KR100304033B1 - 세포증식질환치료용약제학적조성물 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 암, 악성 세포 증식, 양성 증식 질환 및 기타 병적 세포 증식 질환에 존재하는 부적당한 또는 병적인 세포성장을 치료하기 위한 방법을 제공하는 것이다.
또한, 본 발명은 비정상적으로 증식하는 세포로 네가티브-작용성 성장 조절 유전자(NGR)의 하나 이상의 활성유전자 복사물을 투여함을 특징으로 하여 개체에서 세포-증식 질환을 치료하는 방법을 제공하는 것이다.
또다른 양태에서, 본 발명은 PGR 인자의 기능적 발현을 불활성화시키는 본 발명의 활성 DNA 또는 RNA 작제물을 비정상적으로 증식하는 세포로 삽입시켜 비정상적 세포 증식을 억제하는 방법을 제공하는 것이다.

Description

[발명의 명칭]
세포 증식 질환 치료용 약제학적 조성물
[발명의 분야]
본 발명은 네가티브-작용성(negative-acting) 성장 조절(NGR) 인자의 증식 세포로의 삽입을 특징으로 하는 세포 증식 질환의 치료를 위한 치료 양상에 관한 것이다.
[발명의 배경]
세포의 부적당한 국소 증식을 초래하는 병적 상태는 사람 질환의 통상적이 원인이다. 양성(benign) 사람 질환은 신체의 일부분에서 다른 부분으로 전파될 수 없고 일반적으로 성장속도가 더 느리다는 점에서 우선적으로 악성(malignant) 질환(암)과 구별된다. 양성 및 악성 질환 둘다가 사람을 죽이고 실명하게 하고 불구로 만들 수 있다. 복부 수술후의 원하지 않는 내부유착증 및 반혼형성은 장 교액(bowl strangulation) 및 죽음을 초래할 수 있다. 진성 당뇨병으로부터 초래되는 실명은 눈 내부의 신규 혈관의 부적당한 성장으로 인한 것이다. 양성 신경섬유종은 기형(disfiguration)을 야기시킨다. 건선과 같은 피부 질환은 정상 세포의 부적당한 성장과도로 초래되는 장기간의 약질성(debilitating) 진행과정이다. 다수의 상이한 사람 질환이 상기 범주에 해당될 수 있다.
세포의 부적당한 국소 증식으로 초래된 질환은 양성 증식 질환(BPD)로서 총괄하여 언급될 것이다. 과도성장 집단에서 우세한 세포가 섬유아세포인 경우, 상기 아그룹의 질환은 "섬유증식" 질환으로서 공지되어 있다. 우세한 세포가 혈관 내피(혈관의 내부면에 늘어서 있는 세포 타입)인 경우, 아그룹은 "혈관증식" 질환으로 공지되어 있다. 내피의 부적당한 과도성장은 심각한 피부 질환을 초래한다. 현재, 상기 양성 증식 질환의 치료는 빈번하게 수술, 방사선 및/또는 화학요법중 하나를 사용한 조직 박리를 요구한다.
이러한 치료는 모두 병적 조직뿐만아니라 정상 조직에로의 손상이 일반적으로 수반된다. 레이저 또는 국소 한랭요법과 같은 기타 국소 치료양식은 좀처럼 성공적이지 않다.
[세포 증식의 조절]
세포 증식의 조절은 근간에 와서야 이해되기 시작한 복잡한 과정이다. 세포가 성장되어야 하는지 성장되지 않아야 하는지의 여부는 네가티브-작용성 성장 인자와 포지티브-작용성 인자의 발현의 균형에 의존한다. 네가티브-작용성 성장 조절(NGR) 인자는 세포내에서 발현되거나 세포에 제공되는 경우 세포 성장의 억제를 초래하는 것들이다. 포지티브-작용성 성장 조절(PGR) 인자는 일반적으로 세포내에서 발현되거나 세포에 제공되는 경우 세포의 증식을 자극하는 생성물 또는 유전자 및 이의 생성물이다.
[네가티브 성장 조절(NGR)인자]
네가티브-작용성 성장 유전자의 발현은 세포 증식을 조절하고 제어하는데 있어서 중요하다. NGR 인자의 예에는 정태(quiescent)이거나 휴지 상태인 세포에서 발현이 유발되는 것으로 동정된 수개의 유전자가 있다. 이러한 유전자는 네가티브 성장 조절(NGR) 유전자로 명명될 수 있다. 이들 네가티브-작용성 성장 조절 유전자의 하향 조절은 세포 증식의 억제의 제거를 초래한다. 이들 유전자 또는 유전자 생성물의 불활성화를 초래하는 생물학적 또는 생리학적 현상이외에, 네가티브-작용성 성장 조절 유전자의 하향 조절은 세포 증식은 억제의 제거를 초래한다. 이들 유전자, 또는 유전자 생성물의 불활성화를 초래하는 생물학적 또는 생리학적 현상이외에, 네가팁-작용성 성장 조절 유전자가 불활성이거나 부재하는 특정 병적 상태가 확인되었다. 이들 유전자는 유전자의 결실, 돌연변이 또는 하향 조절때문에 불활성이거나, 유전자 생성물에 결합하거나 유전자 생성물을 불활성으로 만들어 유전자의 발현 또는 유전자의 생성물의 기능 및 이로 인해 세포 증식을 차단하거나 억제하는 능력을 부분적으로나 완전히 억제하는 인자의 과다로 인해 불활성일 수 있다.
근래에, 종양 세포 증힉에 대해 네가티브 효과를 갖는 종양 억제 유전자로 명명되는 수개의 NGR 유전자가 동정되었다. 이들 유전자는 사람 망막 아종 유전자 Rb-1, p53 유전자, DCC 유전자, NF1 유전자, Wilms 종양 유전자, NM 23 유전자, 갑상선 호르몬 수용체 유전자 및 레티노산 수용체를 포함하지만, 이들로 제한되지는 않는다. 몇몇 이러한 네가티브 성장 조절 유전자의 부재 또는 불활성화는 특정 타입의 암과 상호관련되어있다.
사람 망막아종 유전자인 Rb1은, 본원에서 네가티브 성장 조절(NGR) 우전자로 명명되는 상기 부류의 종양 억제 유전자의 원형이며, 이때 세포내 유전자의 양쪽 대립형질(allele)의 부재 또는 유전자 또는 이의 유전자 생성물의 발현의 억제는 신생물성(neoplastic) 또는 비정상적 세포 증식을 초래할 것이다. RB1 유전자의 양쪽 대립 형질의 상실 또는 불활성화는 망막아종과 같은 종양 및 임상적으로 관련된 중앙, 예를 들어, 골육종, 섬유육종, 연조직육종 및 흑색종의 임상적 증후를 수반한다.
또한, Rb-1 유전자의 기능의 상실은 제1기의 암의 기타 타입, 예를 들어, 제1기의 소세포 폐암(SCLC), 연조직 육종, 유방암종, 경부암종 및 전립선 암종과 연관되어 있다.
Rb-1 유전자의 Rb-1 유전자를 상실한 종양 세포로의 도입은 종양 성장을 억제한다. 예를 들어, Rb-1의 cDNA가 내인성 Rb 유전자를 상실한 골육종 세포주 SAOS2및 전립선압 세포주 DU145로 전달되는 경우, 상기 종양세포중 일부의 성장이 생체내에서 특이적으로 억제된다[참조 : Huang et al., (1988) Science 242: 1563; Bookstein et al.,(1990) Science 247: 712]. 상기 문헌은 망막아종 유전자가 종양원성 표현형을 특이적으로 억제하면서 정상 세포에는 영향을 주지 않는다고 결론짓고 있다.
[포지티브-작용성 성장 조절(PGR) 인자]
포지티브-작용성 성장 조절(PGR) 인자는 몇몇 형태의 암에서, 정상세포에서 세포증식동안 그리고 특정 병적 세포 증식 질환에서 활성화되어 발현되는 것으로 나타나는 모든 원종양 발생 유전자(proto-oncogene)를 포함한다. 원종양발생 유전자의 발현의 활성화는 세포 증식에서 필수불가결한 것이다. 상기 부류에 있는 많은 특이 유전자는 성장 인자 또는 이의 수용체를 암호화하는 것으로 밝혀졌다. 몇몇 원종양 발생 유전자의 발현은 세포가 성장 인자에 노출되는 경우의 증식 상태와 밀접하게 연관되어 있다고 밝혀졌다. 많은 성장 인자, 예를 들어, 혈소판 유래 성장 인자(PDGF), 표피 성장 인자(EGF), 인슐린 및 트랜스페린이 세포증식을 위해 필요하다. 성장 인자에 대한 특이 수용체 분자를 발현하지 않은 세포는 성장 인자가 세포로 제공되는 경우에서 조차 증식할 수 없다. 한편, 수용체의 발현의 정상적 네가티브 조절이 방해되어 수용체의 비제어된 발현이 초래되는 세포는 비제어된 방식으로 증식할 것이다. 정태성 세포가 혈소판 유래 성장 인자(PDGF) 또는 표피 성장 인자(EGF)에 노출되는 경우, c-fos 및 c-myc를 포함하는 수개의 원종양발생 유전자의 새로운 mRNA의 합성이 유발된다. 유사하게, 휴지상태의 간세포는 부분적 헤파토미(hepatomy)에 의해 자극되어 생체내에서 성장할 수 있다. 이러한 성장의 자극은 c-myc를 포함하는 수개의 원종양발생 유전자의 상승된 발현과 관련되어 있다. 이들 PGR 유전자의 활성화는 정상적 세포증식 뿐만아니라 비정상적 또는 병적 세포증식에 요구된다.
병적 세포 증식 질환 또는 질병은 원종양발생유전자의 부적당한 활성화와 종종 관련된다. 예를 들어, c-myc 발현 수준은 비-임파구 백혈병 세포주 HL-60에서 고도로 증폭된다. HL-60 세포가 화학적 유도제, 예를 들어, 레티노산 및 디메틸 설폭사이드에 의해 증식을 중단하도록 유도되는 경우, c-myc의 수준은 하향조절된다. 다른 한편으로, c-myc 또는 c-myb의 5' 말단에 상보적인 DNA 작제물에의 HL-60 세포의 노출은 이들 mRNA의 해독의 중지를 야기시키고, c-myc 또는 c-myb 단백질 발현이 하향 조절되어 처리된 세포의 세포증식 및 분화의 정지를 초래한다[참조 : Wickstorm et al (1988) Proc. Natl. Acad. Sci 85: 1028: Anfossi et al (1989) Proc. Natl. Acad. Sci. 86: 3379].
[발명의 요약]
한 국면에서, 본 발명은 암, 악성 세포 증식, 양성 증식 질환 및 기타 병적 세포 증식 질환에서 존재하는 부적당하거나 병적인 세포 성장의 치료에 대한 일반화된 접근을 제공한다.
또다른 국면에서, 본 발명은 네가티브-작용성 성장 조절(NGR) 유전자인자의 하나 이상의 활성 유전자 복사물을 비정상적으로 증식하는 세포에 투여함을 특징으로 하여 각 개체에서 세포 증식 질환을 치료하는 방법을 제공한다.
또다른 양태에서, 본 발명은 PGR 인자의 기능적 발현을 불활성화하는 본 발명의 합성 DNA 또는 RNA 작제물을 비정상적으로 증식하는 세포로 삽입시킴에 의해 비정상적 세포 증식을 억제하는 방법을 제공한다.
본 발명의 하나의 양태는 네가티브-작용성 성장 조절(NGR) 유전자의 하나 이상의 활성 유전자 복사물을 투여함을 특징으로하는 각 개체에서 암 및 세포 증식 질환을 치효하는 방법을 제공한다.
