EP0828832A2 - $g(D)P62, SES VARIANTS, SEQUENCES D'ACIDES NUCLEIQUES LES CODANT, ET LEURS UTILISATIONS EN THERAPIE GENIQUE ANTI-CANCEREUSE - Google Patents

$g(D)P62, SES VARIANTS, SEQUENCES D'ACIDES NUCLEIQUES LES CODANT, ET LEURS UTILISATIONS EN THERAPIE GENIQUE ANTI-CANCEREUSE

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Publication number
EP0828832A2
EP0828832A2 EP96918728A EP96918728A EP0828832A2 EP 0828832 A2 EP0828832 A2 EP 0828832A2 EP 96918728 A EP96918728 A EP 96918728A EP 96918728 A EP96918728 A EP 96918728A EP 0828832 A2 EP0828832 A2 EP 0828832A2
Authority
EP
European Patent Office
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nucleic acid
pro
gly
vector
ala
Prior art date
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Withdrawn
Application number
EP96918728A
Other languages
German (de)
English (en)
Inventor
Fabien Schweighoffer
Bruno Tocque
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Aventis Pharma SA
Original Assignee
Rhone Poulenc Rorer SA
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Rhone Poulenc Rorer SA filed Critical Rhone Poulenc Rorer SA
Publication of EP0828832A2 publication Critical patent/EP0828832A2/fr
Withdrawn legal-status Critical Current

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    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/46—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates
    • C07K14/47—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates from mammals
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K48/00—Medicinal preparations containing genetic material which is inserted into cells of the living body to treat genetic diseases; Gene therapy
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/85—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for animal cells
    • C12N15/86—Viral vectors
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2799/00—Uses of viruses
    • C12N2799/02—Uses of viruses as vector
    • C12N2799/021—Uses of viruses as vector for the expression of a heterologous nucleic acid
    • C12N2799/022—Uses of viruses as vector for the expression of a heterologous nucleic acid where the vector is derived from an adenovirus

Definitions

  • the present invention relates to a new polypeptide designated ⁇ P62, its variants, the corresponding nucleic sequences, and their therapeutic uses, in particular in anti-cancer gene therapy.
  • oncogenes and suppressor genes are involved in the control of cell division.
  • the ras genes and their products generally designated p21 proteins, play a key role in controlling cell proliferation in all the eukaryotic organisms where they have been sought.
  • certain specific modifications of these proteins cause them to lose their normal control and lead them to become oncogenic.
  • a large number of human tumors have been associated with the presence of modified ras genes.
  • overexpression of these p21 proteins can lead to disruption of cell proliferation. Understanding the exact role of these p21 proteins in cells, their mode of operation and their characteristics therefore constitutes a major challenge for the understanding and therapeutic approach of carcinogenesis.
  • the GAP protein was the first whose involvement in transduction signal has been documented. It is a cytosolic protein present in all eukaryotic organisms which has the ability to greatly accelerate the hydrolysis of GTP, linked to the normal protein. It has two areas ensuring distinct functions. Its carboxy-terminal end carries the catalytic activity which interacts with the p21 proteins and which increases their GTPase activity.
  • SH2 and SH3 domains which participate in the transduction of the message and interact with other proteins.
  • proteins are two proteins, p62 and p190, of 62kDa and 190 kDa respectively, which are strongly phosphorylated to tyrosine.
  • p62 and p190 proteins which are strongly phosphorylated to tyrosine.
  • These two proteins form a specific complex with GAP and are immunoprecipitated by antibodies directed against different epitopes of GAP.
  • Amino acids 271 to 443 of p62 contain phosphorylated tyrosines and appear to be involved in these interactions.
  • the p62 protein (or even Sam68) has been identified by Wong et al. (Cell 69 (1992) 551). It contains 443 amino acids, the sequence of which has been described in the literature (see SEQ ID No. 1). In addition to the characteristics mentioned above, the p62 protein has several characteristics specific to hnRNP ("heterogeneous nuclear RiboNucleoProtein”):
  • a first object of the invention therefore relates to any p62 derivative capable of at least partially inhibiting the interaction between a GAP protein and p62.
  • the derivatives according to the invention are capable of at least partially inhibiting the oncogenic power of the ras and / or src proteins.
  • the derivatives according to the invention are capable of inducing cell death by apoptosis.
  • the derivatives according to the invention are also characterized by the loss of the ability to interact with the RNA of p62.
  • the present invention describes in particular the detection, cloning and characterization of a natural isoform of the protein p62.
  • This isoform designated ⁇ p62 (or ⁇ Sam ⁇ )
  • ⁇ p62 has a deletion in the zone of homology to the GRP33 protein, which covers the KH domain. Due to this deletion, ⁇ p62 does not have all of the properties of p62. Thus, ⁇ p62 has an interaction domain with GAP and GRB2 intact as well as the various sequences rich in prolines partners of SH3 ( Figure 1). However, ⁇ p62 is no longer able to interact with nucleic acids due to the deletion of the domain of homology to the GRP33 protein.
  • ⁇ p62 therefore interferes with the proliferation and differentiation processes and leads, in the various cell models, to cell death by apoptosis.
  • the invention relates more particularly to any p62 derivative carrying at least one deletion in the region of homology to the GRP33 protein. More particularly, the derivatives according to the invention comprise at least one deletion in the region between residues 145 to 247 of the protein p62 as shown in the sequence SEQ ID No. 1, and which covers the KH domain.
  • the deletion advantageously relates to more than 10 amino acids and, more preferably, to more than 30 acids amines. It can relate to one or more sites inside this region, as soon as the resulting derivative exhibits the properties described above.
  • the derivative according to the invention is a polypeptide comprising all or part of the sequence SEQ ID No. 2 or a variant thereof.
  • the term variant within the meaning of the invention denotes any polypeptide whose structure is distinguished from the sequence SEQ ID No. 2 by one or more modifications of a genetic, biochemical and / or chemical nature. It may in particular be any mutation, substitution, deletion, addition and / or modification of one or more residues.
  • Such derivatives can be generated for different purposes, such as in particular that of increasing the affinity of the peptide for its interaction site, that of improving its production levels, that of increasing its resistance to proteases or of '' improve its passage through cell membranes, that of increasing its therapeutic efficacy or reducing its side effects, or that of giving it new pharmacokinetic and / or biological properties.
  • the variants include deletions or mutations relating to amino acids the presence of which is not decisive for the activity of the derivative.
  • Such amino acids can be identified, for example, by cell activity tests as described in the examples.
  • the derivatives of the invention retain at least part of the p62 protein allowing interaction with the SH2 domain of GAP.
  • This part of p62 is more particularly composed of phosphorylated tyrosines, localized between residues 200 to 450 of the protein p62 (Cf SEQ ID No. 1).
  • a preferred derivative according to the invention therefore comprises at least (i) a deletion in the region between residues 145 to 247 of p62 and (ii) a part of p62 allowing interaction with the SH2 domain of GAP. More preferably, the deletion relates to residues 1 to 202.
  • derivatives according to the invention having particularly advantageous properties may consist of polypeptides essentially comprising the region carrying the phosphorylated tyrosines of p62.
  • a particularly preferred example of a polypeptide according to the invention is represented by the ⁇ p62 polypeptide of sequence SEQ ID No. 2, having a deletion of residues 170-208 of the sequence of p62.
  • Another example is represented by the polypeptide p62-C comprising the residues 203 to 443 of p62 (sequence SEQ ID No. 3).
  • ⁇ p62 can enter into competition with p62 with respect to GAP.
  • GAP being one of the effectors of the Ras proteins
  • ⁇ p62 blocks the mitogenic pathways which depend on it.
  • Overexpressed by gene transfer (transfection, infection, microinjection, etc.) ⁇ p62 induces cell death by apoptosis in normal (fibroblasts NIH3T3 and Swiss 3T3) or tumor (H460; HCT116) cells, and is capable of inhibiting the formation of foci induced by ras.
  • the p62-C derivative (essentially comprising the C-terminal part of ⁇ p62, which covers the region between amino acids 203 and 443 and which corresponds to the domain of interaction with the SH2 domains of GAP and of GRB2).
  • This C-terminal part also contains three sites for interaction with the SH3 domains, those having the most affinity for Fyn.
  • the significant therapeutic activity of the derivatives according to the invention is linked to their multiple properties, and in particular their capacity for titrating the SH3 domains of proteins of the src family (example: fyn), their capacity for inhibiting the recruitment of GRB2 by titrating its SH2 domain, and their ability to inhibit the effector function of the GAP protein for signaling pathways which depend on Ras.
  • the nucleic acid according to the invention can be a ribonucleic acid (RNA) or deoxyribonucleic acid (DNA).
  • RNA ribonucleic acid
  • DNA deoxyribonucleic acid
  • gDNA genomic DNA
  • cDNA complementary DNA
  • It can be of human, animal, viral, synthetic or semi-synthetic origin. It can be obtained in different ways and in particular by chemical synthesis using the sequences presented in the application and for example a nucleic acid synthesizer. It can also be obtained by screening libraries using specific probes, in particular as described in the application (see sequences SEQ ID No. 6 and 7 for example).
  • nucleic acids of the invention can be prepared according to any technique known to those skilled in the art.
  • the nucleic acid according to the invention is a cDNA or an RNA.
  • the nucleic acid according to the invention is advantageously chosen from: (a) all or part of the sequence SEQ ID No. 2 or SEQ ID No. 3 or their complementary strand, (b) any sequence hybridizing with the sequences (a ) and coding for a derivative according to the invention,
  • the present invention also relates to any expression cassette comprising an acid nucleic acid as defined above, a promoter allowing its expression and a transcription termination signal.
  • the promoter is advantageously chosen from functional promoters in mammalian cells, preferably human. More preferably, it is a promoter allowing the expression of a nucleoic acid in a hyperproliferative cell (cancerous, restenosis, etc.).
  • promoters can be used. It may for example be the own promoter of the p62 gene. They can also be regions of different origin (responsible for the expression of other proteins, or even synthetic). It can thus be any promoter or derived sequence stimulating or repressing the transcription of a gene in a specific way or not, inducible or not, strong or weak. Mention may in particular be made of the promoter sequences of eukaryotic or viral genes. For example, they may be promoter sequences originating from the genome of the target cell.
  • ubiquitous promoters can be used in particular (promoter of the HPRT, PGK genes, ⁇ -actin, tubulin, etc.), promoters of intermediate filaments (promoter of the GFAP genes, desmin, vimentin, neurofilaments, keratin, etc. ), promoters of therapeutic genes (for example the promoter of the MDR, CFTR, Factor VIII, ApoAl genes, etc.), tissue-specific promoters (promoter of the pyruvate kinase gene, villin, intestinal fatty acid binding protein, ⁇ - smooth muscle actin, etc.) or promoters responding to a stimulus (steroid hormone receptor, retinoic acid receptor, etc.).
  • they may be promoter sequences originating from the genome of a virus, such as for example the promoters of the E1A and MLP genes of adenovirus, the early promoter of CMV, or also the promoter of the RSV LTR, etc. .
  • these promoter regions can be modified by adding activation or regulatory sequences, or allowing tissue-specific or majority expression.
  • the present invention now provides new therapeutic agents which, by their iterative antiprol properties and / or apoptotics to interfere with many cellular dysfunctions.
  • the nucleic acids or cassettes according to the invention can be injected as such at the site to be treated, or incubated directly with the cells to be destroyed or treated.
  • nucleic acid or the cassette is incorporated into a vector.
  • the vector used can be of chemical origin (liposome, nanoparticle, peptide complex, cationic lipids or polymers, etc.) viral (retrovirus, Adenovirus, herpes virus, AAV, vaccinia virus, etc.) or plasmid.
  • the use of viral vectors is based on the natural properties of transfection of viruses.
  • adenoviruses for example, adenoviruses, herpes viruses, retroviruses and associated adeno viruses. These vectors are particularly effective in terms of transfection.
  • a preferred object according to the invention resides in a defective recombinant retrovirus whose genome comprises a nucleic acid as defined above.
  • Another particular object of the invention resides in a defective recombinant adenovirus whose genome comprises a nucleic acid as defined above.
  • the vector according to the invention can also be a non-viral agent capable of promoting the transfer and expression of nucleic acids in eukaryotic cells.
  • Chemical or biochemical vectors, synthetic or natural represent an interesting alternative to natural viruses in particular for reasons of convenience, security and also by the absence of theoretical limit as regards the size of the DNA to be transfected.
