KR100386899B1 - Rb및p53유전자의돌연변이체및이의용도 - Google Patents
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Abstract
본 발명은 Rb 유전자 및 p53 유전자의 돌연변이체 및 치료학적으로 이들 돌연변이체를 이용하는 방법을 제공한다. 돌연변이된 Rb 유전자 및 p53 유전자와 함께, 본 발명은 돌연변이된 Rb 유전자 또는 p53 유전자를 함유하는 플라즈미드를 제공한다. 또한, 본 발명은 본 발명의 플라즈미드로 형질감염된 세포를 제공한다. 더우기, 본 발명은 다양한 병리생리학적 세포 증식성 질병을 치료하기 위한 방법을 제공한다.
Description
발명의 배경
세포 증식의 조절은 다양한 상호작용하는 성분을 포함하는 복잡한 과정이다. 세포의 성장여부는 음성적으로 작용하는 성장 조절 유전자 및 양성적으로 작용하는 성장 조절 유전자의 발현의 균형에 의존한다. 음성적으로 작용하는 성장 조절 유전자는 세포내에서 발현되거나 세포에 제공되는 경우 세포 성장의 억제를 유도하는 것이다. 양성적으로 작용하는 성장 조절 유전자는 세포내에서 발현되거나 세포에 제공되는 경우 그의 성장을 촉진시키는 것이다.
최근, 세포 증식에 음성적으로 작용하는 종양 억제 유전자로 불리는 몇몇 음성적으로 작용하는 성장 조절 유전자가 밝혀졌다. 이들 유전자는 이에 제한되지는 아니하나 사람 망막아세포종(retinoblastoma) 유전자인 RB-1 및 p53 유전자를 포함한다. 몇몇의 이들 음성적 성장 조절 유전자의 부재나 불활성화는 특정 형태의 암과 상호 연관되어 있다.
사람 망막아세포종 유전자인 RB-1은 세포내에서 이 유전자의 두 대립 형질 모두 부재하거나 이 유전자 또는 이의 유전자 생성물의 발현이 억제될 경우 종양(neoplastic) 또는 비정상적인 세포 증식을 유도하는 종양 억제 유전자의 표본이다. 분자 수준에서 RB-1의 두 대립형질의 소실이나 불활성화는 망막아세포종과 같은 종양 및 골육종, 섬유육종, 연조직 육종 및 흑색종과 같은 임상학적으로 연관된 종양의 임상적 표시와 관련된다. 또한, RB-1의 기능의 소실은 기타 형태의 원발암(예: 폐 소세포 원발암, 방광암, 흉부암, 경부암 및 전립선암)과 연관되어 있다.
종양 억제 유전자 Rb 및 p53은 암성 및 비암성 세포의 증식을 억제한다.
RB-1 또는 p53의 야생형 cDNA를 재삽입하면 재삽입된 유전자가 많은 상이한 종양 세포형에서 성장 저지 및 지연을 유도하여 부분적으로 정상적인 성장 조절을 재건하는 것으로 나타났다. Rb 유전자를 종양 억제 유전자로서 지정하게된 것은 Rb 유전자의 두 대립형질의 불활성화가 암 발달의 소인이라는 사실에 근거한 것이다. 그러나, Rb 유전자의 성장 억제 효과는 종양 세포에만 제한되지는 아니한다. 2개의 복사체(copy)를 가진 정상적인 세포는 특정의 성장 조건하에서 Rb 유전자의 여분의 복사체를 삽입함으로써 성장을 저지시키거나 지연시킬 수 있다. 유사하게, 비암성 세포의 성장을 억제하는 야생형 p53의 능력이 잘 입증되어 있다. 그러므로, Rb 및 p53에 의해 조절되는 단계는 직접적으로 종양성 표현형에 영향을 끼친다기 보다는 오히려 종양 및 정상적인 세포의 성장을 조절하는 단계에 영향을 끼칠 것이다.
정상적인 세포의 병리학적 증식의 기작
치료학적으로 이점을 제공하는 신규한 방법이 필요한 광범위하게 다양한 병리학적 세포 증식 상태가 존재한다. 이들 병리학적 상태는 비정상적인 세포 증식이 가능한 거의 모든 세포형에서 발생할 수 있다. 병리학적 또는 비정상적 성장을 보이는 세포형중에는 (1)섬유아세포, (2)혈관 내피세포 및 (3)상피 세포가 있다. 이상으로부터 개체의 모든 또는 거의 모든 기관 및 조직 시스템에서 국소적인 또는 산재된 병리학적 상태를 치료하기 위한 방법이 필요함을 알 수 있다.
예를 들어, 눈에서만도, 눈의 섬유증식성, 혈관증식성 및/또는 종양성 질병(예: 미성숙의 망막증, 증식성 초자체 망막증, 증식성 당뇨병성 망막증, 모세혈관종, 맥락막 혈관생성망, 망막하부 혈관생성망, 망막하부의 혈관생성, 각막 혈관생성으로 인한 노인성반부변성, 각막상부막 증식으로 인한 반점 주름, 핵 경화증으로 인한 성인 백내장, 외상 또는 수술에 따른 섬유 불성장, 시신경 교종, 망막혈관종증, 혈관생성성 녹내장, 해면 혈관종, 홍채 조홍, 경상 세포 증식성 망막증, 눈 수술 또는 상처 후의 내피세포 하부성장, 후속 백내장 막, 유두종, 지중해 빈혈에서 망막 혈관생성, 탄력성 위황색종으로 인한 망막하부 혈관생성 및 다발성 신경섬유종 형 I 및 II, 망막아세포종, 포도막 흑피증, 및 안구공의 위종양)을 포함하나 이에 제한되지 아니하는 정상적인, 양성의 또는 악성의 세포 또는 조직의 비정상적인 증식으로 인한 광범위한 병리학적 질병 상태를 치료하기 위해 신규의 방법을 사용할 수 있다. 본 발명이 유용한 기타의 양성 세포 증식성 질병은 건선, 어린 선, 유두종, 기저세포암, 편평세포암 및 스티븐-존슨 증후군을 포함하나 이에 제한되지 아니한다.
정상적인 세포의 경우에, 이미 Rb 유전자 및 p53 유전자 각각의 두 정상적인대립형질이 존재하고 있을지라도 세포에 성장 인자가 제공되는 경우, 예를 들어 조직 배양 성장 조건에서 이들 야생형 단백질은 세포가 증식하는 것을 막을 수 없다는 것에 주목하여야 한다. 병리학적 상태에서 휴지세포의 조절되지 않은 증식은 또한 병리학적 상태에 의해 유도된 성장인자에 세포가 노출되기 때문이다[하기 참조]. 예를 들어 지중해빈혈에서 눈에서의 혈관의 조절되지 않은 증식은 증식이 정지되지 아니하는 한 망막의 박리를 유도한다. 이러한 세포내로 Rb 유전자 및 p53 유전자의 여분의 복사체를 삽입하는 것은 세포가 성장하는 것을 억제하기에 충분할 수도 있고 그러하지 아니할 수도 있다. 사실, 외인성 Rb 유전자를 많은 종양 세포내로 삽입하는 것은 완전한 저지 대신에 세포의 성장 속도를 지연시킬 뿐이다. Saos-2 및 DU145와 같은 이미 보고된 세포주는 이런 현상의 좋은 예이다. 유전자의 보다 많은 복사체를 삽입할 필요가 있을수 있으나 한편으로는 삽입되거나 삽입될 수 있는 복사체의 수를 조절하기가 어렵다. 다른 한편으로는 성장 인자 노출이 발현된 Rb 단백질의 불활성화를 유도할 수 있다.
인산화에 의한 Rb 단백질의 활성 조절
성장 억제 유전자의 불활성화가 세포 성장의 억제를 제거하는데 필수적인 단계라면, 세포가 조절된 방식으로 증식할 수 있도록 이들 유전자 생성물의 활성을 조절하는 기작이 있음이 틀림이 없다. 일정한 성장 억제 유전자의 발현은 양적으로 또는 질적으로 조절될 수 있음을 생각할 수 있다. Rb 유전자의 경우에, 단백질의 정지 상태 수준 대 세포 부피의 비가 세포주기를 통해 일정하다. Rb 단백질의 농도의 변화가 없는 것은 세포가 이 단백질의 활성을 조절할 수 있는 다른 기작이 존재하는 것을 의미한다. Rb 단백질(pRb)의 활성이 이의 인산화 상태에 의해 조절되는 것을 보여주는 몇몇 증거가 존재한다. 다양한 성장 자극 또는 억제 인자는 그들의 효과를 Rb 단백질과 같은 성장 억제 유전자 생성물의 인산화를 방해함으로써 발휘할 수 있다. Rb 단백질의 인산화의 유도에 있어 성장 자극 인자의 역할에 대한 증거는 Rb 단백질이 휴지 세포에서 탈인산화된 형태로 존재하는 것을 관찰함으로써 도출된다. 또한, 휴지 세포가 인슐린 및 트랜스페린과 함께 EGF와 같은 성장 인자 또는 혈청에 노출됨으로써 증식이 자극되는 경우, Rb 단백질의 주된 형태는 G1에서 탈인산화되어 있으나 세포가 G1/S경계선을 들어감에 따라 과인산화된다. 이들 자료는 Rb 단백질이 혈청 또는 성장 인자에 의해 유도되는 시그날 전달(signal transduction)의 표적임을 의미한다. 결론적으로, 성장 인자의 증식 자극 효과에 응답할 수 없는 노쇠한 사람 섬유아세포는 또한 Rb 단백질을 인산화시키지 못한다.
Rb 단백질의 인산화의 하향조절(downregulation)에 있어서 성장 억제 인자의 역할에 대한 증거가 또한 존재한다. 활발하게 성장하는 백혈구 또는 신겅아세포종을 레틴산 또는 비타민 D3, DMSO, 기타 분화 유도 시약으로 처리할 경우, Rb 단백질은 초기 G1 단계에서 세포 성장 저지의 시작에 앞서 탈인산화되고 분화를 유도하는 것으로 밝혀졌다. 또한 폐 내피 세포를 파라크린 성장 억제 폴리펩티드-형질전환 성장 인자 베타 1(TGFβ 1)으로 처리하는 것은 Rb 단백질의 인산화의 하향조절 및 후기 G1에서 세포 성장의 공동 저지를 유도한다. 이들 자료를 함께 고려하면, Rb 단백질의 탈인산화된 형태가 실제적으로 세포의 G1/S 경계선 통과를 억제하고 G1에서 활성화된 키나아제(S)가 세포가 S단계로 이동할 수 있도록 Rb 단백질을 불활성화시킬 수 있음을 생각할 수 있다.
