタラビス(Pintalavis)およびＨＮＦ−３β発現が 、脊策からのシグナルに依存している事と一致している。(Ruiz i Altaba and J essell，1992; Dirksen and Jamrich，1992; Ruiz i Altaba et al.，1993a，19 93b)。 目的遺伝子の発現の為プラスミドの神経細胞への局所に注入 ｖｈｈ−１およびＨＮＦ−３β発現の神経細胞パターニングに対する影響を調 べるために、出願人は、まず、将来の神経細胞となる細胞で異所性遺伝子発現を 定常的に行なえる注入プロトコールを確立しようと企図した。ｖｈｈ−１および ＨＮＦ−３β遺伝子を、ＣＭＶプロモータの制御下にプラスミド中に挿入し、ス テージ１または２段階にあるカエルの胚の異なる領域に、注入した（表６）。 数字は、胚の全数（ｎ）のパーセンテージ。外胚葉における発現は、神経組織に おける発現を包含する。胚のパーセンテージは、軸策および軸近傍中胚葉中での 発現であり、より腹方の中胚葉での発現を示すパーセンテージを表していない。 この値は、細胞膜（テキスト参照）下の動物極への注入については決ねられない 。なぜなら単一の散在細胞が胚毎に中胚葉中で認められたからである。注入され たプラスミドからのＨＮＦ−３βの発現は、ＣＭＶプロモータによって推進され た（材料と方法参照）。 １．調査した全ての胚における大区画発現 ２．中胚葉中で認められた散在単一細胞のみ ｎｄ：測定されず 神経外胚葉に遺伝子の異所性発現をさせるため組換えプラスミドが、ひとつま たは二つの細胞胚の末端動物極に、細胞膜下で注入された。嚢胚および神経板ス テージにおいて、ｖｈｈ−１およびＨＮＦ−３βの異所性発現はモザイクであり 、神経および非神経外胚葉において、大区画状で認められた（図１９Ａ、Ｂ、Ｄ 、Ｅ；表６、７）。動物極に対してプラスミドをターゲテイングすると、注入さ れた遺伝子が胚の後領域で優先的に発現される（図１９Ｃおよび図示されず）プ ラスミド注入についても予測されるように、ｖｈｈ−１およびＨＮＦ−３βの異 所性発現はモザイク性が高かった（図１９Ｃ，Ｆ）。１００を超える注入胚の分 析によって、ｖｈｈ−１またはＨＮＦ−３βを発現される細胞が、オタマジャク シ・ステージで、神経管のＤ−Ｖ軸のどの位置においても発見できることがわ かった（表８、図２４、および図示せず）。このように、動物極の細胞膜下の注 入は、カエルの胚の神経外胚葉における遺伝子の発現を成功させるに有効である 。更に、注入されたｖｈｈ−１およびＨＮＦ−３βの発現はモザイクであっても 、神経管内では一定の空間的な限界がない。これらの実験では、出願人は、蛋白 ではなくｍＲＮＡを分析した。ｖｈｈ−１ ｍＲＮＡを発現する全ての細胞が機 能的蛋白を発現できるようにする事は、まだ確立されずにいる。 ｖｈｈ−１またはＨＮＦ−３βの誤発現の底板分化に対する影響を調べる為に 、出願人は、時間的に異なる発現パターンを示す４つの底板マーカーの発現をモ ニターした。ピンタラビス(Pintalavis)は、神経板ステージで一時的に発現され る(図１８；Ruiz i Altaba and Jessell，1992; Dirksen and Jamrich，1992)、 然るに、ｖｈｈ−１は、神経板ステージから連続的に発現された（図１８）。Ｆ −スポンジン(Ｆ−spondin)、つまり底板接着分子をコードしている遺伝子(Klar et al，1992),及びＨＮＦ−３βは、神経管が閉じた後に発現されるにすぎない (図１８、Ruiz i Altaba et al.，1993a; Ruiz i Altaba et al.，1993b)。ＨＮ Ｆ−３β発現は、底板の性質と神経管細胞を比較するに充分のようである(Sasak i and Hogan，1994)ので、ＨＮＦ３βと他のマーカーを組み合わせて使用すると 、誘導される細胞が底板の特質を持っているという有力な事実が提供される。こ れらのマーカーで、出願人は、異所性底板分化の時期および異所性底板細胞の出 現する場所を調べた。 底板誘導におけるｖｈｈ−１による時間的および空間的抑制 ｖｈｈ−１は、神経板ステージにおいて底板マーカーの異所性発現を誘導しない カエルまたはラットのｖｈｈ−１を発現するプラスミドを注入した後、ｖｈｈ −１を発現する細胞の大区画が、後期胞胚／初期嚢胚ステージにおいては外胚葉 で、および神経胚ステージにおいては神経板にある事が認められた（図１９Ａ、 Ｂおよび図示せず）。神経板ステージでは、しかしながらピンタラビス(Pintala vis)の異所性発現は、神経板の正中線の細胞で内在性ピンタラビス(Pintalavis) の発現が生じた時（Ruiz i Altaba and Jessell，1992; 図１８Ｅ、Ｉ）であっ ても、神経外胚葉では、認められなかった（表７）。同様に、カエルのｖｈｈ− １プラスミドを注入しても、神経板ステージにおいては、ＨＮＦ−３βの発現を 誘導しなかった（表７）。 分数は、分析された胚の全数の関数として異所性発現を示す胚の数を示す。注 入された胚は、神経板（ステージ１４ー１６）または神経管ステージ（ステージ ２８ー３８）で分析された。各々の場合に分析されたマーカーを各欄の上部に示 した。ＣＭＶプラスミドにクーロンされて注入された遺伝子は、各列の左に示し た。他の詳細についてはテキスト参照。