  • These synthetic vectors have two main functions, to compact the nucleic acid to be transfected and to promote its cell fixation as well as its passage through the plasma membrane and, where appropriate, the two nuclear membranes.
  • the non-viral vectors all have polycationic charges.
  • the nucleic acid or vector used in the present invention can be formulated for topical, oral, parenteral, intranasal, intravenous, intramuscular, subcutaneous, intraocular, transdermal, etc. administration.
  • the nucleic acid or the vector is used in an injectable form. It can therefore be mixed with any pharmaceutically acceptable vehicle for an injectable formulation, in particular for a direct injection at the site to be treated. They may in particular be sterile, isotonic solutions, or dry compositions, in particular lyophilized, which, by addition as appropriate of sterilized water or physiological saline, allow the constitution of injectable solutes.
  • a direct injection of the nucleic acid into the patient's tumor is advantageous because it allows the therapeutic effect to be concentrated in the affected tissues.
  • the doses of nucleic acid used can be adapted according to different parameters, and in particular according to the gene, the vector, the mode of administration used, the pathology concerned or even the duration of the treatment sought.
  • the invention also relates to any pharmaceutical composition comprising at least one nucleic acid.
  • composition comprising at least one vector as defined above. It also relates to any pharmaceutical composition comprising at least one p62 derivative as defined above.
  • the pharmaceutical compositions according to the invention are very particularly suitable for the treatment of hyperproliferative disorders, such as in particular cancers and restenosis.
  • the present invention thus provides a particularly effective method for the destruction of cells, in particular of hyperproliferative cells. It can be used in vitro or ex vivo. Ex vivo, it essentially consists in incubating the cells in the presence of one or more nucleic acids (or of a vector, or cassette or directly of the derivative). In vivo, it consists in administering to the organism an active quantity of a vector (or of a cassette) according to the invention, preferably directly at the level of the site to be treated (tumor in particular).
  • the subject of the invention is also a method of destroying hyperproliferative cells comprising bringing said cells or a part of them into contact with a nucleic acid as defined above.
  • the present invention is advantageously used in vivo for the destruction of cells in hyperprol iteration (ie in abnormal proliferation). It is thus applicable to the destruction of tumor cells or smooth muscle cells of the vascular wall (restenosis). It is particularly suitable for the treatment of cancers in which an activated oncogene is involved.
  • colon adenocarcinomas thyroid cancers, lung carcinomas, myeloid leukemias, colorectal cancers, breast cancers, lung cancers, gastric cancers, cancer of the lungs esophagus, B lymphomas, ovarian cancer, bladder cancer, glioblastoma, hepatocarcinoma, bone, skin, pancreatic cancer, kidney and prostate cancer, etc.
  • the products of the invention are also useful for the identification of other partners in oncogenic signaling pathways, by searching for inhibitors, agonists, competitors or molecules interacting in vivo with these products.
  • the invention also relates to the antisense sequences, the expression of which in a target cell makes it possible to control the transcription and / or the translation of cellular mRNA coding for p62 or ⁇ p62.
  • sequences can for example be transcribed in the target cell into RNA complementary to the cellular mRNA ⁇ p62 or p62 and thus block their translation into protein according to the technique described in patent EP 140 308.
  • sequences may consist of all or part of the nucleic sequences SEQ ID No. 1, 2 or 3, transcribed in the reverse orientation .
  • the present invention also relates to the use of any compound capable of inducing the expression or the overexpression of ⁇ p62 in a cell for the preparation of a pharmaceutical composition intended for the treatment of hyperproliferative disorders.
  • Figure 1 Schematic representation of the structural domains of p62 and ⁇ p62.
  • Figure 2 Effect of p62 and ⁇ p62 on transactivation by ras proteins of an RRE derived from the enhancer of the polyome virus.
  • Figure 3 Demonstration of cell death induced by ⁇ p62 in NIH3T3 fibroblasts.
  • Figure 4 Demonstration of the expression of ⁇ p62 in embryonic fibroblasts treated with different cytotoxic agents and by deprivation of serum.
  • Figure 5 Inhibition of the formation of foci induced by oncogenes.
  • the pBR322, pUC and phage plasmids of the M13 series are of commercial origin (Bethesda Research Laboratories).
  • the DNA fragments can be separated according to their size by electrophoresis in agarose or acrylamide gels, extracted with phenol or with a phenol / chloroform mixture, precipitated with ethanol and then incubated in the presence of the DNA ligase from phage T4 (Biolabs) according to the supplier's recommendations.
  • the filling of the protruding 5 ′ ends can be carried out by the Klenow fragment of DNA Polymerase I of E. coli (Biolabs) according to the supplier's specifications.
  • the destruction of the protruding 3 ′ ends is carried out in the presence of the DNA polymerase of phage T4 (Biolabs) used according to the manufacturer's recommendations.
  • the destruction of the protruding 5 ′ ends is carried out by gentle treatment with nuclease S1.
  • Mutagenesis directed in vitro by synthetic oligodeoxynucleotides can be carried out according to the method developed by Taylor et al. [Nucleic Acids Res. 13 (1985) 8749-8764] using the kit distributed by Amersham.
  • PCR Polymerase-catalyzed Chain Reaction, Saiki RK et al., Science 22 ⁇ (1985) 1350-1354; Mullis KB and Faloona FA, Meth. Enzym. 155 (1987) 335-350]
  • DNA thermal cycler Perkin Elmer Cetus
  • Verification of the nucleotide sequences can be carried out by the method developed by Sanger et al. [Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 74 (1977) 5463-5467] using the kit distributed by Amersham.
  • Example 1 Isolation of the DNA complementary to ⁇ o62.
  • the complementary DNA of ⁇ p62 was isolated by PCR on a population of complementary DNA synthesized from poly A + RNA extracted from human placenta. 1 ⁇ g of DNA was used in conjunction with the primers derived from the sequence of p62 and which cover amino acids 123 to 131 on the one hand (oligo 5 ') and 437 to 443 on the other hand (oligo 3').
  • the sequences of these primers are as follows: 5 'oligo: CAGCTGCTGACGGCAGAAATTGAG (SEQ ID No. 4) 3' oligo: TTAATAACGTCCATATGGGTGCTC (SEQ ID No. 5)
  • this p62 isoform was confirmed by screening for a DNA library complementary to human placenta established in the vector ⁇ gt 1 1.
  • the oligonucleotide used for this screening is a 24-mer corresponding to the specific junction of the deletion present in
  • Example 2 Construction of expression vectors of ⁇ p62 and p62-C.
  • This example describes the construction of vectors usable for the transfer of the nucleic acids of the invention in vitro or in vivo.
  • Plasmid vector
  • This vector is a eukaryotic expression vector.
  • the nucleic acids coding for the variants p62-C and ⁇ p62 were inserted into this vector in the form of EcoRI fragments. They are thus placed under the control of the promoter of the enhancer of the SV40 virus.
  • the vector pcDNA3 (Invitrogen). It is also a eukaryotic expression vector. The nucleic acids coding for the variants p62-C and ⁇ p62, were inserted into this vector in the form of fragments
  • the invention resides in the construction and the use of viral vectors allowing the transfer and the expression in vivo of nucleic acids as defined above.
  • adenoviruses various serotypes, whose structure and properties vary somewhat, have been characterized.
  • serotypes it is preferred to use, in the context of the present invention, human adenoviruses of type 2 or 5 (Ad 2 or Ad 5) or adenoviruses of animal origin (see application WO 94/26914).
  • adenoviruses of animal origin which can be used in the context of the present invention, mention may be made of adenoviruses of canine, bovine, murine origin (example: Mav1, Beard et al., Virology 75 (1990) 81), ovine, porcine , avian or even simian (example: after-sales service).
  • the adenovirus of animal origin is a canine adenovirus, more preferably a CAV2 adenovirus [Manhattan strain or A26 / 61 (ATCC VR-800) for example].
  • adenoviruses of human or canine or mixed origin are used.
  • the defective adenoviruses of the invention comprise ITRs, a sequence allowing the encapsidation and a nucleic acid according to the invention.
  • the E1 region at least is non-functional.
  • the viral gene considered can be made non-functional by any technique known to a person skilled in the art, and in particular by total suppression, substitution, partial deletion, or addition of one or more bases in the gene (s) considered. Such modifications can be obtained in vitro (on isolated DNA) or in situ, for example, by means of genetic engineering techniques, or by treatment with mutagenic agents.
  • the adenovirus according to the invention comprises a deletion in the E1 and E4 regions.
  • it comprises a deletion in region E1 at the level of which the region E4 and the nucleic acid of the invention are inserted (Cf FR94 13355).
  • the deletion in the E1 region preferably extends from nucleotides 455 to 3329 on the sequence of the adenovirus Ad5.
  • the defective recombinant adenoviruses according to the invention can be prepared by any technique known to those skilled in the art (Levrero et al., Gene 101 (1991) 195, EP 185 573; Graham, EMBO J. 3 (1984) 2917). In particular, they can be prepared by homologous recombination between an adenovirus and a plasmid carrying inter alia the DNA sequence of interest. Homologous recombination occurs after co-transfection of said adenovirus and plasmid in an appropriate cell line.
  • the cell line used must preferably (i) be transformable by said elements, and (ii), contain the sequences capable of complementing the part of the genome of the defective adenovirus, preferably in integrated form to avoid the risks of recombination.
  • a line mention may be made of the human embryonic kidney line 293 (Graham et al., J. Gen. Virol. 36 (1977) 59) which contains in particular, integrated into its genome, the left part of the genome an Ad5 adenovirus (12%) or lines capable of complementing the E1 and E4 functions as described in particular in applications No. WO 94/26914 and WO95 / 02697. Then, the adenoviruses which have multiplied are recovered and purified according to conventional techniques of molecular biology, as illustrated in the examples.
  • AAV adeno-associated viruses
  • the defective recombinant AAVs according to the invention can be prepared by cotransfection, in a cell line infected with a human helper virus (for example an adenovirus), of a plasmid containing a nucleic sequence of the invention of interest bordered by two inverted repeat regions (ITR) of AAV, and of a plasmid carrying the packaging genes (rep and cap genes) of AAV.
  • a cell line which can be used is, for example, line 293.
  • the recombinant AAVs produced are then purified by conventional techniques.
  • retroviruses are integrative viruses, selectively infecting dividing cells. They therefore constitute vectors of interest for cancer applications.
  • the genome of retroviruses essentially comprises two LTRs, an encapsidation sequence and three coding regions (gag, pol and env).
  • gag, pol and env genes are generally deleted, in whole or in part, and replaced by a heterologous nucleic acid sequence of interest.
  • retroviruses such as in particular MoMuLV
  • murine moloney leukemia virus also designated MoMLV
  • MSV murine moloney sarcoma virus
  • HaSV harvey sarcoma virus
  • SNV spleen necrosis virus
  • RSV rous sarcoma virus
  • a plasmid comprising in particular the LTRs
  • the packaging sequence and said nucleic acid is constructed, then used to transfect a cell line called packaging, capable to provide trans deficient retroviral functions in the plasmid.
  • packaging lines are therefore capable of expressing the gag, pol and env genes.
  • packaging lines have been described in the prior art, and in particular the line PA317 (US 4,861, 719); the PsiCRIP line (WO 90/02806) and the GP + envAm-12 line (WO 89/07150).
  • the recombinant retroviruses may include modifications at the level of the LTRs to suppress transcriptional activity, as well as extended packaging sequences comprising a part of the gag gene (Bender et al., J. Virol. 61 (1987) 1639).
  • the recombinant retroviruses produced are then purified by conventional techniques.
  • a defective recombinant adenovirus or retrovirus indeed have properties which are particularly advantageous for the transfer of genes into tumor cells.
  • cationic polymers of polylysine type (LKLK) n, (LKKL) n, immine polyethylene and DEAE dextran or alternatively cationic or lipofectant lipids. They have the property of condensing DNA and promoting its association with the cell membrane.
  • lipopolyamines lipofectamine, transfectam, etc.
  • DOTMA cationic or neutral lipids
  • DOGS DOGS
  • DOPE DOPE
  • NIH 3T3 fibroblasts were transfected with a reporter gene, that of chloramphenicol acetyl transferase, placed under the control of Ras response elements derived from the enhancer of the polyome virus. These elements are stimulated 15 to 20 times when the cells are cotransfected with an expression vector carrying the cDNA of the SV40 Middle T (MT) oncogene. This stimulation is only slightly affected when a cotransfection provides the expression vectors of p62-C and of ⁇ p62 (see example 2). When cotransfection is performed, no longer with MT but with the activated form of the Ha-ras oncogene (Val 12), the CAT activity is stimulated 30 to 40 times above the basic level.
