FI105014B - Menetelmä lääkkeen valmistamiseksi, jota käytetään estämään syöpäsolun neoplastista ilmiasua - Google Patents

Description

χ 105014

Menetelmä lääkkeen valmistamiseksi, jota käytetään estämään syöpäsolun neoplastista ilmiasua

Selitys 5

Ristiviite läheisesti yhteen kuuluviin hakemuksiin Tämä hakemus on osittain jatkoa seuraaville haussa oleville US-patenttihakemuksille: Ihmisen esteraasi D, sen käyttö ja 10 puhdistusmenetelmä, sarjanumero 091,547, jätetty 31. elokuuta, 1987; Retinoblastooma-geeni syöpää tukahduttava ja säätelijä, sarjanumero 108,748, jätetty 15. lokakuuta, 1987; ja Tuotteet ja menetelmät kasvainilmiasun tukahduttamisen valvomiseksi, sarjanumero 265,829, jätetty 31. lokakuuta, 15 1988; Soluterapian menetelmät, sarjanumero 07/553,892, jätetty 16. heinäkuuta, 1990; ja Menetelmä geenin proteiinituotteiden tuottamiseksi, sarjanumero 07/553,905, jätetty 16. heinäkuuta, 1990.

20 Tekniikan taso Tämä keksintö koskee yleensä soluterapiaa ja menetelmiä solujen käsittelemiseksi tukahduttamaan kasvaimien syntyä.

0 25 Tämä keksintö tehtiin hallituksen apurahan n:o EY05758 avulla National· Institute of Health -instituutissa ja Kalifornian yliopistossa. Hallituksella on tiettyjä oikeuksia täh(äri keksintöön.

30'. Alan taustaa ' · Syöpätutkimuksen keskipiste on ollut enimmäkseen tilan diagnosoimisessa ja hoidossa. Koska tieto biokemiallisista ' tapahtumasarjoista solutasolla ja solunsisäisellä tasolla on 35 edistynyt, on viime vuosina ohjattu huomiota ei vain menetelmiin syövän diagnosoimiseksi ja hoitamiseksi, vaan myös eliössä olevan syöpäalttiuden löytämiseksi.

Näissä tutkimuksissa "syövän tukahduttaminen" määritettiin 40 alun perin kasvaimien synnyttämiskyvyn menettämiseksi, jota 2 105014 havaittiin fuusiosoluissa, jotka oli tehty kasvainsoluista ja normaaleista fibroblasteista, imusoluista tai keratino-syyteistä. Normaaleissa soluissa olevien vallitsevien estävien tekijöiden oletettiin välittävän vaikutusta. Todiste 5 osoitti, että nämä tekijät olivat osittain perinnöllisiä, koska esiintyi korrelaatiota kasvaimien synnyttämiskyvyn estämisen ja fuusioiduissa soluissa olevien tiettyjen kromosomien välillä.

10 Toinen merkitys syöpää estäville geeneille syntyi tiettyjen lasten kasvaimien ja aikuisten kasvainoireyhtymien geneettisten tutkimusten yhteydessä. Geenit, jotka myötävaikuttavat näiden kasvaimien muodostumista, näyttävät olevan kasvaimia synnyttäviä menetettyään toimintansa pikemmin kuin 15 aktivoiduttuaan, kuten klassiset syöpägeenit. Retinoblas-tooma, lasten silmäsyöpä, on antanut prototyyppiesimerkin. Pikkutarkka sytogeneettinen analyysi ja restriktiopalasten pituusvaihteluiden tutkiminen yksilöiden välillä (RFLT:t) ovat antaneet ymmärtää, että retinoblastooma voi johtua 20 13ql4-kromosomijuovassa sijaitsevan geenin paikan menetyksestä. Kuten edellä viitatut haussa olevat patenttihakemukset tuovat esiin, on merkittävästi edistytty RB-cDNA:n ja RB-proteiinin hyväksikäytössä ei vain RB:hen liittyvien kasvaimien diagnosoimisessa ja hoitomenetelmissä, vaan myös 25 muiden geenien syöpää estävien toimintojen selvityksessä.

Kuitenkin on olemassa merkittävä tarve saada sopivia mene-: telmiä luusarkooman, keuhkokarsinoornan, imukudoskasvaimien ja leukemioiden hoitokäsittelyjä varten, joita ei voida hoitaa RB-modaliteettien avulla.

30

Ottaen huomioon yllä oleva, olisi erittäin toivottavaa saada menetelmä luusarkoomien, keuhkokarsinoomien, imukudoskasvaimien ja leukemioiden RB-modaliteeteista riippumatonta spesifistä hoitokäsittelyä varten. Lisäksi olisi erittäin » 35 toivottavaa saada tällaisia menetelmiä, joita voitaisiin käyttää yhdessä RB-cDNA:n ja proteiinituotteen kanssa eri kasvaimien hoitamiseksi. Tietysti olisi erittäin toivottavaa saada tällainen hoitotuote, jota voitaisiin tehdä puhdistetussa tilassa ja jota voitaisiin toimittaa helposti ja i 40 tehokkaasti puutteelliseen soluun turvallisella tavalla.

3 105014

Keksinnön paljastus Tämän keksinnön pääkohde on antaa yleensä turvallisia ja 5 spesifisiä hoitomenetelmiä ja tuotteita, jotka ovat hyödyllisiä valvottaessa syövän estoa. Lisäksi tämän keksinnön kohde on antaa syövän eston valvomista varten tuotteita ja menetelmiä, jotka ovat spesifisiä syöpäkasvaimien estolle ja hävittämiselle ja jotka käyttävät hyväksi bioteknologisia 10 menetelmiä ja tuotteita.

Tämän keksinnön tarkoitus on lisäksi antaa käyttöön lääke-koostumus syöpien hoitokäsittelyjä varten, jolloin koostumus on toimiva solutasolla ja solunsisäisellä tasolla.

15 Tämän keksinnön tarkoitus on vielä lisäksi antaa käyttöön lääkekoostumus puutteellisten, mutantti tai puuttuvien syöpää estävien geenien aiheuttamien tilojen hoitamiseksi, jolloin koostumuksen toimiva ainesosa on luonnollinen tai 20 synteettisesti tuotettu tuote.

Tämä keksintö koskee menetelmää, jossa käytetään hyväksi p53-cDNA:ta ja p53-geenituotteita kasvainilmiasun estämiseksi.

25

Lyhyt selitys piirroksista Tämän keksinnön yllä mainitut ja muut tarkoitukset ja yksityiskohdat sekä niiden saavuttamistapa tulevat selviksi, 30 ja itse keksintö ymmärretään parhaiten katsomalla keksinnön suoritusmuodon seuraavaa selitystä yhdessä oheisten piirros-. ten kanssa, joissa: • Kuvio IA on kaaviokuva ihmisen kolmesta p53-cDNA:sta; 35

Kuvio IB on kaaviokuva kolmen p53-retroviruksen geneettisestä rakenteesta;

Kuvio 2A on kromatogrammi, joka kuvaa ihmisen p53-proteii-40 nien ilmenemistä virusta tuottavissa solulinjoissa; 5 105014

Kuvio 2B on kromatogrammi, joka kuvaa ihmisen p53:n puoliintumisajan määritystä virusta tuottavissa linjoissa pulse-chase-leimauskokeiden avulla;

Kuvio 3 kuvaa ihmisen p53-proteiinien ilmenemistä viruksella infektoiduissa Saos-2-soluissa;

Kuvio 4 on kromatogrammi p53B/T-yhdistelmän muodostumisesta 10 Saos-2-soluissa;

Kuvio 5 kuvaa Saos-2-vanhemmaissolujen morfologiaa viljelmässä; 15 Kuvio 6A on kaaviokuva Saos-2-vanhemmaissolujen ja viruksella infektoitujen kloonien kahdentumisajoista;

Kuvio 6B on kaaviokuva Saos-2-vanhemmais- ja EN-kloonien kyllästystiheydestä; 20

Kuvio 7A on Southern blot -analyysi, joka kuvaa p53EN-l:ssä i liittyneenä olevaa yhtä Vp53E-Neo-kopiota; ja

Kuvio 7B on Southern blot -analyysi, joka kuvaa riippumat-25 tomasti liittyviä yksikopioisia p53EN-BH-klooneissa olevia Vp53B-Hygroja.

* * «

Kuvioiden yksityiskohtainen selitys 30 Kuviossa IA on diagrammi ihmisen kolmesta p53-cDNA:sta.

Lamin ja Crawfordin, Mol. Cell. Biol. 6, 1379-1385 (1980, . raportoima jakso, joka tässä leimattiin p53L:ksi, saatiin sekvenssoimalla ihmissikiön maksa-cDNA- ja genomikirjastoklooneja, ja sitä pidetään villityyppisenä.

