CZ291533B6 - Deriváty proteinu p62, nukleové kyseliny kódující tyto deriváty a farmaceutické kompozice, které je obsahují - Google Patents

Abstract

eÜen se t²k nov²ch polypeptid , deriv t proteinu p62, ozna en²ch jako .DELTA.p62 nebo .DELTA.Sam68, a jejich variant, a nukleov²ch kyselin, kter je k duj . D le se t²k farmaceutick kompozice, kter obsahuje deriv t p62 nebo k duj c nukleovou kyselinu, a kter je ur ena k l en rakovinn²ch onemocn n , zejm na metodami genov terapie.\

Description

Deriváty proteinu p62, nukleové kyseliny kódující tyto deriváty a farmaceutické kompozice, které je obsahují

Oblast techniky

Vynález se týká nových polypeptidů, derivátů proteinu p62 ajejich variant, a nukleových kyselin, které je kódují. Dále se týká farmaceutické kompozice, která obsahuje derivát p62 nebo odpovídající kódující nukleovou kyselinu, a která je určena k léčení rakovinných onemocnění, zejména metodami genové terapie.

Dosavadní stav techniky

Různé geny, nazývané onkogeny a geny supresory, se podílejí na kontrole buněčného dělení. Z nich geny ras ajejich produkty označované všeobecně jako proteiny p21, hrají klíčovou úlohu v procesu kontroly buněčného množení u všech eukaryotických organismů, u kterých byly sledovány. Bylo prokázáno, že některé specifické modifikace těchto proteinů u nich zapříčiňují ztrátu jejich normální kontroly a podílejí se tak na tom, že se mění na onkogenické. Značný počet tumorů zjištěných u lidí byl dáván do souvislosti s přítomností těchto modifikovaných genů ras. Rovněž tak určitá superexprese těchto proteinů p21 může vést k narušení buněčného množení. Pochopení přesné úlohy těchto proteinů p21 v buňkách, jejich funkce ajejich charakteristiky je základním problémem pochopení a terapeutiky kancerogeneze.

V případě in vivo neznáme přesnou povahu těchto procesů odpovědných za přenos signálu iniciovaného proteiny p21. Nicméně, stále vyšší počet výsledků zdůrazňuje četnost efektorů, které jsou v přímé a preferenční interakci s aktivní formou (vázanou na GTP) proteinů ras. Z těchto efektorů byl protein GAP první, jehož implikace do procesu přenosu signálu byla podrobně zdokumentována, jedná se o cytosolický protein přítomný ve všech eukaryotických organismech, který má schopnost výrazně urychlovat hydrolýzu GTP vázaného na normální protein. Vykazuje dvě oblasti zajišťující rozdílné funkce, jeho karboxy-terminální konec zahrnuje katalytickou aktivitu, která je v interakci s proteiny p21 a která zvyšuje jejich GTPasovou aktivitu GTPase. na jeho druhém konci pod N-terminálním koncem zaznamenáváme juxtapozici oblastí SH2 a SH3, které se podílejí na přenosu signálu a jsou v interakci s dalšími proteiny. Mezi těmito proteiny jsou dva proteiny, p62 a pl90, respektive 62kDa a 190 kDa, které jsou výrazně fosforylovány na tyrosin. Tyto dva proteiny tvoří specifický komplex s GAP a jsou imunoprecipitovány protilátkami zaměřenými proti různým epitopům GAP. Je známo, že právě na úrovni oblastí SH2 GAP probíhají interakce proteinu p62 s GAP. Aminokyseliny 271 až 443 proteinu p62 obsahují fosforylované tyrosiny a podílejí se pravděpodobně na těchto interakcích. Stejné fosforylace se pravděpodobně podílejí na interakcích mezi proteinem p62 a adaptérem GRB2. Na druhé straně, v celém rozsahu sekvence proteinu p62, jsou rozložena místa obohacená proliny, která se podílejí na vazbě na oblasti SH3 tyrosin-kináz rodiny src jakož i fosfolipázy C.

Protein p62 (nebo Sam68) byl identifikován Wongem (Cell 69 (1992) 551). Obsahuje 443 aminokyselin, jejichž sekvence byla popsána v odborné literatuře (viz SEQ ID č. 1). kromě výše uvedené charakteristiky vykazuje protein p62 některé znaky vlastní hnRPN („heterogeneous nuclear RiboNucleoProtein“):

- je bohatý na glyciny,

- obsahuje oblasti bohaté na argininy,

- navíc pak jeho aminokyseliny 145 až 247 definují oblast výrazně homologovanou svýše popsaným hnRNP, totiž GRP33.

- 1 CZ 291533 B6

Tato oblast zahrnuje místo vazby na sRNA homologní s místem obsaženým v HnRNP K. Toto místo je označeno jako KH oblast (KH = hnRNPK Homolog). Uchovaná rezidua jsou podstatná pro vazbu na sRNA a vliv nulové integrity této oblasti v patologii byl prokázán pro FMR1, což je produkt genu uváděného do souvislosti s mentální retardací, který je pozorován v X-vratkého syndromu (Siomi, Cell77 (1994) 33).

Podstata vynálezu

Předkládaný vynález spočívá především v prokázání významu proteinu p62 (Sam68) pro množení a ničení buněk, vychází zejména z prokázání skutečnosti, že deriváty proteinu p62 jsou schopné zasahovat do procesu buněčné transformace a zejména pak inhibovat signály přenášené proteiny ras a src. Dále pak výchozí z překvapivého prokázání skutečnosti, že tyto deriváty mají rovněž apoptotické vlastnosti a že jsou tedy schopné indukovat smrt buněk.

První předmět předkládaného vynálezu se týká derivátu proteinu p62, který je schopen inhibovat alespoň částečně interakci mezi proteinem GAP a p62. Deriváty podle předkládaného vynálezu jsou schopné přednostně inhibovat alespoň do jisté míry onkogenní schopnost proteinů a/nebo src. Ještě výrazněji preferenčně jsou deriváty podle vynálezu schopné indukovat smrt buněk apoptózou. Deriváty podle vynálezu jsou charakterizovány ztrátou schopnosti spolupůsobit s RNA p62.

Předkládaný vynález popisuje zejména prokázání, klonování a charakteristiku přirozené izoformy proteinu p62. Tato izoforma označená jako Δρ62 (nebo ASam68) vykazuje deleci v oblasti homologie s proteinem GRP33, který pokrývá oblast KH. Na základě této delece polypeptid Δρ62 postrádá integralitu vlastností proteinu p62. Takže polypeptid Δρ62 vykazuje intaktní oblast interakce s GAP a GRB2 jakož i jednotlivé sekvence bohaté na partnerské proliny SH3 (obr. 1). Nicméně polypeptid Δρ62 není schopen vstoupit do interakce s nukleovými kyselinami v důsledku delece oblasti homologie s proteinem GRP33. přihlašovatel rovněž prokázal, že· transfer cDNA polypeptidu Δρ62 do různých normálních nebo nádorových buněčných modelů působí proti součinnosti mezi p62 a Ras a inhibuje signály přenášené normálními a onkogenními proteiny Ras. Superexprimovaný Δρ62 interferuje s proliferačními a diferenciačními procesy a vyúsťuje u jednotlivých buněčných modelů ve smrt buňky v důsledku apoptózy.

Předkládaný vynález se týká zejména jakéhokoliv derivátu p62 přinášejícího přinejmenším deleci do oblasti homologie s proteinem GRP33. Zejména pak deriváty podle předkládaného vynálezu připouštějí deleci v oblasti mezi rezidui 145 až 247 proteinu p62, jak je zobrazena na sekvenci SEQ ID č. 1 a která pokrývá oblast KH. Delece se týká více jak 10 aminokyselin a zejména více jak 30 aminokyselin. Může se týkat jednoho či více míst uvnitř této oblasti, jakmile rezulující derivát vykáže výše popsané vlastnosti.

Výhodná je skutečnost, že derivát podle předkládaného vynálezu je polypeptid obsahující celek nebo část sekvence SEQ ID č. 2 nebo její variantu. Termín varianta ve smyslu předkládaného vynálezu označuje jakýkoliv polypeptid, jehož struktura se odlišuje od sekvence SEQ ID č. 2 jednou či více modifikacemi genetické, biochemické a/nebo chemické povahy. Může se jednat zejména o mutaci, substituci, deleci, adici a/nebo modifikaci jednoho nebo několika reziduí. Takovéto deriváty mohou být generovány s různým cílem, zejména pak s cílem zvýšit afinitu peptidu pro jeho interakční místo, zlepšit jeho úroveň produkce, zvýšit jeho odolnost vůči proteázám nebo zlepšit jeho průchod buněčnými membránami, zvýšit jeho terapeutickou účinnost či snížit jeho druhotné účinky, nebo mu předat nové farmakokinetické a/nebo biologické vlastnosti. Jednotlivé varianty zahrnují delece nebo mutace vztahující se na aminokyseliny, jejichž přítomnost není rozhodující pokud jde o aktivitu derivátu. Takovéto aminokyseliny mohou být identifikovány na příklad pomocí testů buněčné aktivity, jak je popsáno v uvedených příkladech.