  • MT Middle T
  • p62-C and ⁇ p62 almost completely inhibit any activity due to oncogenic Ras.
  • the stimulation obtained by cotransfection with the v-src oncogene is strongly inhibited by the proteins p62-C and ⁇ p62, but not by p62.
  • Example 4 Demonstration of cell death induced by ⁇ p62 in NIH3T3 fibroblasts ( Figure 3).
  • NIH3T3 fibroblasts were transfected with an efficiency of 60% with 5 ⁇ g of ⁇ p62 expression vector (example 2). 24 hours after transfection, the cells show a significant alteration in their viability compared to the control. Analysis of their DNA reveals after migration on agarose gel degradation scales characteristic of apoptosis phenomena. The same phenomena are observed when p62-C is transfected under the same conditions as ⁇ p62.
  • Example 5 Demonstration of the expression of ⁇ p62 in embryonic fibroblasts treated with different cytotoxic agents and by deprivation of serum (Fi ⁇ ure 4).
  • This example describes another study showing that ⁇ p62 interferes with the transformation process induced by oncogenes. More particularly, this example demonstrates that ⁇ p62 is capable of inhibiting the formation of foci induced by different oncogenes (oncogenic ras, v-src) in NIH-3T3 cells, while p62 does not affect this phenomenon.
  • NIH3T3 fibroblasts were co-transfected with 0.1 ⁇ g of v-Src or Ha-Ras Val12 expression vector and with 4 mg of p62, ⁇ p62 or empty expression vector (Example 2).
  • the cells were maintained in a medium containing 10% newborn calf serum and the number of outbreaks was determined after fixing and staining of the cells in the presence of fuchsin phenol. The experiments were carried out in triplicate.
  • Example 7 Demonstration of an interaction with src in vivo
  • NIH3T3 fibroblasts were transfected with a p62 or ⁇ p62 expression vector comprising a myc marker ("myc teg") (Example 2).
  • the transfected cells were kept in asynchronous growth or blocked in the mitotic phase by treatment by nocodazole.
  • the cells were then co-transfected with a v-Src or empty expression vector. 48 hours later, the cells were lysed and the complexes formed were immunodetected using anti-myc antibodies (antibody 9E10) and anti-Src antibodies (antibody N16).
  • NAME RHONE POULENC RORER S.A.
  • GCA CCA AGA GCA CGG ACA GCG GGC ATC CAG AGG ATA CCT TTG CCT CCA 960
  • GCA CGG ACA GCG
  • GGC ATC CAG AGG ATA CCT TTG CCT CCA CCT CCT GCA 480

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Abstract

La présente invention concerne un nouveau polypeptide désigné DELTA P62, ou DELTA Sam68, ses variants, les séquences nucléiques correspondantes, et leurs utilisations, notamment en thérapie génique anti-cancéreuse.

Description

ΔP62. SES VARIANTS. SEQUENCES NUCLEIQUES ET LEURS
UTILISATIONS
La présente invention concerne un nouveau polypeptide désigné ΔP62, ses variants, les séquences nucléiques correspondantes, et leurs utilisations thérapeutiques, notamment en thérapie génique anti¬ cancéreuse.
Différents gènes, appelés oncogènes et gènes suppresseurs, sont impliqués dans le contrôle de la division cellulaire. Parmi ceux-ci, les gènes ras, et leurs produits généralement désignés protéines p21 , jouent un rôle clé dans le contrôle de la prolifération cellulaire chez tous les organismes eucaryotes où ils ont été recherchés. Notamment, il a été montré que certaines modifications spécifiques de ces protéines leur font perdre leur contrôle normal et les conduisent à devenir oncogéniques. Ainsi, un grand nombre de tumeurs humaines a été associé à la présence de gènes ras modifiés. De même, une surexpression de ces protéines p21 peut conduire à un dérèglement de la prolifération cellulaire. La compréhension du rôle exact de ces protéines p21 dans les cellules, de leur mode de fonctionnement et de leurs caractéristiques constitue donc un enjeu majeur pour la compréhension et l'approche thérapeutique de la cancérogénèse.
In vivo, on ne connait pas la nature précise des événements responsables de la transduction du signal initié par les protéines p21. Cependant, un nombre croissant de résultats souligne la multiplicité des effecteurs qui interagissent directement et préférentiellement avec la forme active (liée au GTP) des protéines ras. Parmi ces effecteurs, la protéine GAP a été la première dont l'implication dans la transduction du signal a été documentée. Il s'agit d'une protéine cytosolique présente chez tous les organismes eucaryotes qui possède la faculté d'accélérer fortement l'hydrolyse du GTP, lié à la protéine normale. Elle possède deux domaines assurant des fonctions distinctes. Son extrémité carboxy-terminale porte l'activité catalytique qui interagit avec les protéines p21 et qui augmente leur activité GTPase. A son autre extrémité, en aval de la partie N-terminale, se trouve une juxtaposition de domaines SH2 et SH3 qui participent à la transduction du message et interagissent avec d'autres protéines. Parmi ces protéines se trouvent deux protéines, p62 et p190, respectivement de 62kDa et 190 kDa qui sont fortement phosphorylées en tyrosine. Ces deux protéines forment un complexe spécifique avec GAP et sont immunoprécipitées par des anticorps dirigés contre différents épitopes de GAP. On sait en particulier que c'est au niveau des domaines SH2 de GAP que se font les interactions de p62 avec GAP. Les acides aminés 271 à 443 de p62 contiennent des tyrosines phosphorylées et semblent impliqués dans ces interactions. Ces mêmes phosphorylations semblent par ailleurs participer à des interactions entre p62 et l'adaptateur GRB2. D'autre part, tout au long de la séquence de p62, sont répartis des sites consensus riches en prolines qui participent à la liaison aux domaines SH3 des tyrosines kinases de la famille src ainsi que de la phospholipase Gy.
La protéine p62 (ou encore Sam68) a été identifiée par Wong et al. (Cell 69 (1992) 551). Elle comporte 443 acides aminés, dont la séquence a été décrite dans la littérature (voir SEQ ID n° 1). En plus des caractéristiques mentionnées ci-dessus, la protéine p62 présente plusieurs caractéristiques propres aux hnRNP ("heterogeneous nuclear RiboNucleoProtein") :
- elle est riche en glycines - elle possède des régions riches en arginines
- de plus, ses acides aminés 145 à 247 définissent une région de forte homologie avec une hnRNP précédemment décrite, la GRP33. Cette région contient un site consensus de liaison aux ARNs homologue à celui contenu dans la hnRNP K. Ce site consensus est désigné KH domaine (KH = hnRNPK Homolog). Les résidus conservés sont essentiels à la liaison aux ARNs et l'impact de la non intégrité de ce domaine dans une pathologie a été montré pour FMR1 qui est le produit du gène associé au retard mental qui est observé dans le syndrome du X-fragile (Siomi et al., Cell 77 (1994) 33). La présente invention réside notamment dans la démonstration de l'importance de la protéine p62 (Samδδ) dans la prolifération et la mort cellulaires. Elle découle plus particulièrement de la mise en évidence que des dérivés de p62 sont capables d'interférer dans le processus de transformation cellulaire, et notamment d'inhiber les signaux transduits par les protéines ras et src. Elle découle en outre de la démonstration particulièrement surprenante que ces dérivés sont également doués de propriétés apoptotiques, et donc capables d'induire la mort cellulaire.
Un premier objet de l'invention concerne donc tout dérivé de p62 capable d'inhiber au moins en partie l'interaction entre une protéine GAP et p62. Préférentiellement, les dérivés selon l'invention sont capables d'inhiber au moins en partie le pouvoir oncogène des protéines ras et/ou src. Encore plus préférentiellement, les dérivés selon l'invention sont capables d'induire la mort cellulaire par apoptose. Les dérivés selon l'invention sont également caractérisés par la perte de la capacité à interagir avec l'ARN de p62.
La présente invention décrit en particulier la mise en évidence, le clonage et la caractérisation d'une isoforme naturelle de la protéine p62. Cette isoforme, désignée Δp62 (ou ΔSamβδ), présente une délétion dans la zone d'homologie à la protéine GRP33, qui recouvre le domaine KH. En raison de cette délétion, Δp62 ne possède pas l'intégralité des propriétés de p62. Ainsi, Δp62 possède un domaine d'interaction avec GAP et GRB2 intact ainsi que les différentes séquences riches en prolines partenaires de SH3 (Figure 1). Cependant, Δp62 n'est plus capable d'interagir avec les acides nucléiques en raison de la délétion du domaine d'homologie à la protéine GRP33. La demanderesse a également montré que le transfert de l'ADNc de Δp62 dans différents modèles cellulaires normaux ou tumoraux s'oppose à la coopération entre p62 et Ras et inhibe les signaux transduits par les protéines Ras normales et oncogéniques . Surexprimée, la Δp62 interfère donc avec les processus de prolifération et de différenciation et aboutit, dans les différents modèles cellulaires, à la mort cellulaire par apoptose.
Selon un mode préféré, l'invention concerne plus particulièrement tout dérivé de p62 portant au moins une délétion dans la zone d'homologie à la protéine GRP33. Plus particulièrement, les dérivés selon l'invention comportent au moins une délétion dans la région comprise entre les résidus 145 à 247 de la protéine p62 telle que représentée sur la séquence SEQ ID n° 1 , et qui recouvre le domaine KH. La délétion porte avantageusement sur plus de 10 acides aminés et, plus préférentiellement, sur plus de 30 acides aminés. Elle peut concerner un ou plusieurs sites à l'intérieur de cette région, dès lors que le dérivé résultant présente les propriétés décrites ci-avant.
D'une manière particulièrement avantageuse, le dérivé selon l'invention est un polypeptide comprenant tout ou partie de la séquence SEQ ID n° 2 ou d'un variant de celle-ci. Le terme variant au sens de l'invention désigné tout polypeptide dont la structure se distingue de la séquence SEQ ID n° 2 par une ou plusieurs modifications de nature génétique, biochimique et/ou chimique. Il peut s'agir en particulier de toute mutation, substitution, délétion, addition et/ou modification d'un ou plusieurs résidus. De tels dérivés peuvent être générés dans des buts différents, tels que notamment celui d'augmenter l'affinité du peptide pour son site d'interaction, celui d'améliorer ses niveaux de production, celui d'augmenter sa résistance à des protéases ou d'améliorer son passage à travers les membranes cellulaires, celui d'augmenter son efficacité thérapeutique ou de réduire ses effets secondaires, ou celui de lui conférer de nouvelles propriétés pharmacocinétiques et/ou biologiques. Avantageusement, les variants comprennent des délétions ou des mutations portant sur des acides aminés dont la présence n'est pas déterminante à l'activité du dérivé. De tels acides aminés peuvent être identifiés par exemple par des tests d'activité cellulaire comme décrit dans les exemples.
D'une manière particulièrement préférée, les dérivés de l'invention retiennent au moins une partie de la protéine p62 permettant l'interaction avec le domaine SH2 de GAP. Cette partie de p62 est plus particulièrement constituée de tyrosines phosphorylées, localiées entre les résidus 200 à 450 de la protéine p62 (Cf SEQ ID n° 1). Un dérivé préféré selon l'invention comprend donc au moins (i) une délétion dans la région comprise entre les résidus 145 à 247 de p62 et (ii) une partie de p62 permettant l'interaction avec le domaine SH2 de GAP. Plus préférentiellement, la délétion porte sur les résidus 1 à 202. A cet égard, la demanderesse a également montré que des dérivés selon l'invention présentant des propriétés particulièrement intéressantes peuvent être constitués de polypeptides comprenant essentiellement la région portant les tyrosines phosphorylées de p62.
Un exemple particulièrement préféré de polypeptide selon l'invention est représenté par le polypeptide Δp62 de séquence SEQ ID n°2, possédant une délétion des résidus 170-208 de la séquence de p62. Un autre exemple est représenté par le polypeptide p62-C comprenant les résidus 203 à 443 de p62 (séquence SEQ ID n° 3).
