JP4397922B2 - 老化細胞由来ｄｎａ合成阻害因子 - Google Patents

老化細胞由来ｄｎａ合成阻害因子 Download PDF

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Description

発明の分野：
本発明は、組換ＤＮＡ技術の分野のものである。本発明は、細胞の能力を老化させる遺伝子配列およびタンパク質に関する。本発明は、政府基金により援助されたものである。該政府は本発明について一定の権利を有する。
関連出願の相互参照：
本出願は、米国特許出願07/970,462号（１９９２年１１月２日に出願、および１９９４年４月１２日に米国特許第5,302,706号として発行）および分割米国特許出願08/160,814（１９９３年１２月３日に出願、継続中）および08/268,439（１９９４年６月３０日に出願）の一部を継続するものである米国特許出願08/113,372号（１９９３年８月３０日に出願）の一部を継続するものである米国特許出願08/153,564号（１９９３年１１月１７日に出願）の一部を継続するものである米国特許出願08/203,535号（１９９４年２月２５日に出願）の一部を継続するものである米国特許出願08/229,420号（１９９４年４月１５日に出願）の一部を継続するものである米国特許出願08/274,535号（１９９４年７月１３日に出願）の一部を継続するものであり、これら全ての出願は、米国特許出願07/808,523号（１９９１年１２月１６日に出願、現在放棄されている）の一部を継続するものである。
発明の背景：
正常なヒト二倍体細胞は、有限の増殖成長能力を有している（ヘイフリック，Ｌ.等、イクスペリメンタル・セル・リサーチ、２５巻、５８５頁（１９６１年）；ヘイフリック，Ｌ.、イクスペリメンタル・セル・リサーチ、３７巻、６１４頁（１９６５年））。実際に、イン・ビトロでの制御条件下では、培養ヒト細胞は最大限に増殖しても約８０累積集団倍加（cumulative population doublings）までである。そのような細胞の増殖能力は、細胞が経験する累積集団倍加数の関数であることが見い出された（ヘイフリック，Ｌ.等、イクスペリメンタル・セル・リサーチ、２５巻、５８５頁（１９６１年）；ヘイフリック，Ｌ.等、イクスペリメンタル・セル・リサーチ、３７巻、６１４頁（１９８５年)）。この能力は、また細胞提供者のイン・ビボ年齢に反比例している（マーチン，Ｇ.Ｍ.等、ラボラトリー・インベスティゲーション、２３巻、８６頁（１９７９年）；ゴールドシュタイン，Ｓ.等、プロシーディング・オブ・ナショナル・アカデミー・オブ・サイエンシィズ（Ｕ.Ｓ.Ａ.）、６４巻、１５５頁（１９６９年）；シュナイダー，Ｅ.Ｌ.、プロシーディング・オブ・ナショナル・アカデミー・オブ・サイエンシィズ（Ｕ.Ｓ.Ａ.）、７３巻、３５８４頁（１９７６年）；レギルティ，Ｙ.等、ゲレオントロジア、１９巻、３０３頁（１９７３年)）。
増殖成長に対するその能力を消盡した細胞は、“老化”してしまったと言われる。イン・ビトロでの細胞老化は、形態学的変化により示され、かつ外来成長因子に対する細胞の応答機能減退を伴う。従って、細胞老化は、細胞の増殖能力の喪失を表すものである。イン・ビトロでの細胞老化現象を説明するため、様々な理論が提案されているが、実験的証拠は、増殖能力の年齢依存性喪失が遺伝子プログラムの機能であろうことを示唆している（オーゲル，Ｌ.Ｅ.、プロシーディング・オブ・ナショナル・アカデミー・オブ・サイエンシィズ（Ｕ.Ｓ.Ａ.）、４９巻、５１７頁（１９６３年）；デ・マース，Ｒ．等、ヒューマン・ジェネティックス、１６巻、８７頁（１９７２年）；Ｍ．ブックワルド、ミューテーション・リサーチ、４４巻、４０１頁（１９７７年）、マーチン，Ｇ．Ｍ．等、アメリカン・ジャーナル・オブ・パソロジー、７４巻、１３７頁（１９７４年）；スミス，Ｊ．Ｒ．等、Mech．Age．Dev.、１３巻、３８７頁（１９８０年）；カークウッド，Ｔ.Ｂ．Ｌ．等、セオリティカル・バイオロジー、５３巻、４８１頁（１９７５年））。
イン・ビトロにおけるヒト繊維芽細胞での細胞融合研究は、細胞老化の静止状態型が、増殖状態型よりも優勢であることを示している（ペレイラ−スミス，Ｏ.Ｍ.等、ソマティック・セル・ジェネティックス、８巻、７３１頁（１９８２年）；ノルウッド，Ｔ.Ｈ.等、プロシーディング・オブ・ナショナル・アカデミー・オブ・サイエンシィズ（Ｕ.Ｓ.Ａ.）、７１巻、２２３頁（１９７４年）；ステイン，Ｇ.Ｈ.等、イクスペリメンタル・セル・リサーチ、１３０巻、１５５頁（１９７９年)）。
老化現象に対する洞察が、老化細胞および若い（即ち、非老化）細胞を融合して、ヘテロジカリオン（heterodikaryons）を形成する研究から得られている。ヘテロジカリオンの“若い”核で老化を引き起こすためには（ＤＮＡ合成の阻害により判定するとき）、融合する前に、老化細胞でタンパク質合成が起こらなければならない（バーマー，Ｇ.Ｃ.等、ジャーナル・オブ・セル・バイオロジー、９４巻、１８７頁（１９８２年）；ドレッチャー−リンカーン，Ｃ.Ｋ.等、イクスペリメンタル・セル・リサーチ、１４４巻、４５５頁（１９８３年）；バーマー，Ｇ.Ｃ.等、イクスペリメンタル・セル・リサーチ、１４５巻、７０８頁（１９８３年）；ドレッチャー−リンカーン，Ｃ.Ｋ.等、イクスペリメンタル・セル・リサーチ、１５３巻、２０８頁（１９８４年)）。
同様に、老化繊維芽細胞ｍＲＮＡの若い繊維芽細胞へのマイクロインジェクションが、若い細胞のＤＮＡ合成能力を阻害することが見い出されている（ランプキン，Ｃ.Ｋ.等、サイエンス、２３２巻、３９３頁（１９８６年））。研究者らは、イン・ビトロで老化細胞内で増殖されるユニークなｍＲＮＡを同定した（ウエスト，Ｍ.Ｄ.等、イクスペリメンタル・セル・リサーチ、１８４巻、１３８頁（１９８９年）；ジョルダノ，Ｔ.等、イクスペリメンタル・セル・リサーチ、１８５巻、３９９頁（１９８９年)）。
ヒト二倍体内皮細胞は、これらの細胞がイン・ビトロで細胞老化を真似することから、細胞老化研究の代替細胞型を与えるものである（マシアーク，Ｔ.等、ジャーナル・オブ・セル・バイオロジー、９１巻、４２０頁（１９８１年）；ゴードン，Ｐ.Ｂ.等、イン・ビトロ、１９巻、６６１頁（１９８３年）；ジョンソン，Ａ.等、Mech Age．Dev.、１８巻、１頁（１９８２年）；ソーントン，Ｓ.Ｃ.等、サイエンス、２２２巻、６２３頁（１９８３年）；ヴァン・ヒンスベルグ，Ｖ.Ｗ.Ｍ.等、ヨーロピアン・ジャーナル・オブ・セル・バイオロジー、４２巻、１０１頁（１９８６年）；ニコルス，Ｗ.Ｗ.等、ジャーナル・オブ・セル・フィジオロジー、１３２巻、４５３頁（１９８７年)）。
加えて、ヒト内皮細胞は、様々な機能的かつ可逆の表現型を発現する能力がある。内皮細胞は、幾つかの静止表現型および非末端分化表現型を示す（フォークマン，Ｊ.等、ネイチャー、２８８巻、５５１頁（１９８０年）；マシアーク，Ｔ.等、ジャーナル・オブ・セル・バイオロジー、９４巻、５１１頁（１９８２年）；マドリ．Ｊ.Ａ.等、ジャーナル・オブ・セル・バイオロジー、９７巻、１５３頁（１９８３年）；モンテサノ，Ｒ.、ジャーナル・オブ・セル・バイオロジー、９９巻、１７０６頁（１９８４年）；モンテサノ，Ｒ.等、ジャーナル・オブ・セル・フィジオロジー、３４巻、４６０頁（１９８８年)）。
イン・ビトロにおけるヒト細胞分化の経路は、イン・ビトロでの成長因子誘導内皮細胞増殖を阻害するサイトカイン類により媒介される細胞静止状態の誘導に関与することが示唆されている（ジェイ，Ｍ.等、サイエンス、２２８巻、８８２頁（１９８５年）；マドリ，Ｊ.Ａ.等、イン・ビトロ、２３巻、３８７頁（１９８７年）；クボタ，Ｙ.等、ジャーナル・オブ・セル・バイオロジー、１０７巻、１５８９頁（１９８８年）；イングバー，Ｄ.Ｅ.等、ジャーナル・オブ・セル・バイオロジー、１０７巻、３１７頁（１９８９年)）。
内皮細胞増殖の阻害因子(inhibitors)は、イン・ビトロでの内皮細胞分化中に引き起こされるごく初期の転写事象の調節因子としても機能しており、キャピラリー様、管状内皮細胞表現型の形成に関連する（マシアーク，Ｔ.等、インプルーブメント・アンド・アドバンス・オブ・オンコロジー、デ・ビータ，Ｖ.Ｔ.等、出版、Ｊ.Ｂ.リッピンコット．フィラデルフィア、４２頁（１９９０年）；ゴールドゲイバー，Ｄ．等、プロシーディング・オブ・ナショナル・アカデミー・オブ・サイエンシィズ（Ｕ.Ｓ.Ａ.）８６巻、７６０６頁（１９９０年）；へラ，Ｔ.等、バイオケミカル・アンド・バイオフィジカル・リサーチ・コミュニケーションズ、１６７巻、６３７頁（１９９０年)）。細胞増殖の阻害因子とは以下のものを含む：
１．インターロイキン−１a（ＩＬ−１a）（モンテサノ，Ｒ.等、ジャーナル・オブ・セル・バイオロジー、９９巻、１７０６頁（１９８４年）；モンテサノ，Ｒ.等、ジャーナル・オブ・セル・フィジオロジー、１２２巻、４２４頁（１９８５年）；マシアーク，Ｔ.等、サイエンス、２４９巻、１５７０−１５７４頁（１９９０年)）；
２．腫瘍壊死因子（フレイター−シュローダー，Ｍ.等、プロシーディング・オブ・ナショナル・アカデミー・オブ・サイエンシィズ（Ｕ.Ｓ.Ａ.）、８４巻、５２７７頁（１９８７年）；サトー，Ｎ.等、ジャーナル・オブ・ナショナル・キャンサー・インスティテュート、７６巻、１１１３頁（１９８６年）；プバー，Ｊ.Ｐ.、アメリカン・ジャーナル・オブ・パソロジー、１３３巻、４２６頁（１９８８年）；シマダ，Ｙ.等、ジャーナル・オブ・セル・フィジオロジー、１４２巻、３１頁（１９９０年)）；
３．トランスフォーミング成長因子β（transforming growth factor−β）（ベイルド，Ａ.等、バイオケミカル・アンド・バイオフィジカル・リサーチ・コミュニケーションズ、１３８巻、４７６頁（１９８６年）；ムリュー，Ｇ.等、プロシーディング・オブ・ナショナル・アカデミー・オブ・サイエンシィズ（Ｕ.Ｓ.Ａ.）、８４巻、５６００頁（１９８７年）；マイリ，Ｊ.Ａ.等、ジャーナル・オブ・セル・バイオロジー、１０６巻、１３７５頁（１９８８年)）；
４．ガンマ−インターフェロン（フリーセル，Ｒ.等、ジャーナル・オブ・セル・バイオロジー、１０４巻、６８９頁（１９８７年）；ツルオカ，Ｎ.等、バイオケミカル・アンド・バイオフィジカル・リサーチ・コミュニケーションズ、１５５巻、４２９頁（１９８８年））および
５．腫瘍プロモーター、ホルボールミリスチリン酸（ＰＭＡ）（モンテサノ，Ｒ.等、セル、４２巻、４６９頁（１９８５年）；ドクトロウ，Ｓ.Ｒ.等、ジャーナル・オブ・セル・バイオロジー、１０４巻、６７９頁（１９８７年）；モンテサノ，Ｒ.等、ジャーナル・オブ・セル・フィジオロジー、１３０巻、２８４頁（１９８７年）；ホシ，Ｈ.等、ＦＡＳＡＢジャーナル、２巻、２７９７頁（１９８８年)）。
老化を逆行させ、かつ細胞の増殖能力を回復することへの期待は、多くの分野の努力活動にかかわっている。老齢疾患の多くは、この能力の喪失に関わっている。この能力の回復は、この疾患の、他の年齢関連疾患の、さらに加齢自身の治療に、広い範囲にわたるかかわりを持つものである。
加えて、培養細胞の増殖能力の回復は、医薬および製薬工業において利用される。非形質転換細胞を不死化する能力を用いれば、ある種の組織、さらには細胞生産物を無限に供給することも出来る。
従って、細胞老化の重要性は、数年来、高く評価されてきた（スミス，Ｊ.Ｒ.、セルラー・エイジング、モノグラフス・イン・デベロップメンタル・バイオロジー；ソイアー，Ｈ.Ｗ.（出版）、Ｓ．カーガー、ニュー・ヨーク、Ｎ.Ｙ.、１７巻、１９３−２０８頁（１９８４年）；スミス，Ｊ.Ｒ.等、イクスペリメンタル・ゲロントロジー、２４巻、３７７−３８１頁（１９８９年）、本明細書に参照して組み込んである）。研究者らは、細胞老化に関連した遺伝子をクローン化することを試みている。ＤＮＡ合成阻害因子（an inhibitor of DNA synthesis）の存在と細胞老化現象の間の相関関係が認識されている（スピアリング，Ａ.Ｉ.等、イクスペリメンタル・セル・リサーチ、１７９巻、１５９−１６７頁（１９８８年）；ペレイラ−スミス，Ｏ.Ｍ.等、イクスペリメンタル・セル・リサーチ、１６０巻、２９７−３０６頁（１９８５年）；ドレッチャー−リンカーン，Ｃ.Ｋ.等、イクスペリメンタル・セル・リサーチ、１５３巻、２０８−２１７頁（１９８４年）；ドレッチャー−リンカーン，Ｃ.Ｋ.等、イクスペリメンタル・セル・リサーチ、１４４巻、４５５−４６２頁（１９８３年））。更に、ある種の老化関連ＲＮＡ分子の相対量（relative abundance）が同定されている（ランプキン，Ｃ.Ｋ.等、サイエンス、２３２巻、３９３−３９５頁（１９８６年））。
幾つかの研究室では、“サブトラクション−ディファレンシャル（subtraction-differential）”スクリーニング法を用いて、老化細胞中で優先的に存在するＲＮＡ種に由来するｃＤＮＡ分子を同定している（クラインセック，Ｄ.Ａ.、エイジ、１２巻、５５−６０頁（１９８９年）；ジョルダノ，Ｔ.等、イクスペリメンタル・セル・リサーチ、１８５巻、３９９−４０６頁（１９８９年）；シエラ，Ｆ.等、モレキュラー・アンド・セルラー・バイオロジー、９巻、５６１０−５６１６頁（１９８９年）；ペレイラ−スミス，Ｏ.Ｍ.等、ジャーナル・オブ・セル・バイオケミストリー、（付録 0（１２部Ａ））、１９３頁（１９８８年）；クラインセック，Ｄ.Ａ.、スミス，Ｊ.Ｒ.、エイジ、１０巻、１２５頁（１９８７年)）。
“サブトラクション−ディファレンシャル（subtraction-differential）”スクリーニングと名付けられた１つの方法では、ｃＤＮＡ分子のプールを老化細胞から作成し、次いで、成長細胞のｃＤＮＡまたはＲＮＡとハイブリダイズして、これらの成長細胞に存在する核酸分子に相補的なｃＤＮＡ分子を“控除（subtract out）”する。“サブトラクション−ディファレンシャル”法は、ある目的のためには有用であるけれども、老化関連ｃＤＮＡ分子が、老化の原因に関わっているのか、それとも老化の結果として生成したものかを確定できないという難点がある。実際に、この方法で同定された配列の多くは、細胞外マトリクスのタンパク質をコードすることが見い出されている。そのようなタンパク質の発現における変化が、老化を引き起こすのではないようである。
発明の要約：
本発明は、ある部分では、正常ヒト細胞がイン・ビトロで有限の複製能力を示し、ある回数分裂した後、老化に至るという観察に関係する。細胞が老化すると、それらは、細胞の大きさの肥大、細胞外マトリクス成分の変化、有糸分裂促進物質刺激に対する不応答、および成長調節遺伝子発現の機能減退のようないくつかの形態学的および生化学的変化を示す。
本発明は、老化細胞中に生成するＤＮＡ合成阻害因子を同定するものである。この阻害因子は、老化表現型の発現において重要な役割を果たす。阻害因子をコードする遺伝子は、老化細胞ｃＤＮＡライブラリーを哺乳類発現ベクターに組み込むことにより同定した。次いで、該ｃＤＮＡライブラリーを若い、サイクリング細胞（cycling cell）内にトランスフェクションし、ＤＮＡ合成の開始を抑制するこれらのライブラリーの構成メンバーを同定した。
効率的ＤＥＡＥデキストラン媒介トランスフェクションにより、３種の別々のｃＤＮＡクローンにおいて、老化細胞由来の阻害因子（ＳＤＩ）配列と推定されるものの分離が出来た。１種（ＳＤＩ−１）の発現は細胞老化にして２０倍増加したのに対し、他のもの（ＳＤＩ−２とＳＤＩ−３）は一定を保った。
要するに、本発明は、機能的なアッセー（assay）を用いて、ＤＮＡ合成阻害因子のクローニングを達成するものである。この方法を応用して組織特異的分化および腫瘍抑制遺伝子のような、細胞周期の負の調節に関連する他の遺伝子をクローン化することも出来る。この方法を用いて、３種の阻害因子配列がクローン化されている。これらの配列の１つ（ＳＤＩ−１）は、細胞老化と密接に関係しているようである。
詳細には、本発明は、受容細胞におけるＤＮＡ合成を阻害する能力を持つタンパク質またはポリペプチドをコードする核酸分子を提供するものである。
特に、本発明は、かかるタンパク質またはポリペプチドがサイクリンまたはサイクリン依存性キナーゼ、特に、該サイクリンは、サイクリンＤ１であり、該サイクリン依存性キナーゼは、ＣＤＫ２である、と結合（アソシエート）する能力があり、特に、該タンパク質またはポリペプチドの発現が腫瘍抑制遺伝子により調節されているような実施態様に関係する。
本発明は、ＳＤＩ−１またはＳＤＩ−１融合タンパク質、ＳＤＩ−１のフラグメント、またはＳＤＩ−１の類似体をコードするような核酸分子、並びに、配列番号１、または配列番号１の相補体（complement）とハイブリダイズできる核酸分子を含む。
本発明は、三重構造の形成によりＳＤＩ−１の発現を阻害する能力を持つオリゴヌクレオチドにも関係し、このオリゴヌクレオチドは、ＧおよびＣ残基のみから成り、少なくとも鎖長２０ヌクレオチドであり、ＳＤＩ−１をコードする二本鎖核酸分子とハイブリダイズできるヌクレオチド配列を有するものであって、そのハイブリダイゼーションは、二本鎖分子の、少なくとも約６５％がプリンであるか、または少なくとも約６５％がピリミジンである領域に起こり、ここで、該ヌクレオチドは、ＳＤＩ−１をコードする核酸分子における相補位置が、ＧＣ塩基対であるとき、Ｇ残基を有し、ＳＤＩ−１をコードする核酸分子における相補位置がＡＴ塩基対であるとき、Ｔ残基を有するものである。
本発明は、
（i）受容細胞におけるＤＮＡ合成を阻害し、
（ii）サイクリンまたはサイクリン依存性キナーゼと結合する
能力のある、タンパク質またはポリペプチドのアンタゴニストにも関係する。
本発明は、
（i）受容細胞におけるＤＮＡ合成を阻害し、
（ii）サイクリンまたはサイクリン依存性キナーゼと結合する
能力のある、タンパク質またはポリペプチドにも関係する。
本発明は、特に、ＳＤＩ−１、および融合タンパク質およびそれらのフラグメントに関係し、特に、腫瘍抑制遺伝子産物によって引き起こされる場合、同様の特性を有するその他の分子に関係する。
本発明は、受容細胞におけるＤＮＡ合成を阻害し、サイクリンまたはサイクリン依存性キナーゼと結合する能力のあるような分子の類似体にも関係する。
本発明は、ＳＤＩ−１に結合する、ポリクローナル抗体またはモノクローナル抗体のいずれかにも関係する。
本発明は、（i）受容細胞におけるＤＮＡ合成を阻害し、かつ（ii）サイクリンまたはサイクリン依存性キナーゼと結合する薬剤を細胞中に導入することを含んで成る、細胞増殖を阻害する方法にも関係する。
本発明は、試料を、ＳＤＩ−１と結合できる抗体と接触させ、抗体に結合した全てのＳＤＩ−１タンパク質の存在または量を測定することを含んで成る、試料中のＳＤＩ−１の存在または濃度を測定する方法にも関係する。
本発明は、受容細胞（および特に、細胞が腫瘍細胞、またはインビトロ培養における細胞である）におけるＤＮＡ合成を阻害できるタンパク質をコードする上記の核酸分子の有効量を細胞に与えることを含んで成る、ヒト細胞におけるＤＮＡ合成を阻害する方法も提供する。
本発明は、与えた核酸分子を細胞中で発現させ、その発現により、サイクリンまたはサイクリン依存性キナーゼ、特に、サイクリンＤ１、およびサイクリン依存性キナーゼＣＤＫ２の活性を減ずることができるタンパク質を産生する、上記方法の実施態様も提供する。
本発明は、更に、核酸分子、またはその相補体が、図５Ａ−５Ｄに示した核酸配列（配列番号１）にハイブリダイズでき、および／または該核酸分子は、図５Ａ−５Ｄに示した核酸配列（配列番号１）によりコードされたタンパク質のタンパク質類似体をコードするものであって、その類似体は、サイクリンまたはサイクリン依存性キナーゼ、特に、サイクリンＤ１、およびサイクリン依存性キナーゼＣＤＫ２の活性を減ずることができるものである、上記方法の実施態様に関係する。
本発明は、ＳＤＩ阻害因子（タンパク質、核酸、または有機物質）の有効量を細胞に与えることを含んで成る、静止または老化ヒト細胞におけるＤＮＡ合成の阻害を抑制する方法をも提供する。このような核酸分子（ＤＮＡまたはＲＮＡのいずれか）阻害因子は、受容細胞におけるＤＮＡ合成を阻害する能力があるタンパク質をコードするＲＮＡ分子に対して相補的な配列を持ち、かつ、生理学条件下で該分子をもう一方とハイブリダイズさせるに十分な長さを持つことができる。特に意図されるのは、細胞が内皮細胞、皮膚細胞、または損傷または火傷組織に存在する細胞である場合の実施態様である。本発明は、更にリンパ球、管組織（動脈、小動脈、毛細管、静脈など）、肝臓、腎臓、心臓、および他の筋肉、骨、脾臓などの皮膚以外の組織における本発明の薬剤の使用を意図するものである。本発明は、血管形成を達成するためのＳＤＩ分子の使用に関係する。
本発明は、
（Ａ）標的細胞に輸送され得るＳＤＩ−１およびＳＤＩ−１のフラグメントからなる群から選択されるＳＤＩ部分に薬学的成分をコンジュゲートし；さらに、
（Ｂ）ＳＤＩ部分を標的細胞に輸送させるに十分な条件で、標的細胞の存在下にコンジュゲートした分子をインキュベートし；輸送により、標的細胞への該成分のデリバリーを達成する、
ことを含んで成る製剤学的成分を標的細胞に輸送する方法をも提供する。
図面の簡単な説明：
図１は、ｃＤＮＡクローニングおよび発現ベクター、ｐｃＤＳＲα△（ＢはＢamＨＩ部位を表す）の構造を示す。
図２Ａ、２Ｂ、および２Ｃは、若い細胞のＤＮＡ合成に対して阻害性のｃＤＮＡクローンを同定するものである。異なる棒は、個々のプラスミドに対する独立したトランスフェクション実験を表しており、＊は、実施されなかったことを示し、負の数は、対照より高い標識指数を示す。各グラフは、プラスミドの異なるプールに由来する結果を示す。
図３は、アンチセンスＳＤＩ ｃＤＮＡトランスフェクションを示す。アンチセンスｃＤＮＡ発現プラスミドを作り、若い細胞中にｐＣＭＶβと同時トランスフェクションした。レーン１：対照ｐｃＤＳＲα△、レーン２：ｐｃＤＳＲα△−ＳＤＩ−１、レーン３：ｐｃＤＳＲα△アンチＳＤＩ−１、レーン４：ｐｃＤＳＲα△−ＳＤＩ−２、レーン５：ｐｃＤＳＲα△−アンチＳＤＩ−２。
図４は、細胞加齢中の総ＲＮＡからのポリＡ＋ＲＮＡ回収における変化を示す。
図５Ａ−５Ｄは、ＳＤＩ−１ ｃＤＮＡのヌクレオチド配列（配列番号１）とアミノ酸配列（配列番号２）を与える。
図６は、４Ｇyのγ−照射にさらす（白抜き円）か、または４００μＭ過酸化水素に１時間さらした（塗りつぶし円）後に得られた若い細胞（集団倍加２８）におけるＳＤＩ−１誘導の動力学を示す。
発明の詳細な説明：
Ｉ．細胞老化
培養における、ヒト正常二倍体繊維芽細胞の複製的老化は、充分に確立され、かつ広く受け入れられている細胞加齢モデルである（ヘイフリック，Ｌ.等、イクスペリメンタル・セル・リサーチ、３７巻、６１１−６３６頁（１９６５年）；ノルウッド，Ｔ.Ｈ.，およびスミス，Ｊ.Ｒ.、ハンドブック・オブ・ザ・バイオロジー・オブ・エイジング（第２版）Ｃ.Ｅ.フィンチおよびＥ.Ｌ.シュナイダー、バン・ノストランド出版、ニューヨーク、２９０−３１１頁（１９８５年）；ゴールドシュタイン，Ｓ.、サイエンス、２４９巻：１１２９−１１３３頁（１９９０年))。有限回数の集団倍加（population doublings）後、細胞が老化すると、それらは分裂したり大きくて平らな形態を表したりする能力を失う。この現象の根底にある原因となるメカニズムは、生化学レベルおよび分子レベルで老化細胞を特徴付ける多くの観察にも拘わらず、まだ理解されていない。
１次元および２次元タンパク質ゲル分析により、老化細胞に特異的なマーカータンパク質はほとんど無いことが明らかにされている（リンカーン，Ｄ.Ｗ.等、イクスペリメンタル・セル・リサーチ、１５４巻、１３６−１４６頁（１９８４年）；ワング，Ｅ.等、ジャーナル・オブ・セル・バイオロジー、１００巻、５４５−５５１頁（１９８５年）；スコッティー，Ｊ.等、ジャーナル・オブ・セル・フィジオロジー、１３１巻、２１０−２１７頁（１９８７年）；ベイロイテール，Ｋ.等、プロシーディング・オブ・ナショナル・アカデミー・オブ・サイエンシィズ・ＵＳＡ、８５巻、５１１２−５１１６頁（１９８８年))。老化細胞を特定する抗原性決定因子が、原形質膜上に見つけられた（ポーター，Ｍ.Ｂ.等、ジャーナル・オブ・セル・フィジオロジー、１４２巻、４２５−４３３頁（１９９０年))。フィブロネクチンおよびコラゲナーゼなどの細胞外マトリクスの成分が、老化細胞の中で過剰に発現されることが見い出された（ウエスト，Ｍ.Ｄ.等、イクスペリメンタル・セル・リサーチ、１８４巻、１３８−１４７頁（１９８９年）；クマザキ，Ｔ.等、イクスペリメンタル・セル・リサーチ、１９５巻、１３−１９頁（１９９１年)）。しかしながら、これらの観察と細胞老化との関連性は明らかでは無い。
細胞周期は、成長因子により調節および制御されていることが分かっている。成長因子は、特定の細胞表面受容体に結合することにより、細胞周期の第１間期（Ｇ１）に作用し、次に、促進初期応答遺伝子および遅延初期応答遺伝子の両方の転写を最終的に支配するシグナリング・カスケード（signaling cascades）を引き起こす。成長周期は、キナーゼ類、特に、“サイクリン−依存性キナーゼ類”(“ＣＤＫs”）により、“サイクリン類”自身により、またホスファターゼ類により統御される（シェール,Ｃ.Ｊ.、セル、７３巻、１０５９−１０６５頁（１９９３年)、本明細書に参照して組み込んである）。
ＤＮＡ合成周期に関係する哺乳類キナーゼ類を同定するために、かなりの努力が払われて来た。脊椎動物の細胞において、サイクリン類のファミリーが同定されている（キィオン,Ｙ.等、セル、７１巻、５０５−５１４頁（１９９２年))。これら数種のサイクリン類をコードする遺伝子配列が単離されている（モトクラ,Ｔ.等、ネイチャー、３５０巻、５１２−５１５頁（１９９１年）；キィオン,Ｙ.等、セル、６５巻、６９１−６９９頁（１９９１年）；ルウ,Ｄ.Ｊ.等、セル、６５巻、１１９７−１２０６頁（１９９１年）；キィオン,Ｙ.等、カレント・バイオロジー、１巻、３６２−３６４頁（１９９１年）；マツシメ,Ｈ.等、セル、６５巻、７０１−７１３９頁（１９９１年）；イナバ,Ｔ.等、ゲノミックス、１３巻、５６５−５７４頁（１９９２年）；キィオン,Ｙ.等、ゲノミックス、１３巻、５７５−５８４頁（１９９２年))。
サイクリンＤ類は、成長周期を開始するためにＧ１段階でＣＤＫ２、ＣＤＫ４、およびＣＤＫ５と相互作用する（マツシメ,Ｈ.等、セル、６５巻、７０１−７１３９頁（１９９１年）；シェール,Ｃ.Ｊ.、セル、７３巻、１０５９−１０６５頁（１９９３年))。サイクリンＥ／ＣＤＫ２相互作用は、Ｓ期の開始を調節する（ルウ,Ｄ.Ｊ.等、セル、６６巻、１１９７−１２０６頁（１９９１年）；コフ,Ａ.等、セル、６６巻、１２１７−１２２８頁（１９９１年))。サイクリンＡは、ＣＤＫ２と相互作用して、成長周期のＳ期を調節することが示唆されている（シェール,Ｃ.Ｊ.、セル、７３巻、１０５９−１０６５頁（１９９３年)）。サイクリンＡおよびＢは、ＣＤＣ２と相互作用し、Ｓ期の終了とＧ２期の開始を媒介すると考えられている（ノーブリー,Ｃ.等、アナリティカル・レビュー・オブ・バイオケミストリー、６１巻、４４１−４７０頁（１９９２年）；ファン,Ｆ.等、セル、６６巻、７３１−７４２頁（１９９１年）；ウォルカー,Ｄ.Ｈ.等、ネイチャー、３５４巻、３１４−３１７頁（１９９１年))。
最近、幾つかの成長調節遺伝子の発現における変化が明らかにされた。c−fos cdc２、サイクリンＡおよびＢの発現が老化細胞では減少することが見い出された（セサドリ，Ｔ.およびカンピシ，Ｊ.、サイエンス、２４７巻、２０５−２０９頁（１９９０年))。同様に、老化細胞は、網膜芽腫タンパク質をリン酸化する能力がないことを明示している（ステイン，Ｇ.Ｈ.等、サイエンス、２４９巻、６６６−６６９頁（１９９０年))。これらの観察は、これらが全て成長促進遺伝子発現の低下変化であることから、当該細胞がＳ期に入る能力の無いことを強力に説明し得ると思われるが、しかしながら、これらが老化の原因であるのか、結果であるのかは明らかではない。
老化を引き起こす役割を持つと思われる遺伝子発現におけるもう１つの付加的な変化は、若い繊維芽細胞ではなく、老化繊維芽細胞により生成されたＤＮＡ合成の阻害因子(群)である（スピアリング，Ａ.Ｉ.等、イクスペリメンタル・セル・リサーチ、１９５巻、５４１−５４５頁（１９９１年）参照）。阻害因子(群)が存在する証拠は、最初、ヘテロカリオン実験から得られ、その中で老化細胞は、ヘテロカリオンの中の若い核内でＤＮＡ合成の開始を阻害した（ノルウッド，Ｔ.Ｈ.等、プロシーディング・オブ・ナショナル・アカデミイー・オブ・サイエンシィズ・ＵＳＡ、７１巻、２２３１−２２３４頁（１９７４年）；ペレイラ−スミス，Ｏ.Ｍ.、およびスミス，Ｊ.Ｒ.、ソマティック・セル・ジェネティックス、８巻、７３１−７４２頁（１９８２年))。老化細胞質体と若い細胞全体を含むサイブリッド(cybrids）の研究は、老化細胞中の、表面膜結合タンパク質のＤＮＡ合成阻害因子の存在に対して、更なる支持を与えるものであった（ドレッシャー−リンカーン，Ｃ.Ｋ.、およびスミス，Ｊ.Ｒ.、イクスペリメンタル・セル・リサーチ、１５３巻、２０８−２１７頁（１９８４年))。このことは、老化細胞由来の表面膜含量が豊富な調製物、またはその膜から抽出したタンパク質を若い細胞の培養培地に加えたとき、ＤＮＡ合成を阻害することが見い出されることで直接説明された（ペリラ−スミス，Ｏ.Ｍ.等、イクスペリメンタル・セル・リサーチ、１６０巻、２９７−３０６頁（１９８５年）；ステイン，Ｇ.Ｈ.、およびアトキンス，Ｌ.、プロシーディング・オブ・ナショナル・アカデミー・オブ・サイエンシィズ・ＵＳＡ、８３巻、９０３０−９０３４頁（１９８６年))。この阻害因子の生化学的方法による精製は、現在までのところ、成功していない。しかしながら、マイクロインジェクション実験では、ＤＮＡ合成阻害性メッセンジャーＲＮＡが非常に多く存在することが示されている（ランプキン，Ｃ.Ｋ.等、サイエンス、２３２巻、３９３−３９５頁（１９８６年)）。
ＤＮＡ合成阻害因子(群)をコードする遺伝子(群)のクローン化を試みるために、機能的スクリーニング法（a functional screening procedure）が用いられた。この方法により、若いサイクリング細胞中に導入した場合にＤＮＡ合成阻害活性を示す３種のｃＤＮＡを分離および同定した。これらの分子は、“老化細胞由来阻害因子群”(“ＳＤＩ”）として本明細書に引用される好ましい分類の分子群である。
本発明のＳＤＩ分子のクローニング、単離、配列決定、および特性化に続いて（例えば、ＰＣＴ出願番号ＵＳ９３／１２２５１参照）、他の研究グループも同様の研究を行った。このような後続研究では、本発明のＳＤＩ−１分子をＷＡＦ１、ＣＩＰ１、ＰＩＣ１、およびｐ２１として記載している（ハーパー,Ｊ.Ｗ.等、セル、７５巻、８０５−８１６頁（１９９３年）；エル−デイリー,Ｗ.Ｓ.等、セル、７５巻、８１７−８２５頁（１９９３年）；キィオン,Ｙ.等、ネイチャー、３６６巻、７０１−７０４頁（１９９３年）；ハンター,Ｔ.等、セル、７５巻、８３９−８４１頁（１９９３年)）。
ＩＩ．細胞老化の誘導物質のクローニング
本発明の実施に際し、老化ヒト二倍体繊維芽細胞中に存在するＤＮＡ合成阻害性配列群の分子クローニングのために有効な方法が好適に用いられる。生物学的に重要な遺伝子群のクローン化を試みる場合そうであるように、その生産物の活性は容易に検出し得るのに、細胞老化にかかわる所望の遺伝子を精製するのは可能でないこともある。
このような遺伝子配列を同定するために構想され得る１つの方法は、老化細胞由来ｃＤＮＡライブラリーのディファレンシャル（differential）またはサブトラクティブ（subtractive）スクリーニングを用いることであろう。この方法は、ヴェルナー症候群患者由来の細胞において過剰発現されるｃＤＮＡ分子を同定するのに用いられている（ムラノ，Ｓ.等、モレキュラー・セル・バイオロジー、１１巻、３９０５−３９１４頁（１９９１年８月))。ヴェルナー症候群は、希に遺伝する疾病である。それは早熟加齢（premature aging）により特徴付けられている。自然の加齢とヴェルナー症候群との関連性は知られていない。
不運にも、このようなスクリーニングは、老化細胞の特定には重要であるけれども、老化の主要な原因ではない、多数の遺伝子を同定するだろう。更に、全長ｃＤＮＡのクローニングにおける技術的な制約が、これらの方法によりクローン化される遺伝子群の機能決定を困難にしている。これらの理由から、このようなディファレンシャル法は、老化関連遺伝子配列群を同定するには、一般的に適切でもなく、また最も望ましい方法でもない。
反対に、発現スクリーニングは、このような老化関連遺伝子配列群の好ましい同定および分離方法を与えるものである。このスクリーニング法では、クローン化した遺伝子を受容細胞において発現する能力を有するベクター内でｃＤＮＡを直接クローン化する。こうして、ＤＮＡ合成における何等かの阻害に対して直接受容細胞をスクリーニングすることが出来る。
発現スクリーニングにおいて、最も重要な段階は、ｃＤＮＡの合成である。酵素は、夾雑物がないように、注意深く選択されるべきである。ｃＤＮＡ合成は、満足の行く結果（即ち、正確な逆転写および十分な長さの転写サイズ）が得られることを確実にするために、好ましくは数回繰り返される。最終的に、ｃＤＮＡ生産物は、好ましくは、断片になったり早すぎて終了したｃＤＮＡ生産物を除去するために、サイズ画分される。二本鎖ｃＤＮＡ生産物は、次いで、大きさに基づく画分、即ち、０.５−２.０、２.０−４.５、４.５−１０kb画分に好適に分けられる。膜結合タンパク質の多くが、相対的に高い分子量を有するという推定のもとに、２−４.５kb ｃＤＮＡ画分を用いて、ｃＤＮＡライブラリーを作成した。ｃＤＮＡ群は適切な発現ベクター、好ましくはｐｃＤＳＲα△の中に挿入され、挿入された配列群は若い細胞内で高レベルで転写され得る。
最も好ましいトランスフェクション法は、ＤＥＡＥデキストラン媒介トランスフェクションであり、高い割合で若いサイクリング細胞を一時的に発現させる条件下で行われる。トランスフェクション頻度は、実験毎に変化するため、ｃＤＮＡプールプラスミドを、ｐＣＭＶβ（β−ガラクトシダーゼをコードする）などのマーカープラスミドと一緒にトランスフェクションし、標識指数をβ−ガラクトシダーゼ陽性細胞のみでアッセイした。一般に、トランスフェクションした遺伝子群の同時発現は、トランスフェクション・コンピテントな細胞が多くのプラスミドを受け入れることから、かなり高い。この簡単な同時トランスフェクション法は、細胞外ＤＮＡを発現する細胞におけるＤＮＡ合成の評価を可能にした。