35 p53B on cDNA-klooni ja se saatiin sikiön aivo-RNA:sta RT-PCR-menetelmän avulla, joka johti villityyppisen p53 (p53B) -cDNA:n kloonaamiseen seuraavasti: noin 15 pg sikiön aivo-RNA:ta sekoitettiin 1,5 pg oligo(dT)-alukkeen ja 60 yksikön linnun myeloblastosis-viruksen käänteistranskriptaasin 40 kanssa cDNA-puskurissa (50 mM Tris-HCl, pH 8,0, 80 mM KC1, 5 5 105014 mM MgCli, 1 mM dATP:tä, dGTP:tä, dTTP:tä sekä dCTP:tä). Reaktioseosta inkuboitiin 90 min 42°C:ssa. Reaktion jälkeen RNA pilkottiin 0,5 N NaOHrlla, ja yksijuosteinen cDNA saos-tettiin etanolilla. PCR-monistus suoritettiin yhdelle kym-5 menesosa c-DNA:lle, kun läsnä oli 100 ng jokaista oligonuk-leotidialuketta (5'-TGCAAGCTTTCCACGACGGTGACACGCT-3' ja 5'-AGTGCAGGCCAACTTGTTCAGTGGA-3'), ja 5U Taq-polymeraasia PCR-puskurissa {50 mM KC1, 10 mM Tris-HCl, pH 8,3, 1,5 mM MgCli , ja 0,001% gelatiinia), 40 kierrosta ohjelmoidussa lämpökomp-10 leksissa (Ericomp, Dan Diego, Kalifornia). Jokainen kierros sisälsi 1 minuutin denaturaation 93°C:ssa, 80 sekunnin juosteiden uudelleenpariutumisen 62°C:ssa, ja alukkeen pidennyksen 3 minuutin ajan 72°C:ssa. PCR-tuotteet uutettiin fenolilla ja saostettiin etanolilla. Sakka liuotettiin 15 veteen ja pilkottiin restriktioentsyymeillä (Hind III:lla ja Sma I:llä). p53cDNA-kappale kloonattiin kpljetinvirukseen, jolloin muodostettiin Vp53B-Neo. Kloonattu p53B sekvenssoi-tiin käyttämällä dideoksiketjunlopetusmenetelmää (F. Sanger, S. Nicklen, A.R. Coulsen, Proc. Natl. Acad. Sei. USA 74, 20 5463 (1977)).

p53B:n ja p53L:n päätellyt aminohappojaksot olivat kahdesta merkityksettömästä nukleotidin korvautumisesta huolimatta samoja, kuten on osoitettu. p53E on E. Harlowilta saatu 25 cDNA-klooni, jossa on 72- ja 273-kohdissa aminohappokor- vautumiset, jotka vastaavat p53L:ää tai p53B:tä. Arg/Pro72 -korvautuminen edustaa yleistä aminohappomonimuotoisuutta, johon ei kuulu tunnettua toiminnallista merkitystä. Toisaalta His:n korvautuminen Arg:ksi kohdassa 273 on löydetty 30 yksinomaan kasvainsoluista ja sitä pidetään mutaationa.

Kuten monet muut p53-mutaatiot, Arg273 --> His on toisessa niistä alueista, jotka vaaditaan SV40:n T-antigeeniin sitoutumiseen (viivoituksella varjostetut laatikot).

35 Kuviossa IB on diagrammi kolmen p53-retroviruksen gemonin rakenteesta. Vp53E-Neo rakennettiin liittämällä p53E:n sisältävä 1,5 kb Hind III-Sma I DNA -kappale pLRbRNL-plas-midiin korvaamaan RB-cDNA. RT-PCR:n avulla saatu 1,35 kb p53B-DNA liitettiin suoraan pLRbRNL-kuljettimeen, jolloin 40 muodostettiin Vp53B-Neo. Yhdessä kloonissa oleva liitetty 6 105014 kappale sekvenssoitiin kokonaan, kuten on esitetty kuvion IA diagrammissa. Vp53B-Hygro rakennettiin liittämällä p53B:n sisältävä Hind III -DNA-kappale ja RSV-promoottori 477-plasmidiin (W. Hammerschmidt ja B. Sugden antoivat ystäväl-5 lisesti käyttöön MuLV-Hygro-kuljettimen). Sitten näitä rakenteita käytettiin tuotettaessa vastaavia virusstokkeja käyttämällä tavanomaisia tekniikoita. Osoitetaan joitakin rakentamisen kannalta tärkeitä restriktiokohtia. H = Hind III, R = EcoR I, S = Sma I, B = Bam HI, C = Cla I.

10

Kuvio 2A on kromatogrammi, joka kuvaa hiiren PA 12 -soluja (rivi ml), ihmisen WERI-Rb27-retinoblastoomasoluja (rivi m2), ja Vp53En-, Vp53BN- tai Vp53BH-tuottavia PA 12 -soluja, jotka oli aineenvaihdunnan avulla leimattu 33-metioniinilla. 15 Solulysaatit immunosaostettiin anti-p53-PAb421-vasta-aineel-la käyttämällä hyväksi tavanomaisia menetelmiä. Immunosakat erotettiin 8,5% SDS-polyakryyliamidigeelielektroforeesin (SDS-PAGE) avulla, ja suoritettiin autoradiografia. Merkki-rivit ml ja m2 esittävät sisäsyntyistä hiiren p53:a (Mp53) 20 ja ihmisen molempia monimuotoisia p53-muotoja (Hp53). Osoi-I tetaan hiiren soluissa olevat ihmisen p53B- (täytetty nuoli) ’ ja p53E-proteiinit (avoin nuoli).

Kuvio 2B kuvaa virusta tuottavissa linjoissa olevan ihmisen 25 p53:n puoliintumisajan määritystä pulse-chase-leimauskokei- den avulla. PA12-solut, jotka ilmentävät p53E:tä (kenttä a) tai p53B:tä (kentät b & c, jotka edustavat kahta riippumatonta kloonia) leimattiin 0,25 mCi/ml 35S-metioniinilla 60 minuutin ajan, ja reaktio lopetettiin 1000-kertaisella 30 molaarisella ylimäärällä leimaamatonta metioniinia. Osoitetuilla hetkillä solut kerättiin p53-proteiinin immunosaos-. tusta varten PAb421:n avulla, kuten on selitetty yllä.

p53B:n puoliintumisaika oli 20-30 minuuttia, kun taas p53E:n puoliintumisaika oli 4-5 tuntia. Merkkirivit ml ja m2, sekä 35 täytetyt ja avoimet nuolet olivat kuten kuviossa 2A.

Kuvio 3 on kromatogrammi, joka kuvaa ihmisen p53-proteiinien ilmenemistä viruksella infektoiduissa Saos-2-soluissa. Saos-2-solut (rivit 1 ja 7) infektoitiin Vp53E-Neo:11a, Vp53B-40 Neo:lla tai Vp53B-Hygro:11a, jotta kehitettäisiin p53EN- 7 105014 (rivit 2-6), p53BN- (rivit 8-10) tai p53BH- (rivit 11 ja 12) kloonit vastaavasti. Saos-2-solut infektoitiin myös toisen kerran Vp53E-Neo:lla ja Vp53B-Hygro:11a, jotta kehitettäi-; siin p53EN-BH-kloonit (rivit 13-15). Satunnaisesti valitut 5 kloonit, ja WERI-Rb27-solut (rivit M) leimattiin 33S-metio-niinilla ja immunosaostettiin PAb421:llä, kuten on selitetty koskien kuviota 2A. Osoitetaan p53B (täytetyt nuolet) ja p53E (avoimet nuolet).

10 Kuvio 4 kuvaa p53B/T-yhdistelmän muodostumista Saos-2-so-luissa. Kloonit p53BN-l (rivit 1 ja 2), p53BH-l (rivit 3 ja 4), p53EN-l-BH-l (rivit 5 ja 6) ja p53EN-l-BH-2 (rivit 7 ja 8) transfektoitiin pRSV40T-plasmidilla tavanomaisten menetelmien avulla, ja 60 tunnin kuluttua kloonit leimattiin 15 aineenvaihdunnan avulla 33S-metioniinilla. Solulysaatit immunosaostettiin PAb421:n avulla (rivit M, 1, 3, 5 ja 7) tai PAb419:n avulla, joka on SV40:n T-antigeenia vastaan oleva monoklonaalinen vasta-aine (rivit 2, 4, 6 ja 8).

PAb419 yhteissaosti vain p53B:n soluissa, jotka ilmensivät 20 sekä p53B:tä että p53E:tä.

Kuvio 5 on valokuva, joka kuvaa Saos-2-vanhemmaissolujen ja tyypillisten viruksella infektoitujen kloonien morfologiaa viljelmässä suurennuksen ollessa 100.x. A-rivillä esitetään 25 eksponentiaalisesti kasvavat solut, kun taas B-rivillä esitetään confluency-vaiheessa olevat solut.