Les résultats présentés dans la présente demande montrent notamment que Δp62 peut rentrer en compétition avec p62 vis à vis de GAP. GAP étant l'un des effecteurs des protéines Ras, Δp62 bloque les voies mitogènes qui en dépendent. Surexprimée par transfert de gène (transfection, infection, microinjection, etc) Δp62 induit la mort cellulaire par apoptose dans des cellules normales (fibroblastes NIH3T3 et Swiss 3T3) ou tumorales (H460;HCT116), et est capable d'inhiber la formation de foyers induits par ras. Ce même effet est obtenu avec le dérivé p62-C (comprenant essentiellement la partie C-terminale de Δp62, qui recouvre la région comprise entre les acides aminés 203 et 443 et qui correspond au domaine d'interaction avec les domaines SH2 de GAP et de GRB2). Cette partie C-terminale contient également trois des sites d'interaction avec les domaines SH3, ceux ayant le plus d'affinité pour Fyn. L'activité thérapeutique importante des dérivés selon l'invention est liée à leur propriétés multiples, et notamment leur pouvoir de titration des domaines SH3 des protéines de la famille src (exemple : fyn ), leur capacité d'inhibition du recrutement de GRB2 en titrant son domaine SH2, et leur capacité d'inhibition de la fonction effectrice de la protéine GAP pour les voies de signalisation qui dépendent de Ras.
Un autre objet de la présente invention concerne tout acide nucléique codant pour un polypeptide tel que défini ci-avant. L'acide nucléique selon l'invention peut être un acide ribonucléique (ARN) ou désoxyribonucléique (ADN). En outre, il peut s'agir d'un ADN génomique (ADNg) ou complémentaire (ADNc). Il peut être d'origine humaine, animale, virale, synthétique ou semi-synthétique. Il peut être obtenu de différentes manières et notamment par synthèse chimique en utilisant les séquences présentées dans la demande et par exemple un synthétiseur d'acides nucléiques. Il peut également être obtenu par criblage de banques au moyen de sondes spécifiques, notamment telles que décrites dans la demande (voir séquences SEQ ID n° 6 et 7 par exemple). Il peut encore être obtenu par des techniques mixtes incluant la modification chimique (élongation, délétion, substitution, etc) de séquences criblées à partir de banques. D'une manière générale, les acides nucléiques de l'invention peuvent être préparés selon toute technique connue de l'homme du métier. Préférentiellement, l'acide nucléique selon l'invention est un ADNc ou un ARN.
L'acide nucléique selon l'invention est avantageusement choisi parmi : (a) tout ou partie de la séquence SEQ ID n° 2 ou SEQ ID n° 3 ou de leur brin complémentaire, (b) toute séquence hybridant avec les séquences (a) et codant pour un dérivé selon l'invention,
(c) les variants de (a) et (b) résultant de la dégénérescence du code génétique.
Comme indiqué précédemment, la demanderesse a maintenant isolé et caractérisé de nouvelles séquences d'acide nucléique codant pour des polypeptides dérivés de p62, ayant des propriétés antiprolifératives et apoptotiques tout à fait remarquables. Ces acides nucléiques peuvent maintenant être utilisés comme agents thérapeutiques pour produire dans les cellules des dérivés selon l'invention capables de détruire ou de corriger des dysfonctionnements cellulaires. A cet effet, la présente invention concerne également toute cassette d'expression comprenant un acide nucléique tel que défini ci-avant, un promoteur permettant son expression et un signal de terminaison de la transcription. Le promoteur est avantageusement choisi parmi les promoteurs fonctionnels dans les cellules mammifères, de préférence humaines. Plus préférentiellement, il s'agit d'un promoteur permettant l'expression d'un acide nucléoique dans une cellule hyperproliférative (cancéreuse, resténose, etc). A cet égard, différents promoteurs peuvent être utilisés. Il peut s'agir par exemple du propre promoteur du gène p62. Il peut également s'agir de régions d'origine différente (responsables de l'expression d'autres protéines, ou même synthétiques). Il peut ainsi s'agir de tout promoteur ou séquence dérivée stimulant ou réprimant la transcription d'un gène de façon spécifique ou non, inductible ou non, forte ou faible. On peut citer notamment les séquences promotrices de gènes eucaryotes ou viraux. Par exemple, il peut s'agir de séquences promotrices issues du génome de la cellule cible. Parmi les promoteurs eucaryotes, on peut utiliser en particulier de promoteurs ubiquitaires (promoteur des gènes HPRT, PGK, α-actine, tubuline, etc), de promoteurs des filaments intermédiaires (promoteur des gènes GFAP, desmine, vimentine, neurofilaments, kératine, etc), de promoteurs de gènes thérapeutiques (par exemple le promoteur des gènes MDR, CFTR, Facteur VIII, ApoAl, etc), de promoteurs spécifiques de tissus (promoteur du gène pyruvate kinase, villine, protéine intestinale de liaison des acides gras, α- actine du muscle lisse, etc) ou encore de promoteurs répondant à un stimulus (récepteur des hormones stéroïdes, récepteur de l'acide rétinoïque, etc). De même, il peut s'agir de séquences promotrices issues du génome d'un virus, tel que par exemple les promoteurs des gènes E1A et MLP d'adénovirus, le promoteur précoce du CMV, ou encore le promoteur du LTR du RSV, etc. En outre, ces régions promotrices peuvent être modifiées par addition de séquences d'activation, de régulation, ou permettant une expression tissu-spécifique ou majoritaire. La présente invention fournit maintenant de nouveaux agents thérapeutiques permettant, par leurs propriétés antiprol itératives et/ou apoptotiques d'interférer avec de nombreux dysfonctionnements cellulaires. Dans ce but, les acides nucléiques ou cassettes selon l'invention peuvent être injectés tels quels au niveau du site à traiter, ou incubés directement avec les cellules à détruire ou traiter. Il a en effet été décrit que les acides nucléiques nus pouvaient pénétrer dans les cellules sans vecteur particulier. Néanmoins, on préfère dans le cadre de la présente invention utiliser un vecteur d'administration, permettant d'améliorer (i) l'efficacité de la pénétration cellulaire, (ii) le ciblage (iii) la stabilité extra- et intracellulaires. Dans un mode de mise en oeuvre particulièrement préféré de la présente invention l'acide nucléique ou la cassette est incorporé dans un vecteur. Le vecteur utilisé peut être d'origine chimique (liposome, nanoparticule, complexe peptidique, lipides ou polymères cationiques, etc) virale (rétrovirus, Adénovirus, virus de l'herpès, AAV, virus de la vaccine, etc) ou plasmidique. L'utilisation de vecteurs viraux repose sur les propriétés naturelles de transfection des virus. Il est ainsi possible d'utiliser par exemple les adénovirus, les herpès virus, les rétrovirus et les virus adéno associés. Ces vecteurs s'avèrent particulièrement performants sur le plan de la transfection. A cet égard, un objet préféré selon l'invention réside dans un rétrovirus recombinant défectif dont le génome comprend un acide nucléique tel que défini ci-avant. Un autre objet particulier de l'invention réside dans un adénovirus recombinant défectif dont le génome comprend un acide nucléique tel que défini ci-avant.
Le vecteur selon l'invention peut également être un agent non viral capable de promouvoir le transfert et l'expression d'acides nucléiques dans des cellules eucaryotes. Les vecteurs chimiques ou biochimiques, synthétiques ou naturels, représentent une alternative intéressante aux virus naturels en particulier pour des raisons de commodité, de sécurité et également par l'absence de limite théorique en ce qui concerne la taille de l'ADN à transfecter. Ces vecteurs synthétiques ont deux fonctions principales, compacter l'acide nucléique à transfecter et promouvoir sa fixation cellulaire ainsi que son passage à travers la membrane plasmique et, le cas échéant, les deux membranes nucléaires. Pour pallier à la nature polyanionique des acides nucléiques, les vecteurs non viraux possèdent tous des charges polycationiques. L'acide nucléique ou le vecteur utilisé dans la présente invention peut être formulé en vue d'administrations par voie topique, orale, parentérale, intranasale, intraveineuse, intramusculaire, sous-cutanée, intraoculaire, transdermique, etc. De préférence, l'acide nucléique ou le vecteur est utilisé sous une forme injectable. Il peut donc être mélangé à tout véhicule pharmaceutiquement acceptable pour une formulation injectable, notamment pour une injection directe au niveau du site à traiter. Il peut s'agir en particulier de solutions stériles, isotoniques, ou de compositions sèches, notamment lyophilisées, qui, par addition selon le cas d'eau stérilisée ou de sérum physiologique, permettent la constitution de solutés injectables. Une injection directe de l'acide nucléique dans la tumeur du patient est intéressante car elle permet de concentrer l'effet thérapeutique au niveau des tissus affectés. Les doses d'acide nucléique utilisées peuvent être adaptées en fonction de différents paramètres, et notamment en fonction du gène, du vecteur, du mode d'administration utilisé, de la pathologie concernée ou encore de la durée du traitement recherchée.
L'invention concerne également toute composition pharmaceutique comprenant au moins un acide nucléique
Elle concerne également toute composition pharmaceutique comprenant au moins un vecteur tel que défini ci-avant. Elle concerne aussi toute composition pharmaceutique comprenant au moins un dérivé de p62 tel que défini ci-avant.
En raison de leurs propriétés antiprol itératives, les compositions pharmaceutiques selon l'invention sont tout particulièrement adaptées pour le traitement des désordres hyperprolifératifs, tels que notamment les cancers et la resténose. La présente invention fournit ainsi une méthode particulièrement efficace pour la destruction de cellules, notamment de cellules hyperprolifératives. Elle peut être utilisée in vitro ou ex vivo. Ex vivo, elle consiste essentiellement à incuber les cellules en présence d'un ou plusieurs acides nucléiques (ou d'un vecteur, ou cassette ou directement du dérivé). In vivo, elle consiste à administrer à l'organisme une quantité active d'un vecteur (ou d'une cassette) selon l'invention, de préférence directement au niveau du site à traiter (tumeur notamment). A cet égard, l'invention a également pour objet une méthode de destruction de cellules hyperprolifératives comprenant la mise en contact desdites cellules ou d'une partie d'entre-elles avec un acide nucléique tel que défini ci-avant. La présente invention est avantageusement utilisée in vivo pour la destruction de cellules en hyperprol itération (i.e. en prolifération anormale). Elle est ainsi applicable à la destruction des cellules tumorales ou des cellules de muscle lisse de la paroi vasculaire (resténose). Elle est tout particulièrement appropriée au traitement des cancers dans lesquels un oncogène activé est impliqué. A titre d'exemple, on peut citer les adénocarcinomes du colon, les cancers de la thyroïde, les carcinomes du poumon, les leucémies myéloïdes, les cancers colorectaux, les cancers du sein, les cancers du poumon, les cancers gastriques, les cancers de l'oesophage, les lymphômes B, les cancers ovariens, les cancers de la vessie, les glioblastomes, les hépatocarcinomes, les cancers des os, de la peau, du pancréas ou encore les cancers du rein et de la prostate, etc.
Les produits de l'invention sont également utiles pour l'identification d'autres partenaires des voies de signalisation des oncogenes, par recherche d'inhibiteurs, d'agonistes, de compétiteurs ou de molécules interagissant in vivo avec ces produits.
Par ailleurs, l'invention concerne également les séquences antisens, dont l'expression dans une cellule cible permet de contrôler la transcription et/ou la traduction d'ARNm cellulaires codant pour p62 ou Δp62. De telles séquences peuvent par exemple être transcrites dans la cellule cible en ARN complémentaires des ARNm cellulaires Δp62 ou p62 et bloquer ainsi leur traduction en protéine selon la technique décrite dans le brevet EP 140 308. De telles séquences peuvent être constituées par tout ou partie des séquences nucléiques SEQ ID n° 1 , 2 ou 3, transcrites dans l'orientation inverse. La présente invention concerne également l'utilisation de tout composé capable d'induire l'expression ou la surexpression de Δp62 dans une cellule pour la préparation d'une composition pharmaceutique destinée au traitement des désordres hyperprolifératifs.
La présente invention sera décrite plus en détail à l'aide des exemples qui suivent, qui doivent être considérés comme illustratifs et non limitatifs.
Légendes des figures
Figure 1 : Représentation schématique des domaines structuraux de p62 et Δp62. Figure 2 : Effet de p62 et Δp62 sur la transactivation par les protéines ras d'un RRE dérivé de l'enhancer du virus du polyôme.