종양 세포에서 결실 또는 돌연변이에 의한 Rb 유전자의 영원한 제거는 성장을 허용하고 Rb 유전자가 정상적으로 발현하는 정상적 세포에서의 성장 억제의 제거는 이의 유전자 생성물 즉 Rb 단백질(pRb)의 세포주기 의존성 해독-후 변형에 의해 획득된다. pRb는 다중인산화된 형태로 존재하고 탈인산화된 형태는 활성형이라는 증거가 있다. 예를 들어 SV40의 큰 T 항원은 우선적으로 Rb 단백질의 탈인산화된 형태에 결합한다. Rb 단백질의 인산화는 이를 SV40 큰 T 항원으로부터 방출시키고 pRb의 탈인산화된 형태만이 E2 프로모터에 결합하여 전사를 억제시킨다. 그러므로 Rb 단백질의 탈인산화된 형태는 실제적으로 세포 성장을 억제하는 반면 세포 증식은 Rb 단백질의 과인산화와 연관되어 있다. 그러므로 비록 정상적인 세포가 Rb 단백질을 발현할 수 있다고 할지라도 병리학적 상태를 포함하는 다양한 성장 상태에서 발견되는 것과 같은 적합한 성장 인자에 노출되는 경우 성장이 유도될 수 있다. 특정 병리학적 상태하에서, 정상적인 세포는 바람직하지 않게 증식하도록 유도될 수 있다. 당뇨병성 망막증에서 눈에서의 정상적인 휴지 섬유아세포의 증식은 세포 성장의 상기 바람직하지 않은 유도의 예이다. 치료되지 않고 방치되면 증식하는 섬유아세포는 결국 망막에 부착하여 이의 급성 박리를 유도한다.
p53 단백질의 활성화
Rb 유전자와 유사하게, p53 유전자의 불활성화 또는 돌연변이는 종종 종양 및 비종양성 세포주에서 관찰된다. 야생형 p53 단백질은 또한 그것이 SV40의 큰 T같은 바이러스 항원에 결합한 경우 음성적으로 조절된다. p53 단백질은 전사 인자로서 작용하고 특정 DNA 서열에 결합한다. DNA에 결합하는 야생형 p53 단백질의 능력은 이것이 적절하게 작용하기 위해 결정적이다. 돌연변이 p53 단백질에서 특정한 DNA 표적 서열에 결합하거나 전사를 활성화시키는 단백질의 능력은 상실되는데 이는 이들 활성이 단백질의 억제 작용에 중요함을 의미한다. 그러나, 또한 p53 단백질의 서열 특이성 DNA 결합 활성이 알려지지 않은 것으로 최근에 나타났다. 신규하게 합성된 p53 단백질은 단백질이 변형되지 않는 한 이의 특이성 DNA 서열에 결합할 수 없다는 점에서 불활성이다. 변형을 위한 위치중의 하나는 C-말단에서 아미노산 잔기 365-393번이다. 이 부위는 세균성 가열 쇼크 단백질 dnaK에 결합하기 위한 위치 및 RNA 부분의 부착을 위한 위치이다. 365번 내지 389번 아미노산 잔기에 대한 항체 Pab421의 결합은 p53 단백질이 특정한 DNA 서열에 결합할 수 있도록 단백질의 구조를 변화시킴으로써 단백질을 활성화시킨다.
pRb 및 p53의 작용 양식의 차이
비록 Rb 및 p53이 종양 억제 유전자로 여겨지지만, 이들의 활동 양식은 매우 상이하다. 우선 두개의 유전자가 상이한 방식으로 작용한다는 증거가 제공되었다. Rb 유전자가 없는 마우스는 배아상태에서 치사되나, p53이 없는 마우스는 비록 암 발생에 더욱 민감하지만 정상적으로 발생한다. 세포 수준에서, p53이 존재하지 아니하는 암 세포는 외인성 p53의 부재에도 불구하고 Rb 유전자의 과발현에 의해 성장이 저지되거나 지연된다. 다른 한편, Rb가 존재하지 않는 세포는 p53 유전자의 성장 억제 효과에 민감하다. 분자 수준에서 p53 및 pRb는 상이한 단백질 표적 및 DNA 서열과 (직접적으로 또는 간접적으로) 상호작용한다.
치료법에서 Rb 및 p53 유전자의 용도
이들 두 단백질은 그들의 행동 양식에서 상이할지라도, 이들은 실험적인 상태에서 활성형의 이 두 단백질을 과발현시키면 세포의 성장을 억제 또는 지연시키도록 유도한다는 한가지 점에서는 유사하다. 세포 성장이 pRb 및 p53과 같은 억제 유전자의 발현에 의해 조절되고 이들 단백질이 작용하기 위해 활성형의 구조로 존재할 것이 필요하다는 것이 공지되어 있으므로 유전자 치료법에 있어서 이들 활성형의 유전자를 가지는 것이 바람직하다. pRb의 경우에, 신규하게 합성된 단백질은 탈인산화되어 있고 활성형이다. 불활성화는 세포가 성장 인자에 노출될 때 발생할 수 있다. 활성형으로 존재하고 인산화에 의한 불활성화에 내성이 있는 pRb의 돌연변이체 형태가 바람직하다. p53의 경우에, 신규하게 합성된 단백질은 변형되지 않는 한 DNA에 결합할 수 없다는 점에서 불활성이다. 유전자 치료법에서는, 추가의 변형없이도 이미 활성화된 p53 유전자의 돌연변이체 형태가 매우 바람직하다. 최종적으로, 두 단백질이 작용 양식이 상이하기 때문에, 한 유전자의 성장 억제 효과에 대하여 내성이 있는 세포가 다른 유전자에 민감하도록 하는 돌연변이 또는 성장 조건과 같은 치료법에서 Rb 및 p53 유전자의 배합물을 사용하는 것이 바람직하다.
선행 기술에서는 유전자 생성물(단백질)이 영구적으로 활성이고 심지어 세포가 성장 인자에 노출되더라도 작용할 수 있도록 돌연변이된 종양 억제 유전자가 제공된 적이 없다. 더욱 상세하게, 선행 기술에서는 효과적이고 작용성인 돌연변이된 형태의 p53 및 Rb 유전자가 제공된 적이 없다. 선행 기술에서는 또한 암종 및 비암종 세포 증식성 질병에서 야생형 및/또는 돌연변이형의 Rb 및 p53 유전자의 동시적용을 제공한 적이 없다.
발명의 요약
일면으로, 본 발명은 비암성 세포 증식성 질병 및 암성 세포 증식성 질병에서 존재하는 것과 같은 부적합한 또는 병리학적인 세포 성장의 치료에 일반화된 접근법을 제공한다. 더욱 구체적으로, 본 발명은 돌연변이된 성장 억제 유전자 및/또는 유전자 생성물을 투여함으로써 병리생리학적 세포 증식 질병을 치료하는 방법을 제공한다.
본 발명의 한 실시양태에서, 기능적으로 활성형의 돌연변이된 성장 억제 유전자 또는 돌연변이된 성장 억제 유전자의 배합물인 분리된 DNA 분자를 제공한다.
본 발명의 또 다른 실시양태에서, 기능적으로 활성형의 망막아세포종 또는 p53 유전자 돌연변이체를 함유하는 신규한 플라스미드를 제공한다.
또 다른 본 발명의 실시양태에서, 치료적 목적으로 Rb 및 p53 유전자의 야생형 및/또는 활성형 돌연변이체를 연속적으로 또는 동시에 투여하는 방법을 제공한다.
본 발명의 다른 실시양태에서, 비암성 증식 세포에 돌연변이된 Rb 유전자 및 돌연변이된 p53 유전자를 동시에 또는 연속적으로 투여하는 것을 포함하는, 병리학적 세포 증식성 질병의 치료를 위한 방법을 제공한다.
부가적으로 돌연변이된 Rb 유전자 및 돌연변이된 p53 유전자를 증식하는 암세포내로 동시에 또는 연속적으로 투여하는 것을 포함하는, 개체에서 악성 세포 질병을 치료하는 방법을 제공한다.
본 발명의 다른 추가의 양상, 특징 및 이점은 기술의 목적으로 주어진 본 발명의 바람직한 실시양태의 하기 설명에 의해 분명해질 것이다.
본 발명은 일반적으로 세포 성장의 조절 및 증식성 질병 분야에 관한 것이다. 더욱 구체적으로, 본 발명은 RB-1 및 p53 유전자의 돌연변이체 및 이 돌연변이체의 치료적 용도에 관한 것이다.
제1도는 폴리클로날 항-Rb 항체 RB1-Ab #18 및 #20을 사용하는 세포성 단백질의 면역침강에 의한 pRb 및 p53간의 상동성 부위의 제시도이다.
제2도는 폴리클로날 항-Rb 항체 RB1-Ab #18 및 #20을 사용하는 세포성 단백질의 면역침강에 의한 pRb 및 p53간의 상동성 부위의 구조이다.
제3도는 Pab421의 부재에서 특정한 DNA 서열에 결합하는 P1, P3, P5 돌연변이체 p53 단백질의 능력을 도시한다.
제4도는 야생형의 단백질과 비교한 돌연변이체 Rb 단백질의 인산화 양식의, (A)생체내에서 표지된 단백질, (B)시험관내에서 표지된 단백질의 2차원 지도화 분석을 도시한다.
제5도는 망막아세포종 단백질의 SV40의 큰 T 항원에의 결합 및 인산화에 의한 복합체의 해리를 도시한다.
제6도는 두개의 상이한 형태의 인산화된 망막아세포종 단백질 (SV40의 큰 T 항원에 의해 결합되는 것 및 결합되지 않는 것)의 2차원 지도화 분석을 도시한다.
제7도는 상이한 성장 조건하에서 망막아세포종 단백질의 인산화 양식에서의 변화의 2차원 지도화 분석을 도시한다.
제8도는 정상 세포 WS1의 성장을 억제하는 m89 Rb 돌연변이체의 능력을 도시한다.
제9도는 방광암 세포주 TCCSUP의 성장을 억제하는 m89 Rb 돌연변이체의 능력을 도시한다.
정의
용어 "유전자의 작용성 발현"은 유전자의 전사 억제, 유전자 전사체(프리-mRNA)의 분해, 스플라이싱의 억제, mRNA의 분해, mRNA의 해독의 방해, 단백질 해독-후 변형의 방해, 단백질의 분해 또는 단백질의 정상적 작용의 억제를 포함하는 의미이다.
