NO312681B1 - Fremgangsmåte for fremstilling av en farmasöytisk blanding med suppresiv virkning/aktivitet - Google Patents

Description

Foreliggende oppfinnelse vedrører fremgangsmåter for behandling av celler for å undertrykke tumorgenesen.

Mye av fokus innen kreftforskning har vært på diagnostikk og behandling av tilstanden. I de senere årene, på grunn av fremskritt i kunnskapen om biokjemiske prosesser på det cellulære og subcellulære nivå, har oppmerksomheten vært rettet mot fremgangsmåter, ikke bare for diagnostisering og behandling av cancer, men også for å oppdage en predisposi-sjon for cancer i organismen.

I disse studiene ble "cancersuppresjon" opprinnelig definert som et tap av tumorgenisiteten observert i fusjonsceller dannet med tumorceller og normale fibroblaster, lymfocytter eller keratinocytter. Virkningen ble antatt å være formidlet av dominante suppressive faktorer i normale celler. Bevis tyder på at disse faktorene var delvis genetiske på grunn av at en korrelasjon eksisterte mellom suppresjon av tumorgenisiteten og tilstedeværelse av visse kromosomer i kondenserte celler.

En annen betydning av cancersuppresserende gener oppstod i sammenheng med genetiske studier på visse neoplasmer i barn og tumorsyndromer i voksne. Gener som bidrar til dannelsen av disse tumorene ser ut til å være onkogene ved tap av funksjon, istedenfor aktivering, som med klassiske onkogener. Retinoblastoma, som er en form for øyecancer hos barn, er det prototypiske eksemplet. Cytogeniske analyser og studier av restriksjonsfragmentlengdepolymorfismer (RFLP) har tydet på at retinoblastoma kan være et resultat av et tap av et genlocus beliggende i kromosombånd 13ql4. Det har vært store fremskritt ved anvendelse av RB cDNA og RB-protein ikke bare i diagnostikk og fremgangsmåter for behandling av RB-relaterte tumorer, men også i bestemmelse av cancersuppres-sorfunksjoner av andre gener, som beskrevet i andre inngitte patenter. Til tross for dette eksisterer det et behov for hensiktsmessige fremgangsmåter for terapeutisk behandling av osteosarkom, lungekarsinom, lymfom og leukemi, som ikke kan "behandles ved RB-modal i teter .

I lys av ovennevnte er det ønskelig å oppnå en fremgangsmåte for spesifikk terapeutisk behandling, uavhengig av RB-modaliteter, for osteosarkomer, lungekarsinomer, lymfomer og leukemi. Det er videre ønskelig å oppnå slike fremgangsmåter som kan anvendes sammen med RB cDNA og proteinprodukt for behandling av forskjellige tumorer. Det ville selvfølgelig være meget ønskelig å oppnå et terapeutisk produkt som kunne bli dannet i renset tilstand og som lett og effektivt kan bli levert til en defekt celle på en trygg måte.

Den viktigste hensikten med foreliggende oppfinnelse er å tilveiebringe en fremgangsmåte for fremstilling av en farmasøytisk blanding med suppresiv virkning/aktivitet på en neoplastisk fenotype til en cancercelle som ikke har endogent villtype p53-protein, kjennetegnet ved at nevnte prosess omfatter: 1) å introdusere et gen som koder for et villtype p53-protein som omfatter sekvensen i tabell 1 inn i en viral

vektor; og

2) blande den virale vektoren med en farmasøytisk akseptabelt bærer.

Produktet fremstilt ved fremgangsmåten ifølge foreliggende oppfinnelse, kan anvendes for behandling av tilstander forårsaket av defekte, mutante eller fraværende cancersupressor-gener der den aktive ingrediensen til sammensetningen er et naturlig eller syntetisk produsert produkt.

I en foretrukket utførelsesform er villtype p53-genet innbefattet i en retroviral vektor.

Ovennevnte og andre hensikter og trekk ifølge foreliggende oppfinnelse og måter og oppnå dem vil fremkomme, og selve oppfinnelsen vil best bli forstått med referanse til følgende beskrivelse av utførelsesformene ifølge oppfinnelsen i sammenheng med vedlagte tegninger, der: Fig. IA er en diagramrepresentasjon av tre humane p53cDNA; Fig. IB er en diagramrepresentasjon av den genomiske organisasjonen av tre p53-retroviruser; Fig. 2A er et kromatogram som viser ekspresjon av humane p53-proteiner i virus-produserende cellelinjer; Fig. 2B er et kromatogram som viser halveringstids-bestemmelsen av humant p53 i virus-produserende linjer ved puls-chase merkingseksperimenter; Fig. 3 viser ekspresjonen av humane p53-proteiner i virusinfiserte Saos-2-celler; Fig. 4 er et kromatogram av p53B/T-kompleksdannelsen i Saos-2-cellene; Fig. 5 viser morfologien i en kultur av parentale Saos-2-celler; Fig. 6A er en skjematisk presentasjon av doblingstidene til parentale Saos-2-celler og virusinfiserte kloner; Fig. 6B er en skjematisk presentasjon av metningstettheten til parentale Saos-2- og EN-kloner; Fig. 7A er et Southern-blot som viser tilstedeværelsen av en enkelt integrert kopi av Vp53E-Neo i p53EN-l-celler; og Fig. 7B er et Southern-blot som viser enkle, uavhengig integrerte kopier av Vp53B-Hygro i p53EN-BH-kloner. I fig. IA er tre humane p53 cDNA vist i diagram. Sekvensen angitt av Lam og Crawford, Mol. Cell. Biol. 6, 1379-1385 (1986), her merket som p53L, ble oppnådd ved sekvensering av kloner fra humant føtalt lever-cDNA og genomiske bibliotek og er betraktet å være vill-type. p53B er en cDNA-klon avledet fra føtal hjerne-RNA ved RT-PCR-fremgangsmåten som resulterte i kloning av villtype p53 (p53B) cDNA som følger: omtrent 15 pg føtalt hjerne-RNA ble blandet med 1,5 ijg oligo (dT) primer og 60 enheter avian myeloblastosisvirus revers transkriptase i cDNA-buffer (50 mM Tris-ECl, pH 8,0, 80 mM KC1, 5 mM MgC12, 1 mM hver av dATP, dGTP, dTTP og dCTP). Reaksjonsblandingen ble inkubert i 90 min ved 42° C. Etter reaksjonen ble RNA degradert med 0,5 N NaOH, og enkelttrådet cDNA ble presipitert med etanol. PCR-amplifikasjon ble utført med 1/10 cDNA, 100 ng av hver av oligonukleotidprimer (5'-TGCAAGCTTTCCACGACGGTGACACGCT-3' og 5'-AGTGCAGGCCAACTTGTT-CAGTGGA-3' ) og 5U Taq-polymerase i PCR-buffer (50 mM KC1 , 10 mM tris-HCl, pH 8,3, 1,5 mM MgC12 og 0,001 % gelatin) i 40 sykluser i en programmerbar varmeblokk (Ericomp, San Diego, CA). Hver syklus inkluderte denaturering ved 93° C i 1 minutt, sammensmelting ved 62°C i 80 sekunder og primer-ekstensjon ved 72 "C i 3 minutter. PCR-produktene ble ekstrahert med fenol og presipitert med etanol. Presipitatet ble oppløst i HgO og spaltet med restriksjonsenzymer (Hind III og Sma 1). p53 cDNA-f ragmentet ble subklonet inn i virusvektor for å danne Vp53B-Neo. Subklonet p53B ble sekvensert ved anvendelse av dideoksykjedetermineringsmetoden (F. Sanger, S. Nicklen, A.R. Coulsen, Proe. Nati. Acad. Sei. U.S.A. , 74, 5463 (1977 ) ) .