同時トランスフェクションされるプラスミド量は、パイロット試験から容易に決定できる。トランスフェクション頻度と加えたプラスミドの量との間の相互関係は、マーカープラスミドを用いて試験され、最大効率は、プラスミド１００−５００ngの範囲で得られる。この結果を考慮に入れて、好ましくはｃＤＮＡライブラリーを、各プールが５種の独立したプラスミドクローンを含む小さいプールに分けた。次いで、ｐＣＭＶβ約１００ngとｃＤＮＡプラスミド約４００ngとで同時トランスフェクションを行う。これらのパラメーターは、マーカープラスミドのトランスフェクション頻度を低減すること無く、β−ガラクトシダーゼ陽性細胞におけるｃＤＮＡの同時発現を最大にすることが見い出された。
スクリーニングの第２ラウンド後、ＤＮＡ合成の強力な阻害を示した単一のプラスミドを、第１ラウンドスクリーニングの時に陽性と判断されたプールからうまく分離することが出来た（図２Ａ、２Ｂ、２Ｃ）。図２Ａ、２Ｂ、および２Ｃでは、第１ラウンドスクリーニングにおいて陽性を示したｃＤＮＡプールを個々のプラスミドに分け、再びトランスフェクションした。各ｃＤＮＡプール（図２Ａ、２Ｂ、２Ｃにおいて、それぞれＡ、ＢおよびＣ）について、プラスミドＮｏ.１ないし５は、それぞれ単一プラスミドトランスフェクションの結果を示している。プールＢでは、Ｎo.１プラスミドは、単なる空のベクターであることが分かった。プラスミドの阻害性活性は、好ましくは、核マイクロインジェクション実験により、更に確かめられる。このような実験は、分離されたプラスミドがＤＮＡ合成を阻害する能力を持つ配列群を含むことの、より直接的な証拠を与えるものである。
ＩＩＩ．本発明の分子
本発明の薬剤成分（“ＳＤＩ分子類”として総括的に表す）は、活性細胞におけるＤＮＡ合成の阻害を誘導するか、または老化または静止細胞における、このような阻害を抑制するかのいずれかの能力を持つものである。それ自体、これらは、広範囲の治療および応用に用いられ得る。
本発明のＳＤＩ分子類は、ＳＤＩ核酸分子類（例えば、ＳＤＩ−１をコードする核酸分子、ＳＤＩ−１フラグメントをコードする分子、ＳＤＩ−１融合物をコードする分子、ＳＤＩアンチセンス分子、ＳＤＩ三重鎖抑制分子、等）、ＳＤＩタンパク質分子類（即ち、ＳＤＩ−１およびその融合体およびフラグメント類、かかる分子に対する抗体類、およびタンパク質類似体類およびかかる分子のもどき体類)、および非タンパク質もどき体類およびかかる分子の類似体類を含む。
このような分子類は、天然由来、または非天然由来のいずれかであり得る。天然由来のＳＤＩ−１分子は、該分子を含有する天然由来調製物中に存在するか、または存在し得る１またはそれ以上の分子が、除去されているか、または通常存在する濃度よりも低い濃度で存在するように、精製することができる。
本発明の分子類は、ＳＤＩタンパク質分子の構造に似ているかまたは模倣する三次構造を有する、核酸類、タンパク質類、炭水化物類、または、より好ましくは、有機分子類のいずれかであることができる。本発明は、更に、あらゆる天然由来ＳＤＩ分子の代わりに、または該分子に加えて、ＳＤＩ核酸分子類、ＳＤＩタンパク質分子類等のような分子類の生物学的に活性なフラグメントの使用に関係する。本明細書で使用する場合、分子は、受容細胞の増殖能力における影響を媒介する能力があるならば、細胞増殖に関して“生物学的に活性”であると言う。このような生物学的に活性とは、アンチセンス抑制を媒介する能力、または特定の核酸部位に、またはタンパク質、レセプター等の特定の活性部位と結合する（またはかかる結合のためにその他の分子と競合する）能力などの構造特性であり得る。これとは別に、このような特性は、触媒的であることもでき、また生物学的に活性な分子が化学反応、または受容細胞における応答を媒介する能力を含むこともある。
本発明は、このようなＳＤＩ分子類全ての“純化”形態での単離を可能にするものである。本明細書で使用する場合、ＳＤＩ分子が、その天然状態で通常はＳＤＩ分子と結合する分子が存在しない調製物中に存在するならば、“純化”と言う。タンパク質、脂質、ＳＤＩ分子をコードしない核酸配列は、天然ではＳＤＩ分子と結合する分子の例である。
Ａ．ＳＤＩ核酸分子類、およびそれらのオリゴヌクレオチド
またはポリヌクレオチドフラグメント類
ＳＤＩ核酸分子の好ましい分類は、核酸分子：ＳＤＩ−１、ＳＤＩ−２、およびＳＤＩ−３、およびそれらの生物学的に活性なフラグメントを含む。このようなフラグメントを同定するために、ＳＤＩ核酸分子を、機械による方法により、またはより好ましい制限エンドヌクレアーゼ切断により、切断し、それによって、候補となるフラグメント（candidate fragments）を産生できる。次いで、このようなフラグメント類を細胞に与えることができ、それらがＤＮＡ合成を阻害する能力を追跡することができる。一実施態様では、タンパク質ＳＤＩ分子のフラグメントをコードする遺伝子配列を受容細胞に投与することができる。
（連接した配列とともに、または、なしで）核酸ＳＤＩ分子のフラグメントを投与することにより、ＳＤＩ核酸分子の特定のフラグメントが、その構造からして生物学的な活性を有するかどうかを評価することが可能である。従って、例えば、かかる候補となるＳＤＩ分子を、正常細胞、不死化細胞、または腫瘍細胞のいずれかに導入してもよく、細胞が更に増殖する能力を追跡することができる。この方法で、細胞増殖を抑制する、または静止を誘導する配列を同定できる。
かかる方法を使用することにより、ＳＤＩ−１のアミノ末端側半分をコードする核酸分子が、不死化細胞または腫瘍細胞を静止状態に転換させる能力を示すことが分かった。より詳細には、ＳＤＩ−１アミノ酸残基１−７０をコードする核酸分子は、細胞静止を導く能力があることが分かった。残基１−７０がＳＤＩ−１の触媒ドメインを含有するという認識により、ＳＤＩ−１をコードする配列のその他のフラグメントが触媒活性を有することが示される。候補となる好ましいオリゴヌクレオチドフラグメントは、ＳＤＩ−１アミノ酸残基：５−７０、１０−７０、１５−７０、２０−７０、２５−７０、３０−７０、３５−７０、または４０−７０をコードする核酸分子を含む。
下記のとおり、本発明の一態様は、ＳＤＩ−１ｍＲＮＡのレベルを測定する方法に関係する。ＳＤＩ核酸分子とハイブリダイズする能力のある核酸分子は、かかる診断目的に使用できる。本明細書で使用する場合、２つの核酸分子は、２つの分子が、逆平行構造、二本鎖核酸構造を形成できるならば、もう一方とハイブリダイズできると言う。これらの分子は、これらが、少なくとも常用の“低ストリンジェンシー”条件でもう一方にアニールした状態を維持させるに十分な安定性を伴ってもう一方とハイブリダイズできるならば、“最小限に相補的”であると言われる。同様にして、これらの分子は、これらが、常用の“高ストリンジェンシー”条件でもう一方にアニールした状態を維持させるに十分な安定性を伴ってもう一方とハイブリダイズできるならば、“相補的”であると言う。理解されると思うが、相補的分子は、“完全な相補性”（即ち、１方の分子の全てのヌクレオチドが、他方のヌクレオチドに対して相補的である）を示す必要はなく、その配列が、所定の溶媒および塩濃度下で安定な二本鎖構造を形成できるために十分に相補的であることのみが必要である。核酸分子は、それらが、完全な相補性を示すならば、もう一方の核酸分子の“相補体（complement）”であると言う。常用のストリンジェンシー条件は、サンブルック,Ｊ.等により（モレキュラー・クローニング、ア・ラボラトリー・マニュアル、第２版、コールド・スプリング・ハーバー・プレス、ニューヨーク州コールド・スプリング・ハーバー（１９８９年）に）、およびヘイムス，Ｂ.Ｄ.等により（ヌクレイック・アシッド・ハイブリダイゼーション、ア・プラクティカル・アプローチ、ＩＲＬプレス、ワシントンＤＣ（１９８５年）、両方とも本明細書に参照して組み込んである）記載されている。従って、完全な相補性がなくても、それが、分子の二本鎖構造形成能力を完全に妨げるものでなければ、差し支えないのである。
ＳＤＩ核酸分子にハイブリダイズさせるために使用され得る核酸分子は、好ましくは、かかるＳＤＩ分子よりも短いものである。好ましい分子は、ＳＤＩ核酸分子に対して完全に相補性であり、約１５ないし約２５０ヌクレオチドの長さ、最も好ましくは約１５ないし約３０ヌクレオチドの長さを有するものである。
このような核酸分子は、固相オリゴヌクレオチド合成法を用いて得ることができるが、より好ましくは、このような分子を、ＳＤＩ核酸分子のフラグメントに対して相補的であるプライマー分子のポリメラーゼ媒介化鋳型依存性鎖伸長を介して得る。このようなＳＤＩ核酸分子のフラグメントは、約１５ないし約２５０ヌクレオチドの長さを有し、最も好ましくは、約１５ないし約３０ヌクレオチドの長さを有する。かかるフラグメントは、ＤＮＡまたはＲＮＡであることができ、かつ、ベクター内に組み込まれていてもよく、または実質的に他の核酸分子がない状態であり得る。
Ｂ．核酸ＳＤＩ分子によりコードされるタンパク質およびポリペプチド
本発明は、更に、ＳＤＩ核酸分子またはそれらのオリゴヌクレオチドフラグメントによりコードされるタンパク質およびポリペプチドを含む。ＳＤＩ核酸分子の配列は、静止および老化に関連するＤＮＡ合成の阻害を抑制するか、またはかかる状態を増殖細胞に引き起こすかのいずれかのために使用され得るコード化タンパク質およびポリペプチド分子の帰属および同定を可能にするものである。かかる分子のアミノ酸配列は、核酸分子のヌクレオチド配列とそれがコードするタンパク質のアミノ酸配列との知られた関係から容易に得ることができる。治療上有効なタンパク質類およびポリペプチド類を、治療上有効なＳＤＩ核酸フラグメントを同定する上記方法に類似した方法を用いて同定できる。かかるタンパク質を変異させることにより、ＤＮＡ合成を阻害する能力を欠失した分子を同定することが可能である。このような変異分子の中には、ＳＤＩコード化タンパク質およびポリペプチドの阻害作用を反転させるに十分な優位作用を発揮できるタンパク質がある。
一実施態様では、かかる分子を、核酸ＳＤＩ分子を切断し、次いで、切断フラグメントを翻訳可能な発現ベクター内に組み込むことにより、同定する。この方法では、それぞれが異なるポリペプチドフラグメントを生成する核酸分子のライブラリーを得ることができ、かつ評価できる。このような発現は、付加的または外来タンパク質がなくても良く、また、特定の融合タンパク質に対するＳＤＩフラグメントの融合体を含んでなる場合もある。発現したタンパク質の生物学的な活性は、かかるフラグメントを受容細胞中に導入し、静止または増殖におけるかかる導入の影響を測定することにより評定できる。別法として、かかる分子を、生物学的に活性なＳＤＩ分子と結合するように前処理したカラムに通すことができる。かかるカラムは、例えば、ｐ５３、ＳＤＩ−１、ＲＢ、サイクリンＤ、cdk２、等を結合させた状態で含有することができ、かかる分子に結合する能力を有するフラグメントを同定できる。
タンパク質フラグメントＳＤＩ分子の例には、ＳＤＩ−１の最初の７０アミノ酸があり、これは、ＳＤＩ−１の場合と類似する生物学的な活性を有する。より小さいフラグメント（例えば、ＳＤＩ−１残基：５−７０、１０−７０、１５−７０、２０−７０、２５−７０、３０−７０、３５−７０、または４０−７０を含有するもの）を採用することもできる。ＳＤＩ−１アミノ酸残基２９−４５を有するタンパク質フラグメントが、特に望まれる。保存的アミノ酸置換を考慮するとき、ＳＤＩ−１のこの領域は、ＰＣＮＡに対して３１％の同一性と６２％の類似性を示す。ＳＤＩ−１とＰＣＮＡの双方がサイクリン−Ｃdk複合体と相互作用するため、共通の保存領域（ＳＤＩ−１アミノ酸残基２９−４５）は、かかる相互作用に関係していると考えられている。従って、この保存領域を含有するＳＤＩ−１のフラグメントは、ＳＤＩ−１の阻害因子を含んでなり、実際にＳＤＩ−１機能を示すことができる。
典型的には、ＳＤＩタンパク質およびタンパク質フラグメントは、付加的なアミノ酸残基のない状態で生成されるものである。別法として、ＳＤＩタンパク質およびタンパク質フラグメントは、アミノ酸またはポリペプチドに融合した状態で生成されることもある。かかる合成は、常用のペプチド合成法を用いて、または、より好ましくは、組換え法を用いて達成できる。融合分子が望まれる場合は、かかる分子は、融合分子のＳＤＩ部を該融合タンパク質の残部から切断できるような選択可能な切断部位を含有し得る。
特に好ましい融合分子は、グルタチオンＳ−トランスフェラーゼグルタチオン結合配列をＳＤＩ分子のアミノ末端に融合することにより生じる。かかる融合タンパク質は、カラムにかけた場合のそれらの保持時間によって容易に回収できる。この融合タンパク質は、グルタチオンで洗浄することによりカラムから除去できる。ＧＳＴ−ＳＤＩ−１融合タンパク質は、ペプチド合成、例えば、ＳＤＩタンパク質をグルタチオンＳ−トランスフェラーゼとの融合体として合成することにより、生成できる。別法として、組換えＤＮＡ法を用いて、ＧＳＴをコードするポリヌクレオチドをＳＤＩ−１またはそれらのフラグメントをコードするポリヌクレオチドとつなぐことができる。グルタチオンＳ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）の配列は知られており、この配列を含有するベクターが、報告されている（ロス,Ｖ.Ｌ.等、バイオケミカル・ジャーナル、２９４巻、３７３−３８０頁（１９９３年）；コムストック,Ｋ.Ｅ.等、ジャーナル・オブ・バイオロジカル・ケミストリー、２６８巻、１６９５８−１６９６５頁（１９９３年）；タカハシ,Ｙ.等、ジャーナル・オブ・バイオロジカル・ケミストリー、２６８巻、８８９３−８８９８頁（１９９３年）；クロン,Ａ.等、バイオケミカル・ジャーナル、２８５巻、９２５−９２８頁（１９９２年）；スターンベルグ,Ｇ.等、プロテイン・エクスプレッション・アンド・プリフィケーション、３巻、８０−８４頁（１９９２年）；モロー,Ｃ.Ｓ.等、ジーン、７５巻、３−１２頁（１９８９年))。
これとは別の好ましい融合分子は、アミノ末端［Ｈis］６（配列番号３７）リーダー配列を有するものである。かかるリーダー配列が存在すると、ＳＤＩタンパク質の活性は実質的に低減しない。より好ましくは、ＳＤＩ−１のアミノ末端メチオニンと結合した配列ＭＲＧＳＨＨＨＨＨＨＧＡ（配列番号４）を有するリーダー配列を採用する。
好ましい融合体は、実質的に全てのＧＳＴタンパク質を含む。特に好ましい融合体として、シストソーマ・ジャポニカムのＧＳＴを採用する。このＧＳＴの配列は、スミス等（ジーン、６７巻、３１頁（１９８８年))に記載されており、このＧＳＴをコードするポリヌクレオチドは、商業的に入手できる（pＧＥＸ-２Ｔ；ファルマシア）。シストソーマ・ジャポニカムのＧＳＴをコードするＤＮＡ配列は、配列番号５として示しており；コード化アミノ酸配列は、配列番号６に示している。様々な方法のどれを用いても、かかる好ましい融合体を産生できる：詳細な方法は、実施例２０に与えている。一実施態様において、シストソーマ・ジャポニカムのＧＳＴをコードするポリヌクレオチドにおける制限エンドヌクレアーゼ認識部位を用いて、このポリヌクレオチドを切断できる。次いで、切断生成物を、所望のＳＤＩ分子をコードするポリヌクレオチドにライゲートできる。こうして、例えば、シストソーマ・ジャポニカムのＧＳＴをコードする配列をＢamＨＩで切断して、ＧＳＴをコードするポリヌクレオチドのヌクレオチド１−６７３を含有するポリヌクレオチドフラグメントを得（該分子のヌクレオチド６７３−６７８に位置する部位でＢamＨＩ切断する）、次いで、そのフラグメントをＳＤＩ遺伝子配列（ＳＤＩ−１をコードするポリヌクレオチドなど）にライゲートすることにより、好ましい融合体を作成できる。例えば、ＳＤＩ−１をコードするポリヌクレオチドを用いる場合、発現時に、ＳＤＩ−１のアミノ末端につなげられたＧＳＴの２３２アミノ酸の最初の２２６を含有する融合タンパク質が産生されるように、遺伝子融合により、ＧＳＴフラグメントをＳＤＩ−１ポリヌクレオチドにつなぐ。
下記のとおり、本発明の一態様は、ＳＤＩ−１に対する抗体に関係する。上記タンパク質およびポリペプチドを用いて、本発明の方法に従い使用され得るポリクローナルまたはモノクローナル抗体を顕現させることができる。
Ｃ．ＳＤＩ分子の機能的類似体
本発明は、ＳＤＩ分子の“機能的類似体”にも関係する。かかる類似体は、“古典類似体”と“もどき類似体”の双方を含む。ＳＤＩ分子の古典類似体とは、類似の生物学的活性を持ち、化学的にＳＤＩ分子に関連しているものである。例示説明すると、ＳＤＩ活性を有する非天然由来の変異体タンパク質は、タンパク質ＳＤＩ分子の古典類似体を構成するものである。同様に、変異化ＳＤＩ核酸分子は、ＳＤＩ遺伝子配列の古典類似体の一例を構成するものである。また、ヒト以外の哺乳類（例えば、マウス、サルなど）から単離されたＳＤＩ分子は、ＳＤＩ遺伝子配列の古典類似体の一例を構成するものである。これとは反対に、ＳＤＩ分子の“もどき類似体”とは、その分子の生物学的活性は保有するが、典型的に、化学的には無関係である。その構造がＳＤＩタンパク質の活性部位によく似ているような有機分子は、そのタンパク質の“もどき類似体”を構成するものである。同様に、ＳＤＩの核酸結合部位に結合できる、またはＳＤＩにより認識される非核酸分子は、その分子のもどき類似体である。
従って、機能的類似体は、オリゴヌクレオチドまたはポリヌクレオチド、タンパク質性化合物（グリコシル化、および非グリコシル化タンパク質を含む）、または非タンパク質性化合物（例えば、ステロイド、糖脂質など）のいずれかであることができ、ただし、該成分は、ＳＤＩ核酸分子の全体、またはそれらのオリゴヌクレオチドまたはポリヌクレオチドフラグメントのいずれか、またはかかる分子またはフラグメントによりコードされるタンパク質またはポリペプチドの機能をまねるものである。好ましい古典類似体には、その配列がＳＤＩタンパク質の活性触媒部位または結合部位を含んで成るポリペプチド（環状ペプチド並びに直鎖状ペプチドを含む）、またはＳＤＩ活性を抑制するか、または誘導するかのいずれかの能力を有する核酸ＳＤＩ分子のオリゴヌクレオチドフラグメントがある。好ましいもどき類似体には、ＳＤＩタンパク質のフラグメントまたはそれらの変異体ではないにもかかわらず、ＳＤＩ様の手段で静止を誘導したり、ＳＤＩアンタゴニストのような手段で細胞増殖を誘導する能力を示すポリペプチドがある。
古典類似体は、下記のとおり、合理的に、または確立された変異誘発法を介して、同定できる（例えば、ワトソン,Ｊ.Ｄ.等、モレキュラー・バイオロジー・オブ・ザ・ジーン、第４版、ベンジャミン／キュミングス、メンロ・パーク、カルフォルニア（１９８７年))。重要なのは、無作為変異誘発法は、変異させる遺伝子配列についてのpriori情報を必要としないことである。この方法は、その機能に基づいて、特定の変異が望ましいかどうかを評価する利点を有し、従って、どのように、または、なぜ、生じた変異体タンパク質が特定のコンホーメーションを取るかを理解する必要がない。実際に、標的遺伝子配列の無作為の変異は、所望の特性を有する変異体タンパク質を得るために使用される１つの手法である（レザーバロウ,Ｒ.Ｊ.、プロテイン・エンジニアリング、１巻、７−１６頁（１９８６年）；ノウルス,Ｊ.Ｒ.、サイエンス、２３６巻、１２５２−１２５８頁（１９８７年）；シァウ,Ｗ.Ｖ.、バイオケミカル・ジャーナル、２４６巻、１−１７頁（１９８７年）；ゲリ,Ｊ.Ａ.、ケミカル・レビュー、８７巻、１０７９−１１０５頁（１９８７年))。別法として、特定配列の変更が望まれる場合、部位指向性変異誘発（site-directed mutagenesis）法を採用できる。従って、このような方法を使用して、重要であると考えられるようなタンパク質のアミノ酸のみを選択的に変えることができる（クライク,Ｃ.Ｓ.、サイエンス、２２８巻、２９１−２９７頁（１９８５年）；クロニン,Ｃ.Ｓ.等、バイオケミストリー、２７巻、４５７２−４５７９頁（１９８８年）；ウィルクス,Ｈ.Ｍ.等、サイエンス、２４２巻、１５４１−１５４４頁（１９８８年))。
ＳＤＩ分子の核酸類似体は、ｐ５３、またはその他の細胞調節因子により調節されるそれらの能力により評価され得る。これとは別に、細胞増殖に影響を与えるそれらの能力を直接アッセイすることができる。ＳＤＩのタンパク質類似体の場合、変異体タンパク質を精製し、その活性をＳＤＩ分子と比較することにより、このような研究を達成できる。かかる変異体の分析は、ファージ表示タンパク質リガンドスクリーニング系（phage display protein ligand screening system）の使用により促進され得る（ロウマン,Ｈ.Ｂ.等、バイオケミストリー、３０巻、１０８３２−１０８３８頁（１９９１年)；マークランド,Ｗ.等、ジーン、１０９巻、１３−１９頁（１９９１年）；ロバーツ,Ｂ.Ｌ.等、プロシーディングス・オブ・ナショナル・アカデミー・オブ・サイエンシィス(Ｕ.Ｓ.Ａ.)、８９巻、２４２９−２４３３頁（１９９２年）；スミス,Ｇ.Ｐ.、サイエンス、２２８巻、１３１５−１３１７頁（１９８５年）；スミス,Ｒ.Ｐ.等、サイエンス、２４８巻、１１２６−１１２８頁(１９９０年）、全て本明細書に参照して組み込んである)。一般に、この方法は、所望のタンパク質リガンドがウイルスのコートタンパク質(例えば、Ｍ１３遺伝子IIIコートタンパク質、またはラムダコートタンパク質）のＣ末端に融合している融合タンパク質を発現することを含んでいる。
天然由来ＳＤＩ分子のもどき類似体は、常用のまたは合理的な薬剤デザインの原理を用いて得ることができる（アンドリュース,Ｐ.Ｒ.等、プロシーディングス・オブ・ザ・アルフレッド・ベンゾン・シンポジウム、２８巻、１４５−１６５頁、ムンクスガールト、コペンハーゲン（１９９０年）；マックパーソン,Ａ.、ヨーロピアン・ジャーナル・オブ・バイオケミストリー、１８９巻、１−２４頁（１９９０年）；ホル,Ｗ.Ｇ.Ｊ.等、モレキュラー・レコグニション：ケミカル・アンド・バイオケミカル・プロブレンズ、ロバート,Ｓ.Ｍ.編；ロイヤル・ソサイエティー・オブ・ケミストリー；８４−９３頁（１９８９年）；ホル,Ｗ.Ｇ.Ｊ.、アルツナイム−ホルシュ、３９巻、１０１６−１０１８頁（１９８９年）；ホル,Ｗ.Ｇ.Ｊ.、アグニュー・ケミカル・インターナショナル・エデイション・イングリッシュ、２５巻、７６７−７７８頁（１９８６年）、全て本明細書に参照して組み込んである）。
常用の薬剤デザイン法に従い、所望のもどき分子は、その構造が“本来の”ＳＤＩ分子の構造と共通の特質を有するものである分子、またはＳＤＩ分子と相互作用する分子を無作為に試験することにより得られる。結合する分子の特定の基を変えることにより生じる量的貢献を、本来のＳＤＩ分子と推定もどき体との競合、または協同性の能力を測ることにより、測定できる。
合理的薬剤デザインの一実施態様では、もどき体は、ＳＤＩ分子の最も安定な三次元コンホーメーション特性を共有するように設計される。従って、ＳＤＩ分子のもどき類似体を、ＳＤＩ分子により示されるのと類似のイオン性、疎水性、またはファン・デル・ワールス相互作用を引き起こすに十分な方法で配向される化学基を所有するように設計できる。合理的デザインの第２の方法では、特定のＳＤＩ分子がコンホーメーション的“休息”（conformational"breathing"）を受ける能力を活用する。このような“休息”---異なる分子コンホーメーションを一時的かつ可逆的にとること---は、十分に認識される現象であり、温度、熱力学的因子により、また分子の触媒活性により生じる。ＳＤＩ分子の三次元構造は、かかる評価を容易ならしめるものである。ＳＤＩ分子の天然のコンホーメーション変化を評価すると、ヒンジ部位である可能性のある部位、即ち、水素結合、イオン結合、またはファン・デル・ワールス結合が生じ得るかまたは分子の休息等によって排除され得る可能性のある部位、の認識が容易である。このような認識は、ＳＤＩ分子がとり得る更なるコンホーメーションの同定を可能にし、かかるコンホーメーションを共有するもどき類似体の合理的デザインおよび生成を可能にする。
合理的もどき体デザインを行うのに好ましい方法は、ＳＤＩ分子の三次元構造の画像（RIBBON（プリエストル,Ｊ.、ジャーナル・オブ・モレキュラー・グラフィックス、２１巻、５７２頁（１９８８年)を用いて得られるようなもの)、QUANTA（ポリゲン）、InSite（ビオシン）、またはナノビジョン（アメリカン・ケミカル・ソサイエティー）を形成できるコンピューターシステムを採用するものである。このような分析は、ホル,Ｗ.Ｇ.Ｊ.等により（モレキュラー・レコグニション：ケミカル・アンド・バイオケミカル・プロブレンズ、ロバーツ,Ｓ.Ｍ.編；ロイヤル・ソサイエティー・オブ・ケミストリー；８４−９３頁（１９８９年)に、ホル,Ｗ.Ｇ.Ｊ.（アルツナイム−ホルシュ、３９巻、１０１６−１０１８頁（１９８９年))、およびホル,Ｗ.Ｇ.Ｊ.（アグニュー・ケミカル・インターナショナル・エディション・イングリッシュ、２５巻、７６７−７７８頁（１９８６年)に）例示されている。
このように推定ＳＤＩ類似体を直接比較評価する代わりに、スクリーニングアッセイを用いて、かかる分子を同定してもよい。このようなアッセイは、好ましくは、ＳＤＩ類似体が細胞増殖または静止に影響を与える能力を活用するものである。別法として、この分子を結合リガンド、例えば、ｐ５３、Ｒb、サイクリンＤ等を含有するカラムにかけることができ、カラムに結合する分子の能力をＳＤＩ分子との比較により評価できる。これとは別に、変異化ＳＤＩ分子（ＤＮＡ合成のＳＤＩ媒介化阻害を阻害する）をアンタゴニストである疑いのある化合物と共に投与できる。この場合、細胞を追跡して、化合物がＤＮＡ合成の阻害を再興できるかどうかを測定する。
このようなアッセイは、ＳＤＩ分子のペプチドまたはオリゴヌクレオチドフラグメント、またはもどき体、またはかかる分子の類似体を同定するのに特に有用である。従って、例えば、オリゴヌクレオチドまたはペプチドＳＤＩ類似体（またはフラグメント）およびアンタゴニストである疑いのある化合物のいずれもが存在する中で、細胞をインキュベートできる。細胞を追跡して、化合物が、ＤＮＡ合成を阻害するＳＤＩオリゴヌクレオチドの能力を減ずることができるかどうかを測定する。上記に示したとおり、カラム競合アッセイを、別法として実施しても良い。こうして、所望のＳＤＩ古典およびもどき類似体を様々な方法によって同定することができる。
重要なことに、ＳＤＩ分子がそれらのＤＮＡ合成の阻害を媒介するメカニズムを高く評価することにより、類似体の単離および認識に対する、代替のまたは相補的な手法が提供される。
上記に示したように、サイクリン依存性キナーゼは、細胞ＤＮＡ合成の過程を統御するのに重要な役割を果たす（ドラエッタ,Ｇ.等、トレンズ・バイオロジカル・サイエンス、１５巻、３７８−３８３頁（１９９０年))。本発明のＳＤＩ分子を用いて、このようなキナーゼの役割、およびかかるサイクリンとの関りを詳しく分析することができ、それによって、ＤＮＡ合成を阻害するために使用できるＳＤＩ類似体を同定できる。例えば、Ｄ型サイクリン類は、ＤＮＡ合成のＧ１期またはＳ期において役割を果たすと考えられている（キィオン,Ｙ.等、セル、７１巻、５０５−５１４頁（１９９２年))。サイクリンＤ／cyl１タンパク質のレベルは、Ｇ１期に増大し、Ｓ期およびＧ２期中に減少し、有糸分裂後最下点に達する（マツシメ,Ｈ.等、セル、６５巻、７０１−７１３９頁（１９９１年）；クリオカワ,Ｈ.等、プロシーディングス・オブ・ナショナル・アカデミー・オブ・サイエンシィズ（Ｕ.Ｓ.Ａ）、８９巻、２４４４−２４４７頁（１９９２年）；キィオン,Ｙ.等、セル、７１巻、５０５−５１４頁（１９９２年))。
キィオン,Ｙ.等（セル、７１巻、５０５−５１４頁（１９９２年))は、サイクリンＤ１およびＣＤＫ２に結合（アソシエート）する２１kdのポリペプチドの存在を報告した。免疫学的沈降法を用い、その際、細胞の放射標識化抽出物を抗サイクリン抗体の存在下でインキュベートした。これらの抗体類に結合するタンパク質を電気泳動にかけ、可視化した。
この２１kdのポリペプチドの配列は、現在、決定されており、ＳＤＩ−１によりコードされることが分かっている。従って、ＳＤＩ−１コード化分子はＤＮＡ合成を阻害するため、本発明は、この２１kdのタンパク質の生物学的役割（例えば、細胞のＧ１期からＳ期への、およびＳ期からＧ２期への移行を統御する）を確認するものである。さらに、ＳＤＩ−１コード化タンパク質は、サイクリンＤ１およびＣＤＫ２と相互作用するため、本発明は、この相互作用を阻害または低減する成分が、ＳＤＩ分子の類似体であることを確認するものである。
２１kdのポリペプチドとサイクリンＤ１およびＣＤＫ２分子の結合を示すためにキィオン,Ｙ.等（セル、７１巻、５０５−５１４頁（１９９２年))により使用された免疫学的沈降法を活用して、他のＳＤＩ分子がそれらの阻害作用を媒介することによるメカニズムまたは経路を測定することができ、それによって、他の類似体の同定が可能になる。
例えば、ＳＤＩ−２またはＳＤＩ−３配列を、またはアンチセンス分子をどちらかについて感染させた細胞を分析して、これらが、予めサイクリン分子に結合することが示されている何等かのタンパク質を発現するかどうかを測定できる。これは、処理した細胞の抽出物を抗サイクリン抗体と共にインキュベートした場合に、特定のタンパク質を免疫沈降するかどうかを測定することにより、最も容易に行える。このような方法は、ＳＤＩ分子が相互作用する分子を同定するので、かかるＳＤＩ分子がそれらの阻害作用を媒介することによる経路を確認するものである。この経路を害する、あるいは作用する分子は、かかるＳＤＩ分子の類似体である。従って、本発明の方法を用いて、細胞周期の幾つかの調節因子の阻害因子を同定できる。実際にＳＤＩ−１タンパク質は、ＣＤＫ４およびＣＤＫ５、並びにＣＤＫ２と相互作用することが分かっている。従って、ＳＤＩ−１タンパク質は、多数のＣＤＫおよびサイクリン分子と相互作用するようである。
それ故に、ＳＤＩ分子が、サイクリンおよびＣＤＫ分子との相互作用を介して細胞増殖の統御を発揮するという認識により、ＳＤＩ類似体の同定に対する代替手法が提供される。同様に、他の細胞調節因子が、ＳＤＩ転写または発現を調節することにより、それらの作用を媒介するという認識により、ＳＤＩ類似体を同定するまた別の代替法が提供される。
例えば、ＳＤＩ−１遺伝子の転写は、“腫瘍抑制”遺伝子により、また最も顕著には、ｐ５３腫瘍抑制遺伝子により調節されることが分かっている。実際に、ｐ５３の“腫瘍抑制”能力は、ＳＤＩ−１発現を誘導し、それによって、腫瘍細胞において細胞静止を誘導する能力から生じるものである。
ｐ５３遺伝子は、腫瘍抑制タンパク質をコードすることが予め分かっている（サガー,Ｒ.、サイエンス、２４６巻、１４０６−１４１２頁（１９８９年)；ファインレイ,Ｃ.、セル、５７巻、１０８３頁（１９８９年)；ワインベルグ,Ｒ.Ａ.、サイエンティフィック・アメリカン、１９８８年９月、４４−５１頁；レーン,Ｄ.等、ジーンズ・デベロップメント、４巻、１−８頁（１９９０年))。ｐ５３遺伝子は、フレンド赤白血病ウイルスの形質転換作用に対して保護的な役割を果たすこと（ムンロー,Ｄ.等、オンコジーン、２巻、６２１頁（１９８８年))、および染色体安定性、分化および静止、および細胞増殖に影響を及ぼすこと（サガー,Ｒ.、サイエンス、２４６巻、１４０６−１４１２頁（１９８９年))も分かっている。野生型ｐ５３が電離性放射線後の細胞周期停止に必要であり、野生型ｐ５３の構成性発現が、哺乳類細胞をＧ１期に停どめることが分かっている。細胞周期停止を誘導する能力は、ｐ５３の腫瘍抑制機能に関連すると考えられている。ｐ５３遺伝子によりコードされるタンパク質は、ＳＶ４０ラージＴ抗原およびアデノウイルスＥ１Ｂ５５kdタンパク質の双方と安定な複合体を形成する核タンパク質である。
あらゆる腫瘍細胞の約５０％が、ｐ５３発現を減少させるか、または抹消する変異を示す。ｐ５３遺伝子は、結腸直腸癌において、ある役割を有するものとして関わりを持つものである（ベーカー,Ｓ.Ｊ.等、サイエンス、２４４巻、２１７−２２１頁（１９８９年))。研究は、ｐ５３遺伝子座を包含する対立遺伝子欠失が、７５％以上の結腸直腸癌で起こることを示している（ベーカー,Ｓ.Ｊ.等、サイエンス、２４４巻、２１７−２２１頁（１９８９年))。この領域の欠失は、（良性）腺癌段階から（悪性）癌段階への移行をマークすることが分かった（ホーゲルシュタイン,Ｂ.等、ニュー・イングリッシュ・ジャーナル・オブ・メディシン、３１９巻、５２５頁（１９８８年))。
染色体１７における同様の欠失が、胸および肺癌を含む広範囲の癌において同定されている（マッケイ,Ｊ.等、ランセットii、１３８４頁（１９８８年）；ジェームス,Ｃ.Ｄ.等、キャンサー・リサーチ、４８巻、５５４６頁（１９８８年）；ヤコタ,Ｊ.等、プロシーディングス・オブ・ナショナル・アカデミー・オブ・サイエンシィズ（Ｕ.Ｓ.Ａ.)、８４巻、９２５２頁（１９８７年）；トグチダ等、キャンサー・リサーチ、４８巻、３９３９頁(１９８８年))。様々なヒト腫瘍(脳、大腸、胸、肺）が、２つの正常なｐ５３対立遺伝子の内の１つを失い、残りのｐ５３対立遺伝子が点変異を被っている細胞によって特徴付けられている（ニグロ等、ネイチャー、３４２巻、７０５−７０８頁（１９８９年))。フィーロン等（セル、６１巻、７５９−７６７頁（１９９０年)）は、ｐ５３対立遺伝子における点変異および欠失の双方は、十分に発癌性の表現型に対して欠かせないものであり得ると仮定している。これらの知見は、ｐ５３遺伝子が多くの型の癌においてある役割を持ち得ることを示唆している。
最近では、ｐ５３遺伝子における変異がリィ−フロウメニ症候群、即ち、珍しいヒトの遺伝子異常の原因であり得ることが示唆されている（マルキン,Ｄ.等、サイエンス、２５０巻、１２３３−１２３８頁（１９９０年）；マークス,Ｊ.、サイエンス、２５０巻、１２０９頁（１９９０年）、両方とも本明細書に参照して組み込んである）。この疾患にかかっている個体は、数種の悪性腫瘍−胸癌、柔組織肉腫、脳腫瘍、骨肉腫、白血病、および副腎皮質癌を非常に生じ易い。この疾患は、黒色腫、生殖腺胚細胞腫瘍、および、肺、すい臓、および前立腺の癌の高い発病率にも関連する（リィ,Ｆ.Ｐ.等、アナリティカル・インターナル・メディシィン、７１巻、７４７頁（１９６９年）；バーチ,Ｊ.Ｍ.等、ジャーナル・オブ・クリニカル・オンコロジー、８巻、５８３頁（１９９０年）；バーチ,Ｊ.Ｍ.等、ブリティッシュ・ジャーナル・オブ・キャンサー、４９巻、３２５頁（１９８４年）；リィ,Ｆ.Ｐ.等、キャンサー・リサーチ、４８巻、５３５８頁（１９８８年）；ウィリアムス,Ｗ.Ｒ.等、ファミリアル・キャンサー、ファースト・インターナショナル・リサーチ・カンファレンス、１５１頁（カルガー、バーゼル、１９８５年）；ストロング,Ｌ.Ｃ.等、ジャーナル・オブ・ナショナル・キャンサー・インスティテュート、７９巻、１２１３頁（１９８７年)）。