용어 "형질감염된 플라스미드"는 선택된 세포내로 운반되는 (형질감염되는) 돌연변이된 망막아세포종 또는 p53 유전자를 함유하는 세균의 플라스미드를 포함하는 의미이다.
용어 "유전자 치료법"은 유전자 발현을 조절하기 위해 및/또는 유전자 생성물의 작용을 위해 일부분의 또는 모든 유전자, DNA 작제물, RNA, 또는 유전자 생성물을 세포, 세포의 그룹, 조직, 병리학적 병소, 기관 또는 유기체내로 삽입하는 것을 포함하는 의미이다.
용어 "예방적 유전자 치료법"은 질병의 부분적 또는 총체적 억제 또는 예방 및 질병의 확산을 위해 사용될수 있는 유전자를 포함하고 또한 세포, 조직 또는 생식세포에서 결핍되거나 존재하지 아니하는 음성적인 성장을 대치하거나 보충하기 위해 사용될 수 있는 유전자를 포함하는 의미이다.
용어 "세포 증식성 질병"은 세포, 세포의 그룹 또는 조직(들)의 양성 또는악성의 단일 또는 다중의 국소적인 비정상적 증식으로 특징되는, 기관, 강(cavities) 또는 신체 부분의 임의의 하나 또는 임의의 조합에 영향을 미치는 임의의 사람 또는 동물 질병 또는 장애를 포함하는 의미이다.
용어 "원핵세포"는 본 발명의 재조합 분자의 발현을 위한 DNA로 형질 전환될수 있는 모든 세균을 포함하는 의미이다.
용어 "진핵세포"는 본 발명의 재조합 분자의 발현을 위해 DNA로 형질 전환될수 있는 모든 효모, 균류, 동물 및 식물 세포를 포함하는 의미이다.
본 발명의 DNA 작제물에 있어서 DNA는 합성되거나 임의의 포유동물 종으로부터 유도될 수 있다. 요구되는 모든 것은 Rb 또는 p53 유전자에서 유전자 서열이 원핵세포 또는 진핵세포 유기체에서 작용성으로 발현되어야 한다는 것이다. 합성 DNA가 바람직하다.
본 발명의 DNA 작제물을 암호화하는 재조합 DNA 분자는 당업자에게 통상적으로 공지된 임의의 기술을 사용하여 숙주를 형질전환시키기 위해 사용될 수 있다.
융합된, 작동가능하게 연결된 유전자를 제조하기 위한 방법 및 세균에서 이들을 발현시키기 위한 방법은 공지되어 있고 본원에서 참조문헌으로 삽입된 미합중국 특허번호 제4,366,246호에 나타난다. 본원에서 서술된 유전적 작제물 및 방법은 원핵세포 또는 진핵세포 숙주에서의 본 발명의 DNA 작제물의 작제 및 형질감염을 위해 사용된다.
원핵세포 숙주는 그램 음성 세균 및 그램 양성 세균[예 : 이. 콜라이, 에스. 팀피무리움(S. tymphimurium), 셀라티아 마르세스센스(Serratia marcescens) 및 바실러스 섭틸리스 (Bacillus subtilis)]를 포함할 수 있다. 진핵세포 숙주는 효모[예: 피키아 파스토리스(Pichia pastoris)] 또는 포유 동물 세포를 포함할 수 있다.
일반적으로, 삽입된 DNA 단편의 효과적인 전사를 촉진시키는 프로모터 서열을 함유하는 발현벡터가 숙주와 연관되어 사용된다. 발현벡터는 통상적으로 복제 기점, 프로모터, 종결자 및 형질전환된 세포에서 표현형으로 선별할 수 있도록 하는 특이한 유전자를 함유한다.
본 발명에서 사용될 수 있는 프로모터의 예는 사람 β 액틴 프로모터, 메탈로티오닌 프로모터, SV40 복제 기점, MMTV LTR 프로모터 및 MuLV LTR 프로모터를 포함하나 이에 제한되지는 않는다. 본 발명에서 사용될 수 있는 몇몇의 플라스미드 또는 박테리오파아지의 예는 문헌[참조: Maniatis 등., Molecular Cloning, Cold Spring Harbor Laboratories (1982)]에 서술되어 있고 기타 당업자에게 공지되어 있고 쉽게 확인될 수 있다.
유전자는 특정의 펩티드의 특징적인 아미노산의 mRNA 서열 및 이의 주형을 통해 암호화되는 DNA 서열이다. 용어 cDNA는 인트론 서열이 제거된 유전자를 포함한다. 용어 "재조합 DNA"(rDNA)는 시험관내에서 cDNA 또는 게놈성 DNA 서열을 스플라이싱함으로써 재조합된 분자를 포함한다.
클로닝 비히클은 DNA의 본질적인 생물학적 기능의 소실없이 측정가능한 양식으로 절단될 수 있는 하나 또는 소수의 엔도뉴클리아제 인식 위치를 가지고 형질전환된 세포의 확인에 사용하기에 적합한 마커를 함유하는 것을 특징으로 하는 숙주 세포내에서 복제할 수 있는 플라스미드 또는 파아지 DNA 또는 기타 DNA 서열이다.마커는 예를 들어 테트라사이클린 내성 또는 엠피실린 내성이다. 단어 "벡터"는 때때로 클로닝 비히클로 사용된다.
발현 비히클은 클로닝 비히클과 유사하나 정상적으로 특정 조절 서열의 조절하에서 숙주에서 주어진 구조 유전자를 발현시킬 수 있는 비히클이다.
용어 "개체"는 동물 및 사람을 포함하는 의미이다.
용어 증식성 세포의 성장을 "생물학적으로 억제하는" 또는 성장의 "억제"는 부분적인 또는 총체적인 성장 억제를 포함하는 의미이고 증식률 또는 세포의 성장률의 감소를 포함하는 의미이다. 본 발명의 돌연변이체의 생물학적 억제 투여량은 조직 배양물에서 표적의 악성 또는 비정상적 증식성 세포의 성장, 동물 및 세포 배양물에서 종양 성장에 대한 시험 요소의 효과를 평가함으로써 또는 당업자에게 공지된 임의의 방법으로 결정될 수 있다.
본원에서 사용된 용어 "보존된 상동성 부위"는 표 I에서 도시된 바와 같이 Rb 및 p53 간의 상동성 아미노산 부위를 말한다.
본 발명의 단백질을 국소적으로, 안내로, 비경구적으로, 비강내로, 정맥내로, 근육내로, 피하내로, 또는 임의의 기타 적합한 수단으로 투여할 수 있다. 눈 질병의 치료를 위한 바람직한 투여 방법은 안내의 또는 눈부위의 주사이다. 피부 세포 증식성 질병의 치료를 위한 바람직한 투여 방법은 국소적인 도포 또는 피하주사이다.
또 다른 실시양태에서, 본 발명의 DNA 작제물을 병소 증식성 질병에 직접적으로 전달할 수 있다. 눈의 증식성 질병의 경우에 본 발명의 DNA 작제물을 직접적으로 눈내에 주사할 수 있다. 본 발명의 DNA 작제물을 질병 위치에 직접적으로 주사 바늘을 안내하기 위해 사용되는 이미지 장치를 사용함으로써 내부 기관, 체강 등의 병소에 직접적으로 전달할 수 있다. 본 발명의 DNA 작제물은 또한 수술시에 질병 위치에 투여될 수 있다.
투여될 DNA 투여량은 개체의 연령, 임상학적 상태 및 질병의 범위 또는 유전학적 소인, 위치, 중량, 동반 치료의 종류, 존재한다면, 및 병리학적 또는 악성 상태에 의존한다. 본 발명의 방법에서 유용한 효과적인 전달 시스템은 경구투여를 위한 캡슐, 정제, 액제, 현탁제, 또는 엘릭서, 또는 멸균액 (예: 용제, 현탁제 또는 유제) 형태로 사용될 수 있다. 임의의 불활성 담체는 바람직하게 염수 또는 인산염-완충된 염수, 또는 본 발명의 방법에서 사용되는 화합물이 적합한 용해성을 가지는 임의의 담체이다.
바람직하게, 안내의 전달을 위해 및 기타 국소화된 질병 위치애로의 전달을 위해, 본 발명의 방법에서 유용한 전달 시스템은 용제, 현탁제 또는 유제와 같은 살균 액체 형태로 사용될 수 있다. 국소용으로서는 연고, 크림 또는 스프레이와 같은 형태로 사용될 수 있다. 임의의 불활성 담체는 바람직하게 염수 또는 인산염-완충된 염수, 또는 본 발명의 방법에서 사용되는 화합물이 적합한 용해성을 가지는 임의의 담체이다.
세포에 국소적 투여를 위한 투여 방법은 형질전환, 전기영동, 세포의 미세주사, 또는 리포좀, 리포펙틴과 같은 비히클 내로 또는 DNA 또는 RNA 만으로 당업자에 공지된 임의의 방법일 수 있으나 이에 제한되지는 아니한다. 본 발명의 DNA는공지된 유전자 전달 시스템(예: 레트로바이러스 벡터(Gilboa(1982) J. Virology 44:845: Hocke(1986) Nature 320:275; Wilson 등 Proc Natl Acad Sci USA 85:3014), 백시니아 바이러스 시스템(Chakrabarty 등(1985) Mol. Cell Biol. 5:3403) 또는 당업자에게 공지된 기타 효과적인 DNA 전달 시스템(Yates 등(1985) Nature 313:812)에 의해 전달될 수 있다. 이들은 단지 예시적인 것이다. 비정상적으로 증식하는 세포 및 여분의 비-분열성 세포를 특정하게 운반하거나 형질감염시키기 위해, 당업자에게 공지된 레트로바이러스 운반 시스템을 사용하는 것이 바람직하다. 숙주 DNA 복제는 레트로바이러스 DNA가 삽입되기 위해 요구되고 레트로바이러스는 이의 생활 주기에 요구되는 레트로바이러스 유전자가 부족하기 때문에 자가 복제가 불가능할 것이므로 상기 레트로바이러스 운반 시스템을 사용하여 본 발명은 상기 항-증식성 요소를 비정상적으로 증식하는 세포에 표적화시키고 비분열성의 정상적인 세포를 임의의 간섭으로부터 배제시킬 것이다.
본 발명의 돌얼변이체 단백질을 임의의 생물학적으로 유효한 담체에 담아 투여한다. 생물학적으로 유효한 담체는 레트로바이러스, 리포좀, 및 세포의 게놈내로 외래 단백질을 삽입할 수 있는 임의의 기타 형질감염 기작을 포함할 수 있다. 상기 형질감염 기작은 당업계에 공지되어 있다. 담체는 또한 본 발명의 작제물이 양립할 수 있고 투여된 양에서 처리된 개체 또는 세포에 무독성인 임의의 제제 또는 용매를 포함한다.