Figure 3 : Mise en évidence de la mort cellulaire induite par Δp62 dans les fibroblastes NIH3T3.
Figure 4 : Mise en évidence de l'expression de Δp62 dans des fibroblastes embryonnaires traités par différents agents cytotoxiques et par déprivation de sérum.
Figure 5 : Inhibition de la formation de foyers induite par les oncogenes.
Techniques générales de biologie moléculaire
Les méthodes classiquement utilisées en biologie moléculaire telles que les extractions préparatives d'ADN plasmidique, la centrifugation d'ADN plasmidique en gradient de chlorure de césium, l'électrophorèse sur gels d'agarose ou d'acrylamide, la purification de fragments d'ADN par électroélution, les extraction de protéines au phénol ou au phénol-chloroforme, la précipitation d'ADN en milieu salin par de l'éthanol ou de l'isopropanol, la transformation dans Escherichia coli, etc ... sont bien connues de l'homme de métier et sont abondament décrites dans la littérature [Maniatis T. et al., "Molecular Cloning, a Laboratory Manual", Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, N.Y., 1982; Ausubel F.M. et al. (eds), "Current Protocols in Molecular Biology", John Wiley & Sons, New York, 1987].
Les plasmides de type pBR322, pUC et les phages de la série M13 sont d'origine commerciale (Bethesda Research Laboratories). Pour les ligatures, les fragments d'ADN peuvent être séparés selon leur taille par électrophorèse en gels d'agarose ou d'acrylamide, extraits au phénol ou par un mélange phénol/chloroforme, précipités à l'éthanol puis incubés en présence de l'ADN ligase du phage T4 (Biolabs) selon les recommandations du fournisseur. Le remplissage des extrémités 5' proéminentes peut être effectué par le fragment de Klenow de l'ADN Polymérase I d'E. coli (Biolabs) selon les spécifications du fournisseur. La destruction des extrémités 3' proéminentes est effectuée en présence de l'ADN Polymérase du phage T4 (Biolabs) utilisée selon les recommandations du fabricant. La destruction des extrémités 5' proéminentes est effectuée par un traitement ménagé par la nucléase S1. La mutagénèse dirigée in vitro par oligodéoxynucléotides synthétiques peut être effectuée selon la méthode développée par Taylor et al. [Nucleic Acids Res. 13 (1985) 8749-8764] en utilisant le kit distribué par Amersham. L'amplification enzymatique de fragments d'ADN par la technique dite de PCR [Polymérase-catalyzed Chain Reaction, Saiki R.K. et al., Science 22Û (1985) 1350-1354; Mullis K.B. et Faloona F.A., Meth. Enzym. 155 (1987) 335-350] peut être effectuée en utilisant un "DNA thermal cycler" (Perkin Elmer Cetus) selon les spécifications du fabricant. La vérification des séquences nucléotidiques peut être effectuée par la méthode développée par Sanger et al. [Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 74 (1977) 5463-5467] en utilisant le kit distribué par Amersham.
Exemples
Exemple 1 : Isolement de l'ADN complémentaire de Δo62.
L'ADN complémentaire de Δp62 a été isolé par PCR sur une population d'ADN complémentaire synthétisé à partir d' ARN poly A+ extraits de placenta humain. 1 μg d'ADN a été utilisé conjointement aux amorces dérivées de la séquence de p62 et qui recouvrent les acides aminés 123 à 131 d'une part (oligo 5') et 437 à 443 d'autre part (oligo 3'). Les séquences de ces amorces sont les suivantes : oligo 5' : CAGCTGCTGACGGCAGAAATTGAG (SEQ ID n° 4) oligo 3' : TTAATAACGTCCATATGGGTGCTC (SEQ ID n° 5)
Les réactions ont été menées à 55°C et ont donné deux produits séparés par électrophorèse sur gel d'agarose :
- une bande de 987 paires de bases, qui correspond au produit de PCR de p62 - une bande de 870 paires de bases, qui correspond au produit de PCR de Δp62.
Cette dernière bande a été clonée et sa séquence correspond exactement à la séquence de p62, exception faite d'une délétion de 1 17 paires de bases dans le domaine d'homologie à la GRP33. La séquence complète de Δp62 est présentée SEQ ID n° 2 (voir aussi figure 1 ).
L'existence de cette isoforme de p62 a été confirmée par criblage d'une banque d'ADN complémentaire de placenta humain établie dans le vecteur λgt 1 1. L'oligonucléotide utilisé pour ce criblage est un 24- mer correspondant à la jonction spécifique de la délétion présente dans
Δp62. La séquence de cet oligonucléotide est :
CAGTATCCCAAGGAGGAAGAGCTG (SEQ ID n° 6)
Exemple 2 : Construction de vecteurs d'expression de Δp62 et p62-C.
Cet exemple décrit la construction de vecteurs utilisable pour le transfert des acides nucléiques de l'invention in vitro ou in vivo.
2.1. Vecteur plasmidique :
Pour la construction de vecteurs plasmidiques, 2 types de vecteurs ont été utilisés. - Le vecteur SV2, décrit dans DNA Cloning, A practical approach
Vol.2, D.M. Glover (Ed) IRL Press, Oxford, Washington DC, 1985. Ce vecteur est un vecteur d'expression eucaryote. Les acides nucléiques codant pour les variants p62-C et Δp62 ont été insérés dans ce vecteur sous forme de fragments EcoRI. Ils sont ainsi placés sous le contrôle du promoteur de l'enhancer du virus SV40. - Le vecteur pcDNA3 (Invitrogen). Il s'agit également d'un vecteur d'expression eucaryote. Les acides nucléiques codant pour les variants p62-C et Δp62, été insérés dans ce vecteur sous forme de fragments
EcoRI, sont ainsi placés sous le contrôle du promoteur précoce du CMV.
2.2. Vecteur Viral
Selon un mode particulier, l'invention réside dans la construction et l'utilisation de vecteurs viraux permettant le transfert et l'expression in vivo des acides nucléiques tels que définis ci-avant.
S'agissant plus particulièrement d'adénovirus, différents sérotypes, dont la structure et les propriétés varient quelque peu, ont été caractérisés. Parmi ces sérotypes, on préfère utiliser dans le cadre de la présente invention les adénovirus humains de type 2 ou 5 (Ad 2 ou Ad 5) ou les adénovirus d'origine animale (voir demande WO 94/26914). Parmi les adénovirus d'origine animale utilisables dans le cadre de la présente invention on peut citer les adénovirus d'origine canine, bovine, murine, (exemple : Mav1 , Beard et al., Virology 75 (1990) 81), ovine, porcine, aviaire ou encore simienne (exemple : SAV). De préférence, l'adénovirus d'origine animale est un adénovirus canin, plus préférentiellement un adénovirus CAV2 [souche manhattan ou A26/61 (ATCC VR-800) par exemple]. De préférence, on utilise dans le cadre de l'invention des adénovirus d'origine humaine ou canine ou mixte.
Préférentiellement, les adénovirus défectifs de l'invention comprenent les ITR, une séquence permettant l'encapsidation et un acide nucléique selon l'invention. Encore plus préférentiellement, dans le génome des adénovirus de l'invention, la région E1 au moins est non fonctionnelle. Le gène viral considéré peut être rendu non fonctionnel par toute technique connue de l'homme du métier, et notamment par suppression totale, substitution, délétion partielle, ou addition d'une ou plusieurs bases dans le ou les gènes considérés. De telles modifications peuvent être obtenues in vitro (sur de l'ADN isolé) ou in situ, par exemple, au moyens des techniques du génie génétique, ou encore par traitement au moyen d'agents mutagènes. D'autres régions peuvent également être modifiées, et notamment la région E3 (WO95/02697), E2 (W094/28938), E4 (W094/28152, W094/12649, WO95/02697) et L5 (WO95/02697). Selon un mode préféré de mise en oeuvre, l'adénovirus selon l'invention comprend une délétion dans les régions E1 et E4. Selon un autre mode de réalisation préféré, il comprend une délétion dans région E1 au niveau de laquelle sont insérés la région E4 et l'acide nucléique de l'invention (Cf FR94 13355). Dans les virus de l'invention, la délétion dans la région E1 s'étend préférentiellement des nucléotides 455 à 3329 sur la séquence de l'adénovirus Ad5.
Les adénovirus recombinants défectifs selon l'invention peuvent être préparés par toute technique connue de l'homme du métier (Levrero et al., Gène 101 (1991) 195, EP 185 573; Graham, EMBO J. 3 (1984) 2917). En particulier, ils peuvent être préparés par recombinaison homologue entre un adénovirus et un plasmide portant entre autre la séquence d'ADN d'intérêt. La recombinaison homologue se produit après co-transfection desdits adénovirus et plasmide dans une lignée cellulaire appropriée. La lignée cellulaire utilisée doit de préférence (i) être transformable par lesdits éléments, et (ii), comporter les séquences capables de complémenter la partie du génome de l'adénovirus défectif, de préférence sous forme intégrée pour éviter les risques de recombinaison. A titre d'exemple de lignée, on peut mentionner la lignée de rein embryonnaire humain 293 (Graham et al., J. Gen. Virol. 36 (1977) 59) qui contient notamment, intégrée dans son génome, la partie gauche du génome d'un adénovirus Ad5 (12 %) ou des lignées capables de complémenter les fonctions E1 et E4 telles que décrites notamment dans les demandes n° WO 94/26914 et WO95/02697. Ensuite, les adénovirus qui se sont multipliés sont récupérés et purifiés selon les techniques classiques de biologie moléculaire, comme illustré dans les exemples.
Concernant les virus adéno-associés (AAV), il s'agit de virus à ADN de taille relativement réduite, qui s'intègrent dans le génome des cellules qu'ils infectent, de manière stable et site-spécifique. Ils sont capables d'infecter un large spectre de cellules, sans induire d'effet sur la croissance, la morphologie ou la différenciation cellulaires. Par ailleurs, ils ne semblent pas impliqués dans des pathologies chez l'homme. Le génome des AAV a été clone, séquence et caractérisé. Il comprend environ 4700 bases, et contient à chaque extrémité une région répétée inversée (ITR) de 145 bases environ, servant d'origine de réplication pour le virus. Le reste du génome est divisé en 2 régions essentielles portant les fonctions d'encapsidation : la partie gauche du génome, qui contient le gène rep impliqué dans la réplication virale et l'expression des gènes viraux; la partie droite du génome, qui contient le gène cap codant pour les protéines de capside du virus.
L'utilisation de vecteurs dérivés des AAV pour le transfert de gènes in vitro et in vivo a été décrite dans la littérature (voir notamment WO 91/18088; WO 93/09239; US 4,797,368, US5.139,941 , EP 488 528). Ces demandes décrivent différentes constructions dérivées des AAV, dans lesquelles les gènes rep et/ou cap sont délétés et remplacés par un gène d'intérêt, et leur utilisation pour transférer in vitro (sur cellules en culture) ou in vivo (directement dans un organisme) ledit gène d'intérêt. Les AAV recombinants défectifs selon l'invention peuvent être préparés par co- transfection, dans un lignée cellulaire infectée par un virus auxiliaire humain (par exemple un adénovirus), d'un plasmide contenant une séquence nucléique de l'invention d'intérêt bordée de deux régions répétées inversées (ITR) d'AAV, et d'un plasmide portant les gènes d'encapsidation (gènes rep et cap) d'AAV. Une lignée cellulaire utilisable est par exemple la lignée 293. Les AAV recombinants produits sont ensuite purifiés par des techniques classiques.
Concernant les virus de l'herpès et les rétrovirus, la construction de vecteurs recombinants a été largement décrite dans la littérature : voir notamment Breakfield et al., New Biologist 3 (1991) 203; EP 453242, EP178220, Bemstein et al. Genêt. Eng. 7 (1985) 235; McCormick, BioTechnology 3 (1985) 689, etc. En particulier, les rétrovirus sont des virus intégratifs, infectant sélectivement les cellules en division. Ils constituent donc des vecteurs d'intérêt pour des applications cancer. Le génome des rétrovirus comprend essentiellement deux LTR, une séquence d'encapsidation et trois régions codantes (gag, pol et env). Dans les vecteurs recombinants dérivés des rétrovirus, les gènes gag, pol et env sont généralement délétés, en tout ou en partie, et remplacés par une séquence d'acide nucléique hétérologue d'intérêt. Ces vecteurs peuvent être réalisés à partir de différents types de rétrovirus tels que notamment le MoMuLV
("murine moloney leukemia virus"; encore désigné MoMLV), le MSV ("murine moloney sarcoma virus"), le HaSV ("harvey sarcoma virus"); le SNV ("spleen necrosis virus"); le RSV ("rous sarcoma virus") ou encore le virus de Friend.