広範囲にわたる先行技術によるｐ５３遺伝子の生物学的役割の特徴付けにもかかわらず、その遺伝子産物がその腫瘍抑制活性を媒介することによるメカニズムは、依然解明されていない。本発明の一実施態様は、このメカニズムがＳＤＩ−１に関係するという発見に関連するものである。正常ｐ５３タンパク質は、ＳＤＩ−１の発現を増大し、かかる増大した発現が細胞増殖を抑制する。ｐ５３機能を欠く腫瘍細胞では、ＳＤＩ−１レベルは非常に低く、そのため、細胞増殖を起こすことが出来るのである。
ＳＤＩ−１の過剰発現による細胞増殖阻害の生理学的重要性は、ＳＤＩ−１がサイクリン／cdk２複合体のキナーゼ活性を阻害できることを見い出したことにより増強される。ＧＳＴ−ＳＤＩ−１融合タンパク質を、cdk２抗血清によりヒーラ細胞抽出物から免疫沈降させたサイクリン／cdk２複合体に加えた結果、ヒストンＨ１キナーゼ活性の最大阻害の半分を阻害した。
従って、ｐ５３の腫瘍抑制活性を阻害する分子は、ＳＤＩ−１のアンタゴニストであり；同様に、ｐ５３の腫瘍抑制活性を高める分子は、ＳＤＩ−１のプロタゴニストであって、これもまた本発明に包含されるものである。
正常ヒト細胞において、ＳＤＩ−１は、サイクリン、ＣＤＫ、および増殖細胞核抗原、即ち、“ＰＣＮＡ”(ワガ,Ｓ.等、ネイチャー、３６９巻、５７４−５７８頁（１９９４年）、本明細書に参照して組み込んである）との複合体として存在することが分かった。ＰＣＮＡは、細胞が損傷を受けたＤＮＡを修復する除去修復経路に関連する。ＳＤＩ−１は、ＰＣＮＡがＤＮＡポリメラーゼγを活性化する能力を遮断（ブロック）するように働く。そのため、細胞ＤＮＡがＳ期の前に損傷を受けた場合、ｐ５３を導入して、ＳＤＩ−１遺伝子の転写活性化を導く。発現したＳＤＩ−１タンパク質は、ＣＤＫ／サイクリン媒介化ＤＮＡ複製物と複合体を形成し、そうして、ＰＣＮＡに損傷の除去修復を媒介させる。細胞ＤＮＡがＳ期中に損傷を受けた場合、除去修復は、損傷を増大する可能性を導くであろう。従って、損傷がＳ期に生じるときは、発現したＳＤＩ−１タンパク質はＰＣＮＡと複合体形成して、複製過程を停止させる。下記（実施例２２）に示した通り、２３kDのタンパク質は、ＳＤＩ−１タンパク質の不活性なリン酸化誘導体の特性を示すことを同定している。この誘導体は、ＰＣＮＡのＳＤＩ−１阻害が完全なＤＮＡ修復過程の後に休止されることによるメカニズムに関係し得る。
このようなＳＤＩ−１とＰＣＮＡとの相互関係の知識を用いて、ＳＤＩ−１のアンタゴニストまたはもどき体を同定することができる。従って、例えば、ＳＤＩ−１がＳ期にある細胞中でＰＣＮＡと複合体を形成する能力を阻害する分子は、ＳＤＩ−１作用のアンタゴニストおよび阻害因子を含む。逆に言えば、Ｓ期にある細胞中でＳＤＩ−１がＰＣＮＡと複合体を形成する能力を高める分子は、ＳＤＩ−１もどき体を含む。
Ｄ．ＳＤＩ分子のアンタゴニスト
本発明は、従って、ＳＤＩ分子のアンタゴニストにも関する。このようなアンタゴニストは、ＳＤＩ機能と競合するまたは阻害するＳＤＩ類似体を含み得る。あるいは、このようなアンタゴニストは、ＳＤＩ分子と相互作用する細胞サイクリンまたはｐ５３のような分子の類似体を含み得る。
任意の変法が、ＳＤＩ機能を阻害または抑制するポリペプチドまたは非タンパク質性分子の同定に使用できる。このような分子は、それらが正常ＳＤＩ分子と競合するか否か、または細胞中のその存在がＳＤＩ分子の静止状態の誘発能力に影響するか否か測定するために評価できる。例えば、ｐ５３分子と競合的に結合する核酸分子は、ＳＤＩ分子のアンタゴニストである。このような競合因子は、親和性カラム、またはＤＮＡse−フットプリンティング法により容易に同定できる。
ＳＤＩ配列と相互作用し、活性化できるｐ５３の類似体または他の腫瘍抑制タンパク質は、アンタゴニストの別のクラスである。ｐ５３(および他の腫瘍抑制因子)の阻害因子が、同様にＳＤＩ分子のアンタゴニストである。このような分子は、例えば、ｐ５３をコードするｃＤＮＡの変異、およびＳＤＩ−１遺伝子配列またはＳＤＩ−１タンパク質に結合する能力を残しているが、他は不活性であるｐ５３変異体の同定により得られ得る。ｐ５３遺伝子のｃＤＮＡの配列およびゲノム形は記載されている(全て参考として本明細書に包含する、ペニカ,Ｄ.ら、ヴィロロジー、 134:477-482(1984)；ジェンキンス,Ｊ.ら、ネーチャー、312:651-654(1984)；オーレン,Ｍ.ら、EMBOジャーナル、2:1633-1639(1983)；ザフト−ホウリ,Ｒ.ら、ネーチャー、306:594-597(1983))。
あるいは、候補となる阻害因子を、受容細胞に提供でき、正常ｐ５３機能を障害するその能力を確認できる。例えば、このような分子の、ｐ５３がＳＶ４０ラージＴ抗原と複合体を形成するのを阻害する能力を試験できる(デカプリオ,Ｊ.Ａ.ら、セル、54:275-283(1988)；クローフォールド,Ｌ.Ｖ.、インターナショナル・レビュー・オブエクスペリメンタル・パソロジー、25:1-50(1983)参照)。
同様に、多くの手段が、ＤＮＡ合成のＳＤＩ−媒介化阻害を阻害または抑制する核酸分子の同定のために開発できる。例えば、ＳＤＩ核酸配列を変異させることができ、この変異配列は、ＤＮＡ合成の阻害を示さず、従って所望の変異ＳＤＩ配列を受容している細胞の同定のために細胞に提供される。更に別の方法において、不死化細胞系のＳＤＩ遺伝子配列は、それらが細胞静止媒介能力を欠失している変異ＳＤＩ遺伝子を含むか否かを測定するために評価できる。このような方法において、ある不死化細胞(約１０％)はＳＤＩ−１遺伝子の変異体を持ち、ＳＤＩ−１のアミノ酸残基３１のアルギニンの置換をもたらす(この位置に通常見られるセリン残基の変わり)。このような発見もまたＳＤＩ−１の残基３１をＳＤＩ−１の活性部位または構造に関連するものとして包意するものである。１２名の正常白人ドナー由来のＤＮＡはこのＳＤＩ−１置換体を有しないため、Ａrg３１ＳＤＩ−１変異体が、変異よりむしろ多形現象を反映することはありそうにない。
他の変異ＳＤＩタンパク質は、種々の細胞系のＳＤＩタンパク質のスクリーニングにより同定されている。従って、例えば、アミノ酸残基５４に通常見られるバリンは、アラニンで置換されているか、またはアミノ酸残基８０に通常見られるスレオニンが、メチオニンで置換されているようなＳＤＩ−１変異体が同定されている。
あるいは、このような核酸分子から発現される変異ＳＤＩ配列は、ｐ５３タンパク質、またはrb等のような他の腫瘍抑制遺伝子の遺伝子生産物に結合する能力を評価できる。
更に別の態様において、“三重”核酸分子を使用して、所望の治療を提供し得る。“三重”分子とは、その転写を阻害するのに充分な方法で、２本鎖ＤＮＡに結合できる核酸分子である。このようなオリグヌクレオチドは、この目的に充分な任意の長さであることができる。好ましくは、オリグヌクレオチドは約１０−３０ヌクレオチド長、更に好ましくは約１５−２４ヌクレオチド長である。三重オリゴヌクレオチドは、ホーギャン、米国特許第５,１７６,９９６号およびバルマら、米国特許第５,１７５,２６６号に記載されている。
三重オリゴヌクレオチドは、好ましくは２０ヌクレオチド長またはそれ以上であり、約２／３がプリンであるか、または約２／３がピリミジンである、いずれかのヌクレオチド配列を有するＳＤＩ−１遺伝子の領域に結合するように設計されている。三重オリゴヌクレオチドの配列の設計において、オリゴヌクレオチドは標的領域の相補位置がＧＣ塩基対である場合、Ｇ残基、標的領域の相補位置がＡＴ塩基対である場合、Ｔ残基を有するように構築される。
ＳＤＩ−１遺伝子配列は、遺伝子構築物が介在非翻訳配列(“イントロン”)を含む場合、ｃＤＮＡのものと異なる。一つの態様において、ゲノムＳＤＩ−１配列を得、上記のプリン対ピリミジンの好適な割合に適合する領域の存在を評価する。このようなゲノム配列は、配列番号１から選択された配列を有するオリゴヌクレオチドプローブ(例えば、２０−５０残基長)によるゲノムライブラリーのスクリーニングにより得ることができる。ゲノムライブラリーのスクリーニング法は当分野で既知である。
あるいは、ＳＤＩ−１ｃＤＮＡ配列は、好適な三重分子の産生に使用できる。介在配列(“イントロン”)および翻訳配列(“エクソン”)を有する数百の遺伝子の分析により、イントロン−エクソン境界が、同定された上流および下流コンセンサス配列を有することが明らかとなった(本明細書に参考として包含する、マウント,Ｓ.Ｍ.、ヌクレイック・アシッズ・リサーチ、10:459-472(1982))。ｍＲＮＡ前駆体分子からのイントロンの切断により、これらのコンセンサス配列のほとんどを除去し、ｍＲＮＡを融合してｍＲＮＡにおける“ＣＡＧＧ”または“ＡＡＧＧ”エクソン−エクソン境界を製造する。このようにＳＤＩ−１分子の好適な標的領域は、好ましくは(１)少なくとも２０ヌクレオチド長；(２)ＣＡＧＧまたはＡＡＧＧ配列を欠く；および(３)約２／３がプリンまたは約２／３がピリミジンである。このような好適なオリゴヌクレオチドは、配列番号１の単なる検査により同定できる(例えば、配列番号１のヌクレオチド位置を参照にして、配列番号１１−２０、配列番号１２１−４０、配列番号１５１−７０、配列番号１８１−１００、配列番号１１２８−１４７、配列番号１１３１−１５０、配列番号１１５１−１７０、配列番号１２４１−２６０、配列番号１２８８−３０７、配列番号１３０４−３２３、配列番号１３２９−３４８、配列番号１３３４−３５３、配列番号１３６１−３８０、配列番号１３９０−４０９、配列番号１４２１−４４０、配列番号１４９７−５１６、配列番号１５２５−５４４、配列番号１５４１−５６０等、配列番号１の最初の６００ヌクレオチド以内にいくつかの好適な標的部位を含む)。
更に別の態様において、ＳＤＩ分子の配列は、ＳＤＩ遺伝子配列の転写または配列を抑制できる“アンチセンスオリゴヌクレオチド”を明らかにするために使用できる。一般に、“アンチセンスオリゴヌクレオチド”は、その配列が、標的ｍＲＮＡ分子(またはその対応する遺伝子)の配列と相補的な核酸(ＤＮＡまたはＲＮＡのいずれか)であり、ｍＲＮＡ分子(または遺伝子)と結合またはハイブリダイズし、それによりｍＲＮＡ分子の遺伝子産物への翻訳を損なう(即ち、減じるかまたは妨げる)能力をもつものである。アンチセンスオリゴヌクレオチドとして働くために、核酸分子は、標的ｍＲＮＡの翻訳を媒介する標的ｍＲＮＡ分子(または遺伝子)のその部分に結合またはハイブリダイズできなければならない。従って、本発明のアンチセンス分子は、ＳＤＩ核酸分子に結合し、その活性を阻害できる。アンチセンスオリゴヌクレオチドは、全て本明細書に参考として包含する、欧州特許出願公開第２６３,７４０号；第３３５,４５１号；および第３２９,８８２号およびＰＣＴ公開第ＷＯ90/00624に記載されている。
本発明は、特に、ＳＤＩ遺伝子産物をコード化するｍＲＮＡまたはｃＤＮＡ分子と結合またはハイブリダイズできるアンチセンスオリゴヌクレオチド、特にＳＤＩ−１、ＳＤＩ−２またはＳＤＩ−３遺伝子のフラグメントに関する。従って、本発明の一つの態様において、ＳＤＩｍＲＮＡ転写物の翻訳を特異的に遮断するために設計されたアンチセンスオリゴヌクレオチドは、受容静止細胞におけるＤＮＡ合成の阻害の抑制解除に使用できる。
抗ＳＤＩアンチセンスオリゴヌクレオチドが、これらの目的を達成し得る一つの方法は、ＳＤＩｍＲＮＡの翻訳開始領域に相補的で、ＳＤＩ遺伝子のｍＲＮＡ転写物とハイブリダイズ可能な充分な長さの配列を有することによる。このようなオリゴマーの大きさは、この目的に有効な任意の長さで良い。好ましくは、アンチセンスオリゴヌクレオチドは、約１０−３０ヌクレオチド長、より好ましくは約１５−２４ヌクレオチド長である。
あるいは、生理的、インビボ条件下でＳＤＩｍＲＮＡと安定にハイブリダイズさせるには短すぎる長さのアンチセンスオリゴヌクレオチドを使用し得る。このようなオリゴヌクレオチドは、約６−１０またはそれ以上長さであり得る。本発明に従って使用するために、このようなオリゴヌクレオチドは、好ましくは、ＳＤＩをコードするｍＲＮＡの翻訳領域座に結合できるように修飾する。このような修飾分子の例は、一本鎖ＳＤＩｍＲＮＡ分子に結合可能な、抗体(または抗体フラグメント)または他のリガンド(例えば、トリメチルソラリン、８−メトキシプロラリン等の二価架橋剤)に結合したオリゴヌクレオチドを含む。
更に別の態様において、ＳＤＩ−１アンチセンス分子は、ＳＤＩ−１ｍＲＮＡの不安定セグメントとハイブリダイズし、安定化するように設計し得る。このような分子は、細胞中のＳＤＩ−１の転写および翻訳を促進し、ＤＮＡ複製阻害の能力の増加を導く。このような分子は、癌または過増殖により特徴付けられる他の疾病の処置に使用し得る。
二価架橋剤(例えば、トリメチルソラリンまたは８−メトキシソラリンのようなソラリン)付加物の一つの反応基に結合した抗ＳＤＩアンチセンスオリゴヌクレオチドは、３５０−４２０nmＵＶ光による活性化により、ＳＤＩｍＲＮＡと架橋できる。従って、このような光の強度を(ＵＶランプのワット数の変化、細胞とランプの間の距離の増加等により)制御することにより、アンチセンスオリゴヌクレトチドと細胞のｍＲＮＡの結合の程度を制御し得る。従って、順次、受容細胞におけるＳＤＩ遺伝子発現の減衰の程度を制御できる。
一般に、アンチセンスオリゴマーは、ＳＤＩ遺伝子のヌクレオチド配列に従って製造し、最も好ましくは図５Ａ−５Ｄに提供されているＳＤＩ−１の配列に従う。アンチセンスオリゴヌクレオチドの配列は、１またはそれ以上の、１個またはそれ以上のヌクレオチドの挿入、置換または欠失を含み得るが、ただし、得られるオリゴヌクレオチドは上記ＳＤＩｍＲＮＡ、ｃＤＮＡまたはＳＤＩ遺伝子それ自身のいずれかの翻訳部位と結合またはハイブリダイズ可能である。
本発明のアンチセンスまたは三重オリゴヌクレオチドの合成のために当分野で既知の任意の手段を使用し得る(全て本明細書に参考として包含するザメッチクら、プロシーディングス・オブ・ザ・ナショナル・アカデミー・オブ・サイエンシーズ(USA)83:4143(1986)；グッドチャイルドら、プロシーディングス・オブ・ザ・ナショナル・アカデミー・オブ・サイエンシーズ(USA)85:5507(1988);ウィックストロームら、プロシーディングス・オブ・ザ・ナショナル・アカデミー・オブ・サイエンシーズ(USA)85:1028；ホルト,Ｊ.Ｔ.ら、モレキュラー・アンド・セルラー・バイオロジー、8:963(1988)；ゲルウィッツ,Ａ.Ｍ.ら、サイエンス、242:1303(1988)；アンフォッシ,Ｇ.ら、プロシーディングス・オブ・ザ・ナショナル・アカデミー・オブ・サイエンシーズ(USA)86:3379(1989)；ベッカー,Ｄ.ら、EMBOジャーナル、8:3679(1989))。自動核酸合成装置をこの目的に使用し得る。加えて、所望の任意の配列のヌクレオチドは、このような慣用分子の任意の商業的供給者から得ることができる。
最も好ましくは、本発明のアンチセンスまたは三重オリゴヌクレオチドは、固相“ホスホルアミダイト合成”を使用して製造し得る。合成は、オリゴヌクレオチドの３'−ヒドロキシル末端になるヌクレオチドで誘導化された固体支持体に結合した伸長ヌクレオチド鎖を用いて行う。方法は、５'−ヒドロキシル基がブロック(好ましくは、５'−ＤＭＴ(ジメトキシトリチル)基で)され、そのアミノ基がベンゾイル基(シトシンおよびアデノシンのアミノ基のための)またはイソブチル基(グアノシンの保護のため)のいずれかでブロックされたモノマー単位を使用して、ＤＮＡの循環合成を含む。このような誘導体の合成法は、当分野で既知である。
更に別の態様において、リボザイムを、ＳＤＩ媒介化阻害の阻害因子として使用できる。リボザイム(ＲＮＡ酵素)は、それがハイブリダイズするＲＮＡ標的分子を開裂できる、触媒ＲＮＡ配列(タンパク質を含まない)である(チェッチ,Ｔ.ら、セル、27:487(1981)；チェッチ,Ｔ.、サイエンス、236:1532-1539(1987)；チェッチ,Ｔ.、アニュアル・レビュー・オブ・バイオケミストリー、55:599-630(1986)；ジェームス,Ｗ.、アンチバイラル・ケミストリー・アンド・ケモセラピー、2:191-214(1991))。しばしば、基質はリボザイムそれ自身の一部である。
人工リボザイムは、標的に相補的なフランキング配列により標的ＲＮＡを特異的に開裂するように設計できる(ハースロフ,Ｊ.ら、ネーチャー、334:585-591(1988)；カメロン,Ｆ.ら、プロシーディングス・オブ・ザ・ナショナル・アカデミー・オブ・サイエンシーズ(USA) 86:9139-9143(1989)；ジェームス,Ｗ.、アンチバイラル・ケミストリー・アンド・ケモセラピー、2:191-214(1991))。標的ＲＮＡ内で開裂するために最低限必要なのは、開裂部位の前に好適な３塩基対配列ＧＵＣ、ＧＵＡまたはＧＵＵが位置することである。“ハンマーヘッド”第２構造を特徴とする人工リボザイムは、ハースロフ,Ｊ.ら(ネーチャー、334:585-591(1988；ジェフリーズ,Ａ.ら、ヌクレイック・アシッズ・リサーチ、17:1371-1377(1989)；ゲラッチら、ＷＯ特許出願WO89/05852(1989)；グッドチャイルド,Ｊ.ら、アーカイブス・オブ・バイオケミストリー・アンド・バイオフィジクス、284:386-391(1991)；ジェームス,Ｗ.、アンチバイラル・ケミストリー・アンド・ケモセラピー、2:191-214(1991))により記載されている。
Ｅ．ＳＤＩ分子のプロタゴニスト
本発明は、従って、ＳＤＩ分子のプロタゴニストにも関する。本明細書で使用する限り、ＳＤＩの“プロタゴニスト”はＳＤＩ分子の生理活性を促進または増加させる分子である。
ｐ５３がＳＤＩ発現の誘発因子であるため、それまたはｐ５３をコードする核酸、またはいずれかの生理活性フラグメントは、ＳＤＩ発現増加を得るために、ＳＤＩ分子と結合して細胞内に提供され得る。
本発明は、天然産生腫瘍抑制タンパク質以外のＳＤＩプロタゴニストをまた提供する。このようなプロタゴニストは、ＳＤＩ類似体を含み得るか、またはＳＤＩ分子と相互作用する細胞性分子と相互作用する非類似体分子を含み得る。従って、促進されたＳＤＩ活性化能力を有するｐ５３タンパク質の変異形は、ＳＤＩプロタゴニストの一例を含む。このような分子は、ｐ５３遺伝子の変異、次いで正常ｐ５３タンパク質より早いまたは強いＳＤＩ−１活性の誘発に有効な変異体の選択により製造し得る。
同様に、ＳＤＩプロタゴニストを、例えば、候補分子を、ＳＤＩ分子と共に、受容細胞に提供し、候補分子のＳＤＩ発現促進の能力を追跡する。上記の、合理的もどき体設計方法は、ＳＤＩプロタゴニストを同定するのに使用できる。
Ｆ．ＳＤＩ分子に対する抗体
本発明の具体例の一つは、ＳＤＩタンパク質およびタンパク質フラグメントに対する抗体およびこのような抗体の診断的および治療的使用に関する。
上記ＳＤＩタンパク質およびタンパク質フラグメントは、抗体、一本鎖結合分子、またはＳＤＩエピトープに結合できる他のタンパク質の産生の誘発に使用し得る。このような抗体は、ポリクローナルまたはモノクローナルであり得、無傷免疫グロブリンまたは免疫グロブリンの抗原結合部位(Ｆ(ab')、Ｆ(ab')２のような)フラグメント、または例えば、組換え手段により製造可能な一本鎖免疫グロブリンを含み得る。
マウスモノクローナル抗体が特に好ましい。ＢＡＬＢ／ｃマウスは、この目的に好ましいが、同等の種もまた使用し得る。動物を、好ましくは、好適なアジュバント(TiterMaxアジュバント(Vaxel、Norcross、GA)のような)に乳濁されている親和性精製化ＳＤＩタンパク質(またはそのフラグメント)約２５μgで免疫化する。免疫化は、好ましくは、２筋肉内部位、１腹腔内および尾根の２皮下部位で行う。抗原約２５μgの更なるi.v.注射を、好ましくは正常生理食塩水中で、３週間後にする。２回目の注射の約１１日後、マウスを採血し、血液を抗ＳＤＩ抗体の存在についてスクリーニングする。好ましくは、直接結合ELISAをこの目的のために使用する。
最も好ましくは、最も高い抗体価を有するマウスに、３回目のＳＤＩタンパク質またはフラグメント約，２５μgのi.v.注射をする。この動物由来の脾白血球を３日後に回収し、最も好ましくはポリエチレングリコールを使用して、好適なミエローマ細胞系(例えば、P3X63Ag8.653ミエローマ細胞系)と融合させる。ハイブリドーマ細胞を、“ＨＡＴ”(ヒポキサンチン−アミノプテリン−チミン)選択下で、約１週間培養することにより選択する。得られるクローンを、次いで、ＳＤＩタンパク質に対するモノクローナル抗体を産生する能力について、好ましくは直接ELISAによりスクリーニングし得る。
ある実施態様においては、抗ＳＤＩ−１モノクローナル抗体は、上記ＳＤＩ−１融合体を免疫源として使用して単離し、スクリーニングを促進し得る。従って、例えば、マウスの一群を、フロイント完全アジュバントに乳濁化したＧＳＴ−ＳＤＩ−１融合タンパク質(免疫化当たり約５０μgの抗原)を使用して免疫化し得る。３週間間隔で、同量の抗原をフロイント不完全アジュバントに乳濁化し、動物の免疫化に使用する。３回目の免疫化の１０日後、血清サンプルを取り、抗体の存在を評価する。抗体力価が低ければ、４回目の追加免疫を用いることができる。ＳＤＩ−１に１：５０００希釈で結合できるポリ血清(polysera)を、この方法を使用して得ることができる。
モノクローナル抗体を得るための好ましい方法において、上記免疫化マウスの脾臓を回収し、分解し、免疫脾細胞をフィコール勾配で単離する。単離脾細胞を、ポリエチレングリコールを使用してＢalb/c由来ＨＧＰＲＴ(ヒポキサンチングアニンホスホリボシルトランスフェラーゼ)欠損P3x63xAg8.653形質細胞腫細胞と融合する。融合細胞を、９６ウェルマイクロタイタープレートに入れ、ハイブリドーマ融合細胞について、ヒポキサンチン、アミノプテリンおよびチミジンを補給した培養培地中での約２−３週間の成育能力によりスクリーニングする。平均で、融合の対象となった全ての脾細胞で１０６脾細胞が有用なハイブリドーマを産生する。典型的な脾臓は、５−１０×１０７脾細胞を産生する。
このようなインキュベーションから発生するハイブリドーマ細胞は、好ましくは、ＳＤＩ−１に結合する免疫グロブリンを産生する能力についてスクリーニングする。間接ELISAがこの目的に使用し得る。簡単に、ハイブリドーマの上清を固定化ＧＳＴ−ＳＤＩ−１含有マイクロタイターウェル中でインキュベーションする。洗浄後、結合免疫グロブリンの力価を、西洋ワサビペルオキシダーゼ結合ヤギ抗マウス抗体を使用して測定する。更なる洗浄後、固定化酵素の量を測定する(例えば、色素源基質の使用により)。このようなスクリーニングは、所望のクローンが、非分泌隣接体により過成育しないことを確実にするために、ハイブリドーマ同定後、できるだけ速く行う。望ましくは、融合プレートは、ハイブリドーマ成育速度が変化するため、数回スクリーニングする。好ましい二次的実施態様において、ＳＤＩ−１の異なった抗原形を、ハイブリドーマのスクリーニングに使用し得る。従って、例えば、脾細胞をＧＳＴ−ＳＤＩ−１融合体で免疫化するが、得られるハイブリドーマは、配列番号４のリーダー配列を有するような［Ｈis］６（配列番号３７）融合体を使用してスクリーニングできる。
下記のように、このような抗体分子またはそれらのフラグメントは、診断または治療目的で使用し得る。抗体が診断目的を意図する場合、例えば、リガンド(例えばビオチン)または検出可能マーカー(例えば蛍光基、放射性同位体または酵素)で誘導体化することが望ましい。
抗体またはそのフラグメントが治療目的を意図する場合、免疫反応を減ずるために、“ヒト化”するのが望ましい。ヒト化抗体は、例えば、抗体の免疫源部分を、対応するが非免疫源性である部分と置き換えることにより産生し得る(即ち、キメラ抗体)(全て、本明細書に引用して包含する、ロビンソン,Ｒ.Ｒ.ら、ＰＣＴ特許公開ＰＣＴ／ＵＳ８６／０２２６９；アキラ,Ｋ.ら、欧州特許出願第１８４,１８７号；タニグチ,Ｍ.、欧州特許出願第１７１,４９６号；モリソン.Ｓ.Ｌら、欧州特許出願第１７３,４９４号；ニューベルガー,Ｍ.Ｓ.ら、ＰＣＴ出願WO86/01533；カビリー,Ｓ.ら、欧州特許出願第１２５,０２３号；ベター,Ｍ.ら、サイエンス、240:1041-1043(1988)；リュ,Ａ.Ｙ.ら、プロシーディングス・オブ・ザ・ナショナル・アカデミー・オブ・サイエンシーズ(USA) 84:3439-3443(1987)；リュ,Ａ.Ｙ.ら、ジャーナル・オブ・イムノロジー、139:3521-3526(1987)；サン,Ｌ.Ｋ.ら、プロシーディングス・オブ・ザ・ナショナル・アカデミー・オブ・サイエンシーズ(USA) 84:214-218(1987)；ニシムラ,Ｙ.ら、キャンサー・リサーチ、47:999-1005(1987)；ウッド,Ｃ.Ｒ.ら、ネーチャー、314:446-449(1985)；ショウら、ジャーナル・オブ・ナショナル・キャンサー・インスティテュート、80:1553-1559(1988))。“ヒト化”キメラ抗体の一般的なレビューは、参考として本明細書に包含する、モリソン,Ｓ.Ｌ.(サイエンス、229:1202-1207(1985))およびオイ,Ｖ.Ｔ.ら、バイオテクニクス、4:214(1986)に提供されている。
ある治療実施態様においては、抗体が、ＳＤＩエピトープ(そのような第１Ｆab領域を経由して)および“非ＳＤＩエピトープ”(即ちＳＤＩタンパク質以外のタンパク質のエピトープ)(第２Ｆabを経由して)に結合可能であるように、２つの異なったＦab領域を有するキメラ二価抗体を使用する。ある実施態様においては、このような“非ＳＤＩエピトープ”は、キメラ分子が、ホルモン受容体、免疫応答受容体等のような細胞性受容体に結合できるように選択する。特に好ましくは、非ＳＤＩ受容体は、白血病(セオンら、プロシーディングス・オブ・ザ・ナショナル・アカデミー・オブ・サイエンシーズ(USA) 80:845(1983)；アオタら、キャンサー・リサーチ、43:1093(1983)；ロイストンら、トランスプランテーション・プロシーディングス、13:761(1981))；大腸癌(コプロウスキーら、米国特許第４,３４９,５２８号；サカモトら、欧州特許公開第１１９５５６号；ヘーリンら、プロシーディングス・オブ・ザ・ナショナル・アカデミー・オブ・サイエンシーズ(USA) 76(3):1438(1979)；マグナニら、サイエンス、212:55(1981))；肺癌(チュティッタら、プロシーディングス・オブ・ザ・ナショナル・アカデミー・オブ・サイエンシーズ(USA) 78:4951(1981))；乳癌(コルヒャーら、プロシーディングス・オブ・ザ・ナショナル・アカデミー・オブ・サイエンシーズ、78:3199(1981)；スッコロムら、プロシーディングス・オブ・ザ・ナショナル・アカデミー・オブ・サイエンシーズ(USA) 77:6841(1980))および他の癌(ヘーベルマン編集、ベーシック・クリニカル・テューモア・イムノロジー、1:159-214、ニジョフ、ボストン(1983)中のリロイド、“ヒューマン・テューモア・アンチゲンズ；ディテクション・アンド・キャラクタリゼーション・ウィズ・モノクローナル・アンティボディーズ”参照)に関する抗原のような異常増殖の指標である細胞性抗原を含む。
Ｇ．ＳＤＩ分子の細胞性受容体
本発明の態様の一つは、ＳＤＩの標的細胞へのデリバリーを促進するＳＤＩ分子の細胞性受容体、特にＳＤＩ−１の細胞性受容体に関する。
ある実施態様においては、このようなデリバリーはＳＤＩ分子を、リンホカイン、ホルモン、プロホルモンまたは細胞性受容体または受容体に結合できる細胞表面リガンドを有する他の分子との融合体として発現することにより達成できる。最も好ましくは、これは、ＳＤＩ分子(例えば、ＳＤＩ−１ｃＤＮＡ)をコードするポリヌクレオチドを、受容体または細胞表面リガンドを認識し結合するタンパク質とライゲートし、次いで所望の融合タンパク質を組換え手段により発現させることにより達成される。必要な融合タンパク質は、受容体結合分子の完全配列を含まないが、所望の結合を可能にするのに充分なタンパク質の量のみを含み得るものである。
ある二次的実施態様においては、受容体結合分子は、関連受容体が、全てまたはほとんどの細胞に存在するように選択する。このような分子の例は、その各々の受容体に結合するほとんどのペプチドホルモン(例えば、成長ホルモン、インシュリン等)、トランスフェリン受容体に結合するトランスフェリン、低密度リポタンパク質(ＬＤＬ)受容体に結合するＡpo−Ｂタンパク質等である。あるいは、ＳＤＩ融合タンパク質は、分子がある組織型またはサブタイプによってのみ吸着されるように選択し得る。このような特性は、ある細胞集団(例えば、肝臓細胞、白血球、内皮細胞等)上にのみ存在する受容体またはリガンドに結合する分子の使用により得られ得る。このような分子の例は、グルカゴン、ガストリンのようなタンパク質、ある下垂体ホルモン(ＴＳＨ、ＦＳＨ等)、エリスロポイエチン、インターロイキン、顆粒球−マクロファージコロニー刺激因子、向神経性タンパク質等を含む。更に、ＣＤ４、ＩＣＡＭ−１、セレクチン、ＥＬＡＭＳ、ＬＦＡ−１等の細胞表面タンパク質に結合可能なタンパク質もまた使用し得る。
例えば、ＩＣＡＭ−１(シモンズ,Ｄ.ら、ネーチャー、331:624-627(1988)；スタントン,Ｄ.Ｅ.ら、セル、52:925-933(1988)；スタントン,Ｄ.Ｅ.ら、セル、61:243-254(1990))はＣＤ１８／ＣＤ１１ヘテロダイマー(ＬＦＡ−１等のような)を発現する白血球の内皮細胞表面リガンドであるため、ＩＣＡＭ−１−ＳＤＩ融合分子は、リンパ球のような造血細胞を標的とする。同様に、ＣＤ４−ＳＤＩ−１融合体は、ＣＤ４＋Ｔ細胞を標的とし、ＳＤＩをこのようなＴ細胞にデリバリーするのに使用できる。ＬＦＡ−１−ＳＤＩ−１融合体は、内皮細胞およびある他の細胞型を標的とする。グルカゴン−ＳＤＩ融合体は、肝細胞等を標的とするのに使用できる。
他の態様において、ＳＤＩ分子は細胞性受容体と特異的結合をできる非タンパク質と結合できる。このような分子の例は、エピネフリン、ノルエピネフリンまたはヒスタミン誘導体、プロスタグランジン等である。
更に別の態様において、ＳＤＩ分子と結合可能な内因性細胞性受容体は、ＳＤＩの標的細胞へのデリバリーの促進に利用し得る。このような受容体分子は、上記ＳＤＩタンパク質およびタンパク質フラグメントを使用して得ることができる。ＳＤＩ受容体を得るための一つの方法において、好ましくはＳＤＩタンパク質を発現する細胞からＤＮＡ(または更に好ましくは、ｃＤＮＡ)ライブラリーを製造する。ｃＤＮＡフラグメントを、発現プラスミドにクローン化し、それを、次いで不死化または腫瘍細胞に挿入する。細胞を、次いで、標識ＳＤＩ−１の存在下インキュベーションし、ＳＤＩ−１を細胞表面に吸着し、新しい静止または老化状態を示すクローンを評価する。細胞性受容体をコードするプラスミドを、次いでこのようなクローンから回収する。
ＳＤＩ受容体タンパク質は、細菌または他の宿主内のｃＤＮＡクローンの発現、次いでこのようなクローンがＳＤＩ−１結合可能か否かを測定するにより得ることができる。ある好ましい二次的実施態様においては、ｃＤＮＡをファージ発現ベクターに挿入する(全て、本明細書に参考として包含する、ローマン,Ｈ.Ｂ.ら、バイオケミストリー、30:10832-10838(1991)；マークランド,Ｗ.ら、ジーン、109:13-19(1991)；ロバーツ,Ｂ.Ｌ.ら、プロシーディングス・オブ・ザ・ナショナル・アカデミー・オブ・サイエンシーズ(USA) 89-2429-2433(1992)；スミス,Ｇ.Ｐ.、サイエンス、228:1315-1317(1985)；スミス,Ｒ.Ｐ.ら、サイエンス、248:1126-1128(1990))。上記のように、この方法は、所望のタンパク質リガンドがウイルスコートタンパク質(例えば、Ｍ１３Gene IIIコートタンパク質またはラムダコートタンパク質)のＣ−末端に融合している、融合タンパク質の発現を含む。次いで、ファージベクターを成育させ、異なった融合タンパク質を有するファージのライブラリーを産生させる。このライブラリーを次いで、グルタチオンＳ−トランスフェラーゼグルタチオン結合配列をそのアミノ末端に有する固定化ＳＤＩ−１融合タンパク質の存在下インキュベーションする。ＳＤＩ−１の細胞性受容体を示すファージを、固定化ＳＤＩ−１融合タンパク質により保持し、カラムをグルタチオンで洗浄することにより回収できる。
ＳＤＩ受容体を得る別法として、細胞性抽出物を得、ＳＤＩ−１、特にグルタチオンＳ−トランスフェラーゼグルタチオン結合配列をそのアミノ末端に有するＳＤＩ融合タンパク質の存在下インキュベーションする。ＳＤＩ−１に結合するタンパク質は、細胞性受容体タンパク質を含む。
所望の場合、細胞膜へ受容体をアンカリングする原因であるタンパク質ドメインを切断することにより、受容体分子を可溶化して、可溶性(即ち、膜非結合)受容体分子を形成できる。
ＩＶ．本発明のＳＤＩ分子およびその阻害因子の使用
Ａ．老化または静止の誘導
ＳＤＩ機能阻害可能な分子は、受容細胞に提供した場合、細胞の不死化をもたらし、それにより永久細胞系の確立を可能にする。本発明のアンチセンス、リボザイムおよび他のＳＤＩ阻害分子は、したがって、その他に一過性の増殖能力期を有する有効な細胞系(初期組織培養細胞等)の不死化に使用し得る。それらは、従って、研究に使用するか、器官、組織片または移植片としての多くの細胞の蓄積を可能にするか、促進する。一つの態様において、従って、本発明の試薬は、このような方法を促進するための器官または組織培養法と組み合わせて使用し得る。このような分子は、あるいは、免疫グロブリン産生細胞、または重用な生物学的物、例えばホルモン(インシュリン、成長ホルモン、ＩＧＦ等)、免疫系修飾物(例えば、インターフェロン、粘着性分子、リンホカイン等)を産生する細胞の不死化を行うのに使用し得る。