ｓ＝センス構築物、ａ：アンチセンス構 築物、ＨＮＦ−３β△＝先端切除ＨＮＦ−３β遺伝子を示す（実験方法参照）。 アンチセンスｖｈｈ−１またはＨＮＦ−３β△の発現を推進するＣＭＶプラスミ ドが注入された胚で認められるｖｈｈ−１およびＨＮＦ−３β発現の異所性部位 が、背方領域で認められる。影響を受けた胚の大半が、１つ以上の部位で底板マ ーカーを発現した。 １： ４０／４８の胚が 注入されたアンチセンスｖｈｈ−１プラスミドを発現 した。 ２： ２７／１６４胚が、異所性ＨＮＦ−３βを神経管中で発現した。別の４０ ／１６４の胚が、異所性ＨＮＦ−３βを耳のベシクルで独占的に発現した。背方 後脳および耳のベシクルの間に位置する細胞中の発現は殆ど認められなかった（ ２／１６胚）。神経管内には、終脳内で、ただひとつの異所性部位があった。 ３： 散在した単一細胞のみが神経板および隣接の外胚葉に見られた（テキスト 参照）。 ４： ２３／１２８胚がｖｈｈ−１を外胚葉および神経管中で発現した。別の６ １／１２８胚が、異所性ｖｈｈ−１を非神経外胚葉で独占的に発現した。 ５： Roelink et al．(1994)からのデータ。注入されたラットｖｈｈ−１発現 は、神経板ステージでは１１／１１胚中で、オタマジャクシ・ステージでは２３ ／７４胚中で認められた。ＨＮＦ−３β蛋白は核中で認められた。 ６： ＨＮＦ−３β△蛋白は、細胞質および核中の両方で認められた。 ｎｄ： 測定されず ｖｈｈ−１は、神経板の正中線で細胞によって発現されるので（図１８Ｇ，Ｈ ）、出願人は、ｖｈｈ−１が自身の発現を誘導できるかどうかを、ラットにｖｈ ｈ− １プラスミドを注入する事、及びカエルｖｈｈ−１の発現を分析する事によって テストした。大半の胚において、ｖｈｈ−１の異所性発現は見られなかったが、 若干の胚では、ｖｈｈ−１を発現する散在した細胞が神経板および隣接の外胚葉 中で認められた（図２１Ａ、表７）。 これらの結果は、底板遺伝子がｖｈｈ−１の広範発現に反応して神経板ステー ジで異所性的に誘導されるないことの証拠を提供するものである。 底板マーカーの異所性誘導は、神経管ステージで、ｖｈｈ−１に反応して起こる 底板マーカーは、注入された胚が神経ステージに分化した所で異所性発現され た事が認められた。ＨＮＦ−３βの異所性発現は、カエル（図２０、表７）かま たはラットｖｈｈ−１プラスミド（Roelink et al.，1994; 表７）注入後に認め られた。ｖｈｈ−１の発現を推進するプラスミド構築物をアンチセンス方向で注 入しても、ＨＮＦ−３βは異所性発現には至らなかった（表７）。ラットｖｈｈ −１を注入すると、神経管内（図２１、表７）および非神経系外胚葉（表７）で カエルｖｈｈ−１の異所性発現を引き起こす結果となった。アンチセンス・ラッ トｖｈｈ−１を注入すると、結果として非常に低率のカエルｖｈｈ−１ｍＲＮＡ の異所性発現が引き起こされたに過ぎない（表７）。以前の研究では、ラットの ｖｈｈ−１の広範囲の発現が、Ｆ−spondin(Roelink et al.，1994)の異所性発 現を導く事がわかっている。 ｖｈｈ−１およびＨＮＦ−３βの異所性背方発現は、脊椎、後脳、中脳、間脳 中で観察されたが、ただ終脳では殆ど観察されなかった（データ表示せず）。胚 の前方領域で、注入されたプラスミドが高率の発現を示した（図１９Ｂ，Ｃ）の で、終脳での低率異所性底板マーカ発現は際立つ。 これらの結果を合わせると、ｖｈｈ−１の広範囲の発現は、神経管内での底板 細胞の異所性分化を導く。 ｖｈｈ−１に誘導される異所性底板分化は制限される ＨＮＦ−３βおよびｖｈｈ−１の両者は、注入された胚の神経管で異所性発現 されるけれども、異所性遺伝子発現のパターンには、著しい空間的な制限がある 。ホールマウント（whole-mount）による分析では、全ての影響を受けた胚は、 背方部位で異所性遺伝子発現を示した事がわかった（図２０、２１）。加えて、 ＨＮＦ−３βおよびｖｈｈ−１発現は、時折、神経管のＤーＶ域で起こった（ｖ ｈｈ−１部位で２３％、ｎ＝３５部位；図２１Ｄ参照；およびＨＮＦ−３β部位 の１０％、ｎ＝４０部位；表示せず）。率は低いがある部位においては、異所性 底板マーカーの発現は、通常、腹方正中線ドメインの底板遺伝子発現を拡大した ように見える（９％のｖｈｈ−１部位、図示せず、１０％のＨＮＦ−３β部位、 図２０Ｂ参照）。 異所性底板マーカ発現部位をより正確に決定するために、注入された胚の神経 管の横切片を調べた（表８、図２４）異所性部位の大半は、上衣板の中および周 囲に見られた（。図２０Ａ−Ｅ；２０Ｂ−Ｄ，Ｆ）。上衣板に直に隣接した翼板 の背方領域大部分の細胞はまた、低率で底板マーカーを発現した（図２０Ｄの矢 印）。神経管のより腹方領域では、異所性底板マーカーが脳室領域に沿ってしば しば発現された（表８、図２４）。異所性底板マーカー発現は、基盤の翼の側方 領域では、認められなかた（図２０ＤーＦ、２１Ｄ，Ｆ；表８および図２４）。 ｖｈｈ−１またはＨＮＦ−３βの異所性発現が認められたるでは、神経管の形態 にしばしば変化が現れ、分岐神経管となる事がよく起こった（図２０Ｅ、２１Ｅ 、２１Ｆ）。 数字は、各ゾーンの事例（ｎ）のパーセンテージを、事例の全数の関数と して示す（図２４参照）。ある部位では、発現が２つ以上のゾーンにわたってい た。