WO1997029196A1 - Variants de la thymidine kinase, sequences d'acides nucleiques correspondantes et leur utilisation en therapie genique - Google Patents

Variants de la thymidine kinase, sequences d'acides nucleiques correspondantes et leur utilisation en therapie genique Download PDF

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WO1997029196A1
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variant
thymidine kinase
nucleic acid
wild
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Joël Crouzet
Françis BLANCHE
Michel Couder
Béatrice Cameron
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Rhone-Poulenc Rorer S.A.
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Definitions

  • the present invention relates to nucleic acid sequences encoding enzymes derived from the wild-type thymidine kinase enzyme, TK, and having improved functions for therapeutic use. It relates more particularly to new enzymes having improved substrate specificity and / or efficiency compared to the wild-type thymidine kinase enzyme. It also relates to vectors containing these nucleic acid sequences and to their therapeutic uses, in particular in gene therapy.
  • the present invention relates more particularly to the field of gene therapy which implements suicide genes with a view to inducing cell death of specific cells such as cells infected with a virus such as the HIV type virus (human immunodeficiency virus) ), CMV (cytomegalovirus) or VCR (respiratory syncytial virus).
  • a virus such as the HIV type virus (human immunodeficiency virus) ), CMV (cytomegalovirus) or VCR (respiratory syncytial virus).
  • HIV type virus human immunodeficiency virus
  • CMV cytomegalovirus
  • VCR respiratory syncytial virus
  • suicide gene use is preferably made in gene therapy of genes whose expression product confers on the cell a sensitivity to a therapeutic agent. More generally, these are genes coding for non-mammalian and non-toxic enzymes which, when expressed in mammalian cells, transform a prodrug, initially little or not toxic, into a highly toxic agent.
  • a prodrug activation mechanism is advantageous for several reasons: it makes it possible to optimize the therapeutic index by adjusting the concentration of prodrug or the expression of the enzyme, to interrupt the toxicity by no longer administering the prodrug and assess the mortality rate.
  • suicide genes are described in the literature, for example the genes coding for cytosine deaminase, purine nucleoside. phosphorylase or a thymidine kinase such as for example the thymidine kinases of the chickenpox virus or of the herpes simplex virus type 1.
  • the gene coding for the thymidine kinase of the herpes simplex virus type 1 is which is particularly interesting from the therapeutic point of view because, unlike other suicide genes, it generates an enzyme, thymidine kinase, capable of specifically eliminating cells in the process of division.
  • This enzyme has a different substrate specificity from the cellular enzyme, and has been shown to be the target of guanosine analogs such as acyclovir or ganciclovir (Moolten 1986 Cancer Res. 46 p5276).
  • the mechanism of action can be schematized as follows: mammalian cells, modified to express the HSV1-TK enzyme, carry out the first stage of phosphorylation of ganciclovir to lead to ganciclovir monophosphate. This step would be limiting. Subsequently, cellular kinases allow the metabolism of this ganciclovir monophosphate successively into diphosphate then triphosphate. The ganciclovir triphosphate thus generated, then produces toxic effects by incorporating into the DNA and partially inhibits the cellular DNA polymerase alpha which causes the arrest of DNA synthesis and therefore leads to the death of the cell. (Moolten 1986 Cancer Res. 46 p5276; Mullen 1994 Pharmac. Ther. 6J pl99).
  • TK a propagated toxicity effect
  • This effect is manifested by the destruction not only of the cells which have incorporated the TK gene but also of the neighboring cells.
  • the mechanism of this process can be explained in three ways: i) the formation of apoptotic vesicles which contain phosphorylated ganciclovir or thymidine kinase, originating from dead cells, then the phagocytosis of these vesicles by neighboring cells; ii) the passage of prodrug metabolized by thymidine kinase, by a process of metabolic cooperation from cells containing the suicide gene to cells not containing it and / or iii) an immune response linked to tumor regression (Marini et al .
  • TK gene is delivered to cells by means of various vectors such as in particular retroviral or adenoviral vectors.
  • various vectors such as in particular retroviral or adenoviral vectors.
  • much lower doses should be administered in the range of 5 mg / kg and for a short duration of treatment (14 days) (E. Oldfield et al. 1995 Human Gene Therapy 6 p55).
  • a suicide gene related to the gene coding for wild thymidine kinase capable of generating a more specific and / or more active variant of the wild-type TK enzyme for phosphorylating ganciclovir.
  • a variant can also be used at a significantly reduced dose compared to the dose in wild suicide gene, and in addition make it possible to reduce the dose of substrate which is conventionally associated with it.
  • the object of the present invention is precisely to propose a nucleic acid sequence coding for an enzyme of the thymidine kinase type having a more effective activating behavior with respect to ganciclovir or a nucleoside analog.
  • the present invention describes the construction of new thymidine kinase variants having improved enzymatic properties.
  • the present application also describes the construction of nucleic acid sequences coding for these variants as well as vectors containing said sequences and allowing their administration in vivo and the in vivo production of mutants.
  • the Applicant has indeed prepared, isolated and characterized a series of specific nucleic acid sequences coding for variants of thymidine kinase having the required activating behavior, that is to say significantly improved compared to that of thymidine kinase wild.
  • the Applicant has in particular demonstrated that new variants of the thymidine kinase having improved enzymatic properties could be obtained in particular by modification of the region of the protein responsible for the binding with ATP.
  • a first object of the invention resides in a nucleic acid sequence coding for a thymidine kinase, characterized in that it has, with respect to the wild-type sequence, at least one mutation in the region corresponding to the ATP binding site associated with at least one mutation in the N-terminal and / or C-terminal region.
  • the first object of the present invention is a nucleic acid sequence characterized in that it derives from the nucleic acid sequence coding for a wild thymidine kinase, said nucleic acid sequence having at least one mutation in the region corresponding to the ATP binding site and at least one mutation in the N-terminal and / or C-terminal region.
  • mutation covers any substitution, deletion, addition and / or modification of one or more residues of the nucleic acid sequence considered. It is understood that the claimed nucleic acid sequence may include other mutations, localized or not, in the regions as defined above.
  • the nucleic acid sequence derives from the sequence coding for the TK of the herpes simplex virus type I.
  • the mutation in the region corresponding to the ATP binding site is represented there. by at least one substitution of a guanine in position 180 by an adenine (G180A).
  • the mutation present in the N-terminal part of the TK it may be a substitution of guanine in position 16 by an adenine (G16A) or a double substitution of guanines in position 28 and By adenines (G28A and G30A).
  • the nucleic acid sequences claimed carry, in addition to a mutation in the region corresponding to the ATP binding site, at least one mutation in the terminal C part and more particularly located between positions 990 and 1030.
  • this mutation present in the C-terminal part is also associated with a localized mutation in the N-terminal part of the TK as defined above.
  • the nucleic acid sequence according to the invention can be of bacterial, viral, synthetic or semi-synthetic eukaryotic origin.
  • nucleic acid sequences of the invention can be prepared according to any technique known to those skilled in the art. As an illustration of these techniques, we can notably mention: - chemical synthesis, using the sequences presented in the application and for example a nucleic acid synthesizer,
  • the nucleic acid sequences according to the invention can also be obtained by mutagenesis (s), directed or not, of a nucleic acid sequence, natural or already mutated, coding respectively for a wild thymidine kinase or a of its variants.
  • mutagenesis s
  • Numerous methods making it possible to carry out site-directed or random mutagenesis are known to those skilled in the art and mention may be made of site-directed mutagenesis by PCR or by oligonucleotide, random mutagenesis in vitro by chemical agents such as for example hydroy lamine or in vivo in mutant E. coli strains (Miller "A short course in bacterial genetics", Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY, 1992).
  • the present invention thus extends to any nucleic acid sequence coding for a variant of a wild thymidine kinase and capable of being obtained from a nucleic acid sequence as claimed by using one modification techniques previously mentioned and more preferably mutagenesis, directed or not.
  • the products of the sequences claimed according to the present invention prove to be more efficient than the natural enzyme from which they are derived by structural modification (s).
  • they exhibit improved enzymatic activity compared to the natural enzyme vis-à-vis ganciclovir or a nucleoside analog.
  • the so-called “more activating” or “improved enzymatic activity” of the variants according to the invention is assessed compared to that of the wild-type enzyme, according to the protocols described in detail in the examples below.
  • nucleoside analogue is intended to cover compounds of acyclovir, trifluorothymidine, l- [2-deoxy, 2-fluoro, beta-D- arabino furanosyl] -5-iodouracil, ara-A, araT type, 1 -beta-D-arabinofuranosyl thymidine, 5-ethyl-2'-deoxyuridine, iodouridine, AZT, AIU, dideoxycytidine and AraC.
  • BVDU ganciclovir
  • penciclovir penciclovir
  • the present invention also relates to wild-type thymidine kinase variants capable of being expressed from a claimed nucleic acid sequence.
  • the invention extends to any variant of a thymidine kinase characterized in that it comprises at least one mutation at its ATP binding site associated with at least one mutation in the N- region terminal and / or C- terminal.
  • this ATP binding site within the thymidine kinase peptide sequence varies according to its viral origin. Thus, depending on whether one considers the thymidine kinase of the chickenpox virus, of the herpes simplex virus, of type 1 or not, this region is positioned in different regions. However, in general, it appears there under the consensus GXXXXGK (T / S) (SEQ ID No. 1) with X representing any amino acid and in the particular case of the thymidine kinase of Herpes simplex virus type 1 , under the following specific sequence GPHGMGKT (SEQ ID No. 2).
  • the present invention relates to any variant of a wild thymidine kinase in accordance with the invention and comprising at its next peptide region GXXXXGK (T / S) at least one mutation.
  • the sequence having at least one mutation is that represented by GPHGMGKT (SEQ ID No. 2).
  • the mutation is more preferably represented therein by at least one substitution in position 60 of a Methionine by an Isoleucine.
  • the mutant 1537: E4 described in the examples below.
  • the mutation in the N-terminal region It is preferentially located in the amino acids numbered from 1 to 20. More preferentially said mutation is located in the amino acids numbered from 1 to 15. Even more preferentially said mutation is located in amino acids numbered from 1 to 10. According to one mode of preferred embodiment, said mutation is located in amino acids numbered from 5 to 10.
  • the present invention relates to a variant of the thymidine kinase of the herpes simplex virus type I comprising at least one mutation represented by a substitution in position 60 of a Methionine by an Isoleucine and by a substitution in position 10 of an Alanine by a Threonine.
  • mutant 2-865 H12 described in the examples below.
  • the present invention is a variant of the thymidine kinase of the herpes simplex virus type I comprising at least one mutation represented by a substitution in position 60 of a methionine an isoleucine and a substitution in position 6 of a Glycine by a Serine.
  • mutant 2-336LD3 As a representative of this type of mutant, mention may more particularly be made of the mutant 2-336LD3 described in the examples below.
  • the mutation in the C-terminal region is preferably located in the amino acids numbered from 320 to 350. More preferably, the said mutation is located in the amino acids numbered from 325 to 345. Even more preferably, the said mutation is localized. in amino acids numbered 330 to 343. According to a preferred embodiment, said mutation is located in amino acids numbered 335 to 340.
  • the present invention is a variant of the thymidine kinase of the herpes simplex virus type I comprising at least one substitution in position 60 of a Methionine with an Isoleucine, a substitution in position 10 of an Alanine with a Threonine and a substitution in position 337 of an Arginine with a Glutamine.
  • mutant 3-4216 H2 described in the examples below.
  • variants according to the invention exhibit improved performance in terms of one or more of the following enzymatic characteristics:
  • inhibition by ganciclovir at high concentration is generally observed with the wild-type enzyme; this is reduced or even eliminated with the variants according to the invention.
  • the variants according to the invention advantageously have a greater speed of phosphorylation of ganciclovir or of another analog;
  • thymidine phosphorylation rate will be defined in the following through its specificity constant Kcat / Km. It is a second order apparent speed constant familiar to those skilled in the art. It describes the properties and reactions of the free enzyme and the free substrate. For competing substrates, it determines the specificity of the enzyme with respect to these substrates. (A. Fersht, Enzyme Structure and Mechanism 1985, W.H. Freeman, London).
  • the variants according to the invention and in particular the variant 1537: E4 advantageously exhibit the following kinetic properties: - a substantial reduction or even total inhibition of the phosphorylation activity of ganciclovir, unlike the wild-type enzyme for which the inhibition is very clear from 15 ⁇ M;
  • variants according to the invention and more particularly variants 2-865: H12 and 2-3361: D3 exhibit at least one of the following kinetic performances:
  • the variant 3-4216: H2 according to the invention exhibits at least one of the following kinetic performances:
  • variant according to the present invention is also intended to denote any enzyme obtained by modification, using genetic engineering techniques, of the nucleic acid sequence coding for a wild thymidine kinase and having the behavior defined above with regard to ganciclovir and / or a nucleoside analog.
  • Modification means any mutation, substitution, deletion, addition or modification of a genetic and / or chemical nature).
  • the present invention also relates to any expression cassette comprising a nucleic acid sequence as defined above, a promoter allowing its expression and a transcription termination signal.
  • the promoter is advantageously chosen from functional promoters in mammalian cells, preferably human. More preferably, it is a promoter allowing the expression of a nucleic acid sequence in a hyperproliferative cell (cancerous, restenosis, etc.).
  • different promoters can be used. It can for example be the own promoter of the TK gene of herpes simplex type I. It can also be sequences of different origin (responsible for the expression of other genes, or even synthetic).
  • It can thus be any promoter or derived sequence stimulating or repressing the transcription of a gene in a specific way or not, inducible or not, strong or weak. Mention may in particular be made of the promoter sequences of eukaryotic or viral genes. For example, they may be promoter sequences originating from the genome of the target cell.
  • ubiquitous promoters can be used in particular (promoter of the HPRT, PGK genes, alpha-actin, tubulin, DHFR ete), promoters of intermediate filaments (promoter of the GFAP genes, desmin, vimentin, neurofilaments, keratin, ete), promoters of therapeutic genes (for example the promoter of the MDR, CFTR genes, Factor VTII, ApoAI, ete), tissue-specific promoters (promoter of the pyruvate kinase gene, villin, intestinal fatty acid binding protein, alpha smooth muscle actin, ete), promoters of specific cells of the dividing cell type such as cancer cells or of promoters responding to a stimulus (steroid hormone receptor, retinoic acid receptor, glucocorticoid receptor, ete) or so-called inducible.
  • promoters of specific cells of the dividing cell type such as cancer cells or of promoters responding to a
  • promoter sequences originating from the genome of a virus such as for example the promoters of the El A and MLP genes of adenovirus, the early promoter of CMV, or also the promoter of the RSV LTR, etc.
  • these promoter regions can be modified by adding activation or regulatory sequences, or allowing tissue-specific or majority expression.
  • the nucleic acids or cassettes according to the invention can be injected (s) as (s) as (s) at the site to be treated, or incubated (s) directly with the cells to be destroyed or treat. It has in fact been described that the naked nucleic acid sequences can penetrate cells without any particular vector. Nevertheless, it is preferred in the context of the present invention to use an administration vector, making it possible to improve (i) the efficiency of cell penetration, (ii) targeting (iii) extra- and intracellular stability.
  • the nucleic acid sequence or the cassette is incorporated into a vector.
  • the vector used can be of chemical, biochemical or viral origin.
  • chemical vector is intended to cover, within the meaning of the invention, any non-viral agent capable of promoting the transfer and expression of nucleic acid sequences in eukaryotic cells.
