ES2350626T3 - Inhibidor de la síntesis de adn que es producido en células senescentes. - Google Patents

Abstract

SE HA UTILIZADO UN VECTOR DE EXPRESION DE LA BIBLIOTECA ADNC DERIVADO DE CELULAS SENESCENTES PARA AISLAR CLONES DE ADNC QUE CODIFICAN LOS INHIBIDORES DE LA SINTESIS DE ADN. DICHOS INHIBIDORES TIENEN UNA FUNCION EN LA SENESCENCIA CELULAR, EL ENVEJECIMIENTO Y LA NEOPLASIA. LOS ACIDOS NUCLEICOS DE CONTRASENTIDO REDUCEN LA INHIBICION DE LA SINTESIS DEL ADN. LA INVENCION SE REFIERE A DICHAS MOLECULAS, SUS INHIBIDORES, ANTAGONISTAS Y DERIVADOS. LA INVENCION SE REFIERE TAMBIEN AL DIAGNOSTICO TERAPEUTICO E IN VITRO PARA LA UTILIZACION DE TODOS LOS CITADOS AGENTES.

Description

CAMPO DE LA INVENCIÓN:

La presente invención radica en el campo de la tecnología del ADN recombinante.

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ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN:

Las células diploides humanas normales tienen un potencial finito para el crecimiento proliferativo 10 (Hayflick, L. et al., Exp. Cell Res. 25:585 (1961); Hayflick, L., Exp. Cell Res. 37:614 (1965)). En efecto, en condiciones controladas las células humanas cultivadas in vitro pueden proliferar máximamente solamente hasta aproximadamente 80 duplicaciones de población cumulativa. 15 Se ha encontrado que el potencial proliferativo de tales células es una función del número de duplicaciones de población cumulativa que la célula ha experimentado (Hayflick, L. et al., Exp. Cell Res. 25: 585 (1961); Hayflick, L. et al., Exp. Cell Res. 37: 614 (1985)). Este 20 potencial también es inversamente proporcional a la edad in vivo del donante celular (Martin, G.M. et al., Lab. Invest. 23:86 (1979); Goldstein, S. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. (U.S.A.) 64:155 (1969); Schneider, E.L., Proc. Natl. Acad. Sci. (U.S.A.) 73:3584 (1976); LeGuilty, Y. et

25 al., Gereontologia 19:303 (1973)).

Se dice que las células que han agotado su potencial para el crecimiento proliferativo han experimentado "senescencia". La senescencia celular in vitro se

30 demuestra por medio de cambios morfológicos y está acompañada del fracaso de una célula para responder a factores de crecimiento exógenos. La senescencia celular, de este modo, representa una pérdida del potencial proliferativo de la célula. Aunque se ha propuesto una

35 variedad de teorías para explicar el fenómeno de la

senescencia celular in vitro, la evidencia experimental sugiere que la pérdida dependiente de la edad del potencial proliferativo puede ser función de un programa genético (Orgel, L.E., Proc. Natl. Acad. Sci. (U.S.A.)

49:517 (1963); De Mars, R. et al., Human Genet. 16:87 (1972); M. Buchwald, Mutat. Res. 44:401 (1977); Martin,

G.M. et al., Amer. J. Pathol. 74:137 (1974); Smith, J.R. et al., Mech. Age. Dev. 13:387 (1980); Kirkwood, T.B.L. et al., Theor. Biol. 53:481 (1975).

Los estudios de fusión celular con fibroblastos humanos in vitro han demostrado que el fenotipo quiescente de la senescencia celular es dominante sobre el fenotipo proliferativo (Pereira-Smith, O.M et al., Somat. Cell Genet. 8:731 (1982); Norwood, T.H. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. (U.S.A.) 71:223 (1974); Stein,

G.H. et al., Exp. Cell Res. 130:155 (1979)).

Se ha llegado a comprender el fenómeno de la senescencia a partir de estudios en los cuales se han fusionado células senescentes y jóvenes (esto es, no senescentes) para formar heterodicariones. Con el fin de inducir senescencia en el núcleo "joven" del heterodicarión (determinada por una inhibición de la síntesis de ADN), debe tener lugar la síntesis de proteínas en la célula senescente antes de la fusión (Burmer, G.C. y col., J. Cell Biol. 94:187 (1982); Drescher-Lincoln, C.K. y col., Exp. Cell Res. 144:455 (1983); Burmer, G.C. y col., Exp. Cell Res. 145:708 (1983); Drescher-Lincoln, C.K. y col., Exp. Cell Res.

153:208 (1984)).

Igualmente, se ha encontrado que la microinyección de ARNm de fibroblastos senescentes en fibroblastos jóvenes inhibe la capacidad de las células jóvenes para sintetizar ADN (Lumpkin, C.K. y col., Science 232:393 (1986)). Los investigadores han identificado ARNm exclusivos que son amplificados en células senescentes in vitro (West, M.D. y col., Exp. Cell Res. 184:138 (1989); Giordano, T. y col., Exp. Cell Res. 185:399 (1989)).

La célula endotelial diploide humana representa un tipo celular alternativo para el estudio de la senescencia celular, debido a que tales células remedan la senescencia celular in vitro (Maciag, T. y col., J. Cell Biol. 91:420 (1981); Gordon, P.B. y col., In Vitro

19:661 (1983); Johnson, A. y col., Mech. Age. Dev. 18:1 (1982); Thornton, S.C. y col., Science 222:623 (1983); Van Hinsbergh, V.W.M. y col., Eur. J. Cell Biol. 42:101 (1986); Nichols, W.W. y col., J. Cell Physiol. 132:453 (1987)).

Además, la célula endotelial humana es capaz de expresar una variedad de fenotipos funcionales y reversibles. La célula endotelial muestra varios fenotipos de diferenciación quiescentes y no terminales (Folkman, J. et al., Nature 288:551 (1980); Maciag, T. et al., J. Cell Biol. 94:511 (1982); Madri. J.A. et al., J. Cell Biol. 97:153 (1983); Montesano, R., J. Cell Biol. 99:1706 (1984); Montesano, R. et al., J. Cell Physiol.

34:460 (1988)).

Se ha sugerido que la ruta de diferenciación de células humanas in vitro implica la inducción de quiescencia celular mediada por citoquinas que inhiben la proliferación de las células endoteliales inducida por factores de crecimiento in vitro (Jay, M. y col., Science

288:882 (1985); Madri, J.A. y col., In Vitro 23:387 (1987); Kubota, Y. y col., J. Cell Biol. 107:1589 (1988); Ingber, D.E. y col., J. Cell Biol. 107:317 (1989)). Los inhibidores de la proliferación de células endoteliales funcionan también como reguladores de los acontecimientos transcripcionales tempranos inmediatos inducidos durante la diferenciación de las células endoteliales in vitro, que implica la formación del fenotipo tubular, semejante a un capilar, de las células endoteliales (Maciag, T., En: Imp. Adv. Oncol. (De Vita, V.T. y col., eds., J.B. Lippincott, Philadelphia, 42 (1990); Goldgaber, D. y col., Proc. Natl. Acad. Sci. (U.S.A.) 86:7606 (1990); Hla, T. y col., Biochem. Biophys. Res. Commun. 167:637 (1990)). Los inhibidores de la proliferación celular incluyen:

1. 1. Interleuquina-1a (IL-1a) (Montesano, R. y col.,

J. Cell Biol. 99:1706 (1984); Montesano, R. y col.,

J. Cell Physiol. 122:424 (1985); Maciag, T. y col., Science 249:1570-1574 (1990));

2.

Factor de necrosis tumoral (Frater-Schroder, M. y col., Proc. Natl. Acad. Sci. (U.S.A.) 84:5277 (1987); Sato, N. y col., J. Natl. Cancer Inst. 76:1113 (1986); Pber, J.P., Amer. J. Pathol. 133:426 (1988); Shimada, Y. y col., J. Cell Physiol. 142:31 (1990);

3.

Factor de crecimiento transformante-β (Baird, A. y col., Biochem. Biophys. Res. Commun. 138:476 (1986); Mullew, G. y col., Proc. Natl. Acad. Sci. (U.S.A.) 84:5600 (1987); Mairi, J.A. y col., J. Cell Biol. 106:1375 (1988));

4.

Interferon-gamma (Friesel, R. y col., J. Cell Biol.

104:689 (1987); Tsuruoka, N. y col., Biochem. Biophys. Res. Commun. 155:429 (1988)) y

5.

El promotor tumoral acido forbolmirístico (PMA) (Montesano, R. y col., Cell 42:469 (1985); Doctrow,

S.R. y col., J. Cell Biol. 104:679 (1987); Montesano, R. y col., J. Cell Physiol. 130:284

(1987); Hoshi, H. y col., FASAB J. 2:2797 (1988)).

La posibilidad de revertir la senescencia y restaurar el potencial proliferativo de las células tiene implicaciones en muchos campos de empeño. Muchas de las enfermedades de la tercera edad están asociadas con la perdida de este potencial. La restauración de esta capacidad tendrá implicaciones transcendentales para el tratamiento de esta enfermedad, de otros trastornos relacionados con la edad y del envejecimiento per se.

Además, la restauración del potencial proliferativo de las células cultivadas tiene utilizaciones en medicina y en la industria farmacéutica. La capacidad para inmortalizar células no transformadas puede ser utilizada para generar un suministro inacabable de ciertos tejidos y también de productos celulares.

La significación de la senescencia celular ha sido apreciada por consiguiente durante varios años (Smith, J.R., Cellular Ageing, En: Monographs in Developmental Biology; Sauer, H.W. (Ed.), S. Karger, New York, N.Y. 17:193-208 (1984); Smith, J.R. y col., Exper. Gerontol. 24:377-381 (1989)). Los investigadores han intentado clonar genes relevantes para la senescencia celular. Se ha reconocido una correlación entre la existencia de un inhibidor de la síntesis de ADN y el fenómeno de la senescencia celular (Spiering, A.I. y col., Exp. Cell Res. 179:159-167 (1988); Pereira-Smith, O.M. y col., Exp. Cell Res. 160:297-306 (1985); Drescher-Lincoln, C.K. y col., Exp. Cell Res. 153:208-217 (1984); Drescher-Lincoln, C.K. y col., Exp. Cell Res. 144:455-462 (1983)). Además, se ha identificado la abundancia relativa de ciertas moléculas de ARN asociadas con la senescencia (Lumpkin, C.K. y col., Science 232:393-395 (1986)).

Varios laboratorios han utilizado el método de selección por "sustracción diferencial" para identificar moléculas de ADNc derivadas de especies de ARN que están presentes preferentemente en células senescentes (Kleinsek, D.A., Age 12:55-60 (1989); Giordano, T. y col., Exp. Cell Res. 185:399-406 (1989); Sierra, F. y col., Molec. Cell Biol. 9:5610-5616 (1989); Pereira-Smith, O.M. y col., J. Cell Biochem. (Suplem. 0 (12 parte A)) 193 (1988); Kleinsek, D.A., Smith, J.R., Age 10:125 (1987)).

En un método, denominado selección por "sustracción diferencial" se crea una reserva de moléculas de ADNc a partir de células senescentes y posteriormente se hibridan a ADNc o a ARN de células en crecimiento con el fin de "eliminar por sustracción" aquellas moléculas de ADNc que sean complementarias a las moléculas de acido nucleico presentes en las células en crecimiento. Aunque útil para ciertos fines, el método de "sustracción diferencial" se ve afectado por el hecho de que no es posible determinar si una molécula de ADNc asociada con la senescencia esta asociada con la causa de la senescencia, o es producida como resultado de la senescencia. En efecto, se ha encontrado que muchas de las secuencias identificadas de esta manera codifican proteínas de la matriz extracelular. Sería poco probable que cambios en la expresión de tales proteínas causen senescencia.

COMPENDIO DE LA INVENCIÓN:

La presente descripción tiene que ver, en parte, con la observación de que las células humanas normales muestran un potencial replicativo limitado in vitro y llegan a ser senescentes después de un cierto número de divisiones. Cuando las células resultan senescentes, muestran varios cambios morfológicos y bioquímicos, tales como un aumento del tamaño celular, cambios de los componentes de la matriz extracelular, insensibilidad a la estimulación con mitógenos y la incapacidad para expresar genes reguladores del crecimiento.

La presente descripción hace referencia a la identificación de un inhibidor de la síntesis de ADN que es producido en células senescentes. Este inhibidor juega un papel crucial en la expresión del fenotipo senescente. El gen que codifica el inhibidor fue identificado mediante la incorporación de una biblioteca de ADNc de células senescentes a un vector de expresión de mamífero. La biblioteca de ADNc fue luego transfectada a células jóvenes, en ciclo, para identificar aquellos miembros de la biblioteca que supriman el inicio de la síntesis de ADN.

La transfección eficaz mediada por DEAE dextrano permitió el aislamiento de supuestas secuencias inhibidoras derivadas de células senescentes (SDI) en tres clones de ADNc distintos. La expresión de una de ellas (SDI-1) se incrementaba 20 veces en la senescencia celular, mientras que la de las otras (SDI-2 y SDI-3) permanecía constante.

En resumen, la presente descripción se refiere a la clonación de un inhibidor de la síntesis de ADN utilizando un ensayo funcional. Este método puede ser aplicado para clonar otros genes implicados en la regulación negativa del ciclo celular, tales como genes para la diferenciación específica de tejidos y para la supresión de tumores. Utilizando este método, se han clonado tres secuencias inhibidoras. Una de estas secuencias (SDI-1) parece estar estrechamente relacionada con la senescencia celular.

Con detalle, se describe en la presente memoria una molécula de acido nucleico que codifica una proteína o polipéptido capaz de inhibir la síntesis de ADN en una célula receptora.

En particular, dicha proteína o polipéptido es capaz de asociarse con una ciclina o una quinasa dependiente de ciclina, y especialmente cuando dicha ciclina es la ciclina D1, y dicha quinasa dependiente de ciclina es CDK2, especialmente cuando la expresión de dicha proteína

o polipéptido está regulada por un gen supresor de tumores.

La invención proporciona un fragmento del polipéptido SDI-1 del SEC ID NO 2: donde los residuos de aminoácido 72 a 164 son suprimidos, donde el fragmento inhibe la síntesis de ADN.

La invención incluye secuencias de nucleótidos que codifican tales fragmentos polipeptídicos de SDI-1.

Esta invención incluye adicionalmente un plásmido o vector de expresión que comprende una secuencia de nucleótidos de la invención.

La invención proporciona adicionalmente un fragmento anti-sentido de SDI-1 que consiste en:

1.

(a) la secuencia de nucleótidos del SEQ ID NO: 3;

2.

(b) los nucleótidos 1 a 127 de la hebra antisentido del SEQ ID NO: 1; o

3.

(c) los nucleótidos 1 a 319 de la hebra antisentido del SEQ ID NO: 1.

La invención proporciona adicionalmente un plásmido

o vector de expresión que comprende un fragmento antisentido de SDI-1 de la invención.

La invención también proporciona una composición farmacéutica que comprende un fragmento polipeptídico de la invención, una secuencia de nucleótidos de la invención, un fragmento antisentido de la invención, y un portador, excipiente o estabilizador fisiológicamente aceptable.

La invención también incluye el uso de un fragmento polipeptídico de la invención, una secuencia de nucleótidos de la invención, o un plásmido o vector de expresión de la invención en la fabricación de un medicamento para su uso en la inhibición de la síntesis de ADN en una célula receptora.

La invención proporciona adicionalmente el uso de un fragmento polipeptídico de la invención, una secuencia de nucleótidos de la invención o un plásmido o vector de expresión de la invención para la fabricación de un medicamento para tratar el glaucoma.

La invención proporciona adicionalmente el uso de un fragmento antisentido de la invención o un plásmido o un vector de expresión que comprende un fragmento antisentido de la invención, para la fabricación de un medicamento para su uso en la des-represión de la síntesis de ADN en una célula receptora.

BREVE DESCRIPCIÓN DE LAS FIGURAS

La Figura 1 muestra la estructura de la clonación de ADNc y el vector de expresión pcDSRαΔ (B representa un sitio de BamHI). La Figura 2A, 2B y 2C identifican los clones de ADNc inhibidores de la síntesis de ADN en células jóvenes. Las barras diferentes representan experimentos de transfección independientes para plásmidos individuales, * indica no realizado, un número negativo indica índices de marcaje mayores que los controles. Cada gráfico muestra los resultados de una reserva de plásmidos diferente. La Figura 3 muestra la transfección de ADNc de SDI antisentido. Se construyeron plásmidos de expresión de ADNc antisentido y se cotransfectaron con pCMVβ en células jóvenes. Calle 1: pcDSRαΔ control, calle

2: pcDSRαΔ-SDI-1, calle 3: pcDSRαΔ-antiSDI-1, calle

4: pcDSRαΔ-SDI-2, calle 5: pcDSRαΔ-antiSDI-2. La Figura 4 muestra los cambios en la recuperación de ARN poli A+ a partir del ARN total durante el envejecimiento celular. Las Figuras 5A-5D proporcionan las secuencias de nucleótidos y de aminoácidos del ADNc de SDI-1. La Figura 6 muestra la cinética de la inducción de SDI-1 en células jóvenes (28 duplicaciones de la población) obtenidas después de la exposición a 4 Gy de irradiación γ (círculos abiertos) o peróxido de hidrógeno 400 µM durante 1 hora (círculos cerrados).

DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LA INVENCIÓN

I. Senescencia celular

La senescencia replicativa de fibroblastos diploides humanos normales en cultivo es un modelo de envejecimiento celular bien establecido y ampliamente aceptado (Hayflick, L., Exp. Cell Res. 37:611-636 (1965); Norwood, T.H. y Smith, J.R., En: Handbook of the Biology of Aging (2a ed.) C.E. Finch y E.L. Schneider, eds. Van Nostrand, Nueva York, pp. 291-311 (1985); Goldstein, S., Science 249:1129-1133 (1990)). Después de un número limitado de duplicaciones de la población, cuando las células se convierten en senescentes, pierden la capacidad para dividirse y muestran una morfología grande y aplanada. Los mecanismos subyacentes causantes de este fenómeno no son todavía conocidos, a pesar de las muchas observaciones que caracterizan las células senescentes a niveles bioquímicos y moleculares.

Los análisis de las proteínas en geles de una dimensión y bidimensionales han revelado que existen pocas proteínas marcadoras específicas de las células senescentes (Lincoln, D.W. y col., Exp. Cell Res. 154:136-146 (1984); Wang, E., J. Cell Biol. 100:545-551 (1985); Scottie, J. y col., J. Cell Physiol. 131:210-217 (1987); Bayreuther, K. y col., Proc. Natl. Acad. Sci. (U.S.A.) 85:5112-5116 (1988)). Se han encontrado determinantes antigénicos en la membrana plasmática que son específicos de las células senescentes (Porter, M.B. y col., J. Cell Physiol. 142:425-433 (1990)). Se ha encontrado que componentes de la matriz extracelular, tales como fibronectina y colagenasa, están expresados al alza en las células senescentes (West, M.D. y col., Exp. Cell Res. 184:138-147 (1989); Kumazaki, T. y col., Exp. Cell Res. 195:13-19 (1991)). Sin embargo, no esta clara la relevancia de estas observaciones para la senescencia celular.

Se ha encontrado que el ciclo celular está regulado y dirigido por factores de crecimiento. Los factores de crecimiento actúan en toda la primera fase de intervalo (G1) de ciclo celular uniéndose a receptores específicos de la superficie celular, que a su vez desencadenan cascadas de señalización que rigen por último la transcripción de los genes de respuesta temprana inmediata y retardada. El ciclo de crecimiento está controlado por quinasas, especialmente "quinasas dependientes de ciclina" ("CDK"), por la propias "ciclinas", y por fosfatasas (Sherr, C.J., Cell 73:10591065 (1993)).

Se ha dedicado un esfuerzo considerable a identificar quinasas de mamíferos que estén implicadas en el ciclo de síntesis del ADN. En células de vertebrados, se ha identificado una familia de ciclinas (véase, Xiong,

Y. et al., Cell 71:505-514 (1992)). Se han aislado secuencias génicas que codifican varias de estas ciclinas (Motokura, T. et al., Nature 350:512-515 (1991); Xiong,

Y. et al., Cell 65:691-699 (1991); Lew, D.J. et al., Cell 65:1197-1206 (1991); Xiong, Y. et al., Curr. Biol. 1:362364 (1991); Matsushime, H. et al., Cell 65:701-7139 (1991); Inaba, T. et al., Genomics 13:565-574 (1992); Xiong, Y. et al., Genomics 13:575-584 (1992)).

Las ciclinas D interaccionan con CDK2, CDK4 y con CDK5, con el fin de iniciar el ciclo de crecimiento en la fase G1 (Matsushime, H. et al., Cell 65:701-7139 (1991); Sherr, C.J., Cell 73:1059-1065 (1993)). Las interacciones de ciclina E/CDK2 regulan el inicio de la fase S (Lew,

D.J. et al., Cell 66:1197-1206 (1991); Koff, A. et al., Cell 66:1217-1228 (1991)). Se ha sugerido que la ciclina A interacciona con CDK2 para regular la fase S del ciclo de crecimiento (Sherr, C.J., Cell 73:1059-1065 (1993)). Se cree que las ciclinas A y B interaccionan con CDC2 para mediar la terminación de la fase S y el inicio de la fase G2 (Norbury, C. et al., Ann. Rev. Biochem. 61:441470 (1992); Fang, F. et al., Cell 66:731-742 (1991); Walker, D.H. et al., Nature 354:314-317 (1991).

Recientemente, se han identificado cambios en la expresión de varios genes reguladores del crecimiento. Se ha encontrado que la expresión de c-fos, cdc2, ciclina A y B esta alterada en las células senescentes (Seshadri,

T. y Campisi, J., Science 247:205-209 (1990)). De manera similar, las células senescentes evidencian una incapacidad para fosforilar la proteína del retinoblastoma (Stein, G.H. y col., Science (1990)). Estas observaciones podrán explicar potencialmente la incapacidad de las células para entrar en la fase S, ya que son todos cambios deteriorativos de la expresión de los genes que estimulan el crecimiento; sin embargo no está claro si son la causa o el resultado de la senescencia.

Un cambio adicional en la expresión génica que podrá tener un papel causal en la senescencia es el(los) inhibidor(es) de la síntesis de ADN producido(s) por fibroblastos senescentes pero no por fibroblastos jóvenes (ver, Spiering, A.I. y col., Exp. Cell Res. 195:541-545 (1991)). La evidencia de la existencia del(los) inhibidor(es) fue obtenida primeramente a partir de experimentos con heterocariones en los que las células senescentes inhibían el inicio de la síntesis de ADN en los núcleos jóvenes dentro del heterocarión (Norwood,

T.H. y col., Proc. Natl. Acad. Sci. (U.S.A.) 71:2231-2234 (1974); Pereira-Smith, O.M. y Smith, J.R., Somat. Cell Genet. 8:731-742 (1982)). Estudios con cíbridos en los que estaban implicados citoplastos senescentes y células jóvenes completas proporcionaron un apoyo adicional a la presencia de una proteína asociada a la membrana superficial inhibidora de la síntesis de ADN en células senescentes (Drescher-Lincoln, C.K. y Smith, J.R., Exp. Cell Res. 153:208-217 (1984)). Esto fue demostrado directamente cuando se encontró que preparaciones enriquecidas en membranas superficiales procedentes de células senescentes o proteínas extraídas de las membranas inhibían la síntesis de ADN cuando eran añadidas al medio de cultivo de células jóvenes (Pereira-Smith, O.M. y col., Exp. Cell Res. 160:297-306 (1985); Stein, G.H. y Atkins, L., Proc. Natl. Acad. Sci. (U.S.A.) 83:9030-9034 (1986)). La purificación de ese inhibidor por métodos bioquímicos no ha tenido éxito hasta la fecha. Sin embargo, en experimentos de microinyección, se ha demostrado la presencia de una abundancia elevada de ARN mensajero inhibidor de la síntesis de ADN (Lumpkin,

C.K. y col., Science 232:393-395 (1986)).

Con el fin de intentar clonar el(los) gen(es) que codifica(n) el(los) inhibidor(es) de la síntesis de ADN, se empleó un procedimiento de selección funcional. Este método condujo al aislamiento e identificación de tres especies de ADNc que mostraban actividad inhibidora de la síntesis de ADN cuando eran introducidas en células jóvenes que estaban en ciclo. Estas moléculas son una clase preferidas de las moléculas referidas en la presente como "inhibidores derivados de células senescentes" ("SDI").

Después de la clonación, el aislamiento, la secuenciación y la caracterización de las moléculas de SDI de acuerdo con la descripción (véase, por ejemplo la Publicación de la Solicitud PCT Núm. US93/12251), otros grupos de investigadores realizaron esfuerzos similares. Tales esfuerzos posteriores han descrito la molécula SDI descrita en la presente memoria como WAF1, CIP1, PIC1 y p21 (Harper, J.W. et al., Cell 75:805-816 (1993); El-Deiry, W.S. et al., Cell 75:817-825 (1993); Xiong, Y. et al., Nature 366:701-704 (1993); Hunter, T. et al., Cell 75:839-841 (1993)).

II. Clonación de los inductores de la senescencia celular

De acuerdo con la práctica de la presente invención, se emplea preferiblemente un método eficaz para la clonación molecular de las secuencias inhibidoras de la síntesis de ADN presentes en fibroblastos diploides humanos senescentes. Como es a menudo el caso cuando se intenta clonar genes biológicamente importantes, puede no ser posible purificar un gen deseado responsable de la senescencia celular, incluso aunque la actividad de sus productos pueda ser fácilmente detectada.

Un método que podría ser concebido para identificar tal secuencia génica sería emplear un ensayo de selección diferencial o sustractiva de una biblioteca de ADNc derivada de células senescentes. Este método ha sido utilizado para identificar moléculas de ADNc que están expresadas en exceso en células de pacientes con el Síndrome de Werner (Murano, S. y col., Molec. Cell Biol. 11:3905-3914 (Agosto de 1991)). El Síndrome de Werner es un raro trastorno heredado. Se caracteriza por envejecimiento prematuro. Se desconoce la relevancia del Síndrome de Werner para el envejecimiento natural.

Desafortunadamente, tales ensayos de selección identificarán un número de genes que, aunque importantes para la caracterización de células senescentes, no serán responsables primariamente de la senescencia. Además, las limitaciones técnicas para clonar ADNc de longitud completa hacen difícil determinar la función de los genes clonados por estos métodos. Por estas razones, tales métodos diferenciales no son generalmente adecuados ni son el método más deseable para identificar secuencias

génicas relacionadas con la senescencia.

En contraste, un ensayo de selección por expresión proporciona un método preferido para identificar y aislar tales secuencias génicas relacionadas con la senescencia. En tal método de selección, el ADNc es clonado directamente en un vector que es capaz de expresar el gen clonado en una célula receptora. Las células receptoras pueden ser sometidas a selección directamente por inhibición de la síntesis de ADN.

En los ensayos de selección por expresión, la etapa más importante es la síntesis de los ADNc. Las enzimas deben ser elegidas cuidadosamente para que estén libres de impurezas. La síntesis de ADNc se repite preferiblemente varias veces para asegurar la obtención de resultados satisfactorios (esto es, una transcripción inversa fiable y un tamaño del transcrito de longitud completa). Finalmente, los productos de ADNc son preferiblemente fraccionados por tamaño para eliminar productos de ADNc fragmentados y terminados prematuramente. Los productos de ADNc de doble hebra son posteriormente divididos preferiblemente en fracciones basadas en el tamaño, esto es, fracciones de 0,5-2,0, 2,0-4,5 y 4,5-10 kb. La fracción de ADNc de 2-4,5 kb fue utilizada para construir la biblioteca de ADNc, suponiendo que muchas proteínas asociadas a la membrana tienen un peso molecular relativamente elevado. Los ADNc son insertados en un vector de expresión adecuado, preferiblemente pcDSRαΔ, en el cual las secuencias insertadas pueden ser transcritas a niveles elevados en células jóvenes.

El procedimiento de transfección más preferido es la transfección mediada por DEAE dextrano, llevada a cabo bajo condiciones que permiten la expresión transitoria en un porcentaje elevado de células jóvenes que están en ciclo. Debido a que las frecuencias de transfección podrían variar de experimento a experimento, los plásmidos con el conjunto de los ADNc fueron transfectados junto con un plásmido marcador, tal como pCMVβ (que codifica β-galactosidasa), y el índice de marcaje fue analizado solamente en las células βgalactosidasa positivas. Generalmente, la coexpresión de genes transfectados es bastante elevada, ya que las células competentes para la transfección aceptarán múltiples plásmidos. Este sencillo método de cotransfección permitió la evaluación de la síntesis de ADN en células que expresaban ADN exógeno.

La cantidad de plásmido que iba a ser cotransfectado fue determinada fácilmente a partir de experimentos piloto. Cuando se examina la correlación entre la frecuencia de transfección y la cantidad de plásmido añadida utilizando un plásmido marcador, se obtiene una eficacia máxima en un rango de 100-500 ng de plásmido. Teniendo en cuenta este resultado, la biblioteca de ADNc es dividida preferiblemente en pequeños grupos, conteniendo cada grupo cinco clones plasmídicos independientes. Posteriormente se lleva a cabo la cotransfección con 100 ng aproximadamente de pCMVβ y 400 ng aproximadamente de plásmido con ADNc. Se encontró que estos parámetros maximizaban la coexpresión de ADNc en células β-galactosidasa positivas sin disminuir la frecuencia de transfección del plásmido marcador.

Después de la segunda ronda de selección, pudieron aislarse con éxito plásmidos individuales que mostraban una potente inhibición de la síntesis de ADN del grupo que resultó positivo durante los ensayos de selección de la primera ronda (Figuras 2A, 2B, 2C). En las Figuras 2A, 2B y 2C, grupos de ADNc que resultaron positivos en los ensayos de selección de la primera ronda fueron divididos en plásmidos individuales y transfectados de nuevo. Para cada grupo de ADNc (A, B y C en las Figuras 2A, 2B, 2C, respectivamente), el plásmido Núm. 1 a 5 representa el resultado de la transfección de cada plásmido individual. En el grupo B, se encontró que el plásmido Núm. 1 era solamente el vector vacío. Las actividades inhibidoras de los plásmidos son preferiblemente confirmadas posteriormente mediante experimentos de microinyección nuclear. Tales experimentos proporcionan una evidencia más directa de que los plásmidos aislados contienen secuencias capaces de inhibir la síntesis de ADN.

III. Las moléculas descritas en la presente memoria

Los agentes descritos en la presente memoria (referidos colectivamente como "moléculas SDI") son capaces de inducir la inhibición de la síntesis de ADN en células activas, o de suprimir tal inhibición en células senescentes o quiescentes. Como tales, pueden ser utilizados para un amplio rango de terapias y aplicaciones.

Las moléculas SDI descritas en la presente memoria incluyen moléculas de ácido nucleico de SDI (p. Ej., moléculas de ácido nucleico que codifican SDI-1, moléculas que codifican un fragmento de SDI-1, moléculas que codifican una fusión de SDI-1, moléculas antisentido de SDI, moléculas represoras de triples de SDI, etc.), moléculas de proteínas de SDI (esto es SDI-1, y sus fusiones y fragmentos, anticuerpos para tales moléculas, y análogos de proteínas y miméticos de tales moléculas), y miméticos no proteicos y análogos de tales moléculas.

Tales moléculas pueden ser de origen natural o de origen no natural. Una molécula SDI-1 de origen natural puede ser purificada, de manera que se separan una o más moléculas que están o pueden estar presentes en una preparación de origen natural que contiene la molécula o está presente a una concentración inferior a la cual se podría encontrar normalmente.

Las moléculas pueden ser ácidos nucleicos, proteínas, carbohidratos, o, más preferiblemente, moléculas orgánicas que tienen una estructura terciaria que se asemeja o remeda la estructura de una molécula de proteína SDI. Adicionalmente se describe en la presente memoria el uso de fragmentos de moléculas biológicamente activos, tales como moléculas de ácido nucleico SDI, moléculas de proteínas SDI, etc. en lugar de o además de cualquier molécula SDI de origen natural. Según se utiliza en la presente memoria, se dice que una molécula es "biológicamente activa" con respecto a la proliferación celular si es capaz de mediar un efecto sobre la capacidad proliferativa de una célula receptora. Semejante actividad biológica puede ser un atributo estructural, tal como la capacidad para mediar la represión anti-sentido, o la capacidad para unirse a un sitio concreto del ácido nucleico, o con un sitio activo concreto de una proteína, receptor, etc. (o Para computer con otra molecular por tal unión). Alternativamente, tal atributo puede ser catalítico, y hacer participar la capacidad de la molécula biológicamente activa para mediar en una reacción química o una respuesta a una célula receptora.

La presente descripción permite el aislamiento de todas estas moléculas SDI en una forma "purificada". Según se utiliza en la presente memoria, se dice que una molécula es "purificada" si está presente en una preparación que carece de una molécula que está asociada normalmente con la molécula SDI en su estado natural. Las proteínas, lípidos, secuencias de ácido nucleico que no codifican moléculas SDI son ejemplos de moléculas que están asociadas naturalmente con moléculas SDI.

A. Moléculas de Ácido Nucleico SDI y sus Oligonucleótidos

o Fragmentos Polinucleotídicos

Una clase preferida de moléculas de ácido nucleico de SDI incluye las moléculas de ácido nucleico: SDI-1, SDI-2, y SDI-3, y sus fragmentos biológicamente activos. Para identificar tales fragmentos, las moléculas de ácido nucleico SDI pueden ser escindidas, mediante métodos mecánicos o más preferiblemente escisión con endonucleasas de restricción para generar de ese modo fragmentos candidato. Tales fragmentos pueden ser suministrados a las células, y controlados en cuanto a su capacidad para inhibir la síntesis de ADN. En una realización, las secuencias génicas que codifican fragmentos de moléculas SDI proteicas pueden ser administradas a una célula receptora.

Administrando fragmentos de moléculas SDI de ácido nucleico (con o sin secuencias conectadas) es posible evaluar si un fragmento concreto de una molécula de ácido nucleico SDI tiene actividad biológica debida a su estructura. De este modo, por ejemplo, tales moléculas SDI candidato podrían ser introducidas en una célula normal, inmortalizada, o tumoral, y se puede controlar la capacidad de la célula para experimentar una proliferación adicional. De esta manera, se pueden identificar secuencias que reprimen la proliferación celular, o inducen quiescencia.

A través del uso de tales métodos, se han encontrado moléculas de ácido nucleico que codifican la mitad amino terminal de SDI-1 para mostrar una capacidad para convertir células inmortalizadas o células tumorales a un estado quiescente. Más específicamente, se ha encontrado que las moléculas de ácido nucleico que codifican los residuos de aminoácido 1-70 de SDI-1 son capaces de inducir quiescencia celular. El reconocimiento de que los residuos 1-70 contienen un dominio catalítico de SDI-1 indica que otros fragmentos de la secuencia codificante de SDI-1 tienen actividad catalítica. Los fragmentos oligonucleotídicos candidato preferidos incluyen moléculas de ácido nucleico que codifican los residuos de aminoácido: 5-70, 10-70, 15-70, 20-70, 25-70, 30-70, 3570 o 40-70.

Como se comenta más abajo, un aspecto de la presente descripción tiene que ver con los métodos para determinar el nivel de ARNm de SDI-1. Las moléculas de ácido nucleico que son capaces de hibridar con moléculas de ácido nucleico SDI pueden ser utilizadas para dichos fines diagnósticos. Como se utiliza en la presente memoria, se dice que dos moléculas de ácido nucleico son capaces de hibridar entre sí si las dos moléculas son capaces de formar una estructura de ácido nucleico de doble hebra, anti-paralela. Se dice que las moléculas son "mínimamente complementarias" si pueden hibridar entre sí con una estabilidad suficiente para permitirles permanecer hibridadas entre sí al menos en condiciones de "baja restricción" convencionales. De un modo similar, se dice que las moléculas son "complementarias" si pueden hibridar entre sí con suficiente estabilidad para permitirles permanecer hibridadas entre sí en condiciones de "elevada restricción" convencionales. Como se apreciará, las moléculas complementarias no necesitan mostrar una "complementariedad completa" (esto es donde cada nucleótido de una de las moléculas es complementario a un nucleótido de la otra), si no que necesita solamente tener una secuencia suficientemente complementaria para que sea capaz de formar una estructura de doble hebra estable a concentraciones de disolvente y sal definidas. Se dice que una molécula de ácido nucleico es el "complemento" de otra molécula de ácido nucleico si muestran una complementariedad completa. Las condiciones restrictivas convencionales son descritas por Sambrook, J., et al., (En: Molecular Cloning, a Laboratory Manual, 2a Edición, Cold Spring Harbor Press, Cold Spring Harbor, Nueva York (1989)), y por Haymes, B.D., et al. (En: Nucleic Acid Hybridization, A Practical Approach, IRL Press, Washington, DC (1985))). Por lo tanto son permisibles desviaciones de la complementariedad completa, con tal que tales desviaciones no excluyan completamente la capacidad de las moléculas para formar una estructura de doble hebra.

Las moléculas de ácido nucleico que se pueden utilizar para hibridar con una molécula de ácido nucleico SDI serán preferiblemente mas cortas que tal molécula SDI. Las moléculas preferidas serán completamente complementarias a una molécula de ácido nucleico SDI, y tendrán una longitud entre aproximadamente 15 a aproximadamente 250 nucleótidos, y muy preferiblemente aproximadamente 15 a aproximadamente 30 nucleótidos.

Tales moléculas de ácido nucleico pueden ser obtenidas utilizando métodos sintéticos de oligonucleótidos en fase sólida, no obstante, más preferiblemente, tales moléculas se obtendrán por medio de la prolongación de una molécula cebadora dependiente de un molde, mediada por polimerasa, que sea complementaria a un fragmento de una molécula de ácido nucleico SDI. Tales fragmentos de moléculas de ácido nucleico SDI tendrán una longitud de entre aproximadamente 15 a aproximadamente 250 nucleótidos, y muy preferiblemente de aproximadamente 15 a aproximadamente 30 nucleótidos. Dichos fragmentos pueden ser ADN o ARN, y se pueden incorporar a vectores, o estar esencialmente libres de otras moléculas de ácido nucleico.