•

Kuviot 6A ja 6B ovat kaaviokuvia p53:n ilmenemisen kasvuvaikutuksista Saos-2-soluissa. Kuviossa 6a esitetään eksponen-30 tiaalisessa kasvuvaiheessa olevien Saos-2-vanhemmaissolujen ja viruksella infektoitujen kloonien puoliintumisajät. Yhtä . suuret määrät jokaista solutyyppiä ympättiin 60 mm viljely- : maljoille; kahden maljan solut trypsinoitiin ja laskettiin päivittäin 4 päivän ajan. Kahdenturnisajät saatiin linjoista, 35 jotka sopivat logaritmisolumääriin. Kuvio 6B esittää Saos-2-vanhemmais- ja En-kloonien kyllästystiheyden. Yhtä suuret määrät (1 x 103) soluja ympättiin 60 mm viljelymaljoille; . kahden maljan solut trypsinoitiin ja laskettiin osoitettujen aikojen kuluttua. Graafisesti esitetyt pisteet olivat rin-40 nakkaismaljojen solumäärien keskiarvoja. p53E:tä ilmentävien 8 105014 solujen kyllästystiheys oli 4-5 kertaa korkeampi kuin vanhemmaissolujen.

Kuvio 7 on Southern blot -analyysin tulos p53EN-BH-soluista, 5 joissa on yksi kopio Vp53E-Neo:sta ja yksi kopio Vp53B-Hygro:sta. Saos-2-vanhemmaissoluista ja osoitetuista klooneista eristetty genominen DNA (10 pg) pilkottiin EcoR I:llä, ja DNA-kappaleet erotettiin toisistaan 0,7 % agaroo- i sigeeleissä. DNA siirrettiin geeleiltä nylonfliitereille, 10 jotka hybridisoitiin 3z P-leimatuilla neo- (kenttä A) tai hygro- (kenttä B) DNA-koettimilla käyttämällä hyväksi vakio-menetelmiä. Yksi liitoskappale nähdään jokaisessa kloonissa jokaisella DNA-koettimella, mikä osoittaa jokaisen viruksen yksinkertaisia liittyneitä kopioita.

15

Paras tapa keksinnön toteuttamiseksi

Kasvaimia estävät geenit määritetään geeneiksi, joiden toiminnan menetys -mutaatiot ovat kasvaimia synnyttäviä. On 20 tunnistettu, että tällaisten geenien villityyppiset alleelit voivat toimia kasvaimien syntyä estävästi tai tukahduttavas-ti. Ret.inoblastoomageeni (RB) on tämän luokan prototyyppi. Tämän geenin molemmat alleelit ovat aina mutatoituneet retinoblastoomasoluissa, ja RB-mutaatioita löydetään myös 25 ihmisen muiden kasvaimien alaryhmästä mukaan lukien luusar-kooma, pehmytkudossarkoomat ja rinta-, keuhko-, rakko- ja eturauhaskarsinoomat. RB:n villityyppisen kopion vieminen retinoblastoomasolujen sisään esti niiden kasvaimia synnyttäviä ominaisuuksia ihonvärisissä hiirissä, sillä tavalla 30 antaen suoran todistuksen siitä, että yksi geeni estää kasvaimen. Tässä suhteessa olkaa hyvä ja katsokaa yhteishaussa olevaa patenttihakemusta, jonka otsikko on "Tuotteet ' ja menetelmät kasvainilmiasun tukahduttamisen valvomiseksi", jonka sarjanumero on 265,829, jätetty 31. lokakuuta 1988.

35 Villityyppinen RB-geeni vietiin myös ihmisen eturauhaskar-sinoomasolujen sisään, jotka sisälsivät sisäsyntyisen, mutatoituneen RB-proteiinin (Science 247, 712-715 (1990)). Ulkosyntyisen geenin ilmeneminen jälleen esti näiden solujen kasvaimien synnyttämiskykyä, mikä merkitsee, että villityyp-40 pinen RB-proteiini oli ilmiasullisesti vallitseva mutatoitu- 9 105014 neelle muodolle. Nämä tulokset tukevat yleistä kasvaimia estävien geenien ominaisuuksien ma,llia, joka on tullut esiin Knudsonin "kaksoisosuma"-hypoteesistä ja Harrisin ym. solu-hybriditutkimuksista {Proc. Natl. Acad. Sei. USA 68., 820-823 5 (1971)); Nature 223, 363-368 (1969)). p53-geenin nukleotidi- jakso on kuvattu taulukossa 3.

«

Taulukko 3 105014 1/1 31 7 11 AT5 CAG GAG CCC CAC TCA CA? CCT ACC CTC CAC. CCC CCI CIS ACT CAC CIA ACA ITT TC* ¢1 '7 *21 ..... Π / 31' ~~

GAC C7A 7SG AU.C3A CT? CCT CU AAC WC CTT. C7G 7CC CCC TTC CCC ICC CAA CCA hiG

32l'7'~’<l' - —............ΪΎΐ / £1

CAT CAT T7C ATS C7G TCC CCC CAC CAT ATT SAA..CU 70S TTC ACT CAA CAC CCA CCT CCA

Iti ’/ "ti.......... ' **· ill / 11 CAT CU CCT CCC AC λ A7C CCA CAC CC? CC? CCC CCC G 73 CCC CC? CCA CCA CCA CCT CC i 2<1 / 81 ' ' ...........'ί!ϊ” / '1

;,CA CCC CCC CCC CCT CCA CCA CCC CCC TCC TCC CCC CTC TCA TC? TC? C7C CCT 7CC CAC

3C1 '/ loi' ...... 311" / ill

AAA ACC TAC CAS CCC ACC 7AC CCT. TTC CCT CTC CCC TTC TTC CAT 7CT OCC ACA CCC AAC

Sf 1 / 1?r........ * 291"/ 131

TCT OTA ACT TCC ACC 7AC 7CC CCT CCC CTC AAC AAC ATS TT? TCC CAA CTC CCC UC ACC

«1 / K1 ......."<31 / 1S1

TCC CCT CTC CAC CTC 7CC CTT CAT TCC ACA CCC. CCC CCC CC-C ACC CC-C CTC CCC CCC ATC

m / iti su / ϋι occ ATC TAC UC CAS TCA CAS CAC ATS ACC CAC.CTT C7G ACC CCC TCC CCC CAC CAT G/\S £<1 / in ill' / 1S1 CCC TCC TCA CAT ACC CAT CCT CTC CCC CCT CCT CAC CA? CT? ATC CCA CTC CAA CCA UT fCl /201 K31 / 211 7TC CC? CTO CAS 7AT TTC CAT CAC ACA AAC ACT TTT CCA CAT ACT CTC CTC CTC CCC TA? (tl / 221 «51 / 231

CAS CCC CC?.CAC' CTT CGC TCT C-AC TCT ACC ACC ATC CAC TAC AAC TAC ATC 7C7 AAC ACT

lii / 2<i · 'il / ?il

; TCC TCC ATC CC-C CCC ATS AAC CCS ACA CCC ATC CTC ACC ATC ATC ACA CTC CAA CAC TCC

m / 2(1 m / an

AC? C-3T ΑΑΪ CT A CTC CCA CCC AAC ACC 77T CAC CTC CCT CTT TGT CCC TCT CCT CCS ACA

m / 2ti -. tn / an

CAC CCS CCC ACA CAC CfA CAS AAT CTC CCC AAS AU CCS CAC CC? CAC CAC CAC CTC CCC

SCI / 351 m / 311

CCA CCC Af.C ACT AAC CCA CCA CTC CCC AAC A.AC ACC A.SC TCC 7CT CCC CAC CCA AAC AAC

Sil /321 iti / 331

AU CCA CTC CAT. CCA CU TAI TTC ACC C7T CAS ATC CCT CC-C CCT C-AS CCC TTC CAC ATS

1021 / 5*1 !«1 / 3il

- - TTC CCA CAS C?G AAV' CAC OCC TTC 5U CTC AAS CAT CCC CAS CC? CCS US CAS CCA CSC

2011 / 3 tl 3111 / in

CCS Ate ACO CCT CAC TCC ACC CAC CTC AAC TCC AU AJ-S CCI CAS TCT ACC TCC CCC CAT

no / 2ti nn / m

AU*AU CTC A?S_7TC UC ACA CU CCC CC? CAC TCA CAC TCA

<10516-02.208>

A

11 105014

Taulukko 4 1/1 31/11 »et flu flu pre fin shr asp pro ser V4l 9i„ F-e pr0 i»u ser fin ylu thr phe ser 61 /21 51 / 31 asp Itu trp ly* leu l«u pro ylu aan asn vai lou s*r pro Itu pre t*r fin *1« ««t 121 / <1 151 / 51 *»p asp leu nti l«u i*r pro asp 45? n, glu yln trp ph· thr ylu asp pro yly pro 1B1 / 61 211 / n

asp glu »la pro arg reet pro 91« *ia 41* pro arg vai ala pro ala pro ala ala pro 241 /«1 271 / SI

thr pro ala ala pro »la pro ala pro s»f tr? pro leu str ser str vei pro ser fin 301 / 101 33l’/ 111 lya thr tyr fin yly *ar tyr fly pj,0 »rg leu fly P>.o leu his,ser fly thr ala lys 361 / 121 391 / 131 s«r vai thr cyt.rhr tyr ter pro ala leu e*n lys »at phc cy* fin leu ala lys thr 421 / K1 451 / 161 cy* pro vai gin leu trp vai asp »*r thr pro pro pro fly thr »rg vai «9 ala »et 481 / 161 eii / m ala ilo tyr lys fin ser fin his >#«t thr glu vai vei arg arf cy* pro his his glu 541 / 161 571 / IS! arg cys ser asp ser »sp gly leu ala pro pro fin his leu j.lc »ry vai 5)» yly isn ¢01 / 201 631 / 211