De utledete aminosyresekvensene til p53B og p53L var identiske til tross for to stille nukleotidsubstitusjoner som angitt. p53E er en cDNA-klon tilveiebrakt av E. Harlow, som har aminosyresubstitusjoner i posisjonene 72 og 273 relativt til p53L eller p53B. Arg/Pro<72->erstatningen representerer en felles aminosyrepolymorfisme, uten kjent funksjonell betydning. Derimot finnes substitusjonen av His for Arg i posisjon 273 bare i tumorceller og er betraktet å være en mutasjon. Som mange andre p53-mutasjoner, ligger Arg<273>—► His innenfor én av to regioner som er nødvendig for binding til SV40 T-antigen (stiplede bokser).

I fig. IB er den genomiske organisasjonen av tre p53-retroviruser vist i diagrammet. Vp53E-Neo ble konstruert ved innskudd av et 1,5 kb Hind III-Sma I-DNA-f ragment inneholdende p53E inn i plasmid pLRbRNL, som erstatter RB cDNA. Et 1,35 kb p53B DNA oppnådd ved RT-PCR ble direkte skutt inn i pLRbRNL-vektoren for å danne Vp53B-Neo. Innskuddet i én klon ble fullstendig sekvensert, som vist i diagrammet i fig. IA. Vp53B-Hygro ble konstruert ved innskudd av et Hind III-DNA-fragment inneholdende p53B og RSV-promoter inn i plasmid 477 (en MuLV-Hygro-vektor ble oppnådd fra W. Hammerschmidt og B. Sugden). Disse konstruksjonene ble deretter anvendt for å produsere de korresponderende virusstammene ved anvendelse av konvensjonelle teknikker. Noen hovedrestriksjonsseter som er viktige for konstruksjon, er angitt. H = Hind III, R = EcOR I, S = Sma I, B - Bam HI , C = Cia I. Fig. 2A er et kromatogram som viser murine PA12-celler (kol onne ml), humane WERI—Rb27-retinoblastom-celler (kolonne m2) og Vp53En-, Vp53BN- eller Vp53BH-produserende PA 12-celler som ble metabolsk merket med ^^-metionin. Cellelysater ble immunopresipitert med anti-p53-antistoff PAb421 ved anvendelse av konvensjonelle fremgangsmåter. Immuno-presipitater ble separert ved 8,5 % SDS-polyakrylamid-gelelektroforese (SDS-PAGE) og autoradiografert. Markør-kolonnene ml og m2 viser endogen murin p53 (Mp53) og begge polymorfe former av human p53 (Hp53). Human p53B- (fylt pil) og p53E- (åpen pil) proteinene i museceller er angitt. Fig. 2B viser bestemmelse av halveringstiden av human p53 i virus-produserende linjer ved puls-chase-merkingseksperimenter. PA12-cellene som uttrykker p53E (panel a) eller p53B (paneler b & c, representerende to uavhengige kloner) ble merket med 0,25 mCi/ml <35>S-metionin i 60 minutter og etterfulgt med 1 000 ganger molart overskudd av umerket metionin. Ved angitte tidspunkter ble cellene høstet for immunopresipitering av p53-protein med PAb421 som beskrevet ovenfor. Halveringstiden til p53B var 20-30 minutter, mens for p53E var den 4-5 timer. Markørkolonnene ml og m2 og fylte og åpne piler, var som i fig. 2A. Fig. 3 er et kromatogram som viser ekspresjonen av humane p53-proteiner i virusinfiserte Saos-2-celler. Saos-2-cellene (kolonnene 1 og 7) ble infisert med Vp53E-Neo, Vp53B-Neo eller Vp53B-Hygro for å danne p53EN- (kolonnene 2-6), p53BN-(kolonnene 8-10) eller p53BH- (kolonnene 11 og 12) kloner. Saos-2-cellene var også dobbeltinfiserte med Vp53E-Neo og Vp53B-Hygro for å danne p53EN-BH-kloner (kolonnene 13-15). Tilfeldig-selekterte kloner og WERI-Rb27-cellene (kolonnene M) ble merket med <35>S-metionin og immunopresipitert med PAb421 som beskrevet med hensyn på fig. 2A. p53B (fylte piler) og p53E (åpne piler) er vist. Fig. 4 viser p53B/T-kompleksdannelsen i Saos-2-cellene. Klonene p53BN-l (kolonnene 1 og 2), p53BH-l (kolonnene 3 og 4), p53EN-l-BH-l (kolonnene 5 og 6) og p53EN-l-BH-2 (kolonnene 7 og 8) ble transfektert med plasmid pRSV40T ved konvensjonelle metoder og 60 timer senere ble de merket metabolsk med <35>S-metionin. Cellelysatene ble immunopresipitert med PAb421 (kolonnene M, 1, 3, 5 og 7) eller med PAb419, et monoklonalt antistoff mot SV40T-antigen (kolonnene 2, 4, 6 og 8). PAb419 kopresipiterte bare p53B i celler som uttrykker både p53B og p53E. Fig. 5 er et fotografi som viser morfologien i kultur av parentale Saos-2-celler, og representative virusinfiserte kloner ved forstørrelsen 100x. I spor A ble eksponensielt voksende celler vist, mens i spor B er celler ved konfluks vist. Fig. 6A og 6B er skjematiske presentasjoner av vekstvirk-ningene til p53-ekspresjon i Saos-2-celler. I fig. 6A er doblingstidene av parentale Saos-2-celler og virusinfiserte kloner i et eksponensielt vekststadium vist. Et likt antall av hver celletype ble sådd ut på 60 mm kulturskåler og cellene fra to skåler ble trypsinert og telt daglig i 4 dager. Doblingstidene ble bestemt fra linjer tilpasset logcelletallene. Fig. 6B viser metningstettheten til parentale Saos-2- og En-kloner. Hvert tall (1 x IO<5>) celler ble sådd ut på 60 mm kulturskåler og cellene til to skåler ble trypsinert og telt ved angitte tidspunkter. Plottede punkter var gjennomsnittlige celletall fra duplikate skåler. Metningstettheten til p53E-uttrykkende celler var 4 til 5 ganger høyere enn parentale celler. Fig. 7 er et Southern blot av p53EN-BH-celler som inneholdt én kopi av Vp53E-Neo og én kopi av Vp53B-Hygro. Genomisk DNA (10 jjg) ekstrahert fra parentale Saos-2-celler og indikerte kloner ble spaltet med EcoR I, og separert i 0,7 % agarose-geler. Southern-overføring ble utført, og nylonmembraner ble hybridisert med <32>p-merket neo- (panel A) eller hygro- (panel B) DNA-prober ved anvendelse av standardmetoder. Et enkelt grensefragment sees i hver klon med hver probe, og dette tyder på enkeltintegrerte kopier av hvert virus.