  • These chemical or biochemical vectors, synthetic or natural, represent an interesting alternative to natural viruses in particular for reasons of convenience, safety and also by the absence of theoretical limit as regards the size of the DNA to be transfected.
  • These synthetic vectors have two main functions, to compact the nucleic acid to be transfected and to promote its cellular fixation as well as its passage through the plasma membrane and, where appropriate, the two nuclear membranes.
  • the non-viral vectors all have polycationic charges.
  • viruses as vectors for gene transfer has emerged as a promising alternative to these physical transfection techniques.
  • different viruses have been tested for their ability to infect certain cell populations.
  • retroviruses RSV, HMS, MMS, ete
  • HSV virus HSV virus
  • adeno-associated viruses adenoviruses.
  • the nucleic acid sequence or vector used in the present invention can be formulated for topical, oral, parenteral, intranasal, intravenous, intramuscular, subcutaneous, intraocular, transdermal, etc. administration.
  • the nucleic acid sequence or the vector is used in an injectable form. They can therefore be mixed with any vehicle pharmaceutically acceptable for an injectable formulation, in particular for a direct injection at the site to be treated. They may in particular be sterile, isotonic solutions, or dry compositions, in particular lyophilized, which, by addition as appropriate of sterilized water or physiological saline, allow the constitution of injectable solutes.
  • nucleic acid sequences used can be adapted as a function of various parameters, and in particular as a function of the vector, the mode of administration used, the pathology concerned or also the duration of the treatment sought.
  • the invention also relates to any pharmaceutical composition comprising at least one nucleic acid sequence as defined above.
  • composition comprising at least one vector as defined above.
  • composition comprising at least one variant of the thymidine kinase as defined above.
  • the pharmaceutical compositions according to the invention are very particularly suitable for the treatment of hyperproliferative disorders, such as in particular cancers and restenosis.
  • the present invention thus provides a particularly effective method for the destruction of cells, in particular hyperproliferative cells. It is thus applicable to the destruction of tumor cells or smooth muscle cells of the vascular wall (restenosis). It is particularly suitable for the treatment of cancers.
  • colon adenocarcinomas thyroid cancer, lung carcinoma, myeloid leukemia, colorectal cancer, breast cancer, lung cancer, gastric cancer, cancer esophagus, B lymphomas, ovarian cancer, bladder cancer, glioblastoma, hepatocarcinoma, bone cancer, skin, pancreas or kidney and prostate cancer, larynx cancer, head and neck cancer, HPV positive anogenital cancer, EBV positive nasopharyngeal cancer, etc.
  • vivo it essentially consists in incubating the cells in the presence of a nucleic acid sequence (or of a vector, or cassette or directly of the derivative).
  • vivo it consists in administering to the organism an active quantity of a vector (or of a cassette) according to the invention, preferably directly at the level of the site to be treated (tumor in particular), beforehand, simultaneously and / or after the injection of the prodrug under consideration, ie ganciclovir or a nucleoside analog.
  • the subject of the invention is also a method of destroying hyperproliferative cells comprising bringing said cells or a part of them into contact with a nucleic acid sequence or a thymidine kinase variant such as defined above.
  • the present invention provides a mutated TK enzyme such that the phosphorylation of ganciclovir or of the nucleoside analog used is very significantly increased.
  • a sequence of TK nucleic acids mutated at doses of prodrug i) significantly lower; ii) or likely to cause a more pronounced "by-stander” effect; iii) or not leading to a cellular toxicity which could occur when wild thymidine kinase is overexpressed.
  • Figure 1 pXL2645 expression plasmid
  • Figure 2 Initial phosphorylation rates (specific activity in nmol / min / mg) as a function of thymidine concentration ( ⁇ M) for the wild-type and mutant enzymes HSV1-TK 1537: E4, 2-865: H12, 2-336LD3 and 3-4216: H2.
  • Figure 3 The curve represents the phosphorylation rates (specific activity in nmol / min / mg) as a function of the concentration of ganciclovir in ⁇ M for the wild-type and mutant HSVl-TK enzymes (1537: E4, 2-865: H12, 2 -336LD3 and 3-4216: H2).
  • Figure 4 Schematic representation of the plasmids pcDNA3-TK, pXL 3022 and pXL3037. Table 1 below summarizes the kinetic constants of these enzymes vis-à-vis ganciclovir and thymidine.
  • ACV acyclovir
  • GCV ganciclovir
  • HSVl-TK herpes simplex virus type 1 thymidine kinase.
  • the pUC type plasmids and phages of the Ml 3 series are of commercial origin (Bethesda Research Laboratories), the pBSK or pBKS plasmids come from Stratagen.
  • the enzymatic amplification of DNA fragments by the so-called PCR technique [Polymerase-catalyzed Chain Reaction] can be carried out using a "DNA thermal cycler" (Perkin Elmer Cetus) according to the manufacturer's recommendations.
  • Electroporation of plasmid DNA in E. coli cells can be carried out using an electroporator (Bio-Rad) according to the supplier's recommendations.
  • Verification of the nucleotide sequences can be carried out by the method developed by Sanger et al. [Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 74 (1977) 5463-5467] using the kit distributed by Amersham or the one distributed by Applied Biosystems.
  • the prokary ote expression plasmid pXL2638 was constructed from the plasmid pHSV-106 (Gibco-BRL) and the expression vector pET1 la (from Novagen) as follows. After making the ends blunt, the 1.5 kb BglII-Ncol insert originating from ⁇ HSV-106 and containing the HSVl-TK gene, the sequence of which is published by McKnight 1980 Nucl. Acids Res. 8. p5949, was cloned at the SmaI site of pBSK to form the plasmid pBTK1. An NdeI site was introduced by site-directed mutagenesis from position -3 of the coding sequence for the HSV1-TK gene.
  • a 500 bp fragment containing the 5 ′ part of the gene was amplified by PCR using pBTK1 as template and the 5 ′ sense oligonucleotides (TTA TGA ATT CAT ATG GCT TCG TAC CCC GGC) 3 ′ SEQ ID N ° 4 and 5 'antisense (TTA TTT CTA GAG GTC GAA G AT GAG GGT) 3' SEQ ID No. 5 as primers; this fragment was cloned into M13mpl9 and then sequenced.
  • This fragment digested with EcoRI and SstI generates a 460 bp insert which was co-cloned with the 1 kb Sstl-Xbal insert of pBTKl containing the 3 'part of the HSVl-TK gene in the plasmid pUC19 digested with EcoRI and Xbal; this pUCTK plasmid contains the HSVl-TK gene in the form of an NdeI-BamHI cassette which has been cloned between the NdeI and BamHI sites of pET11a to create the plasmid pXL2638.
  • This plasmid makes it possible to express the HSV1-TK gene under the control of the promoter of the gene 10 of bacteriophage T7; this promoter being induced when the RNA polymerase of bacteriophage T7 is synthesized as for example in the strain of E. goJi BL21, lambdaDE3 (Studier et al. 1990 Methods Enzymol. 185 p89).
  • Acellular extracts of E. nicti strain overproducing the HSV1-TK protein can be prepared in various ways, among which may be mentioned, lysozyme lysis in the presence of EDTA, the use of Menton type grinding devices. Golin, French Press, X-Press, or the action of ultrasound. More particularly, the acellular extracts of the strain of E. coli BL21, lambdaDE3 (Novagen Inc) pXL2638 were prepared as follows:
  • the strain E. ooji BL21, lambdaDE3 pXL2638 is cultured in LB medium
  • HSV1-TK protein is induced by the addition of 1 mM IPTG (isopropylthio-beta-D-galactoside) and is carried out by continuing the growth of the cells for 3 hours at 30 ° C.
  • the cells obtained from 1 l of culture are resuspended in 10 ml of 50 mM Tris / HCl buffer pH 7.8, containing 5 mM DTT, 4 mM MgC12, and 10% glycerol (v / v), and sonicated for 4 min at 4 ° C.
  • the supernatant is injected onto a Source 15Q column (50 ml of gel; Pharmacia) equilibrated in the buffer above.
  • the proteins are eluted with a linear gradient from 0 to 400 mM NaCl in buffer A.
  • the fractions containing the TK activity are combined, brought to a final concentration of 1.1 M of ammonium sulfate and chromatographed on a column of Phenyl-Superose HR 10/10 (Pharmacia) eluted with a decreasing linear gradient from 1.1 to 0 M ammonium sulfate.
  • the fractions containing the TK activity are grouped together. After this step, the preparation presents a single band visible on SDS-PAGE, after revelation with Coomassie Blue, and this band migrates with an apparent molecular weight of approximately 41,000.
  • nucleoside phosphorylation One can detect the ATP-dependent activity of nucleoside phosphorylation by proceeding for example as follows:
  • an enzymatic extract containing approximately 0.1 unit of TK is incubated for 15 min at 37 ° C. in 100 ⁇ l of 50 mM Tris / HCl buffer pH 7.8 containing 1 mg / ml BSA (bovine serum albumin), 5 mM ATP, 4 mM MgC12, 12 mM KC1, 2 mM DTT, 600 ⁇ M EDTA and 100 ⁇ M [8-3H] -GCV (40 nCi / nmol) The reaction is stopped by adding 10 ⁇ l of 50 mM Tris / HCl buffer pH 7.8 containing ImM thymidine non-radioactive.
  • BSA bovine serum albumin
  • the phosphorylated species are fixed on a DEAE-Sephadex column (400 ⁇ l of gel), then, after washing the column, these species are eluted with 2 ml of 1 M HC1. The radioactivity in the sample is then counted by liquid scintillation.
  • the assay of the TK activity using thymidine as substrate is carried out in the same way by bringing into play 0.002 unit of TK and 1 ⁇ M (methyl- 14 C) thymidine (56nCi / nmole).
  • the unit of activity TK is defined as the quantity of enzyme necessary to phosphorylate 1 nmol of substrate per min under the above conditions.
  • the amount of TK introduced into the enzymatic reaction is adjusted so as to transform at most 5% of the substrate introduced at the start, and the specific activity of this substrate is increased accordingly.
  • the Michaelis curves are adjusted to the experimental points using the Enzfitter software (Sigma).
  • heterologous expression systems in E. sou are numerous and well known to those skilled in the art.
  • Expression of the HSV1-TK gene has been found to be best for biochemical screening when the gene is expressed using the tryptophan pTryp promoter at a high copy number on the plasmid pXL2645.
  • the 1.4 kb Ndel-Xbal insert from pUCTK is co-cloned with the 120 bp Ndel-EcoRl inserts and 3.1 kb EcoRI-Xbal inserts from pXL694 (Jung et al. 1988 Ann. Inst. Pasteur / M icrobiol. 129 pl29) to generate the plasmid ⁇ XL2619.
  • plasmid DNA Five ⁇ g of plasmid DNA, dissolved in a 0.2 M pH6 phosphate buffer and containing 0.4 M of hydroxyamine, are incubated at 80 ° C or 86 ° C for 30 min and then cooled to room temperature for 20 min, the solution is then dialyzed and then precipitated. The DNA is then redissolved in 50 ⁇ l of water. If the plasmid DNA is pCHUO (from Pharmacia) and carrying the lacZ gene) lacZ 'mutants are obtained at a frequency of 2.4% (resp. 7.6%) when the plasmid is heated to 80 ° C ( resp. 86 ° C) in the presence of hydroxyamine. 1-6 Screening for mutants with modified TK.
  • the plasmid pXL2645 mutagenized with hydroxylamine at 80 ° C. is introduced by electroporation into the strain of E. cost ME8025 (from the National Institute of Genetics, Mishima, Shizuoka, Ken, Japan).
  • the electroporants are seeded individually in the microtiter plate wells containing 100 ⁇ l of minimum M9 medium supplemented with 0.4% casamino acids and 50 mg / 1 of ampidlline.
  • the cultures are incubated at 37 ° C. with shaking for 17 hours.
  • the reaction is stopped by the addition of 25 ⁇ l of 50 mM Tris / HCl buffer pH 7.8 containing non-radioactive ImM thymidine.
  • the phosphorylated species are fixed on a DEAE-Sephadex column (400 ⁇ l of gel), then, after washing the column, these species are eluted with 2 ml of 1 M HCl.
  • the radioactivity (3H and 14C) in the sample is then counted by liquid scintillation using a double labeling program, and the 3H / 14C ratio is calculated for each sample.
  • the average of the 3H / 14C ratios of all the clones (M) and the standard deviation ( ⁇ ) of the distribution of the 3H / 14C ratios are calculated.
  • the quantity of protein present in each of the wells of the 96-well plate is measured using the Bradford reagent (Coomassie Plus Protein Assay Reagent, Pierce) from an aliquot fraction of the dilution to l / 25th prepared above. Any clone with a protein content of less than a quarter of the average of the clones in the box is permanently eliminated.
  • the 3H / 14C ratio obtained for each clone of a 96-well dish is compared to the average M.
  • the clones having a ratio greater than the sum M + 3 ⁇ while exhibiting a thymidine phosphorylation activity greater than M '/ 2 , M 'being the average thymidine phosphorylation activities are retained for confirmation and study.
  • Table 2 summarizes the results obtained after screening 4129 clones from the hydroxylamine mutagenesis of pXL2645 at 80 ° C. In this screening, for the wild-type enzyme, the TK activity is reported at 100% and the GCV / Thy ratio is 1.
  • the HSV-TK gene expressed from the mutant 1537: E4 was sequenced on both strands and only one G 180 A mutation was observed. This mutation corresponds to a Met ⁇ OIle substitution. It should be noted that this residue is located in the consensus region of the site ATP fixation. A comparable work was carried out with the mutant 1921: H12 and the same substitution (Met60Ile) was observed.
  • the 1.4 kb Ndel-BamHI insert coding for the HSV1-TK gene of the mutant 1537: E4 was cloned into the expression vector pET11a to generate the ⁇ ET: E4. It is from this plasmid pET: E4 that the enzyme HSV1-TK of the mutant 1537: E4 was produced in E. coli BL21, lambdaDE3 under the conditions described in 1-2.
  • the kinetic constants for the mutant TK 1537: E4 and the wild-type TK taken as reference are obtained under the enzymatic assay conditions described in paragraph 1-3.
  • the 2 TKs (wild and mutant 1537: E4) do not exhibit Michaélien behavior with Ganciclovir and Acyclovir (inhibition at high concentration). This therefore prohibits the calculation of a value of Km with these 2 substrates. Only the concentration S0.5 corresponding to the substrate concentration giving an initial speed equal to half the maximum speed observed can be given. Vmax and Vmax obs are expressed in nmol / min / mg of protein.
  • the curve in FIG. 2 shows the initial phosphorylation rates as a function of the concentration of GCV for the two enzymes 1537: E4 and wild type. It shows in particular the almost complete absence of inhibition of the phosphorylation activity of GCV by the mutant TK 1537: E4, unlike the wild-type enzyme for which the inhibition is very clear from 15 ⁇ M. This curve also shows a factor 2 to 2.5 increase in the initial rate of phosphorylation of GCV from 15-20 ⁇ M with the mutant enzyme 1537: E4 compared to the wild-type enzyme.
  • the mutant enzyme 1537: E4 has a Kcat / Km ratio of thymidine reduced by a factor of 2 compared to the wild-type enzyme.
  • the plasmid pXL2838, derived from the mutant 1537: E4 carries, under the control of the promoter pTryp, the gene HSV1-TK, the TK protein of which is different from the wild-type protein by the M60I mutation.
  • This plasmid is mutagenized with hydroxylamine at 86 ° C. and then introduced by electroporation into the E. neck strain tk "ME8025.