-2CZ 291533 B6

Deriváty podle předkládaného vynálezu obsahují alespoň část proteinu p62 umožňující interakci s oblastí SH2 GAP. Tato část proteinu p62 je tvořena především fosforylovanými tvrosiny lakolizovanými mezi rezidui 200 až 450 proteinu p62 (CfSEQIDč. 1). Derivát preferovaný podle předkládaného vynálezu zahrnuje tedy alespoň (i) deleci v oblasti mezi rezidui 145 až 247 p62 a (ii) část p62 umožňující interakci s oblastí SH2 GAP. Delece se především týká reziduí 1 až 202.

V tomto ohledu přihlašovatel rovněž prokázal, že deriváty podle předkládaného vynálezu vykazující obzvláště zajímavé vlastnosti mohou být tvořeny polypeptidy zahrnujícími zejména oblast fosforylovaných tyrosinů p62.

Obzvláště preferovaný příklad polypeptidu podle předkládaného vynálezu představuje polypeptid Δρ62 sekvence SEQ ID č. 2 zahrnující deleci reziduí 170 až 208 sekvence p62. Jiným příkladem je polypeptid p62-C zahrnující rezidua 203 až 443 p62 (sekvence SEQ ID č. 3).

Výsledky uvedené v předkládaném vynálezu prokazují zejména, že polypeptid Δρ62 může konkurovat s proteinem p62 vůči GAP, když GAP je jedním z efektorů proteinů Ras, polypeptid Δρ62 blokuje na tom závisející mitogenní cesty. Polypeptid Δρ62 seperyprimovaný genotransferem (transfekce, infekce, mikroinjekce, atd.) indukuje buněčnou smrt apoptózou v normálních buňkách (fibroblasty NIH3T3 a Swiis 3T3) nebo v buňkách tumorálních (H460, HCT 116) a je schopný inhibovat utváření ložisek indukovaných geny ras. Stejného účinku se dosáhne s derivátem p62-C (zahrnujícím zejména C-terminální část polypeptidu Δρ62, která pokrývá oblast mezi aminokyselinami 203 a 443 a odpovídá oblasti interakce s oblastmi SH2 GAP a GRB2). Tato C-terminální část zahrnuje rovněž tři místa interakce s oblastmi SH3, která vykazují nej vyšší afinitu pro Fyn. Významná terapeutická aktivita derivátů podle předkládaného vynálezu se váže na jejich četné vlastnosti a zejména jejich schopnost titrovat oblasti SH3 proteinů rodiny src (příklad :fyn), jejích kapacitu inhibovat rekrutování GRB2 titrací jeho oblasti SH2 a jejich schopnost inhibovat účinnou funkci proteinu GAP pro signalizační cesty závisející na Ras.

Další předmět předkládaného vynálezu se týká jakékoliv nukleové kyseliny kódující polypeptid jak je definován výše.

Kyselina nukleová podle předkládaného vynálezu může být kyselina ribonukleová (RNA) nebo deoxyribonukleová (DNA). Kromě toho se může jednat o genomovou DNA (gDNA) nebo komplementární (cDNA). Může být lidského, zvířecího, virového, syntetického nebo polosyntetického původu. Může být získána různým způsobem, zejména pak chemickou syntézou za využití sekvencí prezentovaných v přihlášce vynálezu nebo syntetizátoru nukleových kyselin. Rovněž tak může být získána tříděním bank pomocí specifických sond, jak jsou popsány v žádosti (viz sekvence SEQ ID č. 6 a 7). Dále může být získána kombinovanými technikami zahrnujícími chemickou modifikaci (elongaci, deleci, substituci, atd.) sekvencí tříděných v bankách. Všeobecně řečeno, nukleové kyseliny uváděné ve vynálezu mohou být připraveny jakoukoliv odborníkům známou technikou.

Nukleová kyselina podle vynálezu je povětšinou DNAc nebo RNA.

Nukleová kyselina podle vynálezu může být volena především z množiny zahrnující:

(a) celek nebo části sekvence SEQ ID č. 2 nebo SEQ ID č. 3 nebo jejich komplementární části, (b) jakékoliv sekvence hybridizující se sekvencemi (a) a kódující derivát podle předkládaného vynálezu, (c) variant (a) a (b) vyplývajících z degenerace genetického kódu.

Jak je uvedeno výše, přihlašovatel izoloval a charakterizoval nové sekvence kyseliny kódující polypeptidy derivované zp62 vyznačující se pozoruhodnými antiproliferativními a apoptotický

-3CZ 291533 B6 mi vlastnostmi. Tyto nukleové kyseliny mohou být nyní použity jako terapeutická činidla a produkovat v buňkách deriváty podle vynálezu schopné zničit nebo korigovat buněčné dysfunkce, proto se předkládaný vynález týká rovněž každé expresní kazety obsahující nukleovou kyselinu jak je definováno výše, promotor umožňující její expresi a signál ukončení transkripce. Promotor se volí z funkčních promotorů v samčích buňkách, nejlépe lidského původu. Jedná se o promotor umožňující expresi kyseliny nukleové v hyperproliferativní buňce (kancerózní, restenózní, atd.). Z tohoto hlediska je možno použít několik promotorů. Může se příkladně jednat o vlastní promotor genu p62. Také se však může jednat o oblasti různého původu (odpovědné za expresi dalších proteinů, dokonce syntetických). Může se tedy jednat o jakýkoliv promotor nebo derivovanou sekvenci stimulující nebo naopak potlačující transkripci genu specifickým či nespecifickým způsobem, induktivní či nikoliv, výraznou či naopak slabou.

Zejména je možno uvést aktivační sekvence eukaryotických nebo virových genů. Na příklad se může jednat o aktivační sekvence pocházející zgenomu cílové buňky. Z eukaryotických promotorů je možno použít zejména promotory ubikvitámí (promotory genů HPRT, PGK, aaktin, tubulin, atd.), promotory intermediálních vláken (promotory genů GFAP, desmin, vimentin, neurovlákna, keratinu, atd.), promotory terapeutických genů promotory genů MDR, CFTR, faktor VIII, ApoAI, atd.), specifické tkáňové promotory (promotory genu pyruvat-kinázy, vilin, střevní protein vazby mastných kyselin, α-aktin hladkého svalu, atd.) nebo také promotory reagující na určitý podmět (receptory steroidních hormonů, kyseliny retionové, atd.). Dále se může jednat o aktivační sekvence pocházející z genomu určitého viru, jako na příklad promotory genů El A a MLP adenoviru, raný promotor genu CMV nebo také promotor genu LTR a genu RSV, atd. Tyto aktivační oblasti mohou být modifikovány přidáním aktivačních či regulačních sekvencí či sekvencí umožňujících tkáňově specifickou nebo majoritní expresi.

Předkládaný vynález uvádí nyní nová terapeutická činidla umožňující svými antiproliferativními a/nebo apoptotickými vlastnostmi interferovat s četnými buněčnými dysfunkcemi. Za tím účelem mohou být nukleové kyseliny nebo kazety podle vynálezu injikovány jako takové na úrovni místa, které je určeno k ošetření, nebo inkubovány přímo s buňkami, které je třeba zničit nebo ošetřit. Bylo popsáno, že prosté nukleové kyseliny jsou schopny pronikat do buněk bez zvláštního vektoru. Nicméně, v rámci předkládaného vynálezu se upřednostňuje použití tzv. aplikovaného vektoru umožňujícího zvýšení (i) účinnosti průniku do buňky, (ii) zacílení a zvýšení (iii) extra- a intrabuněčné stability.

Při obzvláště preferovaném způsobu aplikace podle předkládaného vynálezu je kyselina nukleová nebo kazeta inkorporována do vektoru. Použitý vektor může být chemického (liposom, nanopartikula, peptidický komplex, lipidy nebo kationtové polymery, atd.) nebo virového původu (retrovirus, adenovirus, virus herpesu, AAV, virus vakcíny, atd.) či původu plazmidového.

Použití virových vektorů je dáno přirozenými schopnostmi transfekce virů. Tak je možné použít na příklad adenoviry, viry herpesu, retroviry a asociované adenoviry. Tyto vektory jsou mimořádně účinné na úseku transfekce. V tomto ohledu předkládaný vynález upřednostňuje defektivní rekombinační retrovirus, jehož genom obsahuje nukleovou kyselinu podle výše uvedené definice.

V jiném případě vynález využívá defektivní rekombinační adenovisrus, jehož genom obsahuje nukleovou kyselinu rovněž podle výše uvedené definice.

Vektorem podle předkládaného vynálezu může být rovněž nevirový agens schopný aktivovat transfer a expresi nukleových kyselin do eukaryotických buněk. Chemické nebo biochemické, syntetické nebo přírodní vektory představují zajímavou alternativu přírodních virů, zejména pak kvůli snadnosti a bezpečnosti aplikace a rovněž v důsledku toho, že není dána teoretická mezní hodnota množství DNA určené k přenosu. Tyto syntetické vektory mají dvě hlavní funkce zhutnit nukleovou kyselinu určenou ktransfekci a aktivovat její buněčnou fixaci jakož i její průchod plazmovou membránou a případně oběma nukleovými membránami. Aby mohly čelit

-4CZ 291533 B6 polyaniontové povaze nukleokyselin jsou nevirové vektory vybaveny polykationtovými funkcemi. Nukleová kyselina nebo vektor použitý v předkládaném vynálezu může být podáván topikálně, orálně, peranterálně, intranazálně, intravenózně, intramuskulámě, subkutánně, intraokulámě, transdermálně, atd. Nejčastěji se kyselina nukleová nebo vektor aplikují injekční formou. Mohou tedy být smíseny s jakýmkoliv farmaceutickým vehikulem přijatelným pro injikovatelnou formu, zejména pro přímé injikování na úrovni místa určeného k ošetření. Může se jednat zejména o sterilní nebo izotonické roztoky nebo o suché, zejména lyofilizované sloučeniny, které přidáním buď sterilizované vody nebo fyziologického séra umožňují vytvoření injikovatelných tekutin. Přímé injikování kyseliny nukleové do tumoru pacienta je velmi zajímavým řešením, protože umožňuje soustředit terapeutický účinek na úroveň postižených tkání. Aplikované dávky kyseliny nukleové mohou být upraveny v závislosti na různých parametrech a především pak v závislosti na genu, na vektoru, na daném způsobu aplikace, na dané patologii nebo na délce trvání sledovaného ošetřování. Předkládaný vynález se rovněž týká jakékoliv farmaceutické kompozice obsahující alespoň kyselinu nukleovou.