처리되어야할 병리학적 세포 증식성 상태
본 발명의 방법이 치료적 이점을 제공하는 광범위하게 다양한 병리학적 암성및 비암성 세포 증식 상태가 존재한다. 이들 병리학적 상태는 비정상적인 세포 증식이 가능한 거의 모든 세포형에서 발생할 수 있다. 병리학적 또는 비정상적 성장을 보이는 세포형 중에는 (1)섬유아세포, (2)혈관 내피세포 및 (3)상피 세포가 있다. 본 발명의 방법이 개체의 모든 또는 거의 모든 기관 및 조직 시스템에서 국소적인 또는 산재된 병리학적 상태를 치료 하기에 유용함을 상기로부터 볼 수 있다.
예를 들어, 본 발명의 방법은 눈에서만도, 눈의 섬유증식성, 혈관증식성 및/또는 종양성 질병(예 : 미성숙의 망막증, 증식성 초자체망막증, 증식성 당뇨병성 망막증, 모세혈관종, 맥락막 혈관생성망, 망막하부 혈관생성망, 망막하부의 혈관생성, 각막 혈관생성으로 인한 노인성반부변성, 각막상부막 증식으로 인한 반점 주름, 핵 경화증으로 인한 성인 백내장, 외상 또는 수술에 따른 섬유 불성장, 시신경 교종, 망막혈관종증, 혈관생성성 녹내장, 해면 혈관종, 홍채 조홍, 경상 세포 증식성 망막증, 눈 수술 또는 상처 후의 내피세포 하부성장, 후속 백내장 막, 유두종, 지중해 빈혈에서 망막 혈관생성, 탄력성 위황색종으로 인한 망막하부 혈관생성 및 다발성 신경섬유종 형I 및 II, 망막아세포종, 포도막 흑피증, 및 안구공의 위종양)을 포함하나 이에 제한되지 아니하는 정상적인(양성의) 또는 악성의 세포 또는 조직의 비정상적인 증식으로 인한 광범위한 병리학적 질병 상태를 치료하기 위해 사용될 수 있다. 본 발명이 유용한 기타의 양성 세포 증식성 질병은 건선, 어린선, 유두종, 기저세포암, 편평세포암 및 스티븐-존슨 증후군을 포함하나 이에 제한되지 아니한다.
일반적으로, 본 발명은 Rb 유전자 및/또는 p53 유전자의 불활성화가 관련된암(예: 골육종, 연조직육종, 흑색종, 섬유육종, 망막아세포종, 유방, 방광, 경부, 폐, 결장, 난소, 신장, 췌장 및 전립선의 암종)을 포함한 모든 형태의 암에 적용가능하다.
pRb 및 p53 사이에 보존된 구조 결정 도메인의 발견
본 발명은 두 종양 억제 유전자 생성물, Rb 및 p53의 구조를 조절하는 보존된 상동성 구조 도메인을 기술함으로써, 이들 유전자의 돌연변이체의 창제 및 이의 사용을 위한 방법을 가능하게 한다. 그러므로 본 발명은 돌연변이된 성장 억제 유전자인 분리된 DNA 분자를 제공한다. 본 발명의 돌연변이된 성장 억제 유전자는 세포의 증식을 억제하는 임의의 유전자일 수 있다. 본 발명의 한 바람직한 실시양태에서 돌연변이된 성장 억제 유전자는 돌연변이된 Rb 유전자이다. 본 발명의 또 다른 바람직한 실시양태에서 돌연변이된 성장 억제 유전자는 돌연변이된 p53 유전자이다.
pRb 및 이의 세포 표적간의 상호작용을 이해하기 위한 시도에서, Rb 단백질의 다양한 친수성 부위에 대한 항체가 유도되었다. Rb 단백질의 상이한 부위가 상이한 단백질과 상호작용하기 때문에 얼마간의 항체가 상호작용으로 방해없이 Rb 단백질 및 이의 표적간의 단백질 복합체를 이루도록 하는 많은 상이한 부위에 대한 항체를 유도할 필요가 있었다. 다양한 친수성 도메인에 상응하는 서열을 갖는 합성 펩티드에 대해 생성된 폴리클로날 항-Rb 항체의 패널중 이들 둘(Rb1-Ab18 및 Rb1-Ab20)은 항상 Rb 단백질 뿐만 아니라 분자량 53kD의 단백질을 침강시킨다(제1A 도, 레인 1, 2, 8 및 9). 이들 두 항체는 동일한 합성 펩티드, p5에 대해 유도되는 것으로 입증되었다. 53kD 단백질은 p5에 대해 유도된 항혈청에 대해 특이적인 것으로 나타난다. 다른 부위에 대한 항혈청, 예를 들면 Rb1-Ab B(제1도, 레인 4-5) 및 Rb1-AbC(제1도, 레인 6-7)는 비록 이들이 여전히 Rb 단백질을 인식할 수 있더라도, 53kD 단백질을 면역침강시키지는 않았다. 상기 단백질 및 p53의 분자량의 유사성 때문에 이것이 p53 단백질 자체인 것으로 보인다. p53에 대한 모노클로날 항체인 Pab 122에 의한 세포주의 면역침강은 p53이 53kD 단백질의 분자량과 사실상 정확히 동일하다는 것을 나타냈다(레인 10). 또한, Pab122를 사용하여 p53을 세포 용균물로부터 우선 제거한 경우, Rb1-Ab18 및 Rb1-Ab20이 Rb 단백질을 침강시키더라도 이들중 어느것도 53kD 단백질을 면역 침강시킬 수 없었다(레인 11). 53kD 단백질이 사실상 p53이란 것을 입증하기 위해 내인성 p53 및/또는 Rb 단백질을 발현하지 않는 몇몇 세포주상에서 면역침강을 시켰다. 모든 경우에 (레인 12 내지 20) 항체는 사실상 이들 세포주에서 p53 유전자의 존재 또는 부재 상태와 일치하여 p53 단백질을 인식할 수 있다. 더욱이, p53의 면역침강이 Rb 단백질의 존재 또는 부재와는 독립적이라는 것은 복합체가 형성되지 않고 p53 단백질이 직접적으로 항체에 의해 인식된다는 것을 시사한다.
p53 단백질이 Rb 단백질과 공통의 항원 도메인을 공유하는지 알아보기 위하여 Rb 단백질의 P5 부위에 상응하는 p53 단백질의 아미노산 서열을 조사해보았다. 3차원적 구조 정보가 이들 두 단백질과 P5 펩티드 사이에 보유된 경우, p53 단백질 상에 상응하는 부위가 존재할 수 있다. 또한, 이러한 보존된 항원 도메인을 갖는 펩티드는 RB1-Ab18 또는 RB1-Ab20에 의한 p53의 면역침강을 차단해야 한다. Rb 및p53 단백질의 Rb-Ab18에 의한 면역침강(제2A도)은 다양한 양의 이들 펩티드의 존재하에 수행되었다. p53 펩티드중 하나인 F19는 시험된 것 중(제2A도: 레인 12-14) 최소 농도(10㎍/ml) 에서 Rb1-Ab18에 의한 p53의 면역침강을 완전 차단하였다. 이는 침강을 차단하는데 사용된 Rb 펩티드 p5 농도와 동일했다(레인 1 및 2). 반대로, 모든 다른 p53 펩티드는 사용된 농도의 50 내지 100배에서도 Rb-Ab18에 의한 p53의 면역침강을 차단시키지 못하였다(레인 3-11).
p5 및 F19 부위가 Rb와 p53 단백질 사이의 구조적 상동성을 보여주는 유일한 부위인 것은 아니다. 둘 이상의 다른 부위가 시각 및 컴퓨터 검색에 의해 확인되었다. 비교를 위해, Rb 및 p53의 상동성 부위를 표 I에 도시한다:
이들 부위가 짧게 존재하는 것으로 나타나긴 하지만, pRb 및 p53 사이에 상동성이 존재하는 아미노산은 p53에서 가장 진화적으로 보존된 아미노산이다(상이한 종에서의 Rb 서열에 대해서는 이용할 자료가 없다). 두 성장 억제 단백질 사이의 이와 같은 고도의 상동성은 이들 부위가 중요한 기능을 가질 수 있음을 시사한다. pRb 및 p53 상의 상동성 부위의 위치에 대한 개략도를 제2B도에 도시한다. p53의 경우, 세 개의 모든 부위는 단백질의 C-말단에 밀집하여 있고, pRb의 경우 P1 및 P3 부위는 N-말단의 중간에 밀집하여 있는 반면 P5 부위는 C-말단의 중간에 있다.그러나, p53 및 pRb 모두의 경우에, 이러한 세 부위는 단백질의 억제 작용에 중요한 것으로 알려져 있는 도메인의 외부에 모두 위치하고 있다. 이들 부위가 이의 억제 표적과의 물리적 상호작용과 무관하다면, 그들은 상호작용 과정의 조절과 관련될 것이다. 부당한 세포 성장을 억제하는데는 활성형 Rb 및 p53 단백질을 갖는 것이 중요한 것과, 마찬가지로 세포를 증식시킬 정도로 그들의 활성을 억제-조절하는 수단을 갖는 것이 중요하다. 보존된 도메인중의 이들 두 성장 억제 유전자 생성물의 존재로 그들의 조화된 조절을 보장할 수 있다. 실제로, 하기 도시된 바와 같이, 이러한 상동성 부위는 두 단백질의 구조를 결정하는 도메인을 형성하는 것처럼 보인다. 특히, 이들 세 부위중 어느 하나의 보존된 아미노산 잔기(상기 표 1에서 밑줄친 곳)에서의 돌연변이에 의한 이 도메인의 파괴는 두 단백질에 활성 구조를 부여했다. 대조적으로, 이러한 부위에서의 비보존된 아미노산의 돌연변이는 어떠한 영향도 나타내지 않는다.