各列は、ラットのｖｈｈ−１（Ｒｖｈｈ−１）、カエルｖｈｈ−１またはカ エルＨＮＦ−３β（各列の左）の発現を推進するＣＭＶプラスミドの注入後の具 体的なマーカー（右上欄）、すなわちｖｈｈ−１ｍＲＮＡまたはＨＮＦ−３β蛋 白の発現結果を示す。異所性F-spondin部位の局在は、表示されていない。なぜ なら小数の部位しか分析されなかったからである。細胞の数（一番下の列）は、 各ゾーンの片側に位置する細胞の平均パーセンテージを示す。平均は、３つの異 なるセクションの１／２で、ＤＡＰＩ染色した核の数を計測して求めた。数は横 切片の視察によって得られた。 ＨＮＦ−３βによる底板誘導における時間的空間的抑制 上記に述べたｖｈｈ−１の広範囲発現の後観察される底板誘導にいおいては、 時間的空間的制限が、主としてピンタラビス(Pintalavis)およびＨＮＦ−３β発 現の誘導の上流で、または平行して起こる。このような制限がピンタラビス(Pin talavis)およびＨＮＦ−３βの活性化の上流で発生するならば、ＨＮＦ−３βの 広範な発現に反応する証拠とはならないであろう。それ故、出願人は、ＨＮＦ− ３βによる底板誘導の際に起こり得る制約を調べた。 ＨＮＦ−３βは、神経板ステージにおいて底板マーカーの異所性発現を誘導しな い ピンタラビス(Pintalavis)またはｖｈｈ−１の異所性発現は、ＨＮＦ−３βプ ラスミドが注入された胚の神経板では認められなかった（表７）。ｖｈｈ−１に 反応して観察される底板マーカー発現における時間的制限は、それ故、ＨＮＦ− ３βの広範囲な発現の後 でも明らかである。 底板マーカーの異所性誘導は、ＨＮＦ−３βに反応して神経管ステージで起こる 。 ｖｈｈ−１およびＦ−スポンジン(Ｆ−spondin)の異所性発現は、注入された ＨＮＦ−３βを発現する大部分の胚の神経管で認められた（図２２Ａ、Ｂ，Ｄ， Ｆ；表２）。先端切除されたＨＮＦ−３β遺伝子（実験方法参照）の発現を推進 するプラスミドを注入しても、ｖｈｈ−１およびＦ−スポンジン(Ｆ−spondin)( 表７)の異所性発現には至らなかった。これらの結果は、ピンタラビス(Pintalav is)の広範囲の発現が、オタマジャクシ・ステージで、 Ｆ−スポンジン(Ｆ−sp ondin)の異所性発現を誘導するという以前の研究(Ruiz i Altaba et al.，1993a )と一致した。ＨＮＦ−３βの広範な発現は、神経管のＡ−Ｐ軸に沿った底板マ ーカーの異所性発現を誘導する事が出来る（図２２Ａ）。終脳では、しかしなが ら、ひとつしか異所性部位がみられなかった。このようにＨＮＦ−３βは、神経 管内で、ｖｈｈ−１および他の底板マーカーの異所性発現を誘導する事ができる 。 ＨＮＦ−３βに誘導される異所性底板分化は空間的に制限される ＨＮＦ−３βの広範囲発現の後に認められるｖｈｈ−１またはＦ−スポンジン (Ｆ−spondin)両者の異所性発現は、神経管内では著しく制限された。全体の分 析では、ＨＮＦ−３βが広範囲に発現されると、背方神経管（図２２、表８、図 ２４）に異所性底板マーカーが優先的に局在する事になり、全ての影響された胚 は、背方異所性発現部位を示す事がわかった。加えて、２３％の部位では、ｖｈ ｈ−１の発現が、神経管のＤ−Ｖ域にわたっており、８％の部位では、ｖｈｈ− １が腹方域へも拡大して発現されていた（ｎ＝６０部位、図示されず；Ruiz i A ltaba et al.，1993aも参照のこと）。 横切片の調査によると、ほとんどの異所性ｖｈｈ−１部位は、背方に見られる 事が明かとなった（表８および図２４）。神経管のより腹方領域では、異所性ｖ ｈｈ−１発現は、脳室帯、多くは片側のゾーン、または底板に直に隣接する細胞 、通常は脳室帯、に限られていた（表８、図２４）。異所性ｖｈｈ−１またはＦ −スポンジン(Ｆ−spondin)の発現は、翼または基板の外方域では認められなかっ た（図２２Ｄ，Ｆ：表８および図２４および図示されず）。神経管の形成不良に は、しばしば異所性ｖｈｈ−１発現が伴なっていた（図示せず）。 これらの結果によって、ＨＮＦ−３βが、神経管細胞中でｖｈｈ−１および他 の底板マーカーの転写を活性化できる事、及びＨＮＦ−３βの広範囲発現の後に はｖｈｈ−１に反応して認められる底板マーカーの発現に空間的制約が明かにあ る事が実証される。実験考察 ｖｈｈ−１およびwinged-helix遺伝子の相互活性化および底板誘導のホメオジェ ニック性 神経板の正中線における底板細胞の分化は、脊策からの信号によって誘導され る(van Straaten et al.，1988; Placzek et al.，19900，1993; Hatta 1991，Y amada et al.，1991; Ruiz i Altaba 1992; Jessel; and Dodd 1992)．一度誘導 されると、底板細胞は別の底板細胞の分化を誘導する能力を獲得する(Placzek e t al.，1990; 1993; Yamada et al.，1991; Hatta et al.,1991)。このように、 底板分化の誘導は、脊策細胞が同様のシグナル特質を正中線神経板細胞に与える ホメオジェニックなプロセスである。ｖｈｈ−１およびＨＮＦ−３βについての 本研究に、以前の知見(Ruiz i Altaba et al.，1993a; Sasaki and Hogan 1994; Kraausss et al.