B. Las Proteínas y Polipéptidos Codificados por Moléculas de Ácidos Nucleicos SDI

Adicionalmente se describen aquí las proteínas y polipéptidos codificados por las moléculas de ácido nucleico SDI o sus fragmentos oligonucleotídicos. Las secuencias de moléculas de ácido nucleico SDI permiten atribuir e identificar una proteína codificada y moléculas de polipéptido que pueden ser utilizadas para suprimir la inhibición de la síntesis de ADN asociada con la quiescencia y la senescencia, o para introducir tales estados en células en proliferación. La secuencia de aminoácidos de tales moléculas puede ser fácilmente obtenida de la relación conocida entre la secuencia de nucleótidos de una molécula de ácido nucleico, y la secuencia de aminoácidos de la proteína que codifica. Las proteínas y polipéptidos terapéuticamente activos pueden ser identificados utilizando un método que es análogo al método descrito antes para identificar fragmentos de ácido nucleico SDI terapéuticamente activos. Mutando tales proteínas, es posible identificar moléculas que han perdido la capacidad de inhibir la síntesis de ADN. Entre tales moléculas mutadas habrá proteínas que sean capaces de ejercer un efecto dominante suficiente para revertir el efecto inhibidor de las proteínas y polipéptidos

codificados por SDI.

En una realización, tales moléculas se identifican escindiendo moléculas SDI de ácido nucleico, e incorporando después los fragmentos de la escisión a vectores de expresión traducibles. De esta manera, se puede obtener y evaluar una biblioteca de moléculas de ácido nucleico, que producen cada una un fragmento peptídico diferente. Semejante expresión puede estar libre de proteínas extrañas o adicionales, o puede comprender una fusión de un fragmento SDI a una proteína de fusión concreta. La actividad biológica de las proteínas expresadas puede ser evaluada introduciendo tales fragmentos en células receptoras, y determinando el efecto de tal introducción sobre la quiescencia o la proliferación. Alternativamente, tales moléculas se pueden hacer pasar a través de columnas que han sido pretratadas para unirse a moléculas SDI biológicamente activas. Tales columnas pueden contener, por ejemplo, p53, SDI-1, RB, ciclina D, cdk2, etc., unidas con el fin de identificar los fragmentos que tienen la capacidad de unirse a tales moléculas.

Los ejemplos de las moléculas SDI fragmentos de proteína incluyen los primeros 70 aminoácidos de SDI-1, que tienen una actividad biológica similar a la de SDI-1. También se pueden emplear fragmentos más pequeños (tales como aquellos que contienen los residuos de SDI-1: 5-70, 10-70, 15-70, 20-70, 25-70, 30-70, 35-70 o 40-70). Son particularmente deseables fragmentos de proteína que poseen los residuos de aminoácido de SDI-1 29-45. Cuando se consideran sustituciones de aminoácidos conservados, esta región de SDI-1 muestra una identidad de 31% y una similitud de 62% con PCNA. Puesto que SDI-1 y PCNA interaccionan ambos con complejos de ciclina-Cdk, se considera que la región conservada en común (residuos de aminoácido de SDI-1 29-45) está implicada en tales interacciones. Por tanto, los fragmentos de SDI-1 que contienen esta región conservada comprenden inhibidores de SDI-1, y pueden mostrar en efecto función SDI-1.

Típicamente, las proteínas y los fragmentos de proteínas SDI serán producidos libres de cualquier residuo de aminoácido adicional. Alternativamente, las proteínas y fragmentos de proteínas SDI pueden ser producidos fusionados a un aminoácido o a un polipéptido. Semejante síntesis se puede completar utilizando medios sintéticos de péptidos convencionales, o, más preferiblemente, utilizando métodos recombinantes. Cuando se desean moléculas de fusión, tales moléculas pueden contener sitios de escisión seleccionables de manera que la porción SDI de la molécula de fusión puede ser escindida de la porción o las porciones restantes de la proteína de fusión.

Una molécula de fusión particularmente preferida resulta de fusionar una secuencia de unión de glutatión S-transferasa glutatión al extremo amino de la molécula SDI. Tales proteínas de fusión pueden ser fácilmente recuperadas por medio de su retención en una columna. La proteína de fusión puede ser separada de la columna lavando con glutatión. Se puede producir una proteína de fusión GST-SDI-I mediante síntesis peptídica, por ejemplo sintetizando la proteína SDI como una fusión con glutation S-transferasa. Alternativamente, se pueden utilizar métodos de ADN recombinante para unir un polinucleótido que codifica GST a un polinucleótido que codifica SDI-1 o uno de sus fragmentos. La secuencia de la glutation S-transferasa (GST) es conocida, y los vectores que contienen esta secuencia han sido descritos (véanse, Ross, V.L., et al., Biochem, J. 294:373-380 (1993); Comstock, K.E. et al., J. Biol. Chem. 268:1695816965 (1993); Takahasi, Y. et al., J. Biol. Chem. 268:8893-8898 (1993); Klone, A. et al., Biochem. J. 285:925-928 (1992); Sternberg, G. et al., Protein Express. Purif. 3:80-84 (1992); Morrow, C.S. et al., Gene 75:3-12 (1989)).

Una molécula de fusión preferida alternativa tiene una secuencia líder [His]6 amino terminal. La presencia de tales secuencias líder no reduce sustancialmente la actividad de las proteínas SDI. Más preferiblemente, se empleará una secuencia líder que tenga la secuencia MRGSHHHHHHGA [SEQ ID NO: 4] acoplada a la metionina amino terminal de SDI-1.

Una fusión preferida incluye esencialmente toda la proteína GST. Una fusión especialmente preferida emplea la GST de Schistosoma japonicum. La secuencia de esta GST es descrita por Smith et al (Gene 67:31 (1988)), y el polinucleótido que codifica esta GST puede ser obtenido comercialmente (pGEX-2T; Pharmacia). La secuencia de ADN que codifica la GST de Schistosoma japonicum se muestra como SEQ ID NO: 5; la secuencia de aminoácidos codificada se muestra en el SEQ ID NO: 6. Se puede utilizar cualquiera de una variedad de métodos para crear tal fusión preferida; se proporciona un método detallado en el Ejemplo 20. En una realización, se puede utilizar un sitio de reconocimiento para una endonucleasa de restricción en el polinucleótido que codifica la GST de Schistosoma japonicum para escindir ese polinucleótido. El producto de la escisión puede ser ligado después a un polinucleótido que codifica una molécula SDI deseada. De este modo, por ejemplo, se puede elaborar una fusión preferida escindiendo la secuencia que codifica GST de Schistosoma japonicum con BamHI con el fin de obtener un fragmento polinucleotídico que contiene los nucleótidos 1-673 del polinucleótido que codifica la GST (escindiendo BamHI en un sitio localizado en los nucleótidos 673-678 de la molécula) y ligando después ese fragmento a una secuencia génica de SDI (tal como un polinucleótido que codifica SDI-1). Cuando, por ejemplo, se emplea un polinucleótido que codifica SDI-1, la fusión génica conectaría el fragmento de GST al polinucleótido SDI-1 de manera que, tras la expresión, se produciría una proteína de fusión que contendría los primeros 226 aminoácidos de los 332 de GST conectados al extremo amino de SDI-1.

Como se discute más abajo, un aspecto de la presente descripción tiene que ver con anticuerpos para SDI-1. Las proteínas y polipéptidos descritos antes se pueden utilizar para lograr anticuerpos policlonales o monoclonales que pueden ser utilizados de acuerdo con los métodos descritos en la presente memoria.

C. Análogos Funcionales de las Moléculas SDI

La presente descripción también está relacionada con "análogos funcionales" de las moléculas SDI. Tales análogos incluyen tanto "análogos clásicos" como "análogos miméticos". Un análogo clásico de una molécula SDI es aquél que tiene una actividad biológica similar, y está químicamente relacionado con la molécula SDI. A modo de ilustración, una proteína mutante de origen no natural que tenga actividad SDI comprendería un análogo clásico de una molécula SDI proteica. De un modo similar, una molécula de ácido nucleico SDI mutada comprendería un ejemplo de un análogo clásico de una secuencia génica de SDI. Del mismo modo, una molécula SDI aislada de una especie de mamífero no humano (tal como un ratón, mono, etc.) comprendería un ejemplo de un análogo clásico de una secuencia génica de SDI. Por el contrario, un "análogo mimético" de una molécula SDI conserva la actividad biológica de la molécula, pero típicamente no estará relacionado químicamente. Una molécula orgánica cuya estructura remeda el sitio activo de una proteína SDI comprendería un "análogo mimético" de esa proteína. De un modo similar, las moléculas que no son de ácido nucleico capaces de unirse a un sitio de unión de ácido nucleico de SDI, o reconocidas por SDI serían un análogo mimético de esa molécula.

De este modo, los análogos funcionales pueden ser un oligonucleótido o un polinucleótido, un compuesto proteináceo (incluyendo proteínas tanto glicosiladas como no glicosiladas), o un compuesto no proteináceo (tal como un esteroide, un glicolípido, etc.) siempre que el agente remede la función de una molécula de ácido nucleico SDI completa, o un fragmento oligonucleotídico o polinucleotídico del mismo, o una proteína o polipéptido codificados por semejante molécula o fragmento. Los análogos clásicos preferidos incluyen polipéptidos (incluyendo péptidos circulares así como lineales) cuyas secuencias comprenden los sitios catalíticos o de unión activos de una proteína SDI, o fragmentos oligonucleotídicos de moléculas SDI de ácido nucleico que son capaces de reprimir o inducir la actividad SDI. Los análogos miméticos preferidos incluyen polipéptidos que no son fragmentos de una proteína SDI, o sus mutantes, pero sin embargo muestran una capacidad de inducción de la quiescencia de una manera similar a SDI, o de inducción de la proliferación celular como un antagonista de SDI.

Los análogos clásicos pueden ser identificados o bien racionalmente, como se describe más abajo, o bien a través de métodos establecidos de mutagénesis (véase, por ejemplo, Watson, J.D. et al., Molecular Biology of the Gene, Cuarta Edición, Benjamin/Cummings, Menlo Park, CA (1987). Significativamente, un enfoque de mutagénesis al azar no requiere una información a priori a cerca de la secuencia génica que se va a mutar. Este enfoque tiene la ventaja de que evalúa el deseo de un mutante concreto basándose en su función, y por tanto no requiere una comprensión de cómo o por qué la proteína mutante resultante ha adoptado una conformación concreta. En efecto, la mutación al azar de secuencias génicas diana ha sido un enfoque utilizado para obtener proteínas mutantes que tienen las características deseadas (Leatherbarrow, R.J. Prot. Eng. 1:7-16 (1986); Knowles, J.R., Science 236:1252-1258 (1987); Shaw, W.V., Biochem.

J. 246:1-17 (1987); Gerit, J.A. Chem. Rev. 87:1079-1105 (1987)). Alternativamente, cuando se desea una alteración de una secuencia concreta, se pueden emplear métodos de mutagénesis dirigida al sitio. De este modo, se pueden utilizar dichos métodos para alterar selectivamente solamente aquellos aminoácidos de la proteína que se cree que son importantes (Craik, C.S., Science 228:291-297 (1985); Cronin, C.S. et al., Biochem. 27:4572-4579 (1988); Wilks, H.M. et al., Science 242:1541-1544 (1988)).

Se pueden evaluar los análogos de ácido nucleico de las moléculas SDI en cuanto a su capacidad para ser reguladas por p53, u otros reguladores celulares. Alternativamente, se puede analizar directamente su capacidad para afectar a la proliferación celular. Para los análogos de proteínas de SDI tales estudios se pueden completar purificando la proteína mutante, y comparando su actividad con una molécula SDI. El análisis de tales mutantes también puede ser facilitado por medio del uso de un sistema de escrutinio de ligandos de proteínas de presentación en fagos (Lowman, H.B. et al., Biochem. 30:10832-10838 (1991); Markland, W. et al., Gene 109:1319 (1991); Roberts, B.L. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. (EEUU) 89:2429-2433 (1992); Smith, G.P., Science 228:1315-1317 (1985); Smith, R.P. et al., Science 248:1126-1128 (1990)). En general, este método implica expresar una proteína de fusión en la cual el ligando de proteína deseado está fusionado al extremo C de una proteína de la envoltura viral (tal como la proteína de la envoltura del Gen III de M13, o una proteína de la envoltura de lambda).

Los análogos miméticos de las moléculas SDI de origen natural se pueden obtener utilizando los principios del diseño de fármacos convencional o racional (Andrews, P.R. et al., En: Proceedings of the Alfred Benzon Symposium, volumen 28, págs. 145-165, Munksgaard, Copenhagen (1990); McPherson, A. Eur. J. Biochem. 189:124 (1990); Hol, W.G.J. et al., En: Molecular Recognition: Chemical and Biochemical Problems, Roberts, S.M. (ed.); Royal Society of Chemistry; págs. 84-93 (1989); Hol, W.G.J., Arzneim-Forsch. 39:1016-1018 (1989); Hol, W.G.J., Agnew. Chem. Int. Ed. Engl. 25:767-778 (1986)).

De acuerdo con los métodos del diseño de fármacos convencional, se obtienen las moléculas miméticas deseadas sometiendo a ensayo al azar moléculas cuyas estructuras tienen un atributo en común con la estructura de una molécula SDI "nativa", o una molécula que interacciona con una molécula SDI. La contribución cuantitativa que resulta de un cambio en un grupo concreto de una molécula de unión se puede determinar midiendo la capacidad de competición o cooperatividad entre la molécula SDI nativa y el supuesto mimético.

En una realización del diseño de fármacos racional, el mimético se diseña para compartir un atributo de la conformación tridimensional más estable de una molécula SDI. De este modo, el análogo mimético de una molécula SDI puede ser diseñado para que posea grupos químicos que estén orientados de un modo suficiente para ocasionar interacciones iónicas, hidrofóbicas, o de van der Waals que sean similares a las mostradas por la molécula SDI. En un segundo método de diseño racional, se explota la capacidad de una molécula SDI concreta para experimentar respiración ("breathing") conformacional. Semejante respiración ("breathing") – adopción transitoria y reversible de una conformación molecular diferente – es un fenómeno bien conocido, y es el resultado de la temperatura, los factores termodinámicos, y de la actividad catalítica de la molécula. El conocimiento de la estructura tridimensional de la molécula SDI facilita semejante evaluación. Una evaluación de los cambios conformacionales naturales de una molécula SDI facilita el reconocimiento de los sitios bisagra potenciales, sitios potenciales en los cuales se pueden formar o se pueden eliminar enlaces de hidrógeno, enlaces iónicos o enlaces de van der Waals debido a la respiración de la molécula, etc. Semejante reconocimiento permite la identificación de conformaciones adicionales que podría asumir la molécula SDI, y permite el diseño racional y la producción de análogos miméticos que comparten tales conformaciones.

El método preferido para realizar el diseño racional de miméticos emplea un sistema computarizado capaz de formar una representación de la estructura tridimensional de la molécula SDI (tales como las obtenidas utilizando RIBBON (Priestle, J., J. Mol. Graphics 21:572 (1988)), QUANTA (Polygen), InSite (Biosyn), o Nanovision (American Chemical Society). Tales análisis son ilustrados por Hol,

W.G.J. et al. (En: Molecular Recognition: Chemical and Biochemical Problems, Roberts, S.M. (ed.); Royal Society of Chemistry; págs. 84-93 (1989)), Hol, W.G.J. (Arzneim-Forsch. 39:1016-1018 (1989)), y Hol, W.G.J., Agnew. Chem. Int. Ed. Engl. 25:767-778 (1986)).

En lugar de tales evaluaciones comparativas directas de supuestos análogos SDI, se pueden utilizar análisis de escrutinio para identificar tales moléculas. Semejante análisis explotará preferiblemente la capacidad del análogo de SDI para afectar a la proliferación o quiescencia celular. Alternativamente, las moléculas pueden ser aplicadas a una columna que contenga un ligando de unión, tal como p53, Rb, ciclina D, etc., y se puede evaluar la capacidad de la molécula para unirse a la columna en comparación con la molécula SDI. Alternativamente, una molécula SDI mutada (que inhibe la inhibición de la síntesis de ADN mediada por SDI) puede ser administrada con un supuesto compuesto antagonista. En este caso se verificarían las células para determinar si el compuesto es capaz de reestablecer una inhibición de la síntesis de ADN.

Tales análisis son particularmente útiles para identificar fragmentos de péptidos u oligonucleótidos o miméticos de moléculas SDI, o análogos de tales moléculas. De este modo, por ejemplo, se pueden incubar células en presencia de un análogo de SDI oligonucleotídico o peptídico (o fragmento) y un supuesto compuesto antagonista. Las células serían verificadas para determinar si el compuesto es capaz de conferir la capacidad del oligonucleótido SDI para inhibir la síntesis de ADN. Como se ha indicado antes, se podrían llevar a cabo alternativamente análisis de competición en columna. De este modo, se pueden identificar análogos clásicos y miméticos de SDI deseados por medio de una variedad de métodos.

Significativamente, una apreciación de los mecanismos a través de los cuales las moléculas SDI median su inhibición de la síntesis de ADN proporciona un enfoque alternativo, o complementario del aislamiento y reconocimiento de análogos.

Como se ha indicado antes, las quinasas dependientes de ciclina juegan un importante papel en el control del procedimiento de la síntesis de ADN celular (Draetta, G. et al., Trends Biol. Sci., 15:378-383 (1990)). Las moléculas SDI de la presente descripción pueden ser utilizadas para diseccionar el papel de tales quinasas, y la implicación de tales ciclinas, y para identificar de ese modo análogos SDI que pueden ser utilizados para inhibir la síntesis de ADN. Por ejemplo, se cree que las ciclinas de tipo B juegan un papel en la fase G1 o S de la síntesis de ADN (Xiong, Y. et al., Cell 71:505-514 (1992)). El nivel de proteína ciclina D/cyl1 aumenta durante toda la G1, decae durante S y G2, y alcanza un nadir después de la mitosis (Matsushime, H. et al., Cell 65:701-7139 (1991); Klyokawa, H. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. (EEUU) 89:2444-2447 (1992); Xiong, Y. et al., Cell 71:505-514 (1992)).

Xiong, Y. et al. (Cell 71:505-514 (1992)) informaron de la existencia de un polipéptido de 21 kd que se asocia con la ciclina D1 y CDK2. Se utilizó un método de precipitación inmunológica en el cual los extractos radiomarcados de las células se incubaron en presencia de anticuerpos-anti-ciclina. Las proteínas que se asocian con estos anticuerpos se sometieron a electroforesis, y se visualizaron.

La secuencia de este polipéptido de 21 kd ha sido determinada ahora, y se ha encontrado que está codificada por SDI-1. De este modo, puesto que SDI-1 codifica moléculas que inhiben la síntesis de ADN, la presente descripción establece un papel biológico para la proteína de 21 kd (p. ej., controlar el tránsito de células de G1 a S, y de S a G2. Por otra parte, puesto que la proteína codificada por SDI-1 interacciona con la ciclina D1 y CDK2, la presente descripción establece que los agentes que inhiben o reducen esta interacción serán análogos de las moléculas SDI.

El método de precipitación inmunológica utilizado por Xiong, Y. et al. (Cell 71:505-514 (1992)) para demostrar la asociación del polipéptido de 21 kd y las moléculas de ciclina D1 y CDK2 puede ser explotado para determinar el mecanismo o ruta a través de los cuales otras moléculas SDI median su efecto inhibidor, y de ese modo permiten la identificación de otros análogos.

Por ejemplo, las células infectadas con la secuencia SDI-2 o SDI-3, o con moléculas antisentido para cualquiera pueden ser analizadas para determinar si expresan cualquiera de las proteínas que se ha demostrado previamente que se unen a una molécula de ciclina. Esto se puede realizar muy fácilmente determinando si una proteína concreta es inmunoprecipitada cuando un extracto de células tratadas es incubado con un anticuerpo anticiclina. Puesto que semejante método identifica las moléculas con las cuales interaccionan las moléculas SDI, éste establece la ruta a través de la cual tales moléculas SDI median su acción inhibidora. Las moléculas que deterioran o afectan esa ruta son análogos de tales moléculas SDI. De este modo, los métodos descritos en la presente memoria pueden ser utilizados para identificar inhibidores de cualquiera de los reguladores del ciclo celular. En efecto, se ha encontrado que la proteína SDI1 interacciona con CDK4 y CDK5 así como CDK2. De este modo, es probable que la proteína SDI-1 interaccione con múltiples moléculas de CDK y ciclina.

De este modo, el reconocimiento de que las moléculas SDI ejercen su control sobre la proliferación celular a través de las interacciones con ciclinas y moléculas de CDK proporciona un enfoque alternativo para la identificación de análogos de SDI. De una manera similar, el reconocimiento de que otros reguladores celulares median sus acciones regulando la transcripción o expresión de SDI proporciona todavía otro método alternativo para identificar análogos de SDI.

Por ejemplo, se ha encontrado que la transcripción del gen SDI-1 está regulada por genes "supresores de tumores", y muy notablemente por el gen supresor de tumores p53. En efecto, la capacidad "supresora de tumores" de p53 es el resultado de su capacidad para inducir la expresión de SDI-1, y de ese modo inducir la quiescencia celular en células tumorales.

Se ha descubierto anteriormente que el gen p53 codifica una proteína supresora de tumores (Sager, R., Science 246:1406-1412 (1989); Finlay, C., Cell 57:1083 (1989); Weinberg, R.A., Scientific Amer., Sept. 1988, págs. 44-51); Lane, D. et al. (Genes Devel. 4:1-8 (1990)). También se ha encontrado que el gen p53 juega un papel protector frente a los efectos transformantes del virus de la eritroleucemia de Friend (Munroe, D. et al. Oncogene 2:621 (1988)), e influye en la estabilidad del cromosoma, la diferenciación y la quiescencia, y la proliferación celular (Sager, R., Science 246:1406-1412 (1989)). Se ha descubierto que p53 de tipo salvaje es necesario para la detención del ciclo celular siguiente a la radiación ionizante y la expresión constitutiva de p53 de tipo salvaje puede detener las células de mamífero en G1. Se piensa que la capacidad para inducir la detención del ciclo celular está relacionada con la función supresora de tumores de p53. La proteína codificada por el gen p53 es una proteína nuclear que forma un complejo estable tanto con el antígeno T grande de SV40 como con la proteína de 55 kd E1B de adenovirus.

Aproximadamente el 50% de todas las células tumorales evidencian una mutación que disminuye o anula la expresión de p53. El gen p53 ha sido implicado por tener un papel en el carcinoma colorrectal (Baker, S.J. et al., Science 244:217-221 (1989)). Los estudios han demostrado que se producían deleciones alélicas que abarcaban el locus p53 en más de 75% de los carcinomas colorrectales (Baker, S.J. et al., Science 244:217-221 (1989)). Se encontró que la deleción de la región marca una transición de una fase de adenocarcinoma (benigna) a una fase carcinomatosa (maligna) (Vogelstein, B. et al., New Engl. J. Med. 319:525 (1988)).

Se han identificado deleciones similares en el cromosoma 17 en una amplia variedad de cánceres que incluyen cánceres de mama y pulmón (Mackay, J. et al., Lancet ii:1384 (1988); James, C.D. et al., Canc. Res. 48:5546 (1988); Yakota, J. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. (EEUU) 84:9252 (1987); Toguchida et al., Canc. Res. 48:3939 (1988)). Una variedad de tumores humanos (cerebro, colon, mama, pulmón) se caracterizan por células que han perdido uno de los dos alelos p53 normales, y han conservado un punto de mutación en el alelo p53 restante (Nigro et al., Nature 342:705-708 (1989)). Fearon et al. (Cell 61:759-767 (1990)) han hipotetizado que ambas mutaciones puntuales y deleciones en los alelos p53 pueden ser requeridas para un fenotipo totalmente tumorigénico. Estos descubrimientos sugieren que el gen p53 puede tener un papel en muchos tipos de cánceres.

La evidencia reciente ha sugerido que una mutación en el gen p53 puede ser responsable del Síndrome de Li-Fraumeni, un trastorno genético humano raro (Malkin, D. et al., Science 250:1233-1238 (1990); Marx, J., Science 250:1209 (1990)). Los individuos aquejados de esta enfermedad son muy susceptibles a numerosos tumores malignos – carcinomas de mama, sarcomas de tejidos blandos, tumores de cerebro, osteosarcomas, leucemia, y carcinoma adrenocortical. La enfermedad también está asociada con una mayor incidencia de melanoma, tumores de células germinales gonadales, y carcinomas de pulmón, páncreas y próstata (Li, F.P. et al., Ann. Intern. Med.

71:747 (1969); Birch, J.M. et al. J. Clin. Oncol. 8:583 (1990); Birch, J.M. et al., Brit. J. Canc. 49:325 (1984); Li, F.P. et al., Canc. Res. 48:5358 (1988); Williams,

W.R. et al., Familial Canc., 1er Int. Res. Conf. p. 151 (Karger, Basel, 1985); Strong, L.C. et al., J. Natl. Canc. Inst. 79:1213 (1987)).

A pesar de la caracterización previa extensa del papel biológico del gen p53, el mecanismo a través del cual su producto génico mediaba su actividad supresora de tumores no había sido dilucidado previamente. Un aspecto de la presente invención hace referencia al descubrimiento de que este mecanismo implica a SDI-1. La proteína p53 normal aumenta la expresión de SDI-1, y semejante incremento de la expresión suprime la proliferación celular. En células tumorales que carecen de la función de p53, los niveles de SDI-1 son bastante bajos, permitiendo de este modo que se produzca la proliferación celular.

La trascendencia fisiológica de la inhibición de la proliferación celular por expresión en exceso de SDI-1 es reforzada por el descubrimiento de que SDI-1 puede inhibir la actividad quinasa de los complejos de ciclina/cdk2. La adición de una proteína de fusión GSTSDI-1 a complejos de ciclina/cdk2 inmunoprecipitados de extractos de células HeLa por antisueros cdk2 dio como resultado la inhibición semimáxima de la actividad histona H1 quinasa.

De este modo, las moléculas que inhiben la actividad supresora de tumores de p53 son antagonistas de SDI-1; de un modo similar, las moléculas que intensifican la actividad supresora de tumores de p53 son protagonistas de SDI-1.

En las células humanas normales, se ha encontrado que SDI-1 existe como un complejo con una ciclina, una CDK, y el antígeno nuclear de células en proliferación, "PCNA" (Waga, S. et al., Nature 369:574-578 (1994)). PCNA está implicado en la ruta de reparación de la separación por corte por medio de la cual las células reparan el ADN dañado. SDI-1 actúa bloqueando la capacidad de PCNA para activar la ADN polimerasa δ. De este modo, si el ADN celular es dañado antes de la fase S, la inducción de p53 conduce a la activación transcripcional del gen SDI-1. La proteína SDI-1 expresada forma complejos con la replicación del ADN mediada por CDK/ciclina, y de este modo permite que PCNA medie la reparación de la separación por corte de la lesión. Si el ADN celular es dañado durante la fase S, la reparación de la separación por corte conduciría a un incremento de la lesión potencial. Por tanto, cuando se produce la lesión durante la fase S, la proteína SDI-1 expresada forma complejos con PCNA para detener el proceso de replicación. Como se demuestra más abajo (Ejemplo 22), se ha identificado una proteína de 23 kD que muestra las características de un derivado fosforilado, inactivo de la proteína SDI-1. Este derivado puede estar implicado en el mecanismo a través del cual la inhibición de SDI-1 de PCNA es disminuida una vez completado el procedimiento de reparación del ADN.

Semejante entendimiento de la inter-relación entre SDI-1 y PCNA puede ser utilizada para identificar antagonistas o miméticos de SDI-1. De este modo, por ejemplo, las moléculas que inhiben la capacidad de SDI-1 para formar complejo con PCNA en células que se encuentran en fase S comprenden antagonistas e inhibidores de la acción de SDI-1. Por el contrario, las moléculas que aumentan la capacidad de SDI-1 para formar complejo con PCNA en células que se encuentran en fase S comprenden miméticos de SDI-1.

D. Antagonistas de las Moléculas SDI

La presente descripción también tiene que ver con antagonistas de las moléculas SDI. Tales antagonistas pueden comprender análogos de SDI que compiten con, o que inhiben la función de SDI. Alternativamente, tales antagonistas pueden comprender análogos de moléculas tales como ciclinas celulares o p53, que interaccionan con moléculas SDI.

Se puede utilizar cualquiera de una variedad de métodos para identificar polipéptidos o moléculas no proteinaceas que inhiben o reprimen la función de SDI. Tales moléculas pueden ser evaluadas para determinar si compiten con moléculas SDI normales, o si su presencia en una célula afecta a la capacidad de una molécula SDI para inducir un estado quiescente. Por ejemplo, las moléculas de ácido nucleico que se unen competitivamente a moléculas p53 son antagonistas de las moléculas SDI. Tales competidores pueden ser fácilmente identificados utilizando columnas de afinidad, o mediante métodos de la huella de ADNasa.

Los análogos de p53, u otras proteínas supresoras de tumores, que son capaces de interaccionar con, y activar las secuencias de SDI son una clase adicional de antagonistas. Los inhibidores de p53 (y otros inhibidores tumorales) son también antagonistas de las moléculas SDI. Tales moléculas se pueden obtener, por ejemplo, mutagenizando el ADNc que codifica p53, e identificando los mutantes p53 que conservan la capacidad de unirse a secuencias génicas de SDI-1 o a proteínas SDI-1, pero son por otra parte inactivas. Las secuencias de ADNc y de las formas genómicas del gen p53 han sido determinadas (Pennica, D. et al., Virol. 134:477-482 (1984); Jenkins,

J. et al., Nature 312:651-654 (1984); Oren, M. et al., EMBO J. 2:1633-1639 (1983); Zahut-Houri, R. et al., Nature 306:594-597 (1983).

Alternativamente, se pueden proporcionar inhibidores candidato a una célula receptora y se puede averiguar su capacidad para deteriorar la función de p53 normal. Por ejemplo, tales moléculas pueden ser sometidas a ensayo en cuanto a su capacidad para evitar que p53 forme complejos con el antígeno T grande de SV40 (véase, DeCaprio, J.A.

et al., Cell 54:275-283 (1988); Crawford, L.V., Int. Rev. Exper. Pathol. 25:1-50 (1983)).

De un modo similar, se pueden explotar una variedad de medios con el fin de identificar moléculas de ácido nucleico que inhiben o reprimen la inhibición de la síntesis de ADN mediada por SDI. Por ejemplo, las secuencias de ácido nucleico de SDI pueden ser mutadas, y las secuencias mutadas pueden ser suministradas a las células con el fin de identificar células que no muestren una inhibición de la síntesis de ADN, y que hayan recibido por lo tanto las secuencias de SDI mutadas deseadas. En otro método más, las secuencias génicas de SDI de líneas celulares inmortalizadas pueden ser evaluadas para determinar si contienen genes de SDI mutados que han perdido la capacidad de mediar la quiescencia celular. De tal manera, se ha determinado que algunas células inmortalizadas (aproximadamente 10%) portan una mutación en el gen SDI-1 que da como resultado la sustitución de arginina en el residuo de aminoácido 31 de SDI-1 (en lugar del residuo de serina encontrado normalmente en esta posición). Dicho descubrimiento también implica que el residuo 31 de SDI-1 es relevante para el sitio activo o la conformación de SDI-1. Puesto que el ADN de 12 donantes Caucásicos normales no tenía esta sustitución en SDI-1, es poco probable que la variante de SDI-1 Arg31 refleje un polimorfismo en lugar de una mutación.

Se han identificado otras proteínas SDI mutantes escrutando las proteínas SDI de diferentes líneas celulares. De este modo, por ejemplo, se han identificado mutantes SDI-1 en los cuales la valina encontrada normalmente en el residuo de aminoácido 54 ha sido remplazada por alanina, o en los cuales la treonina encontrada normalmente en el residuo de aminoácido 80 ha sido remplazada por metionina.

Alternativamente, las secuencias de SDI mutadas expresadas a partir de tales moléculas de ácido nucleico pueden ser evaluadas en busca de su capacidad para unirse a la proteína p53, o los productos génicos de otros genes supresores de tumores tales como rb, etc.

En otra realización más, se pueden utilizar moléculas de ácido nucleico "tríplex" para proporcionar la terapia deseada. Una molécula "tríplex" es una molécula de ácido nucleico que es capaz de unirse a ADN de doble hebra de una manera suficiente para deteriorar su transcripción. Semejante oligonucleótido puede tener cualquier longitud que sea eficaz para este fin. Preferiblemente, el oligonucleótido tendría aproximadamente 10-30 nucleótidos de longitud, muy preferiblemente, aproximadamente 15-24 nucleótidos de longitud. Los oligonucleótidos tríplex son descritos por Hogan, Patente de los Estados Unidos 5.176.996 y por Varma et al., Patente de los Estados Unidos Núm.

5.175.266.

Los oligonucleótidos tríplex tendrán preferiblemente aproximadamente 20 nucleótidos o más de longitud, y se diseñan para que se unan a la región del gen SDI-1 que tiene una secuencia de nucleótidos que tiene aproximadamente 2/3 de purina o aproximadamente 2/3 de pirimidina. En el diseño de la secuencia del oligonucleótido tríplex, se construye el oligonucleótido para que tenga un residuo G cuando la localización complementaria en la región diana es un par de bases GC y un residuo T cuando la localización complementaria en la región diana es un par de bases AT.

La secuencia del gen SDI-1 puede diferir de la del ADNc si el gen contiene secuencias intermedias no traducidas ("intrones"). En una realización, la secuencia de SDI-1 genómica se obtiene y se evalúa en busca de la presencia de regiones que concuerden con la razón de purinas a pirimidinas preferida descrita antes. Tales secuencias genómicas pueden ser obtenidas escrutando bibliotecas genómicas con sondas oligonucleotídicas (p. ej., 20-50 residuos de longitud) que tienen secuencias seleccionadas entre la del SEQ ID NO:1. Los métodos de escrutinio de bibliotecas genómicas son conocidos en la técnica.

Alternativamente, la secuencia de ADNc de SDI-1 puede ser empleada para generar moléculas tríplex adecuadas. Un análisis de varios cientos de genes que tienen secuencias intermedias ("intrones") y secuencias traducidas ("exones") ha revelado que las fronteras intrón-exón tienen secuencias consenso aguas arriba y aguas abajo definidas (Mount, S.M., Nucl. Acids Res. 10:459-472 (1982). La separación por corte de los intrones de moléculas precursoras de ARNm elimina la mayor parte de estas secuencias consenso, y fusiona el ARNm para crear una frontera exón-exón "CAGG" o "AAGG" en el ARNm. De este modo las regiones diana adecuadas de la molécula SDI-1 tendrán preferiblemente (1) al menos 20 nucleótidos de longitud; (2) carecerán de secuencias CAGG o AAGG y (3) tendrán aproximadamente 2/3 de purina o aproximadamente 2/3 de pirimidina. Tales oligonucleótidos adecuados pueden ser fácilmente identificados mediante mera inspección del SEQ ID NO:1 (p. ej., con referencia a las posiciones de los nucleótidos del SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 11-20, SEQ ID NO: 121-40, SEQ ID NO: 151-70, SEQ ID NO: 181-100, SEQ ID NO: 1128-147, SEQ ID NO: 1131-150, SEQ ID NO: 1151-170, SEQ ID NO: 1241-260, SEQ ID NO: 1288-307, SEQ ID NO: 1304-323, SEQ ID NO: 1329-348, SEQ ID NO: 1334-353, SEQ ID NO: 1361-380, SEQ ID NO: 1390-409, SEQ ID NO: 1421-440, SEQ ID NO: 1497-516, SEQ ID NO: 1525-544, SEQ ID NO: 1541-560. etc. comprenden algunos de los sitios diana adecuados en los primeros 600 nucleótidos del SEQ ID NO: 1).

En otra realización más, se pueden utilizar las secuencias de las moléculas SDI para definir "oligonucleótidos antisentido" que pueden reprimir la transcripción o la traducción de una secuencia génica de SDI. En general, un "oligonucleótido antisentido" es un ácido nucleico (ya sea ADN o ARN) cuya secuencia es complementaria a la secuencia de una molécula de ARNm diana (o su correspondiente gen) tal que es capaz de unirse a, o hibridar con, la molécula de ARNm (o el gen), y de ese modo perjudicar (esto es, atenuar o evitar) la traducción de la molécula de ARNm a un producto génico. Para actuar como oligonucleótido antisentido, la molécula de ácido nucleico debe ser capaz de unirse a o hibridar con aquella porción de la molécula de ARNm diana (o gen) que media la traducción del ARNm diana. De este modo, las moléculas antisentido de la presente invención son capaces de unirse a una molécula de ácido nucleico SDI e inhibir su actividad. Los oligonucleótidos antisentido se describen en las Publicaciones de Solicitudes de Patente Europeas Núms. 263.740; 335.451; y 329.882, y en la Publicación PCT Núm. WO90/00624.

La presente descripción tiene que ver concretamente con aquellos oligonucleótidos antisentido, especialmente fragmentos de los genes SDI-1, SDI-2, o SDI-3, que son capaces de unirse a o hibridar con moléculas de ARNm o ADNc que codifican un producto génico SDI. De este modo, se puede utilizar un oligonucleótido antisentido diseñado para bloquear específicamente la traducción del transcrito de ARNm de SDI para des-reprimir la inhibición de la síntesis de ADN en una célula quiescente receptora.

Una manera en la cual un oligonucleótido antisentido anti-SDI puede lograr estos objetivos es teniendo una secuencia complementaria a la de la región de inicio de la traducción de un ARNm de SDI y con una longitud suficiente para que sea capaz de hibridar con el transcrito de ARNm de un gen SDI. El tamaño de semejante oligómero puede ser cualquier longitud que sea eficaz para este fin. Preferiblemente, el oligonucleótido antisentido tendrá aproximadamente 10-30 nucleótidos de longitud, muy preferiblemente, aproximadamente 15-24 nucleótidos de longitud.