  • a total of 4992 electroporants are analyzed for their capacity to phosphorylate ganciclovir and thymidine as described in Example 1
  • the results of this screening are summarized in Table 3 where the TK activity is reported at 100% and the GCV / Thy ratio is 1 for the wild-type enzyme.
  • Two mutants 2-865: H12 and 2-3361 : D3 show a more activating behavior towards ganciclovir.
  • the HSV1-TK gene expressed from the mutants 2-865: H12 and 2-3361: D3 was sequenced on both strands and the following mutations were observed.
  • the mutations are G28A, G30A and G180A which corresponds to the substitutions AlalOThr and Met ⁇ OIle.
  • the mutant 2-3361: D3 the mutations are G16A, G180A, C306T and C308T which corresponds to the substitutions Gly ⁇ Ser, Met ⁇ OIle and Thrl03Ile.
  • the enzymes of the mutants 2-865.H12 and 2-3361: D3 both carry a mutation in the N-terminal part of thymidine kinase position 10 or 6. Since the enzyme corresponding to the mutant 2-3361: D3 also has a mutation at position 103, plasmids comprising the mutations at position 6 and 60 (pXL2964) or at position 60 and 103 (pXL2963) or at position 103 (pXL2965) or only at position 6 (pXL2966) were constructed as follows.
  • Plasmid pXL2964 corresponds to the ligation of the 2.9 kb Mlul-Xmnl insert of ⁇ XL2838 with the 2.1 kb Xmnl-MluI fragment of ⁇ XL2840.
  • the plasmid pXL2966 corresponds to the ligation of the 2.9 kb MluI-Xmnl insert of pXL2645 with the 2.1 kb Xmnl-Mlul fragment of pXL2840. These plasmids were transformed into the strain of E. coli ME8025 and the thymidine kinase activity on thymidine and ganciclovir is determined as in Example 1-6, the GCV / Thy ratios are shown in Table 4.
  • the improvement obtained by combining these two mutations Gly ⁇ Ser and Met ⁇ OIle can also be obtained by combining with the Met ⁇ OIle mutation another mutation located in the N-terminal part of thymidine kinase, for example the Ala lOThr mutation.
  • H12 (respectively 2-3361: D3) was cloned into the expression vector pET11a to form the plasmid pXL2843 (respectively pXL2841).
  • plasmid pXL2843 (respectively pXL2841).
  • the TK enzymes from cultures E. ⁇ o ⁇ BL21rnet ⁇ lambdaDE3, pXL2843 and E. coli BL21metiambdaDE3, pXL2841 were purified until homogeneous.
  • the kinetic constants for TK of the mutants 2-865: H12 and 2-3361: D3 were determined and compared with those of wild-type TK and the mutant 1537: E4.
  • the set of values is reported in FIG. 3.
  • the curve in FIG. 3 shows the phosphorylation rates as a function of the concentration of GCV for the four enzymes.
  • EXAMPLE 4 OBTAINING, PRIMARY STRUCTURE OF THE MUTANT AND BIOCHEMICAL CHARACTERISTION OF THE MUTANT 3-4216: H2
  • the plasmid pXL2842, derived from the mutant 2-865: H12 carries, under the control of the promoter pTryp, the gene HSVl-TK, the TK protein of which is different from the wild-type protein by the AlalOThr and Met ⁇ OIle mutations.
  • This plasmid is mutagenized with hydroxylamine at 86 ° C. and then introduced by electroporation into the strain E. ⁇ oli tk "ME8025.
  • a total of 3900 electroporants are analyzed for their capacity to phosphorylate ganciclovir and thymidine as described in Example 1-6
  • the results of this screening are summarized in Table 5 where the TK activity is reported at 100% and the GCV / Thy ratio is 1 for the wild-type enzyme.
  • a mutant 3-4216: H2 has a more activating behavior towards ganciclovir.
  • HSV1-TK gene of the mutant 3-4216 H2
  • the HSVl-TK gene expressed from the mutant 3-4216: H2 has been sequenced on both strands and the following mutations have been observed (G28A, G30A.G180A, C591T, C892T, G1010A, and G1011A). These mutations correspond to the substitutions AlalOThr, Met ⁇ ODe and Arg337Gln.
  • the TK enzyme from culture E. irritableH BL21metiambdaDE3, pXL3129 was purified to homogeneity.
  • the kinetic constants for the TK of the mutant 3- 4216: H2 were determined and compared with those of wild-type TK and the mutants 1537: E4, 2-865: H12 and 2-336LD3.
  • the set of values is reported in FIG. 3 and in table 1.
  • the enzyme of the mutant 3-4216: H2 is remarkable by the total lifting of the inhibition by the substrate GCV and by the increase in the rate of phosphorylation. of the GCV.
  • the initial rate of phosphorylation of GCV with this mutant is multiplied by a factor of 7, compared to the wild-type enzyme, and a factor of 2.8 compared to the mutant 2-865: H12.
  • the mutant 3-4216: H2 has a weaker thymidine catalytic activity than the wild-type enzyme and the other mutants 1537: E4, 2-865: H12 and 2-336LD3, as indicated by the values.
  • This example describes the construction of vectors usable for the transfer of the nucleic acid sequences of the invention in vitro or in vivo.
  • the vector pSV2 described in DNA Cloning, A practical approach Vol.2, D.M. Glover (Ed) IRL Press, Oxford, Washington DC, 1985.
  • This vector is a eukaryotic expression vector.
  • the nucleic acids coding for the TK variants were inserted into this vector at the Hpal-EcoRV sites. They are thus placed under the control of the promoter of the enhancer of the SV40 virus.
  • the vector pCDNA3 (Invitrogen). It is also a eukaryotic expression vector.
  • the nucleic acid sequences coding for the TK variants of the invention are thus placed, in this vector, under the With regard to the genes coding for wild-type HSV1-TK and control of the CMV early promoter. All the constructions described in the example were introduced into this vector between the Hind III / Not I sites to be tested in the various in vitro evaluation systems.
  • This vector derived from pBSK (Stratagene) comprises the CMV promoter / enhancer amplified by PCR from the plasmid pGCN (Tanaka et al. 1990 Cell 60 p375).
  • the HSV1-TK gene was amplified by PCR using the plasmid pBTK1 (see example 1.1) by creating the Ncol and Ayril sites at the ATG and TGA codons respectively.
  • This gene was then cloned downstream of the CMV promoter of pXL2990 and upstream of the late polyadenylation sequence of SV40 (amplified by PCR using the plasmid pGL3basic (Promega)) to generate the plasmid ⁇ XL3022.
  • the HSVl-TK gene derived from the 2-865: H12 mutant was amplified by PCR using the plasmid pXL2843 (see example 3.4) and then cloned downstream of the CMV promoter from pXL2990 and upstream of the polyadenylation sequence. late in SV40 to generate plasmid pXL3037, see Figure 4. 5.2 - Construction of viral vectors
  • the invention resides in the construction and the use of viral vectors allowing the transfer and the expression in vivo of nucleic acids as defined above.
  • adenoviruses various serotypes, whose structure and properties vary somewhat, have been characterized.
  • serotypes it is preferred to use, within the framework of the present invention, human adenoviruses of type 2 or 5 (Ad 2 or Ad 5) or adenoviruses of animal origin (see application WO94 / 26914).
  • adenoviruses of animal origin which can be used in the context of the present invention, mention may be made of adenoviruses of canine, bovine, murine origin (example: Mavl, Beard et al., Virology 75 (1990) 81), ovine, porcine , avian or even simian (example: after-sales service).
  • the adenovirus of animal origin is a canine adenovirus, more preferably a CAV2 adenovirus [Manhattan strain or A26 / 61 (ATCC VR-800) for example].
  • adenoviruses of human or canine or mixed origin are used.
  • the defective adenoviruses of the invention comprise ITRs, a sequence allowing the encapsidation and a nucleic acid according to the invention.
  • the El region at least is non-functional.
  • the viral gene considered can be made non-functional by any technique known to those skilled in the art, and in particular by total suppression, substitution, partial deletion, or addition of one or more bases in the gene or genes considered. Such modifications can be obtained in vitro (on isolated DNA) or in situ, for example, by means of genetic engineering techniques, or by treatment with mutagenic agents.
  • the adenovirus according to the invention comprises a deletion in the regions E1 and E4.
  • it comprises a deletion in region El at the level of which are inserted the E4 region and the nucleic acid sequence of the invention (Cf FR94 13355).
  • the deletion in the E1 region preferably extends from nucleotides 455 to 3329 on the sequence of the adenovirus Ad5.
  • the defective recombinant adenoviruses according to the invention can be prepared by any technique known to those skilled in the art (Levrero et al., Gene 101 (1991) 195, EP 185 573; Graham, EMBO J. 3 (1984) 2917). In particular, they can be prepared by homologous recombination between an adenovirus and a plasmid carrying, inter alia, the claimed nucleic acid sequence. Homologous recombination occurs after co-transfection of said adenovirus and plasmid in an appropriate cell line.
  • the cell line used must preferably (i) be transformable by said elements, and (ii), contain the sequences capable of complementing the part of the genome of the defective adenovirus, preferably in integrated form to avoid the risks of recombination.
  • a line mention may be made of the human embryonic kidney line 293 (Graham et al., J. Gen. Virol. 36 (1977) 59) which contains in particular, integrated into its genome, the left part of the genome an Ad5 adenovirus (12%) or lines capable of complementing the E1 and E4 functions as described in particular in applications No. WO 94/26914 and WO95 / 02697.
  • the adenoviruses which have multiplied are recovered and purified according to conventional techniques of molecular biology, as illustrated in the examples.
  • adenoviral constructs according to the invention are obtained in accordance with the following protocol:
  • the shuttle plasmid pACK3 was used, it derives from ColEl and contains i) the gene which confers resistance to kanamycin, ii) the sacB gene from B. subtilis. iii) the ITR-Psi sequences (position 1-386 of the adenovirus Ad5) separated from the sequences containing the gene coding for the protein PIX (position 3447-4415 of the adenovirus Ad5) by the restriction sites EcoRV and Sjll.
  • the eukaryotic expression cassettes of the plasmids pXL3022 and pXL3037 were cloned between the EDSRV and Sajl sites of the shuttle plasmid pACK3 to form the plasmids pXL3050 and 3051 respectively, see FIG. 4.
  • the adenoviral plasmids pXL3075 and 3076 were generated.
  • viruses were digested with Pael and transfected into the human cell line 293 in order to produce the viruses ADV3075 and ADV3076. These viruses are deleted in regions E1 and E3 and which respectively contain the expression cassettes of the HSV1-TK genes of the wild-type enzyme and of the mutant 2-865: H12.
  • AAV adeno-associated viruses
  • the defective recombinant AAVs according to the invention can be prepared by cotransfection, in a cell line infected with a human helper virus (for example an adenovirus), of a plasmid containing a nucleic acid sequence of the invention of interest bordered by two inverted repeat regions (ITR) of AAV, and of a plasmid carrying the encapsidation genes (rep and cap genes) of AAV.
  • a usable cell line is, for example, line 293.
  • the recombinant AAVs produced are then purified by conventional techniques.
  • retroviruses are integrative viruses, selectively infecting dividing cells. They therefore constitute vectors of interest for cancer applications.
  • the genome of retroviruses essentially comprises two LTRs, an encapsidation sequence and three coding regions (gag, pol and env).
  • the gag, pol and env genes are generally deleted, in whole or in part, and replaced by a heterologous nucleic acid sequence of interest.
  • These vectors can be produced from different types of retroviruses such as in particular MoMuLV ("murine moloney leukemia virus”; also designated MoMLV), MSV ("murine moloney sarcoma virus"), HaSV ("harvey sarcoma virus”) ; SNV (“spleen necrosis virus”); RSV ("rous sarcoma virus”) or the Friend virus.
  • a plasmid comprising in particular the LTRs
  • the packaging sequence and said nucleic acid sequence is constructed, then used to transfect a cell line so-called packaging, capable of supplying trans deficient retroviral functions in the plasmid.
  • packaging lines are therefore capable of expressing the gag, pol and env genes.
  • packaging lines have been described in the prior art, and in particular the line PA317 (US4,861,719); the PsiCRIP line (WO90 / 02806) and the GP + envAm-12 line (WO89 / 07150).
  • recombinant retroviruses may include modifications to the LTRs to suppress transcriptional activity, as well as extended packaging sequences, comprising a part of the gag gene (Bender et al., J. Virol. 61 (1987) 1639).
  • the recombinant retroviruses produced are then purified by conventional techniques.
  • a defective recombinant adenovirus or retrovirus indeed have properties which are particularly advantageous for the transfer of suicide genes into tumor cells.
  • cationic polymers of polylysine type (LKLK) n, (LKKL) n, polyethylene imine and DEAE dextran or alternatively cationic lipids or lipofectants. They have the property of condensing DNA and promoting its association with the cell membrane. Among the latter, mention may be made of lipopolyamines (lipofectamine, transfectam, etc.), different cationic or neutral lipids (DOTMA, DOGS, DOPE, etc.) as well as peptides of nuclear origin.
  • lipopolyamines lipofectamine, transfectam, etc.
  • DOTMA cationic or neutral lipids
  • DOGS DOGS
  • DOPE DOPE
  • the concept of targeted transfection has been developed, mediated by a receptor, which takes advantage of the principle of condensing DNA thanks to the cationic polymer while directing the binding of the complex to the membrane thanks to a chemical coupling between the cationic polymer and the ligand of a membrane receptor, present on the surface of the cell type that is to be grafted.
  • the targeting of the transferrin, insulin or hepatocyte asialoglycoprotein receptor has thus been described.
  • the preparation of a composition according to the invention using such a chemical vector is carried out according to any technique known to those skilled in the art, generally by simple contacting of the various components. LIST OF SEQUENCES
  • NAME RHONE POULENC RORER S.A.
  • GAG GAC TGG GGA CAG CTT TCG GGG ACG GCC GTG CCG CCC CAG GGT GCC 816
  • GGC ATG CCT TAT GCC GTG ACC GAC GCC GTT CTG GCT CCT CAT ATC GGG 432 Gly Met Pro Tyr Ala Val Thr Asp Ala Val Leu Ala Pro His Ile Gly 130 135 140

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Abstract

La présente invention se rapporte à une séquence d'acides nucléiques caractérisée en ce qu'elle dérive de la séquence d'acides nucléiques sauvage codant pour une thymidine kinase, ladite séquence d'acides nucléiques possédant au moins une mutation dans la région correspondant au site de liaison à l'ATP et avantageusement une deuxième mutation dans la région N-terminale et/ou la région C-terminale. Elle concerne en outre des variants de la thymidine kinase sauvage et leurs utilisations en thérapie génique.

Description

VARIANTS DE LA THYMIDINE KINASE, SEQUENCES D ' ACIDES NUCLEIQUES CORRESPON¬ DANTES ET LEUR UTILISATION EN THERAPIE GENIQUE
La présente invention concerne des séquences d'acides nucléiques codant pour des enzymes dérivées de l'enzyme thymidine kinase sauvage, TK, et possédant des fonctions améliorées en vue d'une utilisation thérapeutique. Elle concerne plus particulièrement des nouvelles enzymes possédant une spécificité de substrat et/ou une efficacité améliorées par rapport à l'enzyme thymidine kinase de type sauvage. Elle se rapporte également à des vecteurs contenant ces séquences d'acides nucléiques et à leurs utilisations thérapeutiques, notamment en thérapie génique.