Tumorsuppressorgener er definert som gener der tap-av-funksjonsmutasjoner er onkogene. Det er kjent at villtype allelene til slike gener kan forhindre eller undertrykke onkogenesen. Retinoblastomgenet (RB) er prototypen i denne klassen. Begge allelene til dette genet blir stadig mutert i retinoblastomceller, og RB-mutasjoner finnes også i under-grupper av andre humane neoplasmer inkludert osteosarkom, bløtvevssarkom og karsinomer i bryst, lunge, blære og prostata. Introduksjon av en villtypekopi av RB inn i retinoblastomceller undertrykte deres tumorgene egenskaper i nakne mus, for derved å tilveiebringe direkte bevis for tumorsuppresjon av et enkelt gen. I dette henseende er det referert til inngitte patentsøknad med tittel "Products and Methods for Controlling the Suppression of the Neoplastic Phenotype", serienr. 265 829, inngitt 31. oktober 1988. Villtype-RB-genet ble også introdusert inn i humane prostata karsinomceller inneholdende et endogent, mutert RB-protein (Science 247, 712-715 (1990)). Ekspresjon av det eksogene genet undertrykte igjen tumorgenisiteten til disse cellene og som viser at villtype-RB-proteinet var fenotypisk dominant i forhold til den muterte formen. Disse resultatene under-støtter en generell modell for egenskaper av tumorsuppressorgener som har fremkommet fra "two-hit"-hypotesen til Knudson og cellehybridstudiene til Harris et al. (Proe. Nati. Acad. Sei. USA, 68, 820-823 (1971)); Nature 223, 363-368 (1969)). Nukleotidsekvensen til p53-genet er angitt i tabell 3. p53 (tabell 4) ble opprinnelig identifisert som et pattedyr-cellulært protein som bindes til SV40T-antigenet, og dette er også en egenskap som er felles for RB-proteinet. Delesjoner eller rearrangementer av det murine eller humane genet kodende for p53, ble funnet i Friend virus-indusert murin erytroleukemi og i humane osteosarkomer, lungekarsinomer, lymfomer og leukemier. Derimot uttrykte mange humane bryst-, lunge- og tarmkarsinomer høye nivåer av varierende p53-arter med markert forlenget halveringstid forårsaket av visse punktmutasjoner i p53-genet (Genes Devel. 4, 1-8 (1990)). Disse observasjonene foreslår at mutasjonen av p53 bidrar til human onkogenese. p53 ble opprinnelig betraktet å være et onkogen på grunn av at det var kjent at det kunne transfor-mere primære rotteembryofibroblaster sammen med et aktivert ras-gen. Observasjonen av p53-delesjonene og punktmutasjonene spredt over flere eksoner, foreslo derimot også at p53 kan være et tumorsuppressorgen, dvs. et gen som ble inaktivert av mutasjonen. Finlay et al, og Eliyahu et al. (Cell j57, 1083-1093 (1989)) Proe. Nati. Acad. Sei D.S.A., 86, 8763-8767

(1989)) fant at kotransfeksjon av murin villtype p53-DNA kunne redusere transformasjonseffektiviteten til trans-fekterte onkogener i rotteembryofibroblaster, mens mutert p53-DNA forsterket slik transformasjon. Den dominante transformerende virkningen var antatt å være forårsaket av en "dominant negativ" aktivitet til det muterte p53-proteinet som blokkerte den vekst-hemmende funksjonen til villtype p53-proteinet i cellene. Denne modellen tydet på at den relative mengden av mutert i forhold til villtype p53, kunne bestemme den transformerte fenotypen, men gendosering kunne ikke bli kontrollert i disse transfeksjonsstudiene.