，1993; Echelard et al.，1993; Roelink et al.，1994)と合 わせる事によって,底板誘導分子的経路及びこの誘導プロセス(図２３)の伝播及 び最後に起こる誘導プロセスの制限の下にあるメカニズムが示唆される。 ピンタラビス(Pintalavis)は、オーガナーザー領域およびｖｈｈ−１発現の開 始前の脊策で発現する。カエルの胚においてピンタラビス(Pintalavis)は、マウ ス(Ruiz i Altaba et al.，1993b)のＨＮＦ−３βが持っている様な初期機能を 果たしているように見え、だから、脊策におけるｖｈｈ−１の発現に必要とされる のであろう。しかしながら、ｖｈｈ−１が、ウイングヘリックス(winged-helix) 転写因子の直接のターゲットであるかどうかは、解明されずに残されている。脊 策におけるｖｈｈ−１発現は、神経板の正中線の細胞における底板マーカーの発 現に先んじており(図１８;Ruiz i Altaba and Jessell，1992)、ｖｈｈ−１は底 板マーカーの異所性発現を誘導できる(図20，21; Echelard et al.，1993; Krau ss et al.，1993; Roelink et al.，1994)。このように、脊策によって分泌され るｖｈｈ−１／ｓｈｈが、通常は底板分化の誘導に関与するようである。 ３つの証拠によって、正中線神経細胞におけるピンタラビス(Pintalavis)およ びＨＮＦ−３βの誘導が、底板の分化に必要である事が示唆される。第一は、カ エルにおけるピンタラビス(Pintalavis)およびひよこにおけるＨＮＦ−３βの発 現は、脊策由来の誘導信号に対する神経板細胞の直接反応の様にみえることであ る(Ruiz i Altaba et al.，1993a; 1995)。第２に、ピンタラビス(Pintalavis) もＨＮＦ−３βも共に、神経管においてｖｈｈ−１／ｓｈｈ（図２２）をはじめ とする底板マーカーの異所性発現を誘導できることである(図２２、Ruiz i Alta ba et al.，1993a，Sasakl and Hogan，1994)。第二に、外胚葉から脊策を分離 すると、神経外胚葉におけるピンタラビス(Pintalavis)およびＨＮＦ−３βおよ び別の底板マーカーが発現しなくなることである(図１Ｑ、Ruiz i Altaba，1994 )。底板は、神経管閉鎖時近辺で、脊策から自由となる（Yamada et al.，199 1; Placzek et al.，1991)。このような自律性は、ＨＮＦ−３βの自律調整によ って生じるが、in vitro(Pani et al.，1992)およびin vivoでは神経管(図１９ Ｆ，２２Ｃ；Sasaki and Hogan，1994)で起こる事が実証されている。 総合すると、これらの実験的観察は、ウイングヘリックス(winged-heix)転写 因子および脊策におけるヘッジホッグ(hedgehog)遺伝子の連続発現が、底板誘導 の初期相の基盤となるというモデルと一致する。これら遺伝子の底板における連 続発現は、別の底板細胞のホメオジェニック誘導にも関係しているかもしれない 。しかしin vivoでは、これらのシグナル・カスケードが神経板および神経管全 体に不明確には伝播しない。底板分化の程度は、分泌されたｖｈｈ−１の作用範 囲によって部分的に制限されるであろうが、また下記に記載したように、ｖｈｈ −１およびウイングヘリックス(winged-heix)因子によって反応すべき神経細胞 の能力の限界によっても制約されるであろう。 異所性底板誘導の抑制 本研究の主要知見は、底板分化を誘導するｖｈｈ−１およびウイングヘリック ス(winged-heix)転写因子の能力には著しい時間的空間的制限があるという事で ある。 通常の発生の間では、底板マーカーは、神経板の正中線細胞によって最初に発 現される（図１８、２３）。対照的に、ｖｈｈ−１またはＨＮＦ−３βが誤発現 されると、神経板細胞における底板まマーカーの異所性発現を誘導しなくなる( 図２４)。側方神経板細胞は、ｖｈｈ−１またはＨＮＦ−３βを発現する事見込 みがなくなり、そして死滅する。なぜならば、これらの細胞は、プラスミドベク ターで推進される同じ遺伝子を発現できるからである（表８、図２４および図示 せず）。底板分化でみられる限界については、脊策が二つのシグナル、すなわち 、脊椎動物ヘッジホッグ(hedgehog)蛋白および別個の因子を、神経板ステージに おける底板分化を引き起こすに必要とされる両シグナルを結合した作用をもって 与えるからであろうという説明が可能であろう。第２の可能性は、非神経組織、 特 に、神経外胚葉の側方領域にある近軸中胚葉派生のシグナルによってｖｈｈ−１ およびＨＮＦ−３βに対して側方神経板細胞が反応できなくさせられる事があげ られる。ｖｈｈ−１およびＨＮＦ−３βに反応する事が出来る唯一の神経板細胞 であるので、脊策に付着していることによって近軸中胚葉の局所的阻害影響を受 けない正中線にある細胞であろう。どちらの場合も、底板分化におけるこれらの 時間的制約は、ＨＮＦ−３βの異所性発現がｖｈｈ−１によって誘導される時、 およびｖｈｈ−１の発現がＨＮＦ−３βで誘導される時に観察される。