La présente invention concerne plus particulièrement le domaine de la thérapie génique qui met en oeuvre des gènes suicides en vue d'induire la mort cellulaire de cellules spécifiques telles que des cellules infectées par un virus comme le virus de type VIH (virus d'immunodéficience humain), CMV (cytomegalovirus) ou VCR (virus respiratoire syncytial). Ce type de traitement thérapeutique, consistant à faire exprimer au sein d'une cellule un gène suicide, est également appliqué pour le traitement des cancers et de certaines maladies cardiovasculaires.
Comme gène suicide, on utilise préférentiellement en thérapie génique des gènes dont le produit d'expression confère à la cellule, une sensibilité à un agent thérapeutique. Plus généralement, il s'agit de gènes codant pour des enzymes non mammifères et non toxiques qui, lorsqu'ils sont exprimés dans des cellules de mammifères, transforment une prodrogue, initialement peu ou pas toxique, en un agent hautement toxique. Un tel mécanisme d'activation de prodrogues est avantageux à plusieurs titres: il permet d'optimiser l'indice thérapeutique en ajustant la concentration en prodrogue ou l'expression de l'enzyme, d'interrompre la toxicité en n'administrant plus la prodrogue et d'évaluer le taux de mortalité.
De nombreux gènes suicides sont décrits dans la littérature comme par exemple les gènes codant pour la cytosine désaminase, la purine nucléoside phosphorylase ou une thymidine kinase comme par exemple les thymidines kinases du virus de la varicelle ou du virus de l'herpès simplex de type 1. Parmi ces gènes, le gène codant pour la thymidine kinase du virus de l'herpès simplex de type 1 est tout particulièrement intéressant sur le plan thérapeutique car, à la différence des autres gènes suicides, il génère une enzyme, la thymidine kinase, capable d'éliminer spécifiquement les cellules en cours de division. Cette enzyme a une spécificité de substrat différente de l'enzyme cellulaire, et on a montré qu'elle était la cible d'analogues de guanosine tels que l'acyclovir ou le ganciclovir (Moolten 1986 Cancer Res. 46 p5276).
Dans le cas particulier du couple HSV1-TK / ganciclovir, le mécanisme d'action peut être schématisé comme suit: les cellules de mammifères, modifiées pour exprimer l'enzyme HSV1-TK, effectuent la première étape de phosphorylation du ganciclovir pour conduire au ganciclovir monophosphate. Cette étape serait limitante. Ultérieurement, des kinases cellulaires permettent la métabolisation de ce ganciclovir monophosphate successivement en diphosphate puis triphosphate. Le ganciclovir triphosphate ainsi généré, produit alors des effets toxiques en s' incorporant à l'ADN et inhibe en partie l'ADN polymerase alpha cellulaire ce qui provoque l'arrêt de la synthèse d'ADN et donc conduit à la mort de la cellule (Moolten 1986 Cancer Res. 46 p5276 ; Mullen 1994 Pharmac. Ther. 6J pl99).
Par ailleurs, un effet de toxicité propagée (effet "by stander") a été observé lors de l'utilisation de la TK. Cet effet se manifeste par la destruction non seulement des cellules ayant incorporé le gène TK mais également les cellules avoisinantes. Le mécanisme de ce processus peut s'expliquer de trois façons : i) la formation de vésicules apoptotiques qui contiennent du ganciclovir phosphorylé ou la thymidine kinase, provenant des cellules mortes, puis la phagocytose de ces vésicules par les cellules voisines; ii) le passage de prodrogue métabolisée par la thymidine kinase, par un processus de coopération métabolique des cellules contenant le gène suicide vers les cellules ne le contenant pas et/ou iii) une réponse immunitaire liée à la régression de la tumeur (Marini et coll. 1995 Gène Therapy 2 p655). Pour l'homme de l'art, l'utilisation du gène suicide codant pour la thymidine kinase du virus de l'herpès est très largement documentée. En particulier, les premières études in vivo sur des rats ayant un gliome montrent des régressions de tumeurs lorsque le gène HSV1-TK est exprimé et que des doses de 150 mg/kg de ganciclovir sont injectées [K. Culver et coll. 1992 Science 25_6_ pi 550]. Toutefois, ces doses sont hautement toxiques chez la souris [T. Osaki et coll. 1994 Cancer Research 54 ρ5258] et donc totalement proscrites en thérapie génique chez l'homme.
Un certain nombre d'essais thérapeutiques sont également en cours chez l'homme, dans lesquels le gène TK est délivré aux cellules au moyen de différents vecteurs tels que notamment des vecteurs rétroviraux ou adénoviraux. Dans les essais cliniques de thérapie génique chez l'homme, ce sont des doses beaucoup plus faibles qui doivent être administrées de l'ordre de 5 mg/kg et pour une durée du traitement courte (14 jours) (E. Oldfield et coll. 1995 Human Gène Therapy 6 p55). Pour des doses plus élevées ou des traitements plus prolongés dans le temps, on observe en effet des effets secondaires indésirables.
Il serait donc particulièrement avantageux de disposer d'un gène suicide apparenté au gène codant pour la thymidine kinase sauvage, capable de générer un variant de l'enzyme TK sauvage plus spécifique et/ou plus actif pour phosphoryler le ganciclovir. Avantageusement, un tel variant peut également être mis en oeuvre à une dose significativement réduite comparativement à la dose en gène suicide sauvage, et en outre permettre de réduire la dose de substrat qui lui est classiquement associée.
La présente invention a précisément pour objet de proposer une séquence d'acides nucléiques codant pour un enzyme de type thymidine kinase ayant un comportement activateur plus performant à l'égard du ganciclovir ou un analogue nucléoside.
La séquence du gène codant pour l'enzyme thymidine kinase du virus de l'herpès simplex de type 1 a été décrite dans la littérature (voir notamment McKnight 1980 Nucl. Acids Res. 8 p5949). Il en existe des variants naturels conduisant à des protéines ayant une activité enzymatique comparable sur la thymidine, ou le ganciclovir (M. Michael et coll. 1995 Biochem. Biophys. Res. Commun 2Q9 p966). De même, ont été décrits des dérivés obtenus par mutagenese dirigée au niveau du site de liaison de l'enzyme avec le substrat. Toutefois, aucune caractérisation biochimique précise sur les enzymes pures n'a été réalisée et aucun test cellulaire utilisant ces mutants n'a été publié (Black et coll., 1993 Biochemistry 22 pll618). En outre, l'expression inductible d'un gène HSVl-TK, délété de ses 45 premiers codons, a été réalisée dans des cellules eucaryotes mais les doses en prodrogue utilisées demeurent comparables à celles décrites dans tous les essais de la littérature (B. Salomon et coll. 1995 Mol. Cell. Biol. 15. p5322). En conséquence, aucun des variants décrits jusqu'ici ne présente une activité améliorée à l'égard ou vis à vis du ganciclovir.
La présente invention décrit la construction de nouveaux variants de thymidine kinase possédant des propriétés enzymatiques améliorées. La présente demande décrit également la construction de séquences d'acides nucléiques codant pour ces variants ainsi que des vecteurs contenant lesdites séquences et permettant leur administration in vivo et la production in vivo des mutants.
De manière inattendue, la Demanderesse a en effet préparé, isolé et caractérisé une série de séquences d'acides nucléiques particulières codant pour des variants de la thymidine kinase possédant le comportement activateur requis c'est à dire significativement améliorée comparativement à celui de la thymidine kinase sauvage. La demanderesse a en particulier mis en évidence que de nouveaux variants de la thymidine kinase ayant des propriétés enzymatiques améliorées pouvaient être obtenus notamment par modification de la région de la protéine responsable de la liaison avec l'ATP.
Ainsi un premier objet de l'invention réside dans une séquence d'acides nucléiques codant pour une thymidine kinase caractérisée en ce qu'elle possède par rapport à la séquence sauvage au moins une mutation dans la région correspondant au site de fixation de l'ATP associée à au moins une mutation dans la région N-terminale et/ou C-terminale.
Plus précisément, la présente invention a pour premier objet une séquence d'acides nucléiques caractérisée en ce qu'elle dérive de la séquence d'acides nucléiques codant pour une thymidine kinase sauvage, ladite séquence d'acides nucléiques possédant au moins une mutation dans la région correspondant au site de fixation de l'ATP et au moins une mutation dans la région N-terminale et/ou C-terminale.
Au sens de la présente invention, le terme mutation, couvre toute substitution, délétion, addition et/ou modification d'un ou plusieurs résidus de la séquence d'acides nucléiques considérée. Il est entendu que la séquence d'acides nucléiques revendiquée peut comprendre d'autres mutations, localisées ou non, dans les régions telles que définies ci -dessus.
Selon un mode préféré de l'invention, la séquence d'acides nucléiques dérive de la séquence codant pour la TK du virus herpès simplex de type I. Préférentiellement, la mutation dans la région correspondant au site de fixation de l'ATP y est représentée par au moins une substitution d'une guanine en position 180 par une adénine (G180A).
En ce qui concerne la mutation présente dans la partie N-terminale de la TK, il peut s'agir d'une substitution de la guanine en position 16 par une adénine (G16A) ou d'une double substitution des guanines en position 28 et 30 par des adénines (G28A et G30A).
Selon un mode préféré de l'invention, les séquences nucléiques revendiquées portent outre une mutation dans la région correspondant au site de fixation de l'ATP au moins une mutation dans la partie C terminale et plus particulièrement localisée entre les positions 990 et 1030. Selon un autre mode de l'invention, cette mutation présente dans la partie C-terminale est en outre associée à une mutation localisée dans la partie N-terminale de la TK telle que définie ci-dessus. A titre représentatif d'une telle séquence on peut citer la séquence d'acides nucléiques comprenant au moins une substitution d'une guanine en position 180 par une adénine (G 180 A), au moins une double substitution des guanine en position 28 et 30 par des adénines (G28A et G30A) une double substitution des cystosines en position 591 et 892 par des thymines (C591T et C 892T) et une double substitution des guanines en position 1010 et 1011 par des adénines (G1010A et G1011A).
La séquence d'acides nucléiques codant pour un variant de la thymidine kinase est avantageusement choisie parmi :
(a) la séquence SEQ ID n° 3 ou une partie de celle ci portant la mutation (G180A) ou un de leur brin complémentaire,
(b) les séquences SEQ ID n° 6 et SEQ ID n° 7 ou une partie de celles-ci portant la mutation (G180A) et respectivement la mutation G16A et la double mutation (G28A ; G30A) ou un de leur brin complémentaire,
(c) la séquence SEQ ID n° 8 ou une partie de celle-ci portant la mutation (G180A) la double mutation (G28A ; G30A), et la quadruple mutation (C591T;
C892T; G1010A; G1011A) ou un de leur brin complémentaire
(d) toute séquence hybridant avec les séquences (a), (b) et/ou (c) codant pour un variant de la thymidine kinase et conforme à la présente invention.
(e) les variants de (a), (b), (c) et(d) résultant de la dégénérescence du code génétique.
La séquence d'acides nucléiques selon l'invention peut être d'origine eucaryote bactérienne, virale, synthétique ou semi-synthétique.
D'une manière générale, les séquences d'acides nucléiques de l'invention peuvent être préparées selon toute technique connue de l'homme du métier. A titre illustratif de ces techniques on peut notamment mentionner: - la synthèse chimique, en utilisant les séquences présentées dans la demande et par exemple un synthétiseur d'acides nucléiques,
- le criblage de banques au moyen de sondes spécifiques, notamment telles que décrites dans la demande, ou encore
- les techniques mixtes incluant la modification chimique (élongation, délétion, substitution, ete) de séquences criblées à partir de banques.
Les séquences d'acides nucléiques selon l'invention peuvent également être obtenues par mutagenese (s), dirigée(s) ou non, d'une séquence d'acides nucléiques, naturelle ou déjà mutée, codant respectivement pour une thymidine kinase sauvage ou un de ses variants. De nombreuses méthodes permettant de réaliser la mutagenese dirigée ou au hasard sont connues de l'homme de l'art et on peut citer la mutagenese dirigée par PCR ou par oligonucleotide, la mutagenese au hasard in vitro par des agents chimiques comme par exemple l'hydroy lamine ou in vivo dans des souches de E. coli mutatrices (Miller "A short course in bacterial genetics", Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, N.Y., 1992).
La présente invention s'étend ainsi à toute séquence d'acides nucléiques codant pour un variant d'une thymidine kinase sauvage et susceptible d'être obtenue à partir d'une séquence d'acides nucléiques telle que revendiquée en mettant en oeuvre l'une des techniques de modifications précédemment citées et plus préférentiellement la mutagenese, dirigée ou non.
Avantageusement, les produits des séquences revendiquées selon la présente invention s'avèrent plus performants que l'enzyme naturelle dont ils dérivent par modification (s) structurale (s). Exprimés dans des cellules cibles, ils présentent une activité enzymatique améliorée par rapport à l'enzyme naturelle vis à vis du ganciclovir ou un analogue de nucleoside. Le comportement dit "plus activateur" ou "l'activité enzymatique améliorée" des variants selon l'invention s'apprécie comparativement à celui de l'enzyme sauvage, selon les protocoles décrits en détails dans les exemples ci-après. Au sens de la présente invention on entend couvrir par analogue nucleoside des composés de type acyclovir, trifluorothymidine, l-[2-deoxy, 2-fluoro, beta-D- arabino furanosyl]-5-iodouracil, ara-A, araT, 1-beta-D-arabinofuranosyl thymidine, 5- éthyl-2'-déoxyuridine, iodouridine, AZT, AIU, didéoxycytidine et AraC. A titre d'analogue préféré dans le cadre de la présente invention, on peut plus particulièrement citer les BVDU, ganciclovir et penciclovir.
La présente invention a également pour objet des variants de thymidine kinase sauvages susceptibles d'être exprimés à partir d'une séquence d'acides nucléiques revendiquée.
Plus particulièrement, l'invention s'étend à tout variant d'une thymidine kinase caractérisé en ce qu'il comprend au moins une mutation au niveau de son site de fixation à l'ATP associée à au moins une mutation dans la région N-terminale et/ou C- terminale.
La localisation de ce site de fixation de l'ATP, au sein de la séquence peptidique de la thymidine kinase varie selon l'origine virale de celle-ci. C'est ainsi que, selon que l'on considère la thymidine kinase du virus de la varicelle, du virus de l'herpès simplex, de type 1 ou non, cette région est positionnée en des régions différentes. Toutefois, de manière générale, elle y figure sous le consensus GXXXXGK(T/S) (SEQ ID N°l) avec X représentant un acide aminé quelconque et dans le cas particulier de la thymidine kinase de l'Herpès simplex virus de type 1, sous la séquence spécifique suivante GPHGMGKT (SEQ ID N°2).
En conséquence, la présente invention vise tout variant d'une thymidine kinase sauvage conforme à l'invention et comprenant au niveau de sa région peptidique suivante GXXXXGK(T/S) au moins une mutation.
Selon un mode préféré de la présente invention, la séquence possédant au moins une mutation est celle représentée par GPHGMGKT (SEQ ID N°2). Dans ce cas particulier, la mutation y est plus préférentiellement représentée par au moins une substitution en position 60 d'une Méthionine par une Isoleucine. A titre représentatif de ce type de mutant, on peut plus particulièrement citer le mutant 1537:E4 décrit dans les exemples ci-après.