Itu arf vai glu tyr lou asp asp ary asn thr phe *rf hi* *«r vai vai vai pro tyt 661 /221 , 691 / 231 ylu pro pro 91» vai yly sei asp cys thr thr 11· his tyr asn tyr act cys asn ser 121 / 241 · 751 / 251 ser cy* met gly 9ly 3>*t, asn »ry arg pro lie l*u thr ile Ile thr leu ylu asp str 281 /261 ' ' en / 271 « iti gly asn l«u leu yly «9 **n ser Fhe ylu vai arf voi cys ala cys pro yly arg 841 / 261. '.· >71 / 251 „p ary *ry thr ylu glu glu asn lev arf ly» lys fly glu P» hi* his glu Itu pro 901 / 301 531 / 311 pre fly ’·? thr lys ary ala l.u pro asn »*n thr *«= ser *«r pro gin Pro lys ly* 961 / 321 551 1 331 ly, p„ le-, .MP 9ly .» ·>" V»· 1« »“ «· ,l!r "» :‘J PS· ?1” 3021/ 3<1 ·' ·; 1051 1 351

Phe »ry glu itu asn giu ·!· leu glu luu lys asp el» gin ala gly lys clv ?ro gly 10n / 3«1 111 ?ly ser »ry ai» his *«r ser hi, le» lys .tr ly* ly- fly fin sar thr ser ary his im / 3»i 1171 7 391 iyf ly» l«u met pht ly* thr ylu gly pro »sp ser »sp ΟίΛ 12 105014 p53 (taulukko 4) tunnistettiin alun perin nisäkässolun proteiiniksi, joka sitoutuu SV40:n T-antigeeniin. Tämä ominaisuus on myös RB-proteiinilla. Hiiren tai ihmisen p53:a koodaavan geenin häviämiä tai uudelleenjärjestelyjä löydet-5 tiin Friend-viruksella indusoiduista hiiren varhais-puna- ja valkosoluveritaudeista ja ihmisen luusarkoomista, keuhkokar-sinoomista, imukudoskasvaimista ja leukemioista. Toisaalta ihmisen monet rinta-, keuhko- ja paksusuolikarsinoomat ilmensivät sellaisten tavallisuudesta poikkeavien p53-lajien 10 korkeita tasoja, joiden puoliintumisajät olivat selvästi pidentyneet, mikä johtui tietyistä pistemutaatioista p53-geenissä (Genes Devel. 4., 1-8 (1990)). Nämä havainnot tuntuvat osoittavan, että p53:n mutaatio myötävaikuttaa ihmisen kasvaimen synnyssä. p53:a pidettiin alun perin syöpägeeninä, 15 koska tiedettiin, että se voisi transformoida rotan alkion primaarifibroblasteja yksissä neuvoin aktivoidun ras-geenin kanssa. Kuitenkin havainto p53-häviämistä ja useiden ek-sonien pistemutaatioista tuntui myös osoittavan, että p53 voisi olla kasvaimia estävä geeni eli geeni, jonka mutaatio 20 tekee tehottomaksi. Tosiaan Finlay ym. ja Eliyahu ym. (Cell 57, 1083-1093 (1989)) (Proc. Natl. Acad. Sei. USA 86, 8763-8767 (1989)) havaitsivat, että hiiren villityyppisen p53-DNA:n yhteistransfektio voisi vähentää transfektoitujen syöpägeenien transformaatiotehokkuutta rotan alkion fibro-25 blasteissa, kun taas mutatoitu p53-DNA lisäsi tällaista transformaatiota. Vallitsevan transformoivan vaikutuksen 9 oletettiin johtuvan mutatoidun p53-proteiinin "vallitsevasta negatiivisesta" aktiivisuudesta, joka jollain tavalla esti villityyppisen p53-proteiinin kasvua rajoittavaa toimintaa 30 soluissa. Tämä malli tuntui osoittavan, että mutatoidun suhteellinen määrä verrattuna villityyppiseen p53:een voisi * · määrätä transformoitua ilmiasua, mutta geeniannosta ei voisi : tiukasti·valvoa näissä transfektiotutkimuksissa.

35 Tällaisten teknillisten kysymysten vuoksi sekä p53:n toiminnan lajispesifisten eroavuuksien mahdollisuuden että sen tosiasian vuoksi, että on kyseenalaista, ovatko transformoidut eläinsolut merkityksellisiä ihmisen uudiskasvulle, päätettiin, että p53:n biologiset ominaisuudet ihmisjärjes-40 telmässä pitäisi vahvistaa uudelleen. Käsitettiin, että 13 105014 para's mahdollinen isäntäsolu näitä tutkimuksia varten sallisi yksikopioisten mutatoitujen tai villityyppisten p53-alleelien koekäsittelyt. Kuitenkin ihmisen useimmat viljellyt solut sisältävät sisäsyntyisiä ja mahdollisesti mutatoi-5 tuja p53-alleeleja, joita ei voida ulkoisesti valvoa. Siksi valittiin ihraisen Saos-2-luusarkoomasolulinja, koska sillä ei ole sisäsyntyistä p53:a, koska koko sen geeni on hävinnyt. Hiiren Moloney-leukemiaviruksesta (Mo-MuLV) saatuja yhdistelmäretroviruksia käytettiin mutatoidun ja/tai vil-10 lityyppisen p53:n viemiseksi LTR-promoottorin valvonnan alaisuuteen. Infektion ja valinnan jälkeen eristetyissä soluklooneissa oli vain yksi liittynyt provirus jokaisesta tyypistä, ja analysoitiin useita klooneja paikkavaikutusten pois sulkemiseksi. Näiden kloonien biologisten ominaisuuk-15 sien laajaan arviointiin kuuluivat morfologia, kasvunopeudet ja kyllästystiheys viljelmässä, pesäkemuodostus pehmeässä agarissa ja kasvaimien synnyttämiskyky karvattomissa hiirissä .

20 Mutatoituneiden ja villityyppisten p53-yhdistelmäretrovirus-ten valmistaminen.

Viitevakiona ihmisen villityyppiselle p53:lle käytettiin Lambin ja 'Crawfordin (Mol. Cell. Biol. 6, 1370-1385 (1980) 25 genomista DNA-jaksoa. Mahdollisesti villityyppinen p53-cDNA eristettiin sikiön aivo-RNA:sta RT-PCR-menetelmän avulla, ja se kloonattiin plasmidiin. Kloonattaessa villityyppistä p53 (p53B) -cDNA:ta sekoitettiin noin 5 pg sikiön aivo-RNA:ta 1,5 pg oligo(dT)alukkeen ja 60 yksikön linnun myeloblas-30 tosis-viruksen käänteistranskriptaasin kanssa cDNA-puskuris-sa (50 mM Tris-HCl, pH 8,0, 80 mM KC1, 5 mM MgCl2, 1 mM dATP:tä, dGTP:tä, dTTP:tä ja dCTPitä). Reaktioseosta in-? kuboitiin 90 min 42°C:ssa. Reaktion jälkeen RNA pilkottiin 0,5 N NaOHrlla, ja yksijuosteinen cDNA saostettiin etanolil-35 la. PCR-monistus toteutettiin yhdelle kymmenesosa cDNA:lle, kun läsnä oli 100 ng jokaista oligonukleotidialuketta (5'-TGCAAGCTTTCCACGACGGTGACACGCT-3' ja 5'-AGTGCAGGCCAACTTGTTCAG-TGGA-3') ja 5 U Taq-polymeraasia PCR-puskurissa (50 mM KC1, 10 mM Tris-HCl, pH 8,3, 1,6 mM MgCl2 ja 0,001 % gelatiinia), 40 40 kierrosta ohjelmoitavassa lämpökompleksissa (Ericomp, San 14 105014

Diego, Kalifornia). Jokainen kierros sisälsi denaturaation 93°C:ssa 1 minuutin ajan, juosteiden uudelleen pariutumisen 62°C:ssa 80 sekunnin ajan, ja alukkeen pidennyksen 72°C:ssa 3 minuutin ajan. PCR-tuotteet uutettiin fenolilla ja saos-5 tettiin etanolilla. Sakka liuotettiin HzOrhon ja pilkottiin restriktioentsyymeillä (Hind III ja Sma I). p53cDNA-kappale kloonattiin kuljetinvirukseen, jolloin muodostettiin Vp53B-Neo. Kloonattu p53B sekvenssoitiin käyttämällä dideoksiket-junlopetusmenetelmää (Proc. Natl. Acad. Sei. USA 7_4, 5463 10 (1977)).

Yhdessä kloonissa oleva liittynyt DNA-kappale (nimitettiin p53B:ksi) sekvenssoitiin kokonaan (noin 1300 bp), jotta tuotaisiin ilmi päätelty aminohappojakso huolimatta kahdesta 15 merkityksettömästä nukleotidikorvautumisesta (kuvio IA).