このような阻害性核酸分子は、好ましくはＳＤＩ分子と相補的なヌクレオチド配列を有し、最も好ましくはＳＤＩ−１遺伝子の複数の領域または全ての配列に相補的である。このようなオリゴヌクレオチドが受容体細胞に与えられると、細胞系の不死化が起きる。あるいは、本発明の抗体は、ＳＤＩ活性を阻害(例えば、体液(例えば血液)中において、体液と接触している細胞の静止の伝達からＳＤＩを保護する)のにも使用し得る。
Ｂ．診断的使用
本発明の分子の主な使用は、癌の存在および素養の診断能力にある。ＳＤＩ−１発現が、それを通してｐ５３依存性癌が、腫瘍形成を媒介する機構であるため、細胞性ＳＤＩ−１発現は、ヒト癌の存在および重症度の診断に使用できる。例えば、リィ−フロウメニ(Li-Fraumeni)症候群は、ｐ５３遺伝子のエクソン７の特異な一連の変異に関する(本明細書に参考として包含する、マーキン,Ｄ.ら、サイエンス、250:1233-1238(1990))。リィ−フロウメニ患者の細胞は、検出可能なＳＤＩ−１ｍＲＮＡまたはＳＤＩ−１タンパク質を産生できない。従って、これらの疾病の診断は、ＳＤＩ−１ｍＲＮＡまたはタンパク質濃度を測定するハイブリダイゼーションアッセイまたは免疫沈降法を使用して行い得る。
示されるように、約５０％のヒト腫瘍は、正常ｐ５３タンパク質の発現ができない。従って、生検サンプルにおけるｐ５３活性のアッセイが、腫瘍の存在の評価に使用できる。このようなアッセイは、本発明のＳＤＩ分子、特にＳＤＩ−１遺伝子配列およびそのフラグメントを使用して容易に達成できる。ｐ５３がＳＤＩ発現の誘発因子であるため、生検材料におけるＳＤＩ−１分子またはｍＲＮＡの検出は、ｐ５３遺伝子の正常発現の指標となる。
本発明の抗ＳＤＩ抗体は、細胞、組織または体液中のＳＤＩの存在を評価するための免疫アッセイに使用し得る。広範囲に整頓されている任意の免疫アッセイ形式が、この目的に使用し得る(ファックレル、ジャーナル・オブ・クリニカル・イムノアッセイ、8:213-219(1985)；ヨークン,Ｒ.Ｈ.、レビューズ・オブ・インフェクシャス・ディジージズ、4:35(1982)；オールターナティブ・イムノアッセイズ、ジョン・ウィリー＆サンズ、ＮＹ(1985)中のコリンズ,Ｗ.Ｐ.；エンザイム・メディエーティッド・イムノアッセイ、プレナム・プレス、ＮＹ(1985)中のヌゴ,Ｔ.Ｔ.ら)。ＳＤＩ存在の検出および／または測定の能力は、腫瘍の存在または重症度の評価手段として非常に望まれる。従って、例えば、特定の腫瘍におけるＳＤＩの欠如は、その腫瘍がＳＤＩ発現腫瘍よりも転移の危険が高いことを示唆する。ある実施態様においては、本発明の抗体は、サンプルの可溶性ＳＤＩ分子の測定に使用される。本発明の方法は、しかしながら、本来の場所で生検サンプル内のＳＤＩ存在の検出および分析を可能にするために使用し得る。
最も単純な免疫アッセイは、単に標的分子を含むことが推定されるサンプルと共に、予め決定した標的分子に結合できる抗体をインキュベーションすることを含む。標的分子の存在は、標的分子に結合した任意の抗体の存在、および濃度の比率により決定できる。標的結合抗体の、最初に存在する非結合抗体からの分離を促進するために、固相が典型的に使用される。従って、例えば、サンプルは固体支持体に受動的に結合し、抗体とのインキュベーションの後、支持体を洗浄して全ての非結合抗体を除去できる。
更に洗練された免疫アッセイでは、標的分子の濃度を、支持体への抗体の結合、次いで支持体を標的分子を含むことが予測されるサンプルと接触させることにより測定する。固定化抗体に結合する標的分子は、任意の種々の方法により検出できる。例えば、支持体は、標的分子の第２エピトープに結合できる標識第２抗体の存在下でインキュベートできる。支持体上の標識抗体の固定化は、このように標的の存在を必要とし、サンプル中の標識の濃度に比例する。別法として、標的をサンプルおよび既知の濃度の標識標的とインキュベーションする。サンプル内に標的分子が存在すると、抗体結合部位に対して標識標的分子と競合する。従って、抗体と結合できる標識標的分子の量が、サンプル中の標的分子の濃度と逆比例する。
一般に、免疫アッセイ形は、放射活性標識(“ＲＩＡ”)または酵素標識(“ELISA”)のいずれかを用いる。ＲＩＡは、単純性、感度および使用の容易さの利点をもつ。放射活性標識は、相対的に小さい原子寸法のものであり、通常反応速度に影響を及ぼさない。しかしながら、このようなアッセイには、放射性同位性崩壊という不都合な難点があり、試薬は貯蔵寿命が短く、特殊な取扱いおよび廃棄を必要とし、複合体の使用および高価な分析装置を必要とする。ＲＩＡは、本明細書に参考として包含する、モレキュラー・バイオロジー、ウォークス,Ｔ.Ｓ.ら、ノース・ホランド・パブリッシング・カンパニー、ＮＹ(1978)中のラボラトリー・テクニクス・アンド・バイオケミストリー内に記載されており、チャード,Ｔ.らの“アン・イントロダクション・トゥー・ラディオイミュン・アッセイ・アンド・リレイテッド・テクニクス”と題する章を特に参考とする。
ELISAは、安価な装置を使用し、無数の異なった酵素で行うことができるので多数の検出方法−−色素、ｐＨ、ガス発生等−−を定量測定のために使用できる。加えて、酵素試薬は、相対的に長い貯蔵寿命を有し、ＲＩＡ使用に伴う放射性混入の危険性はない。ELISAは、本明細書に参考として包含する、イライザ・アンド・アザー・ソリッド・フェーズ・イムノアッセイズ(ケメニー,Ｄ.Ｍ.ら編集)、ジョン・ウィリー＆サンズ、ＮＹ(1988)に記載されている。
Ｃ．治療的使用
本発明の分子は、また治療的有用性を有する。その使用が、生理的状態を変える場合、治療的であると言う。非治療的使用は、使用者の見かけを変えるものである。本発明の試薬は、例えば、老化による作用、例えば皮膚色調、色、きめ等、またはリンパ球、血管組織(動脈、細小動脈、毛細血管、静脈等)、肝臓、腎臓、心臓および他の筋肉、骨、脾臓等のような細胞、組織または器官の変性に抵抗するため、治療的、または非治療的目的で、局所または全身的に使用し得る。本発明の試薬は、このような細胞、組織または器官の若返りに用い得る。従って、それらは、例えば、好適な溶媒に溶解されたアンチセンスオリゴヌクレオチドまたはその等価物、および親油性担体または添加剤を含み得る、医薬等として使用し得る。このような溶媒は、例えば水−エタノール混合物(１０％から３０％ｖ／ｖまたはそれ以上のエタノールを含む)であり得る。このような製剤は、０.００１から１.０％のアンチセンスオリゴヌクレオチドを含み得る。好適な担体、添加剤および溶媒は、下記のものである。
１．癌および他の疾患の処置
タンパク質およびポリペプチドおよび類似体をコードしたＳＤＩ核酸分子、そのフラグメントは、受容細胞の老化または静止状態の誘発に使用される。このような誘導は、老化関連疾患(マーティン，Ｇ.Ｍ.、ゲノム、31:390(1989)；ロエ,Ｄ.Ａ.、クリニカル・ゲリアトリック・メディカル、6:319(1990)；モーラディアン,Ａ.Ｊ.、ジャーナル・オブ・アメリカン・ゲリアトリックス・ソサイエティー、36:831(1988)；アルペルト,Ｊ.Ｓ.、アメリカル・ジャーナル・オブ・カルディオロジー、65:23j(1990))；アルツハイマー病(テリー,Ｒ.Ｄ.、モノグラフ・パソロジー、32:41(1990)；コスタル,Ｂ.ら、ファーマコサイキアトリー、123:85(1990))；無力症および悪液質(ベルデリー,Ｒ.Ｂ.、ゲリアトリクス、45:26(1990))または、急性細胞増殖が望ましくない疾病または状態の処置に望ましい。この点で、本発明の試薬は、癌または癌源細胞の急性増殖の抑制のための治療に使用できる。従って、特に、本発明の分子は、癌、特に肝臓、膵臓、腎臓、肺、胃、乳、子宮、大腸、皮膚、神経膠、リンパ、前立腺、胆道胆嚢癌および悪性メラノーマの処置に使用し得る。実際、下記のように、ＳＤＩ−１は、乳、肺、肝および神経膠腫瘍のような腫瘍細胞系の増殖の抑制に広い活性を有する。著しくは、本発明のＳＤＩ分子は、癌細胞(特に、悪性メラノーマ細胞)の非癌性細胞への分化を媒介する能力を有する。
ある実施態様において、このような処置は、ＳＤＩ−１タンパク質またはタンパク質フラグメントを腫瘍細胞へ与えることにより達成される。このようなタンパク質は、ＳＤＩ−１が、直接腫瘍細胞内へ入ることができるように見えるため、直接与え得る。あるいは、ＳＤＩ−１は、リポソーム、ウイルス鞘または他の媒体中に提供され得る。第２の実施態様において、ＳＤＩ−１またはＳＤＩ−１のフラグメントをコードする遺伝子配列が、癌の遺伝子治療として提供され得る。
メラノーマまたは他の皮膚癌の場合、本発明のＳＤＩ分子を、局所的に、皮膚軟化剤等中に提供し得る(好ましくは、ｐ−アミノ安息香酸(ＰＡＢＡ)のようなＵＶ吸収化合物と共に製剤する)。
本発明のＳＤＩ分子は、特にリポソーム医薬デリバリー媒体中に製剤化された場合、膀胱癌の処置に使用できる。本発明のＳＤＩ分子の他の癌適用は、腫瘍の新血管新生の予防のための内皮細胞複製(抗血管発生)の阻害および細胞成育を停止させ、またはアポトーシス誘発のために腫瘍特異的分子を経由する標的化遺伝子デリバリーを含む。
本発明のＳＤＩ分子は、単独で、またはそうでなければ、治療効果を達成するのに必要な有効濃度を減少させるために、他の既知の化学療法剤と組み合わせて使用し得る。
実際、本発明のＳＤＩタンパク質および核酸分子は、既知の化学療法剤の添加剤として使用した場合、明白な実用性を有する。ある実施態様において、ＳＤＩ−１分子を腫瘍細胞に適用し、それにより化学療法剤の効力を促進する。別のまたは相補的な実施態様において、ＳＤＩ−１分子を、非腫瘍細胞を化学療法剤の細胞毒性効果から隔離するために、準全身的(例えば、局所または特異的器官または組織にまたは局部)に与(または付加的に与)える。
化学療法の前提は、癌細胞が、正常細胞より早く成長し、したがって、成長細胞よりも細胞毒性因子に感受性であるということである。化学療法剤の各適用は、多数回投与が一般に腫瘍を完全に除去するのに必要であるように、存在するある程度の腫瘍細胞を殺戮する(Ｗ.Ｂ.サンダース・カンパニー、フィラデルフィア、3-13頁(1994)“キャンサー・ケモセラピー・アンド・バイオセラビー・ア・リファレンス・ガイド”中のテネンバウム,Ｌ.)。
上記のように、一つの態様において、本発明のＳＤＩ−１分子は、化学療法剤に対する癌細胞の感受性を増加し、したがって低用量および／または化学療法剤を少ない用量を使用して腫瘍の除去を可能にする。このような、増加した感受性は、例えば、患者に、化学療法剤の投与と組み合わせて、ＳＤＩ−１タンパク質(またはＳＤＩ−１を発現する核酸分子)を提供することにより得ることができる。このような投与は、癌細胞の複製の阻害を助ける(正常細胞の複製もまたＳＤＩ−１分子により妨げられるが、このような阻害は、正常細胞が癌細胞より遥かに遅い増殖であるために、ほとんど重要でない)。ＳＤＩ−１分子を患者に提供した後、このような投与を終えるか、または減少させる。このような一時的または減少した投与の効果は、癌細胞を細胞周期の同じ段階に一致させる(すなわち、例えば、細胞周期のＧ１期に細胞を凍結させる)。このようなシンクロナイゼーションは、癌細胞の化学療法剤への感受性を著しく増加させる。
このようなシンクロナイゼーションが、特に投与時の細胞周期の特定の期に細胞の割合を最大限にする手段を提供するため、ＳＤＩ−１分子の投与は、その効果を細胞周期の特定の期または一連期間にその効果を働かせる化学療法剤の臨床的効力を促進する。例えば、ビンカアルカドイロ(例えばビンクリスティン、ビンブラスチン、ビンデシン等)、ポドフィラム誘導体(例えば、エトポシド、テニポシド等)、タキソイド(例えば、タキソール、ドセタクセル等)のような有糸分裂阻害因子は、細胞周期のＭ期の間に、有糸分裂紡錘体の形成を妨害することにより働く。腫瘍細胞の一分画のみが任意の時間でＭ期であるため、このような医薬は、一般に、一回大量よりむしろ反復投与により提供されなければならない。ＳＤＩ−１分子で細胞を処置することにより、腫瘍細胞を、全て(または大部分)の細胞を、同時にＭ期になるように、一致させることが可能である。従って、このようなＳＤＩ−１投与は、有糸分裂阻害因子をより有効に使用することを可能にする。
同様の方法において、葉酸アンタゴニスト(例えば、メトトレキサート等)、プリン類似体（例えば、クレアドリビン、フルダラビンホスフェート、ペントスタチン等）、プリンアンタゴニスト(例えば、６−メルカプトプリン、６−チオグアニン等）およびピリミジンアンタゴニスト(例えば、５−フルオロウラシル、５−フルオロデオキシウリジン、シタラビン等）のような抗代謝産物は、細胞のＳ期に働く。これらの試薬の効力を、ＳＤＩ−１分子の付加的使用により促進し得る。
このような付加的投与は、細胞周期相非特異的化学療法剤(例えば、抗腫瘍抗体、ヒドロキシウレア、プロカルバジン、ホルモンまたはホルモンアンタゴニスト等)の感受性または効力の改善にまた使用し得る。このような試薬の腫瘍細胞の細胞周期期に関する観察される非特異性にもかかわらず、腫瘍細胞期のシンクロナイゼーションが化学療法の効力を増加することは確かなものと思われる。
第２の実施態様によれば、本発明のＳＤＩ−１分子は、正常細胞への損傷を予防または減じるために、準全身的に使用し得る。例えば、既知の癌化学療法の一つの副作用は、毛嚢のような急速成長組織への障害である。この障害は、影響を受けた患者の抜毛(脱毛症)をもたらす。このような損傷の一過性にもかかわらず、癌化学療法に関する精神的障害、不安および抑圧を悪化させる。このような抜毛は、従って、重要な臨床的関心事である。
本発明のＳＤＩ−１タンパク質または核酸分子は、毛嚢の障害または死滅を減じまたは予防するために使用し得、従って化学療法または老化に伴う抜毛の処置を提供する。この態様において、ＳＤＩ−１分子は、局所適用する(例えば、頭皮に局所的、経皮的または皮内的等)。このような適用は、毛嚢成育を阻止し、細胞を、例えばＧ１に停止させる。この適用は、従って、続く既知の化学療法剤の投与による障害に対して、毛嚢を脱感受性とする。
本発明のＳＤＩ分子は、また化学療法の避けられない副作用として起こる粘膜炎(口腔部潰瘍)の処置に使用し得る。
妊娠癌患者に迅速な化学療法を提供する必要性は、彼らの発展した未来を危険にさらし、従って、現在の医薬法は、このような処置が胎児にもたらす明らかな障害を伴った初期癌処置の利益を注意深く比較検討しなければならない。本発明のＳＤＩ−１タンパク質または核酸分子は、妊娠中に化学療法を行わなければならない妊婦の成長している胎児への障害を減じまたは予防するために使用し得る。ＳＤＩ−１タンパク質は、胎児血流中、または胎児が浸かっている羊水に直接注射または点滴により局所提供される。好ましくは、このような局所適用は、母体への化学療法の投与前または同時に行う。ＳＤＩ−１分子の投与は、胎児を化学療法の細胞毒性から隔離する。
多くの癌ではない疾病もまた本発明のＳＤＩ分子で処置できる。ＳＤＩ分子は、皮膚疾患、乾癬の処置に使用し得る。特に、乾癬処置のために局所投与された場合、本発明のＳＤＩ分子の使用は、最少の細胞毒性副作用で、乾癬に関係ある細胞の過剰成長を制限できる。衰弱自己免疫疾患である関節リューマチもまた本発明のＳＤＩ−１分子で処置し得る。
本発明のＳＤＩ分子は、急性傷(例えば、裂傷、刺傷、手術等)または慢性傷(糖尿病潰瘍、静脈潰瘍、床ずれ)の両方の傷処置の介在または促進に使用し得る。
本発明の分子は、血管形成の再狭窄の処置に使用し得る。“狭窄”の語は、排管または管の狭くなることまたは絞窄を意味する。粥状硬化症領域、免疫学的応答、先天性奇形等のような多くの疾病過程は、冠状環動脈の狭窄、従って心筋墟血を導くことができる。その修復のために狭窄血管にバルーンカテーテルを挿入し部分的に膨らます、経皮経管血管形成術(ＰＴＣＡ)が、狭窄の処置に広く使用されている。ＰＴＣＡの主な制限は、血管領域の“再狭窄“(即ち、再絞窄)である(本明細書に参考として包含する、ルイ,Ｍ.Ｗ.ら、サーキュレーション、79:1374-1386(1989))。再狭窄は、手続の６カ月以内に３０から４０％の血管形成患者で発生することが分かっている(カリフ,Ｒ.Ｍ.ら、ジャーナル・オブ・アメリカン・カレッジ・オブ・カルディオロジー、17:2B-13B(1991)、マックブライド,Ｗ.ら、ニュー・イングランド・ジャーナル・オブ・メディシン、318:1734-1737(1988))。再狭窄は非常に早く進行するため、傷により誘発される促進された粥状硬化症の形と見なされ得る。高再狭窄の明白さは、患者、血管または領域で再狭窄起きている確実さの高い割合を予想する不確実さの存在により増加する。実際、妨害する血栓症のないＰＴＣＡ後２日の広範囲の患者の動脈は、カテーテル処置した場所で４−６カ月後に再狭窄を示す(ルイ,Ｍ.Ｗ.ら、サーキュレーション、79:1374-1386(1989))。
緑内障もまた本発明のＳＤＩ分子で処置できる。“緑内障”は、視野の進行的な損失(即ち、見える範囲にあるものか否かを定義する視覚の固定角度)によりそれぞれ特徴付られる糖尿病性眼疾患の一群である。視野の損傷は、抑制しなければ、完全なそして回復できない盲目を導く。
緑内障は、“水様液”(即ち、血漿と同じ成分を有する目の透明な液)の正常な流れの、目の後室および前室への分裂により特徴付けられる(ジェネラル・オフタモロジー、アプレトン＆ランジ、ノールワーク、ＣＴ、213-230頁(1992)中のバウグハム,Ｄ.ら)。水様液は、まつげの過程により作られ、後部眼室に分泌される。正常な目において、それは、瞳孔を通って、目の前室に行く。水様液は、前室から、“トラベキュラーメッシュワーク（trabecular meshwork）”として知られているコラーゲン−エラスチンフィルター構造に流れ、最後に“シェルムの洞”を通って血管血液供給に行く。水様液のシェルムの洞を横切る能力は、経細胞チャンネルの存在および程度に依存し、流出速度は、眼内圧を決定する。正常な目の平均圧力は、約１４mmＨgである。緑内障では、水様液の流出が分散し、眼内圧が上昇する。障害は、通常約３０mmＨgで始まり、目は約２４０倍の平均圧力値で破裂する。
抗有糸分裂物質、５−フルオロウラシルが、緑内障の治療剤として提案されている(サルファラジ,Ｆ.、米国特許第５,３０４,５６１号)。不幸なことに、５−フルオロウラシルは明白に不利な副作用を有する。本発明の薬剤は、細胞増殖を予防できるため、トラベキュラーメッシュワークの細胞の増殖の阻害に使用し得、従って緑内障、特に初期オープンアングル緑内障の処置を提供する。このような使用のために、眼内手段(例えば、点眼または軟膏)で投与できるＳＤＩ−１分子を使用するのが望ましい。医薬の角膜を横切る能力は、医薬が親油性および親水性領域の両方を有する場合、促進される。従って、眼内への送達のために、本発明のＳＤＩ−１分子を、このような領域を有するように修飾することが望ましい。好適な親油性および親水性基は、当分野で既知であり(レミントンズ・ファーマシューティカル・サイエンシズ参照)、芳香族基、脂質等(親油性基)および有機酸、エステル、イオン性基等(親水性基)を含む。このような基は、本発明のＳＤＩ−１分子に、例えば、好適なアミノ酸の側鎖基を誘導体化することにより容易に加えることができる。
システイニル残基をクロロ酢酸またはクロロアセトミドのようなα−ハロ酢酸(および対応するアミン)と反応させ、カルボキシメチルまたはカルボキシアミドメチル誘導体を得られ得る。システイニル残基は、またブロモトリフルオロアセトン、α−ブロモ−β−(５−イミドゾイル)−プロピオン酸、クロロアセチルリン酸、Ｎ−アルキルマレイミド、３−ニトロ−２−プリジルジスルフィド、２−ピリジルジスルフィドメチル、ｐ−クロロメルクリベンゾエート、２−クロロメルクリ−４−ニトロフェノールまたはクロロ−７−ニトロベンゾ−２−オキサ−１,３−ジアゾールと反応して誘導体化できる。
ヒスチジル残基は、この薬剤がヒスチジル側鎖に相対的に特異的であるため、ジエチルプロカルボネートとｐＨ５.５−７.０で反応して誘導体化できる。パラブロモフェンアシルブロミドもまた有用である；この反応は、好ましくはｐＨ６.０で、０.１Ｍナトリウムコカディレート中で行う。
リジニルおよびアミノ末端残基は、コハク酸または他のカルボン酸無水物と反応し得る。これらの薬剤との誘導体化は、リジニル残基の電荷を逆にする作用を有する。α−アミノ酸含有残基の誘導体化に好適な他の試薬は、メチルピコリンイミデートのようなイミドエステル；ピリドキサールホスフェート；ピリドキサール；クロロボロハイロライド；トリニトロベンゼンスルホン酸；Ｏ−メチル−イスウレア；２,４−ペンタンジオン；およびグリオキシレートによるトランスアミナーゼ触媒反応を含む。
アルギニル残基は、１個またはそれ以上の既知の試薬、とりわけ、フェニルグリオキサール、２,３−ブタンジオン、１,２−シクロヘキサンジオンおよびニンヒドリンで修飾し得る。アルギニン残基の誘導体化は、グアニジン官能基の高いｐＫａのため、アルカリ条件下で行うことを必要とする。更に、これらの試薬は、リジンおよびアルギニンイプシロンアミノ基と反応し得る。
カルボキシル側基(アスパルチルまたはグルタミル)は、１−シクロヘキシル−３−(２−モルホリニル−(４−エチル)−カルボジイミドまたは１−エチル−３−(４−アゾニア−４,４−ジメチルペンチル)−カルボジイミドのようなカルボジイミド(Ｒ'−Ｎ−Ｃ−Ｎ−Ｒ')と反応して選択的に修飾し得る。更に、アスパルチルおよびグルタミン残基は、アンモニウムイオンとの反応によりアスパラギニルおよびグルタミニル残基に変換し得る。
２．抗ウイルスおよび抗微生物的使用
別の実施態様において、本発明の分子は、インフルエンザ、肝炎(例えばＢ型肝炎またはＣ型肝炎)、イプスタイン−バール、リノウイルス、パピローマウイルス、ポパバウイルス等のウイルスの増殖を阻害する抗ウイルス剤として使用し得る。特に、ＳＤＩ分子(特にＳＤＩ−１およびその類似体)は細胞増殖阻害として働き、レトロウイルスは、活性分化細胞中でのみ選択的に増殖するため、本発明はＨＩＶに対する抗ウイルス治療を提供し、従ってＡＩＤＳおよびＡＲＣのような疾病の処置に使用できる。同様に、いぼ(性交性いぼを含む)、咽頭乳頭腫症、進行性マルチフォカル・ロイコエンセファロパシー等のような疾病に対して、ＳＤＩ分子の投与は感染細胞増殖を阻害し、従ってこの疾病の症状の処置を提供する。
他の実施態様において、本発明の分子は、真菌、酵母、原虫、蠕虫、線虫および他の寄生体感染(例えば、カンジダ症、アスペルギルス症、コクシジオイデス症、リーシュマニア症、アメーバ症、トリコモナス症、白癬(ペディス、クルシス等)、腟鷲口瘡、住血吸虫症およびマラリア)の処置のための抗寄生体剤として使用し得る。
上記と同様の方法において、ＳＤＩ−１分子の投与は、抗ウイルスまたは抗微生物剤の治療効果を増加できる。ＳＤＩ−１分子が病原体の複製を阻害するため、続く感染の危険性を予防しまたは減じるために、局所的に皮膚に、または全身的に注射で投与し得る。従って、例えば、本分子を好適な医薬組成物に包含し、感染している可能性のある個体に暴露される前に、局所的に外科医または他の医療実施者の手に適用する。
他の態様において、ＳＤＩ−１分子は、抗ウイルス剤の添加剤として、任意のウイルス感染細胞の細胞周期を一致させるために、疑わしいまたは実際のウイルス感染の処置に使用し、それにより抗ウイルス剤の治療効果を促進する。同様に、ＳＤＩ−１分子は、抗寄生体剤の添加剤として、任意の寄生体感染細胞の細胞周期を一致させるために、疑わしいまたは実際の寄生体感染の処置に使用し、それにより抗寄生体剤の治療効果を促進する。このような付加投与は、上記の真菌、酵母、原虫、蠕虫、線虫および他の寄生体感染のような疾病の処置に使用し得る。
３．他の治療的使用
本発明のアンチセンスおよび他のＳＤＩ阻害分子は、ヒトまたは動物における精母細胞の増殖または卵母細胞の成熟の促進に使用し得、それにより受容者の繁殖能力を増加させる。逆に、ＳＤＩ分子およびその類似体は、雄または雌の生殖源性の阻害に使用でき、従って、雄または雌の不妊誘発の避妊薬として使用できる。このような使用には、またウイルス(例えばＨＩＶ等)感染細胞の複製および増殖を減弱する利点があり、従ってウイルス疾患(例えばＡＩＤＳ等)への羅患の可能性を減らす。
本発明のＳＤＩ−１分子は、ＤＮＡ複製阻害が可能であるため、ＵＶ光誘発ＤＮＡ障害(過剰な日光への暴露により遭遇するような)の予防または減少のために使用し得る。このような障害を修復する正常な能力を欠く個体は、ＤＮＡ合成のＳＤＩ−１媒介阻害により、修復が起こる機会をより多く提供されるであろう。従って、本発明のＳＤＩ−１分子は、ＤＮＡ修復能力を欠く個体(例えば、色素性乾皮症、ルイバール症候群等を有する個体)の処置に使用し得る。
本発明のアンチセンスまたは他の阻害分子は、細胞増殖を刺激する能力を有するため、傷治癒、血管発生、内皮細胞増殖、熱傷または手術後の回復、または萎縮組織の回復等に使用し得る。本発明の抗体は、傷治癒、熱傷、または外傷または手術の後の回復を行うのにまた使用し得る。実際、全てのこのような化合物は、一般の組織再生または血管再生の抑制に使用できる。このような実施化のために、これらの試薬は、抗生物質、抗真菌剤等とともに局所または全身投与用に製剤化される。
本発明の分子は、受容患者の遺伝子治療を提供するために使用し得る。一つの態様において、患者の細胞または組織を患者から回収し、活性成長状態の回復を可能にするのに充分な条件下、本発明の分子で処置し得る。この使用の一つの好ましい態様において、個体(例えば、ＡＩＤＳ患者等のような免疫が傷付けられている個体またはリンパ球のドナーとして働くであろう免疫競合個体)のリンパ球を回収し、アンチセンスＳＤＩ核酸で処置できる。これらの分子の投与は、リンパ球の機能を低下させる。投与後、リンパ球は、患者に再導入され、これは増強された対感染戦斗能力を発揮する。
本発明の更に別の実施態様において、本発明の分子をオートロガス(autologous)細胞置換を助長するのに使用できる。この態様において、タンパク質およびポリペプチドをコードする核酸分子、そのフラグメントおよび類似体は、患者のこのような細胞の量または濃度を補給または増加させることから、細胞(骨髄細胞、上皮細胞、筋肉細胞、肝細胞等)をインビトロ増殖させるために使用できる。従って、例えば、骨髄細胞を回収し、このような分子で処置し、次いで、インビトロで細胞が望ましい免疫反応の増強に充分な量となるまで培養し得る。あるいは、肝細胞(肝炎ウイルスのない肝細胞)を患者から回収し、処置し、培養し、次いで肝炎を処置するために、患者に移植して戻すことができる。
ある二次的実施態様においては、このような処置細胞それ自身を患者に直接移植しなおし、そしてインビボ増殖させ得る。あるいは、示されているように、このような細胞は、インビトロで培養することができ、望ましい力価が得られた場合に再導入してもよい。
上記の遺伝子治療の実施態様および二次的実施態様に従い、ＳＤＩ−１ｃＤＮＡおよびアンチセンス配列を、治療効果を所望の部位または組織に限定するために、腫瘍特異的または組織特異的プロモーターと実施可能に結合させ得る。好適な腫瘍特異的プロモーターは、α−フェトプロテイン、腫瘍胎児性抗原、アミラーゼ、γ−グルタミルトランスフェラーゼ等のような腫瘍特異的抗原の転写を指示するものである。好適な組織特異的プロモーターは、フェニルアナリンヒドロキシラーゼプロモーター(ワン,Ｙ.ら、ジャーナル・オブ・バイオロジカル・ケミストリー、269:9137-9146(1994)；スベンソン,Ｅ.ら、ヨーロピアン・ジャーナル・オブ・ヒューマン・ジェネティクス、1:306-313(1993)；コネンツキ,Ｄ.Ｓ.ら、バイオケミストリー、31:8363-8368(1992))、α−１−アンチトリプシン(ＡＡＴ)プロモーター(リ,Ｙ.ら、モレキュラー・アンド・セルラー・バイオロジー、8:4362-4369(1988))；筋肉アクチンプロモーター等を含む。特に関心の対象となるものは、乳、肝臓、肺または大腸組織の発現を指示するプロモーターである。
本発明の分子は、疾病または組織変性の動物モデルの創造および／または研究の使用に特に好適である。従って、本発明の分子は、異常老化または細胞変性により特徴付けられる動物モデルの因子の研究に使用できる。同様に、ＳＤＩ分子の投与(例えば、受容体細胞におけるその発現を可能にするために好適な制御配列と架橋した)を、老化または組織変性の動物モデルの創造に使用できる。
Ｄ．医薬成分の送達
ＳＤＩ−１が細胞へ直接入る能力は、医薬成分の受容細胞への送達を達成する手段を提供する。従って、一つの態様において、医薬成分をＳＤＩ−１と結合させ、受容患者へ提供する。ＳＤＩ−１分子(無傷ＳＤＩ−１タンパク質または輸送に充分なＳＤＩ−１のフラグメントであり得る)の存在は、結合した医薬成分を受容細胞へ輸送する。
任意の種々の架橋剤を、医薬成分をＳＤＩ−１分子に結合するのに使用し得る。あるいは、このような成分を、融合タンパク質として提供できる(上記ＧＳＴ−ＳＤＩ−１融合タンパク質として例示される)。このような融合タンパク質は、例えば、このような融合タンパク質をコード化する核酸分子の発現により製造できる。
この方法で細胞に投与し得る医薬成分は、細胞に治療効果を提供する薬剤を含む(抗過増殖、抗炎症、抗不整脈等)。あるいは、医薬成分を、受容細胞に有益に作用させ得る(サイトカイン、毒素等を含むことにより)。
送達されるべき医薬成分がＳＤＩ−１であることが望まれる場合、これはキメラ結合領域を含み得る本発明の抗ＳＤＩ抗体を使用して達成できる。このようなキメラ抗体の結合領域を選択して、腫瘍抗原に特異的な結合領域を含有させることにより、腫瘍抗原およびＳＤＩ分子の両方に結合可能な抗体の産生が可能になる。このような分子は、ＳＤＩタンパク質を、腫瘍抗原を発生する任意の細胞に“運ぶ”のに使用できる。運搬されるＳＤＩ分子は、腫瘍細胞の静止または老化状態の再開を誘発する。このようなキメラ抗体は、従って抗癌処置を含む。
あるいは、本発明のＳＤＩ分子は、ＳＤＩ分子をホルモンまたは所望の一連の受容細胞と結合できる他の分子と融合することにより、細胞に提供し得る。従って、例えば、ＳＤＩ−１を可溶性ＣＤ４分子またはインシュリン分子と結合することにより、ＣＤ４を発生する白血球またはインシュリン受容体を発生する細胞にＳＤＩ−１投与の的をしぼることができる。このような結合体は種々の方法を使用して製造できるが、このような結合体は、融合タンパク質をコードする核酸分子の発現により産生するのが好ましい。
示唆されるように、ＧＳＴ−ＳＤＩ融合体は、特に好ましい融合体である。ラットＧＳＴのＮ末端ドメインは、ヒト遊送阻止因子(ＭＩＦ)と有意な相同性を示す(本明細書に参考として包含する、デイビッド,Ｊ.Ｒ.、パリストロジー・トゥデイ、9:315-316(1993)；ミカワマ,Ｔ.ら、プロシーデイングス・オブ・ザ・ナショナル・アカデミー・オブ・サイエンシーズ(USA)90:10056-10060(1993))。従って、ＳＤＩの任意の活性とは別に、ＧＳＴはＭＩＦおよび関連分子に結合可能な細胞性受容体への結合の可能性を有する。実際、本発明の一つの実施態様は、ＧＳＴ医薬成分融合タンパク質が、細胞性受容体と結合でき、標的細胞への医薬成分の送達に有効であるという認識を含む。従って、ＳＤＩ以外の分子を、所望の標的細胞への送達を行うために、ＧＳＴ配列(上記のような)と融合できる。
Ｅ．準備的使用
本発明の抗ＳＤＩ抗体は、溶液からＳＤＩタンパク質を精製および回収する簡易な手段を提供する。この実施態様において、細胞融解物または抽出物を好ましくは固体支持体上に固定化した抗ＳＤＩ抗体の存在下インキュベーションする。ＳＤＩ分子は、抗体に結合し、かつこのようにして純化した形で回収できる。
Ｆ．ＳＤＩ細胞受容体およびその可溶化誘導体の使用
ＳＤＩ細胞受容体およびその可溶化誘導体は、ＳＤＩタンパク質含有調製物からのＳＤＩの回収を容易にするために使用できる。この方法において、受容体を偽抗体として使用し得る。受容体は治療的に使用し、細胞発現およびＳＤＩタンパク質に対する応答を緩和し得る。従って、受容体分子は、腫瘍細胞に提供できる(リポソームを経由して、またはこのような細胞に、受容体をコードする核酸と共に提供して)。このような分子は、腫瘍細胞のＳＤＩ存在に対する応答の能力を増加し、それにより癌を改善する。
Ｖ．投与方法
本発明のＳＤＩ分子は、医薬的に有用な組成物を調製する知られた方法に従って製剤化でき、該方法により、所望の純度を有するこれらの材料、またはそれらの機能的誘導体が生理学的に許容され得る担体、賦形剤または安定化剤と組み合わせて混和物とされる。このような材料は、用いる用量および濃度で受容体に非毒性である。このような組成物の“ＳＤＩ分子”は、ＳＤＩ−１タンパク質、融合体(例えばＧＳＴ融合体等)またはＳＤＩ−１タンパク質のフラグメントまたはこのような分子のもどき体である。ＳＤＩ分子は、ＳＤＩ−１ｃＤＮＡのセンス、アンチセンスまたは三重オリゴヌクレオチドまたは遺伝子であり得る。組成物は、その投与が受容患者に耐性である場合には、“医薬的に許容され得る”と言う。投与された量が生理的に明白である場合、“治療的有効量”と言う。その存在が、受容患者において生理的に検出可能な変化をもたらす場合、薬剤は生理的に明白である。
適切な媒体、および、他のヒトタンパク質、例えば、ヒト血清アルブミンを含むそれらの製剤は、例えば、レミントンズ・ファーマシューティカル・サイエンシィズ（第１６版、オソル,Ａ.出版、マック、イーストン、ペンシルバニア（１９８０年））に記載されている。貯蔵または投与に適した医薬的に許容し得る組成物を形成するために、このような組成物は、有効量の１種またはそれ以上の“ＳＤＩ分子”を含むであろう。
組成物が水溶性である場合、好ましくはｐＨ約７から８のリン酸または他の有機酸塩のような緩衝液中で製剤し得る。組成物が、部分的にのみ水溶性である場合、例えば、０.０４−０.０５％(w／v)の用量のトゥイン、プルロニクスまたはＰＥＧ、例えばトゥイン８０のような非イオン性界面活性剤と共にマイクロエマルジョンとして製造し得、溶解性を増加させる。“水溶性”の語は、ポリサッカライトおよびポリエチレングリコールに関して用いられた場合、コロイド溶液および分散剤を含む。一般に、セルロース誘導体の溶解性は、エーテル基の置換の割合により測定し、本発明で有用な安定化誘導体は、セルロース鎖のアンヒドログルコース単位当たりに、このようなエーテル基を、誘導体を水溶性にするのに十分な量有するべきである。アンヒドログルコース単位当たり少なくとも０.３５エーテル基のエーテル置換の割合が、一般に、十分である。更に、セルロース誘導体は、アルカリ金属塩、例えばＬi、Ｎa、ＫまたはＣs塩の形であり得る。