En ce qui concerne plus particlulièrement la mutation dans la région N- terminale. Elle est préférentiellement localisée dans les acides aminés numérotés de 1 à 20. Plus préférentiellement ladite mutation est localisée dans les acides aminés numérotés de 1 à 15. Encore plus préférentiellement ladite mutation est localisée dans les acides aminés numérotés de 1 à 10. Selon un mode de réalisation préféré ladite mutation est localisée dans les acides aminés numérotés de 5 à 10.
Selon un mode préféré, la présente invention vise un variant de la thymidine kinase du virus de l'herpès simplex de type I comprenant au moins une mutation représentée par une substitution en position 60 d'une Méthionine par une Isoleucine et par une substitution en position 10 d'une Alanine par une Thréonine.
A titre représentatif de ce type de mutant, on peut plus particulièrement citer le mutant 2-865:H12 décrit dans les exemples ci-après.
Selon un autre mode tout particulièrement préféré de la présente invention, il s'agit d'un variant de la thymidine kinase du virus herpès simplex de type I comprenant au moins une mutation représentée par une substitution en position 60 d'une Méthionine une Isoleucine et une substitution en position 6 d'une Glycine par une Serine.
A titre représentatif de ce type de mutant, on peut plus particulièrement citer le mutant 2-336LD3 décrit dans les exemples ci-après.
En ce qui concerne la mutation en région C-terminale, elle est de préférence localisée dans les acides aminés numérotés de 320 à 350. Plus préférentiellement ladite mutation est localisée dans les acides aminés numérotés de 325 à 345. Encore plus préférentiellement ladite mutation est localisée dans les acides aminés numérotés de 330 à 343. Selon un mode de réalisation préféré, ladite mutation est localisée dans les acides aminés numérotés de 335 à 340. Selon un mode tout particulièrement préféré de la présente invention, il s'agit d'un variant de la thymidine kinase du virus herpès simplex de type I comprenant au moins une substitution en position 60 d'une Méthionine par une Isoleucine, une substitution en position 10 d'une Alanine par une Thréonine et une substitution en position 337 d'une Arginine par une Glutamine.
A titre représentatif de ce type de mutant, on peut plus particulièrement citer le mutant 3-4216:H2 décrit dans les exemples ci-après.
Avantageusement, les variants selon l'invention présentent des performances améliorées au niveau de l'une ou plusieurs des caractéristiques enzymatiques suivantes:
- inhibition par le substrat: une inhibition par le ganciclovir à forte concentration est généralement observée avec l'enzyme sauvage; celle-ci est diminuée voire supprimée avec les variants selon l'invention.
-Vitesse de phosphorylation du ganciclovir ou d'un autre analogue de nucleoside: les variants selon l'invention possèdent avantageusement une plus grande vitesse de phosphorylation du ganciclovir ou d'un autre analogue;
- Vitesse de phosphorylation de la thymidine: celle ci est préférentiellement inchangée ou diminuée avec les variants de l'invention ce qui leur confère une plus grande sélectivité vis à vis du ganciclovir ou de l'analogue de nucleoside. Cette vitesse de phosphorylation de la thymidine sera définie dans ce qui suit à travers sa constante de spécificité Kcat/Km. Il s'agit d'une constante de vitesse apparente de second ordre familière à l'homme de l'art. Elle permet de décrire les propriétés et les réactions de l'enzyme libre et du substrat libre. Pour des substrats en compétition, elle détermine la spécificité de l'enzyme vis à vis de ces substrats. ( A. Fersht, Enzyme Structure and Mechanism 1985, W.H. Freeman, London ).
Préférentiellement, les variants selon l'invention et en particulier le variant 1537:E4, manifestent avantageusement, les propriétés cinétiques suivantes: - une diminution substantielle voir totale d'inhibition de l'activité de phosphorylation du ganciclovir contrairement à l'enzyme sauvage pour laquelle l'inhibition est très nette à partir de 15μM;
- une augmentation au moins d'un facteur de 2 à 2,5 de la vitesse initiale de phosphorylation du GCV à partir de 15-20μM par rapport à l'enzyme sauvage,
- et un rapport Kcat/Km de la thymidine réduite au moins d'un facteur de 1 à 6 par rapport à celui de l'enzyme sauvage et de préférence d'au moins de 2.
Préférentiellement, les variants selon l'invention et plus particulièrement les variants 2-865:H12 et 2-3361 :D3 présentent au moins l'une des performances cinétiques suivantes:
- une diminution significative de l'inhibition de la phosphorylation du ganciclovir ou de l'analogue de nucleoside à des concentrations élevées en ganciclovir ou en analogue de nucleoside,
- une vitesse de phosphorylation du ganciclovir ou de l'analogue de nucleoside au moins triplée et/ou
- un rapport Kcat/Km de la thymidine soit inchangé comme pour le mutant 2- 865 : H12 soit réduit d'un facteur au moins égal à 5 comme pour le mutant 2- 3361 :D3 par rapport à celui de l'enzyme sauvage.
Plus préférentiellement, le variant 3-4216:H2 selon l'invention présente au moins l'une des performances cinétiques suivantes:
- une absence d'inhibition de la phosphorylation du ganciclovir ou de l'analogue de nucleoside à des concentrations élevées en ganciclovir ou en analogue de nucleoside,
- une augmentation d'un facteur supérieur à 3,5 de la vitesse initiale de phosphorylation du GCV à partir de 15-20 μM par rappoπ à l'enzyme sauvage et/ou - un rapport Kcat/Km de la thymidine diminué d'un facteur 4 par rapport à celui de l'enzyme sauvage.
De ces données, il ressort que le variant 3-4216:H2 manifeste un comportement particulièrement avantageux selon l'invention.
De telles qualités sont particulièrement avantageuses sur le plan thérapeutique puisqu'elles permettent d'envisager une réduction significative des doses d'utilisation en enzymes et/ou en analogue de nucleoside pour une efficacité au moins équivalente voire supérieure. L'innocuité est privilégiée sans pour autant porter préjudice à l'efficacité.
Au sens de l'invention, on entend également désigner par variant selon la présente invention toute enzyme obtenue par modification, à l'aide des techniques du génie génétique, de la séquence d'acides nucléiques codant pour une thymidine kinase sauvage et possédant le comportement défini ci-dessus au regard du ganciclovir et/ou un analogue de nucleoside. (Par modification, on doit entendre toute mutation, substitution, délétion, addition ou modification de nature génétique et/ou chimique).
Bien entendu, ces dérivés selon l'invention, capables d'induire via l'activation du ganciclovir ou un de ses analogues, la destruction desdites cellules peuvent avantageusement être exprimés in vivo directement à partir des séquences d'acides nucléiques revendiquées.
A cet effet, la présente invention concerne également toute cassette d'expression comprenant une séquence d'acides nucléiques telle que définie ci-avant, un promoteur permettant son expression et un signal de terminaison de la transcription. Le promoteur est avantageusement choisi parmi les promoteurs fonctionnels dans les cellules mammifères, de préférence humaines. Plus préférentiellement, il s'agit d'un promoteur permettant l'expression d'une séquence d'acides nucléiques dans une cellule hyperproliférative (cancéreuse, resténose, ete). A cet égard, différents promoteurs peuvent être utilisés. Il peut s'agir par exemple du propre promoteur du gène TK de l'herpès simplex de type I. Il peut également s'agir de séquences d'origine différente (responsables de l'expression d'autres gènes, ou même synthétiques). Il peut ainsi s'agir de tout promoteur ou séquence dérivée stimulant ou réprimant la transcription d'un gène de façon spécifique ou non, inductible ou non, forte ou faible. On peut citer notamment les séquences promotrices de gènes eucaryotes ou viraux. Par exemple, il peut s'agir de séquences promotrices issues du génome de la cellule cible. Parmi les promoteurs eucaryotes, on peut utiliser en particulier de promoteurs ubiquitaires (promoteur des gènes HPRT, PGK, alpha- actine, tubuline, DHFR ete), de promoteurs des filaments intermédiaires (promoteur des gènes GFAP, desmine, vimentine, neurofilaments, kératine, ete), de promoteurs de gènes thérapeutiques (par exemple le promoteur des gènes MDR, CFTR, Facteur VTII, ApoAI, ete), de promoteurs spécifiques de tissus (promoteur du gène pyruvate kinase, villine, protéine intestinale de liaison des acides gras, alpha-actine du muscle lisse, ete) , des promoteurs cellules spécifiques de type cellules en division comme les cellules cancéreuses ou encore de promoteurs répondant à un stimulus (récepteur des hormones stéroïdes, récepteur de l'acide rétinoïque, récepteur de glucocorticoïdes, ete) ou dits inductibles. De même, il peut s'agir de séquences promotrices issues du génome d'un virus, tel que par exemple les promoteurs des gènes El A et MLP d'adénovirus, le promoteur précoce du CMV, ou encore le promoteur du LTR du RSV, etc. En outre, ces régions promotrices peuvent être modifiées par addition de séquences d'activation, de régulation, ou permettant une expression tissu-spécifique ou majoritaire.
La présente invention fournit maintenant de nouveaux agents thérapeutiques permettant d'interférer avec de nombreux dysfonctionnements cellulaires. Dans ce but, les acides nucléiques ou cassettes selon l'invention peuvent être injecté (e)s tel (le) s quel(le)s au niveau du site à traiter, ou incubé(e)s directement avec les cellules à détruire ou traiter. Il a en effet été décrit que les séquences d'acides nucléiques nu(e)s pouvaient pénétrer dans les cellules sans vecteur particulier. Néanmoins, on préfère dans le cadre de la présente invention utiliser un vecteur d'administration, permettant d'améliorer (i) l'efficacité de la pénétration cellulaire, (ii) le ciblage (iii) la stabilité extra- et intracellulaires. Dans un mode de mise en oeuvre particulièrement préféré de la présente invention, la séquence d'acides nucléiques ou la cassette est incorporée dans un vecteur. Le vecteur utilisé peut être d'origine chimique, biochimique ou virale.
Par vecteur chimique, on entend couvrir au sens de l'invention, tout agent non viral capable de promouvoir le transfert et l'expression de séquences d'acides nucléiques dans des cellules eucaryotes. Ces vecteurs chimiques ou biochimiques, synthétiques ou naturels, représentent une alternative intéressante aux virus naturels en particulier pour des raisons de commodité, de sécurité et également par l'absence de limite théorique en ce qui concerne la taille de l'ADN à transfecter. Ces vecteurs synthétiques ont deux fonctions principales, compacter l'acide nucléique à transfecter et promouvoir sa fixation cellulaire ainsi que son passage à travers la membrane plasmique et, le cas échéant, les deux membranes nucléaires. Pour pallier à la nature polyanionique des acides nucléiques, les vecteurs non viraux possèdent tous des charges polycationiques. A titre représentatif de ce type de techniques de transfection non virales, actuellement développées pour l'introduction d'une information génétique, on peut ainsi mentionner celles impliquant des complexes d'ADN et de DEAE-dextran (Pagano et al., J.Virol. 1 (1967) 891), d'ADN et de protéines nucléaires (Kaneda et al., Science 243 (1989) 375), d'ADN et de lipides (Felgner et al., PNAS 84 (1987) 7413), l'emploi de liposomes (Fraley et al., J.Biol.Chem. 255 (1980) 10431), etc.
Plus récemment, l'emploi de virus comme vecteurs pour le transfert de gènes est apparu comme une alternative prometteuse à ces techniques physiques de transfection. A cet égard, différents virus ont été testés pour leur capacité à infecter certaines populations cellulaires. En particulier, les retrovirus (RSV, HMS, MMS, ete), le virus HSV, les virus adéno-associés, et les adénovirus.
La séquence d'acides nucléiques ou le vecteur utilisé dans la présente invention peut être formulé(e) en vue d'administrations par voie topique, orale, parentérale, intranasale, intraveineuse, intramusculaire, sous-cutanée, intraoculaire, transdermique, etc. De préférence, la séquence d'acides nucléiques ou le vecteur est utilisé(e) sous une forme injectable. Ils peuvent donc être mélangés à tout véhicule pharmaceutiquement acceptable pour une formulation injectable, notamment pour une injection directe au niveau du site à traiter. Il peut s'agir en particulier de solutions stériles, isotoniques, ou de compositions sèches, notamment lyophilisées, qui, par addition selon le cas d'eau stérilisée ou de sérum physiologique, permettent la constitution de solutés injectables. Une injection directe de la séquence d'acides nucléiques dans la tumeur du patient est intéressante car elle permet de concentrer l'effet thérapeutique au niveau des tissus affectés. Les doses en séquences d'acides nucléiques utilisées peuvent être adaptées en fonction de différents paramètres, et notamment en fonction du vecteur, du mode d'administration utilisé, de la pathologie concernée ou encore de la durée du traitement recherchée.
L'invention concerne également toute composition pharmaceutique comprenant au moins une séquence d'acides nucléiques telle que définie ci-avant.
Elle concerne également toute composition pharmaceutique comprenant au moins un vecteur tel que défini ci- avant.
Elle concerne aussi toute composition pharmaceutique comprenant au moins un variant de la thymidine kinase tel que défini ci-avant.
En raison de leurs propriétés antiprolifératives, les compositions pharmaceutiques selon l'invention sont tout particulièrement adaptées pour le traitement des désordres hyperprolifératifs, tels que notamment les cancers et la resténose. La présente invention fournit ainsi une méthode particulièrement efficace pour la destruction de cellules, notamment de cellules hyperprolifératives. Elle est ainsi applicable à la destruction des cellules tumorales ou des cellules de muscle lisse de la paroi vasculaire (resténose). Elle est tout particulièrement appropriée au traitement des cancers. A titre d'exemple, on peut citer les adénocarcinomes du colon, les cancers de la thyroïde, les carcinomes du poumon, les leucémies myéloïdes, les cancers colorectaux, les cancers du sein, les cancers du poumon, les cancers gastriques, les cancers de l'oesophage, les lymphomes B, les cancers ovariens, les cancers de la vessie, les glioblastomes, les hépatocarcinomes, les cancers des os, de la peau, du pancréas ou encore les cancers du rein et de la prostate, les cancers du larynx, les cancers tête et cou, les cancers ano-génitaux HPV positifs, les cancers du nasopharynx EBV positifs, etc.
Elle peut être utilisée in vitro ou ex vivo. Ex vivo, elle consiste essentiellement à incuber les cellules en présence d'une séquence d'acides nucléiques (ou d'un vecteur, ou cassette ou directement du dérivé). In vivo, elle consiste à administrer à l'organisme une quantité active d'un vecteur (ou d'une cassette) selon l'invention, de préférence directement au niveau du site à traiter (tumeur notamment), préalablement, simultanément et/ou après l'injection de la prodrogue considérée c'est à dire le ganciclovir ou un analogue nucleoside. A cet égard, l'invention a également pour objet une méthode de destruction de cellules hyperprolifératives comprenant la mise en contact desdites cellules ou d'une partie d'entre-elles avec une séquence d'acides nucléiques ou un variant de la thymidine kinase tels que définis ci-avant.
En conséquence, la présente invention propose une enzyme TK mutée de telle sorte que la phosphorylation du ganciclovir ou de l'analogue nucleoside mis en oeuvre, soit très significativement augmentée. Avantageusement, on peut ainsi, selon l'invention, utiliser dans des tests cellulaires et cliniques un séquence d'acides nucléiques TK mutée à des doses de prodrogue i) significativement plus faibles ; ii) ou susceptibles de provoquer un effet "by-stander" plus prononcé ; iii) ou bien ne conduisant pas à une toxicité cellulaire qui pourrait se produire lorsque la thymidine kinase sauvage est surexprimée.
La présente invention sera plus complètement décrite à l'aide des exemples et figures qui suivent, qui doivent être considérés comme illustratif s et non limitatifs.