Rovněž se týká jakékoliv farmaceutické kompozice obsahující alespoň vektor podle výše uvedené definice.

Rovněž se týká jakékoliv farmaceutické kompozice obsahující alespoň derivát p62 podle výše uvedené definice.

Vzhledem ke svým antiproliferativním vlastnostem jsou farmaceutické kompozice podle vynálezu obzvláště uzpůsobeny pro ošetřování hyperproliferativních poruch, zejména rakoviny a restenózy. Předkládaný vynález nabízí mimořádně účinnou metodu ničení buněk, především pak buněk hyperproliferativních. Ta může být použita jak in vitro, tak i ex vivo. Při použití ex vivo spočívá v inkubaci buněk za přítomnosti jedné či několika nukleových kyselin (nebo vektoru, kazety nebo přímo derivátu). Při použití in vivo pak spočívá v podávání určitého aktivního množství vektoru (nebo kazety) organismu, nejraději přímo na úrovni místa určeného k ošetření (zejména tumoru). Z tohoto hlediska je předmětem vy nálezu metoda ničení hyperproliferativních buněk založená na kontaktu zmíněných buněk nebo jejich části s kyselinou nukleovou podle výše uvedené definice.

Předkládaný vynález se výhodně využívá in vivo pro ničení hyperproliferativních buněk (i.e. v anormální proliferaci). Dá se tedy využít pro ničení tumorálních buněk nebo buněk hladkého svalu vaskulámí stěny (restenóza). Zejména se hodí pro ošetření případů rakoviny, kde je implikován aktivovaný onkogen. pro případ je možno uvést adenokarcinomy tračníku, rakovinu štítné žlázy, karcinomy plic, myeloidní leukamii, kolorektální rakovinu, rakovinu prsu, plic, žaludku, jícnu, B-lymfomů, vaječníků, močového měchýře, glioblastomů, karciomy jater, rakovinu kostí, kůže, pankreasu nebo ledvin či prostaty, atd.

Produkty vynálezu jsou vhodné také pro identifikaci dalších partnerů cest signalizace ankogenů vyhledáváním inhibitorů, agonizujících činidel, kompetitorů nebo molekul reagujících in vivo právě s těmito produkty.

Ostatně, vynález se týká rovněž antimediátorových sekvencím, jejichž exprese v cílové buňce umožňuje řídit transkripci a/nebo transdukci buněčných mRNA kódujících protein p62 nebo polypeptidu Ap62. Takovéto sekvence mohou být ku příkladu přeměněny v cílové buňce na RNA doplňující buněčné mRAN polypeptidu Ap62 nebo proteinu p62 a blokovat jejich přeměnu na protein podle techniky popsané v patentu EP 140 308. Tyto sekvence mohou být tvořeny částečně nebo cele nukleotidovými sekvencemi SEQIDč. 1, 2 nebo 3, transkripovanými v opačné orientaci.

Předkládaný vynález se rovněž týká použití jakékoliv sloučeniny schopné indukovat expresi či superexpresi polypeptidu Ap62 v buňce za účelem přípravy farmaceutické kompozice určené k ošetření hyperproliferativních poruch.

-5CZ 291533 B6

Předkládaný vynález bude popsán podrobněji pomocí následně uvedených příkladů, které je třeba považovat za ilustrativní a nikoliv limitativní.

Popis obrázků

Obr. 1: Schematické zobrazení strukturálních oblastí proteinu p62 a polypeptidu Δρ62

Obr. 2: Účinky proteinu p62 a polypeptidu Δρ62 na transaktivaci RRE-derivátu zesilovače transkripce viru polyomu proteiny ras.

Obr. 3: Průkaz buněčné smrti indukované prostřednictvím polypeptidu Δρ62 ve fibroblastech NIH3T3.

Obr. 4: Prokázání exprese polypeptidu Δρ62 v emboiyonálních fibroblastech ošetřených různými cytotoxickými činidly a sérovou deprivací.

Obr. 5: Inhibice tvoření ložisek indukovaného onkogeny.

Biomolekulámí technika

Metody klasicky používané v molekulární biologii, jako ku příkladu preparativní extrakce plazmidové DNA, centrifugace plazmidové DNA v gradientu chloridu cezia, elektroforéza na agarovém nebo akrylamidovém gelu, purifikace fragmentů DNA elektroelucí, extrakce proteinů fenolem nebo fenolchloroformem, precipitace DNA v solném prostředí etanolem nebo izopropanolem, transformace v Escherichia coli, atd... jsou metody, které odborník dobře zná a které jsou dostatečně popsány v odborné literatuře (Maniatis T. et al., „Molecular Cloning, a Laboratory Manual“, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, N.Y., 199'82, Ausubel F.M. et al. (eds), „Current Protocols in Molecular Biology“, John Wiley and Sons, New York, (1987).

Plazmidy typu pBR322, pUC a fágy série M13 mají obchodní původ (Bethesda Research Laboratories). Pro účely ligatury mohou být fragmenty DNA odděleny podle své velikosti elektroforézou na agarovém nebo akrylamidovém gelu, extrahovány fenolem nebo směsí fenolu a chloroformu, precipitovány etanolem a inkubovány za přítomnosti DNA ligázy fágu T4 (Biolabs) podle doporučení dodavatele.

Přesahují konce 5'mohou být doplněny užitím Klenowova fragmentu DNA poylmerázy I zE. coli (Biolabs) podle specifickace dodavatele. Zničení proeminentních konců 3' se provede za přítomnosti DNA polymerázy fágu T4 (Biolabs) podle doporučení výrobce. Zničení proeminentních konců 5' se uskuteční ošetřením nukleázou SI.

Mutageneze řízená in vitro syntetickými oligodeoxynukleotidy může být uskutečněna podle metody vyvinuté Zaylorem et al. (Nucleic Acids Res., 13 (1985) 8 749-8 764) za použití sady distrubuované Amershamem. Enzymová amplifikace fragmentů DNA technikou řečenou PCR (Polymérase-catalyzed Chain Reaction, Saiki R.K. et al., Science 230 (1985) 1 350-1 354, Mullis K..B. et Fallona F.A., Meth Enzym. 155 (1987) 335-350) může být provedena za použití tzv. „DNA thermal cycler“ (Peřin Elmer Cetus) podle specifikace výrobce, ošetření nukleotidových sekvencí může být uskutečněno metodou vyvinutou Sangerem et al. (Proč. Nati. Acad. Sci. USA, 74 (1977) 5 463-5 467) za použití sady distribuované Amershamem.

-6CZ 291533 B6

Příklady provedení vynálezu

Příklad 1

Izolování komplementární DNA polypeptidů Δρ62.

Komplementární DNA polypeptidů Δρ62 byla izolována pomocí PCR na populaci syntetizované komplementární DNAz RNA póly A+ extrahované z lidské placenty. 1 pg DNA byl použit společně se zárodečnými subjekty derivovanými ze sekvence p62, které pokrývají aminokyseliny 123 až 131 na jedné straně (oligo 5') a 437 až 443 na straně druhé (oligo 3').

Sekvence startérů jsou následující:

oligo 5': CAGCTGCTGACGGCAGAAATTGAG (SEQ ID č. 4), oligo 3': TTAATAACGTCCATATGGGTGCTC (SEQ ID č. 4).

Reakce byly řízené při 55 °C a daly dva produkty oddělené elektroforézou na agarovém gelu:

- pás 987 párů bází odpovídající produktu PCR p62,

- pás 870 párů bází odpovídající produktu PCR Δρ62.

Tento druhý pás byl klonován a jeho frekvence odpovídá přesně sekvenci p62 s výjimkou delece 117 párů bází v oblasti homologie sGRP33. Kompletní sekvence Δρ62 je prezentována jako SEQ ID č. 2 (viz obr. 1).

Existence této izoformy proteinu p62 byla potvrzena tříděním banky komplementární DNA lidské placenty ve vektoru agt 11. Oligonukleotid použitý pro toto třídění je 24 mer odpovídající specificky místu spojení po delecí přítomné v polypeptidů Δρ62. Sekvence tohoto oligonukleotidu je :

CAGTATCCCAAGGAGGAAGAGCTG (SEQ ID č. 6).

Příklad 2

Konstrukce vektorů exprese polypeptidů Δρ62 a proteinu p62-C. tento příklad popisuje konstrukci vektorů použitelných pro transfer nukleových kyselin podle vynálezu in vitro nebo in vivo.