所望により、抗酸化剤、例えばアスコルビン酸；低分子量(約１０残基以下)ポリペプチド、例えばポリアルギニンまたはトリペプチド；血清アルブミン、ゼラチンまたは免疫グロブリンのようなタンパク質；ポリビニルピロリドンのような親水性ポリマー；グリシン、グルタミン酸、アスパラギン酸またはアルギニンのようなアミノ酸；モノサッカライド、ジサッカライドおよびセルロースまたはその誘導体、グルコース、マンノースまたはデキストリンを含む他の炭水化物誘導体；EDTAのようなキレート化剤；およびマンニトールまたはソルビトールのような糖アルコールのような他の成分を加え得る。
更なる製薬方法を用いて、作用の持続期間を制御し得る。組成物のＳＤＩ分子(群)を複合(complex)または吸収するポリマーを用いることにより、放出制御製剤を完成できる。放出制御するために、適切な高分子(例えば、ポリエステル類、ポリアミノ酸類、ポリビニル、ピロリドン、エチレンビニルアセテート、メチルセルロース、カルボキシメチルセルロース、またはプロタミン、サルフェート)と高分子の濃度、同じく組み込み方法を選択することによって、制御された放出を実行できる。
持続放出製剤は、また、マイクロカプセル粒子およびインプラント可能物の形で製造し得、含む。持続放出組成物の製剤のために、組成物のＳＤＩ分子は、好ましくは生物分解可能マトリックスまたはマイクロカプセル内に包含される。この目的に好適な材料は、ポリアクチドであるが、ポリ−Ｄ−(−)−３−ヒドロキシ酪酸(欧州特許第１３３,９８８Ａ号)のようなポリ−(α−ヒドロキシカルボン酸）の他のポリマーも使用できる。他の生物分解可能ポリマーは、ポリ(ラクトン)、ポリ(オルトエステル)、ポリアミノ酸、ハイドロゲルまたはポリ(オルトカルボン酸)ポリ(アセタール)である。重合材料は、また、ポリエステル、ポリ(乳酸)、またはエチレンビニルアセテートコポリマーを含み得る。持続放出製剤の例は、米国特許第３,７７３,９１９号、欧州特許第５８,４８１Ａ号、米国特許第３,８８７,６９９号、欧州特許第１５８,２７７Ａ号、カナダ特許第１１７６５６５号、Ｕ,シドマン.ら、“バイオポリマーズ”22:547［1983］およびＲ.ランガーら、“ケミカル・ティーチ”12:98［1982］参照。
あるいは、組成物のＳＤＩ分子をポリマー粒子中に包含させる代わりに、これらの物質を、例えばコアセルベーション技術、または、界面重合により調製されたマイクロカプセル類、例えばそれぞれヒドロキシメチルセルロースまたはゼラチン−マイクロカプセル類、およびポリ(メチルメタクリレート)マイクロカプセル類中に、もしくはコロイド状薬剤放出システム、例えば、リポソーム類、アルブミンミクロスフェア類、ミクロエマルジョン類、ナノ粒子類、およびナノカプセル類、またはマイクロエマルジョン類中に封じ込む(entrap)ことが可能である。このような技術は、レミントンズ・ファーマシューティカル・サイエンシィズ(１９８０年)に開示されている。
一つの態様において、このような製剤は、その自己細胞内取り込みを媒介できるＳＤＩ−１分子(例えば、ＧＳＴ−ＳＤＩ−１融合等)を含むであろう。好適な方法は、当分野で既知であり、例えば、全て本明細書に参照として包含するビエッセン,Ｅ.Ａ.Ｌ.ら(ＰＣＴ出願WO94/04545)、フェルグナー,Ｐ.Ｌ.(ＰＣＴ特許出願WO93/20801)、アキヤマ,Ｋ.ら(ＰＣＴ出願WO93/20801)、ブラム,Ａ.ら(ＰＣＴ出願WO93/03709)、ホソカワ,Ｓ.ら(米国特許第５,２６４,２２１号)、クリス,Ｐ.Ｒ.ら(米国特許第５,２０４,１１２号；米国特許第５,２５２,２６３号)、日本特許第４,０８２,８９３号、フィリップス,Ｗ.Ｔ.ら(米国特許第５,１５８,７６０号)、ワイナー,Ｎ.Ｄ.(ＰＣＴ出願WO91/01719)、ホステトラー,Ｋ.Ｙ.ら(米国特許第５,２２３,２６３号)、コバヤシ,Ｙ.ら(欧州特許第３３５５９７号)；ワイナー,Ａ.Ｌ.ら(ＰＣＴ出願WO89/05151)；ホープ,Ｍ.Ｊ.ら(ＰＣＴ出願WO87/07530)参照。
第２の態様において、ＳＤＩ−１分子の細胞内取り込みを可能にするリポソーム製剤および方法を使用する。好適な方法は当分野で既知であり、例えば、全て参考として本明細書に包含するチッツ,Ｒ.Ｍ.ら(ＰＣＴ出願WO94/04557)、ジャイセナ,Ｓ.Ｄ.ら(ＰＣＴ出願WO93/12234)、ヤロッシュ.Ｄ.Ｂ(米国特許第５,１９０,７６２号)、チャラハン,Ｍ.Ｖ.ら(米国特許第５,２７０,０５２号)およびゴンザレッツロ,Ｒ.Ｊ.(ＰＣＴ出願91/05771)参照。
治療投与に使用するＳＤＩ医薬組成物は、滅菌濾過膜(例えば、０.２ミクロン膜)を通す濾過により滅菌し得る。組成物は、凍結乾燥形または液体形として貯蔵し得る。前記のある種の賦形剤、担体または安定化剤の使用が、ＳＤＩ分子の塩形をもたらすことは理解されよう。
本発明の組成物は、皮膚または胃腸、腟、口、粘膜等に局所適用できる。局所適用する場合、本組成物のＳＤＩ分子は、好適には、担体および／またはアジュバントのような他の成分と結合し得る。医薬的に許容され得、その意図される適用に有効であり、組成物の活性成分の活性を分解しない限り、このような他の成分に制限はない。好適な媒体の例は、軟膏、クリーム、ゲルまたは精製コラーゲン有りまたは無しの懸濁液を含む。組成物は、経皮パッチ、プラスターおよびバンドエード内に、好ましくは液体または半液体の形で含まれ得る。
ゲル製剤を得るために、液体組成物に調剤された本組成物のＳＤＩ分子を、有効量の水溶性ポリサッカライドまたはポリエチレングリコールのような合成ポリマーと混合し得、局所に提供するための好適な粘性のゲルを形成する。使用し得るポリサッカライドは、例えば、アルキルセルロース、ヒドロキシアルキルセルロースおよびアルキルヒドロキシアルキルセルロース、例えばメチルセルロース、ヒドロキシエチルセルロース、カルボキシメチルセルロース、ヒドロキシプロピルセルロース、ヒドロキシエチルセルロース、カルボキシメチルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、およびヒドロキシプロピルセルロースを含むエーテル化セルロース誘導体；澱粉および分画澱粉；寒天；アルギン酸およびアルギネート；アラビアゴム；プルラン；アガロース；カラゲナン；デキストラン；デキストリン；フルクタン；イヌリン；マンナン；キシラン；アラビナン；キトサン；グリコーゲン；グルカン；および合成バイオポリマーおよびキサンタンガム；およびカラヤガムおよびこれらの誘導体および混合物を含む。この好ましいゲル化剤は、生物系に不活性であり、非毒性であり、製造が簡単であり、さらさらまたは粘性すぎず、その中のＳＤＩ分子を不安定化しないものである。好ましくは、ポリサッカライドはエーテル化セルロース誘導体、更に好ましくは、充分定義され、精製され、ＵＳＰに列記されている、例えばメチルセルロースおよびヒドロキシプロピルセルロース、ヒドロキシエチルセルロースおよびヒドロキシプロピルメチルセルロースのようなヒドロキシアルキルセルロース誘導体である。この中で最も好ましいのはメチルセルロースである。
ゲル化に有用なポリエチレングリコールは、典型的には低および高分子量ポリエチレングリコールの混合物であり、適当な粘性を与える。例えば、分子量４００−６００のポリエチレングリコールと分子量１５００のものの混合物は、ペーストを得るために正確な比率で混合した場合、この目的に有効であろう。
本発明の組成物は、注射、迅速な点滴、鼻咽喉吸収(鼻咽喉内に)、皮膚吸収による非経口的投与、または経口投与用製剤とすることも出来る。これに代えて、該組成物を筋肉内投与または静脈内投与してもよい。非経口投与のための組成物は、滅菌水溶液または非水溶液、懸濁液、および乳液を含んでいる。非水性溶媒の例は、プロピレングリコール、ポリエチレングリコール、オリーブ油などの植物油、およびオレイン酸エチルなどの注射可能な有機エステル類である。担体、助剤または閉鎖包帯を用いて、組織浸透性を増大させたり、抗原吸収を増強させたり出来る。経口投与のための液体投薬形態は、一般にこの液体投薬形態を含有するリポソーム溶液を含んで成ることもある。懸濁状リポソームに適切な形態は、乳液、懸濁液、溶液、シロップ、およびエリキシルを含み、当技術分野で通常用いられる精製水などの不活性希釈剤を含む。不活性希釈剤の他にも、このような組成物は、湿潤剤、乳化剤および懸濁剤、または甘味料、香味料、着色料、または芳香料も含み得る。
メチルセルロースをゲルに用いる場合、好ましくは、ゲル約２−５％、更に好ましくは約３％を含み、組成物のＳＤＩ分子は、ゲルml当たり約３００−１０００μgの量で存在する。用いるべき用量は、上記の因子に依存する。一般的な提案として、組成物のＳＤＩ分子を、有効であるが、過度に毒性でない最大量を組織内で確立し得る用量で製剤し、標的部位または組織に送達させる。
一般に、組成物の有効な量を提供するのに必要な用量は、受容者の年令、状態、性別、および疾病の程度、およびもしあれば、他の可変要因のような因子に依存して変化するが、当業者は容易に調節できる。
本発明の組成物の有効量は、用量または適用当たり、０.０１−１,０００mg／mlの範囲で変化するが、より少ないかまたは多い用量も使用できる。
ＳＤＩ−１核酸分子を(アンチセンスまたは３重リプレッションとして)用いる場合、“遺伝子治療”の方法を使用する。遺伝子治療の原理は、オルダム,Ｒ.Ｋ.(プリンシプルズ・オブ・バイオセラピー、レーベン・プレス、ＮＹ、1987中)および類似のテキストに記載されている。遺伝子治療の方法の記載および使用は、すべて、本明細書に参考として包含する、ボッグス,Ｓ.Ｓ.(インターナショナル・セル・クローニング、8:90-96(1990)；カールソン,Ｅ.Ｍ.(バイオロジー・オブ・レプロダクション、42:39-49(1990)；レドリー,Ｆ.Ｄ.、バイオテクノロジー、ア・コンプリヘンシブ・トリアティーズ、７Ｂ巻、ジーン・テクノロジー、ＶＣＨパブリッシャーズ、インコーポレイテッド、ＮＹ、399-458頁(1989)）により提供されている。このような遺伝子治療は、現れている症状を処置(即ち、抑制または減じる)ために、受容者に提供でき、または遺伝した遺伝子変異または体細胞変異のために、緑内障の資質を有する個体の予防遺伝子治療を提供できる。
最も好ましくは、ウイルスまたはレトロウイルスベクターを、この目的に使用する。好適なベクターの例は、フレッチャー,Ｆ.Ａ.ら(ジャーナル・オブ・エクスペリメンタル・メディスン、174:837-845(1991))、メケレ,Ｔ.Ｐ.ら(ジーン、118:239-294(1992))、ポルガドール,Ａ.ら(キャンサー・リサーチ、52:3679-3986(1992))、ヨシムラ,Ｋ.ら(ヌクレイック・アシッズ・リサーチ、20:3233-3240(1992))、リム,Ｂ.ら(プロシーディングス・オブ・ザ・ナショナル・アカデミー・オブ・ザイエンシーズ(USA)86:8892-8896(1989))、オイ,Ｓ.ら(ジーン、89:279-282(1990))およびルッセル,Ｓ.Ｊ.ら(ジャーナル・オブ・ビロロジー、66:2821-2828(1992))。
以上、本発明を一般的に記載してきたが、以下の実施例を参考にすることにより、より容易に理解されるであろう。それらの実施例は、特記したものを除き、例示のために提供したものであり、本発明の限定を意図するものではない。
実施例１
ｃＤＮＡライブラリーの創製
ｃＤＮＡライブラリーは、細胞系ＨＣＡ２などの正常ヒト新生児包皮繊維芽細胞由来のＲＮＡを用いて得られた。これを行うためには、細胞を、１０％ウシ胎児血清(ＧＩＢＣＯまたはハイクローン)を補った、均衡のとれたアール塩溶液またはハンクス塩溶液のいずれかを含む最小必須成分培地で成育させた。細胞を培養し、それらのイン・ビトロでの寿命を、以下参考として組み込んであるスミス，Ｊ.Ｒ.、およびブラウンシュバイゲル，Ｋ.Ｉ.、ジャーナル・オブ・セル・フィジオロジー、９８巻、５９７−６０１頁(１９７９年)に記載されている条件下で測定した。静止細胞は、細胞が集密的(confluent)になる前に、正常培養培地を、０.５％血清を含む培養培地に変えることにより作成された。該細胞は、低血清培養で３週間まで維持された。
全細胞ＲＮＡをグアニジウムチオシアネート／ＣsＣl法(ガルガー，Ｓ.Ｊ.等、バイオケミカル・アンド・バイオフィジカル・リサーチ・コミュニケーションズ、１１７巻、８３５−８４２頁(１９８３年))か、またはグアニジウムチオシアネート／フェノール法(コムジンスキー，Ｐ.およびサッキ，Ｎ.、アナリティカル・バイオケミストリー、１６２巻、１５６−１５９頁(１９８７年)、ＲＮＡゾルＢ、バイオテックス・ラボラトリー・インコーポレイテッド、テキサス)のいずれかにより分離した。ポリＡ＋ＲＮＡはオリゴ(ｄＴ)セルロースカラムクロマトグラフィー(コラボレイティブ・リサーチ、マサチューセッツ)により分離した。
上記したように、老化細胞から得られたポリＡ＋ＲＮＡ １０μgは、提供者(ＢＲＬ、ＭＡＤ)の教示に従いＲＮアーゼＨ−／ＭＭＬＶ逆転写酵素を用いることにより、二本鎖ｃＤＮＡ群に転換させ、Ｔ４ポリメラーゼ処理により平滑末端にした。二本鎖ｃＤＮＡ調製物群は、アガロースゲル電気泳動によサイズ画分され、発現ベクターに挿入するために、２−４.５kbの画分を分離した。
この目的に用いられる発現ベクターは、３.４kbプラスミドであり、ｐｃＤＳＲα△と呼称されるものである(図１)。プラスミドｐｃＤＳＲα△は、プラスミドｐｃＤＳＲα２９６の誘導体であり、オカヤマ−バーグＳＶ４０プロモーターとＨＴＬＶ−１由来のＬＴＲを含む(タケベ，Ｙ.等、モレキュラー・セル・バイオロジー、８巻、４６６−４７２頁(１９８８年)；Ｍ.ヨシダ博士(キャンサー・インスティテュート・オブ・ジャパン)により提供された)。プラスミドｐｃＤＳＲα△は、ｐｃＤＳＲ２９６からＰｓｔ１−Ｋｐｎ１フラグメントの３３６塩基対(ｂｐ)セグメントを除き、それをｐＵＣ１９由来のＰｓｔ１−Ｋｐｎ１フラグメントの２８塩基対に置き換えることにより形成された。生じたプラスミド(pｃＤＳＲα△)は、クローニングベクターおよび発現ベクターとして用いられた。
プラスミドｐＳＶ２ｃａｔ(ゴーマン，Ｃ.等、モレキュラー・セル・バイオロジー、２巻、１０４４−１０５１頁(１９８２年))は、グレッチェン・ダーリントン博士(テキサス・チルドレンズ・ホスピタル)により与えられた。ｐｃＤベクター(オカヤマ，Ｈ.およびバーグ，Ｐ.、モレキュラー・セル・バイオロジー、３巻、２８０−２８９頁(１９８３年))は、Ｈ.オカヤマ博士(日本、大阪大学)により与えられたもので；該プラスミドは、ＳＶ４０プロモーターとＳＶ４０ポリＡシグナルの間に挿入されたクロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ(“ＣＡＴ”)遺伝子を有する。ｐｃＤＳＲα△−ｃａｔは、ＨindIII−ＳmaＩ消化ＳＲαプロモーターフラグメントの０.８kbをＨindIII消化ｐＳＶＯｃａｔに、２段階の連結反応を経て、挿入することにより、ｐｃＤＳＲα△から構築された。ｃＤＮＡライブラリーの効率良い発現スクリーニングを可能にするためには、非常に強力なプロモーターが望まれていた。数種の哺乳類発現ベクター(若い細胞内にトランスフェクションされたｐＳＶ２ｃａｔ、ｐｃＤ−ｃａｔおよびｐｃＤＳＲα△−ｃａｔ)の分析から、ＳＲαプロモーターが若いサイクリング細胞におけるＣＡＴ遺伝子の発現を高効率で推進することが見い出された。これらのプラスミドの相対的なＣＡＴ活性は、各反応に用いられるタンパク質量に対して標準化することにより、計算された。転写効率は、ＳＶ４０初期遺伝子プロモーターを利用する在来のｐＳＶ２プロモーターよりも約２０倍高かった。
ｐＣＭＶβは、ヒトサイトメガトロウイルス前初期遺伝子(immediate early gene)プロモーターにより駆動されるＥ．コリβ−ガラクトシダーゼ遺伝子を搭載している(マックグレゴール，Ｇ.Ｒ.およびキャスケイ，Ｃ.Ｔ.、ヌクレイック・アシッズ・リサーチ、１７巻、２３６５頁(１９８９年)；テキサス、ベイラー・カレッジ・オブ・メディシン、グラント・マックグレゴール博士により提供された)。プラスミドｐβ４４０は、ヒトβ−アクチン配列の４４３ｂｐを搭載している(ナカジマ−イイジマ，Ｓ.等、プロシーディング・オブ・ナショナル・アカデミー・オブ・サイエンシィズ、８２巻、６１３３−６１３７頁(１９８５年)；日本、大阪大学、コーゾー・マキノ博士により提供された)。プラスミドｐＨｃＧＡＰ(ツォ，Ｊ.Ｙ.等、ヌクレイック・アシッズ・リサーチ、１３巻、２４８５−２５０２(１９８５年))は、ヒトのグリセルアルデヒド３ホスフェートデヒドロゲナーゼ(ＧＡＰＤＨ)ｃＤＮＡの全長を運ぶものであり、メリーランド、ロックビィル、アメリカン・タイプ・カルチャー・コレクションから得られた。
ｃＤＮＡアンチセンス発現のため、ｃＤＮＡフラグメントの全長をＢamＨＩ消化により、当初クローン化したｐｃＤＳＲα△ベクターから摘出し、逆向きに、連結させた。
アガロースゲルから回収したｃＤＮＡ群を直接、子牛腸アルカリホスファターゼ処理したｐｃＤＳＲα△のＳmaＩ部位に挿入し、Ｅ．コリＭＣ１０６１またはＤＨ−１に形質転換した。アンピシリン耐性コロニーを無作為に釣り、プラスミドの大きさを測定した。これらの手順は、２−４.５ｋｂ ｃＤＮＡの挿入が、試験されたプラスミドの９０パーセント以上で起こるようになるまで繰り返された。次いで、各Ｅ.コリのコロニーをつま楊枝で釣り、５コロニーを集めて１つのｃＤＮＡプールにした。４００以上のｃＤＮＡプールを調製し、９６ウェルのミクロタイタープレート内で生育させ、１４％グリセロール中に−７０℃で保存した。ＤＮＡ分離のために、各ＤＮＡプール由来のＥ.コリを２００ml中に培養し、標準方法のエチジウムブロマイド／ＣsＣl超遠心分離(ガルガー，Ｓ.Ｊ.等、バイオケミカル・アンド・バイオフィジカル・リサーチ・コミュニケーション、１１７巻、８３５−８４２頁(１９８３年))に１回または２回かけて処理し、続いて、ＴＥ(１０mMトリスｐＨ８.０、１mMＥＤＴＡ)溶液に対して透析した。
実施例２
ＤＥＡＥ−デキストラン媒介トランスフェクションおよび一時的発現スクリーニング
若い、サイクリング繊維芽細胞(cycling fibroblast cells)を、トランスフェクション前１８時間に、ウェル当たり０.９−１.２×１０５の密度で６ウェル組織培養プレートまたは３５mm組織培養皿に接種した。トランスフェクションは、以下に記載のように微修飾して本明細書に参考として組み込んであるクレン，Ｂ.Ｒ.、ガイド・トゥ・モレキュラー・クローニング・テクニークス・メソッズ・イン・エンザイモロジー、Ｓ.Ｌ.ベルガーおよびＡ.Ｒ.キメル出版、アカデミック・プレス、６８４−７０４頁(１９８７年)；に記載されているようにして行った。
各トランスフェクションのために、ｐＣＭＶβ１００ngとｃＤＮＡプール４００ngを混合し、ホスフェート緩衝化塩水(ＰＢＳ)溶液１９０μlに懸濁し、１０mg／mlのＤＥＡＥ−デキストラン(ファルマシア、分子量５００,０００)１０μlを加えた。クローニングベクタープラスミド、ｐｃＤＳＲα△の４００ngを対照として、ｐＣＭＶβと共に用いた。細胞をＰＢＳで１度洗浄した後、ＤＮＡ溶液を加え、細胞をＣＯ２インキュベーター内で３７℃で４５分間までインキュベートした。次いで、６４μMクロロキン(シグマ、ミズーリ)を含む血清入り細胞培養培地の２mlを直接加え、更に２.５時間インキュベートした。クロロキン処理後、トランスフェクション混合物を除き、細胞を血清入り細胞培養培地中１０％ジメチルスルホキシドで、２分間処理した。細胞をその後、血清入りの新しい細胞培養培地に戻し、インキュベートして、トランスフェクションしたＤＮＡを発現させた。
トランスフェクション後１８時間で、３Ｈ−チミジン０.５μＣｉ／mlを加え、更に４８時間インキュベーションを続けた。２５％グルタルアルデヒド溶液２５μlを培養培地に加えることにより、細胞を固定し、室温で５分間インキュベートし、続いて、ＰＢＳで３回洗浄した。洗浄後、直ちに、細胞をＸ−gal反応混合物(１０mMＫＣｌを含有する０.１Ｍリン酸ナトリウム緩衝液(ｐＨ７.５)に溶解した１mMＭgＣl２、３mMＫ４［Ｆe(ＣＮ)６］、３mMＫ３［Ｆe(ＣＮ)６］、０.１％トリトンＸ−１００、および１mMＸ−gal)で、２０分間まで処理し、細胞を明青色に染色させた。Ｘ−gal染色後、細胞を水で洗浄し、乾燥して、コダックＮＴＢ核トラックエマルション(Kodak NTB nuclear track emulsion)(コダック、ニューヨーク)を用いるオートラジオグラフィーにかけた。次いで、Ｘ−gal陽性細胞におけるＤＮＡ合成活性を測定した。ＤＮＡ合成の阻害パーセントは、式：
Figure 0004397922
 を用いて計算された。
候補となるｃＤＮＡプールを個々のｃＤＮＡ群に分け、特定のＤＮＡ合成阻害ｃＤＮＡ配列群を同定するために、更にスクリーニングにかけた。
若いサイクリング細胞の核マイクロインジェクションは、(ランプキン，Ｃ.Ｋ.等、モレキュラー・セル・バイオロジー、６巻、２９９０−２９９３頁(１９８６年)、参照として本明細書に組み込んである)に記載されているようにして行った。要約すれば、５,０００−１０,０００細胞を３５mm組織培養皿の２２mm四方のエッチングした格子状カバーガラス(square etched grid coverslips)(ベルコ)上にプレートした。３日または４日後、核マイクロインジェクションを、ｐＣＭＶβ＋ｃＤＮＡプラスミドまたはｐＣＭＶβ＋ｐｃＤＳＲα△(対照として働く)のいずれかを用いて、最小３００細胞について行った。プラスミドをそれぞれ５０ng／μlの濃度で同時マイクロインジェクションした。マイクロインジェクション後１８時間で、細胞を３Ｈ−チミジンで２４時間標識し、固定し、Ｘ−galで染色し、オートラジオグラフィーにかけた。ＤＮＡ合成の阻害パーセントは、上記のように計算した。
総ＲＮＡのうち５μgまたはポリＡ＋ＲＮＡ１μgのいずれかを用いて、ノーザンブロット分析を行った。該ＲＮＡは、ホルムアルデヒド−アガロースゲル上の電気泳動によりサイズ画分され、本明細書に参照として組み込んであるマニアチス，Ｔ.等、モレキュラー・クローニング：ア・ラボラトリー・マニュアル；コールド・スプリング・ハーバー・ラボラトリー、コールド・スプリング・ハーバー、ニューヨーク(１９８２年)に記載されているように、ナイロン膜(ＩＣＮ；バイオトランス、前のポール・バイオダインＡ)に移された。放射性活性プローブをランダム・プライマー法により調製し、ブロットは、マニアチス，Ｔ.等、モレキュラー・クローニング：ア・ラボラトリー・マニュアル；コールド・スプリング・ハーバー・ラボラトリー、コールド・スプリング・ハーバー、ニューヨーク(１９８２年)に記載されているように、ハイブリダイズした。
ノーザンブロット分析により、ＳＤＩの細胞転写物の大きさはＳＤＩ ｃＤＮＡの大きさに矛盾していないということが明らかにした。このことは、首尾良く発現スクリーニングを行うには、全長ｃＤＮＡをベクターへ挿入する必要があることから、予想されるものであった。
β−アクチンまたはグリセルアルデヒドホスフェートデヒドロゲナーゼ(ＧＡＰＤＨ)プローブとの再ハイブリダイゼーションのために、使用説明書に従って、フィルターを標識プローブから繰り返し剥がした。そのデータは、アンビス・ラジオアナリティック・スキャンニング・システム(Ambis Radioanalytic Scanning System)により正確に計られた。
ＣＡＴ活性のアッセイは、以下のように測定された：
若いサイクリング細胞を３５mm皿に接種し、上記のようにプラスミド５００ngをトランスフェクションした。トランスフェクション後２４時間で、細胞を皿からこすり集め、ＣＡＴアッセイをゴーマン(ゴーマン，Ｃ.、ＤＮＡクローニング、ア・プラクティカル・アプローチ、ＩＲＬ出版、オックスフォード、イギリス、１４３−１６４頁(１９８５年)、本明細書に参考として組み込んである)により記載されているようにして行った。
実施例３
老化細胞由来のＤＮＡ合成阻害因子群(ＳＤＩ)のｃＤＮＡクローニング
二本鎖ｃＤＮＡ群は老化細胞由来ポリＡ＋ＲＮＡから合成され、若い細胞において細胞質にマイクロインジェクションした場合、ＤＮＡ合成を阻害することが示されている(ランプキン，Ｃ.Ｋ.等、サイエンス、２３２巻、３９３−３９５頁(１９８６年))。このｃＤＮＡ群は、サイズ画分され、ｐｃＤＳＲα△に挿入された。生じたＥ.コリ クローン群は、小プール群に分けた。高効率トランスフェクションにおいてさえ、実験毎に頻度が変わるため、各プール由来のプラスミドをトランスフェクションマーカープラスミド、ｐＣＭＶβと共に、同時トランスフェクションし、これにより、特定的にトランスフェクション細胞の標識指数の測定が可能になった。マーカープラスミドのトランスフェクション頻度は、３０−９０％の範囲であった。約２００のｃＤＮＡプールをスクリーニングし、５回トランスフェクションを繰り返した後、４プールがＤＮＡ合成阻害活性に対して陽性のままであった。候補となるプール群は、次いで、個々のプラスミドに分け、更にスクリーニングした。
３つの別個の陽性プラスミドクローンが得られた。ｃＤＮＡプールＡでは、１つのプラスミド、２番のみが、強力なＤＮＡ合成阻害活性を示した。同様に、プールＢおよびＣでは、１つのｃＤＮＡクローンのみが阻害を引き起こした。挿入されたｃＤＮＡの大きさは、それぞれ２.１kb、１.２kbおよび２.７kbであった。これらのｃＤＮＡ配列は、老化細胞由来の阻害因子として、それぞれＳＤＩ−１、ＳＤＩ−２、ＳＤＩ−３と呼称されている。
ＳＤＩ−１ｃＤＮＡクローン(配列番号１)のヌクレオチド配列、およびＳＤＩ−１のアミノ酸配列(配列番号２)が、決定されている。ＳＤＩ−１について本明細書に表したｃＤＮＡ配列は、Ｕ.Ｓ.特許出願番号07／808,523に記載されているものとは、２８６位に列挙されていないＧを有する点、および１８４３−１８４４位の配列がＧＣではなくＣＧである点で異なっている。今回開示した配列は、その分離と特徴がＵ.Ｓ.特許出願番号07／808,523に記載されているｐｃＤＳＲα△−ＳＤＩ−１プラスミドの再配列化により、得られたものである。ｐｃＤＳＲα△−ＳＤＩ−１プラスミドで形質転換されたＥ.コリ ＤＨ５は、１９９２年１０月１日、アメリカ合衆国、メリーランド、ロックビルのアメリカン・タイプ・カルチャー・コレクションに寄託されており、受託番号ATCC６９０８１が与えられている。
配列が、本明細書に記載のＳＤＩ−１ヌクレオチド配列の一部に対応する核酸分子は、アダムス,Ｍ.Ｄ.ら(ネーチャー、355:632-634(1992))により報告されている無作為遺伝子配列の中から同定されている。
実施例４
若いサイクリング細胞へのＳＤＩ配列群マイクロインジェクション
ＳＤＩ配列群の機能活性を立証するために、マイクロインジェクションを行った。ＳＤＩ−１またはＳＤＩ−２のいずれかを搭載したプラスミドをマーカープラスミドと共に、若いサイクリング細胞の核内へ同時マイクロインジェクションした。生じた青色細胞の標識指数を測定した(表１)。これらのプラスミドは、若い細胞のＤＮＡ合成に強力な阻害活性を示した。対照実験のために、空のベクターを、マーカープラスミドと共に、同時マイクロインジェクションした。これは、標識指数を非インジェクション細胞と比べた場合、わずかに阻害を引き起こしており、トランスフェクション実験では観察される現象でもある。ＳＤＩ−３のマイクロインジェクションは、阻害活性がＳＤＩ−１およびＳＤＩ−２トランスフェクション実験よりも低かったため、行わなかった。
正常ヒト繊維芽細胞に加えて、ＳＤＩ−１分子は、また幾つかの腫瘍細胞型(メラノーマ、肺腫瘍および乳腫瘍等)および不死化ＳＶ４０形質転換繊維芽細胞およびＣＨＯ細胞のＤＮＡ合成阻害が可能であることが分かった。ＳＤＩ−１分子は、また正常ウシ肺動脈平滑筋におけるＤＮＡ阻害も可能であった。
Figure 0004397922
実施例５
アンチセンスＤＮＡトランスフェクション
阻害活性が配列指向特異的であるかどうかを試験するために、ＳＤＩ−１およびＳＤＩ−２配列のアンチセンス発現ベクターを構築した。いずれの配列もＢamＨＩ部位を欠いていたこと、また、ＢamＨＩ部位は、ｃＤＮＡの両方の末端に存在した(図１)ことから、これらの配列は、容易に摘出され、反対方向に再連結された。アンチセンス配列のトランスフェクションは、結果的に若い細胞におけるＤＮＡ合成を阻害しなかった(図３)。加えて、何等増大も観察されなかった。その結果は、明らかに、ＳＤＩ活性の配列指向特異性を示しており、また、ｃＤＮＡ配列群によりコードされる特異的遺伝子産物群の存在を示唆している。
正常ヒト繊維芽細胞および多くの他の細胞は、好適な成長因子の欠損下でＤＮＡ合成を止める。ＳＤＩ−１は、ＤＮＡ合成開始の重要な陰性制御因子であるため、ＳＤＩ−１に対するアンチセンスである分子は細胞のＳ相への移行と原因となることができる。この能力を証明するために、数種の正常ヒト細胞系を単離し、ＳＤＩ−１アンチセンス分子を提供した(ＳＤＩ−１ｃＤＮＡの、メタロチオネインプロモーターを有するベクター中での発現およびアンチセンス配向)。
この目的のために、アンチセンス発現ベクターを、ＳＤＩ−１アンチセンス配列の、置換ヒトメタロチオネインプロモーターを含む誘発可能発現ベクターであるＰＭＥＴへのクローニングにより構築した。ＰＭＥＴ中の、メタロチオネインプロモーターは、ｐＭ２６由来であり、基底(basal)プロモーターに欠損を含み、合成メタル反応因子の３重の添加を有した(マックニール，Ｊ．ら、ジーン、76:81-88(1989))。ＰＭＥＴの構築のために、Ｅ１Ａ遺伝子１２Ｓおよび１３Ｓイントロン(ヌクレオチド９１７−１６７３)を含むアデノウイルス配列を、最初に哺乳類発現ベクターＰＲＣ／ＣＭＶ(インビトロゲン)の、このプラスミドの多重クローニング領域のＮot Ｉ／Ａpa Ｉ部位にクローン化し、ｐＲｃ／ＣＭＶ−Ａｄを創造した。Ｅ１Ａの翻訳が起こっておらず、このベクターにＳpe Ｉクローニング部位が産生されていることを確認するために、停止コドンを含むＳpeＩリンカーをＣＭＶプロモーターと、Ｅ１Ａ配列の枠内のＥ１Ａスプライス配列の間に挿入した。プラスミドＲｃ／ＣＭＶ−ＡｄのＣＭＶプロモーターを、次いでｐＭ２６プロモーターで置換し、ＰＭＥＴを産生した。これを成し遂げるために、メタロチオニンプロモーターを、ＢｇIII消化によりｐＭ２６から削除し、pBlueScript(pBS;Stratagene)のＢamＨＩ部位に挿入した。プロモーターを含むＥcoＲＶおよびＮotＩフラグメントを、次いでｐＢＳから充填ＢgIII部位およびＮotＩ部位へサブクローン化した。ＳＤＩｃＤＮＡのアンチセンス配列は、ｐＢＳのＢamＨＩ部位にクローン化した完全長ｃＤＮＡ由来である。ヌクレオチド１２７のＳtuＩ部位を、ＳpeＩリンカーの挿入によりＳpeＩ部位に変え、ＳＤＩＳＰＥ１２７を製造した。ＳpeＩリンカーはまたヌクレオチド３１８のＡpaＩ部位に挿入され、ＳＤＩＳＰＥ３１８を製造した。これらの構築物を、ＳpeＩで消化し、アンチセンス配向で、ＰＭＥＴのＳpeＩクローニング部位に挿入し、このようにしてｐＭＥＴ−ＡＳ１２７およびｐＭＥＴ−ＡＳ３１８を製造した。
ＳＤＩ−１アンチセンスを発現する細胞系を、細胞がトランスフェクション以後再接種されない以外、チェン，Ｃ．ら、モレキュラー・アンド・セルラー・バイオロジー、7:2745-2752(1987)に記載の、ＢＥＳ／ＣａＰＯ４方法を使用してカルシウムリン酸トランスフェクションにより得た。ＰＤ１０のＨＣＡ２細胞(３×１０５)を、ＰＭＥＴ、ｐＭＥＴＡＳ１２７、またはｐＭＥＴＡＳ３１８ＤＮＡ２０μgでトランスフェクションした。２週間のＧ４１８選択の後、コロニーを取り、広げた。挿入配列の誘発および統合性を、１００μＭ ＺnＣl２および２μＭ ＣdＣl２を加え、続いてＲＮＡ分析することにより試験した。安定な形質転換体由来の全細胞ＲＮＡのＲＮＡ分析は、アダミ，Ｇ．ら、EMBOジャーナル、10:3457-3465(1991)に記載のように［３２Ｐ］−ＵＴＰで内部標識したアンチセンスＲＮＡプローブを使用して、ＲＮＡse保護により行った。ＳＤＩ−１ヌクレオチド４４４−６８６を含むプローブｐＭＥＴ＋ＳＤＩ−１を、トランスフェクション遺伝子および内因性ｍＲＮＡの両方からのＳＤＩ−１発現の測定に使用した。ＥcoＮＩ消化の後、ＰＭＥＴベクター中のＳＰ６プロモーターの転写は、発現発現ベクターおよび内因性ＳＤＩｍＲＮＡの両方とハイブリダイズするアンチセンス標識プロウブをもたらす。これは、挿入構築物およびＳＤＩ−１内因性ＲＮＡ由来の発現の相対的濃度の比較を可能にする。すべての検定において、制御β−アクチンｍＲＮＡとして測定される。ヌクレオチド２１２４−２１８９を含むアクチンプローブを、ｐＢＳのＥcoＲｉと充填ＢamＨＩ部位の間に挿入する。
安定にトランスフェクションされた細胞を、成長因子低濃度(０.５％ウシ胎児血清)を含む培地に７−１０日置き、トリチル化チミジンで２４時間パルス標識した場合、標識取り込みは５％より少ない。しかしながら、アンチセンスＳＤＩ−１を、トリチル化チミジンの添加２４時間前にＺｎＣｌ２およびＣｄＣｌ２の添加により誘発した場合、２５％以上の細胞が、標識取り込みにより、新ＤＮＡの合成の開始が見られ、したがって増殖の能力を回復していることが分かった。
この実験は、本発明のアンチセンス配列が、このような処置がなければ老化するであろう細胞の不死化に使用できることを示す。
実施例６
細胞老化中のＳＤＩ ｍＲＮＡの発現
細胞老化中のＳＤＩ ｍＲＮＡ発現における変化を調べるために、若い細胞および老化細胞由来の総ＲＮＡを３２Ｐ−標識ＳＤＩ ｃＤＮＡプローブとハイブリダイズさせた。このＳＤＩ−１プローブは、２.１kb細胞転写物とハイブリダイズし、ＳＤＩ−２は１.４kb転写物とハイブリダイズし、ＳＤＩ−３は２.５kb転写物とハイブリダイズした(表２)。表２は、若い細胞(Ｙ)と老化細胞(Ｓ)におけるＳＤＩ遺伝子発現の総ＲＮＡノーザン定量分析値を与えるものである。若い細胞および老化細胞由来の総ＲＮＡの各５μgをＳＤＩプローブとハイブリダイズさせた。フィルターは、繰り返し、放射性活性プローブから剥がして、内部対照としてプローブと再ハイブリダイズさせた。各試料におけるＳＤＩ ｍＲＮＡの相対量は、同じフィルター上に検出されるＧＡＰＤＨ量と、ＳＤＩ／ＧＡＰＤＨの相対量により標準化された。
Figure 0004397922