Toinen p53cDNA-klooni (p53E), joka oli eristetty A431-levy-epiteelisyöpäsolulinjasta, sekvenssoitiin myös, ja sen havaittiin sisältävän pistemutaation 273-koodikolmikon kohdalla, joka korvasi Arg:n His:llä (kuvio IA). Tämä on 20 toiminnallisesti tärkeä mutaatio, joka on myös tunnistettu p53:sta kahdessa muussa kasvainsolulinjassa. Lisäksi neutraali jaksomonimuotoisuus 72-koodikolmikossa (kuvio IA) koodasi joko Arg:a (p53B) tai Pro:ta (p53E). Tämä yleinen aminohappomonimuotoisuus, jolla ei ole tunnettua toiminnal-25 lista merkitystä, johti siihen, että p53B-proteiini kulki nopeammin kuin p53E-proteiini SDS-PAGE:ssa, ja siksi sitä « käytettiin erottamaan nämä proteiinit, kun ne yhdessä ilmenivät samassa solussa.

30 Sitten p53E ja p53B liitettiin Mo-MuLV-pohjäiseen kuljetin-retrovirukseen, joka sisälsi neon valikoivana merkkigeeninä, jotta muodostettaisiin Vp53E-Neo- ja Vp53B-Neo-virusgenomit vastaavasti (kuvio IB). Jotta helpotettaisiin kaksoiskor-vautumista, tehtiin lisäksi Vp53B-Hygro liittämällä p53B 35 samanlaiseen kuljettimeen, joka sisälsi geenin, jonka tunnetaan antavan vastustuskyvyn hygromysiinille. Tuotettiin ; Vp53E-Neo-, Vp53B-Neo- ja Vp53B-Hygro-virusstokit käyttä- mällä hyväksi tavanomaisia menetelmiä, jolloin tiitterit olivat noin 1 x 109, 2 x 10« ja 1 x 109 vastaavasti. p53-40 proteiinien ilmeneminen viruksista vahvistettiin alussa is 105014 hiiren NIH3T3:sta saadussa PA12-pakkauslinjassa, jota käytettiin virustuotantoon. Ihmisen mutatoidut ja villityyp-piset p53-proteiinit saatiin selville niiden vastaavista virusta tuottavista soluista odotetun SDS~PAGE:ssa kulkeutu-5 miseron avulla (kuvio 2A). Koska p53:n spontaani mutaatio voi esiintyä usein viljellyissä soluissa, tutkittiin näiden p53-proteiinien kahta biokemiallista lisäominaisuutta. Nämä olivat niiden puoliintumisajät solussa ja niiden kyky sitoutua T-antigeeniin. p53D-proteiinin puoliintumisaika oli 20-10 30 minuuttia verrattuna p53E:n 4-5 tuntiin (kuvio 2B).

p53B-proteiinin puoliintumisaika vastasi julkaistuja raportteja villityyppisten ja mutatoitujen p53-proteiinien puoliintumisa joista . Kun virusta tuottavat solut oli transfek-toitu suuria määriä SV40:n T-antigeenia ilmentävällä plas-15 midilla ja lysaatit oli immunosaostettu anti-p53- tai anti-T-vasta-aineilla, saostui T-antigeeni yhdessä p53B:n kanssa, muttei p53E-proteiinin kanssa, mikä osoitti, että vain p53B-proteiini pystyi sitoutumaan T:hen. Nämä tulokset yhdessä näyttivät osoittavan, että p53B:tä sisältävät virukset 20 ilmensivät villityyppistä ja p53E:tä sisältävä virus ilmensi mutatöitua p53:a.

Ulkosyntyisen p53:n ilmeneminen luusarkoomasoluissa.

25 Saos-2-luusarkoomasolulinja, joka ei sisällä sisäsyntyistä p53:a, koska sen geeni on hävinnyt, antaa käyttöön puhtaan * taustan p53:n toimintatutkimuksille. Aikaisemmissa kokeissa Saos-2-solut, jotka oli infektoitu vain neomysiini- tai hygromysiini-vastustuskykygeeneja sisältävillä vanhemmais- 30 viruksilla, eivät osoittaneet muutoksia morfologiassa ja kasvunopeudessa verrattuna infektoimattomiin soluihin, mikä tuntuu osoittavan, että lääkevalinnalla ei ole merkittävää • vaikutusta niiden kasvainominaisuuksiin. Kun Saos-2-solut infektoitiin joko Vp53E-Neo:n, Vp53B-Xeo:n tai Vp53B-Hygro:n 35 vertailukelpoisilla tiittereillä sopivan valikoivan aineen läsnä ollessa, saatiin samanlaisia määriä lääkkeelle vastustuskykyisiä pesäkkeitä. Useimpia pesäkkeitä pystyi kasvattamaan yksittäin massaviljelmiksi, jolloin havaittiin, että Vp53B:llä infektoidut solut kasvoivat paljon hitaammin kuin 40 Vp53E:llä infektoidut solut. Vp53E:llä infektoidut kloonit . 16 105014 ilmensivät yhdenmukaisesti p53E-proteiinin korkeita tasoja (kuvio 3A). Noin 80 % 30 tutkitusta Vp53B:llä infektoidusta kloonista ilmensi osoitettavissa olevaa p53B-proteiinia (kuvio 3B). Sekä Vp53E-Neo:sta että Vp53B-Hygro:sta valit-5 tiin satunnaisesti kaksi kloonia toisella viruksella infektoimista varten, ja eristettiin kaksoisinfektoidut kloonit ja niitä kasvatettiin kuten yllä. Näissä klooneissa p53E- ja p53B-proteiini ilmenivät yhdessä (kuvio 3C). Jotta uudelleen vahvistettaisiin, ettei p53B-proteiini ole sekundaarisesti 10 mutatoitunut näissä soluissa, transfektoitiin p53:tä ilmentävät kloonit SV40-antigeeniplasmidilla, ja lysaatit immunosaostettiin, kuten on selitetty yllä (kuvio 4). Anti-p53-vasta-aine saostui yhdessä T:n kanssa jokaisessa kloonissa, mutta anti-T-vasta-aine saostui vain yhdessä p53B:n 15 kanssa, vaikka solut ilmensivät sekä p53B:tä että p53E:tä.

Saos-2:ssa olevan p53B:n puoliintumisaika mitattiin myös ja se oli samanlainen kuin p53B:n puoliintumisaika PA 12 -; soluissa. Nämä tiedot jälleen tukevat havaintoa, jonka - mukaan Vp53B:llä infektoidut Saos-2-kloonit ilmensivät 20 villityyppistä p53:a.

Mutatoitu p53 antoi viljelmässä rajoitetun kasvuedun Saos-2-soluille.

25 Viittä satunnaisesti valittua kloonia, jotka pysyvästi ilmensivät p53E-proteiinia (p53EN-l:stä p53EN-5:een), verrattiin vanhemmaissoluihin morfologian (kuvio 5), kasvunopeuden (kahdentumisaikoina, kuvio 6A), kyllästystiheyden (kuvio 6B), pesäkkeiden muodostumisen pehmeässä agarissa ja 30 karvattomille hiirille kasvainten aiheuttamiskyvyn muodossa, jotka määritettiin. Taulukoissa 1 ja 2 on taulukoitu tulokset pesäkkeiden muodostamisesta pehmeässä agarissa ja karvattomille hiirille kasvainten aiheuttamiskyvystä vastaavasti. . - t

Taulukko 1 105014 p53-viruksella infektoitunen Saos-2-solujen pesäkkeiden muodostus pehmeässä agarissa 5 ympätty solumäärä l.OxlO5 2.5X104 viruksella - 10 infektoidut pesäkemäärä p53:n ilmeneminen solut vanhemmais- solut 392/388 104/76 Ei 15 p53EN-l 928/968 396/372 Mutatoitu p53EN-2 517/593 121/105 Mutatoitu p53EN-3 485/534 96/123 Mutatoitu p53EN-4 445/498 106/121 Mutatoitu 20 p53EN-5 582/441 132/172 Mutatoitu p53BN-l <1/<1 <1/<1 Vi11ityyppinen P53BN-2 <1/<1 <1/<1 Vi11ityyppinen p53BN-3 <1/<1 <1/<1 Vi11ityyppinen 25 p53BN-4 <1/<1 <1/<1 Vi11ityyppinen p53BNrR 414/384 54/48 Ei p53BH-l <1/<1 <1/<1 V ί 11 i t y y ppi nen 30 p53BH-2 <1/<1 <1/<1 Vi11ityyppinen p53BH-3 _ <1/<1 <1/<1 Vi11ityyppinen p53EN-l-BH-l <1/<1 <1/<1 Mutatoitu/Vi11ityyppinen p53EN-l-BH-2^ <1/<1 <1/<1 Mutatoitu/Vi11ityyppinen 35 p53EN-l-BH-3 ' <1/<1 <1/<1 Muta toitu/Vi11ityyppinen p53EN-2-BH-l <1/<1 <1/<1 Mutatoitu/Vi11ityyppinen p53EN-2-BH-2 <1/<1 <1/<1 Mu t a t oi t u/V i 11 i t y y pp i nen 40 <10516-02.208> 1β 105014