2.1 Plazmidický vektor:

Pro konstrukci plazmidických vektorů byly použity 2 typy vektorů:

- Vektor SV2, popsaný v DNA Cloning, A practical approach Vol. 2, D.M. Glover (ed) IRL Press, Oxford, Washintong DC, 1985. Tento vektor je vektorem eukarytické exprese. Nukleové kyseliny kódující varianty proteinu p62-C a polypeptidů Δρ62 byly vloženy do tohoto vektoru ve formě fragmentů EcoRI. Jsou tak pod kontrolou promotoru zesilovače transkripce viru SV40.

- Vektor pcDNA3 (invitrogen). Jedná se rovněž o vektor eukaryotické exprese. Nukleové kyseliny kódující varianty proteinu p62-C a polypeptidů Δρ62 byly vloženy do tohoto vektoru ve formě fragmentů EcoRI a jsou tak pod kontrolou raného promotoru CMV.

2.2 Virový vektor

Vynález spočívá v konstrukci a použití virových vektorů umožňujících transfer a expresi nukleových kyselin in vivo podle výše uvedené definice.

-7CZ 291533 B6

Protože se jedná zejména o adenoviry, byly charakterizovány různé sérotypy, jejichž struktura a vlastnosti se poněkud liší.

Z nich se přednostně využívá v rámci předkládaného vynálezu lidských adenovirů typu 2 a 5 (Ad nebo Ad5) nebo adenovirů živočišného původu (viz patentová přihláška WO 94/26 914). Z adenovirů živočišného původu využitelných v rámci předkládaného vynálezu je možno uvést adenoviry psího, bovinního, myšího (příklad :Mavl, Beard et al., Virology 75 (1990) 81), ovčího, prasečího, ptačího nebo opičího původu (příklad : SAV). Adenovirus živočišného původu je adenovirus psí, zejména pak adenovirus CAV3 (na příklad kmen manthattan nebo A26/61 (ATCC VR-800). V rámci předkládaného vynálezu se používá především adenovirů lidského či psího původu nebo adenovirů kombinovaných.

Defektní adenoviry podle vynálezu obsahují ITR, sekvence umožňující inkapsidaci a nukleovou kyselinu podle vynálezu. Ještě častěji je pak vgenomu adenovirů podle vynálezu oblast El nefunkční. Sledovaný virový gen může být znefunkčněn jakoukoliv technikou známou odborníkům, zejména pak celkovou supresí, substitucí, částečnou delecí nebo přidáním jedné či více bází do sledovaného genu (či sledovaných genů). Takovéto modifikace mohou být dosaženy in vitro (na izolované DNA) nebo in šitu pomocí metod genetického inženýrství nebo ošetřením mutagenními Činidly. I další oblasti mohou být rovněž modifikovány a zejména potom oblast E3 (WO 95/02 697), E2 (WO 94/28 938), E4 (WO 94/28 152, WO 94/12 649, WO 95/02 697) a L5 (WO 95/02 697). Podle preferovaného způsobu využití obsahuje adenovirus podle vynálezu deleci v oblastech El a E4. Podle jiného preferovaného realizačního postupu zahrnuje deleci v oblasti El, na jejíž úrovni je vložena oblast E4 a kyselina nukleová podle vynálezu (porovnej FR94 13 355). Ve virech podle vynálezu zasahuje delece v oblasti El od nukleotidů 455 až

329 na sekvenci adenovirus Ad5.

Defektivní rekombinant adenoviry podle předkládaného vynálezu mohou být připraveny jakoukoliv odborníkům známou technikou (Levrero et al., Gene 101 (1991) 195, EP 185 573, Graha, EMBO J. 3 (1984). Zejména pak mohou být připraveny homologní rekombinancí mezi adenovirem a plazmidem se sekvencí DNA. Homologní rekombinace vzniká po ko-transfekci zmíněných adenovirů a plazmidu ve vhodné buněčné linii. Použitá buněčná linie musí být transformovatelná zmíněnými prvky, musí zahrnovat sekvence schopné doplnit část genomu defektivního adenovirů, nejlépe integrovanou formou, aby se zabránilo nebezpečí rekombinace. Pro příklad můžeme uvést lidskou embryonální linii ledvin 293 (Graham et al., J. Gen. Virol. 36 (1977) 59), která obsahuje levou část genomu adenovirů Ad5 (12 %) integrovanou do svého genomu, nebo linie schopné doplnit fukce El a E4, jak jsou popsány v patentových přihláškách č.WO 94/26 914 a WO 95/02 697. Rozmnožené adenoviry jsou zachyceny a purifikovány klasickými metodami molekulární biologie, jak je ilustrováno v vedených příkladech.

Pokud jde o tzv. adenosdružené viry (AAV), jedná se o viry na bázi DNA relativně redukované velikosti, které se integrují do genomu buněk, která infikují, a to stabilně a specificky pro dané místo. Jsou schopné infikovat široké spektrum buněk, aniž by indukobaly jakýkoliv vliv na růst, morfologii nebo diferenciaci buněk. Jak se zdá, nepodílejí se však na patologii u člověka. Genom virů AAV byl klonován, rozložen do sekvencí a charakterizován, zahrnuje zhruba 4 700 bází a obsahuje na každém konci oblast obrácené repetice (ITR) 145 bází. Zbytek genomu je rozdělen do dvou podstatných oblastí s inkapsidačními funkcemi: do levé části genomu obsahující gen rep podílející se na virové replikaci a expresi virových genů a do pravé části genomu obsahující gen cap kódující kapsidoproteiny viru.

Použití vektorů derivovaných z AAV pro transfer genů in vitro a in vivo bylo popsáno v odborné literatuře (zejména WO 91/18 088, WO 93/09 239, US 4 797 368, US 5 139 941, EP 488 528). Zde jsou popisovány různé konstrukce derivované z AAV, ve kterých geny rep a/nebo cap jsou eliminovány delecí a nahrazeny významným genem, a dále je zde popsáno jejich použití pro transfer tohoto významného genu in vitro (na buňkách v kultuře) nebo in vivo (přímo do organismu). Rekombinantní defektivní AAV podle předkládaného vynálezu mohou být

-8CZ 291533 B6 připraveny ko-transfekcí plazmidu s obsahem neukleotidové sekvence ohraničené dvěma oblastmi ITR AAV a plazmidu s inkaopsidačními geny (geny rep a cap) AAV do buněčné linie infikované pomocným lidským virem (na příklad adenovirem). Použitelná buněčná linie je na příklad linie 293. Produkované rekombinantní AAV jsou následně purifikovány klasickými technikami.

Pokud jde o herpes viry a retroviry byla konstrukce rekombinantních vektorů již dříve podrobně popsána v odborné literatuře: viz zejména Breakfild et al., New Biologist 3 (1991) 203, EP 453 242, EP 17 8 220, Bemstein et al. Genet. Eng. 7 (1985) 235, McCormick, BioTechnilogy 3 (1985) 689, atd. retroviry jsou intergrativní viry infikující selektivně buňky v procesu dělení. Představují tedy významné vektoiy vhodné pro aplikaci u případů rakoviny. Genom retrovirů zahrnuje zejména dvě LTR, inkapsidační sekvenci a tři kódující oblasti (gag, pol a env). V rekombinantních vektorech derivovaných z retrovirů pak geny gag, pol a env jsou povětšinou eliminovány delecí, a to celkově nebo částečně a jsou nahrazeny sekvencí zainteresované heterologní nukleové kyseliny. Tyto vektory mohou být realizovány z různých typů retrovirů, jak MoMuLV („Murine moloney sarcoma virus“), HaSV („harvey sarcoma virus“), SNV („spleen necrosis virus“), RSV („rouš sarcoma virus“) či také Friendův virus.

Za účelem konstrukce rekombinantních virů podle vynálezu obsahujících nukleovou kyselinu rovněž podle vynálezu, se vytvoří plazmid obsahující zejména LTR, inkapsidační sekvenci a zmíněnou nukleovou kyselinu a pak se použije pro přenos buněčné linie řečené inkapsidační, schopné vložit do polohy trans retrovirové funkce, které jsou v plazmidu deficientní. Všeobecně vzato jsou inkapsidační linie schopné vyjádřit geny gag, pol a env. Takovéto inkapsidační linie byly popsány v dřívějších pracech, zejména pak linie PA317 (US 4 861 719), linie PsiCRIP (WO 90/02 806) a linie GP + envAm-12 (WO 89/07 150). Rekombinantní viry mohou zahrnovat modifikace na úrovni LTR pro potlačení transkripční aktivity, jakož i inkapsidační sekvence zahrnující část genu gag (Bender et al., J. Virol.61 (1987) 1 639). Produkované rekombinantní retroviry jsou pak purifikovány klasickými technikami.

Pro využití předkládaného vynálezu je výhodné použít adenovirus nebo defektivní rekombinantní retrovirus. Tyto vektory mají skutečně mimořádně zajímavé vlastnosti pro přenos genů do tumorálních buněk.