På grunn av slike tekniske spørsmål, samt muligheten av spesies-spesifikke forskjeller i p53-funksjon og den uvisse relevansen av transformerte dyreceller overfor human neoplasia, ble det bestemt at de biologiske egenskapene til p53 i det humane systemet skulle bli vurdert på nytt. Det ble oppdaget at en ideell vertscelle for disse studiene vil muliggjøre eksperimentell manipulasjon av enkeltkopier av muterte eller villtype p53-alleler. De fleste dyrkede humane cellene inneholder derimot endogene og muligens muterte p53-alleler som ikke er tilgjengelige for ytre kontroll. Den humane osteosarkomacellelinjen Saos-2 ble derfor valgt på grunn av at den har ingen endogen p53 på grunn av fullstendig delesjon av dets gen. Rekombinante retroviruser avledet fra Moloney murin leukemivirus (Mo-MuLV) ble anvendt for å introdusere mutert og/eller villtype p53 under LTR-pro-moterkontroll. Cellekloner isolert etter infeksjon og seleksjon inneholdt bare et enkelt integrert provirus av hver type, og multiple kloner ble analysert for å ekskludere posisjonelle virkninger. En vurdering av biologiske egenskaper til disse klonene innbefattet morfologi, vekstrater og metningstetthet i kultur, kolonidannelse i soft agar, og tumorgenisiteten i nakne mus.

Preparering av muterte og villtype p53- rekombinante retroviruser .

Som en referansestandard for human villtype p53, ble den genomiske DNA-sekvensen til Lamb og Crawford (Mol. Cell. Biol. 6, 1379-1385 (1986)) anvendt. Villtype p53 cDNA ble isolert fra føtalt hjerne-RNA ved metoden RT-PCR og ble klonet inn i plasmid. Ved kloning av villtype p53 (p53B) cDNA ble omtrent 5 jjg føtalt hjerne-RNA blandet med 1,5 jjg oligo(dT)primer og 60 enheter avian-myeloblastosisvirus revers transkriptase i cDNA-buffer (50 mM Tris-HCl, pH 8,0, 80 mM KC1, 5 mM MgCl2, 1 mM hver dATP, dGTP, DTTP og dCTP). Reaksjonsblandingen ble inkubert i 90 min ved 42° C. Etter reaksjonen ble RNA degradert med 0,5 N NaOH og enkelttrådet cDNA ble presipitert med etanol. PCR-amplifikasjon ble utført med 1/10 cDNA, 100 ng av hver av oligonukleotidprimer (5'-TGCAAGCTTTCCACGACGGTGACACGCT-3' og 5'-AGTGCAGGCCAACTTGTT-CAGTGGA-3' ) og 5 U Taq-polymerase i PCR-buffer (50 mM KC1, 10 mM Tris-HCl, pH 8,3, 1,5 mM MgC12 og 0,001 % gelatin) i 4 0 sykluser i en programmerbar varmeblokk (Ericomp, San Diego, CA). Hver syklus inkluderte denaturering ved 93°C i 1 minutt, nysammensmeltning ved 62° C i 80 sekunder og primer-ekstensjon ved 72 °C i 3 minutter. PCR-produktene ble ekstrahert med fenol og presipitert med etanol. Presipitatet ble oppløst i H2O og spaltet med restriksjonsenzymer (Hind III og Sma 1). p53 cDNA-fragmentet ble subklonet inn i virusvektor for å danne Vp53B-Neo. Subklonet p53B ble sekvensert ved anvendelse av dideoksykjedetermineringsmetoden (Proe. Nati. Acad. Sei. U.S.A., 74, 5463 (1977)).

Innskuddet i én klon (betegnet p53B) ble fullstendig sekvensert (~ 1 300 bp) for å vise en villtypeavledet amino-syresekvens til tross for to stille nukleotiderstatninger (fig. IA). En annen p53-cDNA-klon (p53E) isolert fra en epidermoid karsinomcellelinje A431 ble også sekvensert, og ble funnet å inneholde en punktmutasjon i kodon 273 som erstatter Arg med His (fig. IA). Dette er en funksjonell signifikant mutasjon som også er blitt identifisert i p53 fra to andre tumorcellelinjer. I tillegg kodet en nøytral sekvenspolymorfisme i kodon 72 (fig. IA) enten for en Arg (p53B) eller en Pro (p53E). Denne felles aminosyrepolymorfisme, som er uten kjent funksjonell betydning, resulterte i hurtigere migrering av p53B- enn p53E-protein ved SDS-PAGE, og ble derfor undersøkt for å skjelne mellom disse proteinene når de ble kouttrykt i samme celle.