하나의 국면에서, 본 발명의 사람 망막아종 유전자, p53 유전자, p85 유전자, p107 유전자, p130 유전자, 레티노산 수용체 유전자, 갑상선 호르몬 수용체 유전자, myo D 유전자, DCC 유전자, NF-1 유전자, 및 NM-23 유전자로 구성된 그룹중에서 선택된 네가티브 작용성 성장 유전자의 하나 이상의 복사물의 삽입에 의해 병적 또는 비정상적 세포 성장 또는 증식을 억제하는 방법을 제공한다.
또다른 양태에서, 본 발명은 종양 발생 유전자 또는 원종양 발생 유전자와 같은 PGR 인자를 함유하는 세포에 본 발명의 리보자임 작제물을 투여하여 암호화된 리보자임이 표적 PGR 유전자 또는 인자의 프리-mRNA(pre-mRNA) 및/또는 mRNA를 파괴시키게 함을 특징으로 하여 병적 세포 증식 질환을 치료하는 방법을 제공한다.
또다른 양태에서, 본 발명은 (1) 네가티브-작용성 성장 조절 유전자 및 (2) PGR 유전자 또는 인자의 프리-mRNA 또는 mRNA에 대해 특이적으로 유래된 리보자임을 암호화하는 DNA로 구성된 그룹중에서 선택된 NGR 인자 하나이상을 비정상적으로 증식하는 세포에 투여함을 특지으로 하여 병적 세포 증식 질환을 치료하는 방법에 관한 것이다.
또 다른 양태에서, 본 발명은 PGR 유전자를 함유하는 세포에 PGR 인자의 정상 기능적 발현을 방해하거나 억제하는 NGR 인자를 투여함을 특징으로하여 병적 세포 증식 질환을 치료하는 방법에 관한 것이다.
본 발명의 추가의 목적은 NGR 인자를 포함하는 DNA 작제물(이 DNA 작제물은 형질환체 숙주세포와 양립할 수 있는(compatible) 제2의 제어 DNA 서열에 작동적으로 연결된 리보자임을 암호화하는 DNA 서열을 발현하는데 효과적인 재조합 발현 벡터를 포함한다)을 종양발생 유전자 또는 원종양 발생 유전자를 함유하는 세포에 투여하여, 상기 DNA 작제물이 종양 발생 유전자, 원종양발생 유전자 또는 기타 PGR 인자의 활성화를 억제하거나 종양 발생 유전자, 원종양 발생 유전자 또는 기타 PGR 인자의 활성활를 억제허거나 종양 발생 유전자, 원종양 발생 유전자 또는 기타 PGR 인자의 유전자 생성물을 불활성화시킴을 특징으로 하여, 병적 세포 증식 질환을 치료하는 방법을 제공한다. 바람직한 양태에서 DNA 작제물을 형질환체 숙주 세포에 존재하는 종양 발생 유전자, 원종양발생유전자 또는 기타 PGR 인자의 유전자 생성물, 또는 nRNA(nuclear RNA) 또는 mRNA(messenger RNA)에 상보적인 서열을 함유하는 리보자임을 암호화하는 DNA 서열을 포함한다. 본 발명의 방법은 PGR 인자의 프리-mRNA 또는 mRNA를 불활성화하기 위해 이용될 수 있으며 바람직하게는 c-myc, c-fos, c-jun, c-myb, c-ras, Kc 및 JE, 트랜스페린 수용체, 인슐린 수용체, PDGF 수용체 및 EGF 수용체로 구성된 그룹중에서 선택된 PGR인자를 불활성화한다. 가장 바람직한 양태에서, 본 발명의 DNA 작제물은 유도가능한 프로모터와 작동적으로 연결된다.
또다른 양태에서, 본 발명은 망막아종 유전자, p53 유전자, p85 유전자, p107 유전자, p103 유전자, 레티노산 수용체, 갑상선 호르몬 수용체, myo D 유전자, DCC 유전자, NF-1 유전자 및 NM-23 유전자로 구성된 그룹중에서 선택된 NGR 유전자의 하나 이상의 활성 유전자 복사물을 세포에 투여함을 특징으로 하여 개체에서 세포-증식 질환을 치료하는 방법을 제공한다. 바람직하 양태에서, 네가티브 성장 조절 유전자는 네가티브 성장 조절 유전자를 암호화하는 DNA 서열을 발현시키는데 효과적인 재조합 발현 벡터를 포함하는 DNA 작제물이다. 바람직하게는, 상기 DNA 작제물은 형질전환제 숙주 세포와 양립할 수 있는 제2의 제어 DNA 서열에 작동적으로 연결된다.
또다른 국면에서, 본 발명은 항-종양발생 유전자, 네가티브 성장 조절유전자, 및 포지티브-작용성 성장 조절 유전자 또는 인자에 대하여 지시된 리보자임을 암호화하는 DNA 작제물을 구성된 그룹중에서 선택된 NGR 인자를 비정상적으로 증식하는 세포에 삽입함으로써 비정상적 세포 증식을 억제하는 방법을 제공하는 것이다.
하나의 양태에서, NGR 인자는 망막아종 유전자인 Rb-1이다.
본 발명의 또다른 국면은 NGR 유전자의 단지 하나의 활성 대립형질을 가지므로써 종양 발생에 대한 소인을 가진 개체를 동정하고, 사람 망막아종유전자, p53 유전자, p85 유전자, p107 유전자, p103 유전자, 레티노산 수용체 유전자, 갑상선 호르몬 수용체 유전자, myo D 유전자, DCC 유전자, NF-1 유전자 및 NM-23 유전자로 구성된 그룹중에서 선택된 네가티브 성장 유전자의 하나 이상의 추가의 복사물을 상기 네가티브 성장 유전자의 충분한 정상적 복사물이 부족하고 수정 또는 연속 발생학적 발달을 허용하는 것으로 동정된 상기 소인을 가진 개체의 난, 정자 또는 수정란으로 삽입시킴을 특징으로 하여, 유전적으로 소인을 갖는 개체에서 암과 같은 비정상적 세포 증식 질환을 억제하고 방지하기 위한 예방학적 치료방법을 제공한다.
본 발명의 바람직한 양태에서, NGR 인자는 레트로바이러스 벡터를 이용하여 증식 세포로 삽입된다. 가장 바람직한 양태에서, 레트로바이러스성 벡터는 결함이 있는 것이며 이는 비-증식성 세포를 형질전환시키지 않을 것이다.
본 발명의 추가의 국면은 병적 세포 증식 질환, 예를 들어, 증식성 안내 질환, 증식성 피부 질환, 예를 들어, 건선, 어린선, 편평태성, 유두종, 기저 세포 암종, 측두린 세포 암종, 모든 기관의 혈관증식 질환 및 신체를 통한 기타 유사한 증식성 세포 질환(단, 이들로 제한되지는 않는다)의 치료를 위한 방법을 제공한다.
본 발명의 기타 및 추가의 국면, 특정 및 잇점은 발명의 목적을 위해 주어진 본 발명의 바람직한 양태에 대한 하기 기술로부터 명백할 것이다.
[도면의 간단한 설명]
제1도는 사람 β액틴 프로모터의 제어하에 있는 Rb-1 cDNA 일부 또는 전부를 함유하는 플라스미드 HuBAcpr-1-neo-Rb의 작제 및 구조를 나타낸 것이다.
제2도는 사람 섬유아세포 세포주 WS1의 증식에 대한 형질감연된 플라스미드의 효과를 나타낸 것이다.
제3도는 사람 방광암종 세포주 TCCSUP의 증식에 대한 형질감염된 플라스미드의 효과를 나타낸 것이다.
제4도는 시험관내 및 생체내 골육종 SaOS2 세포의 증식에 대한 형질감염된 플라스미드의 효과를 나타낸 것이다.
제5도는 리보자임 DNA 작제물을 도식적으로 나타낸 것이다. 판넬 5A는 리보자임 DNA 작제물의 일반적 도식을 나타낸 것이고, 판넬 5B는 Rb RNA에 대해 표적화된 리보자임을 암호화하는 DNA 작제물을 나타낸 것이고 판넬5는C Rb-리보자임의 촉매적 활성을 시험하기 위한 2개의 RNA 주형을 생성하는데 사용되는 Rb-1 함유 플라스미드 PT7B-Rb-FL을 나타낸 것이고, 판넬 5D는 c-myc mRNA에 대해 표적화된 리보자임을 암호화하는 DNA 작제물을 나타낸것이다.
제6도는 하나 이상의 리보자임(판넬 6A), 안티센스(판넬 6B), 및 NGR 유전자(판넬 6C)을 함유하는 레트로바이러스성 벡터를 도식적으로 나타낸 것이다.
제7도는 표적화된 리보자임의 처리전과 후의 2개의 Rb 합성 RNA 주형의 전기영동 양상을 나타낸 것이다.
제8도는 Rb 항체에 의해 침전된 다양한 단백질 전기영동 양상을 나타낸 것이다.
[바람직한 양태의 상세한 설명]
[정의]
용어 "네가티브-작용성 성장 조절 인자"(NGR 인자)는 증식하는 세포에 투여되어 상기 세포의 게놈으로 혼입되는 경우 세포 성장을 감소시키거나 세포의 증식을 억제하는 작용물을 포함함을 의미한다. 본 발명의 하나의 특이적 양태는 강한 프로모터의 촉진하에서 바람직하게는 베히클 또는 벡터로 혼입되는 NGR 유전자인 Rb-1 유전자의 DNA 작제물이다. 바람직하게는, 본 발명의 DNA 작제물은 MuLV계 레트로바이러스성 벡터를 이용하여 표적 세포로 전달된다.
용어 NGR 인자는 특정 유전자, 유전자 암호화 영역 또는 유전자 생성물, 천연 또는 합성 DNA 또는 RNA, 펩타이드, 스테로이드, 또는 세포에 존재하거나 세포에 제공되는 경우 세포 성장 또는 증식의 억제에 기여하는 기타생물학적 물지를 포함함을 의미한다.
예를 들어, NGR 인자의 하나의 타입은 망막아종 유전자 Rb-1, p53 유전자, DCC 유전자, NF-1 유전자, Wilms 종양 유전자, NM 23 유전자, 갑상선 호르몬 수용체 유전자, 레티노산 수용체 유전자 및 p130, p107 및 p85를 암호화하는 유전자로 구성된 그룹(이로써 제한되지는 않는다)중에서 선택된 열성(recessive) 사람 암 유전자(종양 억제 유전자 또는 항-종양 발생 유전자)이다.
NGR 인자의 두번째 타입은 리보자임을 암호화하는 DNA 작제물이다.
상기 DNA 작제물은 (1) c-myc, c-fos, c-jun, c-myb, c-ras, Kc 및 JE로 구성된(이들로 제한되지는 않는다) 그룹중에서 선택된 종양 발생 유전자 또는 원종양발생 유전자; (2) 혈소판 유래 성장 인자(PDGF), 표피 성장 인자(EGE), 트랜스페린 및 인슐린으로 구성된(이들로 제한되지는 않는다) 그룹중에서 선택된 성장 인자 수용체 유전자와 같은 선택된 포지티브-작용성 성자 조절(PGR) 유전자의 RNA 와 결합하여 RNA를 파괴하는 RNA 효소를 생성하도록 고안된다.
용어 "네가티브-작용성 성장 조절(NGR) 유전자"는 망막아종 유전자 Rb-1, p53 유전자, p85 유전자, p107 유전자, p130 유전자, DCC 유전자, NF-1 유전자, Wilms 종양 유전자, NM 23 유전자, 갑상선 호르몬 수용체 유전자 및 레티노산 수용체 유전자로 구성된(이들로 제한되지는 않는다) 그룹중에서 선택된 유전자 또는 유전자 암호화 영역으로 구성된 NGR 인자의 아그룹을 포함함을 의미한다.