このよう に、これらの制約が、ＨＮＦ−３βの上流および下流の両方で作用するようであ る。 神経管閉鎖のち、神経細胞は、異所性底板分化を伴うｖｈｈ−１およびＨＮＦ −３βの広範囲発現に反応できる。しかしながら異所性底板細胞は、背方神経管 およ脳室帯の細胞に原則的には限られる（図２４）。神経板ステージでおこる抑 制は、それ故、神経管ステージのもっとも背方領域にある細胞および脳室帯の細 胞を除いては、神経管閉鎖後にも持続され得る。神経管ステージにおける異所性 底板分化における空間的制約に寄与するであろう別の抑制は、神経分化である。 ニューロンから底板遺伝子発現を遮断すると、原則として、脳室帯細胞および上 衣板の非神経細胞に対する異所性底板分化を制限することになるであろう。 カエルの胚の神経管の中間領域に異所性底板分化がないことは、ひよこおよび カエルの神経管のこの領域における二次脊策の底板を誘導する能力(Yamade et a l.，1991; ARA and TMJ未出版)およびＣＯＳ細胞中で発現されるｖｈｈ−１の、 ラットの側方神経板外移植物中におけるin vitroの底板分化を誘導する能力と対 照的である(Roelink et al.，1994)。これらの違いは、近軸中胚葉派生抑制シグ ナルのin vivo作用によって説明できよう。脊策移植片は、神経板を体節より物 理的に分離し、神経板細胞をこのようなシグナルの局所的影響を受けないように する。同様に、神経の外移植物をin vitroで単離すると、周囲の組織派生のシグ ナルから神経細胞を切り離す、これによってｖｈｈ−１に反応しておこる底板分 化を可能にする。 通常底板分化に対する空間的制約の寄与 底板細胞は、神経管の腹方正中線にある限られたドメインで分化する(図２３) 。 底板分化の脊策による初期誘導は、接触依存性シグナルによって媒介されると 思われる(Placzek et al.，1993)。このように、底板分化における空間的制約は 、脊策と神経板細胞の間の程度の限られた接触に依存する。しかし、誘導された 底板細胞は、ホメオジェニック誘導を通じて新しい底板細胞を誘導する能力を獲 得する(Hatta et al.，1991; Yamada et al.，1991; Placzek et al.，1993).。 底板分化の広がりに対する制約は、それ故、通常の発生の間に与えられると思わ れる。 in vivoおよびin vitroの研究では、神経細胞が、底板誘導シグナルに反応で きる期間は限られている事がわかった(van Straaten et al.，1988; Yamada et al.，1991; Placzek et al.，1993)。このように、底板誘導の広がりは、一部で 神経細胞の誘導シグナル反応受容能力を欠く事によって制限され得る。出願人の in vivo研究では、しかしながら、ｖｈｈ−１またはＨＮＦ−３βの広範囲に発 現しても、神経板における底板マーカーの異所性発現を推進できない事がわかっ た。それ故in vivoでは、神経細胞の受容能力喪失に先立ちまたは無関係に、底 板分化の広がりが抑制される（図２３）。 ｖｈｈ−１，ウイングヘリックス(winged-heix)遺伝子および前脳のパターニン グ 神経管においては、ｖｈｈ−１の発現が、底板細胞および前脳の正中線細胞を 誘導する。吻状前脳中でのｖｈｈ−１発現に関与する誘導シグナルの供給源とし ては、前脳分化の広がりに関係している(Dixon and Kintner，1989; Ruiz i Alt aba，1992)前脊策板が有力である。ピンタラビス(Pintalavis)およびｖｈｈ−１ の両者は共に、前脊策板中で発現される。このように、ｖｈｈ−１の前脊策板中 胚葉中での発現は、ウイングヘリックス(winged-heix)転写因子によって脊策中 で起こるのと同様な方法で制御され得る。神経軸の後部レベルでの底板特質の誘 導において、脊策由来のｖｈｈ−１が関与しているという観点から、前脊策板に よって分泌されるｖｈｈ−１が吻状前脳の正中線細胞におけるｖｈｈ−１の誘導 に係わっている可能性がある。しかしながら、ピンタラビス(Pintalavis)，HNF- 3βもＨＮＦ−３αもどれも、ｖｈｈ−１ ｍＲＮＡが最初に現れる時は、吻状前 脳では発現されない。このように、この領域でのｖｈｈ−１発現は、底板細胞で の底板発現を誘導するために操作される経路とは異なる経路によって調整される ようだ。実験方法 カエル、胚およびマイクロインジュクション アフリカツメガエル・ラエビス(laevis)の雌に１０００μのヒト絨毛膜ゴナド トロピンを注入して産卵を誘発した。卵を精巣ホモジネートで授精し、標準法で 生育させた(Ruiz i Altaba，1993)。胚の段階発達化は、Nieuwkoop とPaberに従 った(1967)。 授精卵は、第一分割の前に３％のシスチンｐＨ７．６で、ジェルを取り除き、 注入液（３％フィコール、１ｘＭＭＲ）に移した。注入は、記載(Ruiz i Altaba 1993)の様に、第一分割の前後に行なった。殆どの場合に、注入は、動物極をタ ーゲットとした（テキスト参照）。第一分割溝の形成がこの領域で始まるので、 胚は頻繁に割球中に注入を受け、その結果、注入物が一方に片寄って分布した。 注入胚を注入液中で約１時間培養し、徐々に、０．１ｘＭＭＲ中に移した。 