Légende des figures: Figure 1 : Plasmide d'expression pXL2645
Figure 2 : Vitesses initiales de phosphorylation (activité spécifique en nmol/min/mg) en fonction de la concentration en thymidine (μM) pour les enzymes HSV1-TK sauvage et mutantes 1537:E4, 2-865:H12, 2-336LD3 et 3-4216:H2. Figure 3. La courbe représente les vitesses de phosphorylation (activité spécifique en nmol/min/mg) en fonction de la concentration en ganciclovir en μM pour les enzymes HSVl-TK sauvage et mutantes (1537:E4, 2-865:H12, 2-336LD3 et 3-4216:H2).
Figure 4 : Représentation schématique des plasmides pcDNA3-TK, pXL 3022 et pXL3037. Le tableau 1 ci-après résume les constantes cinétiques de ces enzymes vis-à-vis du ganciclovir et de la thymidine.
Figure imgf000020_0001
TABLEAU 1
OO
KO
Le GCV ne présentant pas des constantes cinétiques classiques michaéliennes (sauf avec le mutant 3-4216:H2) les valeurs sont exprimées à l'aide de S0.5 (i.e. concentration en substrat conduisant à la moitié de la vitesse maximale observée) MATERIELS ET METHODES
Abréviations
ACV : acyclovir
GCV : ganciclovir
HSVl-TK : thymidine kinase du virus de l'herpès simplex de type 1.
Techniques générales de biologie moléculaire
Les méthodes classiquement utilisées en biologie moléculaire telles que les extractions préparatives d'ADN plasmidique, la centrifugation d'ADN plasmidique en gradient de chlorure de césium, l'électrophorèse sur gels d'agarose ou d'acrylamide, la purification de fragments d'ADN par électroélution, les extraction de protéines au phénol-chloroforme, la précipitation d'ADN en milieu salin par de l'éthanol ou de l'isopropanol, la transformation dans Escherichia coli sont bien connues de l'homme de métier et sont abondamment décrites dans la littérature (Sambrook et coll. "Molecular Cloning, a Laboratory Manual", Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, N.Y., 1989; Ausubel et coll. "Current Protocols in Molecular Biology", John Wiley & Sons, New York, 1987).
Les plasmides de type pUC et les phages de la série Ml 3 sont d'origine commerciale (Bethesda Research Laboratories), les plasmides pBSK ou pBKS proviennent de Stratagen.
L'amplification enzymatique de fragments d'ADN par la technique dite de PCR [Polymerase-catalyzed Chain Reaction] peut être effectuée en utilisant un "DNA thermal cycler" (Perkin Elmer Cetus) selon les recommandations du fabricant. L'electroporation d'ADN plasmidique dans des cellules de E. coli peut-être réalisée à l'aide d'un électroporateur (Bio-Rad) selon les recommandations du fournisseur.
La vérification des séquences nucléotidiques peut être effectuée par la méthode développée par Sanger et al. [Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 74 (1977) 5463-5467] en utilisant le kit distribué par Amersham ou celui distribué par Applied Biosystems.
EXEMPLE 1 : CRIBLAGE BIOCHIMIQUE DE MUTANTS HSVl-TK.
1-1 Plasmide d'expression procarvote du gène HSVl-TK.
Plusieurs systèmes d'expression du gène HSVl-TK chez E. çoli sont décrits dans la littérature (Colbère et coll. 1979 Proc. Natl. Acad. Sci. USA 76 ρ3755 ; Kit et coll. 1981 Gène 16 p287 ; Waldman et coll. 1983 J. Biol. Chem. 25_g pll571 ; Fetzer et coll. 1992 Pharm. Pharmacol. Lett. 2 pi 12 ; Brown et coll. 1995 Nature Structural Biology 2 p876) . Celui qui est décrit çi-dessous permet une production très régulée et élevée de la protéine HSVl-TK sous sa forme native (non fusionnée, non tronquée).
Le plasmide d'expression procary ote pXL2638 a été construit à partir du plasmide pHSV-106 (Gibco-BRL) et du vecteur d'expression pETl la (provenant de Novagen) de la façon suivante. Après avoir rendu les extrémités franches, l'insert BglII-Ncol de 1,5 kb provenant de ρHSV-106 et contenant le gène HSVl-TK, dont la séquence est publiée par McKnight 1980 Nucl. Acids Res. 8. p5949, a été clone au site Smal du pBSK pour former le plasmide pBTKl. Un site Ndel a été introduit par mutagenese dirigée à partir de la position -3 de la séquence codante du gène HSVl- TK. Pour cela un fragment de 500 bp contenant la partie 5' du gène a été amplifié par PCR en utilisant pBTKl comme matrice et les oligonucléotides sens 5'(TTA TGA ATT CAT ATG GCT TCG TAC CCC GGC) 3' SEQ ID N°4 et antisens 5'(TTA TTT CTA GAG GTC GAA G AT GAG GGT)3' SEQ ID N°5 comme amorces ; ce fragment a été clone dans M13mpl9 puis séquence. Ce fragment digéré par EcoRI et SstI génère un insert de 460 pb qui a été co-cloné avec l'insert Sstl-Xbal de 1 kb du pBTKl contenant la partie 3' du gène HSVl-TK dans le plasmide pUC19 digéré par EcoRI et Xbal ; ce plasmide pUCTK contient le gène HSVl-TK sous forme de cassette Ndel-BamHI qui a été clonée entre les sites Ndel et BamHl du pETlla pour créer le plasmide pXL2638. Ce plasmide permet d'exprimer le gène HSVl-TK sous le contrôle du promoteur du gène 10 du bactériophage T7 ; ce promoteur étant induit lorsque l'ARN polymerase du bactériophage T7 est synthétisée comme par exemple dans la souche de E. goJi BL21, lambdaDE3 (Studier et coll. 1990 Methods Enzymol. 185 p89).
1-2 Préparation des extraits acellulaires.
Les extraits acellulaires de souche de E. çoti surproduisant la protéine HSV1- TK peuvent être préparés de diverses façons, parmi lesquelles on peut citer, la lyse au lysozyme en présence d'EDTA, l'utilisation d'appareils de broyage de type Menton- Golin, French Press, X-Press, ou l'action des ultrasons. Plus particulièrement, les extraits acellulaires de la souche de E. çoli BL21, lambdaDE3 (Novagen Inc) pXL2638 ont été préparés de la façon suivante:
La souche E. ooji BL21, lambdaDE3 pXL2638 est cultivée en milieu LB
(Luria-Bertani) + ampicilline (50 mg/1) à 37 °C jusqu'à une absorbance à 600 nm de 0,7 ; la production de la protéine HSVl-TK est induite par l'ajout de 1 mM IPTG (isopropylthio-beta-D-galactoside) et s'effectue en poursuivant la croissance des cellules pendant 3 heures à 30 °C. Après centrifugation (5000 x g; 20 min), les cellules obtenues à partir de 1 1 de culture sont resuspendues dans 10 ml de tampon Tris/HCl 50 mM pH 7.8, contenant 5 mM DTT, 4 mM MgC12, et 10 % glycérol (v/v), et soniquées durant 4 min à 4°C. Après centrifugation (50 000 x g; 1 h), le surnageant est injecté sur une colonne de Source 15Q (50 ml de gel; Pharmacia) équilibrée dans le tampon çi-dessus. Les protéines sont éluées avec un gradient linéaire de 0 à 400 mM NaCl dans le tampon A. Les fractions contenant l'activité TK sont regroupées, amenées à une concentration finale de 1,1 M de sulfate d'ammonium et chromatographiées sur une colonne de Phenyl-Superose HR 10/10 (Pharmacia) éluée avec un gradient linéaire décroissant de 1,1 à 0 M de sulfate d'ammonium. Les fractions contenant l'activité TK sont regroupées. Après cette étape, la préparation présente une seule bande visible en SDS-PAGE, après révélation au Bleu de Coomassie, et cette bande migre avec un poids moléculaire apparent de 41 000 environ.
1-3 Dosage de l'activité TK.
On peut détecter l'activité ATP-dépendante de phosphorylation de nucléosides en procédant par exemple de la façon suivante:
un extrait enzymatique contenant environ 0.1 unité de TK est incubé durant 15 min à 37°C dans 100 μl de tampon Tris/HCl 50 mM pH 7.8 contenant 1 mg/ml BSA (albumine bovine sérique), 5 mM ATP, 4 mM MgC12, 12 mM KC1, 2 mM DTT, 600 μM EDTA et 100 μM [8-3H]-GCV (40 nCi/nmol) La réaction est arrêtée par l'ajout de 10 μl de tampon Tris/HCl 50 mM pH 7.8 contenant ImM thymidine non radioactive. Les espèces phosphorylées sont fixées sur une colonne de DEAE- Sephadex (400 μl de gel), puis, après lavage de la colonne, ces espèces sont éluées par 2 ml de 1 M HC1. La radioactivité dans l'échantillon est ensuite comptée par scintillation liquide.
Le dosage de l'activité TK en utilisant la thymidine comme substrat est effectué de la même façon en mettant en jeu 0,002 unité de TK et 1 μM (méthyl- 14C) thymidine (56nCi/nmole).
L'unité d'activité TK est définie comme la quantité d'enzyme nécessaire pour phosphoryler 1 nmol de substrat par min dans les conditions ci-dessus.
Pour le calcul des constantes cinétiques, la quantité de TK introduite dans la réaction enzymatique est ajustée de façon à transformer au maximum 5 % du substrat introduit au départ, et l'activité spécifique de ce substrat est augmentée en conséquence. Les courbes de Michaelis sont ajustées aux points expérimentaux à l'aide du logiciel Enzfitter (Sigma).
Puisque le GCV ne présente pas des constantes cinétiques classiques michaéliennes (sauf avec le mutant 3-4216:H2) les valeurs sont exprimées à l'aide de S0.5 (i.e. concentration en substrat conduisant à la moitié de la vitesse maximale observée) 1-4 Plasmide pXL2645 permettant un criblage biochimique.
Les systèmes d'expression hetérologue chez E. sou sont nombreux et bien connus de l'homme du métier. L'expression du gène HSVl-TK s'est avérée être la meilleure pour le criblage biochimique lorsque le gène est exprimé à l'aide du promoteur tryptophane pTryp à un nombre de copies élevé sur le plasmide pXL2645. L'insert Ndel-Xbal de 1,4 kb du pUCTK est co-cloné avec les inserts Ndel-EcoRl de 120 bp et EcoRI-Xbal de 3,1 kb du pXL694 (Jung et coll. 1988 Ann. Inst. Pasteur/M icrobiol. 129 pl29) pour générer le plasmide ρXL2619. Les inserts suivant du pXL2619 : EcoRI-Xbal de 1,5 kb (contenant le gène HSVl-TK et pTryp : la région promoteur/opérateur de l'opéron tryptophane de E. çoH suivie du RBS (site de fixation des ribosomes) du gène cil de lambda) et Xbal-BamHI de 530 bp contenant la région terminateur TmiB de l'opéron ribosomal de E. çoH sont co-clonés dans le vecteur pBSK+ pour créer le plasmide pXL2645.
1-5 Mutagenese du plasmide.
De nombreuses méthodes permettant de réaliser la mutagenese dirigée ou au hasard sur plasmide sont connues de l'homme de l'art et on peut citer la mutagenese dirigée par PCR ou par oligonucleotide en suivant les recommandations du fournisseur Amersham, la mutagenese au hasard in vitro par des agents chimiques ou in vivo dans des souches de E. coli imitatrices (Miller "A short course in bacterial genetics", Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, N.Y., 1992). Le plasmide pXL2645 a été mutagénéisé à l'hydroxylamine selon un protocole déjà décrit et qui conduit à des transitions GC en AT au hasard sur le plasmide (Humphreys et coll. 1976 Mol. Gen. Genêt. 145 plOl). Cinq μg d'ADN plasmidique, dissous dans un tampon phosphate 0,2 M pH6 et contenant 0,4 M d' hydroxy lamine, sont incubés à 80°C ou 86 °C pendant 30 min puis refroidis à température amb'ante pendant 20 min, la solution est ensuite dialysée puis précipitée. L'ADN est alors redissous dans 50 μl d'eau. Si l'ADN plasmidique est pCHUO (provenant de Pharmacia) et portant le gène lacZ) des mutants lacZ' sont obtenus à une fréquence de 2,4% (resp. 7,6%) lorsque le plasmide est chauffé à 80°C (resp. 86°C) en présence d' hydroxy lamine. 1-6 Criblage de mutants présentant une TK modifiée.
Le plasmide pXL2645 mutagénéisé à rhydroxylamine à 80 °C est introduit par électroporation dans la souche de E. coϋ tic ME8025 (provenant du National Institute of Genetics, Mishima, Shizuoka, Ken, Japon). Les électroporants sont ensemmencés individuellement dans les puits de plaque de microtitration contenant 100 μl de milieu minimum M9 supplémenté avec 0,4 % de casaminoacides et 50 mg/1 d'ampidlline. Les cultures sont incubées à 37 °C sous agitation pendant 17 heures. Quinze μl de la culture diluée au l/25ième dans le tampon Tris/HCl 50 mM pH 7.8 sont incubés pendant 20 min à 37°C dans un volume de 250 μl de tampon Tris/HCl 50 mM pH 7.8 contenant 2 mgΛnl lysozyme de blanc d'oeuf, 5 mM ATP, 4 mM MgC12, 12 mM KCl, 2 mM DTT, 600 μM EDTA, 16 μM [8-3H]-GCV (60 nCi/nmol) et 1 μM [méthyl - 14C] -thymidine (56 nCi/nmol). La réaction est arrêtée par l'ajout de 25 μl de tampon Tris/HCl 50 mM pH 7.8 contenant ImM thymidine non radioactive. Les espèces phosphorylées sont fixées sur une colonne de DEAE-Sephadex (400 μl de gel) , puis, après lavage de la colonne, ces espèces sont éluées par 2 ml de 1 M HCl. La radioactivité (3H et 14C) dans l'échantillon est ensuite comptée par scintillation liquide en utilisant un programme de double marquage, et le ratio 3H/14C est calculé pour chaque échantillon.
Pour chaque plaque de microtitration de 96 puits, sont calculés la moyenne des ratios 3H/14C de l'ensemble des clones (M) et l'écart-type (σ) de la distribution des ratios 3H/14C. De plus la quantité de protéines présente dans chacun des puits de la plaque 96 puits est mesurée à l'aide du réactif de Bradford (Coomassie Plus Protein Assay Reagent, Pierce) à partir d'une fraction aliquote de la dilution au l/25ième préparée çi-dessus. Tout clone présentant une teneur en protéines inférieure au quart de la moyenne des clones de la boite est éliminé définitivement.
Le ratio 3H/14C obtenu pour chaque clone d'une boite 96 puits est comparé à la moyenne M. Les clones présentant un ratio supérieur à la somme M+3σ tout en présentant une activité de phosphorylation de la thymidine supérieure à M'/2, M' étant la moyenne des activités de phosphorylation de la thymidine, sont retenus pour confirmation et étude.
Le tableau 2 résume les résultats obtenus après criblage de 4129 clones provenant de la mutagenese à rhydroxylamine du pXL2645 à 80°C. Dans ce criblage, pour l'enzyme sauvage, l'activité TK est rapportée à 100% et le rapport GCV/Thy est de l.
A l'issue de cette étude, il est mis en évidence un mutant dit 1537:E4 manifestant un comportement plus activateur vis à vis du ganciclovir.