Taulukko 2 p53-viruksella infektoitunen Saos-2-solujen kasvaimien aiheuttamiskyky 5 _

Hiirien määrä, joilla on kasvain

Viruksella _ p53- 10 infektoidut Ruiskutettujen hiirien määrä ilmeneminen solut 15 Vanhemmais 10/10 ei p53EN 12/12 mutatoitu p53BN 0/5 villityyppi 20 p53BH 0/6 villityyppi P53BN-R 3/3 ei p53EN-BH ' 0/5 mutatoitu/ 25 villityyppi

Morfologiaero havaittiin vain solujen kerääntymisolosuhteis-30 sa, jolloin EN-kloonien solut olivat paljon pienempiä ja valontaittokykyisempiä kuin vanhemmaissolut (kuvio 5B). Vastaavuussuhteessa edellisen kyllästystiheys oli 4-5 kertaa suurempi kuin vanhemmaissolujen kyllästystiheys (kuvio 6B). Tämä suhteellinen kasvuetu nähtiin huolimatta 35 samanlaisista kahdentumisajoista, jotka mitattiin niukoissa kasvuolosuhteissa (kuvio 6A). Neljä EN-kloonia ja vanhemmaissolut olivat yhtä tehokkaita pesäkkeiden muodostamisessa pehmeässä agarissa (taulukko 1) ja karvattomille hiirille kasvainten synnyttämiskyvyssä (taulukko 2). Yhdellä kloonil-40 la, p53EN-l:llä, oli huomattavasti lisääntynyt kyky molem- 19 105014 missä suhteissa; erityisesti se luotettavasti muodosti suuria kasvaimia jopa vain 5 x 105 ruiskutetusta solusta. Tätä poikkeavuutta pidettiin klonaalisen vaihtelevuuden rajoissa olevana, jota odotetaan olevan kasvainsolujen 5 parissa. Yhteenvetona nämä tulokset näyttivät osoittavan, että mutatoitu p53 toimi villityyppisen p53:n poissa ollessa antaen rajoitetun kasvuedun (korkeamman kyllästystiheyden) viljelmässä oleville Saos-2-soluille. Kasvainilmiasun monissa muissa puolissa pistemutaation sisältävän p53:n läsnäolo 10 olennaisesti vastasi p53:n täydellistä poissaoloa.

Villityyppinen p53 esti Saos-2-solujen kasvainominaisuuksia.

Verrattuna Saos-2-vanhemmaissoluihin p53B:tä ilmentävät 15 kloonit olivat aina suurentuneita ja litteitä (kuvio 5) ja viljelmässä niillä oli pidentyneet kahdentumisajät eli noin 70 tuntia pikemmin kuin 30-3G tuntia, kuten vanhemmais- tai EN-soluilla (kuvio 6A) . Merkittävää oli, että pesäkkeiden muodostumistehokkuus pehmeässä agarissa väheni yhden osoi-20 tettavan pesäkkeen kynnyksen alle, kun taas vanhemmaissolut ja EN-solut muodostivat satoja pesäkkeitä samoissa olosuhteissa (taulukko 1). 1 x 107 solun ruiskuttaminen jokaisesta seitsemästä p53B:tä ilmentävästä kloonista karvattomien hiirien kylkiin ei johtanut kasvainten muodostumiseen 8-10 25 viikon kuluttua, vaikkakin sama määrä vanhemmais- tai p53E:tä ilmentäviä soluja muodosti kasvaimia kaikissa vas-tapuolisissa kyljissä (taulukko 2). Näitä havaintoja ei voinut selittää virusinfektion ja valinnan omalaatuisella vaikutuksella, koska Vp53B-Neo:11a infektoiduista soluista, 30 joista puuttui osoitettava p53B:n ilmeneminen, saadulla yhdellä kloonilla, Vp53BN-R:llä, oli vanhemmaissoluista erottumaton ilmiasu (taulukot 1 ja 2). p53B:n aiheuttama noin 50 % viljeltyjen Saos-2-solujen kasvunopeuden väheneminen oli riittämätön selittämään kasvaimien synnyttämiskyvyn 35 ja pehmeässä agarissa pesäkkeiden muodostumisen täydellisen menetyksen, mikä merkitsee, että villityyppinen p53 erityisesti esti näiden solujen kasvainilmiasua. Nämä tulokset näyttivät osoittavan, että villityyppisen p53:n menetys oli merkittävä tapahtuma yhdessä mutatoitujen sisäsyntyisten 40 p53-geenien kanssa tämän kasvainlinjän ja laajassa merki- 20 105014 tyksessä muiden luusarkoomien syntymisen aikana.

Villityyppinen p53 oli vallitseva mutatoidun p53:n suhteen kaksialleelimuodossa.

5

Koska sekä mutatoitu että villityyppinen p53-proteiini olivat ilmeisesti toimivia Saos-2-soluissa, oli kiinnostavaa määrittää, voisivatko molemmat toiminnat ilmetä yhdessä samanaikaisesti, kumosivatko ne toisensa, vai oliko yksi 10 toiminta selvästi vallitseva toisen suhteen. Yhden villi-tyyppisen ja yhden mutatoidun alleelin muoto oli merkityksellisin ihmisen luonnollisessa kasvaimien synnyssä, koska tämä on välttämätön välivaihe, kun villityyppinen p53 menetetään täydellisesti. Kahden eri p53E:tä ilmentävän kloonin 15 infektoiminen Vp53B-Hygro:11a sai aikaan 22 hygromysiinille vastustuskykyistä kloonia, joista 15 ilmensi sekä p53B:tä että p53E:tä. Jotta määritettäisiin näissä klooneissa olevan jokaisen viruksen liittyneiden kopioiden määrä, Vp53B-Hyg-ro:lla infektoiduista p53EN-l-soluista saatujen kolmen 20 kloonin genomin DNA analysoitiin Southern blotting -menetelmän avulla (kuvio 7). Hybridisaatio neo-koettimella osoitti yhden, yleisen liitoskappaleen kaikissa kolmessa kloonissa, mikä osoitti p53EN-l-soluissa olevan yhden liittyneen Vp53E-Neo-kopion (kuvio 7A). Hybridisaatio hygro:lla osoitti 25 yhden, ainutlaatuisen liitoskappaleen jokaisessa kloonissa, mikä osoitti pS3EN-BH-klooneissa olevan yhden, riippumat-tomasti liittyneen Vp53B-Hygro-kopion (kuvio 7B). Yhdet liittymiset· olivat odotettuja perustuen sukulaisyhdistelmä-retroviruksen aikaisempaan käyttöön, kun kaikki tiitterit 30 olivat vertailukelpoisia. Nämä havainnot vahvistivat, että p53EN-BH-kloonit todella sisälsivät jokaisen viruksen yhden liittyneen kopion ja, että molempia ulkosyntyisiä geenejä ilmennettiin (kuvio 3). Tunnusmerkkien - morfologian, kasvunopeuden, kyllästystiheyden, pehmeässä agarissa pesäkkei-35 den muodostumisen ja karvattomille hiirille kasvaimien synnyttämiskyvyn - perusteella olivat kaksoiskorvautumis-kloonit erottumattomia vain p53B:tä ilmentävistä klooneista (kuviot 5 ja 6, taulukot 1 ja 2). Toisessa järjestyksessä infektoimalla saaduilla soluilla eli Vp53E-Neo:11a infek-40 toiduilla p53B:tä ilmentävillä soluilla oli sama ilmiasu.

2i 105014

Villityyppisen p53:n toiminnan täydellinen vallitsevuus havaittiin huolimatta siitä, että näissä soluissa oli vil-lityyppistä noin 10 kertaa vähemmän kuin mutatoitua p53:a (kuvio 3). Nämä tulokset osoittavat, että p53 voi myötävai-5 kuttaa kasvaimien syntyyn vain molempien villityyppisten alleelien menetyksen jälkeen. Ne myös osoittavat, että villityyppisen p53:n palauttamisella kasvainsoluihin voi olla estävä vaikutus, vaikka mutatoidut p53-alleelit ovat läsnä.

10 p53:n toiminta kasvaimien estäjänä.

Villityyppisen p53:n vieminen ihmisen luusarkoomasolujen sisään, joissa p53 ei ilmennyt, esti selvästi niiden kas-15 vainilmiasua, mikä osoitti, että p53 voi toimia kasvaimia estävänä geeninä tässä järjestelmässä. Päinvastoin mutatoi-dun p53:n liittäminen näihin soluihin lisäsi niiden viljelmässä kasvun yhtä näkökohtaa (kyllästystiheyttä), sillä tavalla osoittaen, että mutatoitu p53 pitää yllä rajoitettua 20 toimintaa, vaikka villityyppinen p53 kumosi yhden toiminnan. Nämä tulokset vastaavat suurin piirtein muiden tutkijoiden tuloksia, jotka ovat osoittaneet hiiren villityyppisen p53:n vaikutuksen rotan alkion fibroblastien syöpägeenin välittämään transformaatioon. Näissä tutkimuksissa villityyppisen 25 p53-geenin sisältävän plasmidi-DNA:n yhteistransfektio vähensi selvästi useiden aktivoitujen syöpägeenien transfor- « maatiotehokkuutta joko yksin tai yhdistelmissä, kuten ras + myc tai ras' + E1A. Mutatoidulla p53:lla ei ollut tällaista estävää vaikutusta ja se sen sijaan kohtuullisesti edisti 30 transformaatiotehokkuutta. Villityyppinen p53 oli myös tehokas vähentämään mutatoidun p53:n aiheuttamaa transformaatiota yksissä neuvoin muiden syöpägeenien kanssa, mikä tuntuu osoittavan villityyppisen estotoiminnan "vallitsevuutta". Pesäkkeet, jotka toipuivat villityyppisellä pöllö DNA:lla transfektoimisen jälkeen, joko epäonnistuivat ilmentämään ulkosyntyistä p53:a tai ilmensivät vain mutatoitua p53:a.