Alternativamente, se pueden utilizar oligonucleótidos antisentido que tengan una longitud que sea demasiado corta para que sean capaces de hibridar establemente con un ARNm de SDI en condiciones fisiológicas, in vivo. Semejante oligonucleótido puede tener aproximadamente 6-10, o más nucleótidos de longitud. Para ser utilizado de acuerdo con la presente invención, semejante oligonucleótido se modifica preferiblemente para permitir que se una a un locus de la región de traducción de un ARNm que codifique SDI. Los ejemplos de tales moléculas modificadas incluyen oligonucleótidos unidos a un anticuerpo (o fragmento de anticuerpo), u otro ligando (tal como un agente de entrecruzamiento divalente (tal como, por ejemplo, trimetilpsoralina, 8-metoxipsoralina, etc.) capaz de unirse a moléculas de ARNm de SDI de hebra sencilla.

En otra realización más, se pueden diseñar moléculas antisentido SDI-1 de manera que hibriden con, y estabilicen, un segmento inestable de ARNm de SDI-1.

Tales moléculas intensificarían de ese modo la transcripción y la traducción de SDI-1 en una célula, y conducirían a un incremento de la capacidad para inhibir la replicación del ADN. Tales moléculas se pueden utilizar para tratar el cáncer, y otras enfermedades o afecciones caracterizadas por una hiperproliferación.

Un oligonucleótido anti-sentido anti-SDI unido a un grupo reactivo de un agente de entrecruzamiento divalente (tal como aducto de psoralina (por ejemplo, trimetilpsoralina, o 8-metoxi-psoralina) sería capaz de entrecruzarse con un ARNm de SDI tras la activación con luz UV de 350-420 nm. De este modo, regulando la intensidad de dicha luz (variando la potencia de la lámpara UV, incrementando la distancia entre las células y la lámpara, etc.) se puede controlar el grado de unión entre el oligonucleótido antisentido y un ARNm de SDI de una célula. Esto, a su vez, permite controlar el grado de atenuación de la expresión del gen SDI en una célula receptora.

En general, el oligómero antisentido se prepara de acuerdo con la secuencia de nucleótidos de un gen SDI, y muy preferiblemente de acuerdo con la secuencia de nucleótidos de SDI-I proporcionada en las Figuras 5A-5D. La secuencia del oligonucleótido antisentido puede contener una o más inserciones, sustituciones, o deleciones de uno o más nucleótidos siempre que el oligonucleótido resultante sea capaz de unirse a o hibridar con el locus de traducción descrito antes de un ARNm de SDI, un ADNc o un gen SDI como tal.

Se puede utilizar cualquier medio conocido en la técnica para sintetizar los oligonucleótidos antisentido

o tríplex descritos en la presente memoria (Zamechik et al., Proc. Natl. Acad. Sci. (U.S.A.) 83:4143 (1986); Goodchild et al., Proc. Natl. Acad. Sci. (U.S.A.) 85:5507 (1988); Wickstrom et al., Proc. Natl. Acad Sci. (U.S.A.) 85:1028; Holt, J.T. et al., Molec. Cell. Biol. 8:963 (1988); Gerwirtz, A.M. et al., Science 242:1303 (1988); Anfossi, G., et al., Proc. Natl. Acad. Sci. (U.S.A.) 86:3379 (1989); Becker, D., et al., EMBO J. 8:3679 (1989). Se pueden emplear sintetizadores de ácido nucleico automatizados para este fin. Además, se pueden obtener nucleótidos deseados de cualquier secuencia de cualquier proveedor comercial de tales moléculas por encargo.

Muy preferiblemente, los oligonucleótidos antisentido o tríplex descritos en la presente memoria se pueden preparar utilizando la "síntesis de fosforamidita" en fase sólida. La síntesis se realiza con la cadena de nucléotido en crecimiento anclada a un soporte sólido derivatizado con el nucleótido que será el extremo 3'hidroxilo del oligonucleótido. El método implica la síntesis cíclica de ADN utilizando unidades monoméricas cuyo grupo 5'-hidroxilo está bloqueado (preferiblemente con un grupo 5'-DMT (dimetoxitritilo)), y cuyos grupos amino están bloqueados con un grupo benzoilo (para los grupos amino de citosina y adenosina) o un grupo isobutirilo (para proteger la guanosina). Los métodos para producir tales derivados son bien conocidos en la técnica.

En otra realización más descrita en la presente memoria, se pueden emplear ribozimas como inhibidores de la inhibición mediada por SDI. Las ribozimas son secuencias de ARN catalíticas (que no contienen proteína) que pueden escindir moléculas diana de ARN con las cuales hibridan (Cech, T. et al., Cell 27: 487 (1981); Cech, T.,

Science 236: 1532-1539 (1987); Cech, T. et al., Ann. Rev. Biochem. 55: 599-630 (1986); James, W., Antivir. Chem. Chemother. 2: 191-214 (1991)). A menudo el sustrato es parte de la propia ribozima.

Se puede diseñar una ribozima artificial para escindir específicamente un ARN diana flanqueando las secuencias complementarias a la diana (Haseloff, J. et al., Nature 334: 585-591. (1988); Cameron, F. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86: 9139-9143 (1989); James, W., Antiviral Chemistry & Chemotherapy 2: 191-214 (1991). El requerimiento mínimo para la escisión en el ARN diana es la localización de una secuencia de tres bases adecuada GUC, GUA, o GUU que preceda al sitio de escisión. Han sido diseñadas ribozimas artificiales que tienen una estructura secundaria en "cabeza de martillo" característica por Haseloff, J. et al. (Nature 334: 585591 (1988); Jeffries, A: et al., Nucleic Acids Res. 17: 1371-1377 (1989); Gerlach et al. WO Patent Application WO89/05852 (1989); Goodchild, J. et al., Arch. Biochem. Biophys. 284: 386-391 (1991); James, W., Antivir. Chem. Chemother. 2: 191-214 (1991)).

E. Protagonistas de Moléculas SDI

La presente descripción también tiene que ver de este modo con protagonistas de las moléculas SDI. Según se utiliza en la presente memoria un "protagonista" de una molécula SDI es una molécula que aumenta o disminuye la actividad biológica de una molécula SDI.

Puesto que p53 es un inductor de la expresión de SDI, éste, o un ácido nucleico que codifique p53, o fragmentos biológicamente activos de cualquiera, pueden ser suministrados a las células junto con una molécula SDI con el fin de obtener un aumento de la expresión de SDI.

La presente descripción también describe protagonistas de SDI distintos de las proteínas supresoras de tumores de origen natural. Tales protagonistas pueden comprender análogos de SDI o pueden comprender moléculas no análogas que interaccionen con las moléculas celulares que interaccionan con las moléculas SDI. De este modo, las formas mutantes de la proteína p53 que tienen potenciada la capacidad activadora de SDI comprenden un protagonista de SDI ilustrativo. Tales moléculas pueden ser producidas mutando el gen p53, y seleccionado después muteínas que lleven a cabo una inducción más rápida o más exhaustiva de la actividad de SDI-1 que la proteína p53 normal.

De un modo similar, se pueden identificar protagonistas de SDI por medio del uso de análisis de escrutinio en los que, por ejemplo, se proporciona una molécula candidato a una célula receptora junto con una molécula SDI, y se controla la capacidad de la molécula candidato para intensificar la expresión de SDI. Los métodos descritos antes de diseño racional de miméticos se pueden utilizar para definir protagonistas de SDI.

F. Anticuerpos para Moléculas SDI

Un aspecto de la presente descripción tiene que ver con anticuerpos para las proteínas SDI y los fragmentos de proteína y los usos diagnósticos y terapéuticos de tales anticuerpos.

Las proteínas SDI y los fragmentos de proteínas descritos antes se pueden utilizar para lograr la producción de anticuerpos, moléculas de unión a antígenos de cadena sencilla, u otras proteínas capaces de unirse a un epítopo SDI. Tales anticuerpos pueden ser policlonales

o monoclonales, y pueden comprender inmunoglobulinas intactas, porciones de unión al antígeno de fragmentos de inmunoglobulinas (tales como (F(ab'), F(ab')2), o inmunoglobulinas de cadena sencilla producibles, por ejemplo, por medios recombinantes.

Los anticuerpos monoclonales murinos son particularmente preferidos. Para este fin se prefieren ratones BALB/c, no obstante, también se pueden utilizar cepas equivalentes. Los animales son inmunizados preferiblemente con aproximadamente 25 µg de proteína SDI purificada por afinidad (o uno de sus fragmentos) que ha sido emulsionada con un coadyuvante adecuado (tal como coadyuvante TiterMax (Vaxcel, Norcross, GA)). La inmunización se lleva a cabo preferiblemente en dos sitios intramusculares, un sitio intraperitoneal, y un sitio subcutáneo en la base de la cola. Se administra preferiblemente una inyección i.v. adicional de aproximadamente 25 µg de antígeno en solución salina normal tres semanas más tarde. Después de aproximadamente 11 días de la segunda inyección, se puede extraer sangre de los ratones y escrutar la sangre en busca de la presencia de anticuerpos anti-SDI. Preferiblemente, se emplea un ELISA de unión directo para este fin.

Muy preferiblemente, al ratón que tiene el título de anticuerpos más elevado se le administra una tercera inyección i.v. de aproximadamente 25 µg de proteína SDI o fragmento. Los leucocitos esplénicos de este animal se pueden recuperar 3 días más tarde, y después se permite que se fusionen, muy preferiblemente, utilizando polietilenglicol, con células de una línea celular de mieloma adecuada (tal como, por ejemplo, la línea celular de mieloma P3X63Ag8.653). Las células de hibridoma se seleccionan cultivando las células bajo selección en "HAT" (hipoxantina-aminopterina-timina) durante una semana. Los clones resultantes se pueden escrutar después en busca de su capacidad para producir anticuerpos monoclonales ("mAb) para la proteína SDI, preferiblemente mediante ELISA directo.

En una realización, se aíslan anticuerpos monoclonales anti-SDI-1 utilizando las fusiones a SDI-1 descritas antes como inmunógenos y para facilitar el escrutinio. De este modo, por ejemplo, se puede inmunizar un grupo de ratones utilizando la proteína de fusión GSTSDI-1 emulsionada en coadyuvante completo de Freund (aproximadamente 50 μg de antígeno por inmunización). A intervalos de tres semanas, se emulsiona una cantidad idéntica de antígeno en coadyuvante incompleto de Freund y se utiliza para inmunizar los animales. Diez días después de la tercera inmunización, se toman muestras de suero y se evalúan en cuanto a la presencia de anticuerpo. Si los títulos de anticuerpo son demasiado bajos, se puede emplear un cuarto refuerzo. Se pueden obtener polisueros susceptibles de unirse a SDI-1 a una dilución 1:5.000 utilizando este método.

En un procedimiento preferido para obtener anticuerpos monoclonales, los bazos de los ratones inmunizados descritos antes se separan, se rompen y se aíslan los esplenocitos inmunes sobre un gradiente de ficoll. Los esplenocitos aislados se fusionan, utilizando polietilenglicol con células de plasmacitoma P3x63xAg8.653 carentes de HGPRT (hipoxantina guanina fosforribosil transferasa). Las células fusionadas se cultivan en placas de microtitulación de 96 pocillos y se escrutan las células de fusión con hibridoma en busca de su capacidad para crecer en medio de cultivo con un suplemento de hipoxantina, aminopterina y timidina durante aproximadamente 2-3 semanas. Por término medio, cada 106 células de bazo sometidas a fusión producen un hibridoma viable. Un bazo típico produce 5-10 x 107 células de bazo.

Las células de hibridoma que surgen de semejante incubación son escrutadas preferiblemente en cuanto a su capacidad para producir una inmunoglobulina que se une a SDI-1. Se puede utilizar un ELISA indirecto para este fin. En resumen, los sobrenadantes de hibridomas se incuban en pocillos de microtitulación que contienen GSTSDI-1 inmovilizada. Después de lavar, se determina el título de inmunoglobulina unida utilizando un anticuerpo anti-ratón de cabra conjugado con peroxidasa de rábano picante. Después de un lavado adicional, se determina la cantidad de enzima inmovilizada (por ejemplo por medio del uso de un sustrato cromogénico). Semejante escrutinio se realiza tan rápidamente como sea posible después de la identificación del hibridoma con el fin de asegurarse de que el clon deseado no es cubierto por los vecinos no secretores. Deseablemente, las placas de fusión se escrutan varias veces puesto que las velocidades de crecimiento del hibridoma varían. En una sub-realización preferida, se puede utilizar una forma antigénica diferente de SDI-1 para escrutar el hibridoma. De este modo, por ejemplo, los esplenocitos pueden ser inmunizados con la fusión GST-SDI-1, pero los hibridomas resultantes pueden ser escrutados utilizando una fusión con [His]6, tal como la que tiene la secuencia líder del SEQ ID NO:4.

Como se comenta más abajo, tales moléculas de anticuerpo o sus fragmentos pueden ser utilizados con fines diagnósticos o terapéuticos. Cuando los anticuerpos están destinados a fines diagnósticos, puede ser deseable derivatizarlos, por ejemplo con un grupo ligando (tal como biotina) o un grupo marcador detectable (tal como un grupo fluorescente, un radioisótopo o una enzima).

Cuando los anticuerpos o sus fragmentos están destinados a fines terapéuticos, puede ser deseable "humanizarlos" con el fin de atenuar cualquier reacción inmunitaria. Los anticuerpos humanizados pueden ser producidos, por ejemplo remplazando una porción inmunogénica de un anticuerpo con una porción correspondiente, pero no inmunogénica (esto es, anticuerpos quiméricos) (Robinson, R.R. et al., Publicación de Patente PCT PCT/US86/02269; Akira, K. et al., Solicitud de Patente Europea 184.187; Taniguchi, M., Solicitud de Patente Europea 171,496; Morrison, S.L. et al., Solicitud de Patente Europea 173,494; Neuberger,

M.S. et al., Solicitud PCT WO 86/01533; Cabilly, S. et al., Solicitud de Patente Europea 125,023; Better, M. et al., Science 240:1041-1043 (1988); Liu, A.Y. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84:3439-3443 (1987); Liu, A.Y. et al., J. Immunol. 139:3521-3526 (1987); Sun, L.K. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84:214-218 (1987); Nishimura, Y. et a/., Canc. Res. 47:999-1005 (1987); Wood, C.R. et al., Nature 314:446-449 (1985)); Shaw et al., J. Natl. Cancer Inst. 80:1553-1559 (1988). Las revisiones generales de anticuerpos quiméricos "humanizados" son proporcionadas por Morrison, S.L. (Science, 229:1202-1207 (1985)) y por Oi, V.T. et al., BioTechniques 4:214 (1986).

En una realización terapéutica, se emplean anticuerpos bivalentes, quiméricos, que contienen dos regiones fab diferentes, de manera que el anticuerpo es capaz de unirse a un epítopo de SDI (por medio de dicha primera región Fab) y a un "epítopo no-SDI" (esto es un epítopo de una proteína distinta de una proteína SDI) (por medio de dicha segunda región Fab). En una realización, tales "epítopos no de SDI" se seleccionan de manera que la molécula quimérica se pueda unir a receptores celulares, tales como receptores de hormonas, receptores de respuestas inmunitarias, etc. Los receptores no de SDI particularmente preferidos incluyen antígenos celulares que son indicativos de neoplasia, tales como antígenos asociados con la leucemia (Seon et al., Proc. Natl. Acad. Sci., USA 80:845 (1983); Aota et al., Cancer Res. 43:1093 (1983); Royston et al., Transplan. Proc. 13:761 (1981)); el cáncer de colon (Koprowski et al., Patente de los Estados Unidos Núm. 4.349.528; Sakamoto et al., Publicación de Patente Europea Núm. 119556; Herlyn et al., Proc. Natl. Acad. Sci., USA 76(3):1438 (1979); Magnani et al., Science

212:55

(1981)); cáncer de pulmón (Cuttitta et al., Proc. Natl. Acad. Sci., USA 78:4591 (1981)); cáncer de mama (Colcher et al., Proc. Natl. Acad. Sci., USA 78:3199 (1981); Schlom et al., Proc. Natl. Acad. Sci., USA 77:6841 (1980)) y otros cánceres (Véase, Lloyd, "Human Tumor Antigens: Detection and Characterization with Monoclonal Antibodies", En: Herberman, ed., Basic and Clinical Tumor Immunology I:159-214, Nijoff, Boston, (1983).

G.

Receptores Celulares de Moléculas SDI

Un aspecto de la presente invención tiene que ver con receptores celulares de moléculas SDI, y en particular receptores celulares de SDI-1, para facilitar la liberación de SDI en células diana.

En una realización, semejante liberación se puede completar expresando la moléculas SDI como una fusión con una linfoquina, hormona, prohormona, u otra molécula que posee un receptor celular o un ligando de la superficie celular que es capaz de unirse a un receptor. Muy preferiblemente, esto se logra ligando un polinucleótido que codifica una molécula SDI (tal como ADNc de SDI-1) a un polinucleótido que codifica la proteína que va a ser reconocida y unida por el receptor o ligando de la superficie celular, y expresando después la proteína de fusión deseada por métodos recombinantes. No se necesita que la proteína de fusión contenga la secuencia completa de la molécula de unión al receptor, pero puede contener solamente una cantidad de proteína suficiente para permitir la unión deseada.

En una sub-realización, la molécula de unión al receptor se selecciona de manera que el receptor relevante esté presente sobre todas o la mayor parte de las células. Los ejemplos de tales moléculas incluyen la mayoría de las hormonas peptídicas (tales como hormona del crecimiento, insulina, etc.) que se unen a sus respectivos receptores, transferrina que se une al receptor de transferrina, proteína Apo-B que se une al receptor de la lipoproteína de baja densidad (LDL), etc. Alternativamente, la proteína de fusión con SDI se puede seleccionar de manera que la molécula sea capaz de ser adsorbida solamente por ciertos tipos o sub-tipos de tejidos. Semejante especificidad se puede obtener por medio del uso de moléculas que se unen a receptores o ligandos que están presentes solamente en ciertas poblaciones de células (tales como células del hígado, leucocitos, células endoteliales, etc.). Los ejemplos de tales moléculas incluyen proteínas tales como glucagón, gastrina, ciertas hormonas pituitarias (TSH, FSH, etc.),

eritropoyetina, interleuquinas, factor estimulador de colonias de granulocitos-macrófagos, proteínas neurotróficas, etc. Adicionalmente, se pueden utilizar proteínas capaces de unirse a proteínas de la superficie celular tales como CD4, ICAM-1, selectinas, ELAMS, LFA-1, etc.

Por ejemplo, puesto que ICAM-1 (Simmons, D. et al., Nature 331:624-627 (1988); Staunton, D.E. et al., Cell 52:925-933 (1988); Staunton, D.E. et al., Cell 61243-254 (1990) es un ligando de la superficie celular endotelial para leucocitos que expresan un heterodímero CD18/CD11 (tal como LFA-1, etc.) una molécula de fusión ICAM-1-SDI se dirigiría a células hematopoyéticas tales como los linfocitos. De un modo similar, una fusión CD4-SDI-1 sería dirigida a células T CD4+, y se podría utilizar para liberar SDI en tales células T. Una fusión LFA-1SDI-1 se dirigiría a células endoteliales y otros ciertos tipos de células. Se podría utilizar una fusión de glucagón-SDI para dirigirse a células del hígado, etc.

En otra realización, la molécula SDI se puede conjugar con una no proteína que pueda experimentar una unión específica a un receptor celular. Los ejemplos de tales moléculas incluyen derivados de epinefrina, norepinefrina o histamina, prostaglandinas, etc.

En otra realización más, se puede explotar un receptor celular endógeno que es capaz de unirse a una molécula SDI para facilitar la liberación de SDI en una célula diana. Tales moléculas receptoras se pueden obtener utilizando las proteínas SDI y fragmentos de proteínas descritos antes. En un método para obtener el receptor de SDI, se produce una biblioteca de ADN (o más preferiblemente, de ADNc), preferiblemente a partir de células que expresan la proteína SDI. Los fragmentos de ADNc son clonados en un plásmido de expresión que es introducido después en células inmortalizadas o tumorales. Las células se incuban después en presencia de SDI-1 marcado, y se evalúan en busca de clones que adsorben SDI-1 a la superficie celular, y que muestran un estado quiescente o senescente renovado. Después se recuperan los plásmidos que codifican los receptores celulares a partir de tales clones.

También se pueden obtener proteínas receptoras de SDI expresando clones de ADNc en bacterias u otros anfitriones, y determinando después si tales clones producen proteínas que sean capaces de unirse a SDI-1. En una sub-realización preferida, el ADNc se incorpora a un vector de presentación en fagos (Lowman, H.B. et al., Biochem. 30:10832-10838 (1991); Markland, W. et al., Gene 109:13-19 (1991); Roberts, B.L. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. (U.S.A.) 89:2429-2433 (1992); Smith, G.P., Science 228:1315-1317 (1985); Smith, R.P. et al., Science 248:1126-1128 (1990). Como se ha indicado antes, este método implica expresar una proteína de fusión en la cual el ligando proteico deseado se fusiona con el extremo C de una proteína de la envoltura viral (tal como la proteína de la envoltura del Gen III de M13, o una proteína de la envoltura de lambda). Los vectores de fagos se hacen crecer después para formar una biblioteca de fagos que posea diferentes proteínas de fusión. La biblioteca se incuba después en presencia de una proteína de fusión con SDI-1 inmovilizada que tiene una secuencia de unión de glutatión S-transferasa glutatión como su extremo amino terminal. Los fagos que presentan receptores celulares de SDI-1 son retenidos por la proteína de fusión a SDI-1 inmovilizada, y pueden ser recuperados lavando la columna con glutatión.

En un método alternativo de obtención del receptor de SDI, se obtiene un extracto celular y se incuba en presencia de una proteína de fusión de SDI-1 que tiene una secuencia de unión a glutatión S-transferasa glutation como su extremo amino. Las proteínas que se unen a SDI-1 comprenden proteínas receptoras celulares.

Cuando se desea, se puede solubilizar la molécula receptora para formar una molécula receptora soluble (esto es no unida a la membrana) truncando los dominios de proteína responsables del anclaje del receptor a la membrana celular.

IV.

Usos de las Moléculas SDI de la Presente Descripción y sus Inhibidores

A.

Inducción de Senescencia o Quiescencia

Las moléculas capaces de inhibir la función de SDI, cuando se suministran a un célula receptora ocasionan la inmortalización de la célua, y de ese modo permiten el establecimiento de una línea celular permanente. Se pueden utilizar de este modo moléculas antisentido, ribozimas y otras moléculas inhibidoras de SDI de la presente invención para inmortalizar tipos de células valiosos (tales como células de cultivos de tejidos primarios, etc.) que podrían tener de otro modo un período transitorio de viabilidad proliferativa. De este modo se pueden utilizar para investigación o para permitir o facilitar la acumulación de grandes números de células, como injertos o transplantes de órganos o tejidos. En una realización, se pueden utilizar, por lo tanto, los agentes de la presente descripción junto con los métodos para el cultivo de órganos o tejidos para facilitar tales métodos. Tales moléculas se pueden utilizar alternativamente para llevar a cabo la inmortalización de células productoras de inmunoglobulinas, o células que producen compuestos biológicos importantes, tales como hormonas (insulina, hormona del crecimiento, IGF, etc.), modificadores del sistema inmunitario (tales como interferones, moléculas de adherencia, linfoquinas, etc.).

Tales moléculas inhibidoras de ácido nucleico tendrán preferiblemente secuencias de nucleótidos que sean complementarias a las secuencias de las moléculas SDI, y muy preferiblemente serán complementarias a la secuencia de regiones o de todo el gen de SDI-1. Cuando tales oligonucleótidos son suministrados a las células receptoras, se produce la inmortalización de la línea celular. Alternativamente, los anticuerpos descritos en la presente memoria se pueden utilizar para inhibir la actividad de SDI (p. ej., para evitar que el SDI de un fluido (tal como la sangre) medie la quiescencia de las células que están en contacto con el fluido).

B. Usos Diagnósticos

Un uso principal de las moléculas de la presente descripción se basa en su capacidad para diagnosticar la presencia y predisposición al cáncer. Puesto que la ausencia de expresión de SDI-1 es el mecanismo por medio del cual los cánceres dependientes de p53 median la tumorigenicidad, se pueden utilizar análisis de expresión de SDI-1 celular para diagnosticar la presencia y la gravedad de los cánceres humanos. Por ejemplo, el Síndrome de Li-Fraumeni está asociado con un grupo concreto de mutaciones en el exón 7 del gen p53 (Malkin,

D. et al., Science 250:1233-1238 (1990). Las células de pacientes con Li-Fraumeni no producen ARN de SDI-1 o proteína SDI-1 detectables. De este modo, se puede realizar una diagnosis de esta enfermedad utilizando análisis de hibridación, o protocolos de inmunoprecipitación que miden los niveles de ARNm o proteína de SDI-1.

Como se ha indicado, aproximadamente el 50% de los tumores humanos no logran expresar la proteína p53 normal. De este modo, los análisis de la actividad de p53 en muestras de biopsia se pueden utilizar para evaluar la presencia de tumores. Tales análisis pueden ser llevados a cabo fácilmente utilizando las moléculas SDI de la presente descripción, especialmente las secuencias del gen de SDI-1, y sus fragmentos. Puesto que p53 es un inductor de la expresión de SDI, la detección de moléculas o ARNm de SDI-1 en un material de biopsia sugiere la expresión normal del gen p53.

Los anticuerpos anti-SDI de la presente descripción pueden ser utilizados en un inmunoanálisis para evaluar la presencia de SDI en una célula, tejido o fluido. Se puede utilizar cualquiera de una amplia selección de formatos de inmunoanálisis para este fin (Fackrell, J. Clin. Immunoassay 8:213-219 (1985)), Yolken, R.H., Rev. Infect. Dis. 4:35 (1982); Collins, W.P., En: Alternative Immunoassays, John Wiley & Sons, NY (1985); Ngo, T.T. et. al., En: Enzyme Mediated Immunoassay, Plenum Press, NY (1985)). La capacidad para detectar y/o medir la presencia de SDI proporciona un método muy deseable para evaluar la presencia o gravedad de un tumor. De este modo, por ejemplo, la ausencia de SDI en un tumor concreto indica que el tumor es más susceptible de metástasis que un tumor que expresa SDI. En una realización, se emplean los anticuerpos de la presente invención para medir las moléculas de SDI solubilizadas de una muestra. Los métodos de la presente descripción se pueden utilizar, no obstante, in situ para permitir la detección y el análisis del SDI presente en una muestra de biopsia.

El inmunoanálisis más simple implica incubar meramente un anticuerpo que es capaz de unir una molécula diana predeterminada con una muestra que se sospecha que contiene la molécula diana. La presencia de la molécula diana se determina mediante la presencia, y proporcional a la concentración, de un anticuerpo unido a la molécula diana. Con el fin de facilitar la separación del anticuerpo unido a la diana del anticuerpo no unido inicialmente presente, se emplea típicamente una fase sólida. De este modo, por ejemplo la muestra se puede unir pasivamente a un soporte sólido, y, tras la incubación con el anticuerpo, se puede lavar el soporte para separar cualquier anticuerpo no unido.

En inmunoanálisis más sofisticados, la concentración de la molécula diana se determina uniendo el anticuerpo a un soporte, y permitiendo después que el soporte esté en contacto con una muestra que se sospecha que contiene la molécula diana. Las moléculas diana que se han unido al anticuerpo inmovilizado se pueden detectar en cualquiera de una variedad de formas. Por ejemplo, se puede incubar el soporte en presencia de un segundo anticuerpo, marcado que es capaz de unirse a un segundo epítopo de la molécula diana. La inmovilización del anticuerpo marcado sobre el soporte requiere de este modo la presencia de la diana, y es proporcional a la concentración de la diana en la muestra. En un análisis alternativo, la diana se incuba con la muestra y con una cantidad conocida de diana marcada. La presencia de molécula diana en la muestra compite con las moléculas diana marcadas por los sitios de unión del anticuerpo. De este modo, la cantidad de moléculas diana marcadas que son capaces de unirse al anticuerpo es inversamente proporcional a la concentración de molécula diana en la muestra.

En general, los formatos de inmunoanálisis emplean marcas radiactivas ("RIA") o marcas enzimáticas ("ELISA"). Los RIA tienen las ventajas de la simplicidad, la sensibilidad y la facilidad de uso. Las marcas radiactivas son de una dimensión atómica relativamente pequeña, y normalmente no afectan a la cinética de la reacción. Tales análisis adolecen, no obstante, de desventajas que, debido al declinar radioisotópico, los reactivos tienen una vida útil corta, requiere una manipulación y un desechado especiales, y suponen el uso de un equipamiento analítico complejo y costoso. Los RIA son descritos en Laboratory Techniques and Biochemistry in Molecular Biology, por Work, T.S., et al., North Holland Publishing Company, NY (1978), con una referencia concreta al capítulo titulado "An Introduction to Radioimmune Assay and Related Techniques" de Chard, T.

Los ELISA tienen la ventaja de que se pueden realizar utilizando un equipamiento poco costoso, y con una miríada de enzimas diferentes, de manera que se puede utilizar un gran número de estrategias de detección -colorimétricas, pH, evolución de gas, etc. – para cuantificar el análisis. Además, los reactivos enzimáticos tienen vidas útiles relativamente largas, y carecen del riesgo de la contaminación por radiación que está presente en el uso de los RIA. Los ELISA son descritos en ELISA and Other Solid Phase Immunoassays (Kemeny, D.M. et al., Eds.), John Wiley & Sons, NY (1988).

C. Usos Terapéuticos

Las moléculas de la presente descripción también poseen utilidad terapéutica. Se dice que un uso es terapéutico si altera un estado fisiológico. Un uso no terapéutico es aquél que altera la apariencia del usuario. Los agentes de la presente descripción se pueden utilizar tópicamente o sistémicamente para un fin terapéutico o no terapéutico, tal como, por ejemplo, para contrarrestar los efectos del envejecimiento, por ejemplo en el tono de la piel, el color, la textura, etc., o sobre la degeneración de las células, tejidos u órganos, tales como linfocitos, tejido vascular (tal como arterias, arteriolas, capilares, venas, etc.), hígado, riñón, corazón y otro músculo, hueso, bazo, etc. Los agentes de la presente descripción se pueden emplear para rejuvenecer tales células, tejidos u órganos. De este modo, se pueden utilizar en productos farmacéuticos. y similares, que pueden comprender, por ejemplo, un oligonucleótido antisentido, o su equivalente, y un portador o coadyuvante lipófilo, preferiblemente disuelto en un disolvente apropiado. Semejante disolvente puede ser, por ejemplo, una mezcla de agua-etanol (que contiene de 10% a 30% v/v o más de etanol. Tales preparaciones pueden contener de 000,1% a 1,0% del oligonucleótido antisentido. Los portadores, coadyuvantes y disolventes adecuados se encuentran más abajo.

1. Tratamiento del Cáncer y Otras Enfermedades

Las moléculas de ácido nucleico de SDI, sus fragmentos, proteínas y polipéptidos codificados, y análogos tienen uso en la inducción de un estado senescente o quiescente en una célula receptora. Tal inducción es deseable en el tratamiento de los trastornos relacionados con la edad (Martin, G.M., Genome 31:390 (1989); Roe, D.A., Clin. Geriatr. Med. 6:319 (1990); Mooradian, A.D., J. Amer. Geriat. Soc.36:831 (1988); Alpert, J.S., Amer. J. Cardiol. 65:23j (1990)); Alzheimer's disease (Terry, R.D., Monogr. Pathol. 32:41 (1990); Costall, B. et al., Pharmacopsychiatry 23:85 (1990)); la astenia y la caquexia (Verdery, R.B., Geriatrics 45:26 (1990)), o las enfermedades o afecciones en las cuales no es deseable una rápida proliferación celular. En este sentido, los agentes de la presente descripción se pueden utilizar terapéuticamente para suprimir la rápida proliferación de células tumorales o tumorigénicas. De este modo, en particular, las moléculas de la presente descripción se pueden utilizar en el tratamiento del cáncer, concretamente cáncer de hígado, pancreático, de riñón, de pulmón, de estómago, de mama, de útero, de colon, de piel, glioma, linfático, de próstata, hepatobiliar y melanoma maligno. En efecto, como se comenta más abajo, SDI-1 tiene una actividad amplia en la supresión de la proliferación de las células de tumores, tales como las líneas tumorales de mama, pulmón, hepático y glioma. Sorprendentemente, las moléculas SDI descritas en la presente memoria tienen la capacidad de mediar la diferenciación de las células cancerosas (especialmente células de melanoma maligno) a células no cancerosas.

En una realización, semejante tratamiento se completa suministrando proteínas o fragmentos de proteínas SDI-1 a células tumorales. Semejante proteína puede ser suministrada directamente, puesto que SDI-I parece ser capaz de entrar directamente en las células tumorales. Alternativamente, se puede suministrar SDI-1 en liposomas, cubiertas virales, u otros vehículos. En una segunda realización, se pueden suministrar las secuencias génicas que codifican SDI-1 o fragmentos de SDI-1 como una terapia génica para el cáncer.

En el caso del melanoma u otros cánceres de piel, se pueden suministrar las moléculas SDI de la presente descripción tópicamente, en un emoliente, etc. (preferiblemente formulado con un compuesto de adsorción de UV, tal como ácido p-aminobenzoico (PABA).

Las moléculas SDI de la presente descripción, concretamente cuando son formuladas en un vehículo de liberación de fármaco liposomal, pueden ser utilizadas para tratar el cáncer de vejiga. Las aplicaciones adicionales para el cáncer de las moléculas SDI descritas en la presente memoria incluyen la inhibición de la replicación de las células endoteliales (antiangiogenésis) para evitar la neovascularización de tumores, y la liberación génica dirigida por medio de moléculas específicas de tumores para detener el crecimiento celular o inducir la apoptosis.

Las moléculas SDI de la presente descripción se pueden utilizar solas, o combinadas con otros agentes quimioterapéuticos convencionales para disminuir las concentraciones eficaces que podrían ser requeridas de otro modo para lograr un efecto terapéutico.

En efecto, la proteína y las moléculas de ácido nucleico SDI-1 de la presente descripción tienen utilidad significativa cuando se utilizan como coadyuvante para agentes quimioterapéuticos convencionales. En una realización, las moléculas SDI-1 se administran a células tumorales, intensificando de ese modo la eficacia de los agentes quimioterapéuticos. En una realización alternativa o complementaria, se proporcionan moléculas SDI-1 (o proporcionadas adicionalmente) subsistémicamente (p. ej., localmente, a órganos o tejidos específicos, o regionalmente) con el fin de aislar las células no tumorales de los efectos citotóxicos de los agentes quimioterapéuticos.

La premisa de la quimioterapia es que las células cancerosas crecen más rápidamente que las células normales, y por lo tanto son más sensibles a los agentes citotóxicos que las células normales. Cada administración de un agente quimioterapéutico elimina un porcentaje de las células tumorales existentes, de manera que generalmente se necesitan administraciones múltiples para eliminar completamente un tumor (Tenenbaum, L., En: "Cancer Chemotherapy and Biotherapy A Reference Guide",

W.B. Saunders Company, Philadelphia, págs. 3-13 (1994)).

Como se ha indicado antes, en una realización, las moléculas SDI-1 de la presente descripción pueden ser utilizadas para incrementar la sensibilidad de las células cancerosas a los agentes quimioterapéuticos, y de este modo permiten la eliminación de un tumor utilizando dosis inferiores y/o dosis más bajas del agente quimioterapéutico. Semejante aumento de sensibilidad se puede obtener, por ejemplo, suministrando una proteína SDI-1 (o moléculas de ácido nucleico que expresan SDI-1) a un paciente en sintonía con la administración del agente quimioterapéutico. Semejante administración sirve para inhibir la replicación de las células cancerosas (la replicación de las células cancerosas también es inhibida por las moléculas SDI-1, sin embargo, semejante inhibición es enormemente irrelevante puesto que las células normales proliferan bastante más lentamente que las células cancerosas). Una vez que las moléculas SDI-1 son suministradas al paciente, se termina o se disminuye dicha administración. El efecto de semejante administración transitoria o disminuida es la sincronización de las células cancerosas con la misma fase del ciclo celular (esto es, congelar las células, por ejemplo, en la fase G1 del ciclo celular). Semejante sincronización incrementa significativamente la sensibilidad de las células cancerosas a los agentes quimioterapéuticos.

Debido a que semejante sincronización proporciona un medio para maximizar el porcentaje de células que están en una fase concreta del ciclo celular en el momento de la administración, la administración de moléculas SDI-1 intensifica la eficacia clínica de los agentes quimioterapéuticos que ejercen su efecto durante una fase

o un grupo de fases específicas del ciclo celular. Por ejemplo, los inhibidores mitóticos tales como alcaloides de vinca (p. ej., vincristina, vinblastina, vindesina, etc.), derivados de Podophyllum (p. ej., etoposido, teniposido, etc.), taxoides (p. ej., taxol, docetaxel, etc.) actúan durante la fase M del ciclo celular interfiriendo en la formación del huso mitótico. Debido a que solamente una fracción de células tumorales están en fase M en cualquier momento dado, Tales fármacos deben ser suministrados generalmente en administraciones repetidas en lugar de un una única dosis grande. Tratando las células con moléculas SDI-1, es posible sincronizar las células tumorales, tal como todas (o una gran fracción) de las células estarán en fase M al mismo tiempo. Por lo tanto, semejante administración de SDI-1 permite emplear inhibidores mitóticos más eficazmente.

De una manera similar, los antimetabolitos tales como los antagonistas de folato (p. ej., metotrexato, etc.), los análogos de purina (p. ej., cladribina, fludarabina fosfato, pentostatina, etc.), los antagonistas de purina (p. ej., 6-mertcaptopurina, 6tioguanina, etc.) y los antagonistas de pirimidina (p. ej., 5-fluorouracilo, 5-fluorodesoxiuridina, citarabina, etc.) actúan sobre las células en fase S. La eficacia de estos agentes puede ser intensificada por medio del uso conjunto de moléculas SDI-1.