Figure imgf000027_0001
TABLEAU 2
EXEMPLE 2 STRUCTURE PRIMAIRE ET CARACTERISATION
BIOCHIMIQUE DU MUTANT 1537:E4.
2-1 Séquence du gène HSVl-TK du mutant 1537:E4.
Le gène HSV-TK exprimé à partir du mutant 1537:E4 a été séquence sur les deux brins et une seule mutation G 180 A a été observée. Cette mutation correspond à une substitution MetόOIle. Il est à noter que ce résidu est situé dans la région consensus du site de fixation de l'ATP. Un travail comparable a été réalisé avec le mutant 1921 :H12 et la même substitution (Met60Ile) a été observée.
2-2 Clonage du gène HSVl-TK du mutant 1537:E4 dans un vecteur procarvote d'expression élevée.
L'insert Ndel-BamHI de 1,4 kb codant pour le gène HSVl-TK du mutant 1537:E4 a été clone dans le vecteur d'expression pETlla pour générer le ρET:E4. C'est à partir de ce plasmide pET:E4 que l'enzyme HSVl-TK du mutant 1537:E4 a été produite chez E. coli BL21, lambdaDE3 dans les conditions décrites en 1-2.
2-3 Données biochimiques.
Les constantes cinétiques pour la TK mutante 1537:E4 et la TK sauvage prise en référence sont obtenues dans les conditions de dosage enzymatiques décrites au paragraphe 1-3.
Les 2 TK (sauvage et mutant 1537:E4) ne présentent pas un comportement Michaélien avec le Ganciclovir et l'Acyclovir (inhibition à forte concentration). Ceci interdit donc le calcul d'une valeur de Km avec ces 2 substrats. Seule peut être donnée la concentration S0.5 correspondant à concentration en substrat donnant une vitesse initiale égale à la moitié de la vitesse maximale observée. Vmax et Vmax obs y sont exprimées en nmole/min/mg de protéine.
La courbe de la figure 2 montre les vitesses initiales de phosphorylation en fonction de la concentration de GCV pour les deux enzymes 1537:E4 et sauvage. Elle fait apparaitre en particulier l'absence presque totale d'inhibition de l'activité de phosphorylation du GCV par la TK mutante 1537:E4, contrairement à l'enzyme sauvage pour laquelle l'inhibition est très nette à partir de 15 μM. Cette courbe montre de plus une augmentation d'un facteur 2 à 2,5 de la vitesse initiale de phosphorylation du GCV à partir de 15-20 μM avec l'enzyme mutante 1537:E4 par rapport à l'enzyme sauvage. L'enzyme mutante 1537:E4 y présente un rapport Kcat/Km de la thymidine réduit d'un facteur 2 par rapport à l'enzyme sauvage. EXEMPLE OBTENTION, STRUCTURE PRIMAIRE ET
CARACTERISATION BIOCHIMQUE DES MUTANTS 2-865:H12 ET 2- 3361:D3.
3.1 Obtention des mutants 2-865:H12 ET 2-3361 :D3.
Le plasmide pXL2838, issu du mutant 1537:E4 porte, sous le contrôle du promoteur pTryp, le gène HSVl-TK dont la protéine TK est différente de la protéine sauvage par la mutation M60I. Ce plasmide est mutagénéisé à rhydroxylamine à 86°C puis introduit par électroporation dans la souche E. cou tk" ME8025. Un total de 4992 électroporants sont analysés pour leur capacité à phosphoryler le ganciclovir et la thymidine comme cela est décrit dans l'exemple 1-6. Les résultats de ce criblage sont résumés dans le tableau 3 où l'activité TK est rapportée à 100% et le rapport GCV/Thy est de 1 pour l'enzyme sauvage. Deux mutants 2-865:H12 et 2-3361 :D3 présentent un comportement plus activateur vis à vis du ganciclovir.
Figure imgf000029_0001
TABLEAU 3
3-2 Séquence du gène HSVl-TK des mutants 2-865:H12 et 2-3361 :D3.
Le gène HSVl-TK exprimé à partir des mutants 2-865:H12 et 2-3361 :D3 a été séquence sur les deux brins et les mutations suivantes ont été observées. Avec le mutant 2-865:H12, les mutations sont G28A, G30A et G180A ce qui correspond aux substitutions AlalOThr et MetόOIle. Alors qu'avec le mutant 2-3361:D3 les mutations sont G16A, G180A, C306T et C308T ce qui correspond aux substitutions GlyόSer, MetόOIle et Thrl03Ile.
3-3 Importance de la mutation localisée dans la N-terminale de la TK.
Les enzymes des mutants 2-865.H12 et 2-3361 :D3 portent toutes deux une mutation dans la partie N-terminale de la thymidine kinase position 10 ou 6. Puisque l'enzyme correspondant au mutant 2-3361 :D3 comporte aussi une mutation en position 103, des plasmides comportant les mutations en position 6 et 60 (pXL2964) ou en position 60 et 103 (pXL2963) ou en position 103 (pXL2965) ou en position 6 seulement (pXL2966) ont été construits de la façon suivante. L'insert SnaBI-B§pEI de 400 bp du plasmide pXL2840 (plasmide extrait du mutant 2-3361 :D3) a été clone soit dans le plasmide pXL2645 digéré par SnaBI-BspEI pour générer pXL2965, ou soit dans le plasmide pXL2838 digéré par S_naBI-B§ρEI pour générer pXL2963. Le plasmide pXL2964 correspond à la ligature de l'insert Mlul-Xmnl de 2,9 kb du ρXL2838 avec le fragment Xmnl- MluI de 2,1 kb du ρXL2840. Le plasmide pXL2966 correspond à la ligature de l'insert MluI- Xmnl de 2,9 kb du pXL2645 avec le fragment Xmnl-Mlul de 2,1 kb du pXL2840. Ces plasmides ont été transformés dans la souche de E. coli ME8025 et l'activité thymidine kinase sur la thymidine et le ganciclovir est déterminée comme dans l'exemple 1-6, les rapports GCV/Thy figurent dans le tableau 4.
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TABLEAU 4 Seul le rapport GCV/Thy obtenu avec le plasmide pXL2964 est comparable à celui obtenu avec le plasmide pXL2840. Et l'ensemble des résultats montrent que ce n'est pas la mutation en position 103 mais la mutation en position 6 qui conduit à une amélioration de l'activité TK sur le GCV du mutant 2-3361 :D3 par rapport au mutant 1537:E4. D'autre part la mutation en position 6 seule conduit à une amélioration de l'activité TK. L'effet de cette mutation est donc additif à l'effet de la mutation en position 60 pour améliorer l'activité TK sur le GCV. De plus l'amélioration obtenue en combinant ces deux mutations GlyόSer et MetόOIle peut aussi être obtenue en combinant avec la mutation MetόOIle une autre mutation située dans la partie N- terminale de la thymidine kinase par exemple la mutation Ala lOThr.
3-4 Clonage du gène HSVl-TK des mutants 2-865:H12 et 2-3361:D3 dans un vecteur procaryote d'expression élevée.
L'insert Ndel-BamHI codant pour le gène HSVl-TK provenant du mutant 2-
865:H12 (respectivement 2-3361:D3) a été clone dans le vecteur d'expression pETlla pour former le plasmide pXL2843 (respectivement pXL2841). Ces plasmides ont été transformés dans E. ooji BL21 met" lambdaDE3 afin de produire les enzymes de ces deux mutants.
3-5 Données biochimiques.
Les enzymes TK issues des cultures E. ςoϋ BL21rnet~lambdaDE3, pXL2843 et E. coli BL21metiambdaDE3, pXL2841 ont été purifiées jusqu'à homogénéité. Les constantes cinétiques pour la TK des mutants 2-865:H12 et 2-3361 :D3 ont été déterminées et comparées à celles de la TK sauvage et du mutant 1537:E4. L'ensemble des valeurs est rapporté sur la figure 3. La courbe de la figure 3 montre les vitesses de phosphorylation en fonction de la concentration en GCV pour les quatre enzymes. Elle fait apparaître une levée partielle de l'inhibition par le GCV des TK mutantes 1537:E4 2-865:H12 et 2-3361 :D3 contrairement à l'enzyme sauvage pour laquelle l'inhibition est nette au delà de 30 μM. Cette courbe montre aussi une augmentation de la vitesse de phosphorylation du GCV d'un facteur 1,6 à 2,5 à 16 μM de GCV et de 4,3 à 4,9 à 100 μM de GCV par rapport à l'enzyme sauvage. Le tableau 1 de la figure 3 montre que l'enzyme du mutant 2-865:H12 possède un rapport Kcat/Km de la thymidine inchangé par rapport à celui de l'enzyme sauvage, et que celle du mutant 2-3361 :D3 manifeste un rapport Kcat/Km réduit d'un facteur supérieur ou égal à 5 par rapport à celui de l'enzyme sauvage.
EXEMPLE 4 : OBTENTION, STRUCTURE PRIMAIRE DU MUTANT ET CARACTERISTION BIOCHIMIQUE DU MUTANT 3-4216:H2
4.1 Obtention du mutant 3-4216;H2.
Le plasmide pXL2842, issu du mutant 2-865:H12 porte, sous le contrôle du promoteur pTryp, le gène HSVl-TK dont la protéine TK est différente de la protéine sauvage par les mutations AlalOThr et MetόOIle. Ce plasmide est mutagénéisé à l'hydroxylamine à 86°C puis introduit par électroporation dans la souche E. ςoli tk" ME8025. Un total de 3900 électroporants sont analysés pour leur capacité à phosphoryler le ganciclovir et la thymidine comme cela est décrit dans l'exemple 1-6. Les résultats de ce criblage sont résumés dans le tableau 5 où l'activité TK est rapportée à 100% et le rapport GCV/Thy est de 1 pour l'enzyme sauvage. Un mutant 3-4216:H2 présente un comportement plus activateur vis à vis du ganciclovir.
Figure imgf000032_0001
TABLEAU 5
4.2 Séquence du gène HSVl-TK du mutant 3-4216:H2. Le gène HSVl-TK exprimé à partir du mutant 3-4216:H2 a été séquence sur les deux brins et les mutations suivantes ont été observées (G28A, G30A.G180A, C591T, C892T, G1010A, et G1011A). Ces mutations correspondent aux substitutions AlalOThr, MetόODe et Arg337Gln.
4-3 Clonage du gène HSVl-TK du mutant 3-4216:H2 dans un vecteur procarvote d'expression élevée.
L'insert Ndel-BamHI codant pour le gène HSVl-TK provenant du mutant 3-4216:H2 a été clone dans le vecteur d'expression pETlla pour former le plasmide pXL3129. Ce plasmide a été transformé dans E. çoH BL21rnet"lambdaDE3 afin de produire l'enzyme de ce mutant.
4-4 Données biochimiques.
L' enzyme TK issue de la culture E. çoH BL21metiambdaDE3, pXL3129 a été purifiée jusqu'à homogénéité. Les constantes cinétiques pour la TK du mutant 3- 4216:H2 ont été déterminées et comparées à celles de la TK sauvage et des mutants 1537:E4, 2-865:H12 et 2-336LD3. L'ensemble des valeurs est rapporté sur la figure 3 et le tableau 1. L'enzyme du mutant 3-4216:H2 est remarquable par la levée totale de l'inhibition par le substrat GCV et par l'augmentation de la vitesse de phosphorylation du GCV. La vitesse initiale de phosphorylation du GCV avec ce mutant est multipliée par un facteur 7, par rapport à l'enzyme sauvage, et un facteur 2,8 par rapport au mutant 2-865:H12. De plus, le mutant 3-4216:H2 possède une activité catalytique de phosphorylation de la thymidine plus faible que l'enzyme sauvage et les autres mutants 1537:E4, 2-865:H12 et 2-336LD3, comme l'indiquent les valeurs Kcat/Km sur le tableau 1.
EXEMPLE 5 - CONSTRUCTION DE VECTEURS D'EXPRESSION DES VARIANTS DE TK
Cet exemple décrit la construction de vecteurs utilisables pour le transfert des séquences d'acides nucléiques de l'invention in vitro ou in vivo.
5.1 - Construction de vecteurs plasmidiques Pour ce faire on peut mettre en oeuvre des vecteurs commerciaux tels que les vecteurs pZeoSV, ρSV2 ρcDNA3...
- Le vecteur pSV2, décrit dans DNA Cloning, A practical approach Vol.2, D.M. Glover (Ed) IRL Press, Oxford, Washington DC, 1985. Ce vecteur est un vecteur d'expression eucaryote. Les acides nucléiques codant pour les variants TK ont été insérés dans ce vecteur aux sites Hpal-EcoRV. Ils sont ainsi placés sous le contrôle du promoteur de l'enhancer du virus SV40.
- Le vecteur pCDNA3 (Invitrogen). Il s'agit également d'un vecteur d'expression eucaryote. Les séquences d'acides nucléiques codant pour les variants TK de l'invention sont ainsi placées, dans ce vecteur, sous le En ce qui concerne les gènes codant pour la HSVl-TK sauvage et contrôle du promoteur précoce du CMV. Toutes les constructions décrites dans l'exemple ont été introduites dans ce vecteur entre les sites Hind III / Not I pour être testées dans les différents systèmes d'évaluation in vitro.
En ce qui concerne le gène codant pour la HSVl-TK sauvage et celle du mutant 2-865:H12, des constructions qui ont été réalisées avec le plasmide pXL2990. Ce vecteur, dérivé de pBSK (Stratagene) comporte le promoteur/enhanceur du CMV amplifié par PCR à partir du plasmide pGCN (Tanaka et coll. 1990 Cell 60 p375). Le gène HSVl-TK a été amplifié par PCR à l'aide du plasmide pBTKl (voir exemple 1.1) en créant les sites Ncol et Ayril aux codons ATG et TGA respectivement. Ce gène a alors été clone en aval du promoteur CMV du pXL2990 et en amont de la séquence de polyadenylation tardive de SV40 (amplifiée par PCR à l'aide du plasmide pGL3basic (Promega)) pour générer le plasmide ρXL3022. De façon comparable le gène HSVl-TK issu du mutant 2-865:H12 a été amplifié par PCR à l'aide du plasmide pXL2843 (voir exemple 3.4) puis clone en aval du promoteur CMV du pXL2990 et en amont de la séquence de polyadenylation tardive de SV40 pour générer le plasmide pXL3037, voir Figure 4. 5.2 - Construction de vecteurs viraux
Selon un mode particulier, l'invention réside dans la construction et l'utilisation de vecteurs viraux permettant le transfert et l'expression in vivo des acides nucléiques tels que définis ci-avant
S'agissant plus particulièrement d'adénovirus, différents sérotypes, dont la structure et les propriétés varient quelque peu, ont été caractérisés. Parmi ces sérotypes, on préfère utiliser dans le cadre de la présente invention les adénovirus humains de type 2 ou 5 (Ad 2 ou Ad 5) ou les adénovirus d'origine animale (voir demande WO94/26914). Parmi les adénovirus d'origine animale utilisables dans le cadre de la présente invention on peut citer les adénovirus d'origine canine, bovine, murine, (exemple : Mavl, Beard et al., Virology 75 (1990) 81), ovine, porcine, aviaire ou encore simienne (exemple : SAV). De préférence, l'adénovirus d'origine animale est un adénovirus canin, plus préférentiellement un adénovirus CAV2 [souche manhattan ou A26/61 (ATCC VR-800) par exemple]. De préférence, on utilise dans le cadre de l'invention des adénovirus d'origine humaine ou canine ou mixte.