용어 "포지티브-작용성 성장 조절 인자"는 특정 유전자 또는 유전자 생성물, 특정 천연 또는 합성 DNA 또는 RNA, 펩타이드, 스테로이드, 또는 세포 성장 또는 증식의 자극에 기여하는 세포에 존재하거나 제공되는 기타 생물학적 물질을 포함함을 의미한다. RGB 인자는 종양발생유전자, 예를 들어, 바이러스성 종양 발생 유전자 vsrc, 원종양발생유전자, 예를 들어, c-myc, 성장 인자 유전자 c-sis, 성장 인자 수용체 유전자, 예를 들어, PDGF 수용체 유전자, 성장 인자, 예를 들어, 인슐린, 성장 인자 수용체, 예를 들어, 인슐린 수용체 또는 트랜스페린 수용체로 구성된(이들로 제한되지는 않는다) 그룹장에서 선택될 수 있다.
용어 "유전자의 기능적 발현"은 유전자의 전사의 억제, 유전자 전사물의 분해(프리-전령 RNA), 스플라이싱(splicing)의 억제, 전령 RNA 파괴, 전령 RNA의 해독의 방지, 단백질의 해독후 변형의 방지, 단백질의 파괴, 또는 단백질의 정상적 기능의 억제를 포함함을 의미한다.
용어 "리보자임"은 선택된 표적 유전자의 mRNA 또는 프리-mRNA를 인지하여 결합하도록 작제된 RNA를 포함함을 의미한다. 리보자임은 상기 프리-mRNA 또는 mRNA를 인지하여 결합한 다음에는, 상기 프리-mRNA 또는 mRNA를 절단하거나 파괴한다. 리보자임은 특정 유전자의 DNA 서열이 공지되어 있는 경우, 그 유전자의 프리-mRNA 또는 mRNA에 대해 표적하되도록 작제될 수 있다.
용어 "형질감염된 플라스미드"는 (1) NGR 유전자 또는 상기 유전자의 일부 및 (2) PGR 인자의 프리 mRNA 및/또는 mRNA를 파괴하도록 작제된 리보자임으로 구성된(이들로 제한되지는 않는다) 그룹중에서 선택된, 선택된 세포로 전달될 수 있는(형질 감염될 수 있는) NGR 인자를 함유하는 세균성 플라스미드를 포함함을 특징으로한다.
용어 "유전자 치료법"은 유전자 발현 및/또는 유전자 생성물의 기능을 조절하기 위한 목적으로 일부 또는 전부의 유전자, DNA 작제물, RNA, 또는 유전자 생성물의 세포, 세포 그룹, 조직, 병적 병변, 기관 또는 유기체로 삽입시킴을 포함함을 특 의미한다.
용어 "예방학적 유전자 치료법"은 질환 및 질산 확산의 부분적 또는 전체적 억제 또는 예방을 위해 사용될 수 있는 유전자를 포함함을 의미하며, 세포, 조직 또는 균주에서 부재하거나 결함이 있는 네가티브 성질을 보충하거나 대체하는데 사용될 수 있는 유전자를 포함함을 의미한다.
용어 "세포 증식성 질환"은 기관, 체강 또는 신체일부중 하나 또는 이들의 콤비네이션에 영향을 끼칠 수 있는, 양성 또는 악성이건간에 세포, 세포의 그룹 또는 조직(들)의 단일 또는 다중성 국소 비정상적 증식으로 특징지워지는 사람 또는 동물 질병 또는 질환을 포함함을 의미한다.
용어 "원핵세포"는 본 발명의 재조합 분자의 발현용 DNA로 형질전환될 수 있는 모든 세균을 포함함을 의미한다.
용어 "진핵세포"는 발명의 재조합 분자의 발현용 DNA로 형질전환될 수 있는 모든 효모, 진균, 동물 및 식물 세포를 포함함을 의미한다.
본 발명의 DNA 작제물용 DNA는 합성될 수 있거나 특정 포유동물종으로 부터 유래될 수 있다. NGR 인자를 위한 유전자 서열이 원핵세포 또는 진핵 세포 유기체에서 기능적으로 발현되어야 하는 것이 요구되는 전부이다. 합성 DNA가 바람직하다.
본 발명의 DNA 작제물을 암호화하는 재조합 DNA 분자는 당해 분야의 통상의 숙련가에게 통상적으로 공지된 기술을 사용하여 숙주를 형질전환시키는데 사용될 수 있다.
융합되고 작동적으로 연결된 유전자를 제조하고 세균에서 이들을 발현시키기 위한 방법은 공지되어 있으며, 예를 들어, 본원에서 참조로 인용된 문헌[참조: 미합중국 특허 제4,366,246호]에 기재되어 있다. 상기 문헌에 기술된 유전 작제물 및 방법은 본 발명의 DNA 작제물의 작제 및 원핵세포 또는 진핵세포 숙주에서의 형질감염에 이용될 수 있다.
원핵 세포 숙주는 그람 네가티브 및 그람 포지티브 세균, 예를 들어, 이 콜라이(E. coli), 에스.타임피무륨(S. tymphimurium), 세라티아 마르세센스(Serratia marcescens) 및 바실러스 서브틸리스(Bacillus subtilis)를 포함할 수 있다.
진핵, 세포 숙주는 효모, 예를 들어, 피키아 파스토리스(Pichia pastoris) 또는 포유동물 세포를 포함할 수 있다.
일반적으로, 삽입된 DNA 단편의 효율적인 전사를 촉진하는 프로모터 서열을 함유하는 발현 벡터가 숙주와 연관하여 사용된다. 발현 벡터는 전형적으로는 복제원, 프로모터(들), 터미네이터(들), 및 형질전환된 세포에서 표현형 선별을 제공할 수 있는 특이 유전자를 함유한다. 형질전환된 숙주는 당해 분야에 공지된 방법에 따라 발효 및 배양되어 최적 세포 성장을 달성할 수 있다.
본 발명의 사용될 수 있는 프로모터의 예는 사람 β액틴 프로모터, 메탈로티오닌 프로모터, SV40 복제원, 및 MMTV LTR 프로모터 및 MuLV LTR 프로모터를 포함하지만, 이로써 제한되지는 않는다. 본 발명에서 사용될 수 있는 프라스미드 또는 박테리오파지의 몇몇 예는 문헌[참조: Maniatis et al., Molecular Cloning, Cold Spring Harbor Laboratories, 1982]에 기술되어 있으며, 기타는 당해 분야의 숙련가에게 공지되어 있으며 용이하게 확인된다.
유전자는 특이 펩타이드로 특징지워지는 아미노산의 DNA 주형 또는 mRNA를 통해 암호화하는 DNA 서열이다. 용어 cDNA는 기재 서열(intervening sequence)이 제거된 유전자를 포함한다. 용어 "재조합 DNA"(rDNA)는 시험관내에서 cDNA 또는 게놈성 DNA 서열을 스플라이싱하여 재조합된 분자를 포함함을 의미한다.
클로닝 베히클은 숙주 세포에서 복제될 수 있는 플라스미드 또는 파지 DNA 또는 기타 DNA 서열(이러한 DNA 서열은 DNA의 필수적 생물학적 기능의 손실없이 결정가능한 방식으로 절단될 수 있는 엔도뉴클레아제 인지부위 하나 또는 소수로 특징지워지며, 형질전환된 세포의 동정에 사용하기에 적합한 마커를 함유한다)이다. 마커는, 예를 들어, 테트라사이클린 내성이거나 암피실린 내성이다. 용어 "벡터"는 때때로 클로닝 베히클에 대해 사용된다.
발현 베히클은 클로닝 베히클과 유사하지만 특징 제어 서열의 제어하에서 정상적으로 숙주에서 지정된 구조유전자를 발현할 수 있는 베히클이다.
용어 "개체"는 동물 및 사람을 포함함을 의미한다.
증식하는 세포의 성장의 "생물학적 억제" 또는 "억제"라는 용어는 부분적 또는 전체 성장 억제를 포함함을 의미하며 세포의 증식 또는 성장 속도를 감소시킴을 포함함을 의미한다. 본 발명의 NGR 인자 또는 유전자의 생물학적 억제 용량은 조직 배양에서의 표적 악성 또는 비정상적 증식 세포 성장(실시예 3 내지 4 및 제2도 내지 제4도 참조), 동물 및 세포 배양에서의 종양 성장에 대한 NGR 인자 시험의 효과를 평가함으로써 또는 당해 분야의 숙련가에게 공지된 기타 방법에 의해 결정될 수 있다.
본 발명의 방법에서 유용한 NGR 인자 또는 유전자의 투여는 국소, 안내, 비경구, 경구, 비강내, 정맥내, 근육내, 피하, 또는 기타 적합한 방법으로 이루어질 수 있다. 눈 질환의 치료를 위한 바람직한 투여방법은 안내 또는 안부근(pericular) 주입이다. 피부 세포 증식 질환 치료를 위한 투여의 바람직한 방법은 국소 적용 또는 피하 주사에 의한 것이다.
또다른 양태에서, 본 발명의 DNA 작제물은 증식 질환의 병소로 직접 전달될 수 있다. 눈 증식 질환의 경우에서, 본 발명의 DNA 작제물은 눈으로 직접 주입될 수 있다. 본 발명의 DNA 작제물은 질환 부위로 주사바늘을 직접 유도하는데 사용되는 영상 장치를 사용하여 내부 기관, 체강 등에 있는 병소의 질환 부위로 직접 전달시킬 수 있다. 본 발명의 DNA 작제물은 또한 외과 수술시 질환 부위로 투여될 수 있다.
투여되는 DNA 용량은 개체의 나이, 임상적 단계 및 질환 또는 유전적 소인의 정도, 위치, 체중, 동시 치료의 종류, 병적 또는 악성 질환의 상태에 따라 다르다. 본 발명의 방법에서 유용한 효과적인 전달 시스템은 경구투여용 캡슐제, 정제, 액제, 현탁제 또는 엘릭서제와 같은 형태, 또는 멸균 액제형태(예: 액제, 현탁제 또는 유제)로 사용될 수 있다. 불활성 담체로는 예를 들어, 염수 또는 포스페이트-완충된 염수, 또는 본 발명의 방법에서 사용되는 화합물이 적합한 용해도 특성을 갖는 담체가 바람직하게 사용된다.
안내전달 및 기타 국소 질환 부위로 전달을 위한, 본 발명에서 사용되는 유용한 전달 시스템은 바람직하게는, 멸균 액제 형태, 예를 들어, 액제, 현탁제 또는 유제로서 사용될 수 있다. 국소 사용을 위해서는 연고제, 크림제 또는 스프레이의 형태로 사용될 수 있다. 불활성 담체는 바람직하게는, 예를 들어, 염수 또는 포스페이트-완충된 염수, 또는 본 발명의 방법에서 사용되는 화합물이 적합한 용해도 특성을 갖는 특정 담체가 사용된다.
세포로의 NGR 인자 또는 유전자의 국소 투여를 위해, 본 발명의 DNA는 형질감염, 전기천공, 세포의 미소주입, 또는 리포좀, 리포펙틴과 같은 비히클내 또는 노출된(naked) DNA 또는 RNA로서의 방법을 포함하는 당해 분야의 숙련가에게 공지된 방법에 의해 투여될 수 있으며 이로써 제한되지는 않는다. 본 발명의 DNA는 레트로바이러스성 벡터[참조: Gilboa(1982) J. Virology 44: 845: Hocke(1986) Nature 320: 275; Wilson et al., Proc Natl Acad Sci USA 85: 3014), 백시니아 바이러스 시스템[참조: Chakrabarty et al., (985) Mol. Cell Biol. 5: 3403] 또는 당해 분야의 숙련가에게 공지된 기타 효과적인 DNA 전달 시스템[참조: Yates et al.,(1985) Nature 313: 812]과 같은 공지된 유전자 전달 시스템(이로써 제한되지는 않는다)에 의해 전달될 수 있다. 상기 참조는 단지 예이며 본원에서 참조로 인용되어 있다. 비정상적으로 증식하는 세포를 특이적으로 전달시키거나 형질감염시키고 비-분열 세포를 남겨두기 위해, 당해 분야의 숙련가에게 공지된 레트로바이러스 전달 시스템을 이용하는 것이 바람직하다. 숙주 DNA 복제가 레트로바이러스성 DNA를 통합시키는데 요구되고 레트로바이러스는 자신의 생명주기를 위해 필요한 레트로바이러스 유전자가 부족하여 자기 복제될 수 없기 때문에, 본 발명의 NGR 인자를 위해 이러한 레트로바이러스성 전달 시스템을 이용하면 상기 항-증식 NGR 인자를 비정상적으로 증식하는 세포로 표적하고 특정 간섭으로부터 비-분열하는 정상적 세포는 남겨둘 것이다.