水中に１００一２００ｐｇの超コイルプラスミドＤＮＡを含ものを、カエル胚 に注入したが、胚の発生に害とはならなかった。大量のプラスミドＤＮＡは有毒 であった。 ライブラリースクリーニング及びクローン カエルのｖｈｈ−１ｃＤＮＡを単離するために、アフリカツメガエルのステー ジ１７の全胚ライブラリーの１０⁶の組換えファージを完全無欠の長さのラット のｖｈｈ−１ｃＤＮＡ(Roelink et al.，1994)で中位の厳密性で、ＨＭ：１０％ デキストランサルフェート、３ｘＳＳＣ、３ｘＳＳＰＥ、５ｘデンハート、０． ５％ＳＤＳ及び１００μｇ／ｍｌの変性サケ精子ＤＮＡ、６０℃でスクリーニン グした。ニトロセルロースフィルターを１ｘＳＳＣ，０．１％ＳＤＳで２ー４時 間洗浄した。５０陽性プラークのうち１０個を更に分析した。出願人は、アフリ カツメガエルのオタマジャクシゲノムのｖｈｈ−１遺伝子の２コピー及びｈｈ遺 伝子族の他のメンバーを単離した。 λクローン＃４をＥｃｏＲＩで消化し、〜２．４Ｋｂの挿入物をｐＢｌｕｅｓ ｃｒｉｐｔＳＫにサブクローン化して、ｐｆｈｈ＃４を作成した。この挿入物の ヌクレオチド配列を、チェインターミネーション法で、ｄｓＤＮＡをテンプレー トとして、シークエナーゼ（ＵＳＢ）を使用して両鎖について決定した。配列分 析をＶＡＸコンピュータで行った。 注入用に、ｐｆｈｈ＃４のＥｃｏＲＩｖｈｈ−１ｃＤＮＡ挿入物を,サイトメガ ロウイルス（ＣＭＶ）プロモーターをポリリンカーに対して５’に、及びＳＶ４ ０ポリアデニレーション配列をポリリンカーに対して３’に含むｐｃＤＮＡＩ− Ａｍｐ(Invitrogen)にクローン化した。２つのクローンは、センス方向とアンチ センス方向のｖｈｈ−１で作成され、ｐＣＭＶ−ｖｈｈ−１Ｓ及びｐＣＭＶ−ｖ ｈｈ−１Ａと命名された。同様に、Ｘβ１(Ruiz i Altaba et al.，1993b)のEco RI-Not I HNF-3β ｃＤＮＡ断片を、ｐｃＤＮＡＩ−Ａｍｐにクローンし、ｐＣ ＭＶ−Ｘβを作成した。コントロールとして、ｐＣＭＶ−Ｘβを単−ＢｇｌII部 位で切断し、補填し、再連結してｐＣＭＶ−Ｘβ△を作成した。この変異は、Ｂ ｇｌII部位の下流の読み取り枠を変え、早期に終了する前に３０のアミノ酸を添 加した。Ｘβ△蛋白産物は、ヘリックス１及びヘリックス２の２つのアミノ酸を 保存するＤＮＡ結合ドメインの殆どを欠く(Clark et al.，1993 and Ruiz i Alt aba et al.，1993b)。Ｘβ△蛋白は、ＤＮＡ結合活性を欠いていると推定される 。 In situハイブリダイゼーション カエルの胚は全て、Hartland(1991)に記載されたように、ホールマウント(who le-mount)in situハイブリダイゼーションでプロセスされた。若い胚の卵黄 膜を手で取り除き胞胚腔及び原腸に穴をあけ、バックグラウンドに標識されるの を防いだ。胚をＭＥＭＦＡ（3.7%ホルムアルデヒド、１ｍＭＥＧＴＡ、２ｍＭＭ ｇＣｌ₂、０．１ＭＭＯＰＳ；Patel et al.，1989）に２時間固定し、乾燥し、 １００％メタノール中に−２０℃で貯蔵した。胚は、前もってハイブリダイズせ ず、ＲＮＡプローブは加水分解しなかった。特異的ハイブリデイゼーションの検 出は、アルカリフォスファターゼと結合した抗ジゴキニン抗体で行ない、ニトロ ブルーテトラゾリウムと５ーブロモー４ークロロー３ーインドールーフォスファ ターゼと反応させた。 単鎖ジゴキニン標識のアンチセンス及びセンスＲＮＡプローブは、ジゴキニン ＵＴＰ存在下での適宜なプラスミドクローンのin vitro転写で生成され、³²Ｐ− ＵＴＰを追跡することによって取り込みを測定した。全ｃＤＮＡクローンをスキ ャンするアンチセンスのカエルｖｈｈ−ＩＲＮＡプローブは、ＮｏｔＩ切片ｐｆ ｈｈ＃４をＴ３ＲＮＡポリメラーゼで転写する事によって生成した。ｖｈｈ−１ 発現と同一なパターンが３’未翻訳領域のみにわたるアンチセンスプローブによ って観察された。センスカエルｖｈｈ−１ＲＮＡプローブは、ＳａｌＩ切片ｐｆ ｈｈ＃４をＴ７ＲＮＡポリメラーゼで転写する事によって生成した。アンチセン スラットｖｈｈ−１ＲＮＡプローブは、ＢａｍＨＩ切片ｐＲｖｈｈ−１＃７(Roe link et al.，1994)をＴ３ＲＮＡポリメラーゼで転写することによって生成した 。異なるステージでの、ラットｖｈｈ−１アンチヤンスプローブによる胚のハイ ブリデイゼーションでは、カエルのｖｈｈ−１ｍＲＮＡの発現のパターンは明か にならなかった。これは、カエルおよびラットのプローブが交差ハイブリダイズ しない事を示す。アンチセンスのピンタラビス(Pintalavis)ＲＮＡプローブは、 Ｈｉｎｄ III切片ｐＦ５(Ruiz i Altaba and Jessell，1992)をＴ７ＲＮＡポリ メラーゼで転写する事によって生成した。アンチセンスgoosecoid ＲＮＡプロー ブは、ステージ１０の背唇ｃＤＮＡから派生したＥｃｏＲＩ切片０．９ＫｂＰＣ ＲクローンをＴ７ＲＮＡポリメラーゼで転写することによって生成した。 免疫化学 ホールマウント（whole-mount）抗体標識が、Dent et al，(1989)及びPatel e t al.，(1989)の記載の様におこなわれた。胚を〜２０分ＭＥＭＦＡ中に固定し 、メタノールに１０％のＨ₂Ｏ₂を入れた中で一晩蛍光下４℃で漂白した。