細胞老化中、ＳＤＩ−１情報は約３倍増加したが、一方ＳＤＩ−２およびＳＤＩ−３情報は３分の１に減少した。同じフィルターをβ−アクチンと再ハイブリダイズさせ、次いで内部対照としてＧＡＰＤＨプローブと再ハイブリダイズさせた。その結果は、いずれの対照遺伝子の発現も細胞老化中に、約３分の１に減少したことを示していた。以前の研究では、細胞老化中β−アクチン発現が２−３分の１に減少することが観察されている(クマザキ，Ｔ.等、イクスペリメンタル・セル・リサーチ、１９５巻、１３−１９頁(１９９１年)；セシャドリ，Ｔ.およびキャンピシ，Ｊ.、サイエンス、２４７巻、２０５−２０９頁(１９９０年)；ファース，Ｊ.Ｊ.、ジャーナル・オブ・ゲロントロジー、４６巻、Ｂ１２２−１２４頁(１９９１年))。老化細胞においてβ−アクチンおよびＧＡＰＤＨ遺伝子の発現がいずれも減少したことから、ノーザン分析用にポリＡ＋ＲＮＡを使用することになった。ポリＡ＋ＲＮＡを、表２で用いられた総細胞ＲＮＡ調製物から分離し、ＳＤＩ ｃＤＮＡとハイブリダイズさせ、続いてβ−アクチンおよびＧＡＰＤＨそれぞれとプローブした(表３)。表３は、若い細胞(Ｙ)と老化細胞(Ｓ)におけるＳＤＩ遺伝子発現のポリＡ＋ＲＮＡノーザン分析の結果を開示するものである。若い細胞と老化細胞由来のポリＡ＋ＲＮＡの各１μgを分析に用いた。各試料におけるＳＤＩ ｍＲＮＡの相対量は表２のように計算した。
Figure 0004397922
その結果は、明らかに、β−アクチンとＧＡＰＤＨの両方の発現は、それらをｍＲＮＡに基づき比較した場合、以前の観察に一致して、若い細胞と老化細胞とで等しいことを示した。ＳＤＩ遺伝子発現をｍＲＮＡレベルで比較した場合、ＳＤＩ−１ ｍＲＮＡは、老化細胞では１１倍増加し、それに対し、ＳＤＩ−２およびＳＤＩ−３の発現は、イン・ビトロでの寿命を通して一定に保たれた(表３)。この結果は、ＳＤＩ−１が老化細胞特異的ＤＮＡ合成阻害因子であり、それに対し、ＳＤＩ−２とＳＤＩ−３は、細胞サイクル調節に関係するより一般的な阻害因子であることがほぼ間違いないと思われる。
実施例７
細胞老化中のポリＡ ＲＮＡ含量の変化
ポリＡ＋ＲＮＡノーザン分析対総ＲＮＡノーザン分析の結果が定量的に異なるという観察は、総ＲＮＡ調製物中のポリＡ＋ＲＮＡ含量が、細胞老化中に変化したのかも知れないことを示した。この仮説を試験するために、細胞を連続的に培養し、総ＲＮＡを異なる集団倍加レベルで集めた。ポリＡ＋ＲＮＡは、各試料から分離された。
結果は明らかにポリＡ＋ＲＮＡ含量が細胞老化中に次第に減少したことを示していた(図４)。図４では、細胞を連続的に培養し、総ＲＮＡを集めた。ポリＡ＋ＲＮＡ：総ＲＮＡ％を培養齢(イン・ビトロでの寿命終了％)に対してプロットした。老化細胞は、非常に若い細胞と比較した場合、３−４分の１に少ないポリＡ＋ＲＮＡを有していた。しかしながら、細胞当たりの総ＲＮＡ含量を計算した場合、老化細胞は、若い細胞より１.３−１.５倍多く有していた(クリストファロ，Ｖ.Ｊ.およびクリチェフスキー，Ｄ.、メディカル・イクスペリメンス、１９巻、３１３−３２０頁(１９６９年)参照)。
ＳＤＩ−１情報が継代培養中、次第に増加するのかどうか、また、迅速な増加が、イン・ビトロでの寿命の終了する間際に起こるのかどうかを判定するために、異集団倍加での培養物由来のポリＡ＋ＲＮＡを３２Ｐ標識ＳＤＩ−１プローブとハイブリダイズさせた。この分析から、ＳＤＩ−１発現は、培養物が老化するにつれて増加し、最期の数パーセント中に大きく変化することが明らかになった(表４)。表４は、細胞加齢過程中のＳＤＩ−１ ｍＲＮＡの蓄積を示している。異集団倍加の細胞由来のポリＡ＋ＲＮＡの各１μgをＳＤＩ−１プローブとハイブリダイズさせた。各試料中のＳＤＩ−１ｍＲＮＡ相対量は、表２と同様に計算した。
Figure 0004397922
静止中のＳＤＩ−１発現における変化もまた調べた。若い静止細胞を０.５％ウシ胎児血清(ＦＢＳ) 含有培地中に、３週間まで保持した。総ＲＮＡを各週集め、ＳＤＩ−１プローブとハイブリダイズするＲＮＡ量を分析した。ＳＤＩ−１情報は、細胞静止中顕著に増加した(表５)。表５は、細胞静止中のＳＤＩ−１ ｍＲＮＡの蓄積を示している。０.５％ＦＢＳ含有培地で１、２、３週間培養した若い細胞から得られた総ＲＮＡの各４μgを、ＳＤＩ−１プローブとハイブリダイズさせた。ＳＤＩ−１ ｍＲＮＡの相対量は、表２と同様に計算した(Ｃ：１０％ＦＢＳ培地での対照培養)。その結果をＧＡＰＤＨ発現に対して標準化すると、ＳＤＩ−１発現は、２週間後、１０％ＦＢＳ培地における対照分配培養の値と比較して低血清培地で１８倍増加したことが見い出された。
Figure 0004397922
ｍＲＮＡ対総ＲＮＡの細胞表現(cellular representation)が、細胞老化中に変化することが見い出された事実は、重要である。イン・ビトロでの加齢の過程中に、細胞当たりの総ＲＮＡが僅かに増加するにも拘わらず、ｍＲＮＡ含量は、次第に減少することが分かった(図４)。この現象は、細胞加齢の過程中、全遺伝子発現が次第に低下することを示しており、また、ノーザンブロット分析を総ＲＮＡで行った場合に、老化細胞においてβ−アクチンとＧＡＰＤＨ遺伝子の発現が低下したことを説明するものである(表２)。しかしながら、若い細胞と老化細胞の間のこれらのハウスキーピング遺伝子(housekeeping genes)の発現レベルは、ノーザンブロット分析をポリＡ＋ＲＮＡで行った場合では、ほとんど一定であった(表３)。この分析により、ＳＤＩ−１情報は、老化細胞において強力に発現し、ＳＤＩ−２およびＳＤＩ−３遺伝子はイン・ビトロでの寿命を通して変化無く発現することが明らかになった。
実施例８
ＳＤＩ−１遺伝子
ＳＤＩ−１遺伝子は、老化細胞特異的ＤＮＡ合成阻害因子をコードする。この遺伝子の発現増加は、細胞がそれらの最終の数分裂期に入った時に起こる(表４)。発現動態は、老化細胞の表現型発現とよく相関している。ＳＤＩ−１遺伝子発現もまた、若い細胞を血清欠乏により静止させ、分裂しないようにした後に、増加することが見い出された。この結果は、老化と同じく細胞静止のＤＮＡ合成阻害においてもこの遺伝子が関与することを示している。血清成長因子の欠乏により静止状態にされた細胞が、老化細胞由来の阻害因子と同様の特徴を持つＤＮＡ合成阻害因子を生産することが示されている(ペレイラ−スミス，Ｏ.Ｍ.等、イクスペリメンタル・セル・リサーチ、１６０巻、２９７−３０６頁(１９８５年)；ステイン，Ｇ.Ｈ.およびアトキンス，Ｌ.、プロシーディング・オブ・ナショナル・アカデミー・オブ・サイエンシィズ・ＵＳＡ、８３巻、９０３０−９０３４頁(１９８６年))。
ＳＤＩ−１発現が老化中および静止中のいずれもで増加するという事実は、それがＤＮＡ合成阻害因子であることを示している(スミス，Ｊ.Ｒ.、ジャーナル・オブ・ゲロントロジー、４５巻、Ｂ３２−３５頁(１９９０年)；本明細書に参照して組み込んである)。あるいは、ＳＤＩ−１配列群は、最近マウス細胞からクローン化された成長停止に特異的な遺伝子群と関係があるかも知れない(シュナイダー，Ｃ.等、セル、５４巻、７８７−７９３頁(１９８８年)；マンフィオレッチ，Ｇ.等、モレキュラー・セル・バイオロジー、１０巻、２９２４−２９３０頁(１９９０年))。
実施例９
ＳＤＩ−１遺伝子生産物の発現
２種の異なる細菌性発現系において発現されたＳＤＩ−１ ｃＤＮＡを、イン・ビトロで転写させ、２種の異なるイン・ビトロ系で翻訳させた。２種の細菌性発現系は、十分量のＳＤＩ−１タンパク質を得る確率を最大限にするために用いた。第一の発現系では、ＳＤＩ−１タンパク質は、グルタチオンＳ−トランスフェラーゼ融合タンパク質として、細菌培養物のリットル当たり５−１０μgの収率で発現した。組換えタンパク質をトロンビンで切断し、精製して、数個の余分なアミノ酸を持つＳＤＩ−１タンパク質を得ることが出来た。ＧＳＴ融合体をシストソマ・ジャポニカム(Schistosoma japonicum)ＧＳＴ−コード化ポリヌクレオチドをＢamＨＩで開裂することにより形成し、ＧＳＴ−コード化配列の１−６７３ヌクレオチドを含む開裂フラグメントを産生した。ＧＳＴ−ＳＤＩ融合タンパク質は、遺伝子融合体の組換え発現により製造した。
第二の発現系では、精製を助けるために６ヒスチジンアミノ末端部(terminal tag)を利用した。この組換えタンパク質は、更に手を加えること無く、使用できる。いずれの系でも、純粋なタンパク質調製物を分離可能であった。
この実験の過程では、イン・ビトロでの転写および翻訳系を用いて、ＳＤＩ−１ ｃＤＮＡの核酸配列から演繹される転写解読枠(open reading frame)を確認した。ＳＤＩ−１タンパク質の計算による分子量は、約１６,０００ダルトンである。イン・ビトロで合成されたタンパク質は、ＳＤＳ ＰＡＧＥにより、約２１,０００ダルトンの相対移動度で移動する。この小さな違いは、ＳＤＩ−１の僅かに異常な電荷またはコンホーメーションが原因であり得る。細菌的に発現したタンパク質の部分的なアミノ酸配列は、転写解読枠を立証するものであった(配列番号２)。
細菌的に発現したタンパク質は、無傷の天然タンパク質に対するポリクローナル抗血清およびモノクローナル抗体を発生させるために用いられた。このような抗体は、ＳＤＩ−１タンパク質およびＳＤＩ−１タンパク質複合体(complex)の免疫沈降において、合成ペプチドから生産された抗血清よりも効果的であり得る。予備的な免疫細胞化学研究は、１：２０,０００希釈でのウエスタン・トランスファ(a western transfer)で融合タンパク質と強力に反応する最も高親和性の抗血清(抗血清ナンバー５５)を用いて、ＳＤＩ−１タンパク質が、分裂中の若い細胞と比較して老化細胞において相対的に豊富であることを示唆した。老化細胞において、その位置は、核周囲であるように見えるのに対し、若い細胞では、核内に位置した少量のＳＤＩ−１タンパク質であるように見える。特異的に染色させるには、検出可能なレベルのＳＤＩ−１ ｍＲＮＡを発現しない細胞(ＴＥ８５)の固定化細胞単層に対する抗血清を前以て吸収する必要があった。当該細胞は、４％パラホルムアルデヒド、次にメタノールで固定した。
通常、低レベルで遺伝子を発現する細胞において引き起こされたＳＤＩ−１ ｍＲＮＡの発現から生じる細胞表現型を研究し、アンチセンスＳＤＩ−１構築物の効果を調べるためには、ＳＤＩ−１遺伝子が誘導プロモーターの制御下、安定に調整される細胞ラインを得ることが望ましい。この目標のために、メタロチオニンプロモーターの制御下、ＳＤＩ−１を含有する機能的ベクターを構築した。この構築物を若い増殖コンピテント細胞にトランスフェクションした後、１００μM塩化亜鉛と２μM塩化カドミウムの存在下でインキュベーションして、ＤＮＡ合成の開始を約５０％まで阻害した。金属の不存在下では、ＤＮＡ合成の阻害は無かった。対照ベクター(ｐｃＤＳＲα)と共にトランスフェクションし、金属の存在下で成長させた細胞は、金属の不存在下で成長させた同じプラスミドと共にトランスフェクションした細胞の約９０％のＤＮＡ合成能力を有することが見い出されていることから、観察された阻害活性は、金属毒性が原因ではない。
ＳＤＩ−１で観察された阻害効果が発現を駆動するために用いられた特定のプロモーターの性質に関連していないことを示すために、他のプロモーターから発現された、ＳＤＩ−１のＤＮＡ合成阻害能力を調査した。それ故に、若い増殖性ヒト繊維芽細胞をＣＭＶ−β−galおよびＣＭＶ−ＳＤＩ−１と共に同時トランスフェクションした。ＣＭＶ−β−galと細胞のトランスフェクションは、ＤＮＡ合成にほとんど影響しなかったが、一方、ＣＭＶ−ＳＤＩ−１は、これらの特定の実験におけるｐｃＤＳＲαベクターでのＳＤＩ−１よりも効果的でさえあった。
ＳＶ４０ラージＴ抗原は、老化細胞を誘導してＤＮＡを合成させる能力がある。それ故に、ＳＤＩ−１の阻害作用が、Ｔ抗原の発現により克服され得るかどうかを決定することは、興味深いものであった。更に、ＳＤＩ−１の作用が細胞における一般的な代謝不均衡の誘導のせいではないことを決定することが望まれていた。もし、そうであれば、誰もラージＴ抗原がその効果と拮抗するとは予想しないであろう。これらの理由により、細胞を、ＳＤＩ−１ｃＤＮＡ、およびＴ抗原がその中でＣＭＶプロモーターにより駆動されるベクターと共に同時トランスフェクションした。このような同時トランスフェクション実験により、ＳＤＩ−１の阻害活性は、ＳＶ４０ラージＴ抗原の同時発現により大幅に破壊されることが明らかになった。
一時的トランスフェクションアッセイ(Transient transfection assays)は、追加のヒト正常繊維芽細胞細胞ライン(新生児包皮細胞ライン(ＣＳＣ３０３))およびＷＩ３８不死細胞ラインを用いて実施し、ＳＤＩ−１の大部分の阻害効果の普遍性を判定した。いずれの場合でも、かなりの阻害(４０−５０％)が観察された。更に、ＳＤＩ−１は、ＳＶ４０形質転換細胞ラインＧＭ６３９またはヒーラ細胞（＜２０％)だけでなくＳＵＳＭＩ(４０％)を阻害することが分かった。ここまでの結果は、ヒーラ細胞およびＳＶ４０ウイルスで形質転換された細胞が老化細胞と融合することによって阻害されないという、ヘテロカリオン実験から得られた以前の結果と一致している。このことは、ＳＤＩ−１が、老化細胞において以前に検出された阻害因子と同様の挙動をすることの更なる証拠を与えるものである。
実施例１０
ＳＤＩ−１遺伝子のサザン分析
ＳＤＩ−１の不存在または不活性が不定分裂に対する４種の相補グループのいずれかにおける細胞不死化性の要因なのかどうかを判定するために、染色体ＤＮＡとｍＲＮＡを４種のグループを代表する細胞ラインから調べた。サザン分析により、Ｅco ＲＩでの消化後、予想された５および１０kbバンドが明らかになった。それ故に、これらの細胞ラインのＳＤＩ−１遺伝子中では大きな欠失または転位は全く起っていない。ノーザン分析により、ＳＤＩ−１ｍＲＮＡは、相補グループＢおよびＣに割り当てられている細胞ライン中においては、少量かまたは存在しないことが測定された。ＳＤＩ−１は、相補グループＡおよびＤを代表する細胞ラインにおいては、より高いレベルで存在した。この結果は、細胞ラインが細胞老化をのがれ得るような機構の一部が、活性ＳＤＩ−１遺伝子の充分なレベルを発現する能力の欠損によることを示唆している。
実施例１１
ＳＤＩ配列の特性検定
機能的スクリーニング法を用いることにより、新規ＤＮＡ合成阻害遺伝子ＳＤＩ−１が同定された。この遺伝子は、非増殖性ヒト２倍体繊維芽細胞から高レベルで発現される。正常ヒト細胞培養物をインビトロで加齢させると、ＳＤＩ−１のメッセージレベルは１０〜２０倍に増加し、発現反応動態は細胞老化の表現型発現と緊密な相関関係を示した。さらに、成長因子妨害により細胞を静止状態にすると、ＳＤＩ−１メッセージは増加した。
上記結果は、ＳＤＩ−１が、細胞周期制御に重要な新規生理学的活性遺伝子産物をコードすることを示している。遺伝子発現は、刺激されて細胞周期に入った細胞において、Ｇ０期からＳ期へ入る間に調整される。さらに、アンチセンスＳＤＩ−１メッセージの発現によって、細胞が刺激され、成長因子の非存在下で細胞周期に入る。負の成長調節因子ｐ５３およびＲｂにより観察される場合と同様に(レーン、Ｄ.Ｐ.等、「ネイチャー」２７８：２６１−２６３（１９７９)、リンツェル、Ｄ.Ｉ.Ｈ.等、「セル」１７：４３−５２（１９７９）、デ・キャプリオ、Ｊ.Ａ.等、「セル」５４：２７５−２８３（１９８８））、ＳＶ４０ Ｔ抗原がＳＤＩ−１の阻害活性を打ち消し得るという観察結果から、細胞周期の調節におけるこの遺伝子産物の重要性が強調される。
本発明の組換えＳＤＩ−１タンパク質は、ＣＤＫ２によるヒストンＨ１のリン酸化を阻止する。ＳＤＩ−１がＤＮＡ合成を遮断することから、この発見は、ヒストンＨ１のリン酸化がＤＮＡ合成の開始においてある役割を有することを示している。
ＳＤＩ−１遺伝子産物はまた、ＣＤＣ２、ＣＤＫ２およびＣＤＫ４を含む幾つかのサイクリン依存性キナーゼの強力な阻害物質である。ヒト細胞抽出物を用いた類似実験において、組換えＳＤＩ−１は、ＣＤＫ２キナーゼ活性を阻害することが見いだされた。これらの結果は、細胞周期の進行に関与する様々なタンパク質に関して知られていることを考慮すると特に重要である。Ｇ１サイクリン類を欠く出芽酵母株を補足する能力により同定された（キショング、Ｙ.等、「セル」６５：６９１−６９９（１９９１）、ルー、Ｄ.Ｊ.等、「セル」６５：１１９７−１２０６（１９９１）、キショング、Ｙ.等、「カレント・バイオロジー」１：３６２−３６４（１９９１）、コフ、Ａ.等、「セル」６６：１２１７−１２２８（１９９１））、幾つかのヒトＧ１サイクリン候補（サイクリンＣ、ＤおよびＥ）は、調節された細胞周期であることが見いだされており、最大ｍＲＮＡ発現はＧ１における様々な時点で行われていた（ルー、Ｄ.Ｊ.等、「セル」６５：１１９７−１２０６（１９９１））。Ｄ型サイクリン類およびサイクリンＥは活性キナーゼ複合体とアソシエートするため（コフ、Ａ.等、「セル」６６：１２１７−１２２８（１９９１）、１９９２、デュリック、Ｖ.等、「サイエンス」２５７：１９５８−１９６１（１９９２）、マツシメ、Ｈ.等、「セル」６５：７０１−７１３９（１９９１）、エーベン、Ｍ.Ｅ.等、「セル」７３：４８７−４９７６（１９９３）、カトウ、Ｊ.Ｙ.等、「ジーンズ・デベロップメント」７：３３１−３４２（１９９３））、これらのキナーゼ類は、「限定点」での新たな１回の細胞分裂に対する哺乳類細胞の責任（commitment）においてある役割を有すると思われる（パーディー、Ａ.Ｂ.、「サイエンス」２４６：６０３−６０８（１９８９））。事実、最近の報告では、サイクリンＥ−ＣＤＫ２キナーゼ複合体がＧ１後期およびＳ期初期において最大活性を有し（デュリック、Ｖ.等、「サイエンス」２５７：１９５８−１９６１（１９９２）、コフ、Ａ.等、「セル」６６：１２１７−１２２８（１９９１））、また培養されたヒト細胞（ヒンズ、Ｐ.Ｗ.等、「セル」７０：９９３−１００６（１９９２））およびインビトロ（エーベン、Ｍ.Ｅ.等、「セル」７３：４８７−４９７６（１９９３））においてＰＢタンパク質をリン酸化する能力を有することが示されている。これは、キナーゼが細胞周期のＧ１からＳ期への移行の調節において中軸的役割を演じ得ることを示唆している。
ＳＤＩ−１タンパク質のイムノブロットにより、このタンパク質のレベルが、異なる成長状態の細胞においては（すなわち活発に成長中の細胞対静止または老化細胞では）それほど変動するとは思われないことが示された。しかしながら、一貫して高水準量のタンパク質は、増殖中の細胞よりも非分裂細胞に存在する。ＳＤＩ−１がＣＤＫ活性の強力な負の調節因子であることから、これは当然だと思われ、この阻害因子の厳重な調節は、適切な細胞周期調節および進行に不可欠である。阻害因子タンパク質の量が小さく変化しても、それに制御される様々な遺伝子産物には重大な影響がもたらされ得る。少なくとも２種のＣＤＫ、すなわちＣＤＣ２およびＣＤＫ２は、ｍＲＮＡにおける細胞周期相依存性変化にもかかわらず、細胞周期を通して比較的一定した定常状態のタンパク質レベルを維持している。ＳＤＩ−１は、ＳＤＩ−１タンパク質のレベルが特定レベルで正確に制御され、ＳＤＩ−１の阻害作用を克服して細胞周期を通した進行を可能にするのに新規ＣＤＫ／サイクリン合成および活性化が必要とされる形で、同様に調節され得る。すなわち、要求されるいき値の刺激性遺伝子産物が存在するまでＳＤＩ−１は細胞周期へ入るのを阻止し、細胞周期の「限定点」を通って細胞分裂を進行させる。活性ＣＤＫ／サイクリン複合体および阻害因子ＳＤＩ−１タンパク質間のかかる動的平衡は、アンチセンスＳＤＩ−１ ｍＲＮＡ発現に起因するＳＤＩ−１タンパク質の定常状態レベルが小さく減少した後に静止細胞で観察されたＤＮＡ合成の刺激を説明している。すなわち、ＳＤＩ−１は、他の細胞増殖阻害因子、例えば腫瘍抑制遺伝子ｐ５３およびＲｂと類似した形で細胞において機能し得、ＳＤＩ−１遺伝子は様々な腫瘍での突然変異に関する標的であり得る。
老化細胞は、有糸分裂促進物質を加えることにより刺激されてもＳ期へは入り得ないが、それらは、サイクリン類Ｄ１、サイクリンＥ、ＣＤＫ２、Ｒｂ、ｐ５３、ｃ−Ｈ−ｒａｓ、ｃ−ｍｙｃ、ｃ−ｊｕｎおよびｊｕｎＢを含む多くの細胞周期調節遺伝子に対するｍＲＮＡを発現しない。しかしながら、ｃ−ｆｏｓ、ヒストンＨ３、ＣＤＣ２、サイクリンＡ、サイクリンＢ１およびＰＣＮＡを含む、幾つかの他の重要な細胞周期調節遺伝子は、有糸分裂促進物質刺激老化細胞では発現されない。老化細胞における網膜芽腫感受性遺伝子Ｒｂのタンパク質産物のリン酸化の欠如は、老化細胞がＤＮＡを合成し得ない一つの原因で有り得る。しかしながら、サイクリンＥ−ＣＤＫ２複合体は、比較的老化細胞に富むが、インビボでＲｂを潜在的にリン酸化し得るキナーゼ活性を欠いている。
本発明のＳＤＩ分子は、活発に細胞分裂している細胞よりも老化細胞での方が高いレベルで発現される。すなわち、ＳＤＩ−１の調節作用による適切なＣＤＫ活性の欠如は、老化細胞がＳ期へ入り得ないことの主たる理由であり得る。これは、老化細胞が、主としてＣＤＫ２の仮定的ＳＤＩ−１媒介阻害の下流の事象において欠失しているという事実により裏付けされる。
Ｅ２Ｆ−１、即ち広い範囲の標的遺伝子を有するＥ２Ｆ−１転写因子の一成分の過剰発現により、ＳＤＩ−１伝達による阻害作用が打ち消され得ることが見いだされた。腫瘍抑制遺伝子Ｒｂおよび関連ｐ１０７タンパク質がＥ２Ｆ−１と複合体を形成して転写を阻害することは、充分に確立されている。サイクリンＡおよびＥの過剰発現により、増殖のｐＲｂ媒介による抑制は打ち消される。さらに、Ｅ２Ｆ−１の過剰発現により、静止ＲＥＦ−５２細胞によるＤＮＡ合成が誘導され得る。すなわち、Ｅ２Ｆ−１がＳＤＩ−１の負の成長活性を打ち消すという観察結果を考慮に入れると、Ｅ２Ｆ−１は、ｐ５３、ＳＤＩ−１およびＲｂにより制御される事象のカスケードにおける最終段階であり得る。
実施例１２
細胞腫瘍抑制因子およびＳＤＩ配列間の関係
細胞周期停止状態におけるＳＤＩ−１に関する役割は、血清排除されたまたは高密度への成長により静止状態にされた正常ヒト細胞では、ＳＤＩ−１ ｍＲＮＡレベルが細胞分裂中の細胞の場合と比べて１０−２０倍に増加したという事実により示されている。しかしながら、血清を加えると、ＳＤＩ−１ ｍＲＮＡレベルは、ＤＮＡ合成の開始直前に低レベルまで急速に減少することが見いだされた。すなわち、ＳＤＩ−１は、「チェックポイント」として作用し、不利な外部条件の存在下で細胞増殖を阻害すると思われる。多くの不死セルラインは、不充分な成長因子に応じたＤＮＡ合成の開始を遮断することができない。しかしながら、本発明によると、様々な不死ヒト細胞においてＳＤＩ−１が過剰発現することにより、低下した成長因子に応じた細胞増殖を停止させる能力とは関係なくセルラインの幾つかにおいてＤＮＡ合成が阻害される。
ＳＤＩ−１の過剰発現およびＳＤＩ−１の過剰発現による細胞増殖の阻害間の生理学的意義は、ＳＤＩ−１がサイクリン／ｃｄｋ２複合体のキナーゼ活性を阻害し得るという発見により強化される。事実、指示された通り、サイクリン／ｃｄｋ２複合体（ｃｄｋ２抗血清によりヒーラ細胞抽出物から免疫沈降した）へ２５０ｎｇの純化ＧＳＴ−ＳＤＩ−１融合タンパク質を加えると、ヒストンＨ１キナーゼ活性の半最大阻害が得られた。
ＳＤＩ−１によるその抗増殖活性の伝達を介している分子機構をさらに調査するため、ＭＤＡＨ ０４１を含む若干の不死セルラインにおいてＳＤＩ−１ ＲＮＡの定常状態レベルを評価した。ＭＤＡＨ ０４１セルラインは、リィ−フロウメニ症候群患者から誘導されたもので、ｐ５３を合成しない。これらの細胞は、低血清成長因子の存在下においてＤＮＡを合成し続け得ることが見いだされた。
ノーザン分析によりＳＤＩ−１レベルを測定し、ＧＡＰＤＨまたはβ−アクチンｍＲＮＡに正規化した。電気穿孔によりＤＮＡを導入した。急速に成長している細胞をトリプシン化し、１０μｇの担体ＤＮＡ、β−ガラクトシダーゼ遺伝子をコードするｐＣＭＶｂ（マクグレガー、Ｇ.Ｒ.等、「ヌクレイック・アシッズ・リサーチ」１７：２３６５（１９８９））１μｇおよび１μｇのｐＣＭＶＳＤＩ−１（ＳＤＩ−１のヌクレオチド１−６８５を含む）を含むリン酸緩衝食塩水０.５ｍｌに１０６細胞を再懸濁した。プラスミドｐＣＭＶｂは、外因性ＤＮＡを組み込み、発現し得る細胞を検出するためのマーカーとしての役割を果たした。２５０−３５０ボルトのパルス後、３×１０５細胞を３５ｍｍ細胞培養皿に播種した。三重水素化チミジン（１μＣｉ／ｍｌ）を、電気穿孔の２４−３０時間後培養培地に加え、細胞をさらに２４時間インキュベーションした。細胞を固定し、ｂ−ガラクトシダーゼ活性について染色し、オートラジオグラフィーにかけて、三重水素化チミジンの存在下でＤＮＡを合成したｂ−ガラクトシダーゼ陽性細胞のパーセンテージを測定した。ｐＣＭＶベクターおよびｐＣＭＶｂによりトランスフェクションされた対照細胞に対する阻害パーセントを測定した。ＭＤＡＨ ０４１細胞の場合にはカルシウムのトランスフェクションを使用した。ＳＤＩ−１ ｍＲＮＡレベルおよびＤＮＡ合成間の相関関係を表６に示す。示されたデータは、少なくとも２実験の平均である。
Figure 0004397922
表６に示されている通り、ＳＤＩ−１ ｍＲＮＡレベルは、同じく野生型ｐ５３タンパク質を欠く幾つかのセルラインにおいて非常に低いかまたは検出不可能であることが見いだされた。重大なことに、ＳＤＩ−１ ＲＮＡおよびタンパク質は、ＭＤＡＨ０４１細胞からは検出不可能であった。ｐ５３レベルおよびＳＤＩ−１レベル間の相関関係は、ｐ５３がＳＤＩ−１の誘導を通して静止状態を誘導することによりその腫瘍抑制活性を伝達すること、およびｐ５３を欠く細胞はＳＤＩ−１発現を誘導し得ないことから腫瘍形成性であることを示唆していた。
細胞成長制御における、そして転写アクチベーターまたはサプレッサーとしてのｐ５３の充分に確立された役割、およびＭＤＡＨ０４１細胞が野生型ｐ５３を発現しないという事実を考えると、それらが同じくＳＤＩ−１発現性を欠くという発見は、これらの細胞へｐ５３が導入された結果、ＳＤＩ−１発現が誘導され、すなわち成長が停止することを示していた。
ｐ５３のＳＤＩ−１発現誘導能力をさらに立証するため、ｐ５３をＭＤＡＨ ０４１細胞に導入した。前記導入の結果、三重水素化チミジン・オートラジオグラフィーにより測定されたところによると、ＳＤＩ−１の発現は増加し、ＤＮＡ合成は阻害された。阻害の度合いは、導入されたプラスミドの量に応じて増加した。観察されたＤＮＡ合成阻害が、ｐ５３の他の何らかの作用によるのではなくｐ５３によるＳＤＩ−１の誘導に起因する場合、アンチセンスＳＤＩ−１配列の同時トランスフェクション後に阻害活性は失われる。
従って、ｐ５３によるＳＤＩ−１の直接誘導を立証するため、上記ＳＤＩ−１およびアンチセンスＳＤＩ−１遺伝子配列を、ｐ５３遺伝子構築物と共に正常ヒト繊維芽細胞へ同時トランスフェクションした。予想通り、アンチセンス構築物は、ＳＤＩ−１単独により誘発されるＤＮＡ合成阻害の８０％を排除することが見いだされた。４μｇのＳＤＩ−１および増加量のｐ５３プラスミドをＭＤＡＨ０４１細胞へ共トランスフェクションしたとき、アンチセンスＳＤＩ−１は、ｐ５３単独により誘発されるＤＮＡ合成阻害を効果的に除去し得ることが見いだされた。これらの発見は、表７で要約されている。この発見は、ｐ５３がＤＮＡ合成阻害を誘発する一方法が、ＳＤＩ−１の発現を活性化することによるものであること、およびＳＤＩ−１の前記誘導がｐ５３のＤＮＡ合成阻害活性の一部に関する必要条件であるという結論を証明した。前記活性化は、少なくとも部分的にＳＤＩ−１遺伝子の転写活性化により行われる。発現されたＳＤＩ−１タンパク質は、一部分、ＣＤＫ／サイクリン複合体のキナーゼ活性を阻害することにより作用するため、細胞周期における多数の時点で作用することにより進行を遮断し得る。野生型ｐ５３活性の喪失の結果、ＳＤＩ−１発現が不足することになり、それによって不適当な細胞周期進行がもたらされる。
Figure 0004397922
ｐ５３タンパク質をコードする遺伝子における突然変異は、ヒト腫瘍ではよくみられることで、腫瘍の約５０％が突然変異体ｐ５３を発現する。このことから、ｐ５３が負の成長調節因子として作用し、腫瘍抑制遺伝子であるという結論が導かれた。本発明の一態様は、ｐ５３の癌抑制遺伝子活性に関与する分子機構の認識に関する。ｐ５３はＳＤＩ−１の転写活性化に必要とされるため、この機能の不活化により不適当な細胞周期の進行が行われ得る。ＳＤＩ−１は、少なくとも一部でｃｄｋ／サイクリン複合体のキナーゼ活性を阻害することにより作用する細胞周期増殖の阻害因子であることが見いだされた。それ自体前記物質は、細胞周期における多数の時点で作用することにより進行を遮断することができる。ｐ５３はＳＤＩ−１の転写活性化に必要とされるため、この融合体の不活化により、抑制されず不適当な細胞周期の進行が行われ得る。これにより、細胞は細胞周期の状態に関する正常な外部シグナルを無視することになり、その場での増殖が行われ得る。ＳＤＩ−１はｐ５３の下流であるため、ＳＤＩ−１は、ｐ５３作用のエフェクターであると思われる。さらに、ＳＤＩ−１からは、突然変異ｐ５３をもたない細胞における細胞増殖改変の一助となり得る突然変異が見いだされた。
実施例１３
ＳＤＩ−１の腫瘍細胞増殖抑制能
上記で示されているところによると、ＳＤＩ−１は、腫瘍細胞増殖抑制能力を有する。この能力を立証するため、幾つかのヒト腫瘍から誘導された細胞を、グルタチオンＳ−トランスフェラーゼ−ＳＤＩ−１融合タンパク質の存在下または非存在下でインキュベーションした。この実験では、５×１０３細胞を３７℃で一夜培養し（接着細胞の場合のみ）、次いでＳＤＩ融合タンパク質とインキュベーションした。３７℃で４８時間後、２４時間細胞にチミジンを適用し、次いで採取した。この実験の結果を表８に示す。未処理細胞によるチミジン取り込みを１００％として表した。全ての測定は４回同様に実施した結果であった。
Figure 0004397922
上記実験は、ＳＤＩ−１により処理された腫瘍細胞がＤＮＡ合成の著しい抑制を呈したことを示している。
実施例１４
腫瘍細胞の増殖に対するＳＤＩ−１ ｃＤＮＡの効果
ＳＤＩ−１ ｃＤＮＡが腫瘍細胞の増殖を抑制する能力を評価した。ＳＤＩ−１ ｃＤＮＡを、電気穿孔により若干の腫瘍誘導性および他のセルラインへ導入した。１μｇのＣＭＶ−ＳＤＩ−１プラスミドを、ＣＭＶプロモーターおよびβ−ガラクトシダーゼ遺伝子を含むプラスミド１μｇと混合した。電気泳動後、細胞を培養し、２４時間後三重水素化チミジンの取り込み能力について検定した。ＳＤＩ−１ ｃＤＮＡにより、黒色腫、肺腫瘍および脳腫瘍を含む若干の腫瘍誘導セルラインにおいてＤＮＡ合成の顕著な阻害が誘発された。ＳＤＩ−１ ｃＤＮＡはまた、マウス３Ｔ３細胞および正常ウシ平滑筋細胞においてＤＮＡ合成を阻害した。３種の腫瘍誘導セルライン（肺腫瘍セルライン１種および腎臓腫瘍セルライン２種）は、ＳＤＩ−１ ｃＤＮＡに反応しなかった。
実施例１５
正常細胞の増殖に対するＳＤＩ−１アンチセンスｃＤＮＡの作用
また、アンチセンス発現ベクターを用いてＤＮＡ合成に対するＳＤＩ−１の作用を評価した。β−ガラクトシダーゼ遺伝子を欠くプラスミドｐＣＭＶβの誘導体であり、ＳＤＩ−１ ｃＤＮＡ配列のヌクレオチド１−６８４を含むプラスミドｐＣＭＶＳＤＩ６８４を導入することにより、ＳＤＩ ｃＤＮＡを細胞に組み込んだ。改変ヒトメタロチオネインプロモーター（ＣＳＩＲＯ、「バイオモレキュラー・エンジニアリング」、ニューサウスウェールズ、オーストラリア）を含む誘導可能な発現ベクター、ｐＭＥＴへＳＤＩ−１アンチセンス配列をクローニングすることにより、アンチセンスベクターを構築した。このプロモーターは、基礎プロモーター中に１欠失および３反復で合成金属応答元素の付加を含む。ｐＭＥＴを構築するため、まず、Ｅ１Ａ遺伝子１２Ｓおよび１３Ｓイントロン（すなわち、ヌクレオチド９１７−１６７３）を含むアデノウイルス配列を、このプラスミドの多重クローニング領域のＮｏｔｌ／Ａｐａｌ部位のところで哺乳類発現ベクターｐＲｃ／ＣＭＶ（インビトロゲン）へクローニングすることにより、ｐＲｃ／ＣＭＶ−Ａｄが作製された。Ｅ１Ａ配列の翻訳が行われなかったことを確実なものにし、ベクターにおいてＳＰＥＩクローニング部位を作るため、停止コドンを含むＳＰＥＩリンカーを、ＣＭＶプロモーターおよびＥＩＡ配列と枠を形成しているＥ１Ａスプライス配列間に挿入した。次いで、プラスミドＲｃ／ＣＭＶ−ＡｄのＣＭＶプロモーターをｐＭ２６プロモーターと置き換えることにより、ｐＭＥＴが作製された。
これを達成するため、メタロチオネインプロモーターを、Ｂｇlll消化によりｐＭ２６から切りとり、pBluescript（ストラタジーン）のＢａｍＨＩ部位に挿入した。次いで、プロモーターを含むＥｃｏＲＶおよびＮｏｔｌ断片を、ｐＢluescriptからＲｃ／ＣＭＶ−ａｄの補充されたＢｇlll部位およびＮotl部位へサブクローニングした。ＳＤＩ−１ ｃＤＮＡからのアンチセンス配列を、クローン化された完全長ｃＤＮＡからｐＢluescriptのＢａｍＨＩ部位へ誘導した。ヌクレオチド１２７にあるＳtul部位を、Ｓpelリンカーの挿入によりＳpel部位に変換すると、ＳＤＩＳＰＥ１２７が得られた。また、Ｓpelリンカーをヌクレオチド３１９のＡpal部位に挿入することにより、ＳＤＩＳＰＥ３１９が作製された。これらの構築物をＳｐｅｌにより消化し、アンチセンス方向でｐＭＥＴのＳｐｅｌクローニング部位へ挿入することにより、ＳＤＩアンチセンス発現ベクターｐＭＥＴ−ＡＳ１２７（配列番号１のＳＤＩ−１ ｃＤＮＡに対するアンチセンス鎖の最初の１２７ヌクレオチドを有する）およびｐＭＥＴ−ＡＳ３１８（配列番号１のＳＤＩ−１ ｃＤＮＡに対するアンチセンス鎖の最初の３１９ヌクレオチドを有する）が作製された。
ＳＤＩ−１アンチセンスを発現するセルラインは、リン酸カルシウムトランスフェクションにより得られた。細胞集団倍加１０で３×１０５のＨＣＡ２細胞（ヒト包皮細胞）を、２０μｇのｐＭＥＴ、ｐＭＥＴＡＳ１２７またはｐＭＥＴＡＳ３１８によりトランスフェクションした。２週間のＧ４１８選択後、コロニーを選び取り、発展させた。挿入された配列の誘導性および完全性を、１００マイクロモルのＺｎＣｌ２および２マイクロモルのＣＤＣｌ２を加えることにより安定した形質転換体を用いて測定した後、全細胞ＲＮＡのＲＮＡ分析を行った。この分析は、［３２Ｐ］−ＵＴＰで内部標識したアンチセンスＲＮＡプローブを用いるリボヌクレアーゼ保護であった。ＳＤＩ−１ヌクレオチド４４４−６８６（配列番号１の）を含むプローブｐＭＥＴ＋ＳＤＩ−１を用いて、トランスフェクションした遺伝子および内在性ｍＲＮＡの両方からのＳＤＩ−１の発現を測定した。ＥｃｏＮＩ消化後、ｐＭＥＴベクターにおいてＳＰ６プロモーターから転写すると、発現ベクターからの両ＲＮＡおよび内在性ＳＤＩ−１ ｍＲＮＡとハイブリダイズするアンチセンス標識プローブが得られた。これによって、導入された構築物およびＳＤＩ−１内在性ＲＮＡからの発現の相対レベルの比較が可能となった。対照として、β−アクチンｍＲＮＡを全てのアッセイで測定した。