2.3 Chemický vektor

Z vyvinutých syntetických vektorů se přednostně v rámci předkládaného vynálezu využívá kationtových polymerů typu polylyzinu, (LKLK)n, (LKKL)n, polyetyleninimu a DEAE dextran nebo kationtových nebo lipofektantních lipidů. Mají tu vlastnost, že kondenzují DNA a podporují její spojení s buněčnou membránou. Z nich můžeme uvést lipopolyaminy (lipofektamin, transfektam, atd.), různé kationtové nebo neutrální lipidy (DOTMA, DOGS, DOPE, atd.) jakož i peptidy nukleárního původu. Kromě toho byl vyvinut koncept cílové transfekce mediované receptorem, který využívá princip kondenzace DNA díky kationtovému polymeru při orientaci fixace komplexu na membránu díky chemické vazbě mezi přítomného na povrchu buněčného typu, který chceme transplantovat. Zacílení receptoru na transferin, inzulín nebo receptoru asialoglykoproteinů hepatocytů bylo již dříve podrobně popsáno. Příprava sloučeniny podle předkládaného vynálezu za použití chemického vektoru je realizována běžnou, odborníkům známou technikou, povšechně pak jednoduchým uvedením jednotlivých složek do vzájemného kontaktu.

Příklad 3

Inhibice transaktivace R.R.E. (ras responsive elents) podmíněná onkogenickými formami Ras (obr. 2)

-9CZ 291533 B6

Fibroblasty NIH 3T3 byly transfektovány nosným genem, genem chloramfenikolacetyltransferázy, řízeným prvky reagujícími na RAS derivovanými ze zesilovače transkripce viru polyomu. Tyto prvky jsou stimulovány 15-20x, jsou-li buňky kontrasfektovány expresním vektorem nesoucím cDNA onkogenu Middle T (MT) SV40. Tato stimulace je jen nepatrně ovlivněna, jestliže kontrasfekce přináší expresní vektory proteinu p62-C a polypeptidu Δρ62 (srovnej příklad 2). Je-li kontrasfekce realizována nikoliv s MT ale s aktivovanou formou onkogenu Ha-ras (Val 12), aktivita CAT je stimulována 30-40x nad základní úroveň. Exprese polypeptidu Δρ62 ovlivňuje tuto stimulací jen nepatrně, zatímco protein p62-C a polypeptid Δρ62 inhibuje téměř beze zbytku veškerou aktivitu podmíněnou onkogenovým Ras. Stejným způsobem je pak stimulace dosažená kontransfekcí s onkogenem v-src výrazně inhibována proteiny p62-C a polypeptidem Δρ62, nikoliv však proteinem p62.

Tyto pokusy byly provedeny s 0,5 pg vektoru umožňujícího expresi MT nebo ras VAL12 nebo v-src et a s 4 pg expresního vektoru nesoucího cDNA proteinu p62-C nebo polypeptidu Δρ62. Jasně prokazují schopnost proteinů podle předkládaného vynálezu působit proti onkogením signálům ras.

Příklad 4

Prokázání smrti buňky indukované polypeptidem Δρ62 ve fibroblastech N1H3T3 (obr. 3).

Fibroblasty NIH3T3 byly transfektovány s účinností 60 % množstvím 5 pg expresního vektoru polypeptidu Δρ62 (příklad 2).

hodin po transfekci vykazují buňky výrazné zhoršení jejich životaschopnosti vzhledem ke kontrolním subjektům. Analýza jejich DNA ukazuje po migraci na agarózovém gelu charakteristická degradační stadia apoptozních jevů. Stejné jevy lze pozorovat v případě, kdy je p62-C transfekován za stejných podmínek jako Δρ62.

Příklad 5

Prokázání exprese polypeptidu Δρ62 v embryonálních fibroblastech ošetřených různými cytotoxickými činidly a sérovou deprivací (obr. 4).

Myší embryonální fibroblasty byly uvedeny do kultury (1), ošetřeny 0,5 pg kyseliny okadové (2), ošetřeny 10 ng/ml PMA a 2 pg ionomycinu (3), 1 pM staurosprinu (4) nebo 2 pg/ml kamtotecinu (5) a pak zbaveny séra.

Exprese mediátorových RNA proteinu p62 a polypeptidu Δρ62 v těchto fibroblastech a během různých ošetření byla podrobena důkladné analýze, při každém ošetření byly analyzovány tři body. Ty odpovídají třem časovým intervalům ošetření: 6,12 a 24 hodin.

Sonda 5' specifická pro polypeptid Δρ62 (SEQ ID č. 7): CTGTCAAGCAGTATCCCAAGGAGG

Sonda 5' specifická pro protein p62 (SEQID č. 8): AAGGGCTCAATGAGAGACAAAGCC

Sonda 3' společná pro p62 a Δρ62 (SEQ ID č. 9):

GTATGTATCATCATATCCTATTTC

-10CZ 291533 B6

Ve fibroblastech uvedených do kultury za přítomnosti 10% detálního telecího séra (SVF) byla mRNA proteinu p62 potvrzena, zatímco mRNA polypeptidů Δρ62 nebyla detekována ani po 24 hodinách po uvedení do kultury. Stejná situace je při ošetření kyselinou okadovou. Naproti tomu je možno pozorovat výraznou indukci mRNA polypeptidů Δρ62 po 6 až 12 hodinách ošetřování pomocí PMA a ionomycinem. RNAm se dá rovněž prokázat po přidání staurosporinu a je výrazně indukována po 12 hodinách ošetřování kamptotecinem. Jakmile jsou embryonální fibroblasty odebrány ze séra, je možno pozorovat výraznou indukci polypeptidů Δρ62 současně se zmizením informace pro protein p62.

Tyto výsledky prokazují, že exprese mRNA polypeptidů Δρ62 je indukována během některých apoptotických situací ve fibroblastech.

Příklad 6

Inhibice polypeptidem Δρ62 tvorby ložisek indukovaných ras

Tento příklad popisuje jinou studii prokazující, že polypeptid Δρ62 interferuje s transformačním procesem indukovaným onkogeny. Zejména tento příklad dokresluje, že polypeptid Δρ62 dokáže inhibovat tvorbu ložisek indukovanou různými onkogeny (ras onkogenický, V-src) v buňkách NIH-3T3, zatím co protein p62 na tento fenomen nepůsobí vůbec.

Fibroblasty NIH3T3 byly kotransfektovány pomocí 0,1 pg vektoru exprese V-src nebo Ha-Ras Val 12 a 4 mg vektoru exprese proteinu p62, polypeptidů Δρ62 nebo vektoru prázdného (příklad 2). Buňky byly udržovány v prostředí obsahujícím 10 % fetálního telecího séra a počet ložisek byl určen po fikaci a zbarvení buněk za přítomnosti fenolfuksinu. Pokusy byly provedeny ve třech opakováních.

Dosažené výsledky jsou uvedeny na obr. 5. Potvrzují, že polypeptid Δρ62 snižuje počet ložisek indukovaných prostřednictvím V-src a Ha-Ras Val 12 asi o 50%. Tento účinek potvrzuje specifickou antagonistickou schopnost transformace prostřednictvím v-src a Ha-Ras onkogenního, protože polypeptid Δρ62 nepůsobí na tvorbu ložisek indukovaných prostřednictvím V-Raf. Kromě toho, sledovaný účinek není vázán na toxicitu produktu, protože počet kolonií rezistentních vůči neomycinu po transfekci prostřednictvím proteinu p62, polypeptidů Δρ62 nebo prázdného vektoru je srovnatelný, tyto výsledky tedy potvrzují inhibiční úlohu molekul podle vynálezu v procesu transformace indukovaném onkogeny. Rovněž potvrzují vhodnost těchto produktů pro korekci procesů buněčné proliferace indukovaných onkogeny, jakož i nástroje pro identifikaci dalších molekul buď aktivních a/nebo podílejících se na signalizaci těchto onkogenů.

Příklad 7

Prokázání interakce s src in vivo

Tento příklad názorně popisuje studii interakce polypeptidů Δρ62 s dalším molekulami, prokazuje zcela jasně, že protein p62 a polypeptid Δρ62 dokáží vstoupit v interakci in vivo se src.

Fibroblasty NIH3T3 byly transfektovány vektorem exprese proteinu p62 nebo polypeptidů Δρ62 obsahujícím markér myc („myc teg“) (příklad 2). Transfektované buňky byly udržovány v asynchronním růstu nebo blokovány v mitotické fázi nocodazolem, Buňky potom byly kontrasfekovány vektorem exprese v-Src nebo prázdným, po 48 hodinách byly buňky lyžovány a utvořené komplexy byly imunodetekovány pomocí protilátek anti-myc (protilátka 9E10) a antiSrc (protilátka NI 6).

-11CZ 291533 B6

Dosažené výsledky potvrzují, že protein p62 a polypeptid Δρ62 dokáže vstoupit v interakci in vivo s src. kromě toho, zatímco interakce mezi p62 a src probíhá, jak se zdá, výlučně v mitotických buňkách, polypeptid Δρ62 váže src průkazně dokonce i v buňkách asynchronních. Tato interakce je zintenzivněna v buňkách mitotických.