Semejante administración conjunta también puede ser utilizada para mejorar la selectividad o la eficacia de los agentes quimioterapéuticos no específicos de la fase del ciclo celular (tales como antibióticos antitumorales, hidroxiurea, procarbazina, hormonas o antagonistas de hormonas, etc.). A pesar de la no especificidad observada de tales agentes con respecto a la fase del ciclo celular de las células tumorales, es muy probable que la sincronización de la fase de la célula tumoral incremente la eficacia de la quimioterapia.

De acuerdo con la segunda realización, las moléculas SDI-1 de la presente descripción pueden ser utilizadas sub-sistémicamente para evitar o atenuar el deterioro de las células normales. Por ejemplo, un efecto secundario de la quimioterapia del cáncer convencional es el deterioro del tejido que crece rápidamente tales como los folículos pilosos. Este deterioro da como resultado la pérdida del cabello (alopecia) en los pacientes afectados. A pesar de la transitoriedad de semejante pérdida, ésta exacerba el trauma psicológico, el malestar y la depresión asociados con la quimioterapia del cáncer. Semejante pérdida del cabello tiene un interés clínico significativo.

La proteína SDI-1 o las moléculas de ácido nucleico de la presente descripción pueden ser utilizadas para atenuar o evitar el deterioro o la muerte de los folículos pilosos, y de ese modo proporcionar un tratamiento para la pérdida del cabello inherente a la quimioterapia o la edad. En esta realización, las moléculas SDI-1 serían aplicadas localmente (p. ej., tópicamente, transdérmicamente, o intradérmicamente al cuero cabelludo, etc.). Tal administración inhibirá el crecimiento folicular, y detendrá las células, por ejemplo, en G1. La administración desensibilizará de este modo los folículos pilosos frente al deterioro causado por la posterior administración de un agente quimioterapéutico convencional.

Las moléculas SDI de la presente descripción también pueden ser utilizadas para tratar la mucositis (úlceras de la boca) que surgen como efecto secundario inevitable de la quimioterapia.

La necesidad de proporcionar una rápida quimioterapia a pacientes con cáncer embarazadas pone en peligro sus fetos en desarrollo, y de este modo la práctica médica actual debe sopesar cuidadosamente los beneficios del tratamiento temprano del cáncer con el perjuicio potencial que semejante tratamiento podría ocasionar al feto. La proteína SDI-1 o las moléculas de ácido nucleico de la presente descripción pueden ser utilizadas para atenuar o prevenir el daño en los fetos en desarrollo en mujeres embarazadas que deben experimentar quimioterapia durante su embarazo. La proteína SDI-1 puede ser suministrada localmente por medio de inyección o infusión en la corriente sanguínea del feto, o en el fluido amniótico que baña al feto. Preferiblemente, semejante administración local se lleva acabo antes o simultáneamente a la administración de un agente quimioterapéutico a la madre. La administración de las moléculas SDI-1 aísla al feto de los efectos

citotóxicos de la quimioterapia.

También se puede tratar un gran número de enfermedades no cancerosas con las moléculas SDI de la presente descripción. Las moléculas SDI pueden ser utilizadas para tratar el trastorno de la piel, la psoriasis. Concretamente cuando se administra tópicamente para tratar la psoriasis, el uso de las moléculas SDI de la presente descripción puede limitar el crecimiento hiperproliferativo de las células implicadas en la psoriasis con efectos secundarios citotóxicos mínimos. La artritis reumatoide, una enfermedad autoinmunitaria debilitante, también puede ser tratada con las moléculas SDI-1 descritas en la presente memoria.

Las moléculas SDI descritas en la presente memoria pueden ser utilizadas para mediar o acelerar la curación de heridas tanto de heridas agudas (p. ej., laceraciones, pinchazos, cirugía, etc.) como heridas crónicas (p. ej., úlceras diabéticas, úlceras venosas, úlceras por presión por decúbito).

Las moléculas descritas en la presente memoria se pueden utilizar para tratar la restenosis inherente a la angioplastia. El término "estenosis" indica un estrechamiento o constricción de un conducto o canal. Una variedad de procesos de enfermedad, tales como las lesiones ateroscleróticas, las reacciones inmunológicas, las deformidades congénitas, etc., pueden conducir a estenosis de las arterias coronarias y de este modo a isquemia miocárdica. La angioplastia coronaria transluminal percutánea (PTCA), la inserción y la inflación parcial de un catéter con balón en un vaso estenótico para efectuar su reparación, ha sido utilizada ampliamente para tratar la estenosis. La limitación principal de la PTCA es la "restenosis" (esto es la re-constricción) de la lesión vascular (Liu, M.W. et al., Circulation 79:1374-1386 (1989). Se ha encontrado que la restenosis ocurre en el 30% a 40% de los pacientes con angioplastia a los seis meses del procedimiento (Califf,

R.M. et al., J. Amer Col. Cardiol. 17:2B-13B (1991), McBride, W. et al., N. Engl. J. Med. 318:1734-1737 (1988)). La restenosis se desarrolla tan rápidamente que puede ser considerada una forma de aterosclerosis acelerada inducida por lesión. La trascendencia de la elevada tasa de restenosis es incrementada por la presente incapacidad para predecir con un alto grado de certeza qué pacientes, vasos, o lesiones experimentarán restenosis. En efecto, las arterias que son muy evidentes 2 días después de la PTCA, libre de trombos obstructivos, han mostrado restenosis en la cateterización 4-6 meses más tarde (Liu, M.W. et al., Circulation 79:1374-1386 (1989)).

Los glaucomas también pueden ser tratados con las moléculas SDI de la presente descripción. Los "glaucomas" son una familia de enfermedades debilitantes del ojo que se caracterizan por una pérdida progresiva del campo visual (esto es, el ángulo sólido de visión que define si un objeto está a la vista). A menos que se verifique, el deterioro del campo visual conduce a una ceguera absoluta e irreversible.

Los glaucomas se caracterizan por una interrupción del flujo normal del "humor acuoso" (esto es, el fluido claro del ojo que tiene una composición similar a la del plasma) a través de las cámaras posterior y anterior del ojo (Vaughan, D. et al., En: General Ophthamology, Appleton & Lange, Norwalk, CT, págs. 213-230 (1992)). El humor acuoso es producido mediante procedimientos ciliares y secretado a la cámara posterior ocular. En los ojos normales, pasa después a través de la pupila y a la cámara anterior del ojo. El humor acuoso fluye fuera de la cámara anterior a la estructura filtrante de colágenoelastina conocida como "malla trabecular", y por último a través del "canal de Schlemm" al suministro de sangre venosa. La capacidad del humor acuoso para atravesar el canal de Schlemm depende de la presencia de canales transcelulares y la velocidad de flujo hacia afuera determina la presión intra-ocular. La presión media en ojos normales es de aproximadamente 14 mm de Hg. En el glaucoma, el flujo hacia afuera del humor acuoso está interrumpido, y la presión intra-ocular aumenta. La lesión comienza normalmente a aproximadamente 30 mm de Hg, y el ojo se desgarra a valores de presión medio de aproximadamente 240 veces.

Se ha propuesto el agente anti-mitótico, 5fluorouracilo, como agente terapéutico para el glaucoma (Sarfarazi, F., Patente de los Estados Unidos Núm. 5.304.561). Desafortunadamente, el 5-fluorouracilo está asociado con efectos secundarios adversos significativos. Puesto que los agentes de la presente invención pueden evitar la proliferación celular, pueden ser utilizados para inhibir la proliferación de las células de la malla trabecular, y por consiguiente proporcionan una terapia para el glaucoma, especialmente, el glaucoma de ángulo abierto primario. Para tales usos, es deseable emplear moléculas SDI-1 que pueden ser administradas mediante métodos intra-oculares (tales como gotas oculares, o pomadas). La capacidad de un fármaco para atravesar la córnea se intensifica si el fármaco tiene regiones tanto lipófilas como hidrófilas. De este modo, para la liberación intra-ocular, es deseable modificar las moléculas SDI-1 de la invención de manera que contengan tales regiones. Los grupos lipófilos e hidrófilos adecuados son conocidos en la técnica (véase, Remington's Pharmaceutical Sciences), y comprenden grupos alifáticos, lípidos, etc. (grupos lipófilos) y ácidos orgánicos, ésteres, grupos iónicos, etc. (grupos hidrófilos). Tales grupos pueden ser fácilmente añadidos a las moléculas SDI-1 de la presente invención, por ejemplo, derivatizando los grupos de las cadenas laterales de los aminoácidos apropiados.

Los grupos cisteinilo se pueden hacer reaccionar con α-haloacetatos (y las correspondientes aminas), tales como ácido cloroacético o cloroacetamida, para dar carboximetilo o derivados carboxamidometilados. Los residuos de cisteinilo también pueden ser derivatizados mediante reacción con bromotrifluoroacetona, ácido αbromo-β-(5-imidozoil)propiónico, fosfato de cloroacetilo, N-alquil-maleimidas, disulfuro de 3-nitro-2-piridilo, disulfuro de metil-2 piridilo, p-cloromercuribenzoato, 2cloromercuri-4-nitrofenol, o cloro-7-nitrobenzo-2-oxa1,3-diazol.

Los residuos de histidilo se pueden derivatizar mediante reacción con dietilprocarbonato a pH 5,5-7,0 debido a que este agente es relativamente específico para la cadena lateral de histidilo. También es útil el bromuro de parabromofenacilo; la reacción se realiza preferiblemente en medio de cacodilato de sodio 0,1 M a pH 6,0.

Los residuos de lisinilo y amino terminales se pueden hacer reaccionar con anhídridos de ácido succínico

o de otros ácidos carboxílicos. La derivatización con estos agentes tiene el efecto de revertir la carga de los residuos de lisinilo. Otros reactivos adecuados para la derivatización de residuos que contienen a-amino incluyen imidoésteres tales como picolinimidato de metilo; fosfato de piridoxal; piridoxal; cloroborohidruro; ácido trinitrobenzenesulfónico; O-metil-isourea; 2,4pentanodiona; y reacción catalizada con glioxilato.

Los residuos de arginilo pueden ser modificados mediante reacción con uno o varios reactivos convencionales, entre ellos fenilglioxal, 2,3butanodiona, 1,2-ciclohexanodiona, y ninhidrina. La derivatización de residuos de arginina requiere que la reacción se realice en condiciones alcalinas debido al elevado pKa del grupo funcional de guanidina. Además, estos reactivos pueden reaccionar con los grupos de lisina así como el grupo epsilon-amino de la arginina.

Los grupos laterales carboxilo (aspartilo o glutamilo) pueden ser codificados selectivamente mediante reacción con carbodiimidas (R'-N-C-N-R') tales como 1ciclohexil-3-(2-morfolinil-(4-etil)carbodiimida o 1-etil3-(4-azonio-4,4-dimetilpentil)carbodiimida. Además, los residuos de arpartilo y glutamilo se pueden convertir en residuos de asparaginilo y glutaminilo mediante reacción con iones amonio.

2. Usos Antivirales y Antimicrobianos

En una realización alternativa, las moléculas de la presente descripción pueden ser utilizadas como agentes anti-viral para reducir la propagación de virus tales como el virus de la influenza, hepatitis, (p. ej., hepatitis B o hepatitis C), Epstein-Barr, rhinovirus, papilomavirus, papovavirus, etc. En particular, puesto que las moléculas SDI (especialmente, SDI-1 y sus análogos) actúan inhibiendo la proliferación celular, y puesto que los retrovirus proliferan preferentemente solo en las células en división activa, la presente descripción proporciona la terapia antiviral contra el VIH, y de este modo se puede utilizar para tratar enfermedades tales como el SIDA y el ARC. De un modo similar, para condiciones tales como verrugas (incluyendo verrugas venéreas), papilomatosis laríngea, leucoencefalopatía multifocal progresiva, etc., la administración de tales moléculas SDI inhibe la proliferación de células infectadas, y de este modo proporciona un tratamiento sintomático para la afección.

En otra realización, las moléculas de la presente descripción se pueden utilizar como agente antiparasítico para tratar infecciones fúngicas, por levadura, por protozoos, helmínticas, por nemátodos y otras (p. ej., candidiasis, aspergilosis, coccidiomicosis, leismaniasis, amebiasis, tricomoniasis, tinea (pedis, crusis, etc.) monolisis vaginales, esquistosomiasis y malaria).

De una manera similar a la descrita antes, la administración de las moléculas SDI-1 puede incrementar la eficacia terapéutica de los agentes antivirales o antimicrobianos. Debido a que las moléculas SDI-1 inhiben la replicación de patógenos, se pueden aplicar tópicamente a la piel, o sistémicamente por medio de inyección, con el fin de evitar o atenuar el riesgo de infección posterior. De este modo, por ejemplo, las moléculas podrían ser incorporadas a una composición farmacéutica adecuada, y aplicadas a las manos de los cirujanos u otros profesionales médicos antes de su exposición a individuos potencialmente infectados.

En otra realización, las moléculas SDI-1 pueden ser

administradas como un coadyuvante de agentes antivirales en el tratamiento de una infección viral presunta o real con el fin de sincronizar los ciclos celulares de cualquiera de las células infectadas viralmente, y aumentar de ese modo la eficacia terapéutica del agente antiviral. Del mismo modo, las moléculas SDI-1 podrían ser administradas como un coadyuvante de agentes antiparasíticos en el tratamiento de una infección parasítica presunta o real con el fin de sincronizar los ciclos celulares de las células del parásito, y aumentar de ese modo la eficacia terapéutica del agente antiparasítico. Semejante administración conjunta se puede utilizar para tratar condiciones tales como las infecciones fúngicas, por levadura, por protozoos, helmínticas, por nematodos u otras infecciones parasíticas.

3. Otros Usos Terapéuticos

Las moléculas antisentido y otras moléculas inhibidoras de SDI de la presente descripción pueden ser utilizadas para estimular la proliferación de espermatocitos, o la maduración de oocitos en seres humanos animales, y de este modo, se pueden utilizar para incrementar la fertilidad de un receptor. Por el contrario, las moléculas SDI y sus análogos se pueden utilizar para inhibir la gametogénesis en machos y hembras, y de este modo se pueden utilizar como agentes contraceptivos para inducir la infertilidad en machos o hembras. Semejante uso también proporciona la ventaja de atenuar la replicación y la proliferación de células infectadas viralmente (p. ej., VIH, etc.), y de ese modo sirve para disminuir la probabilidad de contraer enfermedades virales (p. ej., SIDA, etc.).

Puesto que las moléculas SDI-1 de la presente descripción son capaces de inhibir la replicación del ADN, éstas se pueden utilizar para evitar o atenuar el deterioro del ADN inducido por la luz UV (tal como el encontrado a partir de la exposición al sol). En individuos que carecen de la capacidad normal para reparar tal deterioro, la inhibición mediada por SDI-1 de la síntesis de ADN proporcionaría una mayor oportunidad para que se produzca la reparación. Por consiguiente, las moléculas SDI-1 de la presente descripción se pueden utilizar para tratar individuos que padecen deficiencias en la capacidad de reparación del ADN (p. ej., individuos que tienen xerodermia pigmentosa, ataxia telangiectasia, etc.).

Puesto que las moléculas antisentido y otras moléculas inhibidoras de la presente descripción son capaces de estimular la proliferación celular, se pueden utilizar para promover la curación de heridas, la angiogénesis, la proliferación de células endoteliales, la recuperación de quemaduras, o tras la cirugía, o para restaurar tejido atrofiado, etc. Los anticuerpos de la presente descripción también se pueden utilizar para lograr la curación de heridas, la curación de quemaduras,

o después de un trauma o cirugía. Por supuesto, todos estos componentes también se pueden utilizar para suprimir la regeneración o vascularización de tejidos en general. Para semejante realización, estos agentes pueden ser formulados con antibióticos, agentes anti-fúngicos, o similar, para la administración tópica o sistémica.

Las moléculas de la presente descripción pueden ser utilizadas para proporcionar una terapia génica para pacientes receptores. En una realización, se pueden separar células o tejidos de un paciente y tratarlas con una molécula de la presente descripción en condiciones suficientes para permitir una restauración de un estado de crecimiento activo. En una realización preferida de este uso, se pueden separar los linfocitos de un individuo (tales como, por ejemplo, un individuo comprometido inmunitariamente, tal como un paciente con SIDA, etc., o un individuo inmuno-competente que servirá como donante de linfocitos) y tratarlos con ácidos nucleicos SDI antisentido. La administración de estas moléculas des-reprimirá los linfocitos. Después de la administración, los linfocitos son re-introducidos en el paciente, y tienen una mayor capacidad para combatir la infección.

En otra realización más, las moléculas de la presente descripción se pueden utilizar para facilitar la sustitución de células autólogas. En esta realización, las moléculas de ácido nucleico SDI, sus fragmentos, proteínas y polipéptidos codificados, y análogos pueden ser utilizados para permitir la proliferación in vitro de células (tales como células de médula ósea, células epiteliales, células musculares, células hepáticas, etc.) con el fin de reponer o aumentar la cantidad o concentración de tales células en un paciente. De este modo, por ejemplo, se pueden separar células de médula ósea, tratarlas con tales moléculas, y después cultivarlas in vitro hasta obtener una masa suficiente de células para aumentar una respuesta inmunitaria deseada. Alternativamente, las células hepáticas (tales como las células hepáticas que están libres de un virus de hepatitis) pueden ser separadas de un paciente, tratadas, cultivadas y después transplantadas de nuevo al paciente con el fin de tratar una enfermedad hepática.

En una sub-realización, tales células tratadas pueden ser a su vez transplantadas de nuevo directamente al paciente, y de este modo propagarse in vivo. Alternativamente, como se indica, tales células pueden ser cultivadas in vitro, y reintroducidas cuando se haya obtenido un título deseado.

De acuerdo con las realizaciones y sub-realizaciones descritas antes de la terapia génica, l ADNc de SDI-1 y las secuencias antisentido pueden ser conectadas operablemente a promotores específicos de tumores o específicos de tejidos con el fin de confirmar el efecto terapéutico en un sitio o tejido deseado. Los ejemplos de los promotores específicos de tumores adecuados incluyen aquellos que dirigen la transcripción de los antígenos específicos de tumores tales como la α-fetoproteina, el antígeno carcinoembrionario, la amilasa, la γ-glutamil transferasa, etc. Los ejemplos de los promotores específicos de tejidos adecuados incluyen el promotor de la fenilalanina hidroxilasa (Wang, Y. et al., J. Biol. Chem. 269:9137-9146 (1994); Svensson, E. et al., Eur. J. Hum. Genet. 1:306-313 (1993); Konencki, D.S. et al., Biochemistry 31:8363-8368 (1992)), el promotor de la alfa-1 antitripsina (AAT) (Li, Y. et al., Molec. Cell. Biol. 8:4362-4369 (1988); el promotor de la actina muscular, etc. Tienen un particular interés los promotores que dirigen la expresión en tejidos de mama, hígado, pulmón o colon.

Las moléculas de la presente descripción son particularmente adecuadas para su uso en la creación y/o el estudio de modelos animales para enfermedades o para la degeneración tisular. De este modo, las moléculas de la presente descripción pueden ser utilizadas para estudiar efectores de un modelo animal que se caracteriza por un envejecimiento anormal o una degeneración celular.

De un modo similar, la administración de las moléculas SDI (conectadas, por ejemplo a secuencias reguladoras adecuadas con el fin de permitir su expresión en una célula receptora) puede ser utilizada para crear modelos animales de envejecimiento o de degeneración tisular.

D. Liberación de Agentes Farmacológicos

La capacidad de SDI-1 para entrar directamente en una célula proporciona un medio para lograr la liberación de agentes farmacológicos en una célula receptora. De este modo, en una realización, un agente farmacológico será conjugado con SDI-I y suministrado a un paciente receptor. La presencia del radical de SDI-1 (que puede ser la proteína SDI-1 intacta, o un fragmento suficiente para el transporte de SDI-1) transporta el agente farmacológico adjuntado a la célula receptora.

Se puede utilizar cualquiera de una variedad de agentes de entrecruzamiento para conjugar el agente farmacológico al radical SDI-1. Alternativamente, tales agentes pueden ser suministrados en forma de proteínas de fusión (ilustradas por las proteínas de fusión GST-SDI-1 comentadas antes). Tales proteínas de fusión pueden ser preparadas, por ejemplo, expresando una molécula de ácido nucleico que codifique semejante fusión.

Los agentes farmacológicos que se pueden administrar a las células de esta manera pueden incluir agentes que proporcionen un beneficio terapéutico a las células (tales como un anti-hipertensivo, un anti-inflamatorio, un anti-arrítmico, etc.). Alternativamente, el agente farmacológico puede afectar adversamente a las células receptoras (tales como las que comprenden una citoquina, una toxina, etc.).

Cuando se desea que los agentes farmacológicos que se van a liberar sean SDI-1, esto se puede lograr utilizando los anticuerpos anti-SDI de la presente descripción que pueden comprender regiones de unión quiméricas. Seleccionando las porciones de unión de tales anticuerpos quiméricos para que incluyan un dominio de unión que sea específico para un antígeno tumoral, es posible producir un anticuerpo que se pueda unir tanto al antígeno tumoral como a la molécula SDI. Tal molécula se puede utilizar para "transportar" una proteína SDI a cualquier célula que presente el antígeno tumoral. La molécula SDI transportada puede inducir a la célula tumoral a reanudar un estado quiescente o senescente. Tales anticuerpos quiméricos comprenden de este modo un tratamiento anti-canceroso.

Alternativamente, las moléculas SDI de la presente descripción pueden ser suministradas a las células fusionando la molécula SDI a una hormona, u otra molécula que se une a un subgrupo deseado de células receptoras. De este modo, por ejemplo conjugando SDI-1 a una molécula CD4 soluble, o a una molécula de insulina, se podría dirigir la administración de SDI-I a leucocitos que presentan CD4, o a células que presenten el receptor de insulina. Aunque tales productos conjugados pueden ser producidos utilizando una variedad de métodos, se prefiere producir tales productos conjugados expresando moléculas de ácido nucleico que codifiquen las proteínas de fusión.

Como se ha indicado, una fusión GST-SDI es una fusión particularmente preferida. El dominio N-terminal de GST de rata muestra una homología significativa con el factor de inhibición de la migración humano (MIF) (David, J.R., Parisitology Today 9:315-316 (1993); Mikayama, T.

et al., Proc. Natl. Acad. Sci. (U.S.A.) 90:10056-10060 (1993)). De este modo, a diferencia de cualquier acción de SDI, la GST tiene por lo tanto el potencial de unirse a receptores celulares que son capaces de unirse a MIF y moléculas afines. En efecto, un aspecto de la presente descripción implica el reconocimiento de que una proteína de fusión de GST-agente farmacológico se puede unir a receptores celulares y llevar a cabo la liberación del agente farmacológico en la célula diana. De este modo, se podrían fusionar moléculas distintas de SDI a secuencias GST (tales como las descritas antes) con el fin de llevar a cabo su liberación en una célula diana deseada.

E. Usos Preparatorios

Los anticuerpos anti-SDI de la presente descripción proporcionan un método fácil para purificar y recuperar proteínas SDI de una disolución. En esta realización, se incuban productos lisados o extractos celulares en presencia de un anticuerpo anti-SDI, preferiblemente inmovilizado sobre un soporte sólido. Las moléculas SDI se unen al anticuerpo, y de ese modo se pueden recuperar en forma purificada.

F. Usos del Receptor Celular de SDI y Sus DerivadosSolubilizados

El receptor células de SDI y sus derivados solubilizados pueden ser utilizados para facilitar la recuperación de SDI a partir de preparaciones que contienen la proteína. De esta manera, el receptor se puede utilizar como un pseudo-anticuerpo. El receptor también puede ser utilizado terapéuticamente para modular la expresión celular y las respuestas a la proteína SDI. De este modo, las moléculas de receptor pueden ser suministradas a células tumorales (vía liposomas, o suministrando tales células con ácidos nucleicos que codifican el receptor). Tales moléculas aumentarán la capacidad de las células tumorales para responder a la presencia de SDI, y de ese modo aliviarán el cáncer.

V. Métodos de Administración

Las moléculas SDI de la presente descripción pueden ser formuladas de acuerdo con métodos conocidos para preparar composiciones farmacéuticamente útiles, por medio de lo cual estos materiales, o sus derivados funcionales, que tienen el grado de pureza deseado se combinan mezclados con un portador, excipiente, o estabilizador fisiológicamente aceptable. Tales materiales no son tóxicos para los receptores a las dosis y concentraciones empleadas. La "molécula SDI" de tales composiciones puede ser proteína SDI, fusiones (p. ej., fusiones-GST, etc.) o fragmentos de proteína SDI-1 o miméticos de tales moléculas. Las moléculas SDI pueden ser oligonucleótidos efectores, antisentido o tríplex del ADNc o gen de SDI-1. Se dice que una composición es "farmacéuticamente aceptable" si su administración puede ser tolerada por un paciente receptor. Se dice que dicho agente va a ser administrado en una "cantidad terapéuticamente eficaz" si la cantidad administrada es fisiológicamente significativa. Un agente es fisiológicamente significativo si su presencia da como resultado un cambio detectable en la fisiología de un paciente receptor.

Los vehículos adecuados y su formulación, incluida la de otras proteínas humanas, p. ej., albúmina de suero humano, se describen, por ejemplo, en Remington's Pharmaceutical Sciences (16a ed., Osol, A., Ed., Mack, Easton PA (1980)). Con el fin de formar una composición farmacéuticamente aceptable adecuada para el almacenamiento o la administración, tales composiciones contendrán una cantidad eficaz de una o más "moléculas SDI".

Si la composición va a ser soluble en agua, se puede formular en un tampón tal como fosfato u otra sal de ácido orgánico preferiblemente a un pH de aproximadamente 7 a 8. Si la composición solamente es parcialmente soluble en agua, se puede preparar en forma de una microemulsión formulándola con un tensioactivo no iónico tal como Tween, Pluronics, o PEG, p. ej., Tween 80, en una cantidad, por ejemplo, de 0,04-0,05% (p/v), para incrementar su solubilidad. Se pretende que el término "soluble en agua" aplicado a los polisacáridos y polietilenglicoles incluya soluciones y dispersiones coloidales. En general, la solubilidad de los derivados de celulosa se determina por el grado de sustitución de los grupos éter, y los derivados estabilizadores útiles en la presente memoria deben tener una cantidad suficiente de grupos éter por unidad de glucosa anhidra en la cadena de celulosa para volver los derivados solubles en agua. Generalmente es suficiente un grado de sustitución etérica de al menos 0,35 grupos éter por unidad de glucosa anhidra. Adicionalmente, los derivados de celulosa pueden estar en forma de sales de metales alcalinos, por ejemplo, las sales de Li, Na, K, o Cs.

Opcionalmente se pueden añadir otros ingredientes tales como antioxidantes, p. ej., ácido ascórbico; polipéptidos de bajo peso molecular (menos de aproximadamente diez residuos), p. ej., poliarginina o tripéptidos; proteínas, tales como albúmina de suero, gelatina, o inmunoglobulinas; polímeros hidrófilos tales como polivinilpirrolidona; aminoácidos, tales como, ácido glutámico, ácido aspártico, o arginina; monosacáridos, disacáridos, y otros carbohidratos incluyendo celulosa o sus derivados, glucosa, manosa, o dextrinas; agentes quelantes tales como EDTA; y alcoholes de azúcares tal como manitol o sorbitol.

Se pueden emplear métodos farmacéuticos adicionales para controlar la duración de la acción. Se pueden lograr preparaciones de liberación controlada o sostenida por medio del uso de polímeros para formar complejos o absorber la molécula o las moléculas SDI de la composición. Se puede hacer uso de la liberación controlada seleccionando macromoléculas apropiadas (por ejemplo poliésteres, poliaminoácidos, polivinilpirrolidona, acetato de etilenvinilo, metilcelulosa, carboximetilcelulosa, o protamina, sulfato) y la concentración de macromoléculas así como los métodos de incorporación con el fin de controlar la liberación.

También se pueden preparar formulaciones de liberación sostenida, e incluyen la formación de partículas microcapsulares y artículos implantables. Para preparar composiciones de liberación sostenida, la molécula o moléculas SDI de la composición se incorporan preferiblemente a una matriz biodegradable o microcápsula. Un material adecuado para este fin es una polilactida, aunque se pueden utilizar otros polímeros de poli(ácidos α-hidroxicarboxílicos), tal como ácido poliD-(-)-3-hidroxibutírico (EP 133.988A). Otros polímeros

biodegradables

incluyen poli(lactonas),

poli(ortoésteres),

poliaminoácidos, hidrogeles, o

poli(ortocarbonatos)

poli(acetales). El material

polimérico

también puede comprender también puede

comprender poliésteres, poli(ácido láctico) o copolímeros

de etileno-acetato de vinilo. Para los ejemplos de las composiciones de liberación sostenida, véanse las Patentes de los Estados Unidos Núm. 3.773.919, EP 58.481 A, Patente de los Estados Unidos Núm. 3.887.699, EP 158.277A, Patente Canadiense Núm. 1176565, U. Sidman et al., "Biopolimers" 22:547 [1983], y R. Langer et al, "Chem. Tech." 12:98 [1982].

Alternativamente, en lugar de incorporar una o varias moléculas SDI de la composición a partículas poliméricas, es posible atrapar estos materiales en microcápsulas preparadas, por ejemplo, mediante técnicas de co-acervación o mediante polimerización interfacial, por ejemplo, hidroximetilcelulosa o microcápsulas de gelatina y microcápsulas de poli(metilmetacrilato), respectivamente, o en sistemas de liberación de fármacos coloidales, por ejemplo, liposomas, microesferas de albúmina, microemulsiones, nanopartículas, y nanocápsulas

o en macroemulsiones. Tales técnicas se describen en Remington's Pharmaceutical Sciences (1980).

En una realización, tales formulaciones contendrán una molécula SDI-1 (p. ej., una fusión GST-SDI-1, etc.) que puede mediar su propia absorción intracelular. Los métodos adecuados son conocidos en la técnica, véase, por ejemplo, por ejemplo, de Biessen, E.A.L. et al. (Solicitud PCT WO94/04545), Felgner, P.L. (Solicitud de Patente PCT WO91/17424), Akiyama, K. et al. (Solicitud PCT WO93/20801), Blum, A. et al. (Solicitud PCT WO93/04672), Abai, A.M. et al. (Solicitud PCT WO93/03709), Hosokawa, S. et al. (Patente de los Estados Unidos Núm. 5.264.221), Cullis, P.R. et al. (Patente de los Estados Unidos Núm. 5.204.112; Patente de los Estados Unidos Núm. 5.252.263), Patente Japonesa Núm. 4.082.893, Phillips, W.T. et al. (Patente de los Estados Unidos Núm.

5.158.760), Weiner, N.D. (Solicitud PCT WO91/01719), Hostetler, K.Y. et al. (Patente de los Estados Unidos Núm. 5.223.263), Kobayashi, Y. et al. (Patente Europea 335597); Weiner, A.L. et al. (Solicitud PCT WO89/05151); Hope, M.J. et al. (Solicitud PCT WO87/07530).

En una segunda realización, se emplearán formulaciones de liposomas y métodos que permitan la absorción intracelular de la molécula SDI-1. Los métodos adecuados son conocidos en la técnica, véase, por ejemplo, Chicz, R.M. et al. (Solicitud PCT WO 94/04557), Jaysena, S.D. et al. (Solicitud PCT WO93/12234), Yarosh,

D.B. (Patente de los Estados Unidos Núm. 5.190.762), Callahan, M.V. et al. (Patente de los Estados Unidos Núm. 5.270.052) y Gonzalezro, R.J. (Solicitud PCT 91/05771).

Las composiciones farmacéuticas SDI utilizadas para la administración terapéutica pueden ser esterilizadas, mediante filtración a través de membranas estériles (p. ej., membranas de 0,2 micras). Las composiciones se pueden almacenar en forma liofilizada o en forma de una solución líquida. Se entenderá que el uso de algunos de los excipientes, portadores o estabilizadores anteriores dará como resultado la formación de sales de las moléculas SDI.

Las composiciones de la presente descripción pueden ser aplicadas tópicamente a la piel, o a la mucosa gastrointestinal, vaginal, oral, etc. Cuando se aplican tópicamente, las moléculas SDI de la composición pueden ser combinadas adecuadamente con otros ingredientes, tales como portadores y/o coadyuvantes. No existen limitaciones en cuanto a la naturaleza de tales otros ingredientes, excepto que deben ser farmacéuticamente aceptables y eficace para su administración pretendida, y no puede degradar la actividad de los ingredientes activos de la composición. Los ejemplos de los vehículos adecuados incluyen pomadas, cremas, geles, o suspensiones, con o sin colágeno purificado. Las composiciones también pueden ser impregnadas en parches transdérmicos, emplastos, y vendajes, preferiblemente en forma líquida o semi-líquida.

Para obtener una formulación en gel, la molécula o las moléculas SDI de la composición formulada en una composición líquida pueden ser mezcladas con una cantidad eficaz de un polisacárido soluble en agua o un polímero sintético tal como polietilenglicol para formar un gel de la viscosidad apropiada para ser aplicado tópicamente. El polisacárido que se puede utilizar incluye, por ejemplo, derivados de celulosa tales como derivados de celulosa eterificados, incluyendo alquilcelulosas, hidroxialquilcelulosas, y alquil-hidroxialquilcelulosas, por ejemplo, metilcelulosa, hidroxietilcelulosa, carboximetilcelulosa, hidroxipropil-metilcelulosa, e hidroxipropilcelulosa; almidón y almidón fraccionado; agar; ácido algínico y alginatos; goma arábiga; pullullano; agarosa; carragenano; dextranos; dextrinas; fructanos; inulina; mananos; xilanos; arabinanos; quitosanas; glicógenos; glucanos; y biopolímeros sintéticos; así como goma xantana; goma guar; goma de algarrobo; goma arábiga; goma de tragacanto; y goma karaya; y sus derivados y mezclas. El agente gelificante preferido en la presente memoria es uno que es inerte para los sistemas biológicos, no tóxico, simple de preparar, y no demasiado líquido o viscoso, y no desestabilizará las moléculas SDI contenidas en él. Preferiblemente el polisacárido es un derivado de celulosa eterificado, más preferiblemente uno que esté bien definido, purificado, y enumerado en la USP, p. ej.,

metilcelulosa y los derivados de hidroxialquilcelulosa, tales como hidroxipropilcelulosa, hidroxietilcelulosa, e hidroxipropilmetilcelulosa. La más preferida en la presente memoria es la metilcelulosa.

El polietilenglicol útil para la gelificación es típicamente una mezcla de polietilenglicoles de bajo y elevado peso molecular para obtener la viscosidad apropiada. Por ejemplo, una mezcla de un polietilenglicol de peso molecular 400-600 con uno de peso molecular 1500 sería eficaz para este fin cuando se mezcle en la proporción adecuada para obtener una pasta.

Las composiciones de la presente descripción también pueden ser formuladas para la administración parenteral mediante inyección, infusión rápida, absorción nasofaríngea (intranasofarínega), dermoabsorción, u oralmente. Las composiciones pueden ser administradas alternativamente intramuscularmente, o intravenosamente. Las composiciones para la administración parenteral incluyen soluciones, suspensiones, y emulsiones acuosas o no acuosas estériles. Los ejemplos de los disolventes no acuosos son propilenglicol, polietilenglicol, aceites vegetales tales como aceite de oliva, y ésteres orgánicos inyectables tales como oleato de etilo. Se pueden utilizar portadores, coadyuvantes o vendajes oclusivos para incrementar la permeabilidad del tejido e intensificar la absorción de antígeno. Las formas de dosificación líquida para la administración oral pueden comprender generalmente una solución de liposomas que contenga la forma de dosificación líquida. Las formas adecuadas para suspender liposomas incluyen emulsiones, suspensiones, soluciones, jarabes, y elixires que contienen diluyentes inertes utilizados comúnmente en la técnica, tales como agua purificada. Además de los diluyentes inertes, tales composiciones también incluyen agentes humectantes, agentes emulsionantes y suspensores, o agentes edulcorantes, aromatizantes, colorantes o perfumantes.

Si se emplea metilcelulosa en el gel, preferiblemente ésta comprende aproximadamente 2-5%, más preferiblemente aproximadamente 3%, del gel y la molécula

o las moléculas SDI de la composición están presentes en una cantidad de aproximadamente 300-1000 µg por ml de gel. La dosificación a emplear depende de los factores descritos antes. Como proposición general, se formula o se formulan la molécula o las moléculas SDI de la composición y se liberan en el sitio o tejido diana a una dosificación susceptible de establecer en el tejido una dosis máxima que sea eficaz pero no indebidamente tóxica.

Generalmente, la dosificación necesaria para proporcionar una cantidad eficaz de la composición variará dependiendo de factores tales como la edad del receptor, el estado, el sexo, y el grado de la enfermedad, si la hubiera, y otras variables que pueden ser ajustadas por un experto normal en la técnica.

Las cantidades eficaces de las composiciones de la invención pueden variar de 0,01-1.000 mg/ml por dosis o aplicación, aunque se pueden utilizar cantidades menores.

Cuando se emplean moléculas de ácido nucleico (como en la represión antisentido o tríplex), se emplean métodos de "terapia génica". Los principios de la terapia génica son descritos por Oldham, R.K. (En: Principles of Biotherapy, Raven Press, NY, 1987), y textos similares. Las descripciones de los métodos y usos para la terapia génica son proporcionados por Boggs, S.S. (Int. J. Cell Clon. 8:80-96 (1990)); Karson, E.M. (Biol. Reprod. 42:3949 (1990)); Ledley, F.D., en: Biotechnology, A Comprehensive Treatise, volumen 7B, Gene Technology, VCH Publishers, Inc. NY, págs. 399-458 (1989)). Semejante terapia génica puede ser suministrada a un receptor con el fin de tratar (esto es, suprimir o atenuar) un estado existente, o para proporcionar una terapia génica profiláctica que, debido a mutaciones genéticas heredadas, o mutaciones somáticas celulares, tiene una predisposición al glaucoma.