P1, P3 및 P5 부위는 p53의 구조 및 DNA 결합 능력을 조절한다
p53이 전사를 활성화시키는 능력은 DNA에 결합하는 이의 능력과 밀접하게 관련되어 있다. 암세포주에서 발견된 돌연변이체 p53은 DNA에 결합할 수 없고 전사를 활성화시킬 수 없다. p53 단백질은 항체 Pab421의 존재시에 특정 DNA 서열에 결합할 수 있다. Pab421의 에피토프가 P3 부위와 중첩함이 정밀 검사로 밝혀졌다. Pab421에 의해 인식된 에피토프(제3도 참조)는 P3 부위중의 마지막 4개 아미노산 잔기이다. 항체(Pab421)로 이 전체 P3 부위를 차단하면 단백질의 구조를 충분히 변화시켜 p53 단백질이 특정 DNA 서열과 결합되도록 하는 것으로 나타난다. 따라서,DNA 결합 검정은 p53 단백질의 구조의 조절하에 P3 및 기타 상동성 부위 P1 및 P5의 역할을 시험하는 편리한 수단을 제공한다. 제3도에 도시된 바와 같이, 야생형 p53은 특정 DNA 서열과 결합할 수 없지만(레인 1), 항체 Pab421(레인 2)의 존재하에서는 결합한다. p53의 P1(레인 3), P3(레인 5 및 7) 또는 P5(레인 9) 부위의 보존된 아미노산을 돌연변이시킬 경우, 생성된 p53 돌연변이체 단백질은 Pab421의 부재하에서도 DNA와 결합할 수 있었다. 생성된 복합물은 Pab421(P1, P3 및 P5에 대해 각각 레인 4, 8 및 10)과 결합하여 초전좌되었다. 이러한 초전좌는 이들 돌연변이체중의 P3 부위가 여전히 항체와 결합할 수 있고, Pab421의 부재하에 돌연변이체가 DNA를 결합시키는 능력은 P3 부위의 돌연변이에 기인하지 않는다는 표시이다. 사실, 이들 C-말단 도메인 외부에서 항체 Pab1801의 결합은 또한 복합물을 초전좌시켰다. 레인 7 및 8에 사용된 돌연변이체는 P3 부위의 처음 4개 아미노산 잔기에서 돌연변이되어 있고, 이것은 단백질과 Pab421의 결합에 명백하게 영향을 미치지 않는다. 레인 5 및 6에 사용된 돌연변이체는 P3 부위중의 보존된 마지막 4개 아미노산 잔기에서 돌연변이되어 있고, 이것은 단백질과 Pab421의 결합을 소멸시켰다. 비보존된 아미노산에서의 돌연변이는 어떠한 영향도 미치지 않으며, 그 단백질은 야생형과 본질적으로 유사하게 행동했다. 따라서, 돌연변이체 p53 단백질의 구조는 돌연변이에 의해 상동성 부위가 파괴될 경우, 활성 형태로 전환된다.
상동성 부위에서 돌연변이된 Rb 단백질의 인산화 조절의 변경
pRb 단백질의 활성 구조와 비활성 구조를 구별하는 몇가지 방법이 있다. 활성 Rb 단백질은 탈인산화되며, 세포의 성장을 억제할 수 있다. 불활성 Rb 단백질은완전히 인산화된다. 상동성 도메인이 pRb의 활성 및 불활성 구조에 영향을 미치는 경우, P1, P3, P5 부위에서의 돌연변이가 pRb 단백질이 세포 성장 및 이의 인산화를 억제하는 능력에 영향을 줄 것이다. pRb의 P1, P3 및 P5 부위를 보존된 아미노산 잔기에서 별도로 돌연변이시키고, 세포 성장을 억제하는 돌연변이체의 능력을 측정했다. 모든 돌연변이체는 형질 감염된 세포의 성장을 억제시킬 수 있었다. P5 부위의 보존된 아미노산 잔기에서 돌연변이시킨 Rb 돌연변이체 m89-0가 정상 세포 및 암세포의 성장을 억제시키는 능력을 하기 두개의 실시예에서 제공한다. pRb의 활성은 인산화에 의해 조절되기 때문에, 보존된 부위가 불활성 구조로 pRb를 유지시키기 위해 존재할 경우, P5 부위의 돌연변이는 단백질이 활성적이도록 돌연변이체 pRb의 인산화에 대한 억제 효과를 가질 것이다. RB-1의 두 대립유전자의 돌연변이로 인해 pRb의 발현이 결여된 세포주가 있으며, 이러한 세포주는 그들에게 형질 감염된 Rb 유전자의 억제 효과에 대한 내성을 부여하는 다른 돌연변이를 또한 유도했다. 경부암 세포주 C33A 및 Saos-2의 아집단이 두개의 그러한 세포주이다. 따라서, 이들 세포주는 돌연변이 단백질이 발현되고 세포가 생존할 수 있게 하며, 인산화 상태를 검사하기 위한 다량의 단백질을 추출할 수 있게 한다. 따라서, P5 영역의 보존된 아미노산 잔기에서 돌연변이된 P5 돌연변이체 Huβ AcPr-1-n대-P5C를 상기 세포에 형질감염시키고, 단일 세포 정제에 의해 안정한 세포주를 수득했다. 정제된 돌연변이형 세포주 Saos-2#89로부터 분리한 돌연변이형 pRb의 인산화 패턴을 야생형 Rb로 형질 감염되고 정제된 세포주 Saos-2#84로부터 추출한 야생형 pRb의 인산화 패턴과 비교했다. S기의 Saos-2#84 (야생형) 및 Saos-2#89(돌연변이형)로부터의 pRb의 면역 침강은 야생형 pRb가 현저히 인산화된 반면에 돌연변이형 pRb가 비인산화되었음을 나타냈다. 이것은 세포가 S기에 있을 때 조차 P5 돌연변이형 pRb가 활성 구조로 유지됨을 시사한다. 따라서, P5 돌연변이형은 특정한 부위에서 인산화에 내성이 있는 구조로 추정된다. 또한, 상기 단백질이 다른 기능적으로 중요하지 않은 부위에서는 여전히 인산화되어 있음에 주목하여야 할 것이다.
SDS-PAGE에 의한 1차원적 분석은 상기 단백질이 비인산화됨을 밝혀주었으나 비인산화의 성질에 대해서는 밝혀주지 못하였기 때문에, 두 개의 상이한 프로테아제(트립신 및 키모트립신)를 사용한32P 표지된 pRb의 2차원적 포스포펩티드 분석을 수행했다. 2-D 지도의 비교는 야생형과 비교하여 돌연변이형에서 일정하게 비인산화되어 있는 두 부위(S10a 및 S10b)가 존재함을 보여주었다(제4A도). 인산화 패턴에서의 차이점이 생체내 효소 특이성에서의 변화보다는 단백질의 구조에서의 본래적 차이에 기인함을 보여주기 위해, 단백질의 시험관내 인산화 패턴을 비교했다. 야생형 및 돌연변이형 pRb는 사이클린 관련된 키나제로 이루어진 키나제 제제를 사용하여 인산화시켰다. 시험관내 표지는 인산화를 차단시킨 키나제에 대한 항체로 사이클린 관련된 키나제에 따라 달라진다. 시험관내에서 인산화된 pRb를 2-D 펩티드 유전자 지도작성에 의해 분석하였는데, 제4B도에 도시된 바와 같이, 동일한 인산화 부위가 돌연변이형에서 사용되지 않았다. 따라서, 다량의 효소의 공급 및 야생형 pRB가 완전히 인산화되는 최적의 인산화 조건에서 조차, 돌연변이형 pRb는 인산화 부위 S10a 및 S10b에 대해 완전한 내성이 있었다. 따라서, S10a 및 S10b의 인산화에서의 변이는 생체내 효소 특이성에서의 변이보다는 야생형 및 돌연변이형 단백질의 구조에서의 본래적 차이에 기인한 것이다.
상동성 부위에서 돌연변이된 Rb 단백질이 활성 형태임을 나타내는 증거
(A) S10a 및 S10b에서의 인산화와 pRb의 활성의 상관관계
하기 제시된 데이터는 S10a 및 S10b에서의 인산화의 변이가 SV40 큰 T 항원을 결합시키는 pRb의 능력과 상관됨을 입증하여 준다. 시험관내 인산화 연구의 경우, 폴리헤드린 유전자가 Rb 유전자로 부분적으로 치환되어 있는 재조합 Rb-바큘로바이러스로 감염시킨 sf9 세포로부터 Rb 단백질을 분리했다. 높은 감염 적정 조건하에, 추출된 대부분의 Rb 단백질이 인산화에 의해 SV40 큰 T 항원과 결합할 수 없게 되더라도, 잔류하는 소량의 Rb 단백질이 큰 T 항원과 결합함에 주목해야 한다. 이 결합은 제5도에 도시되어 있다. 시험관내에서 상응하는 바큘로바이러스로 감염시키고 키나제 처리된 S35표지된 SF9 세포로부터 Rb 단백질 및 SV 40 큰 T 항원을 수득했다. 레인 1은 추출된 Rb 단백질이 비인산화된 형태 뿐만 아니라 과인산화된 형태로 이루어졌고, Rb 단백질중 일부가 큰 T 항원과 결합했음을 보여준다. 큰 T 항원은 비인산화된 형태의 Rb 단백질(레인 2 및 레인 3)만을 결합시킬 수 있었다. 상이한 양의 Rb 키나제(레인 3 내지 6)를 사용한 이 큰 T 항원:Rb 복합물의 인산화는 큰 T 항원으로부터 다량의 Rb 단백질을 방출했다. 이러한 형태의 RB 단백질을 RB-E(E=노출된 주요 부위)라 명명할 수 있다. 그러나, 약 20% 내지 30%의 Rb 단백질(RB-H라 명명함)(H는 잠재성 주요 부위)은 큰 T 항원과 단단하게 결합되어 있었고, 항-큰 T 항체에 의해 전체 복합물이 침강될 수 있었다. 가장 중요하게는, 증가량의 Rb 키나제가 이의 가장 느린 이동 형태(레인 4 내지 6과 레인 8 내지 10의 비교)로 Rb 단백질을 인산화시킬 수 있더라도, 과인산화된 Rb 단백질은 큰 T 항원과 결합한채로 유지되었다. 이들 Rb 단백질의 침강이 단백질 A 아가로즈에 대한 비특이적 흡수에 기인하지 않음이 레인 6을 레인 2와 비교함으로서 알 수 있다. Rb 단백질의 약 70%가 큰 T 항원으로부터 방출되었다. 방출된 이 Rb 단백질이 단백질의 비특이적 분해에 기인하지 않음은 반응을 항-Rb 항체로 침강시킬 경우, 모든 Rb 단백질을 밝혀낼 수 있다는 사실(레인 8, 9 및 10에 도시된 바와 같음)로서 알 수 있다. 또한, 다양한 형태의 Rb 단백질이 큰 T 항원과 결합하는 능력은 레인 8, 9 및 10에 도시되어 있으며, Rb 단백질에 의해 더욱 소량의 큰 T 항원이 침강되었다.