본 발명의 DNA는 생물학적 효과적인 담체중에 투여될 수 있다. 생물학적으로 효과적인 담체는 레트로바이러스, 리포좀, 및 외래 DNA를 세포의 게놈으로 도입할 수 있는 기타 형질감염 기작을 포함할 수 있다. 이러한 형질 감염 기작은 당해 분야의 숙련가에게 공지되어 있다. 담체는 또한 본 발명의 작제물과 양립할 수 있고 투여되는 양에서 처리된 기체 또는 세포에서 무독성인 시약 또는 용매를 포함할 수 있다.
매우 다양한 병적 세포 증식 상태에 대해 본 발명의 방법이 치료학적 잇점을 제공할 수 있다. 이러한 병적 상태는 비정상적 세포 증식을 할 수 있는 거의 모든 세포 타입에서 발생할 수 있다. 병적 또는 비정상적 성장을 나타내는 세포 타입중에서는, (1) 섬유증식 공지된 질환을 나타내는 섬유아세포; (2) 혈관증식 질환으로 공지된 질환을 나타내는 혈관 내피세포; (3) 피부증식 질환으로 공지된 질환을 나타내는 표피 세포가 있다. 상기로부터, 본 발명의 방법이 개체의 모든 또는 거의 모든 기관 및 조직 시스템에서 국소 또는 전파된 병적 상태를 치료하는데 유용하다는 것을 알 수 있다.
예를 들어, 눈 단독에서, 본 발명의 방법은 다음의 눈의 섬유증식성, 혈관증식성 및/또는 신생물 질환을 포함하지만 이들로 제한되지는 않는 정상, 양성 또는 악성 세포 또는 조직의 비정상적 증식에 기인하는 다양한 병적 질환 상태를 치료하는데 이용될 수 있다: 조숙 망막증, 증식성 초자체성 망막증, 증식성 당뇨병성 망막증, 모세혈관성 혈관증, 맥락막 신혈관성 그물눈, 망막하 신혈관성 그물눈, 망막하 신혈관 신생에 기인한 노인성 반부면성, 각막 신혈관신생, 망막표피막 증식에 기인한 반부주름, 핵 경화증에 기인한 성인 백내장, 외상 또는 외과수술에 따른 섬유 내부성장, 시신경 교종, 망막혈관종증, 신혈광성 녹내장, 해면상 혈관증, 홍채조홍, 겸상적혈구 증식성 망막증, 눈수술 또는 눈 상해후 표피의 성장 저하, 후속백내장 막, 유두종, 지중해 빈혈로 인한 망막 신혈관신생, 탄력섬유위황색종에 기인한 망막하 신혈관신생, 및 신경섬유종증 타입 1 및 11, 망막아종, 포도막 흑색종, 안와의 위종양.
본 발명이 유용하게 사용될 수 있는 기타 양성 세포 증식 질환은 건선, 어린선, 유도종, 기저세포암종, 촉두린세포 암종, 및 시트븐스-존슨(Sterns-Johnson) 증후군을 포함하지만 이들로 제한되지는 않는다.
본 발명의 방법에 따라, NGR 인자 또는 다증성 NGR 인자를 도입하여 세포성 증식 과정을 조작하여 다양한 세포 증식 질환에서의 비정상적 증식을 예방 또는 억제할 수 있다. 증식 과정의 조작은 표적 증식하는 세포로 NGR 인자를 암호화하는 DNA 작제물을 도입하여 달성될 수 있다. 이러한 NGR 인자는 NGR 유전자를 포함하거나 PGR 인자의 기능적 발현을 불활성하거나 억제한다.
본 발명의 방법에 의한 비-악성 또는 비-암 세포에서 비정상적 세포증식을 억제하기 위한 NGR 인자의 사용을 설명하기 위해, 사람 망막아종 유전자인 Rb-1을 정상 사람 섬유 아세포 세포주로 도입시킨다. 실시예 2에서 더 완전히 기술되는 바와 같이, 사람 Rb cDNA의 정상 사람 섬유아세포인 WS1로의 도입은 세포 성장의 중지를 초래한다. 유사하게, 상기 사람 망막아종 유전자의 수개의 상이한 종양 세포 타입으로의 도입은 실시예 3 및 4에서 추가로 기술되는 바와 같이 시험관내 또는 생체내에서 상기 세포의 성장의 억제를 초래한다.
사람 망막아종 유전자 생성물은 세포가 세포주기의 G1/S 경계 및 S 단계에서 종식하는 경우 심하게 포스포릴화 되며[참조: Buckovich et al., (1989) Cell 58: 1097; Mihara et al., (1989) Science 246; 1300; Decaprio(1989) Cell 58: 1085 및 Chen et al., (1989) Cell 58: 1193], 세포가 G1단계에서 증식하지 않는 경우 비포스포릴화되거나 불충분하게 포스포릴화(underphosphorylated)된다는 것이 밝혀졌다. 정태성 세포의 유사분열 물질에의 노출 Rb 단백질은 포스포릴화하는 키나제 컴플렉스의 활성화를 초래한다. 결과로서, 세포는 DNA 복제 및 유사분열 단계로 들어간다. 따라서, 세포가 DNA 복제를 개시하도록 하기 위해서, 포스포릴화에 의한 사람 망막아종 유전자 생성물의 불활성화가 필요할 수 있다.
본 발명의 한 양태에서, Rb-1 단백질의 정상적인 세포성 포스포릴화는 Rb-1 단백질의 과다 생성을 야기시키는 Rb-1 유전자의 첨가적 복사물의 도입에 의하거나 Rb-1 유전자가 포스포릴화될 수 없도록 Rb-1 유전자를 돌연변이시켜 억제하거나 차단시킬 수 있다.
고도로 발현된 망막아종 유전자가 정상적 비-종양 세포로 도입되는 경우, 많은 양의 망막아종 단백질이 발현된다. 그러므로, 처리된 세포는 과량의 활성 Rb 단백질을 함유하고 증식은 정지된다. 다중적으로 포스포릴화된 형태로 정상적으로 존재하는 망막아종 단백질은 증식하는 세포가 혈청 고갈에 의해 성장 정지되는 경우 탈포스포릴화된다. 이러한 과량의 Rb 단백질은 세포성 키나제의 포스포릴화 능력을 압도하여 Rb 유전자 생성물을 불활성화시킬 수 있다. 따라서, 하나의 양태에서, 세포 증식은 Rb-1 유전자와 같은 NGR 유전자의 세포로의 도입에 의해 정지되거나 억제될 수 있다. 유사하게, 기타 NGR 유전자도 또한 본 발명의 실시를 위해 사용될 수 있다. 성장 정지과정을 확실하게 하기 위해, 도입된 유전자는 강한 프로모터의 제어하에 놓여야 한다. 사람 β-액틴 프로모터가 이러한 강한 프로모터중 하나이다. 사람 β액틴 유전자와 같은 강한 프로모터의 제어하에 있는 Rb 유전자를 포함하는 DNA 작제물의 작제는 실시예 1에 나타나 있다. 그러나, Rb-1 유전자가 기타 NGR 인자로 대체될 수 있으며 기타 강한 프로모터가 또한 본 발명을 실시하는데 이용될 수 있다는 것은 당해 분야의 숙련가에게 명백할 것이다.
또 하나의 양태에서, Rb-1 유전자의 포스포릴화 부위는 세포로 도입되기전에 돌연변이된다. Rb 단백질상에는 7 내지 12개의 잠재적 포스포릴화부위가 있다. Rb-1 cDNA에서 세린 또는 트레오닌 암호화 서열의 알라닌 또는 발린 또는 기타로의 돌연변이는 포스포릴화에 의해 불활성화될 수 없는 영구적으로 활성인 Rb 단백질의 생성을 초래한다. 따라서, 숙주 세포는 포스포릴화에 의해 Rb 단백질을 불활성화할 수 없을 것이다. 그러므로 이러한 돌연변이된 Rb-1 유전자의 세포로의 도입은 성장 정지를 초래할 것이다. 달리는, 기타 NGR 유전자, 예를 들어, p53, p85, p107 및 p130(이들로 제한되지 않는다)의 포스포릴화 부위는 유전자 생성물의 포스포릴화를 방지하기 위해 돌연변이될 수 있으며 비정상적으로 증식하는 세포로 도입되어 이들 세포의 증식을 억제할 수 있다.
NGR 유전자의 여분의 복사물의 도입에 의해 세포 성장을 정지시키는 다른 방법은 포지티브-작용성 조절 인자 또는 유전자 생성물의 발현을 붕괴시키는 것이다. RNA 대사에서 효소로서 작용하는 천연 RNA 분자가 규명되었다. 이러한 부류의 분자는 집합적으로 리보자임으로 명명되며 식물 및 동물 바이러스에서 발견되었다. 하나의 이러한 리보자임이 세터라이트 토바코 링스파트 바이러스(STobRV)에서 규명되었으며 자기-절단 RNA를 위한 일명 해머-헤드(hammar head) 구조가 Symons 및 그의 동료에 의해 제안되었다[참조: Forster 및 Symons(1987) Cell 50:9]. Uhlenbeck은 해머-헤드 구조를 모사한 짧은 스트레치의 RNA로 구성된 RNA 단편이 생리학적 상태하에서 합성 RNA 단편의 절단시 효소로 작용할 수 있다는 것을 밝혔다.
클로람페니콜 아세틸트랜스퍼라제(CAT) RNA에 대해 특이적인 리보자임은 시험관내에서 CAT RNA의 절단시 효과적인 것으로 나타났으며[참조: Haseloff 및 Gerlach, (1988) Nature 334:585], 동일한 작제물은 발현 벡터로 유전공학적으로 제조되는 경우, 생체내 의도된 부위에서 CAT RNA를 절단하는 것으로 나타났다[참조: Cameron 및 Jennings(1989) Proc. Natl. Acad, Sci, 86: 9139]. 더우기 CAT 발현은 형질 감염된 세포에서 억제된다. STobRV의 촉매적 도메인(domain)으로 이루어진 리보자임의 절단 특이성은 매우 광범위하다. 이것은 X가 A, C 또는 U일 수 있는 경우 트리폴리트 5' GUX 3'의 말단에서 절단할 수 있다. 유전 공학적으로 제조된 리보자임의 특이성은 촉매적 도메인이 측면에 존재하는 서열에 존재한다. 이들 서열은 절단되는 RNA상 부위 주위의 서열에 대해 상보적인 것으로 선택된다.