Muy preferiblemente, se emplean para este fin, vectores virales o retrovirales. Los ejemplos de los vectores adecuados son comentados por Fletcher, F.A. et al. (J. Exper. Med. 174:837-845 (1991)), Mäkelä, T.P. et al. (Gene 118:293-294 1992)), Porgador, A. et al. (Canc. Res. 52:3679-3686 (1992)), Yoshimura, K. et al. (Nucl. Acids Res. 20:3233-3240 (1992)), Lim, B. et al. (Proc. Natl. Acad. Sci. (U.S.A.) 86:8892-8896 (1989)), Ohi, S. et al. (Gene 89:279-282 1990)), y Russel, S.J. et al. (J. Virol. 66:2821-2828 (1992)).

Habiendo descrito ahora generalmente la invención, la misma se comprenderá más fácilmente por medio de la referencia a los siguientes ejemplos que se proporcionan a modo de ilustración, y no se pretende que sean limitantes de la presente invención, a menos que se especifique.

EJEMPLO 1

CREACIÓN DE LA BIBLIOTECA DE ADNc

Se obtuvo una biblioteca de ADNc utilizando ARN de fibroblastos de prepucio neonatal humano normal, tal como la línea celular HCA2. Para hacer esto, las células se desarrollaron en medio esencial mínimo con solución salina equilibrada de Earle o Hanks con un suplemento de suero bovino fetal al 10% (GIBCO o Hyclone). Las células se cultivaron, y se determinó su período de vida in vitro, en las condiciones descritas por Smith, J.R., y Braunschweiger, K.I., J. Cell Physiol. 98:597-601 (1979). Las células quiescentes se elaboraron remplazando el medio de cultivo normal por medio de cultivo que contenía 0,5% de suero antes de que las células se volvieran confluyentes. Las células se mantuvieron en medio de cultivo con poco suero hasta durante 3 semanas.

Se aisló ARN celular total o bien mediante el método de tiocianato de guanidinio/CsCl (Garger, S.J. et al., Biochem. Biophys. Res. Commun. 117:835-842 (1983)) o el método de tiocianato de guanidinio/fenol (Chomczynski, P., y Sacchi, N., Anal. Biochem. 162:1.56-159 (1987), RNAzol B, Biotecx Lab. Inc. TX). El ARN poli A+ se aisló mediante cromatografía en columna de oligo (dT) celulosa (Collaborative Res. MA).

Se convirtieron 10 µg de ARN poli A+ derivado de células senescentes, como se ha descrito antes, en ADNc de doble hebra utilizando RNasa H-/transcriptasa inversa MMLV de acuerdo con las instrucciones del proveedor (BRL, MAD), y se volvieron romos los extremos mediante tratamiento con polimerasa de T4. Las preparaciones de ADNc de doble hebra fueron fraccionadas por tamaños mediante electroforesis en gel de agarosa, y la fracción de 2-4,5 kb se aisló, para la inserción en un vector de expresión.

El vector de expresión utilizado para este fin fue un plásmido de 3,4 kb, denominado pcDSRαΔ (Figura 1). El plásmido pcDSRαΔ es un derivado del plásmido pcDSRa296, que incluye el promotor Okayama-Berg SV40 y la LTR de HTLV-1 (Takebe, Y. et al., Mol. Cell. Biol. 8:466-472 (1988); proporcionado por el Dr. M. Yoshida (Cancer Inst. of Japan)). El plásmido pcDSRαΔ se formó separando un segmento de 336 pares de bases (pb) del fragmento Pstl-Kpnl de pcDSRα296 y remplazándolo por 28 pb de un fragmento PstI-KpnI de pUC19. El plásmido resultante (pcDSRαΔ) se utilizó en forma de un vector de clonación y expresión.

El plásmido pSV2cat (Gorman, C. et al., Mol. Cell. Biol. 2:1044-1051 (1982)) fue proporcionado por el Dr. Gretchen Darlington (Texas Children's Hospital). El vector pcD (Okayama, H., y Berg, P., Mol. Cell. Biol. 3:280-289 (1983)) fue proporcionado por el Dr. H. Okayama (Osaka University, Japón); el plásmido tiene el gen de la cloranfenicol-acetiltransferasa ("CAT") insertado entre el promotor SV40 y la señal poli A de SV40. Se construyó pcDSRΔα-cat a partir de pcDSRαΔ mediante la inserción de 0,8 Kb de un fragmento del promotor SRa digerido con HindIII-SmaI en pSVOcat digerido con HindIII por medio de una ligación de dos etapas. Es deseable un promotor muy fuerte con el fin de permitir un escrutinio de la expresión eficiente de la biblioteca de ADNc. A partir de un análisis de varios vectores de expresión de mamífero (pSV2cat, pcD-cat y pcDSRαΔ-cat, transfectados en células jóvenes), se encontró que el promotor SRa conducía la expresión del gen CAT con una elevada eficacia en células en ciclo jóvenes. Las actividades CAT relativas de estos plásmidos se calcularon normalizando a la cantidad de proteína utilizada para cada reacción. La eficacia transcripcional fue aproximadamente 20 veces mayor que la del promotor pSV2 convencional, que utiliza el promotor del gen temprano de SV40.

pCMVβ porta el gen de la β-galactosidasa de E. coli conducido por el promotor del gen temprano inmediato de citomegalovirus (MacGregor, G.R., y Caskey, C.T., Nucleic Acids Res. 17:2365 (1989); proporcionado por el Dr. Grant MacGregor, Baylor College of Medicine, TX). El plásmido pβ440, que porta 443 pb de la secuencia de la β-actina humana (Nakajima-lijima, S. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. 82:6133-6137 (1985); proporcionado por el Dr. Kozo Makino, Osaka University, Japón). El plásmido pHcGAP (Tso, J.Y. et al., Nucleic Acids Res. 13:2485-2502 (1985)), que porta un ADNc de gliceraldehído 3 fosfato deshidrogenasa humana completo (GAPDH), fue obtenido de la Colección de Cultivos Tipo Americana, Rockville, MD.

Para la expresión del ADNc antisentido, se escindieron fragmentos de ADNc completos mediante digestión con BamHI a partir del vector pcDSRαΔ clonado originalmente, y se re-ligaron en la dirección inversa.

Los ADNc recuperados del gel de agarosa se insertaron directamente en un sitio SmaI de pcDSRαΔ tratado con fosfatasa alcalina de intestino de ternera, y se transformaron en E. coli MC1061 o DH-1. Las colonias resistentes a ampicilina se escogieron al azar y los plásmidos se determinaron por tamaños. Estos procedimientos se repitieron hasta lograr inserciones de ADNc de 2-4,5 kb en más del 90 por ciento de los plásmidos sometidos a ensayo. Después cada colonia de E. coli fue seleccionada con palillos de dientes y colonias se combinaron en una reserva de ADNc. Se prepararon más de 400 reservas de ADNc, se hicieron crecer en placas de microtitulación de 96 pocillos y se almacenaron en glicerol al 14% a -70°C. Para el aislamiento de ADN, se cultivó E. coli de cada reserva de ADNc en 200 ml, y se trató mediante métodos convencionales de ultracentrifugación en bromuro de etidio/CsCl (Garger, S.J. et al., Biochem. Biophys. Res. Commun. 117:835-842 (1983)) una o dos veces, seguido de diálisis frente a solución de TE (Tris 10 mM pH 8,0, EDTA 1 mM).

EJEMPLO 2

TRANSFECCIÓN MEDIADA POR DEAE-DEXTRANO Y ESCRUTINIO DE LA EXPRESIÓN TRANSITORIA

Se sembraron fibroblastos en ciclo, jóvenes a una densidad de 0,9-1,2 X 105 por pocillo en placas para el cultivo de tejidos de 6 pocillos o placas para el cultivo de tejidos de 35 mm 18 h antes de la transfección. La transfección se realizó como describe Cullen, B.R., en: Guide to Molecular Cloning Techniques. Methods in Enzymology., S.L. Berger y A.R. Kimmel (ed.) Academic Press, págs. 684-704 (1987); incorporada en la presente memoria como referencia con leves modificaciones como se describe más abajo.

Para cada transfección, se mezclaron 100 ng de pCMVβ y 400 ng de una reserva de ADNc y se suspendieron en 190 µl de solución salina tamponada con fosfato (PBS) y se añadieron 10 µl de 10 mg/ml de DEAE-dextrano (Pharmacia, PM ~500.000). Se utilizaron 400 ng del plásmido del vector de clonación, pcDSRαΔ, con pCMVβ como control. Después de lavar las células con PBS una vez, se añadieron las soluciones de ADN y las células se incubaron hasta durante 45 minutos a 37°C en una incubadora con CO2. Después se añadieron directamente 2 ml de medio de cultivo celular con suero, que contenía cloroquina 64 µM (Sigma, MO) y se incubaron durante otras 2,5 horas. Después del tratamiento con cloroquina, la mezcla de transfección se separó y las células se trataron con sulfóxido de dimetilo al 10% en medio de cultivo celular con suero durante 2 min. Las células se devolvieron a medio de cultivo celular de nueva

5 aportación con suero y se incubaron para permitir la expresión del ADN transfectado.

A las 18 horas de la transfección, se añadieron 0,5 µCi/ml de timidina-H3 y la incubación continuó durante 10 otras 48 horas. Las células se fijaron añadiendo 25 µl de solución de glutaraldehído al 25% al medio de cultivo y se incubaron durante 5 min a la temperatura ambiente, seguido de tres lavados con PBS. Inmediatamente después del lavado, las células se trataron con la mezcla de 15 reacción de X-gal (MgCl2 1 mM, K4[Fe(CN)6] 3 mM, K3[Fe(CN)6] 3 mM, triton X-100 al 0,1%, y X-gal 1 mM disuelto en tampón fosfato de sodio 0,1 M (pH 7,5) que contenía KCl 10 mM) hasta durante 20 min para permitir la tinción con luz azul de las células. Después de la 20 tinción de X-gal, las células se lavaron con agua, se secaron y se trataron para la autorradiografía utilizando emulsión Nuclear Track Kodak NTB (Kodak, NY). Después se determinó la actividad de síntesis de ADN en las células positivas a X-gal. El porcentaje de inhibición se calculó

25 utilizando la siguiente fórmula:

imagen1

Se dividieron las reservas de ADNc candidato en ADNc

individuales y se escrutaron adicionalmente para la identificación de secuencias de ADNc inhibidoras de la síntesis de ADN específico.

Se realizó la microinyección nuclear de células en ciclo jóvenes como describe (Lumpkin, C.K. et al., Mol. Cell Biol. 6:2990-2993 (1986)). En resumen, se cultivaron en placa 5.000 – 10.000 células sobre cubres con rejillas grabadas de 22 mm cuadrados (Bellco) en fuentes para el cultivo de tejidos de 35 mm. Tres o cuatro días más tarde, se realizaron microinyecciones nucleares sobre un mínimo de 300 células, utilizando pCMVβ + plásmido con ADNc o pCMVβ + pcDSRαΔ (que sirvió como control). Los plásmidos se microinyectaron simultáneamente a una concentración de 50 ng/µl cada uno. A las 18 horas de la microinyección, las células se marcaron con timidina-H3 durante 24 h, se fijaron, se tiñeron con X-gal y se procesaron para la autorradiografía. El porcentaje de inhibición de la síntesis de ADN se calculó como antes.

Se realizó el análisis de transferencia Northern utilizando 5 µg de ARN total o 1 µg de ARN poli A+. El ARN se fraccionó por tamaños mediante electroforesis en geles de formaldehído-agarosa y se transfirió a membranas de nailon (ICN; Biotrans, antiguamente Pall Biodyne A) como describen Maniatis, T. et al., Molecular cloning: A Laboratory Manual; Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, Nueva York (1982). Se prepararon sondas radiactivas mediante el método del cebado al azar, y las transferencias se hibridaron como describen Maniatis, T. et al., Molecular cloning: A Laboratory Manual; Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, Nueva York (1982).

Los análisis de transferencia northern revelaron que los tamaños de los transcritos celulares de los SDI eran compatibles con los tamaños de los ADNc de SDI. Esto era lo que se esperaba puesto que e escrutinio de una expresión satisfactoria requiere inserciones de ADNc completo en el vector.

Para la re-hibridación con la sonda de β-actina o gliceraldehído fosfato deshidrogenasa (GAPDH), se despojaron repetidamente los filtros de las sondas marcadas siguiendo las instrucciones del fabricante. Los datos se cuantificaron mediante un Sistema de Barrido Radioanalítico Ambis.

Se determinó un análisis de la actividad CAT como sigue: Se sembraron células en ciclo jóvenes en fuentes de 35 mm de y se transfectaron 500 ng de plásmido transfectado como se ha descrito antes. A las 24 horas de la transfección, las células se rasparon de la fuente, y se realizó el análisis CAT como describe Gorman (Gorman, C., En: DNA Cloning, A Practical Approach. IRL Press, Oxford, Inglaterra, págs. 143-164 (1985)).

EJEMPLO 3

CLONACIÓN DE ADNc DE LOS INHIBIDORES DERIVADOS DE CÉLULAS SENESCENTES (SDI) DE LA SÍNTESIS DE ADN

Se sintetizaron ADNc a partir de ARN poli A+ derivado de células senescentes en células jóvenes cuando se microinyectaron en el citoplasma (Lumpkin, C.K. et al., Science 232:393-395 (1986)). Los ADNc fueron fraccionados por tamaño, insertados en pcDSRαΔ. Los clones de E. coli resultantes se dividieron en pequeñas reservas. Los plásmidos de cada reserva fueron cotransfectados con el plásmido marcador de transfección, pCMVβ, que permitió una determinación del índice de marcaje de las células transfectadas específicamente, puesto que incluso con una elevada eficacia de transfección, las frecuencias variaban de experimento a experimento. Las frecuencias de transfección del plásmido marcador oscilaron de 30-90%. Se escrutaron aproximadamente 200 reservas de ADNc y cuatro reservas continuaban siendo positivos para la actividad inhibidora de de la síntesis de ADN después de cinco transfecciones repetidas. Las reservas candidato se dividieron después en plásmidos individuales y se escrutaron adicionalmente.

Se obtuvieron tres clones plasmídicos positivos independientes. En la reserva A de ADNc, solamente un plásmido, Núm 2, mostraba una fuerte actividad inhibidora de la síntesis de ADN. De un modo similar, en las reservas B y C solamente un clon de ADNc ocasionó la inhibición. El tamaño de los ADNc insertados fue de 2,1 kb, 1,2 kb y 2,7 kb, respectivamente. Estas secuencias de ADNc han sido designadas como inhibidores derivados de células senescentes, SDI-1, SDI-2 y SDI-3, respectivamente.

La secuencia de nucleótidos del clon de ADNc SDI-1 (SEQ ID NO: 1), y la secuencia de aminoácidos de SDI-1 (SEQ ID NO: 2) han sido determinadas. La secuencia de ADNc presentada en la presente memoria para SDI-1 difiere de la descrita en la Solicitud de Patente de los Estados Unidos núm. de serie 07/808,523 al poseer una G no citada en la posición 286, y al tener la secuencia CG en lugar de GC en la posición 1843-1844. La secuencia descrita actualmente se obtuvo por medio de la re-secuenciación del plásmido pcDSRαΔ-SDI-1 cuyo aislamiento y características fueron descritos en la Patente de los Estados Unidos núm. de serie 07/808.523. Se depositó E.

coli DH5 transformada con el plásmido pcDSRαΔ-SDI-1 en la Colección de Cultivos Tipo Americana, Rockville, Maryland, EEUU, el 1 de Octubre de 1992, y se le ha concendido el número de acceso ATCC 69081.

Una molécula de ácido nucleico cuya secuencia corresponde a una porción de la secuencia de nucleótidos de SDI-1 referida en la presente memoria ha sido identificada entre los 2375 fragmentos de la secuencia génica al azar referida por Adams, M.D. et al. (Nature 355:632-634 (1992)).

EJEMPLO 4

MICROINYECCIÓN DE SECUENCIAS SDI EN CÉLULAS JÓVENES EN CICLO

Con el fin de verificar la actividad funcional de las secuencias SDI, se realizaron las microinyecciones. Un plásmido que portaba SDI-1 o SDI-2 fue microinyectado simultáneamente con el plásmido marcador en los núcleos de células jóvenes en ciclo. Se determinó el índice de marcaje de las células azules resultantes (Tabla 1). Estos plásmidos mostraron una fuerte actividad inhibidora de la síntesis de ADN de las células jóvenes. Para los experimentos de control, el vector vacío fue microinyectado simultáneamente con el plásmido marcador.

Esto ocasionó una ligera inhibición cuando se comparó el índice de marcaje con células que no han recibido inyección, un fenómeno también observado en experimentos de transfección. No se llevaron acabo microinyecciones con SDI-3 porque la actividad inhibidora era menor que los experimentos de transfección con SD-I y SDI-2.

Además de los fibroblastos humanos normales, también se encontró que las moléculas SDI-1 eran capaces de inhibir la síntesis de ADN en varios tipos de células tumorales (melanoma, carcinoma de pulmón, y tumor

5 ovárico), y en fibroblastos transformados con SV40 inmortalizados, y células CHO. Las moléculas SDI-1 también fueron capaces de inhibir la síntesis de ADN en músculo liso de arteria pulmonar bovina normal.

Tabla 1

imagen1

Plásmidos Inyectados Núm. de Células Inyectadas Núm. de Núcleos Marcados por Células Azules Totales * Índice de Marcaje (%) % Inhibición

Exp. 1

pCMVβ+pcDSRαΔ 335 58/97 59,8 0

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pCMVβ+SDI-1 380 20/89 22,5 62,4

imagen1

pCMVβ+SDI-2 380 6/82 7,3 87,8

Exp. 2

pCMVβ+pcDSRαΔ† 423 68/109 62,3 0

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pCMVβ+SDI-1 465 26/98 26,5 57,5

pCMVβ+SDI-2

475 27/118 22,9 63,2

Notas: † Control; * El número de células que expresan niveles detectables de β-galactosidasa; La concentración de cada ADN fue de 50 µg/ml.

EJEMPLO 5

ANTISENSE DNA TRANSFECTION

Con el fin de examinar su cualquiera de las actividades inhibidoras es específica de la orientación de la secuencia, se construyeron vectores de expresión anti-sentido de las secuencias SDI-1 y SDI-2. Puesto que ambas secuencias carecían de sitios BamHl y puesto que los sitios BamHI estaban presentes en ambos extremos del ADNc (Figura 1), las secuencias fueron fácilmente escindidas y religadas en la dirección contraria. La transfección de las secuencias antisentido dio como resultado la no inhibición de la síntesis de ADN en células jóvenes (Figura 3). Además, no se observó potenciación. Los resultados indican claramente la especificidad de la orientación de la secuencia de la actividad SDI, y sugieren la presencia de productos génicos específicos codificados por las secuencias de ADNc.

Los fibroblastos humanos normales dejan de sintetizar ADN en ausencia de factores de crecimiento apropiadoss. Puesto que SDI-1 es un regulador negativo clave del inicio de la síntesis de ADN, las moléculas que son antisentido con respecto a SDI-1 son capaces de hacer que las células entren en fase S. Para demostrar esta capacidad, se aislaron varias líneas celulares humanas normales y se dotaron de moléculas antisentido SDI-1 (expresadas clonando el ADNc de SDI-1 en orientación antisentido en un vector que tenía un promotor de metalotioneína).

Para este fin, se construyeron vectores de expresión antisentido clonando secuencias antisentido de SDI-1 en PMET, un vector de expresión inducible que contenía un promotor de metalotioneína humano alterado. El promotor de metalotioneína en PMET fue obtenido a partir de pM26 y contiene una deleción en el promotor basal y la adición de elementos de respuesta a metales sintéticos por triplicado (McNeall, J. et al., Gene 76:81-88 (1989)). Para la construcción de PMET, se clonaron primero las secuencias de adenovirus que contenían los intrones 12S y 13S del gen E1A (nucleótidos 917-1673) en el vector de expresión de mamífero PRC/CMV (Invitrogen) en los sitios Not I/Apa I de la región de clonación múltiple de este plásmido para crear pRc/CMV-Ad. Para asegurarse de que no se producía traducción de las secuencias E1A y para crear un sitio de clonación Spe I en este vector, se insertó un conector Spel que contenía un codón de terminación entre el promotor de CMV y una secuencia de empalme E1A en marco con la secuencia E1A. Después se remplazó el promotor de CMV del plásmido Rc/CMV-Ad por el promotor pM26 para crear PMET. Para completar esto, se escindió el promotor de la metalotioneína de pM26 mediante digestión con BgIII y se insertó en el sitio BamHI de pBlueScript (pBS; Stratagene). Después se subclonó un fragmento EcoRV y NotI que contenía el promotor a partir de pBS en un sitio BglII y un sitio NotI relleno de Rc/CMV-Ad. Las secuencias antisentido del ADNC de SDI-1 se obtuvieron del ADNC completo clonado en el sitio BamHI de pBS. El sitio Stul del nucleótido 127 se convirtió en un sitio Spel mediante inserción de un conector Spel para elaborar SDISPE127. También se insertó un conector Spel en el sitio Apal en el nucleótido 318 para crear SDISPE318. Estos constructos fueron digeridos con Spel e insertados en orientación antisentido en el sitio de clonación Spel de PMET, creando de este modo pMET-AS127 y pMET-AS318.

Las líneas celulares que expresaban el antisentido de SDI-1 fueron obtenidas mediante transfección con fosfato de calcio utilizando el procedimiento de BES/CaPO4 descrito por Chen, C. et al., Molec. Cell. Biol. 7:2745-2752 (1987)) excepto que las células no fueron cultivadas en placa de nuevo después de la transfección. Las células HCA2 (3 x 105) en PD10 fueron transfectadas con 20 µg de ADN de PMET, pMETAS127 o pMETAS318. Después de dos semanas de selección con G418, las colonias se seleccionaron y se expandieron. La inducibilidad y la integridad de la secuencia insertada fueron examinadas mediante la adición de ZnCl2 100 µM y CdCl2 2 µM seguido de análisis del ARN. El análisis del ARN del ARN celular total de transformantes estables se realizó mediante protección con ARNasa utilizando sondas de ARN antisentido marcadas internamente con UTP-[P32] como describen Adami, G. et al., EMBO J. 10:3457-3465 (1991)). La sonda pMET+SDI-1, que contenía los nucleótidos 444-686 de SDI, fue utilizada para medir la expresión de SDI-1 tanto de los genes transfectados como del ARNm endógeno. Después de la digestión con EcoNI, la transcripción del promotor SP6 en el vector PMET da como resultado una sonda marcada antisentido que hibrida tanto con el ARN del vector de expresión como con el ARNm de SDI-1 endógeno. Esto permite una comparación de los niveles de expresión relativos del ARN del constructo introducido de SDI-1 endógeno. Como control se midió el ARNm de β-actina en todos los análisis. La sonda de actina contiene los nucleótidos 2124-2189 insertados entre los sitios Eco RI y Bam HI relleno de pBS.

Cuando las células transfectadas establemente se colocaban en medio que contenía cantidades menores de factores de crecimiento (suero bovino fetal al 0,5%) durante 7-10 días y se marcaban por pulsos durante 24 horas con timidina tritiada, menos del 5% incorporaban marca. No obstante, cuando se inducía SDI-1 antisentido mediante la adición de ZnCl2 y CdCl2 24 horas antes de la adición de la timidina tritiada, se encontró que más del 25% de las células, mediante la incorporación de la marca, habían iniciado la síntesis de ADN nuevo, y de este modo habían recuperado la capacidad de proliferar.

Este experimento demuestra que las secuencias antisentido de la presente invención pueden ser utilizadas para inmortalizar células que estarían ausentes en semejante tratamiento para experimentar senescencia.

EJEMPLO 6

EXPRESIÓN DE ARNm SDI DURANTE LA SENESCENCIA CELULAR

Para examinar los cambios en la expresión del ARNm SDI durante la senescencia celular, se hibridó ARN total de células jóvenes y senescentes con sondas de ADNc SDI

P32

marcadas con . La sonda SDI-1 hibridó con un transcrito celular de 2,1 kb, SDI-2 hibridó con un transcrito de 1,4 kb, y SDI-3 hibridó con un transcrito de 2,5 kb (Tabla 2). La Tabla 2 proporciona una cuantificación del análisis Northern del ARN total de la expresión de los genes SDI en células jóvenes (Y) y senescentes (S). Se hibridaron 5 µg de cada ARN total de células jóvenes y senescentes con sondas SDI. Los filtros se despojaron repetidamente de la sonda radiactiva y se volvieron a hibridar con las sondas para los controles internos. La cantidad relativa de ARNm SDI en cada muestra se normalizó mediante la cantidad de GAPDH detectada en el mismo filtro y mediante la cantidad relativa de SDI/GAPDH.

Tabla 2: Cuantificación del Análisis Northern

ATRIBUTO

SDI-1 SDI-2 SDI-3

Y

S Y S Y S

Cantidad Relativa de SDI

1,0 3,3 1,0 0,31 1,0 0,31

Cantidad Relativa de GAPDH

1,0 0,37 1,0 0,36 1,0 0,38

Cantidad Relativa de SDI/GAPDH

1,0 9,3 1,0 0,86 1,0 0,82

Durante la senescencia celular, el mensaje de SDI-1 aumentó aproximadamente 3 veces, mientras los mensajes de SDI-2 y SDI-3 disminuyeron 3 veces. Los mismos filtros se

5 re-hibridaron con β-actina, y después con una sonda de GAPDH como controles internos. Los resultados demostraron que la expresión de ambos genes de control disminuía aproximadamente 3 veces durante la senescencia celular. En estudios previos, se había observado una disminución

10 de 2-3 veces en la expresión de β-actina durante la senescencia celular (Kumazaki, T. et al., Exp. Cell Res. 195:13-19 (1991); Seshadri, T., y Campisi, J., Science 247:205-209 (1990); Furth, J.J., J. Gerontol. 46:B122-124 (1991)). La disminución de la expresión de los genes

15 tanto de β-actina como de GAPDH en células senescentes condujo al uso de ARN poli A+ para el análisis northern. El ARN poli A+ se aisló de las preparaciones de ARN celular total utilizadas para la Tabla 2, y se hibridó con ADNc SDI, seguido de β-actina y GAPDH respectivamente

20 (Tabla 3). La Tabla 3 describe los resultados de un análisis Northern de ARN poli A+ de la expresión del gen SDI en células jóvenes (Y) y senescentes (S). Se utilizó 1 µg de cada uno de los ARN poli A+ de células jóvenes y senescentes para los análisis. La cantidad relativa de

25 ARNm SDI de cada muestra se calculó como en la Tabla 2.

Tabla 3: Cuantificación del Análisis Northern

ATRIBUTO

SDI-1 SDI-2 SDI-3

Y

S Y S Y S

Cantidad Relativa de GAPDH

1,0 0,83 1,0 0,87 1,0 0,87

Cantidad Relativa de SDI/GAPDH

1,0 11,4 1,0 1,0 1,0 1,0

Los resultados indicaron claramente que la expresión tanto de β-actina como de GAPDH era igual en células 5 jóvenes y senescentes cuando se comparaban basándose en el ARNm, coincidiendo con las observaciones anteriores. Cuando se comparaba la expresión del gen SDI a nivel de ARNm, el ARNm SDI-1 aumentaba 11 veces en las células senescentes, mientras la expresión de SDI-2 y SDI-3 10 permanecía constante durante toda la vida útil in vitro (Tabla 3). Este resultado sugiere que SDI-1 es un inhibidor específico de la senescencia celular de la síntesis de ADN, mientras SDI-2 y SDI-3 son muy probablemente inhibidores más generales implicados en la

15 regulación del ciclo celular.

EJEMPLO 7

CAMBIOS DEL CONTENIDO DE ARN POLI A DURANTE LA 20 SENESCENCIA CELULAR

La observación de que los resultados de los análisis

northern del ARN total frente al poli A+ eran

cuantitativamente diferentes, indicó que el contenido de

25 ARN poli A+ en las preparaciones de ARN total podría cambiar durante la senescencia celular. Para someter a ensayo esta hipótesis, las células se cultivaron en serie y el ARN total se cosechó a diferentes niveles de duplicación de la población. El ARN poli A+ se aisló de cada muestra.

El resultado indicó claramente que el contenido de ARN poli A+ disminuía gradualmente durante la senescencia celular (Figura 4). En la Figura 4, se cultivaron las células seriadamente y se cosechó el ARN total. Se trazó el ARN poli A+: % de ARN total frente a la edad del cultivo (% de vida útil in vitro completada). Las células senescentes tuvieron 3-4 veces menos ARN poli A+ cuando se compararon con células muy jóvenes. No obstante, cuando se calculó el contenido de ARN total por célula, las células senescentes tuvieron 1,3-1,5 veces más que las células jóvenes (véase, Cristofalo, V.J., y Kritchevsky, D., Med. Exp. 19:313-320 (1969)).

Con el fin de determinar si el mensaje de SDI-1 aumentaba gradualmente durante el subcultivo o si se producía un rápido incremento cerca del final de la vida útil in vitro, se hibridó el ARN poli A+ de los cultivos en diferentes duplicaciones de la población con la sonda de SDI-1 marcada con P32. Este análisis reveló que la expresión de SDI-1 aumentaba a medida que los cultivos se volvían senescentes, produciéndose un cambio mayor durante los pocos pases finales (Tabla 4). La Tabla 4 muestra la acumulación de ARNm SDI-I durante el proceso de envejecimiento celular. Se hibridó un microgramo de cada ARN poli A+ de las células de diferentes duplicaciones de población con la sonda de SDI-1. La cantidad relativa de ARNm de SDI-1 de cada muestra se calculó como en la Tabla 2.

Tabla 4: Cuantificación de % de Vida ütil Completado

ATRIBUTO

24% 37% 46% 66% 78% 88% 100%

Cantidad Relativa de GAPDH

1,0 1,6 1,5 1,3 1,4 1,3 0,9

Cantidad Relativa de SDI/GAPDH

1,0 2,2 2,1 4,0 3,5 6,2 20,5

Los cambios en la expresión de SDI-1 durante la quiescencia también se examinaron. Las células jóvenes, 5 quiescentes se mantuvieron en medio que contenía suero bovino fetal al 0,5% (FBS) hasta durante tres semanas. El ARN total se cosechó cada semana y se analizó la cantidad de ARN que hibridaba con la sonda de SDI-1. El mensaje de SDI-1 aumentó significativamente durante la quiescencia 10 celular (Tabla 5). La Tabla 5 muestra la acumulación de ARNm de SDI-1 durante la quiescencia celular. Se obtuvieron 4 µg de cada uno de los ARN totales de las células jóvenes cultivadas con medio que contenía FBS al 0,5% durante 1, 2, 3 semanas, se hibridaron con sonda de 15 SDI-1. Se calculó la cantidad relativa de ARNm de SDI-1 como en la Tabla 2 (C: cultivo de control con medio con FBS al 10%). Cuando el resultado se normalizó a la expresión de GAPDH, se encontró que la expresión de SDI-1 había aumentado 18 veces después de dos semanas en medio 20 con bajo contenido de suero en comparación con la del un

cultivo en división de control en medio con FBS al 10%.

Tabla 5: Acumulación de ARNm de Quiescencia Celular

SDI-1 Durante la

ATRIBUTO

C 1 sem 2 sem 3 sem

Cantidad Relativa de GAPDH

1,0 0,72 0,88 0,37

Cantidad Relativa de SDI/GAPDH

1,0 12,2 18,4 14,9

El hecho de que se encontrara que la representación celular del ARNm vs el ARN total cambiara durante la senescencia celular es significativo. Durante el proceso de envejecimiento in vitro, se encontró que el contenido de ARNm disminuía gradualmente (Figura 4), a pesar del ligero incremento del ARN total por célula. Este fenómeno indica una disminución gradual de las expresiones génicas globales durante el proceso de envejecimiento celular, y explica el descenso de expresión de los genes de β-actina y GAPDH en células senescentes cuando se realizó el análisis de transferencia Northern con el ARN total (Tabla 2). No obstante, los niveles de expresión de estos genes domésticos entre células jóvenes y senescentes eran caso constantes cuando se realizaba el análisis de transferencia Northern con ARN poli A+ (Tabla 3). Este análisis reveló la fuerte expresión del mensaje de SDI-1 en células senescentes, y una expresión sin cambios de los genes SDI-2 y 3 a lo largo de toda la vida útil in vitro.

EJEMPLO 8

EL GEN SDI-1

El gen SDI-1 codifica un inhibidor específico de la célula senescente de la síntesis de ADN. El aumento de expresión de este gen se produjo cuando las células entraron en sus pocas divisiones finales (Tabla 4). La cinética de expresión se correlacionaba bien con la expresión fenotípica de las células senescentes. También se encontró que la expresión del gen SDI-1 aumentaba después de que las células jóvenes se volvieran quiescentes y no se dividieran por privación de suero (Tabla 5). Este resultado demuestra la implicación de este gen en la inhibición de la síntesis de ADN de la quiescencia celular así como de la senescencia. Se ha demostrado que las células que se han vuelto quiescentes por privación de factores de crecimiento del suero producen un inhibidor de la síntesis de ADN con características similares a las del inhibidor de células senescentes (Pereira-Smith, O.M. et al., Exp. Cell Res. 160:297-306 (1985); Stein, G.H., y Atkins, L., Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 83:9030-9034 (1986)).

El hecho de que la expresión de SDI-I aumente tanto durante la senescencia como la durante la quiescencia indica que es un inhibidor de la síntesis de ADN (Smith, J.R., J. Gerontol. 45:B32-35 (1990)). Alternativamente, las secuencias SDI-1 podrían estar relacionadas con genes específicos de la detención del crecimiento recientemente clonados de células de ratón (Schneider, C. et al., Cell 54:787-793 (1988); Manfioletti, G. et al., Mol. Cell. Biol. 10:2924-2930 (1990)).

EJEMPLO 9

LA EXPRESIÓN DEL PRODUCTO GÉNICO DE SDI-1

El ADNc de SDI-1 ha sido expresado en dos sistemas de expresión bacteriana diferentes, ha sido transcrito in vitro y traducido en dos sistemas in vitro diferentes. Se utilizaron dos sistemas de expresión bacteriana diferentes con el fin de maximizar la probabilidad de obtener cantidades suficientes de proteína SDI-1. En el primer sistema de expresión, la proteína SDI-1 fue expresada como una proteína de fusión de glutation Stransferasa a rendimientos de 5-10 µg por litro de cultivo bacteriano. La proteína recombinante pudo ser escindida con trombina y purificada con el fin de dar una proteína SDI-1 con unos pocos aminoácidos extra. La fusión con GST se formó escindiendo un polinucleótido que codificaba GST de Schistosoma japonicum con BamHI con el fin de producir un fragmento de escisión que contuviera los nucleótidos 1-673 de la secuencia codificante de GST. El sitio BamHI libre de la posición 673 generado por dicho tratamiento fue ligado después al polinucleótido codificante de SDI-1 con el fin de formar la fusión génica GST-SDI-1. La proteína de fusión GST-SDI-1 fue producida por medio de la expresión recombinante de esta fusión génica.

En el segundo sistema de expresión, se utilizó una etiqueta amino terminal de 6 histidinas con el fin de ayudar a la purificación. Esta proteína recombinante puede ser utilizada sin modificación adicional. Ambos sistemas permitieron el aislamiento de preparaciones puras de proteína.

En el transcurso de este experimento, se utilizaron sistemas de transcripción y traducción in vitro para confirmar el marco de lectura abierto deducido de la secuencia de ácido nucleico del ADNc de SDI-1. El peso molecular calculado de la proteína SDI-1 es de aproximadamente 16.000 daltons. La proteína sintetizada in vitro migra, mediante SDS PAGE, con una movilidad relativa de aproximadamente 21.000 daltons. Esta pequeña diferencia puede ser debida a una carga o una conformación ligeramente inusual de la proteína SDI-1. Una secuencia de aminoácidos parcial de la proteína expresada bacterianamente verificó el marco de lectura abierto (SEQ ID NO: 2).

Se utilizaron las proteínas expresadas bacterianamente para generar antisueros policlonales y anticuerpos monoclonales para la proteína nativa intacta.

Tales anticuerpos pueden ser más eficaces en la inmunoprecipitación de la proteína SDI-1 y los complejos de proteína SDI-1 que los antisueros producidos a partir de péptidos sintéticos. Los estudios inmunocitoquímicos preliminares, utilizando un antisuero de la más alta afinidad (antisueros núm. 55) que reaccionaba fuertemente con la proteína de fusión en una transferencia western a una dilución 1:20.000, sugirieron que la proteína SDI-1 era relativamente abundante en células senescentes en comparación con células jóvenes en división. En las células senescentes la localización parece ser perinuclear, mientras en células jóvenes parece haber una pequeña cantidad de proteína SDI-1 localizada en el núcleo. Con el fin de obtener una tinción específica fue necesario pre-absorber los antisueros frente a una monocapa de células fijadas de células que no expresan niveles detectables de ARNm SDI-1 (TE85). Las células fueron fijadas con paraformaldehído al 4% seguido de metanol.

Con el fin de estudiar el fenotipo celular resultante de la expresión inducida del ARNm SDI-1 en células que normalmente expresan el gen a bajos niveles y para examinar el efecto de los constructos SDI-1 antisentido es deseable obtener líneas celulares en las que el gen SDI-1 esté integrado establemente bajo el control de un promotor inducible. Para este objetivo, se construyó un vector funcional que contenía SDI-1 bajo el control del promotor de la metalotioneína. Después de la transfección de este constructo a células competentes jóvenes en proliferación y de la incubación en presencia de cloruro de cinc 100 µM y cloruro de cadmio 2 µM, se inhibió la síntesis de ADN en aproximadamente 50%. En ausencia de metales no hubo inhibición de la síntesis de ADN. La actividad inhibidora observada no se debe a la toxicidad del metal puesto que se encontró que las células transfectadas con el vector de control (pcDSRα) y desarrolladas en presencia de metales tienen aproximadamente 90% de la capacidad sintética de ADN de las células transfectadas con el mismo plásmido desarrollado en ausencia de metales.