Pour construire des rétrovirus recombinants selon l'invention comportant un acide nucléique selon l'invention, un plasmide comportant notamment les LTR, la séquence d'encapsidation et ledit acide nucléique est construit, puis utilisé pour transfecter une lignée cellulaire dite d'encapsidation, capable d'apporter en trans les fonctions rétroviraies déficientes dans le plasmide. Généralement, les lignées d'encapsidation sont donc capables d'exprimer les gènes gag, pol et env. De telles lignées d'encapsidation ont été décrites dans l'art antérieur, et notamment la lignée PA317 (US 4,861 ,719); la lignée PsiCRIP (WO 90/02806) et la lignée GP+envAm-12 (WO 89/07150). Par ailleurs, les rétrovirus recombinants peuvent comporter des modifications au niveau des LTR pour supprimer l'activité transcriptionnelle, ainsi que des séquences d'encapsidation étendues, comportant une partie du gène gag (Bender et al., J. Virol. 61 (1987) 1639). Les rétrovirus recombinants produits sont ensuite purifiés par des techniques classiques.
Pour la mise en oeuvre de la présente invention, il est tout particulièrement avantageux d'utiliser un adénovirus ou un rétrovirus recombinant défectif. Ces vecteurs possèdent en effet des propriétés particulièrement intéressantes pour le transfert de gènes dans les cellules tumorales.
2.3. Vecteur chimique
Parmi les vecteurs synthétiques développés, on préfère utiliser dans le cadre de l'invention les polymères cationiques de type polylysine, (LKLK)n, (LKKL)n, polyéthylène immine et DEAE dextran ou encore les lipides cationiques ou lipofectants. Ils possèdent la propriété de condenser l'ADN et de promouvoir son association avec la membrane cellulaire. Parmi ces derniers, on peut citer les lipopolyamines (lipofectamine, transfectam, etc) différents lipides cationiques ou neutres (DOTMA, DOGS, DOPE, etc) ainsi que des peptides d'origine nucléaire. En outre, le concept de la transfection ciblée a été développé, médiée par un récepteur, qui met à profit le principe de condenser l'ADN grâce au polymère cationique tout en dirigeant la fixation du complexe à la membrane grâce à un couplage chimique entre le polymère cationique et le ligand d'un récepteur membranaire, présent à la surface du type cellulaire que l'on veut greffer. Le ciblage du récepteur à la transferrine, à l'insuline ou du récepteur des asialoglycoprotéines des hépatocytes a ainsi été décrit. La préparation d'un composition selon l'invention utilisant un tel vecteur chimique est réalisée selon toute technique connue de l'homme du métier, généralement par simple mise en contact des différents composants. Exemple 3 : Inhibition de la transactivation de R.R.E (ras responsive éléments) due aux formes oncogéniques de Ras (Figure 2)
Des fibroblastes NIH 3T3 ont été transfectés par un gène rapporteur, celui de la chloramphénicol acétyl transférase, placé sous le contrôle d'éléments de réponse à Ras dérivés de l'enhancer du virus du polyôme. Ces éléments sont stimulés de 15 à 20 fois lorsque les cellules sont cotransfectées par un vecteur d'expression portant l'ADNc de l'oncogène Middle T(MT) de SV40. Cette stimulation n'est que peu affectée lorsqu'une cotransfection apporte les vecteurs d'expression de p62-C et de Δp62 (Cf exemple 2). Lorsque la cotransfection est réalisée, non plus avec MT mais avec la forme activée de l'oncogène Ha-ras (Val 12), l'activité CAT est stimulée de 30 à 40 fois au dessus du niveau de base. L'expression de la p62 affecte peu cette stimulation alors que p62-C et Δp62 inhibent presque totalement toute activité due au Ras oncogénique. De la même manière, la stimulation obtenue par cotransfection avec l'oncogène v-src est fortement inhibée par les protéines p62-C et Δp62, mais pas par la p62.
Ces expériences ont été réalisées avec 0,5μg de vecteur permettant l'expression de MT ou de Ras VAL12 ou de v-src et 4μg de vecteur d'expression portant l'ADNc de p62-C ou de Δp62. Elles démontrent clairement le pouvoir des protéines de l'invention de s'opposer aux signaux ras oncogéniques.
Exemple 4 : Mise en évidence de la mort cellulaire induite par Δp62 dans les fibroblastes NIH3T3 (Figure 3).
Des fibroblastes NIH3T3 ont été transfectées avec une efficacité de 60% par 5μg de vecteur d'expression de Δp62 (exemple 2). 24 heures après la transfection, les cellules présentent une altération importante de leur viabilité par rapport au témoin. L'analyse de leur ADN révèle après migration sur gel d'agarose des échelles de dégradation caractéristiques des phénomènes d'apoptose. Les mêmes phénomènes sont observés lorsque p62-C est transfectée dans les mêmes conditions que Δp62.
Exemple 5 : Mise en évidence de l'expression de Δp62 dans des fibroblastes embryonnaires traités par différents agents cytotoxiques et par déprivation de sérum (Fiαure 4).
Des fibroblastes embryonnaires de souris ont été mis en culture
(1), traités par 0,5 μg d'acide okadaïque (2), traités par 10 ng/ml de PMA et par 2 μg de ionomycine (3), soumis à 1 μM de staurosporine (4) ou à 2 μg/ml de camptotécine (5) et enfin déprivés en sérum.
L'expression des ARN messagers de p62 et de Δp62 dans ces fibroblastes et au cours de ces différents traitements a été analysée. A chaque traitement, trois points ont été analysés. Ces points correspondent à trois temps de traitement : 6, 12 et 24 heures. Sonde 5' spécifique de Δp62 (SEQ ID n° 7) : CTGTCAAGCAGTATCCCAAGGAGG
Sonde 5' spécifique de p62 (SEQ ID n° 8) : AAGGGCTCAATGAGAGACAAAGCC
Sonde 3'commun à p62 et à Δp62 (SEQ ID n° 9) : GTATGTATCATCATATCCATATTC Dans les fibroblastes mis en culture en présence de 10 % de sérum de veau foetal (SVF), l'ARNm de p62 est mis en évidence alors que l'ARNm de Δp62 n'est pas détecté même après 24h de mise en culture. La situation est la même au cours du traitement par l'acide okadaïque. En revanche, une forte induction de l'ARNm de Δp62 est observée après 6 à 12 heures de traitement par le PMA et la ionomycine. Cet ARNm est aussi détectable après addition de staurosporine et est très fortement induit après 12 heures de traitement à la camptotécine. Lorsque les fibroblastes embryonnaires sont déprivés en sérum, une forte induction de Δp62 est observée en même temps qu'une disparition du messager de p62.
Ces résultats démontrent donc que l'expression de l'ARNm de Δp62 est induite au cours de certaines situations apoptotiques dans les fibroblastes.
Exemple 6 : Inhibition par Δp62 de la formation de fovers induite par ras
Cet exemple décrit une autre étude montrant que de Δp62 interfère avec le processus de transformation induit par les oncogenes. Plus particulièrement, cet exemple démontre que Δp62 est capable d'inhiber la formation de foyers induite par différents oncogenes (ras oncogénique, v-src) dans les cellules NIH-3T3, alors que p62 n'affecte pas ce phénomène.
Des fibroblastes NIH3T3 ont été co-transfectées par 0,1 μg de vecteur d'expression de v-Src ou Ha-Ras Val12 et par 4 mg de vecteur d'expression de p62, de Δp62 ou vide (exemple 2). Les cellules ont été maintenues en milieu contenant 10 % de sérum de veau nouveau-né et le nombre de foyer a étE déterminé après fixation et coloration des cellules en présence de phénol fuchsin. Les expériences ont été réalisées en triple.
Les résultats obtenus sont présentés sur la figure 5. Ils montrent que Δp62 diminue le nombre de foyers induits par v-src et Ha-Ras Val 12 de
50 % environ. Cet effet reflète un pouvoir antagoniste spécifique de la transformation par v-src et Ha-Ras oncogénique puisque Δp62 n'affecte pas la formation de foyers induite par v-Raf. En outre, l'effet observé n'est pas lié a une toxicité du produit puisque le nombre de colonies résistantes à la néomycine après transfection par p62, Δp62 ou un vecteur vide est comparable. Ces résultats confirment donc le rôle inhibiteur des molécules de l'invention dans le processus de transformation induit par les oncogenes. Ces résultats confirment ainsi l'utilité de ces produits dans des approches de correction des processus de prolifération cellulaire induits par les oncogEnes, ainsi que comme outil pour l'identification d'autres molécules active et/ou impliquées dans les voies de signalisation de ces oncogenes.
Exemple 7 : Mise en évidence d'une interaction avec src in vivo
Cet exemple décrit l'étude de l'interaction de Δp62 avec d'autres molécules. Il démontre que p62 et Δp62 sont capables d'interagir in vivo avec src.
Des fibroblastes NIH3T3 ont été transfectées par un vecteur d'expression de p62 ou de Δp62 comprenant un marqueur myc ("myc teg") (exemple 2). Les cellules transfectées ont été maintenues en croissance asynchrone ou bloquées en phase mitotique par traitement par du nocodazole. Les cellules ont ensuite été co-transfectées par un vecteur d'expression de v-Src ou vide. 48 heures après, les cellules ont été lysées et les complexes formés ont été immunodétectes au moyen d'anticorps anti-myc (anticorps 9E10) et d'anticorps anti-Src (anticorps N16).
Les résultats obtenus montrent que p62 et Δp62 sont capables d'interagir in vivo avec src. En outre, alors que l'interaction entre p62 et src semble se produire uniquement dans les cellules mitotiques, Δp62 lie de manière significative Src même dans les cellules asynchrones. Cette interaction est renforcée dans les cellules mitotiques.
LISTE DE SEQUENCES
(1 ) INFORMATIONS GENERALES:
(i) DEPOSANT:
(A) NOM: RHONE POULENC RORER S.A.