또다른 양태에서, 본 발명은 세포에 PGR 인자의 특이적인 리보자임의 생성을 암호화하는 하나 이상의 DNA 플라스미드를 도입시켜 세포 증식을 중단시키는 방법을 제공한다. 이 양태는 실시예 5에 예시되어 있다. 리보자임을 암호화하고 추가로 특이적 PGR 인자에 대해 리보자임을 표적화하는 서열을 포함하는 DNA 작물의 작제는 실시예 5에 기재된 바와 같이 나타나며 이러한 리보자임 작제물은 제5(a)도에 일반화 형태로 도식적으로 나타나 있다. Rb-1 유전자를 절단하는 리보자임의 작제는 실시예 5에 기재되어 있다. 본 발명의 하나의 양태에 따라서, 리보자임 작제물은 표적 PGR 인자의 nRNA 또는 mRNA를 파괴시키기 위해 도입될 수 있다. 이러한 국면은 실시예 5에 기술된 c-myc 리보자임에 의해 예시된다. 본원의 교시는 어떠한 PGR 인자에도 적용될 수 있으며 리보자임 작제물은 PGR 인자 또는 유전자 생성물을 절단하기 위해 본 발명의 교시에 의해 제조될 수 있다는 것은 당해 분야의 숙련가에게 명백할 것이다. 세포에서 유전자의 발현을 억제하는 다른 방법은 안티센스 RNA를 사용하는 것이다. 안티센스 RNA는 의도된 유전자의 일부 또는 전부의 mRNA에 상보적인 RNA이다. 안티센스 RNA의 과잉 생산은 해독을 위한 표적 RNA의 사용을 방지하므로써 유전자 생성물의 발현을 차단하는 것으로 밝혀졌다.
세포가 증식하는 것을 중단시키기 위해, DNA 작제물은 세포에서 다양한 포지티브 작용성 조절 인자에 대해 특이적으로 표적화된 안티센스 및/또는 리보자임을 발현하는 증식하는 세포로 도입시킬 수 있다.
동일한 부위에 동시에 본 발명의 DNA 작제물 하나 이상을 투여할 수 있다. 예를들어, 수개의 상이한 PGR 유전자를 표적화하는 상이한 리보자임 작제물은 동일한 병소 질환 부위에 동시에 투여할 수 있다. 추가로, 수개의 상이한 DNA 작제물, 예를들어, 하나 이상의 리보자임 및 하나 이상의 NGR 유전자 또는 NGR 인자가 동시에 투여될 수 있다.
본 발명은 또한 네가티브 성장 조절 유전자의 단지 하나의 활성 대립형질만을 지녀 종양이 전개될 소인을 가진 개체를 동정하고, 사람 망막아종 유전자, p53 유전자, p85 유전자, p107 유전자, p130 유전자, 레티노산 수용체, 갑상선 호르몬 수용체, myo D 유전자, DCC 유전자, NF-1 유전자, 및 NM-23 유전자로 이루어진 그룹중에서 선택된 네가티브 성장 유전자의 하나 이상의 복사물을 상기 네가티브 성장 유전자의 충분한 정상적 복사물(들)이 부족한 것으로 확인된 상기 소인을 갖는 개체의 난, 정자 또는 수정란으로 삽입시킨 후, 수정 또는 연속적 배 발생학적 전개를 계속하게 하는 단계를 포함함을 특징으로 하여, 유전적으로 소인을 갖는 개체에서 암을 억제하고 방지하기 위한 예방치료 방법을 제공한다.
지금까지 본 발명을 일반적으로 기술하였지만, 보다 완전한 이해는 하기 구체적 실시예를 참조로 수득될 수 있다. 이들 실시예는 단지 설명의 목적으로 제공된 것이며 다른 지시가 없는한 제한의 의도가 아니다.
[실시예 1]
[Rb-1 cDNA 발현 플라스미드의 작제]
플라스미드 작제 및 DNA 제조의 일반적 방법은 문헌에 기술되어 있다[참조: Maniatis et al.(Maniatis, T., Fuitsch, E.F., 및 Senbrook. J.(1982) Molecular Cloning; A Laboratory Manual(Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, N.Y., U.S.A]. 모든 플라스미드는 베테스다 리서치 라보라토리(Bethesda Research Laboratory: BRL)로부터 구입한 에스케리치아 콜라이(Escherichia coli) 숙주 DH5-α에서 성장한다. 사람 β-액틴 발현 벡터 시스템인 pHBADr-1-neo의 구조 및 특성은 문헌에 기술되어 있다[참조: Gunning et al., (1987) Proc. Natl. Acad. Sci USA 84, 4831-4835]. Rb-1 cDNA 서열은 이미 밝혀져있다[참조: Fung et al., (1989) in Ocogenes, Chapter 13, Molecular Biology of the Human Retinoblastoma Gene, Benz, 및 Lin, (eds.) Kluwen Academic Publishers].
HaBAcpr-1-nep-Rb-8342의 작제는 제1도의 판넬 A 내지 C에 도식적으로 나타나 있다. Hacpr-1-neo-Rb-8342의 작제를 위해, 제1의 엑손부분을 함유하는 BamHl-Eagl DNA 단편을 피지 클론 4-14-5로부터 잘라내고 [참조: T' Ang et al(1989) Oncogene 4, 401-407] BamHl-Eagl 부위에서 Rb-1 cDNA 플라스미드 PGH2의 5' 말단과 연결시킨다[참조: Fung et al, (1987) Science 236: 1657-1661](제1도 판넬 A 참조). 생성된 플라스미드를 성장시키고 Rb-1 프로모터 영역 및 Rb-1 cDNA의 5' 부분을 함유하는 Hind III EcoR1 단편을 Hind III 및 EcoRI 부위에서 플라스미드 PT7BRB로 전이시켜 (제1도 판넬 B 참조) 플라스미드 pBRB2.9를 생성시킨다. Rb cDNA의 3.8kb 3' 반쪽을 PG3.8로부터 EcoR1을 사용하여 잘라내고 [참조: Fung et al, (1987) Science 23: 1657-1661] pBRB2.9의 EcoR1부위로 서브클로닝시켜 PT7BRBFL을 생성한다(제1도 판넬 C참조). 최종적으로, Rb-1 cDNA 및 이의 프로모터를 함유하는 BamH1 단편을 BamHl 부위에서 HBApr-1-neo로 서브클로닝시켜 HuBAcpr-1-neo-Rb-8342를 생성한다.
HuBAcpr-1-neo-Rb-PQ의 작제를 위해, 이본쇄 합성 링커(단지 하나의 본쇄만이 여기에 기재된다):
5' ACGGATC CGCGTC ATG CCC AAA ACC CCC CGA AAA ACG GCCG 3'를 BamHl 및 Eagl으로 분해하고 플라스미드 PT7BRBFL의 BamHl/Eagl 부위로 서브클로닝시켜(제1도 판넬 C 참조) Rb 프로모터를 재위치시킨다. 그다음에 이 플라스미드를 효소 ppuml으로 부분적으로 분해하여 뉴클레오타이드 #2797-2799에서 선형화한다. 폴리 A 시그날(AATAAA) 및 ppuml 부위에 의해 플랭킹된 BamHl 부위를 함유하는 합성 링커를 선형화된 PT7BRBFL의 ppuml 부위로 삽입시킨다. 생성된 플라스미드를 증대시키고 Rb1 cDNA 암호화 영역을 함유하는 BamHl 단편을 잘라낸 다음 플라스미드 HBAcpr-1-neo의 BamHl 부위로 삽입시켜 플라스미드 HuBacpr-1-neo-Rb-PQ를 생성시킨다.
제1(d)도는 사람 β-액틴 프로모터의 제어하에 있는 Rb-1 cDNA 일부 또는 전부를 함유하는 플라스미드 HuBAcpr-1-neo-Rb의 일반적 구조를 나타낸다.
두개의 상이한 HuBAcpr-1-neo-Rb 발현 플라스미드를 작제한다. HuBAcpr-1-neo-1-neo-Rb-8342에 있어서, X는 가장 긴 개방 판독 프레임의 제1의 ATG의 앞에 있는 BamHl 1kb 단편이고[참조: T'Ang et al., (1989) Oncogen 4: 401] Y는 전체 3' 비해독 영역이다.
HuBAcpr-1-neo-Rb-PQ에 있어서, X는 제1의 ATG의 앞에 위치한 합성 링커(5-GATCCGCGTC-3)이고 Y는 뉴클레오타이드 #2801 뒤에 있는 폴리 A 테일시그날 AATAAA를 함유하는 합성 링커이다.
[실시예 2]
사람 섬유아세포 세포주 WS1의 증식에 대한 형질감염된 플라스미드의 효과
정상 케라티노사이트가 많은 세포 타입의 성장을 억제하는 종양 성장인자 β (TGF β)에 노출되는 경우, 케라티노사이트중 망막아종 단백질은 급히 탈포스포릴화 되고 케라티노사이트는 성장이 중지된다. 망막아종 유전자 생성물과 결합함으로써 망막아종 유전자 생성물을 추정적으로 불활성화시키는 SV40 거대 T 항원은 망막아종 단백질의 불충분한-포스포릴화(활성) 형태와만 결합할 수 있다. 그러므로, 세포가 성장 정지 단계로 유도되는 경우, 관련된 변화는 망막아종 단백질의 탈포스포릴화이다. 유사분열 물질에 노출시켜 성장이 정지된 세포를 재자극하면 DNA 합성의 개시에 선행하여 망막아종 단백질의 심한 포스포릴화가 초래된다. 정상 및 종양 세포에서 관찰된 사실은 포스포릴화에 의한 망막아종 단백질의 불활성화가 세포증식을 발생시키기 위해 필요함을 제안한다. 그러므로 망막아종 단백질은 정상 및 종양세포의 성장 지연 또는 정지에 관련될 수 있다.
세포 성장에 대한 RB cDNA의 효과를 연구하기 위해, HuBAc-1-neo-Rb-PQ를 정상 사람 섬유아세포 세포주 WS1으로 형질감염시킨다. 대조군으로서, RSV LTR의 제어하에 있는 네오마이신 내성 유전자를 함유하는 DNA 단편을 플라스미드 PATV-6D3A로부터 잘라내고 합성 Sal 1 링커를 단편에 연결시키고, Sal 1로 분해한 다음 PPUVO로 연결시켜[참조: Kalderon 및 smith. (1984) Virology 139: 109-137] PPVUO-Neo를 생성한다. 이어서, SV40 거대 T 항원을 위한 유전자를 함유하는 이 플라스미드 PPVUO-Neo는 형질감염의 효율을 모니터링하기 위해 형질감염시킨다. 형질 감염을 위해, 각각 100μg의 플라스미드 DNA를 전기 천공 챔버 유니트 Cell-PoratorTM(BRL)중에서 최종용적이 0.8ml인 RPMI 1640 배지(Gibco)+10% FCS에서 대수적으로 성장시킨 107개의 WS1 세포와 혼합시킨다. 전기천공은 200볼트 및 1180uF에서 수행한다. 전기천공된 세포는 10분동안 실온에서 회수한 다음 RPMI 1640+10% 태송아지 혈청(FCS)중에 희석하고 2x104개 세포/㎠의 세포밀도로 60mm 디쉬중에 둔다. 세포를 2일동안 동일한 배지중에서 부착시키고 성장 시킨다. 이후에, 배지를 RPMI 1640+10% FCS+15μg /ml G418(GIBCO)로 바꾼다. 3일마다, 이중 디쉬를 래비트 폴리클로날 항-Rb 단백질 항체 RbL-ABA1 또는 Rb1-AB18을 사용하거나 [참조: Mihara K.et al (1989) Science 246: 1300](제2(a)도 참조) 마우스 모노클로날 항 SV40 거대 T 항원 항체 PAB 101을 사용하는 (제2(b)도 참조). 조직 면역화학적 염색을 위해 취한다. 실시에 8에 기술된 염색 방법을 이용한다. 제2(a)도에 알 수 있는 바와 같이, G418 배지 중에서 형질 감염 13일후 G418 배지에서 선별후 형질감염된 Rb cDNA 플라스미드 HuBAcpr-1-neo-Rb-PQ를 발현하는 WS1 세포는 항-Rb 단백질 항체와 강하게 염색되었다. 그러나, Rb 단백질을 발현하는 세포는 단일 세포로서 잔류하며 분열하지 않았다. 대조적으로, 형질감염된 SV40 거대 T 항원(SVLT)를 발현하는 세포는 제2(b)도에서 마우스 항 SVLT 항체로 포지티브 염색된 세포의 그룹에 의해 나타나는 바와 같이 콜로니로 계속해서 분열하였다.