p53E og p53B ble deretter skutt inn i en Mo-MuLV-basert retroviral vektor inneholdende neo som et selekterbart markørgen for å danne Vp53E-Neo- og Vp53B-Neo-virale genomer (fig. IB). I tillegg for å lette dobbelt erstatning, ble Vp53B-Hygro dannet ved innskudd av p53B inn i en lignende vektor inneholdende genet som er kjent for å utvise resistens overfor hygromycin. Stammer av Vp53E-Neo-, Vp53B-Neo- og Vp53B-Hygro-viruser ble produsert ved anvendelse av konvensjonelle metoder med titere på omtrent 1 x IO<5>, 2 x IO<4> og 1 x 10<5.> Ekspresjon av p53-proteinene fra virusene ble opprinnelig vurdert i murin NIH3T3-avledet pakkende linje, PA12, som ble anvendt for virusproduksjon. Muterte og

villtypehumane p53-proteiner ble detektert i deres respektive virusproduserende celler, med ventet forskjell i migrasjon ved SDS-PAGE (fig. 2A). Pga. at spontan mutasjon av p53 ofte kan oppstå i dyrkede celler, ble to ytterligere biokjemiske egenskaper til disse p53-proteinene undersøkt. Disse var deres cellulære halv-liv og deres evne til å bli bundet til T-antigen. p53B-proteinet hadde et halv-liv på 20-30 minutter sammenlignet med 4 til 5 timer for p53E-proteinet (fig. 2B), som er i samsvar med de publiserte rapportene om halv-livene til villtype og muterte p53-proteiner. Når virusproduserende celler ble transfektert med et plasmid som uttrykker store mengder SV40T-antigen, ble lysater immunopresipitert med anti-p53- eller anti-T-antistoffer, T-antigen ble ko-presipitert med p53B-protein, men ikke p53E-protein, som tyder på at bare p53B-proteinet kunne bli bundet til T. Disse resultatene foreslo sammen at p53B-inneholdende virus uttrykte villtype, og at p53E-inneholdende virus uttrykte mutert p53.

Ekspresjon av eksogen p53 i osteosarkomceller Osteosarkomcellelinje Saos-2, som ikke inneholder endogent p53 pga. delesjon av dets gen, tilveiebringer en ren bakgrunn for funksjonelle studier av p53. I tidligere eksperimenter utviser Saos-2-cellene infisert med parentale viruser inneholdende bare neomycin- eller hygromycin-resistensgener, ingen forandringer i morfologi og vekstrate sammenlignet med uinfiserte celler, og dette tyder på at medikamentseleksjonen ikke hadde noen vesentlig innvirkning på de neoplastiske egenskapene. Saos-2-cellene infisert med sammenlignbare titere av enten Vp53E-Neo, Vp53B-Neo eller Vp53B-Hygro i nærvær av det hensiktsmessige selektive midlet, tilveiebrakte et lignende antall medikamentresistente kolonier. De fleste koloniene kan individuelt bli propagert til massekulturer, med den noterbare observasjonen at Vp53B-infiserte celler vokste mye saktere enn Vp53E-infiserte celler. Vp53E-infiserte kolonier uttrykte høye nivåer av p53E-protein (fig. 3A). Av 30 Vp53B-infiserte kloner som ble undersøkt, uttrykte omtrent 80 % detekterbart p53B-protein (fig. 3B). To av hver av Vp53E-Neo- og Vp53B-Hygro-kloner ble tilfeldig selektert for en andre infeksjon med det andre viruset, og dobbeltinfiserte kloner ble isolert og propagert som ovenfor. Disse klonene uttrykte både p53E- og p53B-protein (fig. 3C). For å på ny verifisere at p53B-proteinet i disse cellene ikke var sekundært mutert, ble p53B-uttrykkende kloner transfektert med SV40-antigenplasmidet, og lysater immunopresipitert som beskrevet ovenfor (fig. 4). Anti-p53-antistoff kopresipiterte T i hver klon, men anti-T-antistoff kopresipiterte bare p53B, selv i celler som uttrykker både p53B og p53E. Halveringstiden til p53B i Saos-2 ble også målt, og var lik p53B i PA 12-celler. Disse data understøtter igjen antakelsen om at Vp53B-infiserte Saos-2-kloner uttrykte villtype p53.

Mutert p53 utviste en begrenset vekstfordel i forhold til Saos- 2- celler i kultur

Fem tilfeldig valgte kloner som stabilt uttrykte p53E-protein (p53EN-l til 5), ble sammenlignet med parentale celler med hensyn på morfologi (fig. 5), veksthastighet (som doblings-tid, fig. 6A), metningstetthet (fig. 6B), soft-agar-kolonidannelse, og tumorgenisitet i nakne mus ble bestemt. I tabellene 1 og 2 er resultatene av soft-agar-kolonidannelse og tumorgenisitet i nakne mus, angitt.

En forskjell 1 morfologi ble bare observert under betingelser med celleopphopning der cellene fra EN-kloner var mye mindre og mere skjøre enn parentale celler (fig. 5B). Metningstetthet til førstnevnte var 4 til 5 ganger større enn den til de parentale cellene (fig. 6B). Denne relative vekstfordelen ble sett til tross for lignende doblingstider målt under dårlige vekstbetingelser (fig. 6A). Fire EN-kloner og parentale celler hadde lignende effektiviteter i soft-agar-kolonidannelse (tabell 1) og tumorgenisitet i nakne mus (tabell 2). Én klon, p53EN-l, hadde merkbare forøkede evner i begge henseender og dannet store tumorer fra så få som 5 x IO<5> injiserte celler. Denne diskrepansen ble betraktet å være innenfor den klonale variabiliteten som er ventet blant tumorceller. Disse resultatene foreslår at mutert p53 funksjonerte i fravær av villtype p53 for å utvise en begrenset vekstfordel (høyere metningstetthet) overfor Saos-2-celler i kultur. I mange andre aspekter av den neoplastiske fenotypen var tilstedeværelse av punkt-mutert p53 vesentlig ekvivalent med fullstendig fravær av p53.