이러한 결과는 Rb 단백질상의 두 부류의 인산화 부위의 존재와 일치하며, 하나는 큰 T 항원과 결합할 수 없도록 Rb 단백질의 불활성화에 중요한 반면에, 나머지는 결합에 영향을 주지 않으면서 인산화될 수 있다. Rb 키나제 복합물의 경우, 17개의 잠재적 인산화 부위(S/TPXX)가 존재한다. 인산화 부위가 Rb 단백질의 불활성화에 중요함을 입증하기 위해, SV40 큰 T와 결합한 채로 남아 있는 Rb 단백질(RB-H) 및 인산화 후 SV40 큰 T로부터 유리된 Rb단백질(RB-E)에 대해 2-D 유전자 지도작성 분석을 수행했다. 큰 T 항원으로부터 Rb가 분리되는 것이 인산화의 결과인 경우, 이들 두 형태의 Rb 단백질 사이에는 인산화 부위에서의 차이가 존재해야 한다. 제6도에 도시된 바와 같이, 큰 T 단백질과 결합한 채로 남아 있는 pRb에서 S10a 및 S10b가 인산화되지 않은 것으로 밝혀졌다.
P5 부위에 존재하는 보존된 아미노산의 돌연변이는 단백질을 활성 구조로 만든다. S10a 및 S10b에서의 인산화는 세포 사이클의 기능이고, 세포가 증식하는 능력과 상호 관련된다.
(B) pRb의 S10a 및 S10b에서의 인산화와 세포 성장 조건과의 상관 관계
하기 제공된 데이터는 S10a 및 S10b에서의 인산화의 돌연변이가 세포사이클 의존적 방식으로 조절됨을 입증한다.
정상 세포 또는 암종 세포를 TGFβ에 노출하면 성장 억제가 빈번히 유도된다는 것은 공지되어 있다. 세포 성장의 억제에서 pRb의 역할은 상기 기술되어 있다. pRb의 인산화에 미치는 TGFβ의 역할을 이해하기 위해, TGFβ로 처리하여 성장을 억제시킬 수 있는 유방암 세포주 MDAMB231을 사용했다. 세포의 증식 상태를3H-티미딘 흡수에 의해 모니터하고,32P 표지된 pRb의 인산화 패턴을 2-D 펩티드 지도작성으로 분석했다. 중요하게도, TGFβ에 의해 성장이 억제된 세포로부터의 pRb는 S10a및 S10b에서 인산화되지 않았다(제7도). 그러나, 세포가 TGFβ로부터 방출된 경우, S10a 및 S10b는 다시 인산화되었다. 따라서, 성장 억제된 세포에서 활성적인 pRb 단백질은 S10a 및 S10b에서 인산화되지 않았다. 이러한 가역적 인산화가 TGFβ의 성장 억제 효과에만 특이적이지 않음은 S10a 및 S10b의 유사한 인산화 패턴이 혈청의 결핍에 의해 성장 억제된 세포로부터 분리된 pRb에서도 발견된다는 사실로부터 알 수 있다. 혈청이나 성장 인자를 재공급하면, S10a 및 S10b는 다시 한번 인산화되었다. 또한, S10a 및 S10b는 레틴산에 의해 세포 성장이 억제된 세포로부터 분리한 pRb에서는 인산화되지 않았다. 따라서, pRb 단백질에서 기능상 중요한 S10a 및 S10b 부위는 상이한 성장 조건하에 가역적 인산화를 수행할 수 있다.
Rb 유전자 및 p53 유전자의 돌연변이체
따라서, pRb 및 p53 모두의 경우, 상동성 부위의 돌연변이는 이들을 활성화시키는 구조를 갖는 단백질을 발생시켰다. Rb 및 p53의 구조적 활성 돌연변이체의 예 및 세포 성장의 억제에서의 이들의 용도는 하기 제시되어 있다. Rb 단백질의 경우, 두 부류의 돌연변이체, (1) 조절 또는 상동성 부위에서의 돌연변이체, 및 (2) 인산화 부위에서의 돌연변이체가 기술되어 있다. p53 단백질의 경우, 상동성 부위의 돌연변이체가 기술되어 있다.
Rb 유전자의 돌연변이체
과인산화된 Rb 단백질의 포스포아미노산 분석은 아미노산 세린 및 트레오닌이 인산화되어 있음을 나타냈다. Rb 단백질에는 79세린 및 55트레오닌 잔기가 존재한다. 이들 가운데, 17개는 cdc2 키나제에 대한 잠재성 인산화 부위인 모티브(S/TPXX)에서 발견된다. cdc2 키나제 및 관련된 키나제는 Rb 단백질을 인산화시킬 수 있는 것으로 알려져 있다.
Rb 단백질 상에는 두 부류의 인산화 부위가 존재하는 것으로 나타나며, 하나는 큰 T와 결합할 수 없도록 Rb 단백질의 불활성화에 중요한 반면, 다른 하나는 결합에 영향을 미치지 않으면서 인산화될 수 있다. Rb 키나제 복합물에 대한 17개 이상의 잠재성 인산화 부위(S/TPXX)가 존재하기 때문에, 일부는 Rb 단백질의 불활성화에 중요할 수 있다. 이들 17개 인산화 부위는 T005, S230, S249, T252, T356,T373, S567, S608, S612, T773, S780, S788, S795, S807, S811, T821, T826이다. 여기서, T 및 S는 각각 트레오닌 및 세린을 의미하며, 번호는 Rb 단백질에서 아미노산의 잔기 번호를 의미한다.
돌연변이된 망막아세포종 유전자는 바람직하게는 두가지 상이한 방법 가운데 하나에 의해 돌연변이되며, 이들 모두는 Rb 단백질이 인산화되는 능력에 영향을 미친다. 첫째, Rb 단백질의 보존된 상동성 부위중의 아미노산을 변화시켜 유전자를 돌연변이화할 수 있다. 바람직하게는, Rb 단백질의 보존된 상동성 부위는 본원에 기술된 바와 같이 P1, P3 및 P5로 이루어진 그룹중에서 선택된다. 돌연변이 Rb 단백질을 암호화하는 돌연변이 Rb 유전자의 대표적인 예는 서열확인 번호 1 및 2에 제시되어 있다. 단백질의 인산화에 대한 보존된 상동성 부위의 중요성을 알고 있는 본 분야의 통상의 기술을 가진 전문가는 기타 바람직한 돌연변이 Rb 단백질을 암호화하는 기타 돌연변이 Rb 유전자를 용이하게 작제할 수 있을 것이다.
인산화를 예방하여 Rb 단백질의 불활성화를 예방하는 두 번째 방법은 인산화 부위중의 아미노산을 변화시켜 상기 유전자를 돌연변이시키는 것이다. 바람직하게는, 인산화 부위는 T005, S230, S249, T252, T373, S567, S608, S612, T773, S780, S788, S795, S807, S811, T821 및 T826이다. 상기 인산화 부위의 약자에서, S는 세린이고, T는 트레오닌이며, 번호는 Rb 단백질의 서열중에서 아미노산의 위치를 의미한다. 본원에 기술된 인산화 돌연변이의 경우, 각각의 트레오닌 또는 세린 잔기는 각각의 플라스미드에서 알라닌으로 돌연변이되었다. 상기 언급한 바와 같이, 두 부류 이상의 인산화 부위가 존재하며, 이중 하나는 pRb의 불활성화에 작용상 중요하다. 따라서, 상기 작제된 하나 이상의 돌연변이체는 돌연변이체 pRb의 인산화를 억제하여 이의 불활성화를 예방해야 한다.
본 발명의 다른 양태로서, 돌연변이 Rb 단백질을 암호화하는 DNA를 포함하는 플라스미드를 또한 제공한다. 또한, 서열 확인 번호 1의 돌연변이 Rb 단백질을 암호화하는 DNA를 포함하는 재조합 세포에서의 발현에 적합한 플라스미드 및 세포에서 cDNA의 발현에 중요한 조절 요소 및 서열확인 번호 2의 돌연변이 Rb 단백질을 암호화하는 DNA를 포함하는 재조합 세포에서의 발현에 적합한 플라스미드 및 세포에서 cDNA의 발현에 필요한 조절 요소를 제공한다.
p53 유전자의 돌연변이체
본 발명의 또다른 양태로서, 돌연변이된 성장 억제 유전자는 돌연변이된 p53 유전자이다. 바람직하게는, p53 유전자의 보존된 상동성 부위중의 아미노산을 변화시켜 p53 유전자를 돌연변이시킨다(상기 표 1에서 밑줄친 부분). 유사하게는, p53 유전자의 보존된 상동성 부위는 P1, P3 및 P5로 이루어진 그룹중에서 선택된다. 돌연변이체는 P1, P3 또는 P5에서의 돌연변이체 단독으로 또는 임의의 조합(세 부위 모두의 돌연변이체를 포함)으로 구성될 수 있다. 또한, C-말단 아미노산 잔기 295 내지 393이 결실되어 있는 돌연변이체는 특이적 DNA 서열과의 결합에서 여전히 활성적이었다.
세포 성장 억제를 위한 pRb 및 p53 돌연변이체의 용도
또한, 본 발명은 신규한 형질 감염된 세포, 예를 들면 돌연변이된 Rb 단백질을 암호화하는 특허청구범위 제1항의 분리된 DNA 분자를 포함하는 형질감염된 세포에 관한 것이다. 또한, 본 발명은 돌연변이 Rb 단백질을 암호화하는 돌연변이체 Rb 유전자를 발현시키는 안정하게 형질감염된 세포를 제공한다. 바람직하게는, 본 발명의 형질감염된 세포는 서열확인 번호 1 또는 서열확인 번호 2에 제시된 돌연변이된 Rb 단백질을 암호화하는 핵산 서열을 포함하는 돌연변이된 Rb 유전자를 함유한다. 또한, 본 발명은 돌연변이 p53 단백질을 암호화하는 돌연변이 p53 유전자를 발현시키는 안정하게 형질감염된 세포를 제공한다.
또한, 본 발명은 돌연변이된 성장 억제 유전자의 DNA 분자를 비암성 증식 세포에 투여하여 병리학적 세포 증식성 질환을 치료하는 방법을 제공한다. 하나의 양태로서, 투여된 분자는 돌연변이 Rb 또는 p53 유전자이다. 유전자는 Rb 유전자의 보존된 상동성 부위중의 아미노산을 변화시켜 돌연변이시키거나 인산화 부위중의 아미노산을 변화시켜 상기 유전자를 돌연변이시킨다. 보존된 상동성 부위 및 인산화 부위는 상기 기술된 바와 같다.