SEZNAM SEKVENCÍ

INFORMACE O SEQ ID č. 1:

Charakteristika sekvence:

(A) Délka: 1 332 párů bází (B) typ: nukleotid (C) Počet vláken: jedno (D) Konfigurace: lineární

Typ molekuly: DNAc

Hypotetická: ne

Antimediátorová: ne

-12CZ 291533 B6

Popis sekvence: SEQ ID č. 1:
ATG CAG CGC CGG GAC GAC CCC GCC
43
Met Gin Arg Arg As o Aso Pro Ala
1 5
CGT AGC GGC TCC ATG GAC CCC TCC
96
Arg Ser Glv Ser Mez Aso Pro Ser
20
ACG CCG TCT CGG CAG CCG CCG CTG
144

GCG	CGC	ATG	AGC	CGG	TCT	TCG	GGC
Ala	Arg 10	Met	Ser	Arg	Ser	Ser 15	Gly
GGT	GCC	CAC	CCC	TCG	GTG	CGT	CAG
Glv 25	Ala	His	Pro	Ser	Val 30	Arg	Gin
CCT	CAC	CGG	TCC	CGG	GGA	GGC	GGA

Thr	Pro	Ser	Arg	Gin	Pro Pro Leu Pro	His	Arg Ser Arg Gly	Gly Gly
		35			40		4 3
GGG	GGA	TCC	CGC	GGG	GGC GCC CGG GCC	TCG	CCC GCC ACG CAG	CCG CCA
192
Gly	Glv	Ser	Arg	Gly	Glv Ala Arg Ala	Ser	Pro Ala Thr Gin	Pro Pro
	50				55		60
CCG	CTG	CTG	CCG	CCC	TCG GCC ACG GGT	CCC	GAC GCG ACA GTG	GGC GGG
240
Pro	Leu	Leu	Pro	Pro	Ser Ala Thr Gly	Pro	Asp Ala Thr val	Gly Gly
65					70		75	80
CCA	GCG	CCG	ACC	CCG	CTG CTG CCC CCC	TCG	GCC ACA GCC TCG	GTC AAG
288
Pro	Ala	Pro	Thr	Pro	Leu Leu Pro Pro	Ser	Ala Thr Ala Ser	val Lys
				85		90		95
ATG	GAG	CCA	GAG	AAC	AAG TAC CTG CCC	GAA	CTC ATG GCC GAG	AAG GAC
336
Met	Glu	Pro	Glu	Asn	Lys Tyr Leu Pro	Glu	Leu Mat Ala Glu	Lys Asp

100 105 ΙΌ

TCG

CTC

GAC

CCG

TCC

/prt“»/··

ACT CAC

GCC

ATG

CAG

CTG

CTG

ACG

GCA GAA

384

Ser

Leu

As o

Pro

Ser

Phe

Thr His

Ala

Met

Gin

Leu

Leu

Thr

Ala Glu

115

120

125

ATT

GAG

AAG

ATT

CAG

GGA GAC

TCA

.AAA

.AAG

CAT

GAT

GAG

GAG AAT

432

Ile

Glu

Lvs

Ile

Gin

Lvs

Gly Asp

Sa zr

Lys

Lys

Λ3 w

Asp

Glu

Glu Asn

130 135 140

TAC	TTG	GAT	TTA	TTT	TCT CAT .AAG	AAC ATG AAA	CTG	AAA		CGA GTG
480
Tyr	Leu	Asp	Leu	Phe	Ser His Lys	Asn Mez Lys	Leu	Lys	Glu	l/a-
145					i	155				1 SC

-13CZ 291533 B6

CTG

ATA

CCT

GTC

AAG

CAG

TAT

CCC

AAG

TTC

AAT

TTT

GTG

GGG

AAG

528 Leu

Ile

Pro

Val

Lys

Gin

Tyr

Pro

Lys

Phe

Asn

Phe

Val

Gly

Lys

165

170

175

CTT

GGA

CCA

CAA

GGG

AAT

ACA

ATC

AAA

AGA

CTG

CAG

GAA

GAG

ACT

576

Leu

Gly

Pro

Gin

Gly

Asn

Thr

Ile

Lys

Arg

Leu

Gin

Glu

Glu

Thr

180

185

190

GCA

AAG

ATC

TCT

GTA

TTG

GGA

AAG

GGC

TCA

ATG

AGA

GAC

AAA

GCC

624

Ala

Lys

Ile

Ser

Val

Leu

Gly

Lys

Gly

Ser

Met

Arg

Asp

Lys

Ala

195

200

205

GAG

GAA

GAG

CTG

CGC

AAA

GGT

GGA

GAC

CCC

AAA

TAT

GCC

CAC

TTG

672

Glu

Glu

Glu

Leu

Arg

Lys

Gly

Gly

Asp

Pro

Lys

Tyr

Ala

His

Leu

210

215

220

ATG

GAT

CTG

CAT

GTC

TTC

ATT

GAA

GTC

TTT

GGA

CCC

CCA

TGT

GAG

720

ΑΤΤ ile

GGT

Gly

AAG

Lys

AAT

Asn

GCT

Met Asp Leu His Val Phe Ile Glu Val Phe Gly Pro Pro Cys Glu Ala ²²⁵ 230 235240

TAT GCT CTT ATG GCC CAT GCC ATG GAG GAA GTC AAG AAA TTT CTA GTA

768

Tyr Ala Leu Met Ala His Ala Met Glu Glu Val Lys Lys Phe Leu Val 245 250255

CCG GAT ATG ATG GAT GAT ATC TGT CAG GAG CAA TTT CTA GAG CTG TCC 816

Pro Asp Met Met Asp Asp Ile Cys Gin Glu Gin Phe Leu Glu Leu Ser 260 265270

TAC TTG AAT GGA GTA CCT GAA CCC TCT CGT GGA CGT GGG GTG CCA GTG 864

Tyr Leu Asn Gly Val Pro Glu Pro Ser Arg Gly Arg Gly Val Pro Val ²⁷⁵ 280285

AGA GGC CGG GGA GCT GCA CCT CCT CCA CCA CCT GTT CCC AGG GGC CGT 912

Arg

Gly 290

Arg

Gly

Ala

Ala

Pro 295

Pro

Pro

Pro

Pro

Val 300

Pro

Arg

Gly

Arg

GGT 960

GTT

GGA

CCA

CCT

CGG

GGG

GCT

TTG

GTA

CGT

GGT

ACA

CCA

GTA

AGG

Gly 305

Val

Gly

Pro

Pro

Arg 310

Gly

Ala

Leu

Val

Arg 315

Gly

Thr

Pro

Val

Arg 320

GGA

GCC

ATC

ACC

AGA

GGT

GCC

ACT

GTG

ACT

CGA

GGC

GTG

CCA

CCC

CCA

1008

Gly Ala

Ile

Thr

Arg

Gly

Ala

Thr

Val

Thr

Arg

Gly

Val

Pro

Pro

Pro

325

330

335

CCT ACT

GTG

AGG

GGT

GCT

CCA

GCA

CCA

AGA

GCA

CGG

ACA

GCG

GGC

ATC

1056

Pro Thr

Val

Arg

Gly

Ala

Pro

Ala

Pro

Arg

Ala

Arg

Thr

Ala

Gly

Ile

340

345

350

-14CZ 291533 B6

CAG AGG 1104 Gin Arg

ATA Ile 355

CCT Pro

TTG CCT CCA CCT CCT

GCA CCA GAA ACA -'XAT

GAA GAA Glu Glu

Leu

Pro Pro

Pro 360

Pro

Ala

Pro Glu

Thr 365

Tyr

TAT GGA

TAT

GAT

GAT

ACA

TAC

GCA

GAA

CAA

AGT

TAC

GAA

GGC

TAC

GAA

1 152

Tyr Glv

Tyr

Asp

Asp

Thr

Tyr

Ala

Glu

Gin

Ser

Tyr

Glu

Gly

Tyr

Glu

370

375

380

GGC TAT

TAC

AGC

CAG

AGT

CAA

GAC

TCA

GAA

TAT

TAT

GAC

TAT

GGA

1200

Gly Tyr

Tyr

Ser

Gin

Ser

Gin

Glv

Asp

Ser

Glu

Tyr

Tyr

Asp

Tyr

Gly

385

390

395

400

CAT GGG

GAG

GTT

CAA

GAT

TCT

TAT

GAA

GCT

TAT

GGC

CAG

GAC

GAC

TGG

1248

Kis Gly

Glu

Val

Gin

Asp

Ser

Tyr

Glu

Ala

Tyr

Gly

Gin

Asp

Asp

Trp

405

410

415

AAT GGG

ACC

AGG

CCG

TCG

CTG

AAG

GCC

CCT

CCT

GCT

AGG

CCA

GTG

AAG

1296

Asn Gly Thr	Arg Pro Ser 420		Lys	Ala 425	Pro	Pro Ala Arg Pro Val Lys 430
GGA GCA TAC	AGA	GAG	CAC	CCA	TAT	GGA	CGT	TAT	TAA
1332
Gly Ala Tyr	Arg	Glu	His		Tyr	Gly	Arg	Tyr	*
435					440

INFORMACE O SEKVENCI ID č. 2:

Charakteristika sekvence:

(A) délka: 1215 párů bází (B) Typ: nukleotid (C) Počet vláken: jedno (D) Konfigurace: lineární