따라서, 세포중 Rb cDNA 의 과잉 발현은 세포 성장의 극도의 지연 또는 정지를 초래한다.
[실시예 3]
사람 방광암종 세포주 TCCSUP의 증식에 대한 형질감염된 플라스미드의 효과
Rb-1 유전자를 실시예 2에 기술된 동일한 방법을 사용하여 내인성 Rb 단백질을 갖지 않는 사람 방광 암종 세포 TCCSUP로 형질 감염시킨다. 사용된 플라스미드, 형질감염 및 면역염색에 대한 방법론은 제2도에 기술된 것과 동일하다.
제3(a)도에서 알수 있는 바와 같이, 형질감연된 Rb-1 cDNA를 발현하는 세포는 분열하지 않는다. 대조적으로, 형질감연된 SVLT를 발현하는 세포는 분열하여 콜로니를 형성 한다(제3(b)도). Rb cDNA의 과잉 발현은 시험관내 종양 세포의 심각한 성장 지연을 초래한다.
[실시예 4]
[골육종 SaOS2세포주의 증식에 대한 형질감염된 플라스미드의 효과]
플라스미드 및 SaOS2세포의 형질감염을 위한 조건은 실시예 2에 기술된 것과 동일하지만 100㎍/㎖ G418을 배지로 사용한다.
모든 종양 세포가 단일 세포 수준에서 성장 정지될 수 있는 것은 아니다. 골육종 세포주 SaOS2가 좋은 예이다. Rb cDNA 플라스미드 HuBAcpr-1-neo-Pb-PQ의 상기 세포주로의 형질감염은 3개의 상이한 세포성 반응을 나타낸다. 추정적으로 SaOS2세포주는 하나이상의 세포 집단으로 구성된다. 제4(a)도 및 제4(b)도에서 나타나는 바와같이, Rb 단백질을 발현하는 HuBAcpr-1-neo-Rb-PQ로 형질감염된 SaOS2세포의 2/3는 분열하지 않는 반면 1/3은 분열한다. Rb 단밸질을 발현하는 형질감염된 SaOS2세포의 약 1/3이 분열하여 콜로니를 형성할 수 있다. Rb 단백질을 발현하는 잔류하는 2/3의 세포는 2개의 상이한 형태이다. 하나는 작고 다른 하나는 5 내지 10배 큰 세포용적을 갖는다. 이들 세포의 2가지 집단은 동비율로 존재한다.
시험관내에서 분열할 수 있는 SaOS2세포가 생체내에서 성장하는지의 여부를 평가하기 위해 SaOS2세포를 당해 분야의 숙련가에게 공지된 방법에 의해 단일-세포 클로닝한다. 요약하면, 단일 세포 클로닝을 위해 형질감염된 G418 내성 SAOS2의 콜로니를 클로닝 실린더로 분리한다. 클로닝 실린더 내부의 세포를 트립신 처리한 다음 60mm 디쉬중에 약 200개 세포로 플레이팅한다. 디쉬상에 단일 세포로 부착된 세포를 약 200개 세포의 콜로니로 성장시키고 클로닝 실린더로 회수한다음 트립신 처리한다. 그 다음에 이들 세포를 성장시키고 모든 세포가 항-Rb 항체 Rb1-ABA1 및 RB1-AB18로 포지티브 염색되는 것을 확인하기 위한 조직면역 염색을 위해 샘플을 취한다. 그 다음에 약 103개의 세포를 10마리의 누드 마우스 각각의 눈의 전방 챔버(anterior chamber)로 주입한다. 대조군으로서, SaOS2모세포를 대조를 위해 동일한 누드 마우스의 반대측 눈에 주입한다. 제4(c)도에서 나타내는 바와같이, Rb 작제물로 형질 감염된 SaOS2는 눈에서 성장이 일어나지 않는 반면 SaOS2모세포는 증식되어 종양을 형성한다.
[실시예 5]
[성장 억제 리보자임의 작제]
리보자임을 암호화하고 추가로 특히 PGR 인자에 리보자임을 표적시키기는 서열을 포함하는 DNA 작제물의 작제는 제5(a)도에 일반화된 형태로 도식적으로 나타나 있다. Rb-1 유전자를 절단하는 리보자임의 도식적 기재가 또한 제5(b)도에도 나타나 있다. 본 발명의 하나이 양태에 따라서, 리보자임 작제물은 리보자임이 PGR 인자의 nRNA 또는 mRNA를 파괴하게 할 세포로 도입시킬 수 있다. 이러한 국면은 제5(d)도상에 도식적으로 기재된 c-myc 리보자임에 의해 예시된다. c-myc의 mRNA 서열의 일부 및 디자이너 리보자임은 제5(d)도에 나타나 있다.
수개의 리보자임을 상이한 위치에서 주어진 mRNA에 대해 유사한 방식으로 제작할 수 있다. 단지 요구조건은 상기 실시에에서 사용된 특수 리보자임을 사용하는 경우 서열에 CUX 삼중자가 존재해야한다는 것이다. RNA 분자상에 상이한 절단부위를 갖는 기타 RNA 절단 효소가 이용될 수 있음은 명백하다. 이들은 RNA 절단 분자를 합성적으로 제조할 수 있거나 기타 천연적 발생하는 RNA 절단 분자일 수 있다.
그러므로 리보자임은 절단될 부위 GUX(X는 A,C 또는 U일 수 있다)에 바로 인접한 mRNA의 3' 및 5' 서열에 상보적인 뉴클레오타이드 서열에 의해 5' 및 3' 양측이 모두 플랭킹된 촉매적 도메인 5'-CUG-AUG AGU CCG UGA GGA CGA AAC-3'로 이루어진다.
제5(a)도에 도시된 일반화된 리보자임에서, N 및 N'는 G, A, U, C이고 N'는 N.B.에 상보적이다.
[Rb RNA에 특이적인 리보자임의 작제]
뉴클레오타이드 1771 및 1772 사이에 있는 Rb 유전자의 절단 부위에서 Rb mRNA를 불활성하는 항-Rb 리보자임은 하기 기술에 따라 작제하며 제5(b)도에 나타나있다.
Rb mRNA를 절장하기 위해, Rb mRNA 서열
5'-CUG-AUG AGU CCG UGA GGA CGA AAC-3'에 상보적인 리보자임을 합성한다.
리보-Rb-DNA 작제물을 제작하기 위해, 하기 2개의 프라이머를 합성한다.
각 1㎍의 2개의 프라이머를 10mM 트리머 HCl(pH7.5), 및 0.1mM EDTA의 40μ1중에서 1분동안 90℃로 가열한다. 가열한 프라이머에 10μ1의 10X 프라이머 연장 완충액을 가하여 최종 용액은 50mM 트리스 HCl(pH7.2), 10mM MgSO4, 0.1mM 디티오트레이톨, 50㎍/㎖ 소혈청 알부민, 각 0.1mM의 dATP, dGTP, dCTP, 및 dTTP를 함유하도록 한다. 혼합물에 4유니트의 움 폴리머라제의 클레나우(Klenow) 단편(NE Biolab)을 가하고 반응물을 1시간동안 실온에서 항온처리한다. 1μ1의 0.5M EDTA를 첨가하여 반응을 중지하고 당해 분양에 공지된 표준 프로토콜, 예를 들어 Maniatis 등의 방법[참조 : Maniatis, T., Fuitsch, E.F., 및 Senbrook, J. (1982) Molecular Cloning: A Laboratory Manual (Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, N.Y., U.S.A.)]에 의해 DNA를 정제한다. 정제된 DNA를 Sall 및 BamH 1으로 절단하고 T7 폴리머라제와 함께 시험관내 발현시키기 위해 pGEN 4 벡터(Promega Biotech)로 서브클로닝시키고 촉매적 활성에 대해 시험한다.
리보바임의 촉매적 활성을 시험하기 위해, PGEM-ribo-Rb-3(리보자임 RAN용)으로부터, 및 플라스미드를 필요한 RNA의 목적 길이를 위해 적당한 부위에서 선형화한 후 PT7BRBFL(기질 RAN용)으로부터 시험관내 전사에 의해 RNA를 생성시킨다. 시험관내 전사를 위해, 2μM의 선형화된 플라스미드 DNA를 25 유니트의 T7 RNA 폴리머라제, 1mM ATP, CTP 및 GRP, 50 유니트의 RNasin, 0.1mM UTP 및 10μ Ci의 [q-32p]UTP, 40mM 트리스 HCl(pH7.9), 20mm MgCl2, 10mM NaCl 및 10mM DTT를 함유하는 50μ1 반응 혼합물중에 1시간동안 40℃에서 배양시킨다. 반응시킨후, 리보자임 RNA를 6%의 7M 우레아-폴리아크릴아미드 겔상에서 저기영동으로 정제한다. 합성 리보자임을 실온에서 10분동안 X-선 필름에 노출시켜 동정한다.
리보자임을 함유하는 겔 슬라이스를 잘라내고 0.1% SDS, 0.5M 암모늄 아세테이트(pH6.9), 1mM EDTA중에서 겔 조작을 볼텍싱하여 RNA를 회수한다. 용출물을 여과한 다음 0.1배 용적의 5M 나트륨 아세테이트(pH5.3) 및 2배 용적의 100% 에탄올을 사용하여 침전시킨다.
반응을 완결한 후, RNA 샘플을 동용적의 페몰중에서 볼텍싱하여 정제하고 원심분리하여 2개의 상으로 분리시킨다. RNA를 함유하는 수성상을 에틸 에테르로 추출한다. 그 다음에 0.2배 용적의 5M 나트륨 아세테이트(pH5.3), 및 2배 용적의 100% 에탄올을 수성상에 가한다.
제5(c)도에 나타난 2개의 주형은 BamH1 부위(주형 A) 또는 Mlu 1부위 (주형 B)에서 PT7BRBFL을 선형화하여 생성시킨다. 주형 A는 4.7kb인 반면 주형 B는 1.8kb이다. 리보자임을 고안된 바와 같이 뉴클레오타이드 #1700에서 절단하는 경우, 주형 A의 크기는 상당히 감소되어야 하며 반면 주형 B의 크기는 단지 최소적으로 감소된 것이다.
리보자임의 촉매적 활성을 시험하기 위해, 1pmole의 Rb-리보자임을 75mM 트리스-HCl 및 2mM EDTA 10μ 1중에서 1pmole의 주형A(제7도, 1,2레인) 또는 주형 B(제7도, 3,4레인)와 혼합한다. 혼합물을 95℃에서 2분 동안 가열한 다음 빙상에서 냉각시킨다. MgCl2을 첨가하여 반응을 개시하고 MgCl2의 최종농도는 20mM이 되도록 한다. 4℃ 또는 42℃에서 12시간후에, 2μ1의 200mM EDTA(pH7.9)를 첨가하여 반응을 중단시킨다. 반응 생성물을 이미 기술된 문헌[참조: Fung et al (1987) Science 236: 1657]과 같이 포름알데하이드 아가로스 겔 전기영동으로 분석한다. 제7도, 2레인에서 증명된 바와같이, 주형 A RNA 생성물(레인 1)은 예상된 바와 같이 원래 크기의 약 1/2로 분해되었다. 그러나, 주형 B RNA의 생성물 크기는 또한 예상한 바와 같이 눈에 보일 정도로 감소되지 않았다.
따라서, Rb-리보자임 작제물은 지정된 부위에서 Rb RNA를 절단하여 Rb RNA를 불활성화시킨다는 것은 명백하다. 일단 RNA의 서열이 유추되기만 하면, 상기 기술된 방법에 따라 특정 RNA에 대해 유도된 리보자임을 작제할 수 있다. 또한 보다 효율적으로 표적 RNA를 파괴하거나 불활성화하기 위해 동일한 표적 RNA에서 수개의 부위에 대해 유도된 다중성 리보자임을 작제하는 것이 유용함을 알 수 있을 것이다.