胚を除 々にＰＢＳ中に移し、ＰＢＳ＋０．１％トリトンＸ−１００（ＰＢＴ）中で、良 く洗浄し、ＰＢＴ＋１０％熱不活性化ヤギ血清中、室温〜１時間でブロックした 。一次抗体インキュベーションを４℃一晩ヌーテーター(Adams)上で行った。Ｐ ＢＴ中で３０分ずつ４−５回、室温にて洗浄したあと、胚をホースラデイシュ・ ペルオキシダーゼ(1/100; Boehringer Mannheim)と結合したヤギ抗ウサギ血清二 次抗体と共にインキュベーションし、２時間室温でヌーテーター上で反応させた 。次に、胚を最低５回、全部で２−３時間洗浄し、Ｈ₂Ｏ₂とジアミノベンジデイ ン存在下で反応させた。胚を乾燥させ、Nomarski光学axiophot(Zeiss)顕微鏡で 観察する前にベンジルアルコール／ベンジルベンゾエート（１／２）で清浄した 。 ラビット抗ＨＮＦ−３β抗体は、雌のニュージーランド白兎を、活性化された キーホール・リンペット（Keyhole lipmet） ヘモシアニン(pierce)と結合したシスチンをＣ末端に含むカエルＨＮＦ−３β蛋 白(Ruiz i Altaba.，1993b)のアミノ末端に対応する３０のアミノ酸ペプチドで 免疫感作して生成した。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ Ｃ０７Ｋ 16/22 9637−4Ｂ Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ Ｃ１２Ｎ 5/10 9637−4Ｂ 21/08 Ｃ１２Ｐ 21/02 7823−4Ｂ Ｃ１２Ｑ 1/68 Ａ 21/08 9282−4Ｂ Ｃ１２Ｎ 5/00 Ｂ Ｃ１２Ｑ 1/68 9051−4Ｃ Ａ６１Ｋ 37/02 ＡＡＡ (72)発明者 ドッド、ジェーン アメリカ合衆国、ニューヨーク州 10025、 ニューヨーク、アパートメント 13エー、 ウエスト・ワンハンドレッドエイス・スト リート 300 (72)発明者 ローリンク、ヘンク アメリカ合衆国、ニューヨーク州 10027、 ニューヨーク、アパートメント ２エー、 ウエスト・ワンハンドレッドトゥエンティ ース・ストリート 434 (72)発明者 エドルンド、トーマス スウェーデン国、エス − 91331 ホル ムスンド、ヤルン バグフガタン 26

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １． 脊椎動物ｖｈｈ−１タンパク質をコードする単離された核酸分子。 ２． 請求の範囲第１項に記載の単離されたＤＮＡ分子。 ３． 請求の範囲第２項に記載の単離されたｃＤＮＡ分子。 ４． 請求の範囲第１項に記載の単離された核酸分子であって、該核酸分子が カエルｖｈｈ−１タンパク質をコードするもの。 ５． 請求の範囲第１項に記載の単離された核酸分子であって、該核酸分子が 哺乳動物ｖｈｈ−１タンパク質をコードするもの。 ６． 請求の範囲第１項に記載の単離された核酸分子であって、該核酸分子が ラットｖｈｈ−１タンパク質をコードするもの。 ７． 請求の範囲第１項に記載の単離された核酸分子であって、該核酸分子が ヒトｖｈｈ−１タンパク質をコードするもの。 ８． 請求の範囲第４、５、６又は７項に記載の単離されたＤＮＡ分子。 ９． 請求の範囲第８項に記載の単離されたｃＤＮＡ分子。 １０． 請求の範囲第１項に記載の核酸分子を含有するベクター。 １１． 請求の範囲第１０項に記載のベクターを含有するプラスミド。 １２． ｐＭＴ２１ ２ｈｈ ＃７（ＡＴＣＣアクセス番号７５６８６）と称 される請求の範囲第１１項に記載のプラスミド。 １３． 請求の範囲第１項に記載の核酸分子を含有する発現プラスミド。 １４． ｃｍｖ ｖｈｈ ７（ＡＴＣＣアクセス番号７５６８５）と称される 請求の範囲第１３項に記載のプラスミド。 １５． 請求の範囲１１項又は第１３項に記載のプラスミドを含有する哺乳動 物細胞。 １６． 請求の範囲第１２項に記載の哺乳動物細胞であって、該細胞がＣｏｓ 細胞であるもの。 １７． 脊椎動物ｖｈｈ−１タンパク質をコードする遺伝子を含有する核酸分 子の配列内に含まれる独特の配列と特異的にハイブリダイズすることができる少 なくとも１５のヌクレオチドの核酸分子を含有する核酸プローブ。 １８． 請求の範囲第１７項に記載の核酸プローブであって、該核酸分子がＤ ＮＡ分子であるもの。 １９． 精製された脊椎動物ｖｈｈ−１タンパク質。 ２０． 請求の範囲第１９項に記載の脊椎動物ｖｈｈ−１タンパク質の精製さ れた独特のポリペプチドフラグメント。 ２１． 精製されたカエルｖｈｈ−１タンパク質。 ２２． 精製された哺乳動物ｖｈｈ−１タンパク質。 ２３． 請求の範囲第２２項に記載の哺乳動物ｖｈｈ−１タンパク質の精製さ れた独特のポリペプチドフラグメント。 ２４． 精製されたヒトｖｈｈ−１タンパク質。 ２５． 脊椎動物ｖｈｈ−１タンパク質に向けられたモノクローナル抗体。 ２６． カエルｖｈｈ−１タンパク質に向けられた請求の範囲第２５項に記載 のモノクローナル抗体。 ２７． 哺乳動物ｖｈｈ−１タンパク質に向けられた請求の範囲第２５項に記 載のモノクローナル抗体。 ２８． ラットｖｈｈ−１タンパク質に向けられた請求の範囲第２５項に記載 のモノクローナル抗体。 ２９． ヒトｖｈｈ−１タンパク質に向けられた請求の範囲第２５項に記載の モノクローナル抗体。 ３０． 脊椎動物ｖｈｈ−１タンパク質に向けられたポリクローナル抗体。 ３１． 請求の範囲第２項に記載の単離されたＤＮＡ分子を含有するヒト以外 のトランスジェニック哺乳動物。 ３２． 請求の範囲第３１項に記載のヒト以外のトランスジェニック哺乳動物 であって、脊椎動物ｖｈｈ−１タンパク質をコードするＤＮＡが、組織特異的調 節要素に手術で結合されたもの。 ３３． 変化するレベルの脊椎動物ｖｈｈ−１タンパク質を発現する生理学的 効果を決定するための方法であって、異なった量の脊椎動物ｖｈｈ−１を各々発 現するヒト以外のトランスジェニック哺乳動物のパネルを作成することを具備す る方法。 ３４． 請求の範囲第１９項に記載の単離されたタンパク質を製造する方法で あって、 ａ． 脊椎動物ｖｈｈ−１タンパク質をコードする核酸分子を適切なベクター に挿入すること、 ｂ． 適切なホスト細胞に生じたベクターを導入すること、 ｃ． 導入されたホスト細胞を脊椎動物ｖｈｈ−１タンパク質の発現に対して 選別すること、 ｄ． 選別された細胞を培養し、ｖｈｈ−１タンパク質を産生すること、 ｅ． 産生されたｖｈｈ−１タンパク質を回収すること を具備した方法。 ３５． 底板細胞の分化を誘導する方法であって、底板細胞の分化を誘導する のに効果的な濃度で、底板細胞を請求の範囲第１９項に記載の精製された脊椎動 物ｖｈｈ−１タンパク質と接触することを具備した方法。 ３６． 対象内の底板細胞の分化を誘導する方法であって、該対象内の底板細 胞の分化を誘導するのに効果的な量で、該対象に請求の範囲第１９項に記載の精 製された脊椎動物ｖｈｈ−１タンパク質を投与することを具備した方法。 ３７． 運動ニューロンの分化を誘導する方法であって、運動ニューロンの分 化を誘導するのに効果的な濃度で底板細胞を請求の範囲第１９項に記載の精製さ れた脊椎動物ｖｈｈ−１タンパク質と接触させることを具備した方法。 ３８． 対象内の運動ニューロンの分化を誘導する方法であって、該対象内の 運動ニューロンの分化を誘導するのに効果的な量で請求の範囲第１９項に記載の 精製された脊椎動物ｖｈｈ−１タンパク質を該対象に投与することを具備した方 法。 ３９． 腹側ニューロンを発生させる方法であって、腹側ニューロンを発生さ せるのに効果的な濃度で始原細胞を請求の範囲第１９項に記載の精製された脊椎 動物ｖｈｈ−１タンパク質と接触させることを具備した方法。 ４０． 対象内の始原細胞から腹側ニューロンを発生させる方法であって、該 対象内の始原細胞から腹側ニューロンを発生させるのに効果的な量で請求の範囲 第１９項に記載の精製された脊椎動物ｖｈｈ−１タンパク質を該対象に投与する ことを具備した方法。 ４１． 請求の範囲第１９項に記載の精製された脊椎動物ｖｈｈ−１タンパク 質及び薬学的に許容しうる担体を含有する薬学的組成物。 ４２． 請求の範囲第２２項に記載の精製された哺乳動物ｖｈｈ−１タンパク 質及び薬学的に許容しうる担体を含有する薬学的組成物。 ４３． 請求の範囲第２３項に記載の精製されたヒトｖｈｈ−１タンパク質及 び薬学的に許容しうる担体を含有する薬学的組成物。 ４４． 請求の範囲第２４項に記載の精製されたヒトｖｈｈ−１タンパク質及 び薬学的に許容しうる担体を含有する薬学的組成物。 ４５． １以上の正常に機能する運動ニューロンの欠如に伴う異常に悩まされ ているヒト患者を治療するための方法であって、ヒト内の未分化運動ニューロン 前駆体細胞から運動ニューロンを発生させるのに効果的な請求の範囲第４１項、 第４２項、第４３項又は第４４項に記載の所定量の薬学的組成物を導入し、これ によって１以上の正常に機能する運動ニューロンの欠如に伴う異常に悩まされて いるヒト患者を治療することを具備した方法。 ４６． 神経退縮性疾患に悩まされているヒト患者を治療するための方法であ って、ヒト内の未分化前駆体細胞から運動ニューロンを発生させるのに効果的な 請求の範囲第４１項、第４２項、第４３項又は第４４項に記載の所定量の薬学的 組成物を導入し、これによって神経退縮性疾患に悩まされているヒト患者を治療 することを具備した方法。 ４７． 請求の範囲第４６項に記載の方法であって、未分化前駆体ニューロン からの運動ニューロンの発生が、慢性神経退縮性疾患を緩和する方法。 ４８． 請求の範囲第４７項に記載の方法であって、該慢性神経退縮性疾患が 筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）である方法。 ４９． 急性の神経系損傷に悩まされているヒト患者を治療する方法であって 、ヒト内の未分化運動ニューロン前駆体細胞から運動ニューロンを発生させるの に効果的な請求の範囲第４１項、第４２項、第４３項又は第４４項に記載の所定 量の薬学的組成物を導入し、これによって急性の神経系損傷に悩まされているヒ ト患者を治療することを具備する方法。 ５０． 該急性の神経系損傷が特異的な中枢軸索に局在化されている請求の範 囲第４９項に記載の方法であって、ヒト内の損傷された軸索に隣接して位置する 未分化の運動ニューロンから運動ニューロンを発生させるのに効果的な、ｖｈｈ −１タンパク質及び薬学的に許容しうる担体を含有した薬学的組成物の所定量の 外科的な移植、これによる特異的な中枢軸索に位置する急性の中枢神経系損傷を 緩和することを具備する方法。