Typ molekuly: DNAc

Hypotetická: ne

Antimediátorová: ne

Popis sekvence: SEQ ID č. 2

-15CZ 291533 B6

ATG CAG 48 Met Gin 1

CGC Arg

CGG GAC

GAC CCC GCC

GCG Ala

CGC ATG

AGC Ser

CGG TCT TCG

GGC Gly

Arg 10

Met

Arg Ser

Ser 15

Arg

Asp 5

Asp

Pro

Ala

CGT 96

AGC

GGC

TCC

ATG

GAC

CCC

TCC

GGT

GCC

CAC

CCC

TCG

GTG

CGT

CAG

Arg

Ser

Gly

Ser 20

Met

Asp

Pro

Ser

Gly 25

Ala

His

Pro

Ser

Val 30

Arg

Gin

ACG 144

CCG

TCT

CGG

CAG

CCG

CCG

CTG

CCT

CAC

CGG

TCC

CGG

GGA

GGC

GGA

Thr

Pro

Ser 35

Arg

Gin

Pro

Pro

Leu 40

Pro

His

Arg

Ser

Arg 45

Gly

Gly

Gly

GGG 192

GGA

TCC

CGC

GGG

GGC

GCC

CGG

GCC

TCG

CCC

GCC

ACG

CAG

CCG

CCA

Gly

Gly 50

Ser

Arg

Gly

Gly

Ala 55

Arg

Ala

Ser

Pro

Ala 60

Thr

Gin

Pro

Pro

CCG 240

CTG

CTG

CCG

CCC

TCG

GCC

ACG

GGT

CCC

GAC

GCG

ACA

GTG

GGC

GGG

Pro 65

Leu

Leu

Pro

Pro

Ser 70

Ala

Thr

Gly

Pro

ASp 75

Ala

Thr

Val

Gly

Gly 80

CCA 288

GCG

CCG

ACC

CCG

CTG

CTG

CCC

CCC

TCG

GCC

ACA

GCC

TCG

GTC

AAG

Pro

Ala

Pro

Thjt

Pro 85

Leu

Leu

Pro

Pro

Ser 90

Ala

Thr

Ala

Ser

Val 95

Lys

ATG GAG CCA GAG AAC AAG TAC CTG CCC GAA CTC ATG GCC GAG AAG GAC 336

Met Glu Pro Glu Asn Lys Tyr Leu Pro Glu Leu Met Ala Glu Lys Asp 100 105 HO

TCG CTC GAC CCG TCC TTC ACT CAC GCC ATG CAG CTG CTG ACG GCA GAA 384

Ser Leu Asp Pro Ser Phe Thr His Ala Met Gin Leu Leu Thr Ala Glu

115 120 125

ATT GAG 432

AAG Lys

ATT CAG

AAA GGA GAC

TCA AAA AAG GAT GAT GAG

GAG Glu

AAT Asn

Ile

Gin

Ser Lys

Lys

Asp 140

Asp

Glu

ile

Glu 130

Lys

Gly 135

Asp

TAC

TTG

GAT

TTA

TTT

TCT

CAT

AAG

AAC

ATG

AAA

CTG

AAA

GAG

CGA

GTG

480

Tyr

Leu

Asp

Leu

Phe

Ser

His

Lys

Asn

Met

Lys

Leu

Lys

G1U

Arg

Val

145

150

155

160

CTG

ATA

CCT

GTC

AAG

CAG

TAT

CCC

AAG

GAG

GAA

GAG

CTG

CGC

AAA

GGT

528

Leu

Ile

Pro

Val

Lys

Gin

Tyr

Pro

Lys

Glu

Glu

Glu

Leu

Arg

Lvs

Gly

165

170

175

GGA

GAC

CCC

AAA

TAT

GCC

CAC

TTG

AAT

ATG

GAT

CTG

CAT

GTC

TTC

ATT

576

Gly

ASp

Pro

Lys

Tyr

Ala

His

Leu

Asn

Met

Asp

Leu

His

Val

Phe

Z<Ls

180

135

190

GAA

GTC

TTT

GGA

CCC

CCA

TGT

GAG

GCT

TAT

GCT

crr

ATG

GCC

CAT

GCC

624

Glu

Val

Phe

Gly

Pro

Pro

Cys

Glu

Ala

Tyr

Ala

Leu

Met

Ala

His

Ala

195

200

205

-16CZ 291533 B6

ATG GAG GAA GTC AAG 672

AAA TTT CTA GTA CCG GAT ATG ATG GAT GAT

ATC Ile

Met

Glu Glu 210

Val Lys

Lys Phe 215

Leu

Val

Pro Asp Met 220

Met Asp Asp

TGT

CAG

GAG

CAA

TTT

CTA

GAG

CTG

TCC

TAC

TTG

AAT

GGA

GTA

CCT

GAA

720

Cys

Gin

Glu

Gin

Phe

Leu

Glu

Leu

Ser

Tyr

Leu

Asn

Gly

Val

Pro

Glu

225

230

235

240

CCC

TCT

CGT

GGA

CGT

GGG

GTG

CCA

GTG

AGA

GGC

CGG

GGA

GCT

GCA

CCT

768

Pro

Ser

Arg

Gly

Arg

Gly

Val

Pro

Val

Arg

Gly

Arg

Gly

Ala

Ala

Pro

245

250

255

CCT

CCA

CCA

CCT

GTT

CCC

AGG

GGC

CGT

GGT

GTT

GGA

CCA

CCT

CGG

GGG

816

Pro

Pro

Pro

Pro

Val

Pro

Arg

Gly

Arg

Gly

Val

Gly

Pro

Pro

Arg Gly

260

265

270

GCT

TTG

GTA

CGT

GGT

ACA

CCA

GTA

AGG

GGA

GCC

ATC

ACC

AGA

GGT

GCC

864

Ala

Leu

Val

Arg

Gly

Thr

Pro

Val

Arg

Gly

Ala

Ile

Thr

Arg

Gly

Ala

275

280

285

ACT

GTG

ACT

CGA

GGC

GTG

CCA

CCC

CCA

CCT

ACT

GTG

AGG

GGT

GCT

CCA

912

Thr

Val

Thr

Arg

Gly

Val

Pro

Pro

Pro

Pro

Thr

Val

Arg

Gly

Ala

Pro

290 295 300

GCA CCA AGA GCA CGG ACA GCG GGC ATC CAG AGG ATA CCT TTG CCT CCA 960

Ala Pro Arg Ala 305

Arg

Thr 310

Ala

Gly

Ile

Gin

Arg Ile 315

Pro Leu Pro Pro 320

CCT CCT

GCA

CCA

GAA

ACA

TAT

GAA

GAA

TAT

GGA

TAT

GAT

GAT

ACA

TAC

1008

Pro Pro

Ala

Pro

Glu

Thr

Tyr

Glu

Glu

Tyr

Gly

Tyr

Asp

Asp

Thr

Tyr

325

330

335

GCA GAA

CAA

AGT

TAC

GAA

GGC

TAC

GAA

GGC

TAT

TAC

AGC

CAG

AGT

CAA

1056

Ala Glu

Gin

Ser

Tyr

G1U

Gly

Tyr

Glu

Gly

Tyr

Tyr

Ser

Gin

Ser

Gin

340

345

350

GGG GAC

TCA

GAA

TAT

TAT

GAC

TAT

GGA

CAT

GGG

GAG

GTT

CAA

GAT

TCT

1104

Gly Asp

Ser

Glu

Tyr

Tyr

Asp

Tyr

Gly

His

Gly

Glu

Val

Gin

Asp

Ser

355

360

365

TAT GAA

GCT

TAT

GGC

CAG

GAC

GAC

TGG

AAT

GGG

ACC

AGG

CCG

TCG

CTG

1152

Tyr Glu

Ala

Tyr

Gly

Gin

Asp

Asp

Trp

Asn

Gly

Thr

Arg

Pro

Ser

Leu

370

375

380

AAG GCC

CCT

CCT

GCT

AGG

CCA

GTG

AAG

GGA

GCA

TAC

AGA

GAG

CAC

CCA

1200

Lys Ala

Pro

Pro

Ala

Arg

Pro

Val

Lys

Gly

Ala

Tyr

Arg

Glu

His

Pro

385

390

395

400

TAT GGA CGT TAT TAA 1215

Tyr Gly Arg Tyr *

405

-17CZ 291533 B6

INFORMACE O SEKVENCE ID č. 3:

Charakteristika sekvence:

(A) Délka: 726 párů bází (B) Typ: nukleotid (C) Počet vláken: jedno (D) Konfigurace: lineární io Typ molekuly: DNAc

Hypotetická: ne

Antimediátorová: ne

Popis sekvence: SEQ ID č. 3:

ATG 48

AGA

GAC

AAA

GCC

AAG

GAG

GAA

GAG

CTG

CGC

AAA

GGT

GGA

GAC

CCC

Met 1

Arg

Asp

Lys

Ala 5

Lys

Glu

Glu

Glu

Leu 10

Arg

LVS

Gly

Gly

Asp 15

Pro

AAA 96

TAT

GCC

CAC

TTG

AAT

ATG

GAT

CTG

CAT

GTC

TTC

ATT

GAA

GTC

TTT

Lys

Tyr

Ala

His 20

Leu

Asn

Met

Asp

Leu 25

His

Val

Phe

Ile

Glu 30

Val

Phe

GGA 144

CCC

CCA

TGT

GAG

GCT

TAT

GCT

CTT

ATG

GCC

CAT

GCC

ATG

GAG

GAA

Gly

Pro

Pro 35

Cys

Glu

Ala

Tyr

Ala 40

Leu

Met

Ala

His

Ala 45

Met

Glu

Glu

GTC 192

AAG

AAA

TTT CTA GTA CCG GAT ATG ATG

GAT GAT ATC TGT

CAG

GAG

Val

Lys

Lys

Phe

Leu

Val

Pro

ASp

Met

Met

Asp

Asp

Ile

Cys

Gin

Glu

50

55

60

-18CZ 291533 B6

CAA

TTT

CTA

GAG

CTG

TCC

TAC

TTG

AAT

GGA

GTA

CCT GAA

CCC

TCT

CGT

240

Gin

Phe

Leu

G1U

Leu

Ser

Tyr

Leu

Asn

Gly

Val

Pro Glu

Pro

Ser

Arg

65

70

75

80

GGA CGT 288 Gly Arg	GGG GTG CCA GTG AGA	GGC Gly
Gly	Val	Pro 85	Val	Arg
CCT 336	GTT	CCC	AGG	GGC	CGT	GGT	GTT
Pro	Val	Pro	Arg 100	Gly	Arg	Gly	Val
CGT 384	GGT	ACA	CCA	GTA	AGG	GGA	GCC
Arg	Gly	Thr 115	Pro	Val	Arg	Gly	Ala 120
CGA 432	GGC	GTG	CCA	CCC	CCA	CCT	ACT
Arg	Gly 130	Val	Pro	Pro	Pro	Pro 135	Thr
GCA 480	CGG	ACA	GCG	GGC	ATC	CAG	AGG
Ala 145	Arg	Thr	Ala	Gly	Ile 150	Gin	Arg
CCA 528	GAA	ACA	TAT	GAA	GAA	TAT	GGA
Pro	Glu	Thr	Tyr	Glu 165	Glu	Tyr	Gly
AGT	TAC	GAA	GGC	TAC	GA\	GGC	TAT

576

CGG	GGA	GCT	GCA	CCT	CCT	CCA	CCA
Arg	Gly 90	Ala	Ala	Pro	Pro	Pro 95	Pro
GGA	CCA	CCT	CGG	GGG	GCT	TTG	GTA
Gly 105	Pro	Pro	Arg	Gly	Ala 110	Leu	Val
ATC	ACC	AGA	GGT	GCC	ACT	GTG	ACT
Ile	Thr	Arg	Gly	Ala 125	Thr	Val	Thr
GTG	AGG	GGT	GCT	CCA	GCA	CCA	AGA
Val	Arg	Gly	Ala 140	Pro	Ala	Pro	Arg
ATA	CCT	TTG	CCT	CCA	CCT	CCT	GCA
Ile	Pro	Leu 155	Pro	Pro	Pro	Pro	Ala 160
TAT	GAT	GAT	ACA	TAC	GCA	GAA	CAA
Tyr	Asp 170	Asp	Thr	Tyr	Ala	Glu 175	Gin

TAC AGC CAG AGT CAA GGG GAC TCA

Ser

Tyr

Glu

Gly

Tyr

Glu

Gly

Tyr

Tyr

Ser

Gin

Ser Gin

Gly

Asp

Ser

180

185

190

GAA

TAT

TAT

GAC

TAT

GGA

CAT

GGG

GAG

GTT

CAA

GAT TCT

TAT

GAA

GCT

624

Glu

Tyr

Tyr

Asp

Tyr

Gly

His

Gly

Glu

Val

Gin

Aso Ser

Tyr

Glu

Ala

195

200

205

TAT

GGC

CAG

GAC

GAC

TGG

AAT

GGG

ACC

AGG

CCG

TCG CTG

AAG

GCC

CCT

672

Tyr

Gly

Gin

Asp

Asp

Trp

Asn

Gly

Thr

Arg

Pro

Ser Leu

Lys

Ala

Pro

210

215

220

CCT

GCT

AGG

CCA

GTG

AAG

GGA

GCA

TAC

AGA

GAG

CAC CCA

TAT

GGA

CGT

720

Pro

Ala

Arg

Pro

Val

Lys

Gly

Ala

Tyr

Arg

Glu

His Pro

Tyr

Gly

Arg

225

230

235

240

TAT TAA

726

Tyr *

-19CZ 291533 B6

INFORMACE O SEKVENCI ID č. 4:

Charakteristika sekvence:

(A) Délka: 24 párů bází (B) Typ: nukleotid (C) Počet vláken: jedno (D) Konfigurace: lineární

Typ molekuly: DNAc

Hypotetická: ne

Antimediátorová: ne

Popis sekvence: SEQ ID č. 4

CAGCTGCTGA CGGCAGAAAT

INFORMACE O SEKVENCI ID č. 5:

Charakteristika sekvence:

(A) Délka: 24 párů bází (B) Typ: nukleotid (C) Počet vláken: jedno (D) Konfigurace: lineární

Typ molekuly: DNAc

Hypotetická: ne

Antimediátorová: ne

Popis sekvence: SEQ ID č. 5:

TTAATAACGT CCATATGGGT

NFORMACE O SEKVENCI ID č. 6:

Charakteristika sekvence:

(A) Délka: 24 párů bází (B) Typ: nukleotid (C) Počet vláken: jedno (D) Konfigurace: lineární

Typ molekuly: DNAc

Hypotetická: ne

Antimediátorová: ne

Popis sekvence: SEQ ID č. 6

CAGTATCCCA AGGAAGGAAGA

TGAC

GCTC

GCTC

-20CZ 291533 B6

INFORMACE O SEKVENCI SEQ ID č. 7:

Charakteristika sekvence:

(A) Délka: 24 párů bází (B) Typ: nukleotid (C) Počet vláken: jedno (D) Konfigurace: lineární

Typ molekuly: DNAc

Hypotetická: ne

Antimediátorová: ne

Popis sekvence: SEQ ID č. 7 CTGTCAAGCA GTATCCCAAG

NFORMACE O SEKVENCI ID č. 8:

Charakteristika sekvence:

(A) Délka: 24 párů bází (B) Typ: nukleotid (C) Počet vláken: jedno (D) Konfigurace: lineární

Typ molekuly. DNAc

Hypotetická: ne

Antimediátorová: ne

Popis sekvence SEQ ID č. 8

AAGGGCTCAA TGAGAGACAA

INFORMACE O SEKVENCI ID č. 9:

Charakteristika sekvence:

(A) Délka: 24 párů bází (B) Typ: nukleotid (C) Počet vláken: jedno (D) Konfigurace: lineární

Typ molekuly: DNAc

Hypotetická: ne

Antimediátorová: ne

Popis sekvence: SEQ ID č. 9:

GTATGTATCA TCATATCCAT

GAGG

AGCC

ATTC

-21CZ 291533 B6

Claims (18)

1. PATENTOVÉ NÁROKY

   1. Derivát proteinu p62, který je polypeptid obsahující sekvenci uvedenou v seznamu sekvencí jako SEKVENCE ID. Č. 2 nebo SEKVENCE ID. Č. 3.
2. 2. Nukleová kyselina, která kóduje polypeptid podle nároku 1.
3. 3. Nukleová kyselina podle nároku 2, která je cDNA nebo RNA.
4. 4. Nukleová kyselina podle nároku 2 nebo 3, která je vybrána ze skupiny obsahující:

   a) SEKVENCI ID. Č. 2 nebo SEKVENCI ID. Č. 3 nebo sekvenci k ní komplementární,

   b) nukleotidovou sekvenci, která hybridizuje s komplementární sekvencí k SEKVENCI ID. Č. 2 nebo SEKVENCI ID. Č. 3 v přítomnosti formamidu při 42 °C a po promytí při 50 °C a 60 °C,

   c) varianty sekvence z a) nebo b), které jsou důsledkem degenerace genetického kódu.
5. 5. Nukleová kyselina mající sekvenci uvedenou v seznamu sekvencí jako SEKVENCE ID. Č.

   2.
6. 6. Nukleová kyselina mající sekvenci uvedenou v seznamu sekvencí jako SEKVENCE ID. Č.

   3.
7. 7. Expresní kazeta, která obsahuje nukleovou kyselinu podle kteréhokoliv z nároků 2 až 6 a dále obsahuje promotor pro expresi nukleové kyseliny a signál pro ukončení transkripce.
8. 8. Vektor, který obsahuje nukleovou kyselinu podle kteréhokoliv z nároků 2 až 6 nebo kazetu podle nároku 7.
9. 9. Vektor podle nároku 8, který je plazmidovým vektorem.
10. 10. Vektor podle nároku 8, který je virovým vektorem.
11. 11. Vektor podle nároku 10, který je odvozen zadenoviru, retroviru, adeno-asociovaného viru nebo herpes viru.
12. 12. Detektivní rekombinantní retrovirus, jehož genom obsahuje nukleovou kyselinu podle kteréhokoliv z nároků 2 až 6 nebo kazetu podle nároku 7.
13. 13. Defektní rekombinantní adenovirus, jehož genom obsahuje nukleovou kyselinu podle kteréhokoliv z nároků 2 až 6 nebo kazetu podle nároku 7.
14. 14. Farmaceutická kompozice, vyznačující se tím, že obsahuje nukleovou kyselinu podle nároku 2.
15. 15. Farmaceutická kompozice, vyznačující se tím, že obsahuje vektor podle nároku

    8.
16. 16. Farmaceutická kompozice, vyznačující se tím, že obsahuje derivát podle nároku 1.

    -22CZ 291533 B6
17. 17. Farmaceutická kompozice podle kteréhokoliv z nároků 14 až 16 k léčení rakoviny.
18. 18. Použití nukleové kyseliny podle nároku 2 nebo vektoru podle nároku 8 pro výrobu farmaceutické kompozice určené k léčení nemocí spojených s hyperproliferací.