Villtype p53 undertrykte de neoplastiske egenskapene til Saos- 2- cellene

Sammenlignet med parentale Saos-2-celler, var kloner som uttrykker p53B, forstørrede og flate (fig. 5) og hadde forlengede doblingstider i kultur på omtrent 70 timer istedenfor 30-36 timer for parentale eller EN-celler (fig. 6A). Effektiviteten til soft-agar-kolonidannelse ble redusert til mindre enn terskelen for bestemmelse av en enkel koloni, mens parentale celler og EN-celler dannet hundrevis av kolonier under de samme betingelsene (tabell 1). Injeksjon av 1 x 10<7->celler fra hver av de syv p53B-uttrykkende klonene inn i sidene på nakne mus, resulterte ikke i dannelsen av tumorer etter 8-10 uker, selv mens det samme antallet av parentale eller p53E-uttrykkende celler dannet tumorer i alle kontralaterale sider (tabell 2). Disse funnene kunne ikke bli forklart av en bestemt virkning av viral infeksjon og seleksjon pga. at én klon, Vp53BN-R, avledet fra Vp53B-Neo-infiserte celler, men som manglet detekterbar ekspresjon av p53B, hadde en fenotype som ikke kunne skjeldnes fra parentale celler (tabellene 1 og 2). Den ~ 50 % reduksjonen av vekstraten til dyrkede Saos-2-celler ved p53B, var utilstrekkelig for å stå for det fullstendige tapet av tumorgenisiteten og soft-agar-kolonidannelsen som impliserte at villtype p53 spesifikt undertrykte den neoplastiske fenotypen til disse cellene. Disse resultatene tyder på at tap av villtype p53 var en betraktelig hendelse i løpet av genesen av denne tumorlinjen og, ved formering av andre osteosarkomer, med muterte endogene p53-gener.

Villtype p53 var dominant i forhold til mutert p53 i en to- allelkonf igurasjon

På grunn av at både muterte og villtype p53-proteiner var funksjonell i Saos-2-celler, var det av interesse å bestemme om begge aktivitetene kunne bli uttrykt samtidig, om de utelukket hverandre, eller om én aktivitet var klart dominant over den andre. Konfigurasjonen til én villtype og ett mutert allel var mest relevant for naturlig human tumorgenese, på grunn av at dette er et nødvendig mellomtrinn på veien mot fullstendig tap av villtype p53. Infeksjon av to forskjellige p53E-uttrykkende kloner med Vp53B-Hygro, ga 22 hygromycin-resistente kloner der 15 kouttrykte både p53B og p53E. For å bestemme antallet integrerte kopier av hvert virus til stede i disse klonene ble genomisk DNA av tre kloner avledet fra p53EN-l-cellene infisert med Vp53B-Hygro analysert ved Southern-blotting (fig. 7). Hybridisasjon med neo som en probe, viste et enkelt, felles grensefragment i alle tre klonene som indikerte på tilstedeværelse av en enkelt integrert kopi av Vp53E-Neo i p53EN-l-celler (fig. 7A). Hybridisasjon med hygro viste et enkelt, unikt grensefragment i hver klon som tydet på tilstedeværelse av enkelte, uavhengig integrerte kopier av Vp53B-Hygro i p53EN-BH-kloner (fig. 7B). Enkeltintegrasjoner var ventet, basert på tidligere anvendelse av et relatert rekombinant retrovirus med alle sammenlignbare titere. Disse funnene bekrefter at p53EN-BH-kloner inneholdt én integrert kopi av hvert virus og at begge eksogene p53-genene ble uttrykt (fig. 3). Ved kriterier som morfologi, vekstrate, metning, tetthet, soft-agar-kolonidanneIse og tumorgenisitet i nakne mus, var dobbelt-erstatningskloner uskjelnbare fra kloner som bare uttrykker p53B (fig. 5 og 6, tabell 1 og 2). Cellene oppnådd ved infisering i annen rekkefølge, dvs. p53B-uttrykkende celler infisert med Vp53E-Neo, hadde samme fenotype. Fullstendig dominans av villtype p53-aktivitet ble observert til tross for de ~10 ganger lavere mengdene av villtype enn mutert p53 i disse cellene (fig. 3). Disse resultatene tyder på at p53 bare kan bidra med tumorgenese etter tap av begge villtype-allelene. De indikerer også at gjenopprettelse av villtype p53 i tumorceller kan ha en suppresiv virkning, selv i nærvær av muterte p53-alleler.

Funksjon til p53 som en tumorsuppressor

Innføring av villtype p53 i humane osteosarkomaceller som mangler p53-ekspresjon, undertrykte klart deres neoplastiske fenotype, og dette tyder på at p53 kan virke som et tumorsuppressorgen i dette systemet. Innskudd av mutert p53 inn i disse cellene forøkte ett aspekt av deres vekst i kultur (metningstetthet), som derved viste at mutert p53 beholder en begrenset funksjon, én som var opphevet av villtype p53. Disse resultatene er i samsvar med andre forskere som har tilegnet innvirkningen av villtype murin p53 på onkogen-formidlet transformasjon av primære rotteembryofibroblaster. I disse studiene reduserte kotransfeksjon av plasmid-DNA inneholdende villtype p53-genet, betraktelig transformeringseffektiviteten til flere aktiverte onkogener, enten enkeltvis eller i kombinasjoner så som ras + mye eller ras + EIA. Mutert p53 hadde ikke denne suppressive virkningen og økte bare moderat transformeringseffektiviteten. Villtype p53 var også effektiv når det gjelder redusering av transformasjon av mutert p53 sammen med andre onkogener, som tyder på "dominans" av villtype-suppresjonsfunksjonen. Kolonier isolert etter transfeksjon med villtype p53-DNA, uttrykte enten eksogen p53 eller uttrykte bare mutert p53.