일반적으로, 본 발명의 방법은 모든 세포 증식성 질환의 치료에 사용할 수 있다. 비암성 세포 증식성 질환의 대표적인 예에는 건선, 양성 증식성 피부 질환, 어린선, 유두종, 기저세포암, 편평상피세포암, 섬유증식성 질환, 혈관증식성 질환 및 피부증식성 질환이 포함된다.
또한, 본 발명은 돌연변이된 Rb 또는 p53 유전자의 DNA 분자를 증식성 암세포에 투여하여 개체의 악성 세포 질환을 치료하는 방법을 제공한다. 이러한 돌연변이 유전자는 상기한 바와 같다.
일반적으로, 악성 세포 질환을 치료하는 방법은 비암성 세포 증식성 질환의치료 방법과 유사하다. 증식성 암세포에 의해 유발되는 질환의 대표적인 예에는 골수암종, 섬유육종, 망막아세포종, 유방암, 방광암, 경부암, 폐암, 결장암, 난소암, 신장암, 췌장암 및 전립선암이 포함되며, 이로써 한정되는 것은 아니다.
본 발명의 방법에 따라, 돌연변이체 Rb 또는 p53 단백질의 도입에 의해 세포 증식 방법을 조절하여 다양한 세포 증식성 질환에서 비정상적인 증식을 예방 또는 억제할 수 있다. 증식 방법의 조절은 돌연변이체 Rb 또는 p53 단백질 요소를 암호화하는 DNA 작제물을 표적 증식성 세포내로 도입하여 달성할 수 있다.
또한, 본 발명은 돌연변이된 Rb 또는 p53 유전자를 증식성 세포에 투여하여 병소 세포 증식성 질환을 치료하는 방법을 제공한다. 일반적으로, 증식성 세포는 눈의 섬유증식성, 혈관증식성 및 종양성 질환과 같은 대표적인 절환을 유발할 수 있다.
또다른 양태로서, Rb 유전자의 인산화 부위를 세포내로 도입하기 전에 돌연변이화시킨다. Rb 단백질상에는 17개의 잠재성 인산화 부위가 존재한다. 따라서, Rb cDNA 중의 세린 또는 트레오닌 암호서열의 알라닌 또는 발린 등으로의 돌연변이는 인산화에 의해 불활성화시킬 수 없는 영구적인 활성 Rb 단백질의 생성을 유도한다. 즉, 숙주 세포는 인산화에 의해 Rb 단백질을 불활성화시킬 수 없다. 세포내로 그러한 돌연변이 Rb 유전자의 도입은 성장 억제를 유도한다. 이들 모든 돌연변이체는 사람 β-악틴 프로모터 벡터내에서 서브클로닝시킨다. Rb cDNA의 서브클로닝을 위해, 전체 오픈 리딩 프레임을 5' 말단에 BamHI 부위 CGGATCCGCGTC를 함유하는 합성 링커 및 3' 말단에 AATAAA 및 BamHI 부위를 함유하는 합성 링커와 연결시킨다.생성된 BamHI 단편을 선택된 정방향으로 벡터 및 클론의 BamHI 부위내로 서브클로닝시킨다.
실시예 1
P5 돌연변이체 m89-O 및 m88-O의 제조
m89-O 돌연변이체를 제조하기 위해, 돌연변이시키고자 하는 'P5' 부위를 함유하는 한쌍의 DNA 올리고뉴클레오티드 프라이머(Pm1 및 QM1) 및 'P5' 부위에 접하는 한쌍의 올리고뉴클레오티드(P3 및 Q3)를 제작자의 지시에 따라 AB1 PCR-메이트 올리고뉴클레오티드 합성기를 사용하여 합성했다. 주형으로서 야생형 Rb cDNA를 사용하여, 폴리머라제 연쇄 반응(PCR)을 프라이머 P3 및 Qm1으로 40 사이클 수행했다. 제2 튜브에서, 40 사이클의 폴리머라제 연쇄 반응을 프라이머 Pm1 및 Q3으로 수행했다. 완전히 반응시킨 후, 제1 튜브로부터 소량의 반응 생성물을 취하고, 과량의 P3 프라이머의 존재하에 80 사이클의 PCR을 수행했다. 유사하게, 제2 튜브에서 과량의 Q3 프라이머의 존재하에 80 사이클의 PCR을 수행했다. 이어서, 이들 두 튜브로부터의 뚜렷한 일본쇄 반응 생성물을 합하고, 20 사이클동안 프라이머를 연장시킨다. 돌연변이된 P5 부위를 함유하는 생성된 이본쇄 생성물을 Mlu 1 및 Hind 3 부위에서 Rb 발현 플라스미드 HuBAcpr-1-neo-PQ(m89-0)내로 서브클로닝시켰다. 생성된 플라스미드는 돌연변이된 아미노산(밑줄)과 함께 돌연변이된 P5 부위를 포함한다. K870 및 H890은 각각 Rb 단백질의 870 위치 및 890 위치에 존재하는 리신및 히스티딘 아미노산 잔기를 의미한다. m88-0를 유사한 방법으로 제조했다.
실시예 2
형질감염된 플라스미드가 사람 섬유아세포주에 미치는 영향
세포 성장에 대한 Rb cDNA의 영향은 돌연변이체 m89-0를 정상의 사람 섬유아세포주 WS1내에 형질감염시킴으로서 알 수 있었다. SV40 큰 T 항원의 유전자를 형질감염의 조절자로서 사용했다. 이어서, SV40 큰 T 항원의 유전자 및 네오마이신 내성 유전자를 함유하는 플라스미드, pPVUO-Neo를 형질감염시켜 형질감염의 효율을 모니터했다. 또한, 불활성 돌연변이체 형태의 Rb 유전자, "HuBAcpr-1-neo-P16"을 대조군으로서 사용했다. 형질감염을 위해, 각각의 플라스미드 DNA 100㎍을 일렉트로포레이션 챔버 유닛 Cell-PoratorTM(BRL)내에서 RPM1 1640 배지(Gibco) 및 10% FCS의 최종 용적 0.8mℓ로 107개의 지수적으로 성장된 WS1 세포와 혼합했다. 일렉트로포레이션은 200 볼트 및 1180uF에서 행했다. 일렉트로포레이션된 세포를 실온에서 10분 동안 회복시킨 다음, RPM1 1640 및 10% 송아지 태아 혈청(FCS)중에 희석하고, 2x 104개 세포/㎠의 세포밀도로 60mm 디쉬에 플레이팅했다. 동일한 배지에서 2일 동안 세포를 부착 및 배양했다. 그 후, 배지를 RPM1 1640 + 10%FCS + 15㎍/mℓG418(Gibco)로 대체했다. 토끼 폴리클로날 항-Rb 단백질 항체 RB1-ABA1(제8A도) 또는 마우스 모노클로날 항-SV40 큰 T 항원 항체 Pab 101(제8B도)를 사용하여 3일마다 조직면역학적 염색을 위해 2개씩의 디쉬를 취했다. 제8A도에서 볼 수 있는 바와 같이, 형질감염되고 G418 배지에서 선택된 후 13일 경과하여, 형질감염된 Rb cDNA 플라스미드 m89-0를 발현하는 WS1 세포는 항-Rb 단백질 항체로 강하게 염색되었다. 그러나, Rb 단백질을 발현하는 세포는 단일 세포로 잔류하며, 분열하지 않았다. 이와 대조적으로, 제8B도에 도시된 바와 같이, 형질감염된 SV40 큰 T 항원(SVLT)을 발현하는 세포는 마우스 항 SVLT 항체로 양성적으로 염색된 세포의 그룹에 의해 나타난 바와 같이 계속 분열하여 콜로니를 형성했다. 따라서, 세포에서 m89-0 Rb cDNA를 과발현시키면, 정상 세포 WS1의 세포 성장을 완전히 억제했다. 불활성 형태의 Rb Huβ Acpr-1-neo-P16으로 형질감염된 세포는 억제되지 않고 분열하여 콜로니를 형성했다.
실시예 3
형질감염된 플라스미드가 사람 방광암 세포주 TCCSUP에 미치는 영향
상기 기술된 방법과 동일한 방법을 사용하여 내인성 Rb 단백질을 포함하지 않는 사람 방광암종 세포 TCCSUP내로 돌연변이체 m89-0 및 Huβ cpr-1-neo-P16 플라스미드를 형질감염시켰다. 사용된 플라스미드, 형질감염 및 면역염색에 대한 방법은 상술된 방법과 동일하다.
제9A도에서 볼 수 있는 바와 같이, 형질감염된 m89-0 cDNA를 발현하는 세포는 분열하지 않았다. 이와 대조적으로, 형질감염된 Huβ cpr-1-neo-P16을 발현하는세포는 분열하여 콜로니를 형성했다(제9B도). m89-0 Rb cDNA의 과발현은 시험관내에서 종양세포가 성장하는 것을 현저히 지연시켰다.
실시예 4
Rb 및 p53 간에 상동성인 부위에서의 돌연변이체 이외에도 p53 단백질이 돌연변이되었다. 표 II는 야생형 p53과 제조된 보존된 아미노산 돌연변이체의 부분적인 아미노산 서열을 수록한 것이다. 또한, 표 II는 돌연변이체 아미노산 서열에 상응하는 DNA 서열을 수록한 것이다. 돌연변이체를 제조하기 위해, 두 개의 프라이머를 합성하여 함께 어닐링시켰다. PCR은 상기 기술된 바와 같이 수행했다. 상기 나타낸 바와 같이, 변이 P1, P3 및 P5 부위는 표적 DNA 서열과 직접적으로 결합할 수 있도록 p53 단백질의 구조 변화를 유도했다.
표 II
실시예 5
돌연변이체 Rb 유전자를 함유하는 재조합 레트로바이러스의 제조
돌연변이체 Rb#89의 전체 암호 부위를 함유하는 HindIII/BamHI 단편을 레트로바이러스 벡터중의 HindIII/BgIII 부위내로 서브클로닝시켰다. 생성된 플라스미드 벡터를 세포주 Psi-2로 형질감염시킨다. 형질감염된 세포의 배양에 사용된 배지는 또다른 세포주 PA317로 감염시킨다. 재조합 바이러스를 생성하는 세포를 G418에서 선택하고, 배지로부터 수거한 레트로바이러스를 수크로즈 구배로 농축 및 정제한다. 동일한 방법으로 p53 유전자의 돌연변이체를 시험한다.