Con el fin de demostrar que los efectos inhibidores observados con SDI-1 no estaban relacionados con la naturaleza del promotor específico utilizado para conducir la expresión, se investigó la capacidad de SDI1, expresado a partir de otros promotores, para inhibir la síntesis de ADN. Por consiguiente se co-transfectaron fibroblastos humanos en proliferación jóvenes con CMV-βgal y CMV-SDI-1. La transfección de células con CMV-β-gal tuvo un efecto pequeño sobre la síntesis de ADN mientras CMV-SDI-1 fue incluso más eficaz que SDI-1 en el vector pcDSRα en estos experimentos concretos.

El antígeno T grande de SV40 es capaz de inducir a las células senescentes a sintetizar ADN. Por lo tanto fue interesante determinar si la acción inhibidora de SDI-1 podía ser superada por la expresión del antígeno T. Por otra parte, fue deseable determinar que la acción de SDI-1 no se debía a la inducción de un desequilibrio metabólico general en las células. Si éste era el caso, no cabría esperar que el antígeno T grande susctitara antagonismo sobre su efecto. Por estas razones, se cotransfectaron las células con ADNc SDI-1 y vectores en los cuales el antígeno T estaba conducido por el promotor de CMV. Semejantes experimentos de co-transfección revelaron que la actividad inhibidora de SDI-1 era abolida en gran parte por la co-expresión del antígeno T grande de SV40.

Se realizaron análisis de transfección transitoria utilizando una línea celular de fibroblastos humanos normales adicional (línea celular de prepucio (CSC303) y línea celular inmortal W138 con el fin de determinar la generalidad del efecto inhibidor de SDI-1. En ambos casos, se observó una inhibición significativa (40-50%). Además, se encontró que SDI-1 inhibía SUSMI (40%) pero no una línea de células transformadas de SV40 GM639 o células HeLa (< 20%). Los resultados hasta ahora son coincidentes con los resultados anteriores obtenidos a partir de experimentos con heterocariones en los que las células HeLa y las células transformadas con el virus SV40 no fueron inhibidas por la fusión con células senescentes. Esto proporciona una evidencia adicional de que SDI-1 se comporta como el inhibidor detectado previamente en células senescentes.

EJEMPLO 10

ANÁLISIS SOUTHERN DEL GEN SDI-1

Con el fin de determinar si la ausencia o inactividad de SDI-1 era responsable de la inmortalidad celular en cualquiera de los cuatro grupos de complementación para la división indefinida, se examinó el ADN y el ARNm de líneas celulares representativas de los cuatro grupos. El análisis Southern reveló las bandas de 5 y 10 kb esperadas tras la digestión con EcoRI. Por lo tanto, no se han producido deleciones o transposiciones groseras en el gen SDI-1 en estas líneas celulares. Mediante análisis Northern, se determinó que el ARNm de SDI-1 era inferior o estaba ausente en las líneas celulares que habían sido asignadas a los grupos de complementación B y C. SDI-1 estuvo presente a niveles superiores en las líneas celulares representativas de los grupos de complementación A y D. Este resultado sugiere que parte del mecanismo por el cual las líneas celulares pueden haber escapado de la senescencia celular es a través de la pérdida de capacidad para expresar niveles suficientes del gen SDI-1 activo.

EJEMPLO 11

CARACTERIZACIÓN DE SECUENCIAS SDI

Utilizando un método de escrutinio funcional, se identificó un gen inhibidor de la síntesis de ADN novedoso, SDI-1. El gen es expresado a niveles elevados en fibroblastos humanos que no están en proliferación. Los niveles de mensaje de SDI-1 aumentaron de 10 a 20 veces a medida que los cultivos celulares humanos normales envejecían in vitro, con una cinética de expresión íntimamente correlacionada con la expresión fenotípica de la senescencia celular. Además, el mensaje de SDI-1 aumentó cuando las células se hicieron quiescentes por privación de factor de crecimiento.

Los resultados descritos antes demuestran que SDI-1 codifica un producto génico fisiológicamente activo, novedoso que es importante para el control del ciclo celular. La expresión del gen es modulada durante la salida desde la fase Go y la entrada en la fase S en células que han sido estimuladas para que entren en el ciclo celular. Además, la expresión del mensaje de SDI-1 antisentido estimula a las células a entrar en el ciclo celular en ausencia de factores de crecimiento. La observación de que el antígeno T de SV40 puede contrarrestar la actividad inhibidora de SDI-1 de una manera similar a la observada con los reguladores del crecimiento negativos p53 y Rb (Lane, D.P. et al., Nature 278:261-263 (1979); Linzer, D.I.,H. et al., Cell 17:43-52 (1979); De Caprio, J.A. et al., Cell 54:275-283 (1988)), subraya la importancia de este producto génico en la regulación del ciclo celular.

La proteína SDI-1 recombinante de la presente invención inhibe la fosforilación de la histona H1 por CDK2. Puesto que SDI-1 bloquea la síntesis de ADN, este descubrimiento indica que la fosforilación de la histona H1 tiene un papel en el inicio de la síntesis de ADN.

El producto génico SDI-1 también es un potente inhibidor de varias quinasas dependientes de ciclina, incluyendo CDC2, CDK2, y CDK4. En experimentos similares utilizando extractos de células humanas, se encontró que el SDI-1 recombinante inhibía la actividad de la quinasa CDK2. Estos resultados tienen una particular importancia a la vista de lo que se conoce sobre las diferentes proteínas implicadas en el progreso del ciclo celular. Se encontró que numerosos candidatos a ciclina G1 humana (ciclinas C, D, y E), identificadas por su capacidad para complementar una cepa de levadura en gemación que carecía de ciclinas G1 (Xiong, Y. et al., Cell 65:691-699 (1991); Lew, D.J. et al., Cell 65:1197-1206 (1991); Xiong, Y. et al., Curr. Biol. 1:362-364 (1991); Koff, A. et al., Cell 66:1217-1228 (1991)), tenían el ciclo celular regulado, produciéndose la expresión máxima del ARNm en diferentes puntos de GI (Lew, D.J. et al., Cell 65:1197-1206 (1991)). Puesto que las ciclinas de tipo D y la ciclina E están asociadas con complejos de quinasa activos (Koff,

A. et al., Cell 66:1217-1228 (1991); 1992; Dulic, V. et al., Science 257:1958-1961 (1992); Matsushime, H. et al., Cell 65:701-7139 (1991); Ewen, M.E. et al., Cell 73:4874976 (1993); Kato, J.Y. et al., Genes Devel. 7:331-342 (1993), es probable que estas quinasas tengan un papel en la dedicación de las células de mamífero a una nueva ronda de división celular en el "punto de restricción". (Pardee, A.B., Science 246:603-608 (1989)). En efecto, informes recientes indican que los complejos de ciclina E-quinasa CDK2 tienen una actividad máxima en la fase G1 tardía y en la S temprana (Dulic, V. et al., Science 257:1958-1961 (1992); Koff, A. et al., Cell 66:1217-1228 (1991)), y también tienen la capacidad de fosforilar la proteína RB en células humanas cultivadas (Hinds, P.W. et al., Cell 70:993-1006 (1992)) e in vitro (Ewen, M.E. et al., Cell 73:487-4976 (1993)). Esto sugiere que la quinasa puede jugar un papel trascendental en la regulación de la transición de la fase G1 a la S del ciclo celular.

Las inmunotransferencias de proteína SDI-1 han revelado que los niveles de esta proteína no parecen variar exhaustivamente en células en diferentes grados de crecimiento (esto es, células en crecimiento activo frente a quiescentes o senescentes). Sin embargo, en células que no están en división en comparación con las que están proliferando se encuentran presentes cantidades consistentemente superiores de proteína. Esto parece razonable porque SDI-1 es un potente regulador negativo de la actividad de CDK, y la estrecha regulación de este inhibidor sería esencial para la regulación y el progreso apropiados del ciclo celular. Pequeños cambios en la cantidad de proteína inhibidora podrían dar como resultado un impacto muy importante sobre los diferentes productos génicos que controla. Al menos dos CDK: CDC2 y CDK2, mantienen niveles de proteína en estado estacionario relativamente constantes a lo largo del ciclo celular a pesar de los cambios dependientes de la fase del ciclo celular en el ARNm. SDI-1 puede estar regulado de una manera similar, de modo que el nivel de proteína SDI-1 esté controlado precisamente a un nivel concreto, y que se necesite una nueva síntesis y activación de CDK/ciclina para superar los efectos inhibidores de SDI-1 para permitir el progreso a través del ciclo celular. De este modo, SDI-1 evitaría la entrada en el ciclo celular hasta que estuviera presente un umbral requerido de productos génicos estimuladores, permitiendo que la célula pasara al "punto de restricción" del ciclo celular. Semejante equilibrio dinámico entre complejos de CDK/ciclina activos y la proteína SDI-1 inhibidora explica la estimulación observada de la síntesis de ADN en células quiescentes después de una pequeña disminución en los niveles en estado estacionario de la proteína SDI-1 debido a la expresión del ARNm de SDI-1 antisentido. De este modo, SDI-1 puede funcionar en la célula de una manera similar a otros inhibidores de la proliferación celular, tales como los genes supresores de tumores p53 y Rb, y el gen SDI-1 puede ser una diana para la mutación en diferentes tumores.

Aunque las células senescentes no pueden ser estimuladas para entrar en la fase S mediante la adición de mitógenos, no expresan los ARNm para muchos genes regulados por el ciclo celular incluyendo las ciclinas D1, la ciclina E, CDK2, Rb, p53, c-H-ras, c-myc, c-jun, y jun B. No obstante, otros diversos genes regulados por el ciclo celular importantes, incluyendo c-fos, histona H3, CDC2, ciclina A, ciclina B1, y PCNA, no son expresados en células senescentes estimuladas por mitógenos. La carencia de fosforilación del producto proteico del gen de susceptibilidad a retinoblastoma Rb en células senescentes podría ser una causa de la incapacidad de las células senescentes para sintetizar ADN. No obstante, los complejos de ciclina E-CDK2, aunque relativamente abundantes en células senescentes, carecen de la actividad quinasa que podría fosforilar potencialmente Rb in vivo.

Las moléculas SDI de la presente invención son expresadas a un nivel superior en las células senescentes que en las que están en ciclo activamente. De este modo, la carencia de actividad CDK apropiada a través de la acción reguladora de SDI-1 podría ser una razón clave para la incapacidad de las células senescentes para entrar en la fase S. Esto es apoyado por el hecho de que las células senescentes carecen principalmente de eventos aguas abajo de la inhibición de CDK2 mediada por SDI-1 postulada.

Se ha encontrado que la sobreexpresión de E2F-1, un componente del factor de transcripción E2F-1 que tiene una amplia gama de genes diana, es capaz de revertir el efecto inhibidor de SDI-1. Está bien establecido que el gen supresor de tumores Rb, así como los complejos de proteína p107 relacionados con E2F-1 inhiben la transcripción. La expresión en exceso de ciclinas A y E revierte la supresión mediada por Rb de la proliferación. Además, la expresión en exceso de E2F-1 puede inducir a las células REF-52 quiescentes a sintetizar ADN. De este modo, a la vista de la observación de que E2F-1 revierte la actividad de crecimiento negativo de SDI-1, E2F-1 puede ser la última etapa en una cascada de eventos controlada por p53, SDI-1 y Rb.

EJEMPLO 12

LA RELACIÓN ENTRE SUPRESORES TUMORALES CELULARES Y SECUENCIAS SDI

Un papel para SDI-1 en la detención del ciclo celular está indicada por el hecho de que en células humanas normales que se han vuelto quiescentes por privación de suero o crecimiento a una elevada densidad, los niveles de ARNm de SDI-1 aumentaron 10-20 veces en comparación con las células en ciclo. No obstante, tras la adición de suero, se encontró que los niveles de ARNm de SDI-1 disminuían rápidamente a niveles bajos justo antes del comienzo de la síntesis de ADN. De este modo parece que SDI-1 actúa como un "punto de verificación" para inhibir la proliferación celular en presencia de condiciones externas desfavorables. Muchas líneas celulares inmortales son incapaces de bloquear el inicio de la síntesis de ADN en respuesta a factores de crecimiento insuficientes. No obstante, de acuerdo con la presente invención, la sobreexpresión de SDI-1 en diferentes células humanas inmortales dio como resultado la inhibición de la síntesis de ADN en varias de las líneas celulares con independencia de su capacidad para detener la proliferación celular en respuesta a la disminución de factores de crecimiento.

La trascendencia fisiológica entre la expresión en exceso de SDI-1 y la inhibición de la proliferación celular por una expresión en exceso de SDI-1 es reforzada por el descubrimiento de que SDI-1 puede inhibir la actividad quinasa de los complejos de ciclina/cdk2. En efecto, como indica la adición de 250 ng de proteína de fusión GST-SDI-1 purificada a complejos de ciclina/cdk2 (inmunoprecipitados de extractos de células HeLa por antisueros cdk2) que dio como resultado la inhibición máxima de la actividad de la histona H1 quinasa.

Con el fin de investigar adicionalmente el mecanismo molecular a través del cual SDI-1 mediaba su actividad proliferativa, los niveles en estado estacionario de ARN de SDI-1 fueron evaluados en numerosas líneas celulares inmortales, incluyendo MDAH 041. La línea celular MDAH 041 se obtuvo de un paciente con síndrome de Li-Fraumeni, y no sintetiza p53. Se encontró que las células eran capaces de continuar sintetizando ADN en presencia de bajo contenido en suero de factores de crecimiento.

Los niveles de SDI-1 se determinaron mediante análisis northern y se normalizaron para el ARNm de GAPDH

o b-actina. El ADN fue introducido mediante electroporación. Las células que crecían rápidamente se trataron con tripsina y se suspendieron 106 células en 0,5 ml de solución salina tamponada con fosfato junto con 10 µg de ADN portador, 1 µg de pCMVb (MacGregor, G.R. et al., Nucl. Acids Res. 17:2365 (1989)) que codificaba el gen de la b-galactosidasa y 1 µg de pCMVSDI-1 (que contenía los nucleótidos 1-685 a SDI-1). El plásmido pCMVb sirvió como marcador para detectar las células que eran capaces de incorporar y expresar ADN exógeno. Después de un pulso de 250-350 voltios, se sembraron 3 x 105 células en fuentes para el cultivo de tejidos de 35 mm. Se añadió timidina tritiada (1 µCi/ml) al medio de cultivo 24-30 horas después de la electroporación y las células se incubaron durante 24 horas más. Las células se fijaron, se tiñeron en busca de actividad bgalactosidasa, y se trataron para la autorradiografía para determinar el porcentaje de células positivas para b-galactosidasa que habían sintetizado ADN en presencia de timidina tritiada. Se determinó el porcentaje de inhibición con respecto a las células de control que estaban transfectadas con el vector con pCMV y pCMVb. Se utilizó la transfección con calcio en el caso de las células MDAH 041. La correlación entre los niveles de ARNm de SDI-1 y la síntesis de ADN se presenta en la Tabla 6. Los datos se presentan como medias de al menos dos experimentos.

Tabla 6: Correlación entre el nivel de ARNm de SDI-1 y la Inhibición de la síntesis de ADN

Línea Celular

% Inhibición Nivel de ARNm de SDI-1 Estado P53

MADH 041

95 ± 4 No Detectable Mutante

SAOS2

47 No Realizado Mutante

TE85

75 ± 7 No Detectable Mutante

T98G

35 ± 5 No Detectable Mutante

Hela

60 ± 5 Bajo Infectado HPV-18

A1698

15 ± 3 Normal Tipo salvaje

UABC023 Ser 31 → Arg 31 Homozigoto

57 ± 6 Bajo Desconocido

GM639

78 Normal Transformado SV40

GM847 Ser 31 → Arg 31 Heterozigoto

21 Normal Transformado SV40

RN13

Sin Inhibición Normal Desconocido

PR282

Sin Inhibición Normal Desconocido

Como se ha indicado en la Tabla 6, se encontró que los niveles de ARNm de SDI-1 eran muy bajos o no detectables en varias líneas celulares que también carecían de proteína p53 de tipo salvaje.

Significativamente, el ARNm y la proteína SDI-1 no eran detectables en las células MDAH 041. La correlación entre el nivel de p53 y el nivel de SDI-1 sugirió que p53 mediaba su actividad supresora de tumores induciendo un estado senescente a través de la inducción de SDI-1, y que las células que carecían de p53 eran neoplásicas debido a su capacidad para inducir la expresión de SDI-1.

A la vista del papel bien establecido de p53 en el control del crecimiento celular y como activador o supresor transcripcional, y del hecho de que las células MDAH 041 no expresen p53 de tipo salvaje, el descubrimiento de que también carecían de expresión de SDI-1 indicaba que la introducción de p53 en estas células daría como resultado una inducción de la expresión de SDI-1 y de este modo, la detención del crecimiento.

Para demostrar adicionalmente la capacidad de p53 para inducir la expresión de SDI-1, se introdujo p53 en células MDAH 041. Semejante introducción dio como resultado un aumento de la expresión de SDI-1 y de la inhibición de la síntesis de ADN, medido mediante autorradiografía con timidina tritiada. El grado de inhibición aumentó con la cantidad de plásmido p53 introducida. Si la inhibición de la síntesis de ADN observada se debía a una inducción de SDI-1 por p53, en lugar de por algún otro efecto de p53, la actividad inhibidora se perdería después de la co-transfección de secuencias de SDI-1 antisentido.

Por lo tanto, para demostrar la inducción deseada de SDI-1 por p53, se co-transfectaron las secuencias de SDI1 y del gen SDI-1 antisentido descritas antes con un constructo con el gen p53 en fibroblastos humanos

normales. Como se esperaba, se encontró que el constructo antisentido eliminaba el 80% de la inhibición de la síntesis de ADN ocasionada por SDI-1 solo. Cuando se cotransfectaron 4 µg de SDI-1 y cantidades crecientes de 5 plásmidos con p53 en células MDAH 041, se encontró que el SDI-1 antisentido era capaz de contrarrestar eficazmente la inhibición de la síntesis de ADN causada por p53 solo. Estos descubrimientos se resumen en la Tabla 7. Este descubrimiento verificó la conclusión de que una manera 10 en la cual p53 ocasiona la inhibición de la síntesis de ADN es por medio de la activación de la expresión SDI-1 y de que semejante inducción de SDI-1 es un requisito para parte de la actividad inhibidora de la síntesis de ADN de p53. Semejante activación se produce, al menos en parte, 15 mediante la activación transcripcional del gen SDI-1. La proteína SDI-1 expresada actúa, en parte, inhibiendo las actividades quinasa de los complejos de CDK/ciclina y por lo tanto puede actuar en múltiples puntos del ciclo celular para bloquear el progreso. La pérdida de la

20 actividad de p53 de tipo salvaje conduciría a la carencia de expresión de SDI-1 y de ese modo daría como resultado un progreso del ciclo celular inapropiado.

Tabla 7: Inducción de SDI-1 por P53

Cantidad de ADN de P53

Síntesis de ADN (como % aprox. del control)

Transfectado (ng)

P53 Solo P53 + anti-SDI-1

0

100 121

10

25 50

30

15 45

100

10 25

Las mutaciones en el gen que codifica la proteína

p53 son comunes en los tumores humanos expresando aproximadamente el 50% de los tumores un p53 mutante. Esto ha conducido a la conclusión de que p53 actúa como regulador del crecimiento negativo y es un gen supresor de tumores. Un aspecto de la presente invención tiene que ver con el reconocimiento del mecanismo celular responsable de la actividad anti-oncogénica de p53. Se ha encontrado que SDI-1 es un inhibidor del progreso del ciclo celular que actúa al menos en parte, inhibiendo las actividades quinasa de los complejos de cdk/ciclina. Como tal, puede actuar en múltiples puntos del ciclo celular bloqueando el progreso. Puesto que p53 es necesario para la activación transcripcional de SDI-1, la inactivación de esta función podría permitir un progreso del ciclo celular incontrolado e inapropiado. Esto permitiría que las células ignoraran las señales externas normales para la estasia del ciclo celular y permitirían la proliferación in situ. Puesto que SDI-1 está aguas abajo de p53, parece que SDI-1 es el efector de la acción de p53. Además, se han encontrado mutaciones en SDI-1 que pueden contribuir a la proliferación celular alterada en células sin p53 mutado.

EJEMPLO 13

CAPACIDAD DE SDI-1 PARA SUPRIMIR LA PROLIFERACIÓN DE CÉLULAS TUMORALES

Como se ha indicado antes, SDI-1 tiene la capacidad de suprimir la proliferación de las células tumorales. Para demostrar esta capacidad, se incubaron células derivadas de varios tumores humanos en presencia o ausencia de una proteína de fusión de glutation Stransferasa-SDI-1. En el experimento, se cultivaron en placa 5 x 103 células durante la noche a 37° C (solamente para las células adherentes) y después se incubaron con la proteína de fusión de SDI. Después de 48 horas a 37° C, las células fueron pulsadas con timidina durante 24 horas y después cosechadas. Los resultados de este experimento se muestran en la Tabla 8; la incorporación de timidina por las células no tratadas se expresión como el 100%. Todas las determinaciones se realizaron por cuadruplicado.

Tabla 8: Efectos Antiproliferativos de SDI-1

Línea Celular

Viabilidad Celular Relativa (% de Control)

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50 µg/ml 30 µg/ml

Células Mieloides:

imagen1 imagen1

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Promielocíticas (HL-60) 1 ± 0 1 ± 0

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Promonocíticas (ML-1) 1 ± 0 1 ± 0

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Mielógenas (KG-1) 1 ± 0 1 ± 0

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Mielógenas (KG-1 a) 1 ± 0 1 ± 0

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Linfoma Histiocítico (U-937) 1 ± 0 1 ± 0

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Promonocítico (THP-1) 1 ± 0 1 ± 0

Linfoma Células B

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Linfoma de Burkitt (Daudi) 1 ± 0 3 ± 0

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Linfoma de Burkitt (Raji) 1 ± 0 1 ± 0

Células Epiteliales

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Mama (BT-20) 1 ± 0 1 ± 0

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Mama (BT-20 TNF R) 1 ± 0 1 ± 0

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Mama (SK-BR3) 1 ± 0 1 ± 0

Mama (MCF-7)

1 ± 0 1 ± 0

Tabla 8: Efectos Antiproliferativos de SDI-1

Línea Celular

Viabilidad Celular Relativa (% de Control)

imagen1

50 µg/ml 30 µg/ml

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Mama (T-47 D) 2 ± 0 2 ± 0

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Adenocarcinoma de Pulmón (A-549) 25 ± 3 40 ± 1

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Hepatocelular (Hep G2) 12 ± 2 21 ± 3

Células de Glioblastoma

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Glial (U-251) 35 ± 2 66 ± 4

Células Normales

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Células endoteliales de Vena umbilical humana 2 ± 1 5 ± 1

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Fibroblastos de prepucio humano 1 ± 0 No Realizado

Células Tumorales Murinas

imagen1 imagen1

Fibroblastos (L-929)

4 ± 1 No Realizado

El experimento anterior indica que las células tumorales tratadas con SDI-1 mostraban una profunda supresión de la síntesis de ADN.

5

EJEMPLO 14

EFECTO DEL ADNc DE SDI-1 SOBRE LA PROLIFERACIÓN DE CÉLULAS TUMORALES

10 Se evaluó la capacidad del ADNc de SDI-1 para reprimir la proliferación de las células tumorales. Se introdujo ADNc de SDI-1 en numerosas líneas celulares

derivadas de tumores y otras mediante electroporación. Se mezcló un µg del plásmido con CMV-SDI-1 con 1 µg de plásmido que contenía el promotor de CMV y el gen de la β-galactosidasa. Tras la electroporación, las células se cultivaron en placa y 24 horas después se analizaron en busca de su capacidad para incorporar timidina tritiada. El ADNc de SDI-1 ocasionó una inhibición significativa de la síntesis de ADN en numerosas líneas celulares derivadas de tumores incluyendo melanoma, tumor pulmonar y tumor cerebral. El ADNc de SDI-1 también inhibió la síntesis de ADN en células 3T3 de ratón y en células de músculo liso bovino normal. Tres líneas celulares derivadas de tumores (una línea celular de tumor pulmonar, y dos líneas celulares de tumor renal) fueron insensibles al ADNc de SDI-1.

EJEMPLO 15

EFECTO DEL ADNc ANTISENTIDO DE SDI-1 SOBRE LA PROLIFERACIÓN DE CÉLULAS NORMALES

También se evaluó el efecto de SDI-1 sobre la síntesis de ADN utilizando vectores de expresión antisentido. Se proporcionó ADNc de SDI a las células introduciendo el plásmido pCMVSD1684 que es un derivado del plásmido pCMVβ que carece del gen de la βgalactosidasa, y que contiene los nucleótidos 1-684 de la secuencia de ADNc de SDI-1. Se construyeron vectores antisentido clonando las secuencias antisentido de SDI-1 en pMET, un vector de expresión inducible que contenía un promotor de metalotioneína humana alterado (CSIRO, Biomolecular Engineering, New South Wales, AU). El promotor contiene una deleción den el promotor basal y la adición de elementos de respuesta a metales sintéticos por triplicado. Para la construcción de pMET, se clonaron primero secuencias de adenovirus que contenían los intrones 12S y 13S del gen E1A (esto es, los nucleótidos 917-1673) en el vector de expresión en mamíferos pRc/CMV (Invitrogen) en los sitios Notl/Apal de la región de clonación múltiple de este plásmido para crear pRc/CMV-Ad. Para asegurar que no se había producido traducción de las secuencias de E1A, y para crear un sitio de clonación SPEI en el vector, se insertó un conector SPEI que contenía un codón de terminación entre el promotor de CMV y la secuencia de empalme de E1A en marco con la secuencia de E1A. El promotor de CMV del plásmido Rc/CMV-Ad fue remplazado después por el promotor pM26 para crear pMET.

Para completar esto, se separó por corte el promotor de la metalotioneína de pM26 mediante digestión con Bglll y se insertó en el sitio BamHI de pBluescript (Stratagene). Después se subclonó un fragmento EcoRV y Notl que contenía el promotor a partir de pBluescript en un sitio BglII relleno y un sitio NotI de Rc/CMV-Ad. Las secuencias antisentido del ADNc de SDI-1 fueron obtenidas del ADNc completo clonado en el sitio BamHI de pBluescript. El sitio Stul del nucleótido 127 fue convertido en un sitio Spel mediante inserción de un conector Spel para elaborar SDISPE127. Asimismo se insertó un conector Spel en el sitio Apal en el nucleótido 319 para crear SDISPE319. Estos constructos fueron digeridos con Spel e insertados en orientación antisentido en el sitio de clonación Spel de pMET, creando de este modo los vectores de expresión antisentido de SDI pMET-AS127 (que tenía los primeros 127 nucleótidos de la hebra antisentido de ADNC de SDI-1, SEQ ID NO: 1) y pMET-AS318 (que tenía los primeros 319 nucleótidos de la hebra antisentido de ADNc de SDI-1, SEQ ID NO: 1).

Las líneas celulares que expresan el antisentido de SDI-1 fueron obtenidas mediante transfección con fosfato de calcio. Se transfectaron 3 x 105 células HCA2 (células de prepucio humano) a una duplicación de la población de 10 con 20 µg de pMET, pMETAS127, o pMETAS318. Después de dos semanas de selección con G418, se escogieron las colonias y se expandieron. Se determinaron la inducibilidad y la integridad de la secuencia insertada utilizando transformantes estables mediante la adición de ZnCl2 100 µM y CDCl2 2 µM seguido de análisis de ARN del ARN celular total. El análisis consistió en una protección con ARNasa utilizando sondas de ARN antisentido, marcadas internamente con UTP-[P32]. Se utilizó la sonda pMET+SDI-1, que contenía los nucleótidos 444-686 de SDI-1 (del SEQ ID NO: 1), para medir la expresión de SDI-1 tanto de los genes transfectados como del ARNm endógeno. Después de la digestión con EcoNI, la transcripción a partir del promotor SP6 en el vector pMET dio como resultado una sonda marcada antisentido que hibridaba tanto con el ARN del vector de expresión como con el ARNm de SDI-1 endógeno. Esto permitió una comparación de los niveles de expresión relativos del constructo introducido y el ARN endógeno de SDI-1. Como control, se midió el ARNm de acción β en todos los análisis.

Con el fin de determinar el grado de síntesis de ADN, se trataron con tripsina las células y se sembraron 1 x 104 células por pocillo en placas de 24 pocillos. De cuatro a seis horas después del cultivo en placa, las células se lavaron 3 veces con solución salina tamponada con fosfato y se remplazó el medio por medio que contenía suero bovino fetal al 0,5%. Esta privación de suero indujo quiescencia en las células. De seis a diez días más tarde, el medio se remplazó y se añadió metal para

inducir el promotor de la metalotioneína. La cantidad de metal añadido fue optimizada para cada plásmido; las cantidades optimizadas fueron ZnCl2 70 µM y CdCl2 1,4 µM para pMET1 y ZnCl2 50 µM y CdCl2 1 µM para AS1. Veinte 5 horas más tarde, se reforzó la inducción mediante la adición de medio de nueva aportación. Se añadió timidina [H3] (1,5 µCi/ml) a cada cultivo 4 hors más tarde. Veinticuatro horas después, se fijaron las células y se analizaron mediante autorradiografía. Los resultados

10 obtenidos en un experimento típico se muestran en la Tabla 9, y demuestran la capacidad de las moléculas antisentido de la presente invención para inducir la proliferación de células quiescentes.

Tabla 9

% de Células Marcadas

Línea Celular

Antes de la Inducción con Metal Después de la Inducción con Metal

No Integrante

<5% 5%

Vector Control

<5% 5%

Constructo I Antisentido

7% 49%

Constructo II Antisentido

<5% 57%

15

EJEMPLO 16

CAPACIDAD DE LOS OLIGONUCLEÓTIDOS ANTISENTIDO DE SDI-1 PARA REPRIMIR LA INHIBICIÓN DE LA PROLIFERACIÓN MEDIADA 20 POR SDI

Como se ha comentado, la expresión de SDI-1 inhibe la síntesis de ADN. En algunos casos, tales como la inmortalización de células humanas en cultivo, es deseable reprimir semejante inhibición. Las moléculas antisentido de SDI-1 de la presente invención son capaces de mediar dicha represión.

Con el fin de demostrar la capacidad de los oligonucleótidos antisentido de SDI-1 para reprimir los efectos inhibidores de la síntesis de ADN de SDI-1, se suministró a las células un oligonucleótido que tenía la secuencia:

imagen2

Este oligonucleótido es antisentido con respecto al SEQ ID NO:1 en los nucleótidos 75-93.

Se cultivaron células en medio de cultivo que contenía suero bovino fetal al 10% (FBS) durante aproximadamente una semana, en cuyo momento el medio fue remplazado por medio que contenía FBS al 0,5%. Las células se dividieron en células de control y células experimentales. El Día 1, se suministraron 1, 2 o 5 µM del oligonucleótido descrito antes a las células experimentales; las células de Control no recibieron el oligonucleótido. El Día 3, y de nuevo el Día 5, todas las células recibieron medio de nueva aportación que contenía FBS al 0,5% FBS; las células experimentales recibieron oligonucleótidos adicionales (1, 2 o 5 µM). El Día 6, se añadió timidina tritiada al medio de cultivo y las células se cosecharon el día 7. Las células experimentales (que habían recibido el oligonucleótido antisentido) mostraron un incremento en la cantidad de timidina tritiada incorporada en su ADN, con respecto a las células de control.

Los resultados indicaron que los oligonucleótidos que contenían regiones complementarias a los nucleótidos 75-93 de SDI-1 pueden actuar como represores antisentido de la función de SDI-1.

EJEMPLO 17

EFECTO DEL DETERIORO DEL ADN Y LA DETENCIÓN DEL CRECIMIENTO SOBRE LA EXPRESIÓN DE SDI-1

Los experimentos descritos anteriormente demostraron que p53 induce la expresión de SDI-1, y que la producción del ARNm de SDI-1 se indujo en células inhibidas por contacto y privadas de suero, así como también en células humanas senescentes. Para determinar si la inducción de SDI-1 fue una característica general de los estados de detención del crecimiento, se evaluó el efecto del deterioro del ADN sobre los niveles de ARNm de SDI-1.

Se cree que las células experimentan detención del crecimiento en respuesta a agentes que deterioran en ADN antes de entrar en las fases S o M del ciclo celular. La detención del crecimiento permite a la célula reparar cualquier lesión genética causada por los agentes que deterioran en ADN. Un fallo en la reparación de tal deterioro crea una mutación, y puede tener graves consecuencias que van de muerte celular a neoplasia. De este modo, la capacidad de una célula para experimentar detención del crecimiento en respuesta al deterioro del ADN tiene una gran importancia tanto en la etiología del cáncer como en la respuesta de las células cancerosas a la quimioterapia.

Para evaluar el efecto de los agentes que deterioran el ADN sobre la producción de ARNm de SDI, se emplearon fibroblastos de prepucio neonatal humanos normales (cepa HCA2); una línea celular inmortalizada (TE85, obtenible de la Colección de Cultivos Tipo Americana, Rockville, MD, US), y las líneas celulares MDAH 041 anteriormente descritas. Todas las células se cultivaron en medio esencial mínimo de Eagle con sales de Earl más suero bovino fetal al 10% (Gibco BRL, Gaithersburg, MD, US) en CO2 al 5% a 37°C, o en sales de Hanks más suero bovino fetal al 10% a 37°C. Las células HCA2 lograron aproximadamente 80 duplicaciones de población antes de volverse senescentes. Las células se utilizaron a una duplicación de la población de 27 o menos.

Las células se cultivaron en placa a 1 x 104 células/cm2 sobre cubreobjetos de vidrio y se hicieron crecer durante 24-48 horas a una confluencia de 50-75% y después se trataron con uno de varios agentes que deterioran en ADN: rayos γ (4 Gy); bleomicina (75 µg/ml; 4 horas), etoposido (400 µM en DMSO al 4%; 8 horas), peróxido de hidrógeno (400 µM; 1 hora), luz UV (30 J/m2), metanosulfonato de metilo ("MMS") (100 µg/ml; 4 horas), mitomicina C ("MMC") (5 µg/ml; 30 horas) y CdCl2 (250 µM; 1 hora). Para la irradiación UV, las células se cultivaron en placas para el cultivo de tejido de 150 cm2. Inmediatamente antes del tratamiento el medio se separó y las placas, sin tapas, se colocaron en un dispositivo de entrecruzamiento StratalinkerUV de Stratagene (La Jolla, CA, US) y se irradiaron con una dosis de 30 J/m2. Después se añadió medio con un suplemento de suero de nueva aportación y las células se incubaron a 37°C, CO2 al 5%. Se realizó la irradiación γ sobre las células en medio de cultivo completo en matraces para el cultivo de tejido de 25 cm2, utilizando una fuente fija de Cs137. El ritmo de dosificación fue de 4,21 Gy/min. La exposición fue a 4 Gy. Además, se evaluaron los efectos del choque térmico (42°C; 4 horas), la hidroxiurea (2 mM; 24 horas) y la prostaglandina A2 (10 µg/ml en etanol al 0,1%; 24 hr).

Se añadió timidina tritiada 16 horas después de cada uno de tales tratamientos y las células se incubaron durante 8 horas, se fijaron y se procesaron para la autorradiografía como se ha descrito antes. El ARN se cosechó 4 o 24 horas después del tratamiento utilizando RNAzol B (Cinna/Biotecx, Houston, TX.) de acuerdo con el protocolo del fabricante. Se separaron 10-20 µg de ARN sobre un gel de agarosa al 1,2% con formaldehído al 20%, se transfirieron a una membrana Gene screen plus (EN, Boston, MA), se sondearon, y se cuantificaron. Se determinó la multiplicidad de inducción comparando las muestras tratadas con los controles no tratados. Los controles fueron células tratadas simuladamente sometiéndolas al mismo lavado, cambio de medio, transporte, y fluctuación de temperatura involuntaria que las que recibieron tratamiento. Los controles para los agentes disueltos en etanol o dimetilsulfóxido se expusieron a la misma concentración de disolvente solo. Los valores de ARN de SDI-1 se normalizaron a los niveles de GAPDH. En algunos casos también se realizó la normalización al ARN de actinas y no reveló diferencias sustanciales en la multiplicidad de inducción. Los resultados de este experimento se muestran en la Tabla

10.

Tabla 10: Inducción del ARNm de SDI-1 y Detención del Crecimiento por Varios Tratamientos

Mecanismo de Acción

Agente Dosis Nivel de SDI-1 * % Detención del crecimiento

Roturas de la Doble Hebra

rayos γ 4 Gy 2,0 70%

Roturas de la doble

bleomicina 75 µg/ml 11,8 100%

hebra

imagen1 4 hr imagen1 imagen1

Proteína Asociada

etoposido 400 µM 8,0 100%

Roturas de la Doble

imagen1 8 hr imagen1 imagen1

Hebra

imagen1 imagen1 imagen1 imagen1

Radicales libres

H2O2 400 µM 6,3 95%

imagen1

imagen1

1 hr

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imagen1

Aductos masivos

luz UV 30 J/m2 15,2 60%

(algunos radicales libres)

imagen1 imagen1 imagen1 imagen1

Alquilación

MMS 100 µg 3,27 53%

4 hr

Tabla 10: Inducción del ARNm de SDI-1 y Detención del Crecimiento por Varios Tratamientos

Mecanismo de Acción

Agente Dosis Nivel de SDI-1 * % Detención del crecimiento

Entrecruzamiento

Mitomicina C 5 µg/ml 2,8 100%

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imagen1

30 hr

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imagen1

Metal Mutagénico

CdCl2 250 µM 1,3 0%

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1 hr

imagen1

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Estrés General

Choque térmico 42° C 2,3 No realizado

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4 hr

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Inhibidor de dNTP

hidroxiurea 2 mM 7,9 100%

Síntesis

imagen1 24 hr imagen1 imagen1

Hormona Paracrina

prostaglandina A2 10 µg/ml 6,1 100%

imagen1

imagen1

24 hr

imagen1

* Multiplicidad de inducción de SDI-1 a nivel de 24 horas

Estudios preliminares (EI-Deiry, W.S. et al., Cell 75:817-825 (1993)) sugirieron que la producción de WAF1 podría ser inducida por luz UV. Los experimentos anteriores demostraron que la producción de ARNm de SDI-1 es inducida por el deterioro del ADN y otros tratamientos de detención del crecimiento tanto en células normales como en células que carecen de p53 de tipo salvaje. Los resultados del experimento anterior demostraron el papel de SDI-1 en la reparación del deterioro del ADN o de las mutaciones que podrían conducir a neoplasia en células de mamífero.