(B) RUE: 20, AVENUE RAYMOND ARON
(C) VILLE: ANTONY (E) PAYS: FRANCE
(F) CODE POSTAL: 92165
(G) TELEPHONE: (1) 40.91.69.22 (H) TELECOPIE: (1) 40.91.72.91 (ii) TITRE DE L'INVENTION: ΔP62, SES VARIANTS, SEQUENCES
NUCLEIQUES ET LEURS UTILISATIONS
(iii) NOMBRE DE SEQUENCES: 9
(iv) FORME DECHIFFRABLE PAR ORDINATEUR:
(A) TYPE DE SUPPORT: Tape
(B) ORDINATEUR: IBM PC compatible
(C) SYSTEME D'EXPLOITATION: PC-DOS/MS-DOS (D) LOGICIEL: Patentln Release #1.0, Version #1.30 (OEB)
(2) INFORMATIONS POUR LA SEQ ID NO: 1:
(i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE: (A) LONGUEUR: 1332 paires de bases
(B) TYPE: nucléotide
(C) NOMBRE DE BRINS: simple
(D) CONFIGURATION: linéaire (ii) TYPE DE MOLECULE: ADNc
(iii) HYPOTHETIQUE: NON
(iv) ANTI-SENS: NON
(ix) CARACTERISTIQUE:
(A) NOM/CLE: CDS
(B) EMPLACEMENTS ..1332
(xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID NO: 1 :
ATG CAG CGC CGG GAC GAC CCC GCC GCG CGC ATG AGC CGG TCT TCG GGC 48
Met Gin Arg Arg Asp Asp Pro Ala Ala Arg Met Ser Arg Ser Ser Gly 1 5 10 15
CGT AGC GGC TCC ATG GAC CCC TCC GGT GCC CAC CCC TCG GTG CGT CAG 96
Arg Ser Gly Ser Met Asp Pro Ser Gly Ala His Pro Ser Val Arg Gin 20 25 30
ACG CCG TCT CGG CAG CCG CCG CTG CCT CAC CGG TCC CGG GGA GGC GGA 144 Thr Pro Ser Arg Gin Pro Pro Leu Pro His Arg Ser Arg Gly Gly Gly 35 40 45
GGG GGA TCC CGC GGG GGC GCC CGG GCC TCG CCC GCC ACG CAG CCG CCA 192
Gly Gly Ser Arg Gly Gly Ala Arg Ala Ser Pro Ala Thr Gin Pro Pro 50 55 60
CCG CTG CTG CCG CCC TCG GCC ACG GGT CCC GAC GCG ACA GTG GGC GGG 240
Pro Leu Leu Pro Pro Ser Ala Thr Gly Pro Asp Ala Thr Val Gly Gly 65 70 75 80
CCA GCG CCG ACC CCG CTG CTG CCC CCC TCG GCC ACA GCC TCG GTC AAG 288
Pro Ala Pro Thr Pro Leu Leu Pro Pro Ser Ala Thr Ala Ser Val Lys
85 90 95
ATG GAG CCA GAG AAC AAG TAC CTG CCC GAA CTC ATG GCC GAG AAG GAC 336
Met Glu Pro Glu Asn Lys Tyr Leu Pro Glu Leu Met Ala Glu Lys Asp 100 105 110
TCG CTC GAC CCG TCC TTC ACT CAC GCC ATG CAG CTG CTG ACG GCA GAA 384
Ser Leu Asp Pro Ser Phe Thr His Ala Met Gin Leu Leu Thr Ala Glu 115 120 125
ATT GAG AAG ATT CAG AAA GGA GAC TCA AAA AAG GAT GAT GAG GAG AAT 432
Ile Glu Lys Ile Gin Lys Gly Asp Ser Lys Lys Asp Asp Glu Glu Asn 130 135 140
TAC TTG GAT TTA TTT TCT CAT AAG AAC ATG AAA CTG AAA GAG CGA GTG 480
Tyr Leu Asp Leu Phe Ser His Lys Asn Met Lys Leu Lys Glu Arg Val
145 150 155 160
CTG ATA CCT GTC AAG CAG TAT CCC AAG TTC AAT TTT GTG GGG AAG ATT 528
Leu Ile Pro Val Lys Gin Tyr Pro Lys Phe Asn Phe Val Gly Lys Ile
165 170 175
CTT GGA CCA CAA GGG AAT ACA ATC AAA AGA CTG CAG GAA GAG ACT GGT 576
Leu Gly Pro Gin Gly Asn Thr Ile Lys Arg Leu Gin Glu Glu Thr Gly 180 185 190
GCA AAG ATC TCT GTA TTG GGA AAG GGC TCA ATG AGA GAC AAA GCC AAG 624
Ala Lys Ile Ser Val Leu Gly Lys Gly Ser Met Arg Asp Lys Ala Lys 195 200 205
GAG GAA GAG CTG CGC AAA GGT GGA GAC CCC AAA TAT GCC CAC TTG AAT 672
Glu Glu Glu Leu Arg Lys Gly Gly Asp Pro Lys Tyr Ala His Leu Asn 210 215 220
ATG GAT CTG CAT GTC TTC ATT GAA GTC TTT GGA CCC CCA TGT GAG GCT 720 Met Asp Leu His Val Phe Ile Glu Val Phe Gly Pro Pro Cys Glu Ala 225 230 235 240
TAT GCT CTT ATG GCC CAT GCC ATG GAG GAA GTC AAG AAA TTT CTA GTA 768
Tyr Ala Leu Met Ala His Ala Met Glu Glu Val Lys Lys Phe Leu Val 245 250 255
CCG GAT ATG ATG GAT GAT ATC TGT CAG GAG CAA TTT CTA GAG CTG TCC 816
Pro Asp Met Met Asp Asp Ile Cys Gin Glu Gin Phe Leu Glu Leu Ser 260 265 270
TAC TTG AAT GGA GTA CCT GAA CCC TCT CGT GGA CGT GGG GTG CCA GTG 864
Tyr Leu Asn Gly Val Pro Glu Pro Ser Arg Gly Arg Gly Val Pro Val 275 280 285
AGA GGC CGG GGA GCT GCA CCT CCT CCA CCA CCT GTT CCC AGG GGC CGT 912
Arg Gly Arg Gly Ala Ala Pro Pro Pro Pro Pro Val Pro Arg Gly Arg
290 295 300
GGT GTT GGA CCA CCT CGG GGG GCT TTG GTA CGT GGT ACA CCA GTA AGG 960
Gly Val Gly Pro Pro Arg Gly Ala Leu Val Arg Gly Thr Pro Val Arg 305 310 315 320
GGA GCC ATC ACC AGA GGT GCC ACT GTG ACT CGA GGC GTG CCA CCC CCA 1008
Gly Ala Ile Thr Arg Gly Ala Thr Val Thr Arg Gly Val Pro Pro Pro 325 330 335
CCT ACT GTG AGG GGT GCT CCA GCA CCA AGA GCA CGG ACA GCG GGC ATC 1056
Pro Thr Val Arg Gly Ala Pro Ala Pro Arg Ala Arg Thr Ala Gly Ile 340 345 350
CAG AGG ATA CCT TTG CCT CCA CCT CCT GCA CCA GAA ACA TAT GAA GAA 1104
Gin Arg Ile Pro Leu Pro Pro Pro Pro Ala Pro Glu Thr Tyr Glu Glu 355 360 365
TAT GGA TAT GAT GAT ACA TAC GCA GAA CAA AGT TAC GAA GGC TAC GAA 1152
Tyr Gly Tyr Asp Asp Thr Tyr Ala Glu Gin Ser Tyr Glu Gly Tyr Glu 370 375 380
GGC TAT TAC AGC CAG AGT CAA GGG GAC TCA GAA TAT TAT GAC TAT GGA 1200
Gly Tyr Tyr Ser Gin Ser Gin Gly Asp Ser Glu Tyr Tyr Asp Tyr Gly
385 390 395 400
CAT GGG GAG GTT CAA GAT TCT TAT GAA GCT TAT GGC CAG GAC GAC TGG 1248
His Gly Glu Val Gin Asp Ser Tyr Glu Ala Tyr Gly Gin Asp Asp Trp 405 410 415
AAT GGG ACC AGG CCG TCG CTG AAG GCC CCT CCT GCT AGG CCA GTG AAG 1296 Asn Gly Thr Arg Pro Ser Leu Lys Ala Pro Pro Ala Arg Pro Val Lys 420 425 430
GGA GCA TAC AGA GAG CAC CCA TAT GGA CGT TAT TAA 1332
Gly Ala Tyr Arg Glu His Pro Tyr Gly Arg Tyr * 435 440
(2) INFORMATIONS POUR LA SEQ ID NO: 2:
(i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE:
(A) LONGUEUR: 1215 paires de bases
(B) TYPE: nucléotide (C) NOMBRE DE BRINS: simple
(D) CONFIGURATION: linéaire
(ii) TYPE DE MOLECULE: ADNc (iii) HYPOTHETIQUE: NON
(iv) ANTI-SENS: NON
(ix) CARACTERISTIQUE:
(A) NOM/CLE: CDS
(B) EMPLACEMENT: 1..1215
(xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID NO: 2:
ATG CAG CGC CGG GAC GAC CCC GCC GCG CGC ATG AGC CGG TCT TCG GGC 48
Met Gin Arg Arg Asp Asp Pro Ala Ala Arg Met Ser Arg Ser Ser Gly 1 5 10 15
CGT AGC GGC TCC ATG GAC CCC TCC GGT GCC CAC CCC TCG GTG CGT CAG 96
Arg Ser Gly Ser Met Asp Pro Ser Gly Ala His Pro Ser Val Arg Gin 20 25 30
ACG CCG TCT CGG CAG CCG CCG CTG CCT CAC CGG TCC CGG GGA GGC GGA 144
Thr Pro Ser Arg Gin Pro Pro Leu Pro His Arg Ser Arg Gly Gly Gly 35 40 45
GGG GGA TCC CGC GGG GGC GCC CGG GCC TCG CCC GCC ACG CAG CCG CCA 192
Gly Gly Ser Arg Gly Gly Ala Arg Ala Ser Pro Ala Thr Gin Pro Pro 50 55 60
CCG CTG CTG CCG CCC TCG GCC ACG GGT CCC GAC GCG ACA GTG GGC GGG 240
Pro Leu Leu Pro Pro Ser Ala Thr Gly Pro Asp Ala Thr Val Gly Gly 65 70 75 80
CCA GCG CCG ACC CCG CTG CTG CCC CCC TCG GCC ACA GCC TCG GTC AAG 288
Pro Ala Pro Thr Pro Leu Leu Pro Pro Ser Ala Thr Ala Ser Val Lys 85 90 95 ATG GAG CCA GAG AAC AAG TAC CTG CCC GAA CTC ATG GCC GAG AAG GAC 336
Met Glu Pro Glu Asn Lys Tyr Leu Pro Glu Leu Met Ala Glu Lys Asp 100 105 110
TCG CTC GAC CCG TCC TTC ACT CAC GCC ATG CAG CTG CTG ACG GCA GAA 384
Ser Leu Asp Pro Ser Phe Thr His Ala Met Gin Leu Leu Thr Ala Glu 115 120 125
ATT GAG AAG ATT CAG AAA GGA GAC TCA AAA AAG GAT GAT GAG GAG AAT 432
Ile Glu Lys Ile Gin Lys Gly Asp Ser Lys Lys Asp Asp Glu Glu Asn 130 • 135 140
TAC TTG GAT TTA TTT TCT CAT AAG AAC ATG AAA CTG AAA GAG CGA GTG 480
Tyr Leu Asp Leu Phe Ser His Lys Asn Met Lys Leu Lys Glu Arg Val 145 150 155 160
CTG ATA CCT GTC AAG CAG TAT CCC AAG GAG GAA GAG CTG CGC AAA GGT 528
Leu Ile Pro Val Lys Gin Tyr Pro Lys Glu Glu Glu Leu Arg Lys Gly 165 170 175
GGA GAC CCC AAA TAT GCC CAC TTG AAT ATG GAT CTG CAT GTC TTC ATT 576
Gly Asp Pro Lys Tyr Ala His Leu Asn Met Asp Leu His Val Phe Ile 180 185 190
GAA GTC TTT GGA CCC CCA TGT GAG GCT TAT GCT CTT ATG GCC CAT GCC 624
Glu Val Phe Gly Pro Pro Cys Glu Ala Tyr Ala Leu Met Ala His Ala 195 200 205
ATG GAG GAA GTC AAG AAA TTT CTA GTA CCG GAT ATG ATG GAT GAT ATC 672
Met Glu Glu Val Lys Lys Phe Leu Val Pro Asp Met Met Asp Asp Ile 210 215 220
TGT CAG GAG CAA TTT CTA GAG CTG TCC TAC TTG AAT GGA GTA CCT GAA 720
Cys Gin Glu Gin Phe Leu Glu Leu Ser Tyr Leu Asn Gly Val Pro Glu 225 230 235 240
CCC TCT CGT GGA CGT GGG GTG CCA GTG AGA GGC CGG GGA GCT GCA CCT 768
Pro Ser Arg Gly Arg Gly Val Pro Val Arg Gly Arg Gly Ala Ala Pro 245 250 255
CCT CCA CCA CCT GTT CCC AGG GGC CGT GGT GTT GGA CCA CCT CGG GGG 816
Pro Pro Pro Pro Val Pro Arg Gly Arg Gly Val Gly Pro Pro Arg Gly 260 265 270
GCT TTG GTA CGT GGT ACA CCA GTA AGG GGA GCC ATC ACC AGA GGT GCC 864
Ala Leu Val Arg Gly Thr Pro Val Arg Gly Ala Ile Thr Arg Gly Ala 275 280 285 ACT GTG ACT CGA GGC GTG CCA CCC CCA CCT ACT GTG AGG GGT GCT CCA 912
Thr Val Thr Arg Gly Val Pro Pro Pro Pro Thr Val Arg Gly Ala Pro 290 295 300
GCA CCA AGA GCA CGG ACA GCG GGC ATC CAG AGG ATA CCT TTG CCT CCA 960
Ala Pro Arg Ala Arg Thr Ala Gly Ile Gin Arg Ile Pro Leu Pro Pro 305 310 315 320
CCT CCT GCA CCA GAA ACA TAT GAA GAA TAT GGA TAT GAT GAT ACA TAC 1008
Pro Pro Ala Pro Glu Thr Tyr Glu Glu Tyr Gly Tyr Asp Asp Thr Tyr 325 330 335
GCA GAA CAA AGT TAC GAA GGC TAC GAA GGC TAT TAC AGC CAG AGT CAA 1056
Ala Glu Gin Ser Tyr Glu Gly Tyr Glu Gly Tyr Tyr Ser Gin Ser Gin 340 345 350
GGG GAC TCA GAA TAT TAT GAC TAT GGA CAT GGG GAG GTT CAA GAT TCT 1104
Gly Asp Ser Glu Tyr Tyr Asp Tyr Gly His Gly Glu Val Gin Asp Ser 355 360 365
TAT GAA GCT TAT GGC CAG GAC GAC TGG AAT GGG ACC AGG CCG TCG CTG 1152