5'-U CCU CAC AGC CCC CUG GUC CUC AAG AGG-3'에 상보적인 리보자임을 합성한다. 이것은 목적 위치에서 c-myc mRNA를 절단하는 제5(d)도에 기재된 구조를 초래한다.
뉴클레오타이드 888 및 889 사이의 절단부위를 위한 c-myc mRNA의 리보자임의 예는 제5(d)도에 나타나 있다.
세포에서 c-myc RNA를 파괴하기 위해, 리보자임을 암호화하는 DNA 플라스미드가 필요하다. 이러한 리보자임 플라스미드의 작제는 하기 단계를 포함한다.
1. 리보자임 도메인의 합성.
2. 리보자임 도메인의 포유동물 발현 벡터로의 서브클로닝.
[리보자임 도메인의 합성]
제5(d)도에 나타난 c-myc mRNA에 대한 리보자임은 하기와 같이 제작한다: 2개의 올리고뉴클레오타이드를 합성한다.
[Sal 1]
[Bamh1 HindIII]
(a)에서 밑출진 뉴클레오타이드는 c-myc mRNA 5'측 절단부위에 있는 서열이다.
각 1㎍의 2개의 프라이머를 10mM 트리스 HCl(pH7.5), 및 0.1mM EDTA 40μl중에서 1분동안 90℃로 가열한다. 가열한 프라이머에 10μl의 10×프라이머 연장 완충액을 가하여 최종 용액이 50mM 트리스 HCl(pH7.2). 10mM MgSO4. 0.1mM 디티오트레이돌, 50μg/ml th 혈청 알부민, 각 0.1mM의 dATP, dGTP, dCTP 및 dTTP를 함유하도록 한다. 혼합물에 4유니트의 DNA 폴리머라제의 클레나우 단편(NE Biolab)을 가하고 반응물을 1시간 동안 실온에서 항온처리한다. 1μl의 0.5M EDTA를 가하여 반응을 중단시키고 표준 프로토콜에 의해 DNA를 정제한다. 정제됨 DNA는 Sal 1 및 BamHl으로 절단하고 T7 폴리머라제를 이용한 시험관내 발현 및 촉매적 활성의 시험(하기 참조)을 위해 PGEMA 벡터로 서브클로닝한다. 달리는 정제된 DNA를 HBPpr-1-neo의 Sal1/Bamh1 부위로 서브클로닝하여 HuBAcpr-1-neo-c-myc-1을 수득한다.
[실시예 6]
[재조합 작제물로부터 레트로바이러스의 생성]
레트로바이러스 벡터를 사용하여 작제물 HuBAcpr-1-neo-ribo-c-myc-1을 세포로 전달하기 위해서, EcoRI/Hind III 단편을 절단하고 레트로바이러스 벡터 PMV7에 기초한 뮤린 백혈병 바이러스 EcoRI/HindIII 부위에 서브클로닝한다. 생선된 레트로바이러스 작제물 PMV7-HBAp-ribo-c-myc-1의 구조가 제6도에 나타나 있다.
제6(a)도는 c-myc-mRNA에 대한 MuLV 벡터중의 리보자임의 도식도이며, 여기에서 Z는 (1) 리보자임을 MuLV 벡터로 서브클로닝하기 위한 짧은 스트레치의 합성 링커이거나, (2) 사람 β-액틴 프로모터이다. 리보자임 구조는 제5(d)에서와 같다.
리보자임 또는 안티센스에 대해 수득된 레트로바이러스 플라스미드 DNA 또는 네가티브 작용성 성장 조절 유전자를 갖는 것을 전기 천공에 의해 ψm 또는 PA12 세포로 형질감염시키고 G418 내성 콜로니를 실시예 2에 기술된 바와 같이 분리시킨다. 조직 배양 상등액을 매일 수거하여 소발 HB-4 로타를 사용하여 4℃에서 10,000rpm으로 원심분리시켜 청면하게 한다. 바이러스 역가는 NIH 3T3세포를 수회 희석된 상등액과 함께 배양하여 측정한다. 이 세포를 RPMI 1640 배지 + 10% FCS 및 100μg/ml G418중에서 성장시킨다. 바이러스 역가는 수득된 G418 내성 콜로니의 수로부터 측정한다. 단지 낮은 역가가 수득되는 경우에만, ψ2 세포를 감염시키는데 바이러스를 사용할 수 있으며 G418 내성 ψ2 세포로부터의 상등액을 상기한 바와 같이 바이러스 역가의 결정을 위해 분석한다. 바이러스 역가가 여전히 낮은 경우 ψ2로부터의 상등액을 비감염된 ψm 세포를 감염시키는데 사용하고 ψm으로부터의 상등액을 바이러스 역가 측정을 위해 시험할 것이다. 이러한 프로토콜의 감염을 이용하는 경우, 통상 103내지 105/ml의 바이러스 역가가 얻어진다. 고역가 103-5/ml을 나타내는 세포 콜로니를 바이러스 생성을 위해 성장시킨다. 이때 이 바이러스는 치료적 목적에 사용될 수 있다.
리보자임에 대한 대체적 벡터가 기술되어 있다[참조 : Cotten M. and Birnstiel M.L.(1989) EMBO J 8: 3861]. 리보자임을 tRNAMet의 구조적 유전자에 서브클로닝시킨다. 생성된 하이브리드 분자 ribo-tRNAMet는 목적한 RNA 기질에 대해 촉매 활성을 갖는 것으로 밝혀졌다. 다른 리보자임 시스템이 또한 사용될 수 있다[참조: Kuo, et al. (1988) J. Virol 62: 4439; Herschlag and Cech(1990) Nature 344 7: 405; Robertson and Joyce(1990) Nature 344: 467].
[실시예 7]
[시험관내 및 생체내에서 리보자임 촉매적 활성 분석]
리보자임을 생성하기 위해서, 리보자임 플라스미드 pGEM-ribo-c-myc-1 2μM을 1시간동안 40℃에서 0.5단위/㎕ T7 RNA 폴리머라제; 40mM TRIS-HCl pH7.9, 20mM MgCl2; 10mM NaCl; 10mM DTT, 0.1ml UTP, 10μci[γ32p] UTP, 각각 1mM의 ATP, CTP 및 GTP; 및 1단위/μ1의 사람 태반 RNase억제제를 함유하는 50μl 반응용액중에서 항온처리한다.
반응이 완결된 후, 95% 포름아미드, 1mM EDTA, 0.1%(w/v) 크실렌 시아놀 블루, 0.1%(w/v) 브로모페놀 블루를 함유하는 로딩 용액 50μl를 반응 혼합물에 가한다.
용액을 5분동안 60℃에서 가열한 후 6% 7M 우레아-폴리아크릴아미드 겔상에 로딩시킨다. 1×TBE 완충액(50mM 트리스-보레이트 pH8.4 및 1.5mM EDTA)중에서 전기영동시킨다. 합성 리보자임을 X-선 필름에 노출시켜 10분 동안 실온에서 겔에 위치시킨다. 리보자임을 함유하는 겔 단편을 절단시키고, 0.1% SDS, 0.5M 암모늄 아세테이트 pH6.9, 1mM EDTA중에서 볼텍싱하여 RNA를 용출시킨다. 용출물을 여과시키고, 0.1용적의 5M 나트륨 아세테이트 pH5.3 및 2용적의 100% 에탄올로 침전시킨다.
리보자임의 촉매적 활성을 시험하기 위해서, 상기에서 분리된 1pmol의 리보자임을 75mM TRIS-HCl 및 2mM EDTA중의 c-myc mRNA 1pmol과 혼합한다. 혼합물을 2분동안 95℃로 가열한 후 얼음상에서 급냉시킨다. 파라핀 유충하에 37℃에서 12시간동안 5mM TRIS-HCl pH7.5, 1mM EDTA 및 10 내지 20mM MgCl2를 함유하는 10㎕의 최종 용적으로 조절하여 반응을 개시한다. 2㎕의 20mM EDTA pH7.9를 가하여 반응을 정지시킨다. 반응 생성물을 노던 블럿으로 분석한다.
[실시예 8]
[세포내에 Rb 단백질의 면역조직화학적 국부화]
세포를 10% FCS 및 0.1% 페니실린/스트렙토마이신으로 보충된 RPM1 1640 배지중에서 배양한다. 세포를 냉각된 PBS(포스페이트 완충된 염수)로 2회 세정한다. 세포를 12시간동안 4℃에서 5% 아세트산 및 95% 에탄올을 함유하는 용액으로 고정시킨다.
고정시킨후, 세포를 냉각된 PBS 중에 2회 세척한다. 4℃에서 1시간동안 1% 정상 말(hores) 혈청, 3% 소 혈청 알부민 및 0.2% 트리톤 X-100을 함유하는 PBS 용액중에서 세포를 배양하여 비특이적 결합을 차단시킨다. 이어서 세포를 PBS로 2회 세정한다. 이 세포를 37℃에서 1시간동안 PBS중의 RB1-AB18의 1:1600 희석액 또는 RB1-ABA1의 1:100의 희석액을 함유하는 4℃ 용액과 배양한다. 이어서 세포를 냉각된 PBS 및 1% 트리톤 X-100 및 PBS를 함유하는 PBS로 연속세척한다. 37℃에서 1시간동안 바이오티닐화된 염소항-래비트 1gG 항체(PBS중에 1:200 희석됨)와 항온처리하여 세포에 대한 RB1 항체의 특이적 결합을 가시화한다. 세포를 냉각된 PBS로 3회 세척한 후, 세포를 30분동안 37℃에서 ABC 시약(아비딘:바이오틴 콤플렉스)와 항온처리하고, 냉각된 PBS로 세척하며, 이어서 새로이 제조된 DAB(3,3'-디아믹소벤지딘-테트라하이드로클로라이드)용액(10ml의 0.05M TRIS-HCl, pH7.6, 0.3% 나트륨 아지드 및 10㎕ 과산화수소중의 6mg의 DAB)과 4분동안 실온에서 항온처리한다. 이어서, 세포를 증류수로 세척하고 광학-현미경하에서 검사한다.
[실시예 9]
[c-myc 및 c-myb에 대한 안티센스 RNA 작제물]
비-임파성 백혈병 세포주 HL-60 및 다른 세포주의 성장을 억제하는데 c-myc 및 c-myb에 대한 안티센스 RNA를 사용하는 것은 이미 문헌에 기술되어 있다[참조: Wackstrom et al (1988) Proc. Natl. Acad. Sci, 85: 1028; Anfoss et al. (1989) Proc. Natl. Acad. Sci 86: 3379]. 이들 실험은 세포를 시험관내에서 올리고리보뉴클레오타이드와 항온처리함으로써 수행한다. 생체내 사용을 위해서, 지정된 안티센스 RNA에 대한 한쌍의 올리고리보뉴클레오타이드를 하기와 같이 생성한다: c-myc에 대해서, 제 1의 15개 염기로된 개방 판독 프레임(c-myc mRNA의 뉴클레오타이드 559 내지 573)에 상보적인 서열을 5' 말단상에는 EcoR1 부위로 플랭킹시키고 3' 말단사에는 Hind III 부위로 플랭킹시킨다.
올리고리보뉴클레오타이드 쌍을 1분동안 90℃에서 가열한 후, 2X 결합 완충액(20mM TRIS HCl pH7.5, 10mM MgCl2, 10MM 디티오트레이틀(DTT) 및 0.2mM ATP)중에서 어닐링시키고, 레트로 바이러스 벡터 PWV7의 EcoR1/HindIII 부위에 결합시킨다.
포지티브 작용성 성장 조절 유전자(예: c-fos, PDGF 수용체등)에 대한 안티센스 RNA를 암호화하는 cDNA를 유사한 방식으로 작제한다.