Se encontró que cada agente estudiado, con una excepción, causaba un aumento del ARNm de SDI-1 en estas células (Tabla 10). El cloruro de cadmio, a la concentración utilizada, fracasó en el incremento del nivel del mensaje de SDI-1. No obstante, el análisis de incorporación de timidina tritiada reveló que el tratamiento con cloruro de cadmio no indujo detención del crecimiento (sin inhibición de la síntesis de ADN) (Tabla 10). En contraste, la detención del crecimiento, según se midió por la incorporación de timidina tritiada, fue esencialmente completa en respuesta a los otros agentes probados (Tabla 10). Sin embargo, en el caso de la irradiación UV y el tratamiento MMS, se observó una inhibición de sólo 50-60%. Es posible que la detención del crecimiento, en respuesta a estos agentes, no hubiera alcanzado su máximo en el momento en el que se midió la síntesis de ADN o por el contrario ya se hubiera reanudado la proliferación celular. La falta de inducción por cloruro de cadmio indica que el mensaje de SDI-1 aumentó con el deterioro del ADN sólo cuando el deterioró causó la detención del crecimiento. Esto está apoyado por la observación de que el peróxido de hidrógeno fue incapaz de elevar adicionalmente los niveles de ARN de SDI-1 en las células en las que ya se detuvo el crecimiento mediante inhibición por contacto.

Se encontró que las cinéticas de inducción del ARN de SDI-1 mediante irradiación γ y peróxido de hidrógeno diferían (Figura 6), proporcionando una evidencia adicional para los múltiples mecanismos implicados en la regulación de la expresión del gen SDI-1. La inducción del mensaje de SDI-1 mediante irradiación γ para este gen por p53 sigue el curso del tiempo. Se ha demostrado en células de próstata de ratón que la actividad de p53 aumenta rápidamente (en 30 minutos) después de la exposición a radiación ionizante y después disminuye al nivel de la línea base en 3 horas (Lu, X. et al., Cell 75:765-778 (1993)). La inducción del ARN de SDI-1 observada en células humanas normales es similar a este patrón aunque se dilata en el tiempo ligeramente como se podría esperar. La diferencia principal es que el mensaje de SDI-1 disminuye más lentamente (a lo largo de aproximadamente 30 horas) que la actividad de p53, explicando así la observación de Lu, X. et al. (Cell 75:765-778 (1993)). La inducción del ARNm de SDI-1 observada en células humanas normales es similar a este patrón aunque se dilata en el tiempo ligeramente. La diferencia principal es que el mensaje de SDI-1 disminuyó más lentamente (a lo largo de aproximadamente 30 horas) que la actividad de p53. Esto explica la observación de Lu, X. et al. (Cell 75:765-778 (1993)), de que la detención inducida por radiación ionizante perdura durante 20-30 horas, bastante después de que haya declinado la actividad de p53.

La inducción del mensaje de SDI-1 por peróxido de hidrógeno (Figura 6) exhibió un patrón muy diferente. Se ha propuesto que la exposición a peróxido de hidrógeno da como resultado un rápido incremento de la actividad de p53 (Tishler, R.B. et al., Canc. Res. 53:2212-2216 (1993)), que regresa a la línea base mediante 4 horas de post-tratamiento. El nivel de ARNm de SDI-1, en contraste, no aumentó significativamente hasta 9 horas después del tratamiento y continuó aumentando durante al menos 48 horas (Figura 6). La lenta respuesta del nivel de ARN de SDI-1 al tratamiento con peróxido de hidrógeno indica que mientras que parece que nivel elevado de ARNm de SDI-1 está asociado universalmente con la detención del crecimiento, puede no siempre ser la causa inicial de la detención. Se observó un patrón similar de elevación del mensaje de SDI-1 mediante privación de suero e inhibición por contacto de células humanas normales y se parece al que se observa en los casos de estabilización del ARNm. También se observó un lento incremento del ARNm en respuesta a la privación de suero y la inhibición por contacto para los genes GADD (Fornace, A.J. et al., Molec. Cell. Biol. 9:4196-4203 (1989)). En todos estos casos, SDI-1 puede actuar para mantener la detención del crecimiento después de haber sido iniciada por otra ruta.

EJEMPLO 18

PAPEL DE P53 EN LA RESPUESTA DE SDI-1 AL DETERIORO DEL ADN Y LA DETENCIÓN DEL CRECIMIENTO

Como se ha indicado, los agentes que causan la detención del crecimiento, pero no dañan el ADN (choque térmico, hidroxiurea, y prostaglandina A2) también se examinaron (Tabla 10) y se encontró que causaban un aumento en los niveles del mensaje de SDI-1. El choque térmico y los tratamientos con hidroxiurea aumentaron el mensaje de SDI-1 (Tabla 10) aunque se ha demostrado que ninguno de los dos aumentan la actividad de p53 (Lu, X. et al., Cell 75:765-778 (1993); Zhan, P. et al. Molec. Cell. Biol. 13:4242-4250 (1993)), lo que indica que estos agentes pueden operar a través de un mecanismo independiente de p53.

Con el fin de investigar adicionalmente esta posibilidad, el estado de p53 de diversas líneas celulares inmortales se determinó mediante estudios de inmunoprecipitación y se comparó con el nivel de estado estacionario del ARNm de SDI-1 en las mismas líneas celulares. Con este fin, las líneas celulares se cultivaron hasta una confluencia de aproximadamente 70% en matraces de 75 cm2 antes de ser cultivadas durante 1 hora en medio de Eagle modificado de Dulbecco sin metionina, y después se marcaron en un medio sin metionina que contenía suero fetal bovino dializado al 10% y 100 µCi/ml de L-[S35] metionina (TRAN35SLABEL; ICN). Un matraz se utilizó para la inmunoprecipitación. Después de una incubación de 3 horas en este medio de marcaje, las células se colocaron sobre hielo, se lavaron con solución salina tamponada con fosfato (PBS) enfriada con hielo y se recogieron en tampón de lisis (Tris 20 mM, pH 7,4, NaCl 150 mM, NP-40 al 0,5%, EDTA 1 mM, 50 μ/ml de leupeptina, 30 µg/ml de aprotinina). Los productos lisados se rasparon de los tubos de microcentrífuga y se cortaron 3 veces mediante el paso a través de una aguja de calibre 25. Se añadió fluoruro de fenilmetilsulfonilo a una concentración final de 1 mM y los productos lisados se centrifugaron a 14.000 rpm en una microcentrífuga Eppendorf a 4°C durante 45 min. Los volúmenes de sobrenadante se ajustaron para normalizar el número de células, después se preaclararon durante 30 minutos a 4°C durante 45 min. Los volúmenes de sobrenadante se ajustaron para normalizar el número de células, después se preaclararon durante 30 minutos a 4°C en una rueda giratoria con aproximadamente 40 µl de volumen de empaquetamiento de proteína A-agarosa (Pharmacia) que se había revestido de forma secuencial con IgG anti-ratón de conejo (ICN) y una mezcla de dos proteínas de mieloma IgG2a de ratón (ICN). Los productos lisados se centrifugaron después en una microcentrífuga y cada sobrenadante resultante se incubó con 50 µl de volumen de relleno de proteína G PLUS/Proteína A-agarosa (Oncogen Science), recubierto con 4 µg de un anticuerpo específico de p53 apropiado o un anticuerpo no específico de la misma clase y subclase. Los anticuerpos específicos fueron PAb421, que une las dos formas de tipo salvaje y mutante de P53, PAb 240, que reconoce un subconjunto de las formas mutantes, y PAb1620, que reconoce específicamente p53 de tipo salvaje. Todos los anticuerpos p53 se obtuvieron de Oncogene Science. Los anticuerpos no específicos utilizados fueron un anticuerpo IgG1 no específico para la proteína de síntesis de antranilato de E. coli o una mezcla de dos proteínas de mieloma IgG2a. Las incubaciones se llevaron a cabo durante 2 horas a 4°C en una rueda giratoria. Las muestras se centrifugaron en una microcentrífuga y los "sedimentos" se lavaron 4 veces con tampón de lavado enfriado con hielo (Tris 20 mM, pH 7,5, NaCl 150 mM, NP40 al 0,5%, y SDS al 0,1%) luego dos veces con PBS. Las muestras se resuspendieron en 2X tampón de carga (SDS-gel de poliacrilamida al 4%, pH 8,8. El gel se fijó, se trató con Amplify (Amersham), se secó y se expuso a una película Kodak X-AR durante 20 a 28 horas a 80°C.

Si p53 hubiera sido el único regulador de la transcripción del ARNm de SDI-1, la ausencia de p53 de tipo salvaje coincidiría con un bajo nivel de expresión de SDI-1, mientras que, la presencia de p53 funcional debería haber correspondido a un nivel más alto de expresión de SDI-1.

La evidencia de un mecanismo de regulación independiente de p53 de la expresión SDI-1 se obtuvo mediante la exposición de células TE85 y MDAH 041, que carecen de p53 funcional, a muchos de los agentes descritos en la Tabla 10 y la determinación de los

cambios en los niveles del mensaje de SDI-1. TE85 es una línea derivada de osteosarcoma, que se ha encontrado, mediante inmunoprecipitación, que expresa sólo p53 mutante. Todos los tratamientos examinados excepto la 5 irradiación γ, que requiere p53 wt para la detención en G1 (Kuerbitz, S.J. et al., Proc. Natl. Acad. Science. EE.UU. 89 :7491-7495 (1989)), fueron capaces de aumentar el mensaje de SDI-1 en la línea celular TE85 (Tabla 11). La regulación al alza independiente de p53 del nivel de 10 ARN de SDI-1 se confirmó en las células MDAH041 después del tratamiento con peróxido de hidrógeno e hidroxiurea (Tabla 11). El patrón de acumulación de ARNm de SDI-1 es similar por lo tanto al de GADD45. Este gen también requiere p53 funcional para la inducción por irradiación 15 γ, pero no por la mayoría de otros agentes (Zhan, P. et al. Molec. Cell. Biol. 13:4242-4250 (1993)). GADD45 es miembro de una familia de genes que fueron identificados en base a su inducción tanto por la detención del crecimiento como por deterioro en el ADN (Fornace, A.J.

20 et al. Molec. Cell. Biol. 9:4196-4203 (1989)). Estos hallazgos indican que P53 no es el único regulador de SDI-1, y que existen reguladores adicionales de SDI-1. Los métodos anteriores se pueden utilizar para identificar tales reguladores adicionales.

25

Tabla 11

Agente

TE85 MDAH 041

Control

1 1

Rayos γ

1,3 1,1

etopósido

2,6

H2O2

4,0 3,3

Luz UV

3,0

Tabla 11

Agente

TE85 MDAH 041

MMS

4,4 imagen1

MMC

2,5

Hidroxiurea

7,5 2,5

En resumen, los resultados anteriores demuestran

que: 1) una amplia variedad de agentes que inducen la

detención del crecimiento, incluidos los que dañan el

5 ADN, elevan el nivel de mensaje de SDI-1, 2) algunos agentes pueden lograr esto en ausencia de p53 funcional y 3) esta elevación sigue dos patrones temporales distintos. En uno, un aumento de la actividad de p53 da como resultado un aumento paralelo del ARNm de SDI-1.

10 Esto ocurre suficientemente temprano para ser la causa de la detención. En el segundo, un inhibidor del crecimiento que causa la detención mediante un mecanismo que no depende enteramente de p53. Esta detención se asocia con una acumulación gradual de ARNm de SDI-1, tal vez debido

15 a un aumento en la estabilidad del mensaje.

EJEMPLO 19

PRODUCCIÓN DE ANTICUERPOS MONOCLONALES CONTRA PROTEÍNAS 20 DE FUSION DE SDI-1

Los anticuerpos monoclonales anti-SDI-1 fueron aislados como se ha descrito anteriormente utilizando la fusión GST-SDI-1 como inmunógeno y utilizando la fusión

25 [His]6 que tiene la secuencia líder del SEQ ID NO:4 en un escrutinio de hibridomas adecuado. Todos los anticuerpos podrían inmunoprecipitar proteína SDI-1 tanto celular como recombinante además de la proteína de fusión GST

SDI-1.

Los anticuerpos monoclonales se utilizaron en una evaluación inmunohistoquímica de tejido humano. Los anticuerpos (10 µg/ml) de las cuatro líneas de hibridoma (18A10; C6B6; 8A8; 2G12), y de un control de IgG2b de ratón, se incubaron con sobrenadante puro durante la noche a 4°C. El anticuerpo se detectó utilizando el kit Vector Standard ABC con DAB como cromógeno. Se evaluó el tejido de las amígdalas humanas (que contiene tanto un componente linfoide como células epiteliales), piel humana adulta (que contiene tanto componentes del tejido conectivo como células epiteliales) o colon humano adulto (que contiene tejido conectivo y componentes celulares epiteliales glandulares). La tinción se evaluó en una escala cualitativa +/-. El anticuerpo de control no logró la tinción de ningún tejido.

Anticuerpo monoclonal 18A10

Amígdala

ninguna de las capas de células epiteliales, ninguno

de los linfocitos y ninguno de los componentes del

estroma se tiñeron. Piel

todas las capas superiores y posiblemente la capa de

células basales mostraron trazas de tinción

citoplasmática difusa 1 +. Los componentes del

tejido conectivo no se tiñeron. Colon

Las células epiteliales no se tiñeron. La mucosa del

interior de las glándulas mostró trazas de tinción 1

+. Los componentes del tejido conectivo no se

tiñeron.

Anticuerpo monoclonal C6B6

Amígdala ninguna de las capas de células epiteliales, ninguno de los linfocitos y ninguno de los componentes del estroma se tiñeron.

Piel las células epiteliales de la célula basal tenían una tinción citoplasmática difusa +/-a traza +. Los componentes del tejido conectivo no se tiñeron.

Colon Las células individuales entre las células epiteliales mostraron una tinción nuclear/citoplasmática 3 +/. La mucosa del interior de las glándulas no se tiñó. Los componentes del tejido conectivo no se tiñeron.

Anticuerpo Monoclonales 8A8

Amígdala todas las capas de células epiteliales de la capa superior y posiblemente las células basales mostraron una tinción citoplasmática difusa +/-a traza +. Los linfocitos y ninguno de los componentes del estroma mostraron inmunorreactividad.

Piel todas las células epiteliales superiores mostraron una tinción citoplasmática difusa +/-a 1+. Los componentes del tejido conectivo no se tiñeron.

Colon Las áreas de las células epiteliales mostraron una tinción nuclear/citoplasmática 3+. Las mucosas exhibieron una tinción +/-. Los componentes del tejido conectivo no se tiñeron.

Anticuerpo monoclonal 2G12

Amígdala la capa epitelial de células basales mostró trazas de tinción 1+. Algunos linfocitos mostraron trazas de tinción de la membrana. Los componentes del estroma no se tiñeron.

Piel la capa de células basales mostró una tinción citoplasmática difusa 1+. Las capas celulares superiores no parecen teñirse.

Colón Fue evidente el material precipitado de color pardo significativo, lo que sugiere que algunas células epiteliales ductales exhibieron una intensa tinción nuclear. La mucosa del interior de las glándulas no se tiñó. Los componentes del tejido conectivo no se tiñeron

El experimento indicó que los anticuerpos monoclonales podrían distinguir entre tipos de tejidos que expresaban SDI-1 y los que no expresaban SDI-1. Por otra parte, fue posible discernir un patrón diferencial de tinción en tipos de células diferentes. La evaluación inmunohistoquímica se pudo realizar en una biopsia de tejido. La detección de focos de células no teñidos dentro de la masa tumoral podría ser indicativa de células que ya no expresan SDI-1, y que por tanto podrían garantizar una terapia antineoplásica y antimetastásica más agresiva.

EJEMPLO 20

SUMINISTRO DE SDI-1 A CÉLULAS DIANA

La capacidad de entregar un agente farmacológico a una célula constituye un problema general en la definición de los protocolos terapéuticos. Con el fin de evaluar el papel del radical GST para facilitar la absorción celular de SDI-1, se evaluó la capacidad de suministro de fármacos de dos constructos GST-SDI-1.

Construcción de la Primera Fusión GST-SDI-1

La primera de estas fusiones fue la fusión GST-SDI-1 de Schistosoma japonicum especialmente preferida (comentada anteriormente) que inicialmente se había reconocido que era capaz de entrar en las células diana. Sorprendentemente, sin embargo, se encontraron ligeras modificaciones en la estructura de esta fusión que destruye sustancialmente su capacidad de ser absorbida por las células diana. Así, la fusión GST-SDI-1 de Schistosoma japonicum descrita originalmente tenía características propias y distintivas que no se habían reconocido plenamente anteriormente.

La fusión GST-SDI-1 de Schistosoma japonicum especialmente preferida se formó por escisión del plásmido pcDSRαΔ-SDI-1 con Acy1 y EcoRI, liberando de tal modo un fragmento que codifica SDI-1. Acy1 escinde los cuatro nucleótidos del plásmido que preceden al codón de iniciación de SDI-1; EcoRI escinde la molécula aproximadamente en la posición 1010 del SEQ ID NO: 1. El fragmento se clonó después entre los sitios SmaI y EcoRI del plásmido pBS. Este constructo se escindió luego con BamHI y EcoRI para liberar un fragmento que codifica SDI1 que contenía los nucleótidos: GGATCCCCCCGCC (SEQ ID NO: 7) inmediatamente antes del codón de iniciación ATG de SDI-1. El extremo distal de la molécula estaba aproximadamente en la posición 1010 del SEQ ID NO: 1.

El plásmido PGEX2T, que contiene la secuencia que codifica GST de Schistosoma japonicum se escindió con BamHI y EcoRI. La enzima BamHI rompe las secuencias que codifican GST de Schistosoma japonicum en un sitio localizado en los nucleótidos 662-667 de la molécula (aproximadamente en el codón 226 de la molécula); la enzima EcoRI escinde el plásmido fuera de las secuencias que codifican GST. El desdoblamiento enzimático dual evita la religación del plásmido, y asegura que las secuencias SDI-1 se introducirán en la orientación correcta.

El ADN pGEX2T tratado con BamHI-EcoRI se incubó con el fragmento que codificaba SDI-1 antes descrito que contenía, en un extremo los nucleótidos: GGATCCCCCCGCC (SEQ ID NO: 7) inmediatamente antes del codón de iniciación ATG de SDI-1, y en el otro extremo un sitio de escisión por EcoRI. La ligación de las dos moléculas produjo un plásmido en el que las secuencias que codificaban SDI-1 se fusionaron en un nucleótido fuera del marco de las secuencias que codifican GST. Con el fin de restaurar el marco de lectura, el plásmido se escindió con BamHI, los extremos escalonados se llenaron utilizando la ADN polimerasa de Klenow, y luego se ligaron a un conector Xho1 (Promega) de 10 pares de bases que tenía la secuencia: CCCTCGAGGG (SEQ ID NO: 8). Por lo tanto, el constructo final contenía secuencias que codificaban los aminoácidos 1-226 de GST fusionadas a un fragmento de 9 residuos que codificaba Pro-Arg-Gly (residuos 1-3 del SEQ ID NO: 9) fusionado a un conector rellenado con BamHI (SEQ ID NO: 7) que codificaba Asp-Pro-Pro-Ala (residuos 4-7 del SEQ ID NO: 9) fusionado al codón de iniciación ATG de SDI-1 y el resto de la secuencia que codifica SDI-1. La secuencia de nucleótidos de la fusión génica completa se proporciona en el SEQ ID NO:10; la secuencia de aminoácidos codificada por esta fusión génica se proporciona en el SEQ ID NO:11. Una cepa de E. coli transformada con el plásmido pAG20, que contenía la primera fusión génica GST-SDI-1 antes descrita se depositó en la Colección de Cultivos Tipo Americana (Rockville, MD, EE.UU.) bajo los términos del Tratado de Budapest que regulan los depósitos microbianos. El depósito se realizó el 5 de Abril de 1994, y se le asignó el Número de Acceso de Depósito ATCC 69597.

Construcción de la Segunda Fusión GST-SDI-1

La segunda fusión SDI se obtuvo amplificando la región que codifica SDI-1 del plásmido pcDSRaA-SDI-1 utilizando la reacción en cadena de la polimerasa, y los cebadores que tienen la secuencia: Cebador 12614 (SEQ ID NO:12) GGAGGATCCATGTCAGAACCGGCT Cebador 12615 (SEQ ID NO: 13) GCAGAATTCCTGTGGGCGGATTAG

Estos cebadores amplifican un polinucleótido que contiene los residuos 77-587 del SEQ ID NO:1. El cebador 12614 tiene un sitio BamHI inmediatamente aguas arriba del sitio de iniciación de la traducción ATG. El cebador 12615 incluye 14 nucleótidos aguas abajo del sitio de parada de la traducción, e incluye un sitio EcoRI parcial.

El producto amplificado se escindió con BamHI y EcoRI y se clonó en el plásmido pGEX2T del tratado con BamHI/EcoRI descrito antes. El plásmido resultante contenía una fusión en marco que une el codón 226 de la secuencia de GST al codón de SDI-1.

Las dos fusiones de proteína por lo tanto sólo se diferencian en que la primera fusión contiene una "región

imagen3

mientras que la segunda región no contiene región 5 bisagra.

Cuando la primera y segunda fusiones GST-SDI-1 se proporcionaron a células jóvenes, se encontró que la primera proteína de fusión era detectable en las células,

10 mientras que la segunda proteína de fusión no se detectó en las células. Estas observaciones indicaron que mientras que la primera fusión GST-SDI-1 tenía la capacidad de unirse a las células y ser incorporada a las células receptoras, la segunda fusión GST-SDI-1 carecía

15 de esta capacidad. De acuerdo con estas observaciones, de las células jóvenes que habían estado expuestas a cualquiera de la primera proteína de fusión o de la segunda proteína de fusión, sólo las células expuestas a la primera proteína de fusión exhibieron quiescencia.

20

EJEMPLO 21

ANÁLISIS DE DELECIÓN DE LA PROTEÍNA SDI-1

25 Con el fin de investigar los dominios funcionales de la proteína SDI-1, se prepararon varios constructos genéticos en los que se utilizó el promotor de CMV para impulsar la transcripción de fragmentos de la secuencia de ADNc de SDI-1.

30 En concreto, se construyeron polinucleótidos SDI-1 que carecían de los codones para los aminoácidos: 24-29 (designado como: SDI-11-23;25-164), 30-35 (designado como: SDI-11.29;36-164), 42-47 (designado como: SDI-11-41,48-164), 53

58 (designado como: SDI-11-52,59-164), 66-71 (designado como: SDI-11-65,72-164), 72-164 (designado como: SDI-11-71). Además, se construyó un polinucleótido SDI-1 que había sido tratado para eliminar un fragmento Stu -Tth que 5 incluía los codones 16-52 (designado como: SDI-1Stu-Tth). Estos constructos, y un constructo que codificaba SDI-1 intacto (designado como: SDI-11-164) y un vector de control de CMV se co-transfectaron en células MDAH 041 junto con un vector que expresaba β-galactosidasa 10 dirigido por el promotor de CMV. El porcentaje de inhibición del crecimiento se determinó en relación con las células que habían sido co-transfectadas con el vector CMV-β-gal y CMV. Los experimentos se realizaron por triplicado. El porcentaje de inhibición obtenido para

15 cada polinucleótido SDI-1 se muestra en la Tabla 12.

Tabla 12

Constructo

Amino Porcentaje de inhibición

Ácidos suprimidos

Expt. 1 Expt. 2 Expt. 3 Promedio

Vector CMV

ninguno 98 100 98 99

SDI-11-23;25-164

24-29 93 93 92 93

SDI-11-29;36-164

30-35 93 91 83 89

SDI-11-41,48-164

42-47 66 76 75 72

SDI-11-52,59-164

53-58 40 46 57 48

SDI-11-65,72-164

66-71 88 81 88 86

SDI-1Stu-Tth

Stu-Tth 11 36 13 20

SDI-11-164

72-164 90 98 98 95

Los resultados indican que la supresión de los aminoácidos 42-47 causó una disminución en la eficacia y el grado de inhibición. La supresión de los aminoácidos 53-58 muestra una disminución importante en la eficacia y el grado de inhibición. La supresión de la porción carboxi terminal de la molécula de SDI-1 (aminoácidos 72164) no afectó significativamente al grado de inhibición. Por lo tanto, los dominios activos de SDI-1 están presentes en un fragmento de péptido que contiene los aminoácidos 1-71, y los aminoácidos 42-47 y 53-58 contienen dominios SDI-1 activos. En suma, los dominios activos de SDI-1 están contenidos entre los aminoácidos 42-58 de la proteína SDI-1.

EJEMPLO 22

IDENTIFICACIÓN DE UNA PROTEÍNA DE 23 KD INMUNORREACTIVA

Como era de esperar, todos los anticuerpos monoclonales y policlonales anteriormente descritos resultaron ser capaces de inmunoprecipitar una proteína de 21 kD ("p21") correspondiente a SDI-1. El análisis de la proteína inmunoprecipitada por estos anticuerpos reveló que, inesperadamente, los anticuerpos también precipitaron una proteína de 23 kD que estaba presente en los extractos celulares. El hecho de que todos los anticuerpos anti-SDI-1 probados precipitaran esta proteína de 23 kD ("p23") indica que SDI-1 y la proteína de 23 kD están estructuralmente relacionados y comparten epítopos múltiples. El hecho de que la proteína SDI-1 de 21 kD expresada a partir de los vectores de ADNc descritos anteriormente sea biológicamente activa, indica que la proteína 23 kD exhibe las características de un precursor inactivo, fosforilado de la proteína SDI-1 de 21 kD activa.

Al poseer tal precursor, SDI-1 se parece a la proteína Rb que se ha encontrado que presenta estados de fosforilación múltiples que tiene un peso molecular de 110-114 kD, la forma desfosforilada tiene un peso molecular de 110 kD (Lee, W.-H. y col., En: Tumor Suppressor Genes, Klein, G. (ed.), Marcel Dekker, Inc., New York, págs. 169-200 (1990)).

La identificación de una forma fosforilada, inactiva de SDI-1 indicaría que la actividad biológica de SDI-1 es a la vez regulada positivamente mediante la inducción por p53 de la transcripción y regulada negativamente por una quinasa celular. La identificación de tal o tales quinasas se puede determinar fácilmente mediante el escrutinio de una genoteca de ADNc para los miembros que en la expresión producen proteínas que pueden aumentar la fosforilación de SDI-1 con p21 desfosforilada. Tal evolución se puede analizar mediante la realización de transferencias Western de proteína inmunoprecipitada p21p23. Dado que estas enzimas inactivan p21 de SDI-1, confieren una capacidad proliferativa a la célula, y se pueden identificar como moléculas que superan la senescencia inducida por SDI-1. Tales moléculas se pueden emplear de la misma manera que los ácidos nucleicos antisentido de SDI-1. Del mismo modo, las enzimas que desfosforilan la proteína p23 se pueden identificar escrutando polinucleótidos que, después de la expresión, forman una proteína que puede convertir la forma p23 en la forma p21. Los métodos de transferencia Western se pueden utilizar para identificar estas moléculas. Dado que estas enzimas convierten la molécula p23 en la forma p21 activa, tales enzimas confieren una capacidad quiescente o anti-proliferativa a las células. Tales moléculas pueden ser empleadas de la misma manera que SDI-1 o ácidos nucleicos que codifican SDI-1.

EJEMPLO 23

CARACTERIZACIÓN DE FRAGMENTOS SDI-1

Como se ha mencionado anteriormente, el control de la proliferación celular en organismos eucariotas de levaduras a seres humanos implica la síntesis regulada, la activación, y la degradación de una familia de ciclinas que actúan como subunidades reguladoras de las proteínas quinasas denominadas quinasas dependientes de ciclina (Cdk). Las Cdk son necesarias para el inicio de la fase S y la mitosis. El mecanismo de inhibición de la síntesis de ADN por la proteína SDI-1 implica la inhibición de una serie de actividades quinasa Cdk (por ejemplo, cdk1-cdk6)). En efecto, se ha encontrado que la proteína SDI-1 in vivo se asocia con varios de estos complejos de CDK-ciclina mediante inmunoprecipitación con anticuerpos contra los diferentes anticuerpos de ciclina (véase, Xiong, H. et al., Cell 71:505-514 (1992)). Estos complejos se rompen tras la transformación celular con algunos virus tumorales de ADN (Solicitud de Patente PCT WO94/09135; Waga, S. et al., Nature 369:574-578 (1994)), confirmando el mecanismo anteriormente establecido por el cual las proteínas oncogénicas alteran el ciclo celular de las células transformadas. Además, un informe reciente ha confirmado la relación antes descrita entre SDI-1 y p53, y ha demostrado que p53 de tipo salvaje transactiva directamente SDI-1 (Harper, J.W. et al., Cell 75:805-816 (1993); El-Deiry, W.S. et al., Cell 75:817-825 (1993); Xiong, Y. et al., Nature 366:701-704 (1993); Dulic, V. et al., Cell 76:1013-1023 (1994)), confirmando así que es el efector aguas abajo de p53. Estos resultados confirman que SDI-1 no sólo es un regulador negativo durante la proliferación celular normal, sino también es un factor supresor de tumores durante la carcinogénesis.

Con el fin de determinar la región o regiones de la molécula SDI1 que se requerían para inhibir la síntesis de ADN, se construyeron una serie de plásmidos en la que varios ADNc de SDI-1, expresados a partir del promotor de CMV, se truncaron progresivamente desde el extremo 3' de la región codificante. La capacidad de los mutantes de deleción para inhibir la actividad quinasa y/o la síntesis de ADN se evaluó utilizando un ensayo de expresión transitoria y un ensayo de unión con cdk2.

Los plásmidos se construyeron digiriendo el plásmido pCMVβ con NotI para eliminar el gen de la β-galactosidasa de E. coli. Este sitio se volvió romo con Klenow y se insertó un conector Spel con el fin de crear pCMVSpeI. El ADNc de SDI-1 completo se digirió con BamHI y DraI y se clonó en un vector pBluescript. Se ligó un conector Spel en el sitio Hinc II de este vector para crear extremos Spel para los nucleótidos 1 a 686 del ADNc de SDII [plásmido pBSsdil(1-686)Spel]. El fragmento de SDI-1 unido a Spel de este vector se ligó a continuación en el vector pCMVSpel para crear pCMVsdil(1-686), que contiene la región codificante de 164 aminoácidos completa (SEQ ID NO: 2) para la secuencia de ADNc de SDI-1 de tipo salvaje. Una serie de mutantes que codifican versiones truncadas carboxi-terminal de SDI-1 fueron generados utilizando enzimas de restricción que tenían sitios únicos en la secuencia codificante de SDI-1.

HCA2, los fibroblastos diploides humanos normales descritos antes derivados de prepucio neonatal fueron empleados en el análisis mutacional. Estas células alcanzan 80 duplicaciones de población (DP) antes de entrar en senescencia y se utilizaron a una DP de 20-30 en todos los experimentos. Cada constructo se sometió a ensayo en busca de la capacidad para inhibir la iniciación de la síntesis de ADN cuando se transfectaron en HCA2. Después de la transfección, se sometieron a ensayo los constructos de deleción en busca de la producción de proteínas mediante inmunofluorescencia utilizando un anticuerpo monoclonal anti-HA (12CA5, obtenido a partir de BabCO).

La transfección de la región codificante de SDI1 completa dio como resultado una disminución de 90% en el porcentaje de células que incorporaban la timidina tritiada. Un SDI-1 truncado, que codificaba sólo los 71 aminoácidos amino terminales fue tan eficaz como la proteína de 164 aminoácidos completa al bloquear la entrada en la fase S mientras que, una forma truncada más severamente que codificaba sólo los primeros 52 aminoácidos era totalmente inactiva (Tabla 13). Esto indicó que una región crítica para la actividad inhibidora de la síntesis de ADN se encontraba entre los aminoácidos 52 y 71. Así, los fragmentos peptídicos de SDI-1 que tienen los residuos de aminoácido 52-71 comprenden miméticos de la proteína SDI-1. Del mismo modo, las moléculas que imitan un grupo lateral reactivo de SDI-152-71 comprenden miméticos de SDI-1. El papel de la porción amino terminal de la proteína en la inhibición de la entrada en la fase S se aclaró aún más cuando también se encontró que un constructo con una deleción de los aminoácidos 16-52 (plásmido "1-164 (Δ16-52)") había perdido toda la actividad inhibidora de la síntesis de ADN.

Tabla 13

Residuos de aminoácidos Presentes en los fragmentos de proteína SDI-1

% De Inhibición de la Síntesis de ADN con Relación al Control

1 a 164

88%

1 a 123

90%

1 a 82

92%

1 a 71

85%

1 a 52

0%

1 a 16

0%

1 a 164 (Δ16-52)

0%

Para cartografiar más precisamente la región inhibidora de la síntesis de ADN de la molécula, se 5 introdujeron pequeñas deleciones internas (en las que sólo se eliminaron 4-6 aminoácidos y se sustituyeron tres aminoácidos (Pro-Arg-Gly)) en la porción amino terminal de la molécula que los constructos con grandes deleciones habían indicado que eran necesarias para la actividad 10 inhibidora. Las deleciones de seis aminoácidos se construyeron en el ADNc de SDI-1 en los aminoácidos 2429, 30-35, 42-47, 53-58 y 66-71. Estos constructos se fusionaron en marco con el ADN que codificaba una porción de la molécula de hemaglutinina (HA) para proporcionar 15 una etiqueta (HA) de hemaglutinina en marco en el extremo C-terminal de la proteína SDI-1 completa. La etiqueta de HA proporcionó un antígeno único para la inmunotinción, y permitió una determinación de si los productos proteicos se expresaron y de dónde se localizaron dentro de la 20 célula. Para asegurarse de que la etiqueta de HA no interfería con la actividad inhibidora de la síntesis de

ADN de SDI-1, el ADNc que codificaba la especie completa (164 aminoácidos) o truncada (aminoácidos 1-71) también se fusionó a la secuencia de HA en el extremo carboxi. La secuencia de la etiqueta de HA fue introducida mediante la reacción en cadena de la polimerasa (PCR) utilizando los cebadores:

SEQ ID NO: 14

TCTAGGCCTGTACGGAAGTG

(Sitio de empalme en el vector pCMV)

SEQ ID NO: 15

imagen1

La actividad inhibidora de estos ADNc fue la misma que la de los constructos sin la etiqueta de HA. Otro constructo de control se suprimió en los aminoácidos 16-52 y no tuvo 10 actividad inhibidora estuviera etiquetado o no. Curiosamente, y como apoyo adicional de la importancia de la integridad de la región amino terminal de la molécula en la inhibición del crecimiento, los ADNc etiquetados con HA en el extremo amino no tuvieron actividad

15 inhibidora del crecimiento.

Se introdujeron después deleciones en la región

codificante de la proteína del ADNc de SDI-1 en el

plásmido pCMVsdil(I-686)HA mediante PCR. La etiqueta

20 permitió discernir que las proteínas de tipo salvaje y mutada se expresaron en las células transfectadas con los diferentes constructos y también determinar la localización de la proteína mutante.

25 Se utilizaron los siguientes grupos de cebadores para introducir las deleciones indicadas (Tabla 14):

Tabla 14

Aminoácidos suprimidos

SEQ ID NO Secuencia de nucleótidos

24-29

16 TTCGGCCCTCGAGGCCTGAGOOGCGACTGT

imagen1

17 GCTCAGGCCTCGAGGGCCGAAGAGGCGGCGACTGT

30-35

18 TTAGCGCGCCTCGAGGCTGCTCGCTGTCCAC

imagen1

19 CGAGCAGCCTCGAGGCGCGCTAATGGCGGC

42-47

20 GGCTGCCCTCGAGGCCGATGGAACTTCGAC

imagen1

21 CCATCGGCCTCGAGGGCAGCOCGOCATTAG

49-53

22 CGTGAGCGACCCCGGGGCGTCACCGAGACACCACTG

imagen1

23 CTCGGTGACGCCCCGGGGTCGCTCACGGGCCTCCTCCTG

53-58

24 TTCGAOOCTCGAGGCCTGGAGGGTGACTTC

imagen1

25 CTCCAGGCCTCGAGGGTCGAAGTTCCATCG

58-61

26 ACCGAGACATCCCGGGCCGACTTCGCCTGGGAGCGT

imagen1

27 GGCGAAGTCGGCCCGGGATGTCTCGGTGACAAAGTC

61-66

28 OCACTGGAGCCCCGGGGCCGTGTGCGGGGCCTTGGC

imagen1

29 CCGCACACGGCCCCGGGGCTCCAGTGGTGTCTCGGT

66-71

30 GPCTGGCCTCGAGGCGGCCTGCCCAAGCTC

imagen1

31 CAGGCCGCCTCGAGGCCAGGCGAAGTCACC

72-77

32 CGGGGCCTTCCCCGGGGCCTTCCCACGGGGCCCCGGCGAG

33

CGTGGGAAGGCCCCGGGGAAGGCCCCGCACACGCTCCCAG

Cada cebador se utilizó con un cebador que hibridaba con el vector para ampliar una porción del plásmido SDI1, los materiales amplificados a partir de las dos reacciones se agruparon y se permitió que se recocieran.