Täten ilmeni, että ulkosyntyisen, villityyppisen p53:n 40 ilmeneminen oli yhteen sopimaton transformoitujen pesäkkei- 22 105014 den muodostumisen kanssa. Nämä tiedot antoivat ymmärtää, että hiiren villityyppinen p53 voisi toimia transformoitujen solujen estäjänä, vaikka villityyppisen p53:n epäspesifistä, myrkyllistä vaikutusta ei helposti suljettu ulkopuolelle.

5 Päinvastoin tämän keksinnön kehittämisessä käytettiin hyväksi transformoituja soluja, ja saatiin kasvavia klooneja, joilla oli muuttunut ilmiasu ja jotka pysyvästi ilmensivät ulkosyntyistä, villityyppistä p53:a. Nämä tiedot ihmisso-luista ja aikaisemmat tutkimukset hiirestä yhdessä osoit-; 10 tavat, että p53:n kasvaimia estävä toiminta on spesifinen ja perustavaa laatua oleva ominaisuus, joka on säilynyt yli lajirajojen.

p53-mutaation luonne.

15

On tunnettua, että monista viljellyistä solulinjoista kloonatuilla hiiren p53-geeneillä on pistemutaatioita, jotka kerääntyvät viidelle säilyneelle alueelle. Tämä mutaatio-luokka oli vastuussa alkuvaikutelmasta, jonka mukaan p53 oli 20 vallitseva syöpägeeni, koska tällaiset p53-DNA-kappaleet tai rakenteet olivat aktiivisia jyrsijäsolujen transformaation edistämisessä eri kokeissa. Lisäksi mutatoitujen p53~geenien proteiinituotteilla on yhteisiä antigeenisiä ja biokemiallisia tunnusomaisia piirteitä, jotka ovat erilaisia kuin 25 villityyppisen p53-proteiinin, mukaan lukien pidentynyt puoliintumisaika, joka johtaa epänormaalin korkeisiin solun p53-proteiinitasoihin. Nämä piirteet täysin muistuttavat muita vallitsevia syöpägeenejä, kuten mvc:ä ja ras:a. Toisaalta p53-geenin suuria häviämiä tai uudelleen järjestely-30 jä, jotka ovat yhteen sopimattomia geenituotteen ilmenemisen kanssa, on löydetty Friend-viruksella indusoiduista hiiren varhais-puna- ja valkosoluveritaudeista (Nature 314, 633-636 (1985)).’Näitä mutaatioita pidetään tunnusomaisina niin kutsutuille kasvaimia estäville geeneille ja mutaatiot 35 tekevät tehottomaksi niiden normaalin toiminnan. Jotta selitettäisiin, miten molemman tyyppiset mutaatiot voisivat antaa saman kasvaimia synnyttävän ilmiasun, ehdotettiin, että villityyppinen p53 todella toimi kasvaimien muodostumisen estämiseksi ja, että monet tunnetut p53:n pistemu-ϊ 40 taatiot itse asiassa tekivät tehottomaksi tämän toiminnan.

. 23 1 0 5 0 1 4

Jotta selitettäisiin primaarisoluissa olevien mutatoitujen p53-geenien vallitseva transformoiva toiminta, oli välttämätöntä esittää hypoteesi siitä, että mutatoitu p53-proteiini jollain tavalla teki tehottomaksi sisäsyntyisen, villityyp-5 pisen p53-proteiinin. Estävät vuorovaikutukset mutatoitujen ja villityyppisten proteiinien välillä saattaisivat aiheuttaa tämän "vallitsevan negatiivisen" vaikutuksen (Nature, 329, 219-222 (1987)). Transfektion tekniset haitat ja primaarisoluissa olevan sisäsyntyisen p53:n epävarma rooli 10 rajoittivat näiden tutkimusten lisätulkintoja.

Vogelstein ja kolleegat ovat osoittaneet hienoissa tutkimuksissaan, että ihmisjärjestelmässä p53:n häviämät ja pis-temutaatiot voivat yhdessä olla colorektaalisissa, keuhko-15 tai rintakarsinoomissa. Monimuotoisten merkkigeenien hetero-tsygoottisuuden menetys 17p-kromosomialueella nähdään usein näissä kasvaimissa, mikä vastaa p53-geenin yhden kopion menetystä (häviämän tai mitoosin aikana tapahtuvan kromosomien epätasaisen jakautumisen avulla). Somaattiset pistemu-20 taatiot säilyneellä alueella usein vaikuttavat jäljelle jääneeseen p53-alleeliin. Lopputulos on molempien villityyppisten p53-alleelien menetys kasvainsoluista. Molempien p53-alleelien häviämiä esiintyy myös ihmisen luusarkoomissa ja maksasolusyövissä. Villityyppisten alleelien täydellinen 25 menetys on retinoblastoomageenihavaintoja hyvin vastaava ja . tukee ideaa, jonka mukaan p53 on kasvaimia estävä geeni.

Nigro ym., J. M. Nigro et ai., Nature 342, 705-708 (1989), selittivät kuitenkin yhtä colorektaalikarsinoomaa, joka ilmensi sekä mutatoituja (Asp281 --> Gly) että villityyp-30 pisiä p53-alleeleja. Tämän kasvaimen olemassaolon tulkittiin suosivan yhden mutatoidun p53-alleelin kasvaimia synnyttävää ' toimintaa villityyppisen p53:n läsnäollessa; toisen vil- lityyppisen alleelin menetys avustaisi kasvaimen edistymis-• tä.

35 Tässä keksinnössä on havaittu, että Saos-2-solujen, joissa oli yksikopioisia villityyppisiä ja mutatoituja p53-alleele-ja, ilmiasu oli erottumaton soluista, jotka ilmensivät pelkästään villityyppistä p53:a, mikä tuntuu osoittavan, 40 että villityyppinen p53 on vallitseva mutatoidun p53:n 24 105014 suhteen kaksialleelimuodossa. Kun tunnetaan tämä tulos, voidaan ottaa huomioon muita selityksiä poikkeavalle pak-susuolikarsinoomatapaukselle: 1) vangittiin sattumalta p53-mutaation välivaihe ja p53 ei ollut vielä myötävaikuttanut 5 tämän kasvaimen kasvainominaisuuksiin; ja 2) tässä kasvaimessa olevassa "villityyppisessä" p53-alleelissa oli itse asiassa toiminnallisesti tärkeä mutaatio sekvenssoidun alueen ulkopuolella (eksonit 5-9), Toisaalta on mahdollista, että tietyt mutatoidut p53-alleelit käyttäytyvät eri tavalla 10 kuin toiset, tai että mutatoidut p53-alleelit toimivat eri tavalla muissa kasvainsolutyypeissä kuin meidän Saos-2-mallijärjestelmässä. Nämä mahdollisuudet voidaan osoittaa toistamalla kokeet toisilla mutatoiduilla p53-geeneillä ja muilla p53-negatiivisilla soluilla.

15

Villityyppisen ja mutatoidun p53:n vuorovaikutuksen aikaisempien tutkimusten epäselvyys on luonut varjon olennaiselle kysymykselle: onko p53 täysin toimimaton eli onko se vastaava sen täydelliselle häviämälle, vai säilyttääkö se 20 jonkin rajoitetun toiminnan? On päätelty, että jälkimmäinen tapaus on todennäköisempi. Mutatoidun p53:n yksi kopio lisäsi Saos-2-solujen kyllästystiheyttä ja tietysti tätä vaikutusta ei voinut välittää sisäsyntyisen p53:n tehottomaksi tekeminen. Samoin Wolf ym. (Cell 38., 119-126 (1984)) 25 veivät todennäköisesti mutatoidun p53-geenin hiiren AB-MuLV-transformoitujen solujen sisään, joista puuttui sisäsyntyisen p53:n ilmeneminen, ja havaitsivat, että niiden kasvaimia synnyttävät mahdollisuudet lisääntyivät. Siksi mutatoidut p53-alleelit voivat antaa kasvuedun tai pahanlaatui-30 semman ilmiasun in vivo kasvainsoluille, joilla ei ole villityyppistä p53:a.