ＤＮＡ合成の範囲を測定するため、細胞をトリプシン化し、２４ウェルプレートにおいて１ウェル当たり１×１０４細胞を播種した。培養の４〜６時間後、細胞をリン酸緩衝食塩水で３回洗浄し、この培地を０.５％ウシ胎児血清含有培地と交換した。この血清の排除により細胞は静止状態に誘導された。６〜１０日後、培地を取り替え、金属を加えることによりメタロチオネインプロモーターを誘導した。加えられた金属の量を各プラスミドについて最適化した。最適化された量は、ｐＭＥＴ１の場合７０マイクロモルのＺｎＣｌ２および１.４マイクロモルのＣｄＣｌ２であり、ＡＳ１の場合５０マイクロモルのＺｎＣｌ２および１マイクロモルのＣｄＣｌ２であった。２０時間後、新鮮な培地を加えることにより、誘導を推し進めた。［３Ｈ］−チミジン（１.５μＣｉ／ｍｌ）を４時間後各培養物に加えた。２４時間後、細胞を固定し、オートラジオグラフィーにより分析した。典型的な実験で得られた結果は表９に示されており、本発明のアンチセンス分子が静止細胞の増殖を誘導する能力を立証している。
Figure 0004397922
実施例１６
ＳＤＩ−１アンチセンスオリゴヌクレオチドがＳＤＩ伝達による増殖阻害を抑制する能力
上記で検討されているところによると、ＳＤＩ−１の発現によりＤＮＡ合成は阻害される。場合によって、例えば培養中のヒト細胞を不死化するためには、上記阻害の抑制が望ましいこともある。本発明のＳＤＩ−１アンチセンス分子は、上記抑制を伝達することができる。
ＳＤＩ−１アンチセンスオリゴヌクレオチドが示すＳＤＩ−１のＤＮＡ合成阻害作用を抑制する能力を立証するため、下記配列：
配列番号：３ ＡＧＣＣＧＧＴＴＣＴＧＡＣＡＴＧＧＣＧ
を有するオリゴヌクレオチドを細胞に提供した。
このオリゴヌクレオチドは、ヌクレオチド７５−９３が配列番号１に対してアンチセンスである。
１０％ウシ胎児血清（ＦＢＳ）含有培地中で細胞を約１週間培養し、その時点で培地を０.５％ＦＢＳ含有培地と取り替えた。細胞を対照細胞および実験細胞に分けた。１日目、１、２または５マイクロモルの上記オリゴヌクレオチドを実験細胞に提供した。対照細胞にはオリゴヌクレオチドを全く与えなかった。３日目、そして再び５日目、全細胞に新鮮な０.５％ＦＢＳ含有培地を与えた。実験細胞には追加のオリゴヌクレオチド（１、２または５マイクロモル）を与えた。６日目、三重水素化チミジンを培養培地に加え、細胞を７日目に採取した。実験細胞（アンチセンスオリゴヌクレオチドを与えたもの）は、対照細胞に対して、それらのＤＮＡ中に取り込まれた三重水素化チミジンの量の増加を呈した。
結果は、ＳＤＩ−１ヌクレオチド７５−９３に相補的な領域を含むオリゴヌクレオチドが、ＳＤＩ−１機能のアンチセンスリプレッサーとして作用し得ることを示していた。
実施例１７
ＳＤＩ−１の発現に対するＤＮＡ損傷および成長停止作用
上記実験は、ｐ５３がＳＤＩ−１発現を誘導すること、およびＳＤＩ−１ ｍＲＮＡの製造が接触阻害および血清排除細胞並びに老化ヒト細胞において誘導されることを立証した。ＳＤＩ−１の誘導が成長停止状態の一般的特徴であるのか否かを測定するため、ＳＤＩ−１ ｍＲＮＡレベルに対するＤＮＡ損傷作用を評価した。
細胞においては、細胞周期のＳまたはＭ期にはいる前にＤＮＡ損傷剤に反応して成長停止が行われると考えられている。成長停止により、細胞ではＤＮＡ損傷剤により誘発された遺伝子病変があればそれらの修復が行われ得る。前記損傷を修復し損ねると、突然変異が誘発され、細胞死から腫瘍形成に及ぶ過酷な結果に至り得る。すなわち、細胞のＤＮＡ損傷に応じた成長停止に耐える能力は、癌の原因論および化学療法に対する癌細胞の応答の両方において非常に重大である。
ＳＤＩ ｍＲＮＡ製造に対するＤＮＡ損傷剤の影響を評価するため、正常ヒト新生児包皮繊維芽細胞（ＨＣＡ２株）、不死化セルライン（ＴＥ８５、アメリカ合衆国、メリーランド、ロックビルのアメリカン・タイプ・カルチャー・コレクションから入手可能）および上記ＭＤＡＨ０４１セルラインを使用した。３７℃で５％ＣＯ２中アール塩類＋１０％ウシ胎児血清を含むイーグルの最少必須培地（ギブコＢＲＬ、ガイザーズバーグ、メリーランド、アメリカ合衆国）、または３７℃でハンクス塩類＋１０％ウシ胎児血清において全細胞を培養した。ＨＣＡ２細胞は、老化する前に約８０細胞集団倍加を達成する。細胞は、細胞集団倍加２７またはそれ未満で使用された。
細胞を、ガラス製カバーグラスにおいて１×１０４細胞／ｃｍ２で培養し、２４−４８時間５０−７５％密集度に成長させ、次いで幾つかのＤＮＡ損傷源：γ線（４Ｇｙ）、ブレオマイシン（７５μｇ／ｍｌ、４時間）、エトポシド（４％ＤＭＳＯ中４００マイクロモル、８時間）、過酸化水素（４００マイクロモル、１時間）、ＵＶ光線（３０Ｊ／ｍ２）、メタンスルホン酸メチル（「ＭＭＳ」）（１００μｇ／ｍｌ、４時間）、マイトマイシンＣ（「ＭＭＣ」）（５μｇ／ｍｌ、３０時間）およびＣｄＣｌ２（２５０マイクロモル、１時間）のうちの１つで処理した。ＵＶ照射の場合、細胞を１５０ｃｍ２の組織培養皿で培養した。処理の直前、培地を除去し、皿を蓋無しでストラタジーン（ラ・ジョラ、カリフォルニア、アメリカ合衆国）ストラタリンカーＵＶ架橋装置中に置き、３０Ｊ／ｍ２の線量で照射した。次いで、新鮮な血清補充培地を加え、細胞を３７℃、５％ＣＯ２でインキュベーションした。γ線照射は、固定した１３７Ｃｓ供給源を用いて、２５ｃｍ２組織培養フラスコに入れた完全細胞培養培地中の細胞に対して行われた。線量率は４.２１Ｇｙ／分であった。照射線量は４Ｇｙまでであった。さらに、熱ショック（４２℃、４時間）、オキシ尿素（２ミリモル、２４時間）およびプロスタグランジンＡ２（０.１％エタノール中１０μｇ／ｍｌ、２４時間）の影響を評価した。
上記各処理の１６時間後、三重水素化チミジンを加え、細胞を８時間インキュベーションし、固定し、上記要領でオートラジオグラフィーにかけた。製造会社のプロトコルに従いＲＮＡゾールＢ（シンナ／バイオテックス、ヒューストン、テキサス）を用いた処理の４または２４時間後ＲＮＡを採取した。１０−２０μｇのＲＮＡを、２０％ホルムアルデヒドを伴う１.２％アガロースゲルにおいて分離し、ジーン・スクリーン・プラス（ボストン）膜へ移し、プローブし、定量した。処理試料を未処理対照と比較することにより、折り返し誘導（fold induction）を測定した。対照は、処理試料の場合と同じ洗浄、培地交換、輸送および不注意な温度変動を経験した模擬処理細胞であった。エタノールまたはジメチルスルホキシドに溶かした薬剤成分に関する対照を、同じ濃度の溶媒単独に暴露した。ＳＤＩ−１ ＲＮＡ値をＧＡＰＤＨレベルに正規化した。場合によっては、アクチンＲＮＡに対する正規化も行ったが、折り返し誘導における実質的な差異は示されなかった。この実験の結果を表１０に示す。
Figure 0004397922
予備試験（エル−デイリィ、Ｗ.Ｓ.等、「セル」、７５：８１７−８２５（１９９３））は、ＷＡＦ１の製造は、ＵＶ光線により誘導され得ることを示唆した。上記実験は、ＳＤＩ−１ ｍＲＮＡの製造が、正常細胞および野生型ｐ５３を欠く細胞の両方においてＤＮＡ損傷および他の成長停止処理により誘導されることを立証している。上記実験の結果は、哺乳類細胞で腫瘍形成に至り得るＤＮＡ損傷または突然変異の修復におけるＳＤＩ−１の役割を示している。
試験された損傷源は全て、１つ例外はあるものの、これらの細胞においてＳＤＩ−１ ｍＲＮＡの増加を誘発することが見いだされた（表１０）。使用濃度の塩化カルシウムでは、ＳＤＩ−１メッセージレベルは高められなかった。しかしながら、三重水素化チミジン取り込み分析は、塩化カルシウム処理が成長阻止を誘導しない（ＤＮＡ合成の阻害は無し）ことを示した（表１０）。対照的に、三重水素化チミジン取り込みによって測定されたところによると、成長停止は、試験された他の損傷源に応じて本質的に完全であった（表１０）。しかしながら、ＵＶ照射およびＭＭＳ処理の場合、５０−６０％の阻害しか観察されなかった。これらの損傷源に応じた成長停止がＤＮＡ合成の測定時点ではその最大に到達していなかったまたは逆に言えば細胞増殖が既に再開していたという可能性がある。塩化カルシウムによる誘導の欠如は、損傷が成長停止を誘発するときのみ、ＳＤＩ−１メッセージがＤＮＡ損傷により高められたことを示している。過酸化水素は、接触阻害により既に成長阻止している細胞ではそれ以上ＳＤＩ−１ ｍＲＮＡレベルを上昇させ得なかったという観察結果がこれを裏付けている。
γ−照射および過酸化水素処理によるＳＤＩ−１ ＲＮＡ誘導の速度論は相異なることが見いだされ（図６）、ＳＤＩ−１遺伝子発現の調節に関与する多様な機構についての更なる証拠が提供された。γ−照射によるＳＤＩ−１メッセージの誘導は、ｐ５３によるこの遺伝子の場合の時間経過に従う。イオン化放射に暴露した後にｐ５３活性が急速に（３０分以内）増加し、次いで３時間以内に基線レベルまで低下するということ（リュ、Ｘ.等、「セル」７５：７６５−７７８（１９９３））が、マウス前立腺細胞において立証された。正常ヒト細胞で観察されるＳＤＩ−１ ｍＲＮＡの誘導は、予想されている通り時間的には僅かに遅れるがこのパターンと類似している。主たる差異は、ＳＤＩ−１メッセージがｐ５３活性よりもさらにゆっくりと（約３０時間にわたって）低下したことであるため、リュ、Ｘ.等の観察結果（「セル」７５：７６５−７７８（１９９３））を説明している。正常ヒト細胞で観察されるＳＤＩ−１ ｍＲＮＡの誘導は、時間的には僅かに遅れるが、このパターンに類似している。主たる差異は、ＳＤＩ−１メッセージがｐ５３活性よりもさらにゆっくりと（約３０時間にわたって）低下したことである。これは、ｐ５３活性低下のずっと後も、イオン化放射誘導による停止が２０−３０時間続くという、リュ、Ｘ.等の観察結果（「セル」７５：７６５−７７８（１９９３））を説明している。
過酸化水素によるＳＤＩ−１メッセージの誘導（図６）は、非常に異なるパターンを呈した。過酸化水素に暴露すると、ｐ５３活性が急速に増加し（ティシュラー、Ｒ.Ｂ.等、「キャンサー・リサーチ」５３：２２１２−２２１６（１９９３））、処理の４時間後までに基線へ戻るということが提案された。対照的に、ＳＤＩ−１ ｍＲＮＡレベルは、処理の９時間後までそれほど上昇せず、少なくとも４８時間増加し続けた（図６）。過酸化水素処理に対するＳＤＩ−１ ＲＮＡレベルの緩慢な応答は、上昇したＳＤＩ−１ ｍＲＮＡのレベルが普遍的に成長停止と関連していると思われるが、それが常に停止の最初の原因であるとは限らないことを示している。ＳＤＩ−１メッセージ上昇の類似パターンは、正常ヒト細胞の血清排除および接触阻害により観察され、ｍＲＮＡ安定化の場合に観察されるものと似ている。また、血清排除および接触阻害に応じたｍＲＮＡの緩慢な増加は、ＧＡＤＤ遺伝子の場合（フォーネイス、Ａ.Ｊ.等、「モレキュラー・セル・バイオロジー」９：４１９６−４２０３（１９８９））にも注目されている。これら全ての場合において、ＳＤＩ−１は、別の経路により開始された後に成長停止を維持すべく作用し得る。
実施例１８
ＤＮＡ損傷および成長停止に対するＳＤＩ−１応答におけるｐ５３の役割
示されているとおり、成長停止を誘発するがＤＮＡを傷つけることはない誘発源（熱ショック、オキシ尿素およびプロスタグランジンＡ２）についても調べると（表１０）、ＳＤＩ−１メッセージレベルの増加を誘発することが見いだされた。熱ショックおよびオキシ尿素処理はＳＤＩ−１メッセージを高めたが（表１０）、両方ともｐ５３活性を高めないことが示され（リュ、Ｘ.等、「セル」７５：７６５−７７８（１９９３）、ツァン、Ｑ.等、「モレキュラー・セル・バイオロジー」１３：４２４２−４２５０１９９３））、これらの誘発源がｐ５３依存性機構を通して作動し得ることが示された。
この可能性をさらに調べるため、様々な不死セルラインのｐ５３状態を免疫沈降試験により測定し、同じセルラインでＳＤＩ−１ ｍＲＮＡレベルの定常状態と比較した。この目的のため、セルラインを、７５ｃｍ２フラスコ中約７０％の密集度まで成長させた後、メチオニン不含有修飾ダルベッコのイーグル培地中で１時間培養し、次いで１０％透析ウシ胎児血清を含むメチオニン不含有培地および１００μＣｉ／ｍｌ Ｌ−［３５Ｓ］メチオニン（TRAN35SLABEL、ＩＣＮ）中で標識した。１免疫沈降に対し１本のフラスコを使用した。この標識培地中で３時間インキュベーション後、細胞を氷上に置き、氷冷リン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）で洗浄し、溶菌緩衝液（２０ミリモルのトリス、ｐＨ７.４、１５０ミリモルのＮａＣｌ、０.５％ＮＰ−４０、１ミリモルのＥＤＴＡ、５０μｇ／ｍｌのロイペプチン、３０μｇ／ｍｌのアプロチニン）中で採取した。リゼイトをマイクロフュージ管中にすり落とし、２５ゲージ針に通すことにより３回せん断した。フェニルメチルスルホニルフルオリドを加えて１ミリモルの最終濃度とし、リゼイトをエッペンドルフ・マイクロフュージ中４℃で４５分間１４０００rpmの遠心分離にかけた。上清容量を調節することにより細胞数に対して正規化し、次いで３０分間４℃で４５分間事前に浄化した。上清容量を調節することにより細胞数に対して正規化し、次に、ウサギ抗マウスＩｇＧ（ＩＣＮ）および２種のマウスＩｇＧ２ａ黒色腫蛋白混合物（ＩＣＮ）により逐次被覆しておいた約４０μｌ充填容量のプロテインＡ−アガロース（ファルマシア）と共に回転盤において３０分間４℃で事前に浄化した。次いで、リゼイトをマイクロフュージし、生成した各上清を、４μｇの適当なｐ５３特異抗体または同じ種類およびその下位分類に属する非特異抗体で被覆しておいた５０μｌ充填容量のプロテインＧ ＰＬＵＳ／プロテインＡ−アガロース（オンコジーン・サイエンス）とインキュベーションした。特異抗体は、Ｐ５３の野生型および突然変異形態の両方と結合するＰＡｂ４２１、突然変異形態のサブセットを認識するＰＡｂ２４０、および野生型ｐ５３を特異的に認識するＰＡｂ１６２０であった。ｐ５３抗体は全て、オンコジーン・サイエンスから入手された。使用された非特異抗体は、エシェリヒア・コリのアントラニレート合成タンパク質に対する非特異ＩｇＧ１抗体または２種のＩｇＧ２黒色腫タンパク質の混合物であった。回転盤において４℃で２時間インキュベーションを行った。試料をマイクロフュージし、沈澱物を、氷冷洗浄緩衝液（２０ミリモルのトリス、ｐＨ７.５、１５０ミリモルのＮａＣｌ、０.５％ＮＰ−４０および０.１％ＳＤＳ）で４回、次いでＰＢＳにより２回洗浄した。試料を２×ローディング緩衝液（４％ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル、ｐＨ８.８）に再懸濁した。ゲルを固定し、アンプリファイ（アマーシャム）で処理し、乾燥し、８０℃で２０−２８時間コダックＸ−ＡＲフィルムに感光させた。
ｐ５３がＳＤＩ−１ ｍＲＮＡ転写の唯一の調節因子であったとすると、野生型ｐ５３が存在しない場合、ＳＤＩ−１発現レベルは低いものとなり、機能的ｐ５３が存在する場合、それに応じてＳＤＩ−１発現レベルはより高いものとなったはずである。
ＳＤＩ−１発現の調節のｐ５３依存性機構についての証拠は、機能的ｐ５３を欠くＴＥ８５およびＭＤＡＨ０４１細胞を、ＳＤＩ−１メッセージレベルの変化を決定する表１０記載の誘発源の多くにさらすことにより得られた。ＴＥ８５は、免疫沈降により突然変異体ｐ５３のみを発現することが見いだされた骨肉腫誘導ラインである。Ｇ１停止にｗｔ ｐ５３を必要とする（クエルビッツ、Ｓ.Ｊ.等、「プロシーディング・オブ・ナショナル・アカデミー・オブ・サイエンス・オブ・ザ・ユナイテッド・ステーツ・オブ・アメリカ」８９：７４９１−７４９５（１９８９））γ照射を除き、試験された処理は全て、セルラインＴＥ８５においてＳＤＩ−１メッセージを増加させることができた（表１１）。ＳＤＩ−１ ＲＮＡレベルのｐ５３非依存性調節向上は、過酸化水素およびオキシ尿素処理後のＭＤＡＨ０４１細胞において確認された（表１１）。従って、ＳＤＩ−１ ｍＲＮＡ蓄積パターンは、ＧＡＤＤ４５の場合と類似している。この遺伝子はまた、γ照射によるものであって、大部分の他の誘発源によるものではない誘導に関して機能的ｐ５３を必要とする（ツァン、Ｑ.等、「モレキュラー・セル・バイオロジー」１３：４２４２−４２５０（１９９３））。ＧＡＤＤ４５は、成長停止およびＤＮＡ損傷の両方による誘導性に基づいて同定された遺伝子群の一員である（フォーネス、Ａ.Ｊ.等、「モレキュラー・セル・バイオロジー」９：４１９６−４２０３（１９８９））。これらの発見は、Ｐ５３がＳＤＩ−１の唯一の調節因子ではないこと、そしてＳＤＩ−１の追加的調節因子が存在することを示している。上記方法を用いることにより、それら追加的調節因子を同定することができる。
Figure 0004397922
要約すると、上記結果は、１）ＤＮＡを損傷するものを含め成長停止を誘導する広い範囲の誘発源によって、ＳＤＩ−１メッセージレベルが高められ、２）機能的Ｐ５３の非存在下でこれを達成し得る誘発源もあり、そして３）この上昇は２つの相異なる時間的パターンに従うことを立証している。１つ目では、ｐ５３活性が上昇すると、ＳＤＩ−１ ｍＲＮＡも平行して増加する。これが充分早くに生ずるため、停止の誘因となり得る。２つ目のパターンでは、成長阻害因子は、ｐ５３に完全に依存しているわけでもない機構によって停止を誘発する。この停止に伴ってＳＤＩ−１ ｍＲＮＡが漸進的に蓄積しており、これはおそらくメッセージ安定性の増加に起因するものと思われる。
実施例１９
ＳＤＩ−１融合タンパク質に対するモノクローナル抗体の製造
上記に従い、適当なハイブリドーマ用のスクリーンにおいて免疫原としてＧＳＴ−ＳＤＩ−１融合体を用い、配列番号４のリーダー配列を有する［Ｈis］６（配列番号３７）融合体を用いて、抗ＳＤＩ−１モノクローナル抗体を単離した。抗体の全ては、ＧＳＴ−ＳＤＩ−１融合タンパク質に加えて細胞および組換えＳＤＩ−１タンパク質の両方についても免疫沈降させ得た。
ヒト組織の免疫組織化学的評価においてモノクローナル抗体を使用した。４種のハイブリドーマライン（１８Ａ１０、Ｃ６Ｂ６、８Ａ８、２Ｇ１２）およびマウスＩｇＧ２ｂ対照からの抗体（１０μｇ／ｍｌ）を、４℃で一夜ニート上清とインキュベーションした。抗体は、色素原としてのＤＡＢと共にベクター・スタンダードＡＢＣキットを用いて検出された。ヒト扁桃（リンパ様および上皮細胞成分の両方を含む）、成人皮膚（結合組織および上皮細胞成分の両方を含む）または成人結腸（結合組織および腺上皮細胞成分を含む）からの組織を評価した。染色性を定性的＋／−尺度で評価した。対照抗体はどの組織においても染色性を示し得なかった。
モノクローナル抗体１８Ａ１０
扁桃 全上皮細胞層、全リンパ球および全ストロマ成分は着色しなかった。
皮膚 全上層およびことによると基底細胞層が、痕跡〜１＋拡散細胞質染色性を
示した。結合組織成分は着色しなかった。
結腸 上皮細胞は着色しなかった。腺内の粘液が痕跡〜１＋染色性を呈した。結
合組織成分は着色しなかった。
モノクローナル抗体Ｃ６Ｂ６
扁桃 全上皮細胞層、全リンパ球および全ストロマ成分は着色しなかった。
皮膚 基底細胞上皮細胞が、＋／−〜痕跡＋拡散細胞質染色性を有していた。結
合組織成分は着色しなかった。
結腸 上皮細胞間の個々の細胞が、３＋核／細胞質染色性を示した。腺内の粘液
は着色しなかった。結合組織成分は着色しなかった。
モノクローナル抗体８Ａ８
扁桃 全上層、上皮細胞層およびことによると基底細胞が、＋／−〜痕跡＋拡散
細胞質染色性を示した。リンパ球および全ストロマ成分は免疫反応性を示
さなかった。
皮膚 全上部上皮細胞が、＋／−〜１＋拡散細胞質染色性を示した。結合組織成
分は着色しなかった。
結腸 上皮細胞領域が、３＋核／細胞質染色性を示した。粘液が＋／−染色性を
示した。結合組織成分は着色しなかった。
モノクローナル抗体２Ｇ１２
扁桃 基底細胞上皮層が痕跡〜１＋染色性を示した。全リンパ球の中には痕跡膜
染色性を呈するものもあった。ストロマ成分は着色しなかった。
皮膚 基底細胞層が、痕跡〜１＋拡散細胞質染色性を示した。上部細胞層は着色
するとは思えなかった。
結腸 顕著な褐色沈澱物質が目につき、管上皮細胞の中には強い核着色を呈して
いるものもあることを示唆していた。腺内の粘液は着色しなかった。結合
組織成分は着色しなかった。
この実験は、モノクローナル抗体が、ＳＤＩ−１を発現する組織型およびＳＤＩ−１を発現しない組織型間を識別し得ることを示していた。さらに、異なる細胞型において他と異なる染色パターンを識別することが可能だった。免疫組織化学的評価は生検組織において遂行され得た。腫瘍塊内の細胞の非染色性フォーカスの検出は、もはやＳＤＩ−１を発現することのない、従ってより攻撃的な抗腫瘍および抗転移療法を保証する細胞の指標となる。
実施例２０
標的細胞へのＳＤＩ−１のデリバリー
細胞への薬剤デリバリー能力は、治療プロトコルを明確にする際の一般的問題となっている。ＳＤＩ−１の細胞取り込み促進におけるＧＳＴ部分の役割を評価するために、２種のＧＳＴ−ＳＤＩ−１構築物の薬剤デリバリー能力を評価した。
第１ＧＳＴ−ＳＤＩ−１融合体の構築
これらの融合体の第１は、標的細胞に入り得るものとしてとして最初に認識された特に好ましいシストソーマ・ジャポニカムＧＳＴ−ＳＤＩ−１融合体（上記で検討）であった。しかしながら、注目すべきことに、この融合体の構造における僅かな修飾でも、標的細胞によって取り込まれる能力を実質的に破壊することが見いだされた。すなわち、初めに記載されたシストソーマ・ジャポニカムＧＳＴ−ＳＤＩ−１融合体は、以前に充分には認識されていなかった固有の他と区別される特徴をもっていた。
特に好ましいシストソーマ・ジャポニカムＧＳＴ−ＳＤＩ−１融合体は、プラスミドｐｃＤＳＲαΔ−ＳＤＩ−１をＡｃｙｌおよびＥｃｏＲＩで開裂し、ＳＤＩ−１コード化フラグメントを遊離させることにより形成された。Ａｃｙｌは、ＳＤＩ−１開始コドンの後のプラスミド４ヌクレオチドを開裂する。ＥｃｏＲＩは配列番号１の１０１０付近で分子を開裂する。次いで、フラグメントをプラスミドｐＢＳのＳｍａｌおよびＥｃｏＲＩ部位間でクローン化した。次に、この構築物をＢａｍＨＩおよびＥｃｏＲＩで開裂することにより、ＳＤＩ−１ ＡＴＧ開始コドンの直後にヌクレオチド：ＧＧＡＴＣＣＣＣＣＣＧＣＣ（配列番号７）を含むＳＤＩ−１コード化フラグメントが放出された。分子の遠位末端は、配列番号１のほぼ１０１０位にあった。
シストソーマ・ジャポニカムＧＳＴ−コード化配列を含むプラスミドｐＧＥＸ２Ｔを、ＢａｍＨＩおよびＥｃｏＲＩで開裂した。ＢａｍＨＩ酵素は、分子のヌクレオチド６６２−６６７（分子のコドン２２６付近）に位置する部位でシストソーマ・ジャポニクムＧＳＴ−コード化配列を開裂する。ＥｃｏＲＩ酵素は、ＧＳＴ−コード化配列の外側でプラスミドを開裂する。２酵素開裂によりプラスミドの再連結反応が阻止され、ＳＤＩ−１配列が適切な配向で導入されるのを確実なものにする。
ＢａｍＨＩ−ＥｃｏＲＩ処理ｐＧＥＸ２Ｔ ＤＮＡを、ＳＤＩ−１ ＡＴＧ開始コドンの直後にヌクレオチド：ＧＧＡＴＣＣＣＣＣＣＧＣＣ（配列番号７）を１端に含み、他端にＥｃｏＲＩ開裂部位を含む上記ＳＤＩ−１コード化フラグメントとインキュベーションした。２分子の連結反応により、ＳＤＩ−１コード化配列がＧＳＴコード化配列からの枠外の１ヌクレオチドと融合しているプラスミドが製造された。読み枠を修復するために、プラスミドをＢａｍＨＩで開裂し、スタッガード末端をクレノウＤＮＡポリメラーゼを用いて補充し、次いで配列：ＣＣＣＴＣＧＡＧＧＧ（配列番号８）を有する１０塩基対Ｘｈｏｌリンカー（プロメガ）にライゲートした。すなわち、最終構築物は、ＳＤＩ−１のＡＴＧ開始コドンおよびＳＤＩ−１コード化配列の残りに融合したＡｓｐ−Ｐｒｏ−Ｐｒｏ−Ａｌａ（配列番号３８：配列番号９の残基４−７）をコードするＢａｍＨＩ補充リンカー（配列番号７）に融合したＰｒｏ−Ａｒｇ−Ｇｌｙ（配列番号９の残基１−３）をコードする９残基フラグメントに融合したＧＳＴのアミノ酸１−２２６をコードする配列を含んでいた。完全遺伝子融合体のヌクレオチド配列は、配列番号１０に与えられている。この遺伝子融合体によりコードされるアミノ酸配列は、配列番号１１に与えられている。上記の第１ＧＳＴ−ＳＤＩ−１遺伝子融合体を含むプラスミドｐＡＧ２０により形質転換されたエシェリヒア・コリ株は、微生物寄託を管理するブダペスト条約の合意のもとアメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション（ロックビル、メリーランド、アメリカ合衆国）に寄託された。この寄託は１９９４年４月５日に為され、寄託番号ＡＴＣＣ６９５９７が付された。
第２ＧＳＴ−ＳＤＩ−１融合体の構築
第２ＳＤＩ融合体は、ポリメラーゼ連鎖反応および下記配列を有するプライマーを用いて、プラスミドｐｃＤＳＲαΔ−ＳＤＩ−１のＳＤＩ−１コード化領域を増幅することにより得られた。
プライマー１２６１４（配列番号１２）
ＧＧＡＧＧＡＴＣＣＡＴＧＴＣＡＧＡＡＣＣＧＧＣＴ
プライマー１２６１５（配列番号１３）
ＧＣＡＧＡＡＴＴＣＣＴＧＴＧＧＧＣＧＧＡＴＴＡＧ
これらのプライマーは、配列番号１の残基７７−５８７を含むポリヌクレオチドを増幅する。プライマー１２６１４は、ＡＴＧ翻訳開始部位の上流に隣接してＢａｍＨＩ部位を有する。プライマー１２６１５は、翻訳停止部位の下流に１４ヌクレオチドを含み、部分的ＥｃｏＲＩ部位を含む。
増幅生成物をＢａｍＨＩおよびＥｃｏＲＩにより開裂し、上記ＢａｍＨＩ／ＥｃｏＲＩ処理ｐＧＥＸ２Ｔプラスミドへクローン化した。生成したプラスミドは、ＧＳＴ配列のコドン２２６をＳＤＩ−１のコドン１に連結する枠内融合を含んでいた。
すなわち、２種のタンパク質融合体は、第１融合体がアミノ酸：
配列番号９ Pro-Arg-Gly-Asp-Pro-Pro-Ala
から成る「ヒンジ領域」を含み、第２融合体がヒンジ領域を全く含まないという点のみ異なる。
第１および第２ＧＳＴ−ＳＤＩ−１融合体を若い細胞に供すると、第１融合タンパク質は、細胞内で検出され得ることが見いだされ、第２融合タンパク質は細胞内からは検出されなかった。これらの観察結果は、第１ＧＳＴ−ＳＤＩ−１融合体が細胞に結合し、受容細胞に組み込まれる能力を有し、第２ＧＳＴ−ＳＤＩ−１融合体がこの能力を欠くことを示した。これらの観察結果と一致して、第１タンパク質融合体または第２タンパク質融合体に曝された若い細胞の中で、第１タンパク質融合体に曝された細胞のみが老化を呈した。
実施例２１
ＳＤＩ−１タンパク質の欠失分析
ＳＤＩ−１タンパク質の機能的ドメインを調べるため、ＣＭＶプロモーターを用いることによりＳＤＩ−１ ｃＤＮＡ配列のフラグメントの転写が促される幾つかの遺伝子構築物を製造した。
具体的には、次のアミノ酸のコドンを欠くＳＤＩ−１ポリヌクレオチド、すなわち２４−２９（ＳＤＩ−１１−２３;２５−１６４と称す）、３０−３５（ＳＤＩ−１１−２９;３６−１６４と称す）、４２−４７（ＳＤＩ−１１−４１;４８−１６４と称す）、５３−５８（ＳＤＩ−１１−５２;５９−１６４と称す)、６６−７１（ＳＤＩ−１１−６５;７２−１６４と称す)、７２−１６４（ＳＤＩ−１１−７１と称す）を欠くものが構築された。さらに、コドン１６−５２を含むＳｔｕ−Ｔｔｈフラグメント（ＳＤＩ−１Ｓｔｕ−Ｔｔｈと称す）が除去処理されたＳＤＩ−１ポリヌクレオチドが構築された。これらの構築物および無傷のＳＤＩ−１コード化構築物（ＳＤＩ−１１−１６４と称す）およびＣＭＶ対照ベクターを、ＣＭＶプロモーターに駆られてβ−ガラクトシダーゼを発現するベクターを随伴するＭＤＡＨ０４１細胞中に共トランスフェクションした。ＣＭＶ−β−ｇａｌおよびＣＭＶベクターと共トランスフェクションされた細胞に対して成長阻害パーセントを測定した。実験は同様にして３回行われた。各ＳＤＩ−１ポリヌクレオチドについて得られた阻害パーセントを表１２に示す。
Figure 0004397922
これらの結果は、アミノ酸４２−４７の欠失により、阻害効率および範囲の減少が誘発されたことを示している。アミノ酸５３−５８の欠失により、阻害効率および範囲の重大な減少が示された。ＳＤＩ−１分子のカルボキシ末端部分（アミノ酸７２−１６４）の欠失は、阻害範囲にあまり影響を及ぼさなかった。すなわち、ＳＤＩ−１の活性ドメインは、アミノ酸１−７１を含むペプチドフラグメント内に存在し、アミノ酸４２−４７および５３−５８は活性ＳＤＩ−１ドメインを含む。要約すると、ＳＤＩ−１の活性ドメインは、ＳＤＩ−１タンパク質のアミノ酸４２−５８間に含まれる
実施例２２
免疫反応性２３ｋＤタンパク質の同定
予想された通り、上記モノクローナルおよびポリクローナル抗体は全て、ＳＤＩ−１に対応する２１ｋＤタンパク質（「ｐ２１」）を免疫沈降させ得ることが見いだされた。これらの抗体により免疫沈降したタンパク質の分析は、予想に反して、これらの抗体が細胞抽出物中に存在する２３ｋＤタンパク質を沈澱させることを示した。試験された抗ＳＤＩ−１抗体の全てがこの２３ｋＤタンパク質（「ｐ２３」）を沈澱させたという事実は、ＳＤＩ−１および２３ｋＤタンパク質は構造的に関連性があり、多数の抗原決定基を共有することを示す。上記ｃＤＮＡベクターから発現された２１ｋＤのＳＤＩ−１タンパク質が生物活性であるという事実は、２３ｋＤタンパク質が活性２１ｋＤ ＳＤＩ−１タンパク質の不活性リン酸化前駆体の特徴を呈することを示している。
かかる前駆体をもつ場合、ＳＤＩ−１は、１１０−１１４ｋＤの分子量を有する多重リン酸化状態を呈することが見いだされたＲｂ−タンパク質に類似している。脱リン酸化形態は、１１０ｋＤの分子量を有する（リー、Ｗ.Ｈ.等、「チューマー・サプレッサー・ジーンズ」中、クレイン、Ｇ.（編）、マーセル・デッカー、ニューヨーク、インコーポレイテッド、１６９−２００頁（１９９０))。
ＳＤＩ−１の不活化リン酸化形態の同定結果は、ＳＤＩ−１の生物活性に対し、転写のｐ５３誘導により正の調節が為されるとともに、細胞キナーゼにより負の調節が為されることを示している。上記キナーゼ（複数も可）の同定は、発現時、脱リン酸化ｐ２１ ＳＤＩ−１のリン酸化を促進し得るタンパク質を製造する構成成分についてｃＤＮＡライブラリーをスクリーニングすることにより容易に決定され得る。上記変換は、ｐ２１−ｐ２３免疫沈降タンパク質のウエスタン・ブロットを行うことにより分析され得る。それらの酵素はｐ２１ ＳＤＩ−１を不活化するため、それらは細胞に増殖能力を付与し、ＳＤＩ−１誘導による老化を克服する分子として同定され得る。上記分子は、ＳＤＩ−１アンチセンス核酸と同様にして使用され得る。同様に、ｐ２３タンパク質を脱リン酸化する酵素は、発現時、ｐ２３形態をｐ２１形態に変換し得るタンパク質を形成するポリヌクレオチドについてスクリーニングすることにより同定され得る。ウエスタン・ブロット方法を用いることにより、上記分子が同定され得る。上記酵素はｐ２３分子を活性ｐ２１形態に変換するため、それらの酵素は、細胞に静止または抗増殖能力を付与する。上記分子は、ＳＤＩ−１またはＳＤＩ−１コード化核酸と同様にして使用され得る。
実施例２３
ＳＤＩ−１フラグメントの特性検定
上記検討によると、酵母からヒトまでの真核生物における細胞増殖の制御には、サイクリン依存性キナーゼ類（Ｃｄｋｓ）と呼ばれるタンパク質キナーゼの調節性サブユニットとして作用する１群のサイクリン類の調節された合成、活性化および分解がある。ｃｄｋｓは、Ｓ期および有糸分裂の開始に必要である。タンパク質ＳＤＩ−１によるＤＮＡ合成の阻害機構には、一連のＣｄｋキナーゼ活性（例、ｃｄｋ１−ｃｄｋ６）の阻害が含まれる。事実、インビボＳＤＩ−１タンパク質は、様々なサイクリン抗体に対する抗体を用いた免疫沈降により、これらのｃｄｋ−サイクリン複合体の幾つかに伴うことが見いだされた（キショング、Ｈ.等、「セル」７１：５０５−５１４（１９９２）参照）。これらの複合体は、何らかのＤＮＡ腫瘍ウイルスによる細胞の形質転換時に破壊され（ＰＣＴ特許出願ＷＯ９４／０９１３５、ワガ、Ｓ.等、「ネイチャー」３６９：５７４−５７８（１９９４））、発癌性タンパク質が形質転換細胞の細胞周期を改変する上述の機構が確認された。さらに、最近の報告はＳＤＩ−１およびｐ５３間の上記関係を確認しており、野生型ｐ５３がＳＤＩ−１を直接トランス活性化することを示したため（ハーパー、Ｊ.Ｗ.等、「セル」７５：８０５−８１６（１９９３）、エル-デイリー、Ｗ.Ｓ.等、「セル」７５：８１７−８２５（１９９３）、キショング、Ｙ.等、「ネイチャー」３６６：７０１−７０４（１９９３）、デュリック、Ｖ.等、「セル」７６：１０１３−１０２３（１９９４））、それがｐ５３の下流エフェクターであることが確認された。これらの結果により、ＳＤＩ−１が、正常な細胞増殖中には負の調節因子であるだけでなく、発癌中には腫瘍サプレッサー因子でもあることが確認される。
ＤＮＡ合成阻害に必要とされるＳＤＩ−１分子の領域（複数も可）を決定するため、ＣＭＶプロモーターから発現された様々なＳＤＩ−１ ｃＤＮＡが、コード化領域の３’末端から漸進的に先端切除された一連のプラスミドを構築した。欠失突然変異体がキナーゼ活性および／またはＤＮＡ合成を阻害する能力を、一時的発現アッセイおよびｃｄｋ２との結合アッセイを用いて評価した。
ＮｏｔｌでプラスミドｐＣＭＶβを消化して、エシェリヒア・コリβ−ガラクトシダーゼ遺伝子を除去することにより、プラスミドを構築した。この部位をクレノウにより平滑にし、Ｓｐｅｌリンカーを挿入することによりｐＣＭＶＳｐｅｌを作製した。完全長ＳＤＩ−１ ｃＤＮＡをＢａｍＨＩおよびＤｒａｌで消化し、ｐＢluescriptベクターにクローン化した。ＳｐｅｌリンカーをこのベクターのＨｉｎｃII部位へライゲートさせることにより、ＳＤIIｃＤＮＡのヌクレオチド１−６８６に関してＳｐｅｌ末端が作製された［プラスミドｐＢＳsdil（１−６８６）Ｓｐｅｌ］。次いで、このベクターからのＳＤＩ−１のＳｐｅｌ結合フラグメントをｐＣＭＶＳｐｅｌベクターへライゲートさせることにより、野生型ＳＤＩ−１ ｃＤＮＡ配列に関する完全１６４アミノ酸コード化領域（配列番号２）を含むｐＣＭＶsdil（１−６８６）が作製された。ＳＤＩ−１のカルボキシ末端先端切除バージョンをコードする一連の突然変異体を、ＳＤＩ−１コード化配列内に非反復部位を有する制限酵素を用いることにより生成した。