실시예 6
G1NaSvRb89 바이러스가 눈에서의 세포증식에 미치는 영향
토끼 섬유아세포의 주입 및 국소 창상의 유도에 의해 실험적 증식성 유리체 망막증(Proliferative Vitreous Retinopathy; PVR)을 유도한다. 이 방법은 가장자리에서 창상을 유도하고, 전신 마취하에 유리체내로 2x105개의 토끼 섬유아세포를 2회 주입하는 것이다. 방법 수행후, 토끼에게 항생물질을 함유하는 국소 연고를 발라준다.
돌연변이된 Rb 또는 p53 유전자를 가진 재조합 레트로바이러스를 전신 마취하에 동물의 유리체(2x105개의 세포/토끼)내에 주입한다. 초기에, 바이러스의 최대 용량(사용될 바이러스의 농도 및 주입 바이러스의 용적)을 분석하여 바이러스의 국소 내독성을 시험한다. 이미, 레티노바이러스는 마우스 망막하부의 주입용으로 사용되어 왔으며, 어떠한 부작용도 보고되지 않았다[참조: Turner and Cepko, Nature 328:132, 1987]. 부작용을 유발하지 않는 최대 용량을 이후의 모든 처리에 사용할것이다.
포토그래피에 의해 생체 내에서의 세포 성장을 모니터한다. 1-갈락토시다제 유전자를 함유하는 레티노바이러스만을 주입할 때의 대조군과 망막 박리의 정도를 비교한다. 또한, 브로모데옥시우리딘으로 유리체 내부를 표지하여 생체 내 세포성장을 모니터한다. 안락사 1시간 전에, 토끼에게 50mg/kg BrdU를 정맥내 투여하여 증식성 세포를 표지한다. 안락사시킨 후, BrdU에 대한 항체로 면역염색하여 DNA내로의 BrdU 삽입에 대해 세포를 분석한다. 동시에, Rb 또는 p53 단백질 또는 1-갈락토시다제 단백질에 대한 항체를 사용한 세포의 면역염색을 수행하여 감염의 효율을 분석한다.
PVR의 유도 후 여러가지 시간에서 바이러스를 주입하여 레트로바이러스가 주입된 세포의 성장을 억제하는 최적 시간을 분석한다. 또한, 토끼 섬유아 세포에서 유리체가 감염 효율에 미치는 영향을 검사한다. 또한, 토끼 섬유아세포에의 이들 바이러스 첨가에 대한 시간 지연을 검사한다. 섬유아세포 성장 인자로 자극하여 성장 속도를 증가시킨 토끼 섬유아세포에의 이들 바이러스 첨가에 대한 시간 지연을 또한 검사한다.
본 명세서에서 언급된 모든 특허 및 공보는 본 발명과 관련되어 있는 기술 분야의 통상의 지식을 가진 자의 수준을 나타낸다. 참조로서 삽입된 각각의 공보를 특정적 및 개별적으로 나타냈을지라도, 모든 특허 및 공보를 유사하게 본원에 참조로서 삽입한다.
본 기술 분야의 전문가는 본 발명이 본원에 고유한 것들 뿐만 아니라 본 발명의 목적을 수행하고 언급된 결과 및 잇점을 달성하기 위해 잘 적합화 됨을 용이하게 알 수 있을 것이다. 본원에 기술된 방법, 공정, 처리, 분자 및 특정 화합물과 함께 본 실시예들은 현재의 바람직한 양태를 나타낸 것이며, 본 발명의 범주를 제한하고자 한 것은 아니다. 본원의 변화 및 기타 용도가 특허청구의 범위에서 정의된 바와 같이 본 발명의 범위내에 포함됨은 본 기술 분야의 통상의 지식을 가진자에게 명백할 것이다.
Claims (29)
- 돌연변이된 기능적으로 활성형의 망막아세포종(retinoblastoma) 단백질을 암호화하고, P1 부위(아미노산 184-192), P3 부위(아미노산 245-262) 및 P5 부위(아미노산 873-886)로 이루어지는 그룹으로부터 선택되는 Rb 단백질의 보존된 상동성 부위내의 아미노산을 암호화하는 뉴클레오타이드를 변화시킴으로써 돌연변이된 합성 Rb 유전자인 분리된 DNA 분자.
- 제1항에 있어서, 유전자가 서열확인 번호 1 및 2에 제시된 서열로 이루어지는 그룹으로부터 선택되는 아미노산 서열을 암호화하는 DNA 분자.
- 돌연변이된 기능적으로 활성형의 망막아세포종 단백질을 암호화하고, T005, S230, S249, T252, T373, S567, S608, S612, T773, S780, S788, S795, S807, S811, T821 및 T826으로 이루어지는 그룹으로부터 선택되는 Rb 단백질의 인산화 위치내의 아미노산을 암호화하는 뉴클레오타이드 서열을 변화시킴으로써 돌연변이된 합성 Rb 유전자인 분리된 DNA 분자.
- 돌연변이된 기능적으로 활성형의 p53 단백질을 암호화하고, P1 부위(아미노산 343-351), P3 부위(아미노산 372-380) 및 P5 부위(아미노산 381-393)로 이루어지는 그룹으로부터 선택되는 p53 단백질의 보존된 상동성 부위내의 아미노산을 암호화하는 뉴클레오타이드 서열을 변화시킴으로써 돌연변이된 합성 p53 유전자인 분리된 DNA 분자.
- 제1항의 DNA를 포함하는 플라스미드.
- 제4항의 DNA를 포함하는 플라스미드.
- 제5항에 있어서, 암호화 cDNA 및 세포에서 cDNA의 발현을 위해 필요한 조절 요소를 포함하는, 재조합 세포내에서의 발현을 위해 개작된 플라스미드.
- 제6항에 있어서, 암호화 cDNA 및 세포에서 cDNA의 발현을 위해 필요한 조절 요소를 포함하는, 재조합 세포내에서의 발현을 위해 개작된 플라스미드.
- 제1항의 DNA 분자를 포함하는, 건선, 양성 증식성 피부 질환, 어린선, 유두종, 기저세포암, 편평상피세포암, 섬유증식성 질환, 혈관증식성 질환 및 피부증식성 질환으로 이루어지는 그룹으로부터 선택되는 병리학적 세포 증식성 질환의 치료를 위한 약제학적 조성물.
- 제9항에 있어서, DNA 분자가 돌연변이된 Rb 유전자인 약제학적 조성물.
- 제10항에 있어서, 유전자가 P1 부위(아미노산 184-192), P3 부위(아미노산 245-262) 및 P5 부위(아미노산 873-886)로 이루어지는 그룹으로부터 선택되는 Rb 단백질의 보존된 상동성 부위내의 아미노산을 암호화하는 뉴클레오타이드 서열을 변화시킴으로써 돌연변이된 약제학적 조성물.
- 제9항에 있어서, 유전자가 서열확인 번호 1 및 2에 제시된 서열로부터 선택되는 아미노산 서열을 암호화하는 약제학적 조성물.
- 제9항에 있어서, 유전자가 T005, S230, S249, T252, T373, S567, S608, S612, T773, S780, S788, S795, S807, S811, T821 및 T826으로 이루어지는 그룹으로부터 선택되는 Rb 단백질의 인산화 위치내의 아미노산을 암호화하는 뉴클레오타이드 서열을 변화시킴으로써 돌연변이되는 약제학적 조성물.
- 제9항에 있어서, 유전자가 돌연변이된 p53 유전자인 약제학적 조성물.
- 제14항에 있어서, 유전자가 P1 부위(아미노산 343-351), P3 부위(아미노산 372-380) 및 P5 부위(아미노산 381-393)로 이루어지는 그룹으로부터 선택되는 p53 단백질의 보존된 상동성 부위내의 아미노산을 암호화하는 뉴클레오타이드 서열을 변화시킴으로써 돌연변이되는 약제학적 조성물.
- 제1항의 DNA 분자를 포함하는, 악성 세포 질환에서 증식하는 암세포를 치료하기 위한 약제학적 조성물.
- 제16항에 있어서, DNA 분자가 돌연변이된 Rb 유전자인 약제학적 조성물.
- 제17항에 있어서, 유전자가 P1 부위(아미노산 184-192), P3 부위(아미노산 245-262) 및 P5 부위(아미노산 873-886)로 이루어지는 그룹으로부터 선택되는 Rb 단백질의 보존된 상동성 부위내의 아미노산들 암호화하는 뉴클레오타이드 서열을 변화시킴으로써 돌연변이된 약제학적 조성물.
- 제18항에 있어서, 유전자가 서열확인 번호 1 및 2에서 제시된 서열로 부터 선택되는 아미노산 서열을 암호화하는 약제학적 조성물.
- 제17항에 있어서, 유전자가 T005, S230, S249, T252, T373, S567, S608, S612, T773, S780, S788, S795, S807, S811, T821 및 T826으로 이루어지는 그룹으로부터 선택되는 Rb 단백질의 인산화 위치내의 아미노산을 암호화하는 뉴클레오타이드 서열을 변화시킴으로써 돌연변이되는 약제학적 조성물.
- 제16항에 있어서, DNA 분자가 돌연변이된 p53 유전자인 약제학적 조성물.
- 제21항에 있어서, 유전자가 P1 부위(아미노산 343-351), P3 부위(아미노산 372-380) 및 P5 부위(아미노산 381-393)로 이루어지는 그룹으로부터 선택되는 p53 단백질의 보존된 상동성 부위내의 아미노산을 암호화하는 뉴클레오타이드 서열을 변화시킴으로써 돌연변이되는 약제학적 조성물.
- 제16항에 있어서, 악성 세포 질환이 난소암, 방광암, 폐암, 경부암, 유방암, 전립선암, 신경교종, 섬유육종, 망막아세포종, 흑색종, 연조직 육종, 골육종, 결장암, 신장암 및 췌장암으로 이루어지는 그룹으로부터 선택되는 약제학적 조성물.
- 제1항의 DNA 분자를 포함하는, 병소 세포 증식성 질환의 치료를 위한 약제학적 조성물.
- 제24항에 있어서, 병소 세포 증식성 질환이 눈에서의 섬유증식성 질환, 혈관증식성 질환 및 종양성 질환으로 이루어지는 그룹으로부터 선택되는 약제학적 조성물.
- 제4항의 DNA 분자를 포함하는, 병소 세포 증식성 질환의 치료를 위한 약제학적 조성물.
- 제26항에 있어서, 병소 세포 증식성 질환이 눈에서의 섬유증식성 질환, 혈관증식성 질환 및 종양성 질환으로 이루어지는 그룹으로부터 선택되는 약제학적 조성물.
- 제1항의 유전자에 의해 생성되는 돌연변이된 망막아세포종 단백질.
- 제4항의 유전자에 의해 생성되는 돌연변이된 p53 단백질.
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