Tyr Glu Ala Tyr Gly Gin Asp Asp Trp Asn Gly Thr Arg Pro Ser Leu 370 375 380
AAG GCC CCT CCT GCT AGG CCA GTG AAG GGA GCA TAC AGA GAG CAC CCA 1200
Lys Ala Pro Pro Ala Arg Pro Val Lys Gly Ala Tyr Arg Glu His Pro 385 390 395 400
TAT GGA CGT TAT TAA 1215
Tyr Gly Arg Tyr * 405
(2) INFORMATIONS POUR LA SEQ ID NO: 3:
(i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE: (A) LONGUEUR: 726 paires de bases
(B) TYPE: nucléotide
(C) NOMBRE DE BRINS: simple
(D) CONFIGURATION: linéaire (ii) TYPE DE MOLECULE: ADNc (iii) HYPOTHETIQUE: NON (iv) ANTI-SENS: NON
(ix) CARACTERISTIQUE:
(A) NOM/CLE: CDS
(B) EMPLACEMENT:1..726 (xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID NO: 3:
ATG AGA GAC AAA GCC AAG GAG GAA GAG CTG CGC AAA GGT GGA GAC CCC 48
Met Arg Asp Lys Ala Lys Glu Glu Glu Leu Arg Lys Gly Gly Asp Pro 1 5 10 15
AAA TAT GCC CAC TTG AAT ATG GAT CTG CAT GTC TTC ATT GAA GTC TTT 96
Lys Tyr Ala His Leu Asn Met Asp Leu His Val Phe Ile Glu Val Phe 20 25 30
GGA CCC CCA TGT GAG GCT TAT GCT CTT ATG GCC CAT GCC ATG GAG GAA 144
Gly Pro Pro Cys Glu Ala Tyr Ala Leu Met Ala His Ala Met Glu Glu 35 40 45
GTC AAG AAA TTT CTA GTA CCG GAT ATG ATG GAT GAT ATC TGT CAG GAG 192
Val Lys Lys Phe Leu Val Pro Asp Met Met Asp Asp Ile Cys Gin Glu 50 55 60
CAA TTT CTA GAG CTG TCC TAC TTG AAT GGA GTA CCT GAA CCC TCT CGT 240
Gin Phe Leu Glu Leu Ser Tyr Leu Asn Gly Val Pro Glu Pro Ser Arg 65 70 75 80
GGA CGT GGG GTG CCA GTG AGA GGC CGG GGA GCT GCA CCT CCT CCA CCA 288
Gly Arg Gly Val Pro Val Arg Gly Arg Gly Ala Ala Pro Pro Pro Pro 85 90 95
CCT GTT CCC AGG GGC CGT GGT GTT GGA CCA CCT CGG GGG GCT TTG GTA 336
Pro Val Pro Arg Gly Arg Gly Val Gly Pro Pro Arg Gly Ala Leu Val
100 105 110
CGT GGT ACA CCA GTA AGG GGA GCC ATC ACC AGA GGT GCC ACT GTG ACT 384
Arg Gly Thr Pro Val Arg Gly Ala Ile Thr Arg Gly Ala Thr Val Thr 115 120 125
CGA GGC GTG CCA CCC CCA CCT ACT GTG AGG GGT GCT CCA GCA CCA AGA 432
Arg Gly Val Pro Pro Pro Pro Thr Val Arg Gly Ala Pro Ala Pro Arg 130 135 140
GCA CGG ACA GCG GGC ATC CAG AGG ATA CCT TTG CCT CCA CCT CCT GCA 480
Ala Arg Thr Ala Gly Ile Gin Arg Ile Pro Leu Pro Pro Pro Pro Ala 145, 150 155 160
CCA GAA ACA TAT GAA GAA TAT GGA TAT GAT GAT ACA TAC GCA GAA CAA 528
Pro Glu Thr Tyr Glu Glu Tyr Gly Tyr Asp Asp Thr Tyr Ala Glu Gin
165 170 175
AGT TAC GAA GGC TAC GAA GGC TAT TAC AGC CAG AGT CAA GGG GAC TCA 576 Ser Tyr Glu Gly Tyr Glu Gly Tyr Tyr Ser Gin Ser Gin Gly Asp Ser 180 185 190
GAA TAT TAT GAC TAT GGA CAT GGG GAG GTT CAA GAT TCT TAT GAA GCT 624
Glu Tyr Tyr Asp Tyr Gly His Gly Glu Val Gin Asp Ser Tyr Glu Ala 195 200 205
TAT GGC CAG GAC GAC TGG AAT GGG ACC AGG CCG TCG CTG AAG GCC CCT 672
Tyr Gly Gin Asp Asp Trp Asn Gly Thr Arg Pro Ser Leu Lys Ala Pro
210 215 220
CCT GCT AGG CCA GTG AAG GGA GCA TAC AGA GAG CAC CCA TAT GGA CGT 720
Pro Ala Arg Pro Val Lys Gly Ala Tyr Arg Glu His Pro Tyr Gly Arg 225 230 235 240
TAT TAA 726
Tyr *
(2) INFORMATIONS POUR LA SEQ ID NO: 4:
(i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE:
(A) LONGUEUR: 24 paires de bases
(B) TYPE: nucléotide (C) NOMBRE DE BRINS: simple
(D) CONFIGURATION: linéaire
(ii) TYPE DE MOLECULE: ADNc (iii) HYPOTHETIQUE: NON
(iv) ANTI-SENS: NON
(xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID NO: 4:
CAGCTGCTGA CGGCAGAAAT TGAG 24
(2) INFORMATIONS POUR LA SEQ ID NO: 5: (i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE:
(A) LONGUEUR: 24 paires de bases
(B) TYPE: nucléotide
(C) NOMBRE DE BRINS: simple
(D) CONFIGURATION: linéaire
(ii) TYPE DE MOLECULE: ADNc
(iii) HYPOTHETIQUE: NON (iv) ANTI-SENS: NON (xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID NO: 5:
TTAATAACGT CCATATGGGT GCTC
24
(2) INFORMATIONS POUR LA SEQ ID NO: 6:
(i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE: (A) LONGUEUR: 24 paires de bases (B) TYPE: nucléotide
(C) NOMBRE DE BRINS: simple
(D) CONFIGURATION: linéaire
(ii) TYPE DE MOLECULE: ADNc (iii) HYPOTHETIQUE: NON (iv) ANTI-SENS: NON
(xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID NO: 6: CAGTATCCCA AGGAGGAAGA GCTG
24
(2) INFORMATIONS POUR LA SEQ ID NO: 7:
(i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE:
(A) LONGUEUR: 24 paires de bases
(B) TYPE: nucléotide
(C) NOMBRE DE BRINS: simple (D) CONFIGURATION: linéaire
(ii) TYPE DE MOLECULE: ADNc
(iii) HYPOTHETIQUE: NON
(iv) ANTI-SENS: NON
(xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID NO: 7:
CTGTCAAGCA GTATCCCAAG GAGG
24
(2) INFORMATIONS POUR LA SEQ ID NO: 8: (i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE: (A) LONGUEUR: 24 paires de bases
(B) TYPE: nucléotide
(C) NOMBRE DE BRINS: simple
(D) CONFIGURATION: linéaire
(ii) TYPE DE MOLECULE: ADNc
(iii) HYPOTHETIQUE: NON (iv) ANTI-SENS: NON
(xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID NO: 8: AAGGGCTCAA TGAGAGACAA AGCC
(2) INFORMATIONS POUR LA SEQ ID NO: 9:
(i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE: (A) LONGUEUR: 24 paires de bases (B) TYPE: nucléotide
(C) NOMBRE DE BRINS: simple
(D) CONFIGURATION: linéaire
(ii) TYPE DE MOLECULE: ADNc (iii) HYPOTHETIQUE: NON (iv) ANTI-SENS: NON
(xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID NO: 9: GTATGTATCA TCATATCCAT ATTC
24

Claims

REVENDICATIONS
1. Dérivé de p62 capable d'inhiber au moins en partie l'interaction entre une protéine GAP et p62.
2. Dérivé selon la revendication 1 caractérisé en ce qu'il inhibe au moins partiellement les signaux transduits par ras.
3. Dérivé de p62 caractérisé en ce qu'il a perdu la capacité de p62 d'interagir avec TARN.
4. Dérivé selon l'une des revendications 1 à 3 caractérisé en ce qu'il comporte au moins une délétion dans la zone d'homologie à la protéine GRP33.
5. Dérivé selon la revendication 1 à 4 caractérisé en ce qu'il comporte une partie de p62 permettant l'interaction avec le domaine SH2 de GAP.
6. Dérivé selon la revendication 5 caractérisé en ce qu'il s'agit d'un polypeptide comprenant tout ou partie de la séquence SEQ ID n° 2 ou d'un variant de celle-ci.
7. Polypeptide Δp62 de séquence SEQ ID n°2.
8. Dérivé selon la revendication 5 caractérisé en ce qu'il comprend essentiellement la région portant les tyrosines phosphorylées de p62.
9. Dérivé selon ta revendication 8 caractérisé en ce qu'il s'agit d'un polypeptide comprenant tout ou partie de la séquence SEQ ID n° 3.
10. Polypeptide p62-C de séquence SEQ ID n°3.
11. Acide nucléique codant pour un polypeptide selon l'une des revendication 1 à 10.
12. Acide nucléique selon la revendication 11 caractérisé en ce qu'il s'agit d'un ADNc ou d'un ARN.
13. Acide nucléique selon la revendication 11 ou 12 caractérisé en ce qu'il est choisi parmi : (a) tout ou partie de la séquence SEQ ID n° 2 ou SEQ ID n° 3 ou de leur brin complémentaire,
(b) toute séquence hybridant avec les séquences (a) et codant pour un dérivé selon la revendication 1 ,
(c) les variants de (a) et (b) résultant de la dégénérescence du code génétique.
14. Acide nucléique de séquence SEQ ID n° 2.
15. Acide nucléique de séquence SEQ ID n°3.
16. Cassette d'expression comprenant un acide nucléique selon l'une des revendications 11 à 15, un promoteur permettant son expression et un signal de terminaison de la transcription.
17. Vecteur comportant un acide nucléique selon l'une des revendications 11 à 15 ou une cassette selon la revendication 16.
18. Vecteur selon la revendication 17 caractérisé en ce qu'il s'agit d'un vecteur plasmidique.
19. Vecteur selon la revendication 17 caractérisé en ce qu'il s'agit d'un vecteur viral.
20. Vecteur selon la revendication 19 caractérisé en ce que le vecteur viral dérive d'un adénovirus, d'un rétrovirus, d'un virus AAV ou d'un virus de l'herpès.
21. Rétrovirus recombinant défectif dont le génome comprend un acide nucléique selon l'une des revendications 11 à 15 ou une cassette selon la revendication 16.
22. Adénovirus recombinant défectif dont le génome comprend un acide nucléique selon l'une des revendications 11 à 15 ou une cassette selon la revendication 16.
23. Composition pharmaceutique comprenant au moins un acide nucléique selon la revendication 11.
24. Composition pharmaceutique comprenant au moins un vecteur selon la revendication 17.
25. Composition pharmaceutique comprenant au moins un dérivé selon la revendication 1.
26. Composition pharmaceutique selon les revendications 23 à 25 pour le traitement des cancers.
27. Utilisation d'un acide nucléique selon la revendication 11 ou d'un vecteur selon la revendication 17 pour la préparation d'une composition pharmaceutique destinée au traitement des désordres hyperprolifératifs.
EP96918728A 1995-06-01 1996-05-29 $g(D)P62, SES VARIANTS, SEQUENCES D'ACIDES NUCLEIQUES LES CODANT, ET LEURS UTILISATIONS EN THERAPIE GENIQUE ANTI-CANCEREUSE Withdrawn EP0828832A2 (fr)

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