Las regiones monocatenarias se rellenaron con la polimerasa, y los fragmentos se ligaron a continuación entre sí para producir los vectores circulares cerrados covalentemente deseados. El uso del SEQ ID NO: 26-27 sustituyó los aminoácidos 58-61 de SDI-1 por el tripéptido "Ser-Arg-Ala". Los constructos truncados codificaron de este modo el extremo amino terminal de la proteína hasta el aminoácido 123, 82, 71, 52 y 16, respectivamente. Todos los constructos se secuenciaron para verificar que se habían realizado las deleciones deseadas, que la integridad de la etiqueta de HA estaba intacta y para confirmar que no se habían introducido mutaciones adicionales en los constructos.

Las células HCA2 y MDAH 041 se co-transfectaron con pCMVβ-gal y los plásmidos que portaban el ADN mutado de SDI-1 descrito antes utilizando precipitación con fosfato de calcio. La línea celular MDAH 041 procedía de un paciente con síndrome de Li-Fraumeni, y no sintetiza p53 puesto que una mutación de cambio del marco causa la terminación prematura de la región amino terminal de la molécula p53. MDAH041 fueron las células de elección para estas transfecciones porque no expresan niveles detectables de SDI1. Ellas, por lo tanto, proporcionaron un ensayo más sensible a pequeños cambios en la actividad inhibidora de la síntesis de ADN de lo que se podría esperar en el caso de estos constructos mutantes mínimamente suprimidos.

Se añadió timidina tritiada de 1 µCi/ml al medio de cultivo 24 horas después de la transfección y las células se incubaron durante un período adicional de 36 horas. Las células se fijaron, se tiñeron en busca de actividad β-galactosidasa, y se trataron para su autorradiografía para determinar el porcentaje de células positivas a la β-galactosidasa que habían sintetizado el ADN. El porcentaje de inhibición se determinó en relación con las células de control co-transfectadas con el vector pCMV y pCMVB-gal.

Se encontró que la deleción de los aminoácidos 53-58 daba como resultado la mayor pérdida de la actividad inhibidora de la síntesis de ADN (que fue alrededor del 50% de la del ADNc completo). Otras dos deleciones (de los aminoácidos 42 a 47 y de los aminoácidos 66 a 71 del SEQ ID NO: 2) también causaron una disminución en la actividad, aunque de menor magnitud. Dado que existía la posibilidad de que un constructo particular que en realidad era mínimamente inhibidor exhibiera una mayor inhibición si se transfectara una mayor cantidad de ADN, la cantidad de ADN del plásmido se redujo a 200 ng por transfección. Los resultados de los experimentos de transfección utilizando esta menor cantidad de ADN confirmaron que la deleción de los aminoácidos 42-47 y 66-71 del SEQ ID NO: 2 dio como resultado efectivamente una pérdida de actividad inhibidora, y que la supresión de los aminoácidos 53-58 del SEQ ID NO: 2 dio como resultado una pérdida significativa en la capacidad de inhibir la síntesis de ADN. Las deleciones 24-29, 30-35 tuvieron una actividad similar a la de tipo salvaje a ambas concentraciones de ADN. Estos resultados indican que la región crítica del producto proteico del SDI1 debe estar comprendida entre los aminoácidos 42 y 71. Por lo tanto, esto apoya la conclusión de que los péptidos que tiene la secuencia del SEQ ID NO:242-71 y no las moléculas de péptidos que imitan a un grupo lateral reactivo del SEQ ID NO:242-71 comprenden miméticos de SDI-1. En particular, un mimético preferido tiene la secuencia de aminoácidos del SEQ ID NO:249-77. Un péptido mimético particularmente preferido tiene una secuencia: WNFDFXXXXPLEGXXXWXXVXXXXLPXXY (SEQ ID NO: 34). Tal mimético se puede formar usando los métodos antes descritos y cebadores que tienen las secuencias:

SEQ ID NO: 35

imagen1

SEQ ID NO: 36

imagen1

Un mimético no peptídico preferido tiene residuos que 5 imitan grupos laterales reactivos del SEQ ID NO: 34.

Para determinar si la inhibición de la síntesis de

ADN causada por estos mutantes se produjo a través de la

inhibición de las quinasas cdk, se examinó la unión de

10 los productos proteicos mutantes por deleción traducidos in vitro con la proteína cdk2 purificada. Por lo tanto, los diversos mutantes por deleción de SDI-1 se tradujeron en productos lisados de reticulocitos (Promega) utilizando plásmidos basados en pBluescript como moldes

15 para la transcripción para la ARN polimerasa de T7. Para la unión in vitro, se añadieron 45 µl del producto de traducción a 500 µl de tampón de unión (Tris-HCl 50 mM, pH 7,5, NaCl 120 mM, EDTA 2 mM, NP-40 al 0,1%, NaF 1 mM, vanadato de sodio 0,1 mM, 5 µg/ml de leupeptina, 5 µg/ml

20 de inhibidor de tripsina de soja, 5 µg/ml de aprotinina) que contenía 1 µg de proteína cdk2 purificada a partir de un sistema de expresión de baculovirus. La mezcla se agitó suavemente durante 1 hora a 4°C y después se añadieron 7,5 µg de anticuerpo policlonal anti-cdk2 de

25 conejo. La mezcla se mantuvo durante 1 hora a 4°C. El inmunocomplejo se absorbió mediante incubación con 40 µl de proteína G más cuentas A durante 2 horas. Las matrices se lavaron después tres veces con 0,5 ml de tampón de unión antes de la electroforesis y la autorradiografía.

Todos los constructos mutantes produjeron proteína que tenía un peso molecular de aproximadamente 23 kD. Para comprobar que las proteínas eran de hecho productos de SDI-1 sometidos a deleción, se inmunoprecipitaron utilizando CA5 (un anticuerpo monoclonal contra la secuencia de la etiqueta HA) y todas precipitaron satisfactoriamente el anticuerpo. La proteína de tipo salvaje SDI-1 y las tres deleciones, 24-29, 30-35, 72-77, se unieron a la proteína cdk2 de manera eficiente, lo que sugiere que la actividad inhibidora de la síntesis de ADN de estos constructos fue el resultado de la unión a cdk2. Por el contrario, los mutantes, 42-47, 53-58 y 66-71, que habían disminuido la actividad inhibidora no se unieron a cdk2.

Inmunohistoquímica

Se ha informado de que la localización intracelular de SDI-1 es nuclear y hay una señal de supuesta translocación nuclear en el extremo 3' de la región codificante del gen. Sin embargo, como se indicó anteriormente, se descubrió que una proteína truncada en el extremo C (SDI-11-71), que carece de esta supuesta señal de translocación nuclear tenía la misma actividad inhibidora que la proteína de tipo salvaje (Tabla 13). Con el fin de determinar la localización de los productos proteicos de los diversos constructos mutantes por deleción de SDI-1 tras su transfección en células MDAH 041, se llevó a cabo la inmunotinción de la etiqueta HA.

Para la inmunotinción, las células se sembraron en cubreobjetos de vidrio a una densidad de confluencia de 50%, y se permitió que se adhirieran durante la noche antes de la transfección. Tras la transfección las células se incubaron a 37ºC durante 24 horas, luego se lavaron dos veces con tampón fosfato salino (PBS) y se fijaron en solución de formaldehído recién preparada [paraformaldehido en PBS al 4% (peso/vol)] durante 15 minutos a temperatura ambiente. Las células fijadas se lavaron después en PBS y se incubaron en glicina 50 mM en PBS a temperatura ambiente durante 10 min. Las células se lavaron nuevamente con PBS y se permeabilizaron mediante incubación en Triton-X100 en PBS al 0,2%, a temperatura ambiente, durante 10 minutos. Después de lavados adicionales con PBS se realizó la inmunotinción de acuerdo con las directrices del kit ABC (fuente). El anticuerpo primario (12CA5) se diluyó 1:1000 en el tampón disponible en el kit.

Se encontró que las proteínas suprimidas, pero aún inhibidoras del crecimiento se localizaban en el núcleo, mientras que un alto porcentaje de células que expresaban las proteínas mutantes inactivas o menos activas exhibieron tinción citoplásmica. Estos datos, junto con los resultados de unión a cdk, indican claramente que la translocación de SDI-1 al núcleo depende de la formación de un complejo de SDI-1 ciclina-cdk.

Por lo tanto, el truncamiento de la región C terminal de SDI-1 reveló que las moléculas de SDI-1 que tenían los aminoácidos 1-71 del SEQ ID NO:2 mostraron casi la misma capacidad de inhibir la síntesis de ADN que la proteína SDI-1 completa (SEQ ID NO:2). El análisis de deleción preciso mostró que los aminoácidos de la región 42-71 del SEQ ID NO:2 fueron cruciales tanto para la inhibición de la quinasa como para la inhibición de la síntesis de ADN. Este resultado fue confirmado también por los resultados que mostraron que las moléculas de SDI-1 que tienen deleciones de los aminoácidos de la región 42-71 del SEQ ID NO:2 no mostraron actividad de unión.

A partir del análisis inmunohistoquímico, se encontró que la mayoría de la proteína mutante activa estaba localizada en el núcleo. Por el contrario, se encontró que los mutantes de SDI-1 que carecían de actividad estaban localizados en el citoplasma, lo que indica que la translocación de SDI-1 al núcleo depende principalmente de la capacidad de elaborar los complejos con cdk-ciclinas en lugar de a la existencia de secuencias de tipo translocación nuclear del extremo C de la proteína SDI-1. Debido a la importancia de la región 42-71 del SEQ ID NO:2 en la inhibición de la quinasa y la inhibición de la síntesis de ADN, esta región ha sido estudiada con gran detalle. Este análisis indicó claramente que las regiones de homología (49-53 y 58-61 del SEQ ID NO:2) proporcionaron un nuevo motivo inhibidor entre los inhibidores de CDK (como SDI-1 y p27).

Los resultados anteriores implican claramente a la región amino terminal de la proteína SDI-1 como la zona que participa en la inhibición de la síntesis de ADN. Los estudios cartográficos precisos implican a la región entre los aminoácidos 48-65 como crítica para los efectos de un crecimiento negativo del gen. Los datos también demuestran que cuando el producto génico está involucrado en la inhibición activa éste se localiza en el núcleo de la célula y que las formas inactivas de la proteína permanecen en el citoplasma. Con respecto a esta última observación, tiene interés señalar que existe una supuesta señal de localización nuclear en la región carboxi terminal de la proteína. No obstante, la deleción de los aminoácidos 72-164 que elimina esta secuencia señal, es plenamente capaz de inhibir la síntesis de ADN y se expresa en el núcleo. Esto indica que alguna otra u otras moléculas, tal vez los complejos de ciclinas, cdk y PCNA con los que se asocia SDI-1, tranportan la proteína SDI-1 al núcleo.

LISTA DE SECUENCIAS

(1)

INFORMACIÓN GENERAL:

(I)

SOLICITANTE: BAYLOR COLLEGE OF MEDICINE SMITH, JAMES

R.

(ii)

TÍTULO DE LA INVENCIÓN: INHIBIDORES DE LA SÍNTESIS DE ADN DERIVADOS DE CÉLULAS SENESCENTES

(iii) NÚMERO DE SECUENCIAS: 36

(iv)

DIRECCIÓN PARA LA CORRESPONDENCIA:

1.

(a) DESTINATARIO: HOWREY & SIMON

2.

(B) CALLE: 1299 PENNSYLVANIA AVENUE, N.W.

3.

(C) CIUDAD: WASHINGTON

4.

(D) ESTADO: D.C.

5.

(E) PAÍS: EE.UU.

6.

(F) CÓDIGO POSTAL: 20004

(V)

FORMA LEGIBLE EN EL ORDENADOR:

1.

(A) MEDIO TIPO: Disco flexible

2.

(B) ORDENADOR: PC compatible con IBM

3.

(C) SISTEMA OPERATIVO: PC-DOS/MS-DOS

4. (D) SOPORTE LÓGICO: Patentln Release #1.0, Versión Núm. 1.25

(vi) DATOS ACTUALES DE SOLICITUD:

1.

(A) NÚMERO DE SOLICITUD: EE.UU.

2.

(B) FECHA DE PRESENTACIÓN:

(C) CLASIFICACIÓN:

(vii)

DATOS DE SOLICITUD ANTERIORES:

1.

(A) NÚMERO DE SOLICITUD: US. 07/808.523

2.

(B) FECHA DE PRESENTACIÓN: 16-Diciembre-1991

(vii)

DATOS DE SOLICITUD ANTERIORES:

1.

(A) NÚMERO DE SOLICITUD: US. 07/970.462

2.

(B) FECHA DE PRESENTACIÓN: 02-Noviembre-1992

(vii)

DATOS DE SOLICITUD ANTERIORES:

1.

(A) NÚMERO DE SOLICITUD: US. 08/113.372

2.

(B) FECHA DE PRESENTACIÓN: 30-agosto-1993

(vii)

DATOS DE SOLICITUD ANTERIORES:

1.

(A) NÚMERO DE SOLICITUD: US. 08/153.564

2.

(B) FECHA DE PRESENTACIÓN: 17-Noviembre-1993

(vii)

DATOS DE SOLICITUD ANTERIORES:

1.

(A) NÚMERO DE SOLICITUD: US. 08/203.535

2.

(B) FECHA DE PRESENTACIÓN: 25-Febrero-1994

(vii)

DATOS DE SOLICITUD ANTERIORES:

1.

(A) NÚMERO DE SOLICITUD: US. 08/229.420

2.

(B) FECHA DE PRESENTACIÓN: 15-Abril-1994

(vii)

DATOS DE SOLICITUD ANTERIORES:

1.

(A) NÚMERO DE SOLICITUD: US. 08/274.535

2.

(B) FECHA DE PRESENTACIÓN: 13-Julio-1994

(viii) INFORMACIÓN DEL ABOGADO/AGENTE:

1.

(A) Nombre: AUERBACH, JEFFREY I.

2.

(B) NUMERO DE REGISTRO: 32.680

3.

(C) REFERENCIA/NÚMERO DE EXPEDIENTE: 225-102-CIP7PCT

(ix)

INFORMACIÓN DE TELECOMUNICACIONES:

1.

(A) TELEFONO: (202)383-7451

2.

(B) Telefax: (202)383-6610

(2)

INFORMACIÓN PARA EL SEQ ID NO:1:

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

1.

(A) LONGITUD: 2106 pares de bases

2.

(B) TIPO: ácido nucleico

3.

(C) CADENA: sencilla

4.

(D) TOPOLOGÍA: lineal

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: ADNc

(iii) HIPOTÉTICO: NO

(iv)

ANTI-SENTIDO: NO

(vi)

FUENTE ORIGINAL:

(A)

ORGANISMO: Homo sapiens

(G)

TIPO CELULAR: CÉLULAS SENESCENTES HUMANAS

(vii) FUENTE INMEDIATA:

1.

(A) GENOTECA: GENOTECA DE ADNc DERIVADA DE CÉLULAS SENESCENTES

2.

(B) CLON: SDI-1

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:1:

(2)

INFORMACIÓN PARA EL SEQ ID NO: 2:

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

imagen1

imagen1

(A)

LONGITUD: 164 aminoácidos 5 (B) TIPO: aminoácido

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: proteína

(iii) HIPOTÉTICO: NO

(iv)

ANTI-SENTIDO: NO 10(vi) FUENTE ORIGINAL:

1.

(A) ORGANISMO: HOMO SAPIENS

2.

(B) CEPA: SDI-1

(vii) FUENTE INMEDIATA:

1. (A) GENOTECA: GENOTECA DE ADN DERIVADA DE CÉLULAS 15 SENESCENTES

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:2:

(2)

INFORMACIÓN PARA EL SEQ ID NO:3:

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

1.

(A) LONGITUD: 19 pares de bases

2.

(B) TIPO: ácido nucleico

3.

(C) CADENA: sencilla

4.

(D) TOPOLOGÍA: lineal

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: ADNc

imagen1

imagen1

(iii) HIPOTÉTICO: NO

(iv)

ANTI-SENTIDO: SI

(vi)

FUENTE ORIGINAL:

1. (A) ORGANISMO: HOMO SAPIENS

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:3: AGCCGGTTCT GACATGGCG 19

(2)

INFORMACIÓN PARA EL SEQ ID NO: 4:

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

(A)

LONGITUD: 12 aminoácidos

(B)

TIPO: aminoácido

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: péptido

(iii) HIPOTÉTICO: NO

(v) FRAGMENTO DE TIPO: N-terminal

(vii) FUENTE INMEDIATA:

(B)

CLON: péptido líder [His]6

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:4:

(2)

INFORMACIÓN PARA EL SEQ ID NO: 5:

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

1.

(A) LONGITUD: 699 pares de bases

2.

(B) TIPO: ácido nucleico

3.

(C) CADENA: sencilla

4.

(D) TOPOLOGÍA: lineal

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: ADNc

imagen1

imagen4

(iii) HIPOTÉTICO: NO

(iv)

ANTI-SENTIDO: NO 5(vi) FUENTE ORIGINAL:

1. (A) ORGANISMO: Schistosoma japonicum

(vii) FUENTE INMEDIATA:

(B)

CLON: GST

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:5:

(2)

INFORMACIÓN PARA EL SEQ ID NO: 6:

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

(A)

LONGITUD: 232 aminoácidos

(B)

TIPO: aminoácido15 (D) TOPOLOGÍA: lineal

(ii) TIPO DE MOLÉCULA: proteína

(iii) HIPOTÉTICO: NO

(vi) FUENTE ORIGINAL:

1. (A) ORGANISMO: Schistosoma japonicum 20 (vii) FUENTE INMEDIATA:

(B)

CLON: GST

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:6:

(2)

INFORMACIÓN PARA EL SEQ ID NO:7:

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

imagen1

5 1. (A) LONGITUD: 13 pares de bases

2.

(B) TIPO: ácido nucleico

3.

(C) CADENA: sencilla

4.

(D) TOPOLOGÍA: lineal

(ii) TIPO DE MOLÉCULA: ADNc10 (iii) HIPOTÉTICO: NO

(iv) ANTI-SENTIDO: NO

(vii) FUENTE INMEDIATA:

(B)

CLON: fragmento conector para la fusión génica GSTSDI-1

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:7: GGATCCCCCC CGC 13

(2)

INFORMACIÓN PARA EL SEQ ID NO: 8:

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

1.

(A) LONGITUD: 10 pares de base

2.

(B) TIPO: ácido nucleico

3.

(C) CADENA: sencilla

4.

(D) TOPOLOGÍA: lineal

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: ADNc

(iii) HIPOTÉTICO: NO

(iv) ANTI-SENTIDO: NO

(vii) FUENTE INMEDIATA:

(B)

CLON: fragmento conector para la fusión génica GSTSDI-1

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:8: CCCTCGAGGG 10

(2)

INFORMACIÓN PARA EL SEQ ID NO:9:

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

(A)

LONGITUD: 7 aminoácidos

(B)

TIPO: aminoácido

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: péptido

(iii) HIPOTÉTICO: NO

(V) FRAGMENTO DE TIPO: interno

(vii) FUENTE INMEDIATA:

(B)

CLON: proteína de fusión de la región bisagra GSTSDI-1

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:9:

(2)

INFORMACIÓN PARA EL SEQ ID NO:10:

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

1.

(A) LONGITUD: 1194 pares de bases

2.

(B) TIPO: ácido nucleico

3.

(C) CADENA: sencilla

4.

(D) TOPOLOGÍA: lineal

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: ADNc

imagen1

(iii) HIPOTÉTICO: NO

(iv) ANTI-SENTIDO: NO

(vii) FUENTE INMEDIATA:

(B)

CLON: fusión génica GST-SDI-1

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:10:

(2)

INFORMACIÓN PARA EL SEQ ID NO:11:

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

(A)

LONGITUD: 397 aminoácidos

(B)

TIPO: aminoácido

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: proteína

imagen1

(iii) HIPOTÉTICO: NO

(vii) FUENTE INMEDIATA:

(B)

CLON: proteína de fusión GST-SDI-1

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 11:

(2)

INFORMACIÓN PARA EL SEQ ID NO:12:

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

imagen1

imagen1

1. (A) LONGITUD: 24 pares de bases

5 2. (B) TIPO: ácido nucleico

3.

(C) CADENA: sencilla

4.

(D) TOPOLOGÍA: lineal

(ii) TIPO DE MOLÉCULA: ADNc

(iii) HIPOTÉTICO: NO 10 (iv) ANTI-SENTIDO: NO

(vii) FUENTE INMEDIATA:

(B)

CLON: Cebador 12614

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:12:

GGAGGATCCA TGTCAGAACC GGCT 24 15 (2) INFORMACIÓN PARA EL SEQ ID NO: 13:

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

1.

(A) LONGITUD: 24 pares de bases

2.

(B) TIPO: ácido nucleico

3.

(C) CADENA: sencilla

4.

(D) TOPOLOGÍA: lineal

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: ADNc

(iii) HIPOTÉTICO: NO

(iv) ANTI-SENTIDO: NO

(vii) FUENTE INMEDIATA:

(B)

CLON: Cebador 12615

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:13: GCAGAATTCC TGTGGGCGGA TTAG 24

(2)

INFORMACIÓN PARA EL SEQ ID NO: 14:

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

1.

(A) LONGITUD: 20 pares de base

2.

(B) TIPO: ácido nucleico

3.

(C) CADENA: sencilla

4.

(D) TOPOLOGÍA: lineal

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: ADNc

(iii) HIPOTÉTICO: NO

(iv) ANTI-SENTIDO: NO

(vii) FUENTE INMEDIATA:

(B)

CLON: Cebador

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:14: TCTAGGCCTG TACGGAAGTG 20

(2)

INFORMACIÓN PARA EL SEQ ID NO:15:

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

1.

(A) LONGITUD: 60 pares de bases

2.

(B) TIPO: ácido nucleico

3.

(C) CADENA: sencilla

4.

(D) TOPOLOGÍA: lineal

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: ADNc

(iii) HIPOTÉTICO: NO

(iv) ANTI-SENTIDO: NO

(vii) FUENTE INMEDIATA:

(B)

CLON: Cebador

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:15: TAGGAATTCA CTAGTCTAAG CGTAATCTGG AACATCGTAT GGGTAGGGCT

TCCTCTTGGA 60

(2)

INFORMACIÓN PARA EL SEQ ID NO: 16:

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

1.

(A) LONGITUD: 30 pares de bases

2.

(B) TIPO: ácido nucleico

3.

(C) CADENA: sencilla

4.

(D) TOPOLOGÍA: lineal

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: ADNc

(iii) HIPOTÉTICO: NO

(iv) ANTI-SENTIDO: NO

(vii) FUENTE INMEDIATA:

(B)

CLON: Cebador

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:16: TTCGGCCCTC GAGGCCTGAG CCGCGACTGT 30

(2)

INFORMACIÓN PARA EL SEQ ID NO:17:

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

1.

(A) LONGITUD: 30 pares de bases

2.

(B) TIPO: ácido nucleico

3.

(C) CADENA: sencilla

4.

(D) TOPOLOGÍA: lineal

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: ADNc

(iii) HIPOTÉTICO: NO

(iv) ANTI-SENTIDO: NO

(vii) FUENTE INMEDIATA:

(B)

CLON: Cebador

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:17: GCTCAGGCCT CGAGGGCCGA AGAAGCGGCG 30

(2)

INFORMACIÓN PARA EL SEQ ID NO:18:

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

1.

(A) LONGITUD: 31 pares de bases

2.

(B) TIPO: ácido nucleico

3.

(C) CADENA: sencilla

4.

(D) TOPOLOGÍA: lineal

(ii) TIPO DE MOLÉCULA: ADNc

(iii) HIPOTÉTICO: NO

(iv) ANTI-SENTIDO: NO

(vii) FUENTE INMEDIATA:

(B)

CLON: Cebador

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:18: TTAGCGCGCC TCGAGGCTGC TCGCTGTCCA C 31

(2)

INFORMACIÓN PARA EL SEQ ID NO: 19:

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

1.

(A) LONGITUD: 31 pares de bases

2.

(B) TIPO: ácido nucleico

3.

(C) CADENA: sencilla

4.

(D) TOPOLOGÍA: lineal

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: ADNc

(iii) HIPOTÉTICO: NO

(iv) ANTI-SENTIDO: NO

(vii) FUENTE INMEDIATA:

(B)

CLON: Cebador

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:19: CGAGCAGCCT CGAGGCGCGC TAATGGCGGG C 31

(2)

INFORMACIÓN PARA EL SEQ ID NO:20:

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

1.

(A) LONGITUD: 30 pares de bases

2.

(B) TIPO: ácido nucleico

3.

(C) CADENA: sencilla

4.

(D) TOPOLOGÍA: lineal

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: ADNc

(iii) HIPOTÉTICO: NO

(iv) ANTI-SENTIDO: NO

(vii) FUENTE INMEDIATA:

(B)

CLON: Cebador

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:20: GGCTGCCCTC GAGGCCGATG GAACTTCGAC 30

(2)

INFORMACIÓN PARA EL SEQ ID NO:21:

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

1.

(A) LONGITUD: 30 pares de bases

2.

(B) TIPO: ácido nucleico

3.

(C) CADENA: sencilla

4.

(D) TOPOLOGÍA: lineal

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: ADNc

(iii) HIPOTÉTICO: NO

(iv) ANTI-SENTIDO: NO

(vii) FUENTE INMEDIATA:

(B)

CLON: Cebador

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:21: CCATCGGCCT CGAGGGCAGC CCGCCATTAG 30

(2)

INFORMACIÓN PARA EL SEQ ID NO:22:

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

1.

(A) LONGITUD: 36 pares de bases

2.

(B) TIPO: ácido nucleico

3.

(C) CADENA: sencilla

4.

(D) TOPOLOGÍA: lineal

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: ADNc

(iii) HIPOTÉTICO: NO

(iv) ANTI-SENTIDO: NO

(vii) FUENTE INMEDIATA:

(B)

CLON: Cebador

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:22: CGTGAGCGAC CCCGGGGCGT CACCGAGACA CCACTG 36

(2)

INFORMACIÓN PARA EL SEQ ID NO:23:

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

1.

(A) LONGITUD: 36 pares de bases

2.

(B) TIPO: ácido nucleico

3.

(C) CADENA: sencilla

4.

(D) TOPOLOGÍA: lineal

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: ADNc

(iii) HIPOTÉTICO: NO

(iv) ANTI-SENTIDO: NO

(vii) FUENTE INMEDIATA:

(B)

CLON: Cebador

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:23: CTCGGTGACG CCCCGGGGTC GCTCACGGGC CTCCTG 36

(2)

INFORMACIÓN PARA EL SEQ ID NO: 24:

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

1.

(A) LONGITUD: 30 pares de bases

2.

(B) TIPO: ácido nucleico

3.

(C) CADENA: sencilla

4.

(D) TOPOLOGÍA: lineal

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: ADNc

(iii) HIPOTÉTICO: NO

(iv) ANTI-SENTIDO: NO

(vii) FUENTE INMEDIATA:

(B)

CLON: Cebador

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:24: TTCGACCCTC GAGGCCTGGA GGGTGACTTC 30

(2)

INFORMACIÓN PARA EL SEQ ID NO:25:

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

1.

(A) LONGITUD: 30 pares de bases

2.

(B) TIPO: ácido nucleico

3.

(C) CADENA: sencilla

4.

(D) TOPOLOGÍA: lineal

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: ADNc

(iii) HIPOTÉTICO: NO

(iv) ANTI-SENTIDO: NO

(vii) FUENTE INMEDIATA:

(B)

CLON: Cebador

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:25: CTCCAGGCCT CGAGGGTCGA AGTTCCATCG 30

(2)

INFORMACIÓN PARA EL SEQ ID NO: 26:

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

1.

(A) LONGITUD: 36 pares de bases

2.

(B) TIPO: ácido nucleico

3.

(C) CADENA: sencilla

4.

(D) TOPOLOGÍA: lineal

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: ADNc

(iii) HIPOTÉTICO: NO

(iv) ANTI-SENTIDO: NO

(vii) FUENTE INMEDIATA:

(B)

CLON: Cebador

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:26: ACCGAGACAT CCCGGGCCGA CTTCGCCTGG GAGCGT 36

(2)

INFORMACIÓN PARA EL SEQ ID NO:27:

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

1.

(A) LONGITUD: 36 pares de bases

2.

(B) TIPO: ácido nucleico

3.

(C) CADENA: sencilla

4.

(D) TOPOLOGÍA: lineal

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: ADNc

(iii) HIPOTÉTICO: NO

(iv) ANTI-SENTIDO: NO

(vii) FUENTE INMEDIATA:

(B)

CLON: Cebador

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:27: GGCGAAGTCG GCCCGGGATG TCTCGGTGAC AAAGTC 36

(2)

INFORMACIÓN PARA EL SEQ ID NO: 28:

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

1.

(A) LONGITUD: 36 pares de bases

2.

(B) TIPO: ácido nucleico

3.

(C) CADENA: sencilla

4.

(D) TOPOLOGÍA: lineal

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: ADNc

(iii) HIPOTÉTICO: NO

(iv) ANTI-SENTIDO: NO

(vii) FUENTE INMEDIATA:

(B)

CLON: Cebador

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:28: CCACTGGAGC CCCGOGGCCG TGTGCGGGGC CTTGGC 36

(2)

INFORMACIÓN PARA EL SEQ ID NO:29:

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

1.

(A) LONGITUD: 36 pares de bases

2.

(B) TIPO: ácido nucleico

3.

(C) CADENA: sencilla

4.

(D) TOPOLOGÍA: lineal

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: ADNc

(iii) HIPOTÉTICO: NO

(iv) ANTI-SENTIDO: NO

(vii) FUENTE INMEDIATA:

(B)

CLON: Cebador

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:29: CCGCACACGG CCCCGGGGCT CCAGTGGTGT CTCGGT 36

(2)

INFORMACIÓN PARA EL SEQ ID NO:30:

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

1.

(A) LONGITUD: 30 pares de bases

2.

(B) TIPO: ácido nucleico

3.

(C) CADENA: sencilla

4.

(D) TOPOLOGÍA: lineal

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: ADNc

(iii) HIPOTÉTICO: NO

(iv) ANTI-SENTIDO: NO

(vii) FUENTE INMEDIATA:

(B)

CLON: Cebador

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 30: GCCTGGCCTC GAGGCGGCCT GCCCAAGCTC 30

(2)

INFORMACIÓN PARA EL SEQ ID NO:31:

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

1.

(A) LONGITUD: 30 pares de bases

2.

(B) TIPO: ácido nucleico

3.

(C) CADENA: sencilla

4.

(D) TOPOLOGÍA: lineal

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: ADNc

(iii) HIPOTÉTICO: NO

(iv) ANTI-SENTIDO: NO

(vii) FUENTE INMEDIATA:

(B)

CLON: Cebador

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:31: CAGGCCGCCT CGAGGCCAGG CGAAGTCACC 30

(2)

INFORMACIÓN PARA EL SEQ ID NO:32:

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

1.

(A) LONGITUD: 41 pares de bases

2.

(B) TIPO: ácido nucleico

3.

(C) CADENA: sencilla

4.

(D) TOPOLOGÍA: lineal

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: ADNc

(iii) HIPOTÉTICO: NO

(iv) ANTI-SENTIDO: NO

(vii) FUENTE INMEDIATA:

(B)

CLON: Cebador

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:32: CGGGGCCTTC CCCGGGGCCT TCCCACGGGG CCCCGGCGAG G 41

(2)

INFORMACIÓN PARA EL SEQ ID NO:33:

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

1.

(A) LONGITUD: 40 pares de bases

2.

(B) TIPO: ácido nucleico

3.

(C) CADENA: sencilla

4.

(D) TOPOLOGÍA: lineal

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: ADNc

(iii) HIPOTÉTICO: NO

(iv) ANTI-SENTIDO: NO

(vii) FUENTE INMEDIATA:

(B)

CLON: Cebador

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:33: CGTGGGAAGG CCCCGGGGAA GGCCCCGCAC ACGCTCCCAG 40

(2)

INFORMACIÓN PARA EL SEQ ID NO:34:

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

(A)

LONGITUD: 29 aminoácidos

(B)

TIPO: aminoácido

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: el péptido

(iii) HIPOTÉTICO: NO

(V) FRAGMENTO DE TIPO: interno

(vii) FUENTE INMEDIATA:

(B)

CLON: fragmento de péptido mimético

(xi) DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:34:

imagen1

(2)

INFORMACIÓN PARA EL SEQ ID NO: 35:

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

5 1. (A) LONGITUD: 54 pares de bases

2.

(B) TIPO: ácido nucleico

3.

(C) CADENA: sencilla

4.

(D) TOPOLOGÍA: lineal

(ii) TIPO DE MOLÉCULA: ADNc10 (iii) HIPOTÉTICO: NO

(iv) ANTI-SENTIDO: NO

(vii) FUENTE INMEDIATA:

(B)

CLON: Cebador

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 35:

15 CAGAATCACA AGCCACTCGA GGGTAAGTAC GAGTGGGAGC GTGTGCGGGG CCTT 54

(2)

INFORMACIÓN PARA EL SEQ ID NO:36:

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

1. (A) LONGITUD: 48 pares de bases

20 2. (B) TIPO: ácido nucleico

3.

(C) CADENA: sencilla

4.

(D) TOPOLOGÍA: lineal

(ii) TIPO DE MOLÉCULA: ADNc

(iii) HIPOTÉTICO: NO 25 (iv) ANTI-SENTIDO: NO

(vii) FUENTE INMEDIATA:

(B)

CLON: Cebador

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:36: CTTACCCTCG AGTGGCTTGT GATTCTGAAA GTCGAAGTTC CATCGCTC 48

30

Claims (18)

1. REIVINDICACIONES

   1.

   Un fragmento de un polipéptido SDI-1 del SEQ ID NO:2 donde los residuos de aminoácidos 72 a 164 se suprimen, donde el fragmento inhibe la síntesis de ADN.

2. 2.

   Un fragmento de acuerdo con la reivindicación 1, que contiene los residuos del SEQ ID NO:2 seleccionados del grupo que consiste en 5 a 70, 10 a 70, 15 a 70, 20 a 70, 25 a 70, 30 a 70, 35 a 70 y 40 a 70.

3. 3.

   Una secuencia de nucleótidos que codifica un polipéptido de acuerdo con la reivindicación 1 o 2.

4. 4.

   Un plásmido o vector de expresión que comprende una secuencia de nucleótidos de acuerdo con la reivindicación 3.

5. 5.

   Un vector de expresión de acuerdo con la reivindicación 4, que es un vector viral.

6. 6.

   Un fragmento antisentido de SDI-1 que consiste en:

   (a)

   la secuencia de nucleótidos del SEQ ID NO:3;

   (b)

   los nucleótidos 1 a 127 de la cadena antisentido del SEQ ID NO: 1; o

   (c)

   los nucleótidos 1 a 319 de la cadena antisentido del SEQ ID NO: 1.

7. 7.

   Un plásmido o vector de expresión que comprende un fragmento antisentido de acuerdo con la reivindicación

8. 6.

9. 8.

   Un vector de expresión de acuerdo con la reivindicación 7, que es un vector viral.

10. 9.

    Una composición farmacéutica que comprende un fragmento polipeptídico de acuerdo con la reivindicación 1 o 2, una secuencia de nucleótidos de acuerdo con la reivindicación 3, un fragmento antisentido de acuerdo con la reivindicación 6, o un plásmido o vector de expresión de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 4, 5, 7 u 8 y un vehículo, excipiente o estabilizador fisiológicamente aceptables.

11. 10.

    El uso de un fragmento polipeptídico de acuerdo con la reivindicación 1 o 2, una secuencia de nucleótidos de acuerdo con la reivindicación 3 o un plásmido o vector de expresión de acuerdo con la reivindicación 4 ó 5 para la fabricación de un medicamento para su uso en la inhibición de la síntesis de ADN en una célula receptora.

12. 11.

    El uso de acuerdo con la reivindicación 10, donde la célula receptora es una célula tumoral que es una célula mieloide, una célula de linfoma de células B, una célula epitelial, una célula de glioblastoma, un fibroblasto o una célula de tumor de ovario.

13. 12.

    El uso de un fragmento polipeptídico de acuerdo con la reivindicación 1 o 2, una secuencia de nucleótidos de acuerdo con la reivindicación 3 o un plásmido o vector de expresión de acuerdo con la reivindicación 4 ó 5 para la fabricación de un medicamento para el tratamiento del glaucoma.

14. 13.

    El uso de un fragmento antisentido de acuerdo con la reivindicación 6, o un plásmido o vector de expresión de acuerdo con la reivindicación 7 u 8 para la fabricación de un medicamento para su uso en la des-represión de la síntesis de ADN en una célula receptora.

15. 14.

    Un fragmento polipeptídico de acuerdo con la reivindicación 1 o 2, una secuencia de nucleótidos de acuerdo con la reivindicación 3, o un plásmido o vector de expresión de acuerdo con la reivindicación 4 ó 5, para su uso en un método para inhibir la síntesis de ADN en una célula receptora.

16. 15.

    Un fragmento polipeptídico, la secuencia de nucleótidos, plásmido o vector de expresión de acuerdo con la reivindicación 14, para su uso en dicho método en el que la célula receptora es una célula tumoral, que es una célula mieloide, una célula de linfoma de células B, una célula epitelial, una célula de glioblastoma, un fibroblasto o un célula de tumor de ovario.

17. 16.

    Un fragmento polipeptídico de acuerdo con la reivindicación 1 o 2, una secuencia de nucleótidos de acuerdo con la reivindicación 3, o un plásmido o vector de expresión de acuerdo con la reivindicación 4 ó 5, para su uso en un método para tratar el glaucoma.

18. 17.

    Un fragmento antisentido de acuerdo con la reivindicación 6, o un plásmido o vector de expresión de acuerdo con la reivindicación 7 u 8, para su uso en un método para des-reprimir la síntesis de ADN en una célula receptora.