[실시예 10]
[Rb 단백질에 대해 유사하거나 동일한 구조적 도메인을 갖는 신규한 단백질의 면역학적 검정]
본 발명자는 최근에 Rb 단백질과 유사하거나 동일한 구조적 도메인을 공유하는 일 그룹의 단백질을 발견하였다. 이들 단백질은 신규한 네가티브 작용성 성장 조절 유전자의 생성물일 수 있다. 이들 단백질은 RB 유전자 생성물에 대해 생성된 항체와의 면역침전에 의해 검출된다. 면역침전은 항-Rb 항체 RB1AB 20 및 RB1AB 18 및 RB1AB A1으로 수행한다. 이들 3개의 항체의 제조방법과 용도는 이미 보고되었다[참조: Mihara et al(1989) Science 246: 1300]. 또한, 래비트 폴리클로날 항체 RB1AB C는 펩타이드 P3(CRTPRRGQNRSARIAKQLEND, Rb 단백질로 구성된 펩타이드, N-말단에 시스테인 잔기가 첨가된 아미노산 250번 내지 270번)에 대해 제조되었다.
면역침전을 위해서 유착성 사람 암 세포 SW613(4x106개 세포)의 랜덤군을 ([35S]메티오닌이 표지물로서 사용되는 경우) 메티오닌의 부재하에 또는 (32P 포스페이트가 사용되는 경우) 포스페이트의 부재하에 듈베코 최소 필수 배지(DMEM) 및 5% 투석된 태송아지 혈청(FBS)중에서 배양한다. 37℃에서 1시간동안 배양한후, 배지를 5% 투석된 FBS 및 300UCi의 [35S]메티오닌(100Ci/mmol) 또는 300μCi의 [32P]오르토포스페이트(9120 Ci/mmol)로 37℃에서 2시간동안 대체시킨다. 이어서 세포를 포스페이트-완충된 염수(PBS)로 2회 세척하고, 단백질을 0.5㎖의 EBC(40mM TRIS-HCl pH8.0, 120mM NaCl, 0.5% NP-40, 아프로티닌(2㎍/㎖), 펩스타틴(2㎍/ml), 푸이펩틴(2㎍/㎖) 및 페닐메틸설포닐 플루오라이드(100㎍/㎖)로 시간동안 0℃에서 추출한다. 세포 용해물을 4℃에서 10분동안 15,000rpm으로 원심분리시켜 청명화시키고, 상등액을 5 내지 10㎕의 항-Rb 항체 또는 4℃에서 2시간 이상 동안 100㎍ 면역화 펩타이드와 항온처리된 항체와 4℃에서 2시간동안 항온처리한다. 면역컴플렉스를 단백질 A-아가로즈(Calbiochem)상에서 수거하고 EBC로 5회 세척한다. 면역 침전된 단백질을 시료 완충액[62.5mM TRIS HCl pH6.8, 5% β-머캅토에탄올, 2.3% SDS, 10% 글리세롤 및 0.001% 브로모페놀 블루]중 87℃에서 10분동안 가열하여 용출시키고, SDS-PAGE로 분리시킨다. 겔을 고정화하고 X-선 필름에 노출시킨다.
제8도에서 알 수 있는 바와 같이, 항 Rb 항체로 침전될 수 있는 적어도 4개 그룹의 단백질이 있다. 이들 단백질은 Rb 단백질과 유사한 구조적 도메인을 공유하므로, Rb 단백질에 대한 항체에 의해 인지된다. 기타 단백질을 Rb 단백질과 결합시켜 공동-침전시킬 수 있다. 이들 단백질의 특성이 하기에 열거되어 있다.
(1). P110-P130은 110 내지 130kd의 분자량을 갖는 이종 그룹의 단백질 종류이다. 분자량은 사용된 겔 전기영동 마커의 이동으로부터 가장 잘 평가된다. 이 단백질은 107 내지 150kd의 분자량을 갖는다.
이들 단백질은 먼저 Rb 단백질을 갖는 사람 암 세포주 SW613에서 검출되었다. 제8도 레인 1, 9 및 13에서 알 수 있는 바와 같이, RB1AB 20은 분자량 105 내지 130kd인 단백질 그룹을 침전시킨다. 이들 단백질이 항 Rb 항체에 의해 특이적으로 인지된다는 것은 항체를 면역화 펩타이드 P5로 예비흡수시키는 경우 이들 단백질을 면역침전시키지 못하는 사실에 의해 인지된다(제8도 레인 2, 10 및 14). 콤플렉스로서 Rb 단백질과의 결합대신에 이들 그룹의 단백질은 Rb 단백질과 구조적 모티프를 공유하는 듯하다. 이는, 이들이 유방암 세포주 BT-549 및 망막아종 세포주 Y79(제8도 레인 11)(이들은 모두 내인성 Rb 단백질이 없다)과 같은 세포에서 RB1AB 20으로 검출된다는 사실로부터 밝혀진다. 또한, 이는 이들 단백질이 Rb1 유전자에 의해 암호화되지 않는다는 것을 나타낸다.
이러한 그룹의 단백질중 하나이상의 멤버가 최근에 보고된 p107/p120 단백질과 관련될 수 있다[참조: Ewen M.E. et al (1989) Cell 58:257; Dyson N. et al (1989) Cell 58:249]. p107/p120은 SV40 및 JC 바이러스의 거대 T항원 및 아데노바이러스의 E1A 단백질에 결합할 수 있는 단백질 종류이다. 동일한 바이러스 항원 도메인이 이들 및 Rb 단백질을 결합하는데 사용되므로, 이들 단백질은 바이러스 단백질에 의해 인지될 수 있는 구조적 모티프를 공유할 수 있다. Rb 유전자의 결실 맵핑(mapping)으로 이들 바이러스 항원에 결합하는데 중요한 아미노산 393 내지 572번 및 646 및 772번의 위치를 알아내었다. 사실, Rb 단백질의 이들 영역에 대해 생성된 항체는 p107/p120 종류를 인지할 수 있다. 그러나, Rb1AB 20이 생성되는 아미노산의 스트레치인 P5는 E1A 또는 SV40 거대 %에 결합하는데 필요한 도메인 밖이라는 것을 주목해야 한다. P5는 이들 단백질중에서 보존되는 도메인의 일부분일 수 있다. 이 항체에 의해 또한 인지되는 p107-110kd가 제8도 레인 3 및 4에 나타나 있다. 경부암 세포주 ME180으로부터의 세포 용해물의 면역침전은 105kd 및 110kd 단백질의 존재를 나타낸다(제8도 레인 3). 항체를 펩타이드 P52로 미리흡수시키면 양밴드 모두가 사라진다. 그러나, 포스포릴화가 많이 된 Rb 105kd 단백질은 약 107 내지 110kd의 분자량을 지니므로, 이 영역에서의 기타 단백질을 가릴 수 있다. 이들 단백질이 Rb 단백질의 포스포릴화된 형태에 의해 가려지는가를 시험하기 위해서, 경부암세포주 C33A(제8도 레인 5 및 6) 및 방광 세포주 J82(제8도 레인 7 및 8도)를를 사용하여 동일한 실험을 하였으며, 여기에서 Rb 단백질은 돌연변이 되었으며 포스포릴화될 수 없다. 양 세포주 모두로부터의 세포 용해물의 면역침전은 Rb 단백질의 105kd 비포스포릴 형태 및 107kd 단백질의 존재를 나타내었다. 따라서, RB1AB-20은 분자량이 107 내지 130kd인 일그룹의 단백질을 파괴시킬 수 있다. 이들 단백질은 Rb 단백질과 공통적인 구조적 도메인을 공유하며 항 Rb 항체에 의해 인지될 수 있다.
(2). 약 85kd의 분자량을 갖는 단백질 P85는 사람 암세포주 SW613에서 검출되었으며, P85는 항체 RB1AB 20 및 RB1AB C를 사용하여 검출될 수 있다. 제8도 레인 1 및 2에서 알 수 있는 바와 같이, P85는 용이하게 검출될 수 있으나(제8도 레인 1), 항체가 면역화 펩타이드(P5)로 차단되는 경우에는 그렇지 않다(제8도 레인 2). 정상인의 케라티노사이트를 TGF-β로 처리하는 경우, 성장 저지는 P85는 단백질 발현의 상승조절과 관련된다. 보다 중요하게, P85의 발현 증가는 TGF-β 처리용량에 및 처리동안 의존적이다. TGF-β 처리로 많은 세포 타입을 성장 억제시킬 수 있다는 것이 공지되어 있다. 세포중 P85 발현이 TGF-β 처리로 증가된다는 사실은 P85가 Rb 단백질과 공통의 구조적 모티프를 공유하는 또다른 네가티브 작용성 성장 조절 유전자 생성물이라는 가능성과 일치한다.
(3). 약 53kd의 분자량을 갖는 또다른 단백질 P53이 RB 항체에 의해 침전된다. Rb 단백질과 공통적인 구조적 모티프를 공유하는 단백질이 모든 네가티브-작용성 성장 조절 생성물이라는 가장 강력한 증거는 종양 억제 유전자 생성물 P53이 RB1AB 20(제8도 레인 13 및 14) 및 RB1AB18(제8도 레인 15 내지 18) 항체에 의해 침전된다는 것이다. P53이 Rb와의 결합 또는 연결에 의해 공동침전되지 않는다는 것을 입증하기 위해서, 사람 유방암 세포주 MDAMB468(이는, Rb 유전자는 결실되고, P53 유전자는 함유한다)를 시험하였다. P53은 또한 사람 유방암 세포주 MDAMB468로부터 양 항체 모두로 침전되었다.
따라서, 이들 그룹의 단백질은 네가티브 작용성 성장 조절 유전자에 의해 암호화될 수 있다. 따라서 이들 유전자는 이들을 비정상적으로 증식하는 표적 세포에 도입하여 세포 성장을 억제하기 위한 본 발명의 실시에 이용될 수 있다.
본 발명을 상세히 기술하였으며, 당해 분야의 전문가라면 하기에 실린 본 발명의 목적 및 범위를 벗어나지 않으면서 많은 변형과 수정을 가할 수 있다는 것을 알 수 있을 것이다.

Claims (8)

  1. 망막아종 유전자, p53 유전자, p85 유전자, p107 유전자 및 p130 유전자로 이루어진 그룹중에서 선택되는 네가티브 성장 조절 유전자를 암호화하는 DNA를 포함하는 조성물을 세포에 투여하여 비-종양성, 양성(benign) 세포 증식 질환을 치료하기 위한 약제학적 조성물.
  2. 제1항에 있어서, 네가티브 성장 조절 유전자를 암호화하는 DNA가 재조합 발현 벡터내에 포함되는 약제학적 조성물.
  3. 제1항에 있어서, 네가티브 성장 조절 유전자가 망막아종 유전자인 약제학적 조성물.
  4. 제1항에 있어서, 네가티브 성장 조절 유전자가 p53 유전자인 약제학적 조성물.
  5. 제1항에 있어서, 건선, 양성 증식성 피부 질환, 어린선, 유두종, 기저 세포 암종, 측두린 세포 암종, 섬유조직 증식 질환, 혈관증식 질환, 피부증식 질환 및 눈의 신생물성 질환으로 이루어진 그룹중에서 선택된 질환과 관련된 비정상적 증식 세포의 치료를 위한 약제학적 조성물.
  6. 제1항에 있어서, 네가티브 성장 조절 유전자를 암호화하는 DNA를 포함하는, 내인성의 야생형 네가티브 성장 조절 단백질이 결핍된 증식 세포 성장윽 억제시키기 위한 약제학적 조성물.
  7. 제6항에 있어서, 내인성의 야생형 네가티브 성장 조절 단백질이 결핍된 증식 세포가 내인성의 야생형 네가티브 성장 조절 유전자가 결핍된 세포인 약제학적 조성물.
  8. 제6항에 있어서, 내인성의 야생형 네가티브 성장 조절 단백질이 결핍된 증식 세포가 돌연변이된 네가티브 성장 조절 유전자를 갖는 약제학적 조성물.
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