Ekspresjon av eksogen villtype p53 var inkompatibel med dannelsen av transformerte kolonier. Disse data tydet på at villtype murin p53 kunne virke som en suppressor på transformerte celler, til tross for at en uspesifikk, toksisk virkning av villtype p53 ikke lett kunne bli ekskludert. I kontrast til dette ble ved utvikling av foreliggende oppfinnelse, transformerte celler anvendt, og voksende kloner med endret fenotype som stabilt uttrykte oksogen villtype p53, ble oppnådd. Disse data i humane celler og de tidligere studiene i mus, tyder sammen på at den tumorundertrykkende funksjonen til p53 er en spesifikk og fundamental egenskap bevart over artsgrensene.

Naturen til p53- mutasjon

Det er kjent at murine p53-gener klonet fra mange dyrkede cellelinjer, har punktmutasjoner som er sammenhopet i fem bevarte regioner. Denne mutasjonsklassen var ansvarlig for det opprinnelige inntrykket av at p53 var et dominant onkogen, på grunn av at slike p53-DNA-f ragmenter eller konstruksjoner var aktive når det gjelder fremming av transformasjonen av gnagerceller i forskjellige analyser. Videre har proteinprodukter av muterte p53-gener felles antigene og biokjemiske karaktertrekk som er forskjellige fra villtype p53-protein, inkludert et forlenget halveringsliv som resulterer i unormalt høye cellulære p53-proteinnivåer. Disse trekkene minner meget om andre dominante onkogener som mye og ras. Derimot har store delesjoner eller rearrangementer av p53-genet, som er inkompatibelt med ekspresjonen av et genprodukt, blitt funnet i Friend-virusindusert murin erytroleukemi (Nature 314, 633-636 (1985)). Slike mutasjoner blir betraktet å være karakteristiske for såkalte tumorsuppressorgener og inaktiverer deres normale funksjon. For å forklare hvordan begge mutasjonstypene kunne gi samme onkogeniske fenotype, ble det foreslått at villtype p53 undertrykte tumordanneIsen, og at de mange kjente punktmutasjonene til p53 inaktiverte denne funksjon. For å forklare den dominante transformeringsaktiviteten til muterte p53-gener i primære celler, var det nødvendig å anta at mutert p53-protein inaktiverte endogent villtype p53-protein. Denne "dominant negativ"-virkningen kan oppstå ved inhibitoriske inter-aksjoner mellom muterte og villtype-proteiner (Nature, 329, 219-222 (1987)). Ytterligere vurderinger av disse studiene var begrenset av de tekniske ulempene med transfeksjon og av den uvisse rollen til endogent p53 i primærcellene.