Havainnot siitä, että mutatoidulla p53:lla on biologinen toiminta ja, että sen toiminta on väistyvää villityyppisen 35 p53:n toiminnan suhteen, ovat yhteen sopimattomia vallisevan negatiivisen vaikutuksen hypoteesin kanssa, ainakin, kun sitä sovelletaan ihmisen luonnolliseen kasvaimien syntyyn. Hiiren mutatoitujen p53-alleelien vallitsevat transformoivat ominaisuudet voivat johtua transfektoimalla solujen sisään 40 vietyjen geenien kopioiden suurista määristä ja siitä seu- . 25 105014 raavasta mutatoidun p53:n valtavasta yli-ilmenemisestä. Näissä olosuhteissa jopa sen rajoitettu luontainen toiminta voi olla riittävä myötävaikuttamaan transformoituun ilmiasuun.

5 p53-toiminnan mekanismit.

p53:n fysiologiset tai biokemialliset toiminnat tunnetaan nyt varmasti. Transformoimattomissa soluissa p53-synteesi ja 10 lRNA-transkriptio lisääntyvät dramaattisesti Go/Gi:stä S-vaiheeseen siirtymisen aikana, mikä epäsuorasti näyttää osoittavan roolin solujen jakautumiskierron säätelyssä.

Tuore todiste myös osoittaa mahdollisesti liittyvään toimintaan DNA:n kahdentumisen säätelyssä. Tutkimukset kasvainil-15 miasun estosta saattavat antaa käyttöön yleiset parametrit p53:n normaalin toiminnan ymmärtämiselle. On esimerkiksi selvää, että p53:a ei tarvita solujen jakautumiskierron edistymistä varten, eikä se välttämättä estä solun kasvua ja jakautumista. Siksi se saattaa osallistua näiden solun 20 perustapahtumasarjojen säätelyyn reaktiona ulkopuoliselle kasvu- tai erilaistumissignaaleille. Villityyppinen ja mutatoitu p53 voivat erota toisistaan yhden aminohapon verran ja kuitenkin niillä on solussa vastakkaiset toiminnat. Yhtä "suuren geeniannoksen olosuhteissa villityyppinen 25 p53 pystyy kumoamaan mutatoidun p53:n vaikutuksen huolimatta jälkimmäisen lO-kertaisesta molaarisesta ylimäärästä. Nämä havainnot voidaan selittää villityyppisen ja mutatoidun p53:n kilpailulla solun yleisistä kohteista, joille villityyppinen p53 on paljon ahneempi. Tässä mallissa villi-30 tyyppinen ja mutatoitu p53 lähettäisivät vastakkaisia kasvusignaaleja näihin kohteisiin, jolloin p53:n puuttuminen kokonaan olisi ehkä välisignaali. Vaihtoehtoisesti mutatoitu p53 voi toimia riippumattomassa ketjussa edistäen kasvainil-miasun valikoivia piirteitä.

35 p53:n tehottomaksi tekemisen geneettiset mekanismit.

, Villityypin vallitsevuus mutatoidun p53:n suhteen kaksial- leelimuodossa merkitsee, että täytyy menettää molemmat 40 villityyppiset p53-alleelit kasvaimia synnyttävää vaikutusta 105014 varten. Tässä suhteessa p53 on yhdenmukainen kasvaimia estävän geenin tehottomaksi tekemisen mallin kanssa, joka voidaan ymmärtää retinoblastoomageenin tapauksessa. Tässä suhteessa voidaan viitata haussa oleviin hakemuksiin Retino-5 blastoomageeni syöpää estävä ja säätelijä, sarjanumero 108,748, jätetty 15. lokakuuta, 1987 ja Kasvainilmiasun tukahduttaminen, sarjanumero 265,829, jätetty 31. lokakuuta, 1988. RB-geenituotteen täydellinen menetys on toistaiseksi yleistä retinoblastoomissa, ja villityyppisten ja mutatoitu-10 jen RB-alleelien ei ole havaittu olevan yhdessä kasvain-soluissa. Nämä havainnot näyttävät osoittavan, että RB myötävaikuttaa kasvaimien syntyyn vain, kun se on tehty täysin tehottomaksi. Toisaalta monissa kasvainsoluissa RB ilmenee normaalisti ja ne ovat uudiskasvuisia luultavasti 15 muissa geeneissä olevien mutaatioiden vuoksi. Ulkosyntyisen lisä-RB:n sisään viemisellä tällaisten RB-r-kasvainsolujen sisään on vähän tai ei lainkaan vaikutusta; esimerkiksi on havaittu, ettei tunneta RB+U20S~luusarkoomasolulinjoja, joilla olisi villityyppisiä p53-alleeleja. Tähän päivään 20 mennessä saadut tulokset osoittavat, että p53:lla on laaja estotöiminta ihmisen useissa eri kasvaintyypeissä. Täten ulkosyntyisen RB:n tai p53:n estovaikutus voi esiintyä vain kasvainsoluissa, joissa on tehottomaksi tehtyjä RB- tai p53-geenejä. Nämä RB:n ja p53:n yhteiset ominaisuudet vahvis-25 tavat kasvaimia estävä geeni -käsitettä, joka sisältää mahdollisen kliinisen hyödyn, kun ne korvataan sopivissa kasvainsoluissa.

Yhteenveto.

30 p53:a, solun 53 kD proteiinia, koodaavan geenin mutaatioita löydetään usein ihmisen kasvainsoluista, mikä näyttää osoit-: tavan ratkaisevan roolin tälle geenille ihmisen kasvaimen synnyssä. Jotta suunniteltaisiin p53-alleelien mutaatio tai 35 molempien p53-alleelien menetys ihmisen kasvaimen synnyn aikana, käytettiin hyväksi ihmisen Saos-2-luusarkoomasolu-linjaa, jolta puuttui sisäsyntyinen p53 koko geenin häviämän vuoksi. Sitten yksikopioisia ulkosyntyisiä p53-geenejä : vietiin solujen sisään infektoimalla solut yhdistelmäretro- * 40 viruksilla, jotka sisälsivät p53cDNA-jakson joko villityyp- 27 105014 pisiä tai pistemutatoituja versioita. Havaittiin, että 1) villityyppisen p53:n ilmeneminen estää Saos-2-solujen kas-vainilmiasua; 2) mutatoidun p53:n ilmeneminen antaa rajoitetun kasvuedun soluille villityyppisen p53:n poissaollessa; 5 ja 3) villityyppisen p53:n ilmiasu on vallitseva mutatoidun p53:n suhteen kaksialleelimuodossa. Kuten retinoblastooma-geenin osalta, nämä tulokset osoittavat, että p53-geenin molempien alleelien mutaatio on olennaista sen roolille kasvaimen synnyssä.

10

Vaikka tämä keksintö koskee tiettyjä suoritusmuotoja, on selvää, että monet eri muunnokset ovat mahdollisia ja niitä tarkastellaan liitteenä olevien patenttivaatimusten todellisessa hengessä ja rajoissa. Siksi ei ole tarkoitus rajoit-15 taa tässä esitettyä tarkkaa tiivistelmää tai paljastusta.

Claims (5)

1. Menetelmä lääkkeen valmistamiseksi, jota käytetään estämään syöpäsolun neoplastista ilmiasua, jossa syöpäsolussa ei ole sisäsyntyistä villityypin p53 proteiinia, kyseisen menetelmän käsittäessä taulukon 3 sekvenssin sislrävän 5 villityypin p53 geenin sekoittamisen farmaseuttisesti hyväksyttävään kantajaan.

2. Process enligt krav 1, i vilken process den naturliga p53-genen är införlivad i en retrovirusvektor.

2. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmä, jossa villi-tyypin p53 geeni sisältyy retrovirusvektoriin. 10

3. Process enligt krav 1, i vilken process cancercellen utan endogent naturligt p53-protein saknar den naturliga p53-tumörsuppressorgenen.

3· Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmä, jossa syöpäsolusta, jossa ei ole sisäsyntyistä villityypin p53 proteiinia, puuttuu villityypin p53 kasvaimia estävä geeni.

4. Process enligt krav 1, i vilken process cancercellen utan endogent naturligt p53-protein innehäller en muterad p53-tumörsuppressorgen.

4. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmä, jossa syöpä solulla, jossa ei ole sisäsyntyistä villityypin p53 proteiinia, on mutatoitunut p53 syöpää ehkäisevä geeni.

5. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmä, jossa syöpä-20 solu, jossa ei ole sisäsyntyistä villityypin p53 proteiinia, on luusarkoomasolu, keuhkokarsinoomasolu, imukudos-kasvainsolu, leukemiasolu, pehmeän kudoksen sarkoomasolu, rintakarsinoomasolu, rakkokarsinoomasolu tai eturauhas-karSinoomasolu. • I t = 9 ’ 29 105014 X. Process för framställning av läkemedel för användning vid hämning av den neoplastiska fenotypen av en cancercell utan endogent naturligt p53-protein, varvid processen innefattar blandandet av den naturliga p53-genen innefattande den sekvens som visas i tabell 3 med en farmaceutisk acceptabel bärare.

5. Process enligt krav 1, i vilken process cancercellen utan endogent naturligt p53-protein är en osteosarkomcell, en lungkarcinomcell, en lymfomcell, en leukemicell, en mjukdelssarkomcell, en bröstkarcinomcell7 en bläskarcinomcell eller en prostatakarcinomcell. « 9 · «