ＨＣＡ２、すなわち新生児包皮から誘導された上記の正常ヒト２倍体線維芽細胞を、突然変異分析で使用した。これらの細胞は、老化期にはいる前に８０集団倍加（ＰＤ）を達成し、全実験において２０−３０のＰＤで使用された。ＨＣＡ２へのトランスフェクション時にＤＮＡ合成開始阻害能力について各構築物を試験した。トランスフェクション後、抗ＨＡモノクローナル抗体（１２ＣＡ５、バブコから得られる）を用いる免疫蛍光法によりタンパク質製造について欠失構築物を試験した。
完全長ＳＤＩ−１コード化領域をトランスフェクションすると、三重水素化チミジンを取り込んだ細胞のパーセンテージが９０％減少した。アミノ末端７１アミノ酸のみをコードする先端切除ＳＤＩ−１は、Ｓ期へ入るのを遮断する場合に完全長１６４アミノ酸タンパク質と同程度に有効だったが、最初の５２アミノ酸のみをコードするより厳密な先端切除形態は完全に不活性であった（表１３）。これは、ＤＮＡ合成阻害活性に関する重要な領域がアミノ酸５２および７１間に位置することを示している。すなわち、アミノ酸残基５２−７１を有するＳＤＩ−１のペプチドフラグメントは、ＳＤＩ−１タンパク質のもどき体を含む。同様に、ＳＤＩ−１５２ー７１の反応性側鎖基を模倣する分子は、ＳＤＩ−１のもどき体を含む。またアミノ酸１６−５２に欠失を伴う構築物（プラスミド「１−１６４（Δ１６−５２）」）がＤＮＡ合成阻害活性を全て失ったことが見いだされたとき、Ｓ期へ入るのを阻害する場合におけるタンパク質のアミノ末端部分の役割はさらに明確化された。
Figure 0004397922
分子のＤＮＡ合成阻害領域をさらに細かくマッピングするため、小さな内部欠失（４〜６アミノ酸のみが除去され、３アミノ酸（Ｐｒｏ−Ａｒｇ−Ｇｌｙ）が置換された）を、（大きな欠失構築物が示したところでは）阻害活性に必要である分子のアミノ末端部分に導入した。６アミノ酸の欠失体を、ＳＤＩ−１ ｃＤＮＡにおけるアミノ酸２４−２９、３０−３５、４２−４７、５３−５８および６６−７１のところで構築した。これらの構築物を、赤血球凝集素（ＨＡ）分子の一部分をコードするＤＮＡと枠内融合することにより、完全長ＳＤＩ−１タンパク質のＣ−末端に枠内赤血球凝集素（ＨＡ）標識が付された。ＨＡ標識により免疫染色用の唯一の抗原が得られ、タンパク質産物が発現されるか否かおよびそれらが細胞内のどこに位置しているかの決定が可能となった。確実に、ＨＡ標識がＳＤＩ−１のＤＮＡ合成阻害活性に干渉することのないようにするため、完全長（１６４アミノ酸）または先端切除（アミノ酸１−７１）類をコードするｃＤＮＡを、同じくカルボキシ末端のところでＨＡ配列に融合した。ＨＡ標識配列は、プライマー：
配列番号１４： ＴＣＴＡＧＧＣＣＴＧＴＡＣＧＧＡＡＧＴＧ
（ｐＣＭＶベクターにおけるスプライス部位）
Figure 0004397922
 を用いるポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）により導入された。これらのｃＤＮＡの阻害活性は、ＨＡ標識をもたない構築物の同活性と同じであった。別の対照構築物はアミノ酸１６−５２が欠失され、標識されている場合もされていない場合も阻害活性を全くもたなかった。興味深いことに、そして成長阻害における分子のアミノ末端領域が無傷な状態であることの重要性のさらなる証拠立てにおいて、アミノ末端がＨＡにより標識されたｃＤＮＡは成長阻害活性を全くもっていなかった。
次いで、欠失体を、ＰＣＲによりプラスミドｐＣＭＶsdil（１−６８６）ＨＡにおけるＳＤＩ−１ ｃＤＮＡのタンパク質コード化領域へ導入した。この標識によって、野生型および突然変異タンパク質が様々な構築物によりトランスフェクションされた細胞において発現されることを確認し、また突然変異タンパク質の局在性を決定することが可能となった。
下記のプライマーセットを用いることにより、示された欠失体を導入した（表１４）。
Figure 0004397922
各プライマーをベクター内でハイブリダイゼーションするプライマーと共に用いることにより、ＳＤＩ−１プラスミドの一部分を増幅し、２つの反応からの増幅物質をプールし、アニーリングを行わせた。１本鎖領域をポリメラーゼと共に充填し、次いでフラグメントを一緒にライゲートさせることにより、所望の共有結合性閉環状ベクターが製造された。配列番号２６−２７を用いて、ＳＤＩ−１アミノ酸５８−６１をトリペプチド「Ｓｅｒ−Ａｒｇ−Ａｌａ」により置換した。すなわち、先端切除構築物は、アミノ酸１２３、８２、７１、５２および１６までのタンパク質のアミノ末端を各々コードした。全構築物について配列決定することにより、所望の欠失が為されたこと、ＨＡ標識の完全性が無傷であることを証明し、追加の突然変異が構築物へ全く導入されなかったことを確認した。
ＨＣＡ２およびＭＤＡＨ ０４１細胞を、リン酸カルシウム沈澱を用いてｐＣＭＶβ-galおよび上記ＳＤＩ−１突然変異ＤＮＡをもつプラスミドと共トランスフェクションした。ＭＤＡＨ０４１セルラインはリィ−フロウメニ症候群患者から誘導されたもので、フレームシフト突然変異がｐ５３分子のアミノ末端領域において時期尚早の終止を誘発することからｐ５３を合成しない。ＭＤＡＨ０４１は、検出可能なレベルのＳＤＩ−１を発現しないため、これらのトランスフェクションに関して特に適した細胞であった。従って、それらは、これらの極微検出された欠失突然変異構築物の場合に予想され得るＤＮＡ合成阻害活性における小さな変化についてより感度の高いアッセイを提供した。
１μＣｉ／ｍｌの三重水素化チミジンを、トランスフェクションの２４時間後に培養培地に加え、細胞をさらに３６時間インキュベーションした。細胞を固定し、β−ガラクトシダーゼ活性について染色し、オートラジオグラフィーにかけることにより、ＤＮＡを合成したβ−ガラクトシダーゼ陽性細胞のパーセンテージを測定した。ｐＣＭＶベクターおよびｐＣＭＶＢ−ｇａｌにより共トランスフェクションした対照細胞に対して阻害パーセントを測定した。
アミノ酸５３−５８の欠失は、ＤＮＡ合成阻害活性の最大の喪失（完全長ｃＤＮＡの場合の約５０％である）をもたらすことが見いだされた。また、２つの他の欠失（配列番号２のアミノ酸４２−４７およびアミノ酸６６−７１の）は、範囲はより小さいが、活性の減少を誘発した。大量のＤＮＡがトランスフェクションされると、実際に極微阻害性である特定構築物がより大きな阻害性を呈し得るという可能性が存在するため、プラスミドＤＮＡの量を１トランスフェクション当たり２００ｎｇに低減させた。この低減量のＤＮＡを用いるトランスフェクション実験の結果から、配列番号２のアミノ酸４２−４７および６６−７１の欠失は実際に阻害活性の喪失をもたらし、そして配列番号２のアミノ酸５３−５８の欠失はＤＮＡ合成阻害能力の顕著な喪失をもたらすことが確認された。欠失２４−２９、３０−３５は、両ＤＮＡ濃度での野生型の場合と類似した活性を有していた。これらの結果は、ＳＤＩ−１のタンパク質産物の重要な領域がアミノ酸４２および７１間に存在しなければならないことを示す。従って、それらは、配列番号２４２−７１の配列を有するペプチドおよび配列番号２４２−７１の反応性側鎖基を模倣する非ペプチド分子がＳＤＩ−１のもどき体を構成するという結論を裏付ける。特に、好ましいもどき体は配列番号２４９−７７のアミノ酸配列を有する。特に好ましいペプチドもどき体は、配列：WNFDFXXXXPLEGXXXWXXVXXXXLPXXY（配列番号３４）を有する。上記もどき体は、上記方法および下記配列を有するプライマーを用いて形成され得る。
Figure 0004397922
Figure 0004397922
 好ましい非ペプチドもどき体は、配列番号３４の反応性側鎖基を模倣する残基を有する。
これらの突然変異体により誘発されるＤＮＡ合成阻害がｃｄｋキナーゼの阻害を通して行われているか否かを決定するため、精製ｃｄｋ２タンパク質とインビトロ翻訳欠失突然変異タンパク質の結合を調べた。すなわち、ＳＤＩ−１の様々な欠失突然変異体は、Ｔ７ ＲＮＡポリメラーゼ用の転写鋳型としてｐＢluescriptに基づくプラスミドを用いることにより網状赤血球リゼイト（プロメガ）中で翻訳された。インビトロ結合の場合、４５μｌの翻訳産物を、バキュロウイルス発現系から精製された１μｇのｃｄｋ２タンパク質を含む５００μｌ結合緩衝液（５０ミリモルのトリス／ＨＣｌ、ｐＨ７.５、１２０ミリモルのＮａＣｌ、２ミリモルのＥＤＴＡ、０.１％ＮＰ−４０、１ミリモルのＮａＦ、０.１ミリモルのナトリウムバニデート、５μｇ／ｍｌのロイペプチン、５μｇ／ｍｌの大豆トリプシン阻害因子、５μｇ／ｍｌのアプロチニン）に加えた。混合物を４℃で１時間静かに振動させ、次いで７.５μｇの抗ｃｄｋ２ウサギポリクローナル抗体を加えた。混合を４℃で１時間続行した。２時間４０μｌのプロテインＧ＋Ａビーズとインキュベーションすることにより、免疫複合体を吸収させた。次いで、電気泳動およびオートラジオグラフィーの前にマトリックスを０.５mlの結合緩衝液により３回洗浄した。
突然変異構築物は全て、約２３ｋＤの分子量を有するタンパク質を製造した。タンパク質が実際に欠失したＳＤＩ−１生成物であることを証明するため、ＣＡ５（ＨＡ標識配列に対するモノクローナル抗体）を用いてそれらを免疫沈降させると、どの場合も抗体の沈澱に成功した。野生型タンパク質ＳＤＩ−１および３欠失体２４−２９、３０−３５、７２−７７はｃｄｋ２タンパク質と効果的に結合し、これらの構築物のＤＮＡ合成阻害活性がｃｄｋ２への結合の結果であることを示唆していた。対照的に、阻害活性を減らした突然変異体４２−４７、５３−５８および６６−７１は、ｃｄｋ２と結合しなかった。
免疫組織化学
ＳＤＩ−１の細胞内局在性は核であると報告されており、遺伝子のコード化領域の３’末端には核転座シグナルが存在すると推定される。しかしながら、上記で示されているところによると、この推定的核転座シグナルを欠くＣ−末端先端切除タンパク質（ＳＤＩ−１１−７１)は、野生型タンパク質と同じ阻害活性を有することが見いだされた（表１３）。ＭＤＡＨ ０４１細胞へのトランスフェクション後にＳＤＩ−１の様々な欠失突然変異構築物のタンパク質産物の局在性を決定するため、ＨＡ標識の免疫染色を行った。
免疫染色をするため、細胞を約５０％の密集度でガラス製カバーグラスに播種し、トランスフェクション前に一夜接着させた。トランスフェクション後、細胞を３７℃で２４時間インキュベーションし、次いでリン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）により２回洗浄し、調製したばかりのホルムアルデヒド溶液［ＰＢＳ中４％（重量／容量）のパラホルムアルデヒド］に室温で１５分間固定した。次いで、固定した細胞をＰＢＳ中で洗浄し、室温で１０分間ＰＢＳ中５０ミリモルのグリシン中でインキュベーションした。細胞をＰＢＳにより再洗浄し、室温で１０分間ＰＢＳ中０.２％トリトン−Ｘ１００でインキュベーションすることにより浸透させた。ＰＢＳによる追加洗浄後、ＡＢＣキット（供給源）の使用説明書に従い、免疫染色を遂行した。１次抗体（１２ＣＡ５）を、キットで利用可能な緩衝液中で１：１０００に希釈した。
欠失されたが依然として成長阻害性のタンパク質は、核に局在していることが見いだされ、高いパーセンテージの不活性または活性の劣る突然変異タンパク質を発現する細胞は細胞質着色を呈した。これらのデータは、ｃｄｋ結合結果に加えて、核へのＳＤＩ−１の転座はＳＤＩ−１サイクリン−ｃｄｋ複合体の構成に左右されることを強く示している。
すなわち、ＳＤＩ−１のＣ末端領域の先端切除は、配列番号２のアミノ酸１−７１を有するＳＤＩ−１分子が、完全長ＳＤＩ−１タンパク質（配列番号２）とほぼ同じＤＮＡ合成阻害能力を呈することを示した。精巧な欠失分析は、配列番号２の領域４２−７１におけるアミノ酸がキナーゼ阻害およびＤＮＡ合成阻害の両方にとって非常に重要であることを示した。この結果はまた、配列番号２の領域４２−７１にアミノ酸の欠失を有するＳＤＩ−１分子が結合活性を全く呈しないことを示す結果により確認された。
免疫組織化学分析から、活性突然変異タンパク質の大部分が核に局在していることが見いだされた。対照的に、活性を欠くＳＤＩ−１突然変異体は、細胞質に局在していることが見いだされ、核へのＳＤＩ−１の転座が、主としてＳＤＩ−１タンパク質のＣ−末端における核転座様配列の存在ではなくｃｄｋ−サイクリンとの複合体形成能力に左右されることを示した。キナーゼ阻害およびＤＮＡ合成阻害にとって配列番号２の領域４２−７１が重要であることから、この領域を非常に詳細に試験した。この分析は、相同領域（配列番号２の４９−５３および５８−６１）により、ｃｄｋ阻害因子間に新たな阻害モチーフが与えられることを明白に示した（例えばＳＤＩ−１およびｐ２７）。
上記結果は、明らかにＤＮＡ合成阻害に関与する領域としてＳＤＩ−１タンパク質のアミノ末端領域をとらえている。微細なマッピング試験は、遺伝子の負の成長作用にとって非常に重大なものとしてアミノ酸４８−６５間の領域をとらえている。これらのデータはまた、遺伝子産物が活性阻害に関与するとき、それは細胞核に局在しており、タンパク質の不活性形態は細胞質に残存していることを立証している。この後の方の観察については、推定的核局在性シグナルがタンパク質のカルボキシ末端領域に存在することに注目すると興味深い。それにもかかわらず、このシグナル配列を排除するアミノ酸７２−１６４の欠失により、ＤＮＡ合成は充分に阻害され得、核において発現される。これは、何らかの他の分子（複数も可）、おそらくはＳＤＩ−１が会合するサイクリン、ｃｄｋおよびＰＣＮＡの複合体がＳＤＩ−１タンパク質を核へ輸送することを示している。
本発明をその実施態様と結び付けて記載したが、さらに修飾が加えられ得ること、およびこの出願が、総じて本発明の原理に従い、本発明が関係する技術分野内における既知または慣例的実践の範囲内から生まれ、上記の本質的特徴に適用され得、後記請求の範囲に従う、本開示から出発したものを含め、本発明の変形、用途または適応を全て包含するものであることは言うまでもない。
配列表
（１） 一般的情報：
（ｉ） 特許出願人：ベイラー・カレッジ・オブ・メディシン
スミス、ジェームス・アール
（ii） 発明の名称：老化細胞由来ＤＮＡ合成阻害因子
(iii) 配列の数：３６
（iv） 連絡先：
（Ａ） 名宛人：ホーレイ・アンド・サイモン
（Ｂ） 通り：エヌ・ダブリュー、ペンシルバニア・アベニュー１２２９番
（Ｃ） 市：ワシントン
（Ｄ） 州：ディー・シー
（Ｅ） 国：アメリカ合衆国
（Ｆ） ＺＩＰ：２０００４
（ｖ） コンピューター解読書式：
（Ａ） 媒体型：フロッピー・ディスク
（Ｂ） コンピューター：ＩＢＭ ＰＣコンパティブル
（Ｃ） オペレーティング・システム： ＰＣ−ＤＯＳ／ＭＳ−ＤＯＳ
（Ｄ） ソフトウエア：PatentIn Release ＃１.０、Version ＃１.２５
（vi） 本出願のデータ：
（Ａ） 出願番号：ＵＳ
（Ｂ） 出願日：
（Ｃ） 分類：
(vii) 優先権出願データ
（Ａ） 出願番号：US 07／808,523
（Ｂ） 出願日：１９９１年１２月１６日
(vii) 優先権出願データ
（Ａ） 出願番号：US 07／970,462
（Ｂ） 出願日：１９９２年１１月２日
(vii) 優先権出願データ
（Ａ） 出願番号：US 08／113,372
（Ｂ） 出願日：１９９３年８月３０日
(vii) 優先権出願データ
（Ａ） 出願番号：US 08／153,564
（Ｂ） 出願日：１９９３年１１月１７日
(vii) 優先権出願データ
（Ａ） 出願番号：US 08／203,535
（Ｂ） 出願日：１９９４年２月２５日
(vii) 優先権出願データ
（Ａ） 出願番号：US 08／229,420
（Ｂ） 出願日：１９９４年４月１５日
(vii) 優先権出願データ
（Ａ） 出願番号：US 08／274,535
（Ｂ） 出願日：１９９４年７月１３日
(viii) 弁理士／代理人情報：
（Ａ） 氏名：オイエルバッハ、ジェフリー・アイ
（Ｂ） 登録番号：３２,６８０
（Ｃ） 参照／整理番号：２２５−１０２−ＣＩＰ７−ＰＣＴ
（ix） 電話連絡先情報：
（Ａ） 電話番号：(２０２) ３８３−７４５１
（Ｂ） ファックス番号：(２０２) ３８３−６６１０
（２） 配列番号１の情報：
（ｉ） 配列の特徴
（Ａ） 長さ：２１０６塩基対
（Ｂ） 型：核酸
（Ｃ） 鎖の数：一本鎖
（Ｄ） トポロジー：直鎖状
（ii） 配列の種類：ｃＤＮＡ
(iii) ハイポセティカル：ＮＯ
（iv） アンチセンス：ＮＯ
（vi） 起源：
（Ａ）生物名：ホモ・サピエンス
（Ｂ）細胞の種類：老化ヒト細胞
(vii) 直接の起源：
（Ａ）ライブラリー名：老化細胞由来ｃＤＮＡライブラリー
（Ｂ）クローン名：ＳＤＩ−１
（xi） 配列：配列番号１：
Figure 0004397922
Figure 0004397922
（２） 配列番号２の情報：
（ｉ） 配列の特徴
（Ａ） 長さ：１６４アミノ酸
（Ｂ） 型：アミノ酸
（Ｄ） トポロジー：直鎖状
（ii） 配列の種類：タンパク質
(iii) ハイポセティカル：ＮＯ
（iv） アンチセンス：ＮＯ
（vi） 起源：
（Ａ）生物名：ホモ・サピエンス
（Ｂ）ストレイン：ＳＤＩ−１
(vii) 直接の起源：
（Ａ）ライブラリー名：老化細胞由来ｃＤＮＡライブラリー
（xi） 配列：配列番号２：
Figure 0004397922
Figure 0004397922
（２） 配列番号３の情報：
（ｉ） 配列の特徴
（Ａ） 長さ：１９塩基対
（Ｂ） 型：核酸
（Ｃ） 鎖の数：一本鎖
（Ｄ） トポロジー：直鎖状
（ii） 配列の種類：ｃＤＮＡ
(iii) ハイポセティカル：ＮＯ
（iv） アンチセンス：ＹＥＳ
（vi） 起源：
（Ａ）生物名：ホモ・サピエンス
（xi） 配列：配列番号３：
Figure 0004397922
（２） 配列番号４の情報：
（ｉ） 配列の特徴
（Ａ） 長さ：１２アミノ酸
（Ｂ） 型：アミノ酸
（Ｄ） トポロジー：直鎖状
（ii） 配列の種類：ペプチド
(iii) ハイポセティカル：ＮＯ
（ｖ） フラグメント型：Ｎ末端
(vii) 直接の起源：
（Ｂ）クローン名：[His]６リーダーペプチド
（xi） 配列：配列番号４：
Figure 0004397922
（２） 配列番号５の情報：
（ｉ） 配列の特徴
（Ａ） 長さ：６９９塩基対
（Ｂ） 型：核酸
（Ｃ） 鎖の数：一本鎖
（Ｄ） トポロジー：直鎖状
（ii） 配列の種類：ｃＤＮＡ
(iii) ハイポセティカル：ＮＯ
（iv） アンチセンス：ＮＯ
（vi） 起源：
（Ａ）生物名：シストソーマ・ジャポニカム
(vii) 直接の起源：
（Ｂ）クローン名：ＧＳＴ
（xi） 配列：配列番号５：
Figure 0004397922
（２） 配列番号６の情報：
（ｉ） 配列の特徴
（Ａ） 長さ：２３２アミノ酸
（Ｂ） 型：アミノ酸
（Ｄ） トポロジー：直鎖状
（ii） 配列の種類：タンパク質
(iii) ハイポセティカル：ＮＯ
（vi） 起源：
（Ａ）生物名：シストソーマ・ジャポニカム
(vii) 直接の起源：
（Ｂ）クローン名：ＧＳＴ
（xi） 配列：配列番号６：
Figure 0004397922
Figure 0004397922
（２） 配列番号７の情報：
（ｉ） 配列の特徴
（Ａ） 長さ：１３塩基対
（Ｂ） 型：核酸
（Ｃ） 鎖の数：一本鎖
（Ｄ） トポロジー：直鎖状
（ii） 配列の種類：ｃＤＮＡ
(iii) ハイポセティカル：ＮＯ
（iv） アンチセンス：ＮＯ
(vii) 直接の起源：
（Ｂ）クローン名：GST−SDI−１遺伝子融合体のリンカーフラグメント
（xi） 配列：配列番号７：
Figure 0004397922
（２） 配列番号８の情報：
（ｉ） 配列の特徴
（Ａ） 長さ：１０塩基対
（Ｂ） 型：核酸
（Ｃ） 鎖の数：一本鎖
（Ｄ） トポロジー：直鎖状
（ii） 配列の種類：ｃＤＮＡ
(iii) ハイポセティカル：ＮＯ
（iv） アンチセンス：ＮＯ
(vii) 直接の起源：
（Ｂ）クローン名：GST−SDI−１遺伝子融合体のリンカーフラグメント
（xi） 配列：配列番号８：
Figure 0004397922
（２） 配列番号９の情報：
（ｉ） 配列の特徴
（Ａ） 長さ：７アミノ酸
（Ｂ） 型：アミノ酸
（Ｄ） トポロジー：直鎖状
（ii） 配列の種類：ペプチド
(iii) ハイポセティカル：ＮＯ
（ｖ） フラグメント型：中間部
(vii) 直接の起源：
（Ｂ）クローン名：ＧＳＴ−ＳＤＩ−１遺伝子融合体のヒンジ領域
（xi） 配列：配列番号９：
Figure 0004397922
（２） 配列番号１０の情報：
（ｉ） 配列の特徴
（Ａ） 長さ：１１９４塩基対
（Ｂ） 型：核酸
（Ｃ） 鎖の数：一本鎖
（Ｄ） トポロジー：直鎖状
（ii） 配列の種類：ｃＤＮＡ
(iii) ハイポセティカル：ＮＯ
（iv） アンチセンス：ＮＯ
(vii) 直接の起源：
（Ｂ）クローン名：ＧＳＴ−ＳＤＩ−１遺伝子融合
（xi） 配列：配列番号１０：
Figure 0004397922
（２） 配列番号１１の情報：
（ｉ） 配列の特徴
（Ａ） 長さ：３９７アミノ酸
（Ｂ） 型：アミノ酸
（Ｄ） トポロジー：直鎖状
（ii） 配列の種類：タンパク質
(iii) ハイポセティカル：ＮＯ
(vii) 直接の起源：
（Ｂ）クローン名：ＧＳＴ−ＳＤＩ−１融合タンパク質
（xi） 配列：配列番号１１：
Figure 0004397922
Figure 0004397922
（２） 配列番号１２の情報：
（ｉ） 配列の特徴
（Ａ） 長さ：２４塩基対
（Ｂ） 型：核酸
（Ｃ） 鎖の数：一本鎖
（Ｄ） トポロジー：直鎖状
（ii） 配列の種類：ｃＤＮＡ
(iii) ハイポセティカル：ＮＯ
（iv） アンチセンス：ＮＯ
(vii) 直接の起源：
（Ｂ）クローン名：プライマー１２６１４
（xi） 配列：配列番号１２：
Figure 0004397922
（２） 配列番号１３の情報：
（ｉ） 配列の特徴
（Ａ） 長さ：２４塩基対
（Ｂ） 型：核酸
（Ｃ） 鎖の数：一本鎖
（Ｄ） トポロジー：直鎖状
（ii） 配列の種類：ｃＤＮＡ
(iii) ハイポセティカル：ＮＯ
（iv） アンチセンス：ＮＯ
(vii) 直接の起源：
（Ｂ）クローン名：プライマー１２６１５
（xi） 配列：配列番号１３：
Figure 0004397922
（２） 配列番号１４の情報：
（ｉ） 配列の特徴
（Ａ） 長さ：２０塩基対
（Ｂ） 型：核酸
（Ｃ） 鎖の数：一本鎖
（Ｄ） トポロジー：直鎖状
（ii） 配列の種類：ｃＤＮＡ
(iii) ハイポセティカル：ＮＯ
（iv） アンチセンス：ＮＯ
(vii) 直接の起源：
（Ｂ）クローン名：プライマー
（xi） 配列：配列番号１４：
Figure 0004397922
（２） 配列番号１５の情報：
（ｉ） 配列の特徴
（Ａ） 長さ：６０塩基対
（Ｂ） 型：核酸
（Ｃ） 鎖の数：一本鎖
（Ｄ） トポロジー：直鎖状
（ii） 配列の種類：ｃＤＮＡ
(iii) ハイポセティカル：ＮＯ
（iv） アンチセンス：ＮＯ
(vii) 直接の起源：
（Ｂ）クローン名：プライマー
（xi） 配列：配列番号１５：
Figure 0004397922
（２） 配列番号１６の情報：
（ｉ） 配列の特徴
（Ａ） 長さ：３０塩基対
（Ｂ） 型：核酸
（Ｃ） 鎖の数：一本鎖
（Ｄ） トポロジー：直鎖状
（ii） 配列の種類：ｃＤＮＡ
(iii) ハイポセティカル：ＮＯ
（iv） アンチセンス：ＮＯ
(vii) 直接の起源：
（Ｂ）クローン名：プライマー
（xi） 配列：配列番号１６：
Figure 0004397922
（２） 配列番号１７の情報：
（ｉ） 配列の特徴
（Ａ） 長さ：３０塩基対
（Ｂ） 型：核酸
（Ｃ） 鎖の数：一本鎖
（Ｄ） トポロジー：直鎖状
（ii） 配列の種類：ｃＤＮＡ
(iii) ハイポセティカル：ＮＯ
（iv） アンチセンス：ＮＯ
(vii) 直接の起源：
（Ｂ）クローン名：プライマー
（xi） 配列：配列番号１７：
Figure 0004397922
（２） 配列番号１８の情報：
（ｉ） 配列の特徴
（Ａ） 長さ：３１塩基対
（Ｂ） 型：核酸
（Ｃ） 鎖の数：一本鎖
（Ｄ） トポロジー：直鎖状
（ii） 配列の種類：ｃＤＮＡ
(iii) ハイポセティカル：ＮＯ
（iv） アンチセンス：ＮＯ
(vii) 直接の起源：
（Ｂ）クローン名：プライマー
（xi） 配列：配列番号１８：
Figure 0004397922
（２） 配列番号１９の情報：
（ｉ） 配列の特徴
（Ａ） 長さ：３１塩基対
（Ｂ） 型：核酸
（Ｃ） 鎖の数：一本鎖
（Ｄ） トポロジー：直鎖状
（ii） 配列の種類：ｃＤＮＡ
(iii) ハイポセティカル：ＮＯ
（iv） アンチセンス：ＮＯ
(vii) 直接の起源：
（Ｂ）クローン名：プライマー
（xi） 配列：配列番号１９：
Figure 0004397922
（２） 配列番号２０の情報：
（ｉ） 配列の特徴
（Ａ） 長さ：３０塩基対
（Ｂ） 型：核酸
（Ｃ） 鎖の数：一本鎖
（Ｄ） トポロジー：直鎖状
（ii） 配列の種類：ｃＤＮＡ
(iii) ハイポセティカル：ＮＯ
（iv） アンチセンス：ＮＯ
(vii) 直接の起源：
（Ｂ）クローン名：プライマー
（xi） 配列：配列番号２０：
Figure 0004397922
（２） 配列番号２１の情報：
（ｉ） 配列の特徴
（Ａ） 長さ：３０塩基対
（Ｂ） 型：核酸
（Ｃ） 鎖の数：一本鎖
（Ｄ） トポロジー：直鎖状
（ii） 配列の種類：ｃＤＮＡ
(iii) ハイポセティカル：ＮＯ
（iv） アンチセンス：ＮＯ
(vii) 直接の起源：
（Ｂ）クローン名：プライマー
（xi） 配列：配列番号２１：
Figure 0004397922
（２） 配列番号２２の情報：
（ｉ） 配列の特徴
（Ａ） 長さ：３６塩基対
（Ｂ） 型：核酸
（Ｃ） 鎖の数：一本鎖
（Ｄ） トポロジー：直鎖状
（ii） 配列の種類：ｃＤＮＡ
(iii) ハイポセティカル：ＮＯ
（iv） アンチセンス：ＮＯ
(vii) 直接の起源：
（Ｂ）クローン名：プライマー
（xi） 配列：配列番号２２：
Figure 0004397922
（２） 配列番号２３の情報：
（ｉ） 配列の特徴
（Ａ） 長さ：３６塩基対
（Ｂ） 型：核酸
（Ｃ） 鎖の数：一本鎖
（Ｄ） トポロジー：直鎖状
（ii） 配列の種類：ｃＤＮＡ
(iii) ハイポセティカル：ＮＯ
（iv） アンチセンス：ＮＯ
(vii) 直接の起源：
（Ｂ）クローン名：プライマー
（xi） 配列：配列番号２３：
Figure 0004397922
（２） 配列番号２４の情報：
（ｉ） 配列の特徴
（Ａ） 長さ：３０塩基対
（Ｂ） 型：核酸
（Ｃ） 鎖の数：一本鎖
（Ｄ） トポロジー：直鎖状
（ii） 配列の種類：ｃＤＮＡ
(iii) ハイポセティカル：ＮＯ
（iv） アンチセンス：ＮＯ
(vii) 直接の起源：
（Ｂ）クローン名：プライマー
（xi） 配列：配列番号２４：
Figure 0004397922
（２） 配列番号２５の情報：
（ｉ） 配列の特徴
（Ａ） 長さ：３０塩基対
（Ｂ） 型：核酸
（Ｃ） 鎖の数：一本鎖
（Ｄ） トポロジー：直鎖状
（ii） 配列の種類：ｃＤＮＡ
(iii) ハイポセティカル：ＮＯ
（iv） アンチセンス：ＮＯ
(vii) 直接の起源：
（Ｂ）クローン名：プライマー
（xi） 配列：配列番号２５：
Figure 0004397922
（２） 配列番号２６の情報：
（ｉ） 配列の特徴
（Ａ） 長さ：３６塩基対
（Ｂ） 型：核酸
（Ｃ） 鎖の数：一本鎖
（Ｄ） トポロジー：直鎖状
（ii） 配列の種類：ｃＤＮＡ
(iii) ハイポセティカル：ＮＯ
（iv） アンチセンス：ＮＯ
(vii) 直接の起源：
（Ｂ）クローン名：プライマー
（xi） 配列：配列番号２６：
Figure 0004397922
（２） 配列番号２７の情報：
（ｉ） 配列の特徴
（Ａ） 長さ：３６塩基対
（Ｂ） 型：核酸
（Ｃ） 鎖の数：一本鎖
（Ｄ） トポロジー：直鎖状
（ii） 配列の種類：ｃＤＮＡ
(iii) ハイポセティカル：ＮＯ
（iv） アンチセンス：ＮＯ
(vii) 直接の起源：
（Ｂ）クローン名：プライマー
（xi） 配列：配列番号２７：
Figure 0004397922
（２） 配列番号２８の情報：
（ｉ） 配列の特徴
（Ａ） 長さ：３６塩基対
（Ｂ） 型：核酸
（Ｃ） 鎖の数：一本鎖
（Ｄ） トポロジー：直鎖状
（ii） 配列の種類：ｃＤＮＡ
(iii) ハイポセティカル：ＮＯ
（iv） アンチセンス：ＮＯ
(vii) 直接の起源：
（Ｂ）クローン名：プライマー
（xi） 配列：配列番号２８：
Figure 0004397922
（２） 配列番号２９の情報：
（ｉ） 配列の特徴
（Ａ） 長さ：３６塩基対
（Ｂ） 型：核酸
（Ｃ） 鎖の数：一本鎖
（Ｄ） トポロジー：直鎖状
（ii） 配列の種類：ｃＤＮＡ
(iii) ハイポセティカル：ＮＯ
（iv） アンチセンス：ＮＯ
(vii) 直接の起源：
（Ｂ）クローン名：プライマー
（xi） 配列：配列番号２９：
Figure 0004397922
（２） 配列番号３０の情報：
（ｉ） 配列の特徴
（Ａ） 長さ：３０塩基対
（Ｂ） 型：核酸
（Ｃ） 鎖の数：一本鎖
（Ｄ） トポロジー：直鎖状
（ii） 配列の種類：ｃＤＮＡ
(iii) ハイポセティカル：ＮＯ
（iv） アンチセンス：ＮＯ
(vii) 直接の起源：
（Ｂ）クローン名：プライマー
（xi） 配列：配列番号３０：
Figure 0004397922
（２） 配列番号３１の情報：
（ｉ） 配列の特徴
（Ａ） 長さ：３０塩基対
（Ｂ） 型：核酸
（Ｃ） 鎖の数：一本鎖
（Ｄ） トポロジー：直鎖状
（ii） 配列の種類：ｃＤＮＡ
(iii) ハイポセティカル：ＮＯ
（iv） アンチセンス：ＮＯ
(vii) 直接の起源：
（Ｂ）クローン名：プライマー
（xi） 配列：配列番号３１：
Figure 0004397922
（２） 配列番号３２の情報：
（ｉ） 配列の特徴
（Ａ） 長さ：４１塩基対
（Ｂ） 型：核酸
（Ｃ） 鎖の数：一本鎖
（Ｄ） トポロジー：直鎖状
（ii） 配列の種類：ｃＤＮＡ
(iii) ハイポセティカル：ＮＯ
（iv） アンチセンス：ＮＯ
(vii) 直接の起源：
（Ｂ）クローン名：プライマー
（xi） 配列：配列番号３２：
Figure 0004397922
（２） 配列番号３３の情報：
（ｉ） 配列の特徴
（Ａ） 長さ：４０塩基対
（Ｂ） 型：核酸
（Ｃ） 鎖の数：一本鎖
（Ｄ） トポロジー：直鎖状
（ii） 配列の種類：ｃＤＮＡ
(iii) ハイポセティカル：ＮＯ
（iv） アンチセンス：ＮＯ
(vii) 直接の起源：
（Ｂ）クローン名：プライマー
（xi） 配列：配列番号３３：
Figure 0004397922
（２） 配列番号３４の情報：
（ｉ） 配列の特徴
（Ａ） 長さ：２９アミノ酸
（Ｂ） 型：アミノ酸
（Ｄ） トポロジー：直鎖状
（ii） 配列の種類：ペプチド
(iii) ハイポセティカル：ＮＯ
（ｖ） フラグメント型：中間部
(vii) 直接の起源：
（Ｂ）クローン名：ペプチドもどき体フラグメント
（xi） 配列：配列番号３４：
Figure 0004397922
（２） 配列番号３５の情報：
（ｉ） 配列の特徴
（Ａ） 長さ：５４塩基対
（Ｂ） 型：核酸
（Ｃ） 鎖の数：一本鎖
（Ｄ） トポロジー：直鎖状
（ii） 配列の種類：ｃＤＮＡ
(iii) ハイポセティカル：ＮＯ
（iv） アンチセンス：ＮＯ
(vii) 直接の起源：
（Ｂ）クローン名：プライマー
（xi） 配列：配列番号３５：
Figure 0004397922
（２） 配列番号３６の情報：
（ｉ） 配列の特徴
（Ａ） 長さ：４８塩基対
（Ｂ） 型：核酸
（Ｃ） 鎖の数：一本鎖
（Ｄ） トポロジー：直鎖状
（ii） 配列の種類：ｃＤＮＡ
(iii) ハイポセティカル：ＮＯ
（iv） アンチセンス：ＮＯ
(vii) 直接の起源：
（Ｂ）クローン名：プライマー
（xi） 配列：配列番号３６：
Figure 0004397922
図１は、ｃＤＮＡクローニングおよび発現ベクター、ｐｃＤＳＲα△（ＢはＢamＨＩ部位を表す）の構造を示す。 図２Ａは、若い細胞のＤＮＡ合成に対して阻害性のｃＤＮＡクローンを同定するものである。異なる棒は、個々のプラスミドに対する独立したトランスフェクション実験を表しており、＊は、実施されなかったことを示し、負の数は、対照より高い標識指数を示す。各グラフは、プラスミドの異なるプールに由来する結果を示す。 図２Ｂは、若い細胞のＤＮＡ合成に対して阻害性のｃＤＮＡクローンを同定するものである。異なる棒は、個々のプラスミドに対する独立したトランスフェクション実験を表しており、＊は、実施されなかったことを示し、負の数は、対照より高い標識指数を示す。各グラフは、プラスミドの異なるプールに由来する結果を示す。 図２Ｃは、若い細胞のＤＮＡ合成に対して阻害性のｃＤＮＡクローンを同定するものである。異なる棒は、個々のプラスミドに対する独立したトランスフェクション実験を表しており、＊は、実施されなかったことを示し、負の数は、対照より高い標識指数を示す。各グラフは、プラスミドの異なるプールに由来する結果を示す。 図３は、アンチセンスＳＤＩ ｃＤＮＡトランスフェクションを示す。アンチセンスｃＤＮＡ発現プラスミドを作り、若い細胞中にｐＣＭＶβと同時トランスフェクションした。レーン１：対照ｐｃＤＳＲα△、レーン２：ｐｃＤＳＲα△−ＳＤＩ−１、レーン３：ｐｃＤＳＲα△アンチＳＤＩ−１、レーン４：ｐｃＤＳＲα△−ＳＤＩ−２、レーン５：ｐｃＤＳＲα△−アンチＳＤＩ−２。 図４は、細胞加齢中の総ＲＮＡからのポリＡ＋ＲＮＡ回収における変化を示す。 図５Ａは、ＳＤＩ−１ ｃＤＮＡのヌクレオチド配列（配列番号１）とアミノ酸配列（配列番号２）を与える。 図５Ｂは、ＳＤＩ−１ ｃＤＮＡのヌクレオチド配列（配列番号１）とアミノ酸配列（配列番号２）を与える。 図５Ｃは、ＳＤＩ−１ ｃＤＮＡのヌクレオチド配列（配列番号１）とアミノ酸配列（配列番号２）を与える。 図５Ｄは、ＳＤＩ−１ ｃＤＮＡのヌクレオチド配列（配列番号１）とアミノ酸配列（配列番号２）を与える。 図６は、４Ｇyのγ−照射にさらす（白抜き円）か、または４００μＭ過酸化水素に１時間さらした（塗りつぶし円）後に得られた若い細胞（集団倍加２８）におけるＳＤＩ−１誘導の動力学を示す。

Claims (5)

  1. 配列番号３の配列からなる、ＳＤＩ−１アンチセンス核酸分子。
  2. 請求項１に記載のＳＤＩ−１アンチセンス核酸分子を含む、静止細胞の増殖の誘導に有用な組成物。
  3. 請求項１に記載の核酸分子を含むプラスミド。
  4. 請求項１に記載の核酸分子を含む発現ベクター。
  5. ベクターがウイルスベクターである、請求項４に記載の発現ベクター。
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