I det humane systemet har Vogelstein og kollegaene vist i elegante studier at delesjoner og punktmutasjoner av p53 kan eksistere sammen i kolorektale lunge- eller bryst-karsinomer. Tap av heterozygositeten til polymorfe markører i kromosom-region 17p sees ofte i disse tumorene, og fører til tapet av én kopi av p53-genet (ved delesjon eller mitotisk ikke-disjunksjon). Det gjenværende p53-allelet blir ofte påvirket av somatiske punktmutasjoner i konserverte regioner. Sluttresultatet er tap av begge villtype p53-alleler fra tumorcellene. Det samme tapet skjer også i humane osteosarkomer og hepatocellulære karsinomer ved delesjon av begge p53-allelene. Fullstendig tap av villtype-alleler er sterkt analogt med funnene med retinoblastomgenet, og understøtter idéen om at p53 er et tumorsuppressorgen. Nigro et al., J. M. Nigro et al., Nature 342, 705-708 (1989), beskrev ett kolorektalt karsinom som uttrykte både mutert (Asp2*1 —► Gly) og villtype p53-alleler. Eksistensen av denne tumoren ble bestemt fordelaktig på den onkogeniske aktiviteten til et enkelt mutert p53-allel i nærvær av villtype p53; og tap av det andre, villtype-allelet ville bidra med progresjon av tumoren. ;I foreliggende oppfinnelse er det blitt oppdaget at fenotypen til Saos-2-cellene med enkeltkopier av villtype og muterte p53-alleler, var uskjelnbare i forhold til celler som bare uttrykker villtype p53, og dette tyder på at villtype p53 er dominant i forhold til mutert p53 i to-allelkonfigurasjonen. Med dette resultatet kan andre forklaringer på det diskrepante kolonkarsinomtilfellet bli betraktet: 1) et mellomliggende trinn av p53-mutasjonen ble tilfeldig oppfanget og p53 hadde enda ikke bidratt med de neoplastiske egenskapene til denne tumoren; og 2) "villtype"-p53-allelet i denne tumoren inneholdt en funksjonell viktig mutasjon utenfor regionen som ble sekvensert (eksonene 5-9). Det er derimot mulig at visse muterte p53-alleler har annen atferd enn andre, eller at muterte p53-alleler har annen funksjon i andre typer av tumorceller enn i vår modell av Saos-2-systemet. Disse mulighetene kan bli sett på ved replikerings-eksperimenter med andre muterte p53-gener og andre p53-negative celler. ;Forvirring i tidligere studier angående interaksjonen mellom villtype og mutert p53 har tåkelagt et vesentlig spørsmål: er mutert p53 fullstendig funksjonsløs, dvs. er det ekvivalent med dets fullstendige delesjon, eller har det beholdt en begrenset funksjon? Det blir konkludert at sistnevnte tilfelle er mere sannsynlig. En enkel kopi av mutert p53 økte i metningstetthet av Saos-2-cellene, og denne virkningen kunne selvfølgelig ikke bli formidlet ved inaktivering av endogen p53. Likeledes introduserte Wolf et al. (Cell 38, 119-126 (1984)) det som sannsynligvis var et mutert p53-gen inn i AB-MuLV-transformerte murine celler som manglet endogen p53-ekspresjon, og det ble oppdaget at deres onkogeniske potensiale var øket. Muterte p53-alleler kan derfor utvise en vekstfordel eller en mere malign fenotype in vivo overfor tumorceller uten villtype p53. ;Funnene om at mutert p53 har en biologisk funksjon, og at dets funksjon er resessiv i forhold til den til villtype p53, er ikke i samsvar med hypotesen av en dominant negativ virkning, idet minste slik den fremkommer i naturlig humant tumorgenese. De dominante transformerende egenskapene til muterte murine p53-alleler kan være forårsaket av de høye kopitallene til genene introdusert ved transfeksjon, og den resulterende massive overekspresjonen av mutert p53. Under disse tilstandene kan selv den begrensende intrinsike aktiviteten være tilstrekkelig for å bidra til en trans-formert fenotype. ;Mekanismen til p53- funksjonen ;De fysiologiske eller biokjemiske funksjonene til p53 er ikke med sikkerhet kjente. I ikke-transformerte celler øker p53-syntesen av mRNA-transkripsjonen dramatisk i løpet av overgangen fra Gq/G^ til S-fasen, som indirekte tyder på en rolle i cellesyklusreguleringen. En mulig beslektet aktivitet ved regulering av DNA-replikasjonen fremkommer også. Studier på suppresjon av den neoplastiske fenotypen kan tilveiebringe generelle parametere for forståelsen av den normale p53-funksjonen. Det er f.eks. klart at p53 ikke er nødvendig for progresjonen av cellesyklusen, og dets nærvær er heller ikke nødvendigvis forhindrende for cellevekst og -deling. Det kan derfor delta i reguleringen av disse basiske cellulære prosessene i respons til ytre vekst eller differansierings-signaler. Villtype og mutert p53 kan være forskjellig med en enkel aminosyre, men ha motsatte funksjoner i cellen. Under betingelser med lik gendosering kan villtype p53 overgå innvirkningen av mutert p53 til tross for et 10 ganger molart overskudd av sistnevnte. Disse observasjonene kan bli forklart ved konkurransen mellom villtype og mutert p53 for felles cellulære mål, som villtype p53 er mye mer avid overfor. I denne modellen vil villtype og mutert p53 overføre motsatte vekstsignaler til disse målene med totalt fravær av p53, kanskje et mellomliggende signal. Alternativt kan mutert p53 virke i en uavhengig reaksjonsvei for å fremme selektive trekk til den neoplastiske fenotypen. ;Genetiske mekanismer til p53- inaktivering ;Dominansen til villtype over mutert p53 i en to-allel-konfigurasjon impliserer at begge villtype p53-allelene må bli tapt for en onkogen virkning. I dette henseende utviser p53 en modell av tumorsupressorgeninaktivering som kan forstås når det gjelder retinoblastomgenet. I dette henseendet kan det henvises til de inngitte søknadene Retinoblastoma Gene Cancer Suppressing and Regulator, serienr. 108 748, inngitt 15. oktober 1987 og Suppression of the Neoplastic Phenotype, serienr. 265 829, inngitt 31. oktober 1988. Fullstendig tap av RB-genproduktet er universal i retinoblastomer, og villtype og muterte RB-alleler er ikke blitt observert å eksistere sammen i tumorcellene. Disse funnene tyder på at RB bidrar til onkogenesen bare etter fullstendig inaktivering. Derimot har mange tumorceller normal RB-ekspresjon og er neoplastiske antakeligvis på grunn av mutasjoner i andre gener. I slike RB+-tumorceller kan innføring av ytterligere eksogent RB ha liten eller ingen virkning og det er f. eks. blitt oppdaget at RB+ U20S-osteosarkomcellelinjer med villtype p53-alleler ikke eksisterer. Resultatene oppnådd inntil nå tyder på at p53 har bred suppresjonsaktivitet i flere typer av humane tumorer. Slik at den undertrykkende virkningen av eksogent RB eller p53 bare kan oppstå i tumorceller med inaktiverte RB- eller p53-gener. Disse fellesegenskapene til RB og p53 underbygger tumorsuppressorgenkonseptet, inkludert den mulige kliniske anvendelsen av erstatningen i hensiktsmessige tumorceller. ;Mutasjoner av genet kodende for p53, et 53 kD-cellulaert protein, finnes ofte i humane tumorceller og dette tyder på at dette genet har en viktig rolle i human onkogenese. For å danne en modell av den trinnvise mutasjonen eller tapet av hegge p53-allelene i løpet av human onkogenese, ble en human osteosarkomcellelinje, Saos-2, anvendt som manglet endogen p53 på grunn av fullstendig delesjon av genet. Enkeltkopier av eksogene p53-gener ble deretter innført ved infisering av cellene med rekombinante retrovirus inneholdende enten villtype eller punktmuterte versjoner av den p53 cDNA-sekvensen. Det ble funnet at 1) ekspresjon av villtype p53 undertrykker den neoplastiske fenotypen til Saos-2-cellene; 2) ekspresjon av mutert p53 fører til en begrenset vekstfordel til cellene i fravær av villtype p53; og 3) villtype p53 er fenotypisk dominant i forhold til mutert p53 i en to-allel-konfigurasjon. Disse resultatene tyder på at, som med retinoblastomagenet, mutasjon av begge allelene eller p53-genet er essensielt for dets rolle i onkogenesen. ;Spesielle utførelsesformer ifølge foreliggende oppfinnelse er blitt beskrevet og forskjellige modifikasjoner er mulig og blir betraktet innenfor rammen av kravene. *

Claims (2)

1. Fremgangsmåte for fremstilling av en farmasøytisk blanding med suppresiv virkning/aktivitet på en neoplastisk fenotype til en cancercelle som ikke har endogent vil-ltype p53-protein, karakterisert ved at nevnte prosess omfatter:

1) å introdusere et gen som koder for et villtype p53-protein som omfatter sekvensen i tabell 1 inn i en viral vektor; og

2) blande den virale vektoren med en farmasøytisk akseptabelt bærer.

2. Fremgangsmåte ifølge krav 1, karakterisert ved at villtype p53-genet er innbefattet i en retroviral vektor.