Préférentiellement, les adénovirus défectifs de l'invention comprenent les ITR, une séquence permettant l'encapsidation et un acide nucléique selon l'invention. Encore plus préférentiellement, dans le génome des adénovirus de l'invention, la région El au moins est non fonctionnelle. Le gène viral considéré peut être rendu non fonctionnel par toute technique connue de l'homme du métier, et notamment par suppression totale, substitution, délétion partielle, ou addition d'une ou plusieurs bases dans le ou les gènes considérés. De telles modifications peuvent être obtenues in vitro (sur de l'ADN isolé) ou in situ, par exemple, au moyens des techniques du génie génétique, ou encore par traitement au moyen d'agents mutagènes. D'autres régions peuvent également être modifiées, et notamment la région E3 (WO95/02697), E2 (WO94/28938), E4 (WO94/28152, WO94/12649, WO95/02697) et L5 (WO95/02697). Selon un mode préféré de mise en oeuvre, l'adénovirus selon l'invention comprend une délétion dans les régions El et E4. Selon un autre mode de réalisation préféré, il comprend une délétion dans région El au niveau de laquelle sont insérés la région E4 et la séquence d'acides nucléiques de l'invention (Cf FR94 13355). Dans les virus de l'invention, la délétion dans la région El s'étend préférentiellement des nucléotides 455 à 3329 sur la séquence de l'adénovirus Ad5.
Les adénovirus recombinants défectifs selon l'invention peuvent être préparés par toute technique connue de l'homme du métier (Levrero et al., Gène 101 (1991) 195, EP 185 573; Graham, EMBO J. 3 (1984) 2917). En particulier, ils peuvent être préparés par recombinaison homologue entre un adénovirus et un plasmide portant entre autre la séquence d'acides nucléiques revendiquée. La recombinaison homologue se produit après co-transfection desdits adénovirus et plasmide dans une lignée cellulaire appropriée. La lignée cellulaire utilisée doit de préférence (i) être transformable par lesdits éléments, et (ii), comporter les séquences capables de complémenter la partie du génome de l'adénovirus défectif , de préférence sous forme intégrée pour éviter les risques de recombinaison. A titre d'exemple de lignée, on peut mentionner la lignée de rein embryonnaire humain 293 (Graham et al., J. Gen. Virol. 36 (1977) 59) qui contient notamment, intégrée dans son génome, la partie gauche du génome d'un adénovirus Ad5 (12 %) ou des lignées capables de complémenter les fonctions El et E4 telles que décrites notamment dans les demandes n° WO 94/26914 et WO95/02697.
Ensuite, les adénovirus qui se sont multipliés sont récupérés et purifiés selon les techniques classiques de biologie moléculaire, comme illustré dans les exemples.
Plus particulièrement, les constructions adénovirales selon l'invention sont obtenues conformément au protocole suivant :
Ils ont été construits selon la technologie décrite dans le brevet WO96/25506 auquel on se référera pour la description détaillée des plasmides ci-après cités. Pour cela, le plasmide navette pACK3 a été utilisé, il dérive de ColEl et contient i) le gène qui confère la résistance à la kanamycine, ii) le gène sacB de B. subtilis. iii) les séquences ITR-Psi (position 1-386 de l'adénovirus Ad5) séparées des séquences contenant le gène codant pour la protéine PIX (position 3447-4415 de l'adénovirus Ad5) par les sites de restrictions EcoRV et Sjll. Les cassettes d'expression eucaryotes des plasmides pXL3022 et pXL3037 ont été clones entre les sites EçoRV et Sajl du plasmide navette pACK3 pour former les plasmides pXL3050 et 3051 respectivement, voir figure 4. Par double recombinaison homologue à l'aide du plasmide adénoviral pXL2822 (décrit par J. Crouzet et coll. 1997 Proc. Natl. Acad. Sci. 94 sous presse), les plasmides adénoviraux pXL3075 et 3076 respectivement ont été générés. Ces plasmides ont été digérés par Pael et transfectés dans la lignée cellulaire humaine 293 afin de produire les virus ADV3075 et ADV3076. Ces virus sont délétés dans les régions El et E3 et qui contiennent respectivement les cassettes d'expression des gènes HSVl-TK de l'enzyme sauvage et du mutant 2-865:H12.
Concernant les virus adéno-associés (AAV), il s'agit de virus à ADN de taille relativement réduite, qui s'intègrent dans le génome des cellules qu'ils infectent, de manière stable et site-spécifique. Ils sont capables d'infecter un large spectre de cellules, sans induire d'effet sur la croissance, la moφhologie ou la différenciation cellulaires. Par ailleurs, ils ne semblent pas impliqués dans des pathologies chez l'homme. Le génome des AAV a été clone, séquence et caractérisé. Il comprend environ 4700 bases, et contient à chaque extrémité une région répétée inversée (ITR) de 145 bases environ, servant d'origine de réplication pour le virus. Le reste du génome est divisé en 2 régions essentielles portant les fonctions d'encapsidation : la partie gauche du génome, qui contient le gène rep impliqué dans la réplication virale et l'expression des gènes viraux; la partie droite du génome, qui contient le gène cap codant pour les protéines de capside du virus.
L'utilisation de vecteurs dérivés des AAV pour le transfert de gènes in vitro et in vivo a été décrite dans la littérature (voir notamment WO 91/18088; WO 93/09239; US 4,797,368, US5,139,941 , EP 488 528). Ces demandes décrivent différentes constructions dérivées des AAV, dans lesquelles les gènes rep et/ou cap sont délétés et remplacés par un gène d'intérêt, et leur utilisation pour transférer in vitro (sur cellules en culture) ou in vivo (directement dans un organisme) ledit gène d'intérêt. Les AAV recombinants défectifs selon l'invention peuvent être préparés par co- transfection, dans un lignée cellulaire infectée par un virus auxiliaire humain (par exemple un adénovirus), d'un plasmide contenant une séquence d'acides nucléiques de l'invention d'intérêt bordée de deux régions répétées inversées (ITR) d'AAV, et d'un plasmide portant les gènes d'encapsidation (gènes rep et cap) d'AAV. Une lignée cellulaire utilisable est par exemple la lignée 293. Les AAV recombinants produits sont ensuite purifiés par des techniques classiques.
Concernant les virus de l'herpès et les retrovirus, la construction de vecteurs recombinants a été largement décrite dans la littérature : voir notamment Breakfield et al., New Biologist 3 (1991) 203; EP 453242, EP178220, Bernstein et al. Genêt. Eng. 7 (1985) 235; McCormick, BioTechnology 3 (1985) 689, etc. En particulier, les retrovirus sont des virus intégratifs, infectant sélectivement les cellules en division. Ds constituent donc des vecteurs d'intérêt pour des applications cancer. Le génome des retrovirus comprend essentiellement deux LTR, une séquence d'encapsidation et trois régions codantes (gag, pol et env). Dans les vecteurs recombinants dérivés des retrovirus, les gènes gag, pol et env sont généralement délétés, en tout ou en partie, et remplacés par une séquence d'acide nucléique hetérologue d'intérêt. Ces vecteurs peuvent être réalisés à partir de différents types de retrovirus tels que notamment le MoMuLV ("murine moloney leukemia virus"; encore désigné MoMLV), le MSV ("murine moloney sarcoma virus"), le HaSV ("harvey sarcoma virus"); le SNV ("spleen necrosis virus"); le RSV ("rous sarcoma virus") ou encore le virus de Friend.
Pour construire des retrovirus recombinants selon l'invention comportant une séquence d'acides nucléiques selon l'invention, un plasmide comportant notamment les LTR, la séquence d'encapsidation et ladite séquence d'acides nucléiques est construit, puis utilisé pour transfecter une lignée cellulaire dite d'encapsidation, capable d'apporter en trans les fonctions retrovirales déficientes dans le plasmide. Généralement, les lignées d'encapsidation sont donc capables d'exprimer les gènes gag, pol et env. De telles lignées d'encapsidation ont été décrites dans l'art antérieur, et notamment la lignée PA317 (US4,861,719); la lignée PsiCRIP (WO90/02806) et la lignée GP+envAm-12 (WO89/07150). Par ailleurs, les retrovirus recombinants peuvent comporter des modifications au niveau des LTR pour supprimer l'activité transcriptionnelle, ainsi que des séquences d'encapsidation étendues, comportant une partie du gène gag (Bender et al., J. Virol. 61 (1987) 1639). Les retrovirus recombinants produits sont ensuite purifiés par des techniques classiques.
Pour la mise en oeuvre de la présente invention, il est tout particulièrement avantageux d'uti'iser un adénovirus ou un retrovirus recombinant défectif. Ces vecteurs possèdent en effet des propriétés particulièrement intéressantes pour le transfert de gènes suicides dans les cellules tumorales.
5.3 - Vecteurs chimiques
Parmi les vecteurs synthétiques développés, on préfère utiliser dans le cadre de l'invention les polymères cationiques de type polylysine, (LKLK)n, (LKKL)n, polyéthylène imine et DEAE dextran ou encore les lipides cationiques ou lipofectants. Ils possèdent la propriété de condenser l'ADN et de promouvoir son association avec la membrane cellulaire. Parmi ces derniers, on peut citer les lipopolyamines (lipofectamine, transfectam, ete) différents lipides cationiques ou neutres (DOTMA, DOGS, DOPE, ete) ainsi que des peptides d'origine nucléaire. En outre, le concept de la transfection ciblée a été développé, médiée par un récepteur, qui met à profit le principe de condenser l'ADN grâce au polymère cationique tout en dirigeant la fixation du complexe à la membrane grâce à un couplage chimique entre le polymère cationique et le ligand d'un récepteur membranaire, présent à la surface du type cellulaire que l'on veut greffer. Le ciblage du récepteur à la transferrine, à l'insuline ou du récepteur des asialoglycoprotéines des hépatocytes a ainsi été décrit. La préparation d'un composition selon l'invention utilisant un tel vecteur chimique est réalisée selon toute technique connue de l'homme du métier, généralement par simple mise en contact des différents composants. LISTEDESEQUENCES
(1 ) INFORMATIONS GENERALES:
(i) DEPOSANT:
(A) NOM: RHONE POULENC RORER S.A.
(B) RUE: 20, Avenue Raymond Aron
(C) VILLE: ANTONY (E) PAYS: FRANCE
(F) CODE POSTAL: 92165
(G) TELEPHONE: 40.91.69.22
(H) TELECOPIE: (1) 40.91.72.96 (il) TITRE DE L' INVENTION: NOUVEAUX VARIANTS DE LA THYMIDINE KINASE, SEQUENCES D'ACIDES NUCLEIQUES CORRESPONDANTES ET LEUR UTILISATION EN THERAPIE GENIQUE
(m) NOMBRE DE SEQUENCES: 8
(îv) FORME DECHIFFRABLE PAR ORDINATEUR:
(A) TYPE DE SUPPORT: Tape
(B) ORDINATEUR: IBM PC compatible (C) SYSTEME D' EXPLOITATION: FC-DOS/MS-DOS
(D) LOGICIEL: Patentln Release #1.0, Version #1.30 (OEB)
(2) INFORMATIONS POUR LA SEQ ID NO: 1 :
(i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE:
(A) LONGUEUR: 8 acides aminés
(B) TYPE: acides aminés
(D) CONFIGURATION: linéaire
(il) TYPE DE MOLECULE:peptide
(îx) CARACTERISTIQUE:
(D) AUTRE INFORMATION: Les quatres premiers Xaa représentent un acide aminé quelconque et le troisième Xaa une thréonine ou une serine.
(xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE SEQ ID NO: 1 : Gly Xaa Xaa Xaa Xaa Gly Lys Xaa
5
(2) INFORMATIONS POUR LA SEQ ID NO: 2:
(1) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE:
(A) LONGUEUR: 8 acides aminés
(B) TYPE: acides aminés
(D) CONFIGURATION: linéaire in) TYPE DE MOLECULE:peptide
(xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID NO: 2 Gly Pro His Gly Met Gly Lys Thr
5
(2) INFORMATIONS POUR LA SEQ ID NO: 3:
(i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE:
(A) LONGUEUR: 1131 paires de bases (B) TYPE: nucléotide
(C) NOMBRE DE BRINS: simple
(D) CONFIGURATION: linéaire
(ii) TYPE DE MOLECULE: ADNc
(xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID NO: 3:
ATG GCT TCG TAC CCC GGC CAT CAA CAC GCG TCT GCG TTC GAC CAG GCT 48 Met Ala Ser Tyr Pro Gly His Gin His Ala Ser Ala Phe Asp Gin Λla 1 5 10 15
GCG CGI TCT CGC GGC CAT AGC AAC CGA CGT ACG GCG TTG CGC CCT CGC 96 Ala Arg Ser Arg Gly His Ser Asn Arg Arg Thr Ala Leu Arg Pro Arg 20 25 30
CGG CAG CAA GAA GCC ACG GAA GTC CGC CCG GAG CAG AAA ATG CCC ACG 144 Arg Gin Gin Glu Ala Thr Glu Val Arg Pro Glu Gin Lys Met Pro Thr 35 40 45
CTA CTG CGG GTT TAT ATA GAC GGT CCC CAC GGG ATA GGG AAA ACC ACC 192 Leu Leu Arg Val Tyr Ile Asp Gly Pro His Gly Ile Gly Lys Thr Thr 50 55 60 ACC ACG CAA CTG CTG GTG GCC CTG GGT TCG CGC GAC GAT ATC GTC TAC 240 Thr Thr Gin Leu Leu Val Ala Leu Gly Ser Arg Asp Asp Ile Val Tyr 65 70 75 80
GTA CCC GAG CCG ATG ACT TAC TGG CGG GTG CTG GGG GCT TCC GAG ACA 288 Val Pro Glu Pro Met Thr Tyr Trp Arg Val Leu Gly Ala Ser Glu Thr
85 90 95
ATC GCG AAC ATC TAC ACC ACA CAA CAC CGC CTC GAC CAG GGT GAG ATA 336 Ile Ala Asn Ile Tyr Thr Thr Gin His Arg Leu Asp Gin Gly Glu Ile 100 105 110
TCG GCC GGG GAC GCG GCG GTG GTA ATG ACA AGC GCC CAG ATA ACA ATG 384 Ser Ala Gly Asp Ala Ala Val Val Met Thr Ser Ala Gin Ile Thr Met 115 120 125
GGC ATG CCT TAT GCC GTG ACC GAC GCC GTT CTG GCT CCT CAT ATC GGG 432 Gly Met Pro Tyr Ala Val Thr Asp Ala Val Leu Ala Pro His Ile Gly 130 135 140 GGG GAG GCT GGG AGC TCA CAT GCC CCG CCC CCG GCC CTC ACC CTC ATC 480
Gly Glu Ala Gly Ser Ser His Ala Pro Pro Pro Ala Leu Thr Leu Ile 145 150 155 160
TTC GAC CGC CAT 2C ATC GCC GCC CTC CTG TGC TAC CCG GCC GCG CGG 528 Phe Asp Arg His Pro lie Ala Ala Leu Leu Cys Tyr Pro Ala Ala Arg
165 170 175 TAC CTT ATG GGC AGC ATG ACC CCC CAG GCC GTG CTG GCG TTC GTG GCC 576 Tyr Leu Met Gly Ser Met Thr Pro Gin Ala Val Leu Ala Phe Val Ala 180 185 190
CTC ATC CCG CCG ACC TTG CCC GGC ACC AAC ATC GTG CTT GGG GCC CTT 624 Leu Ile Pro Pro Thr Leu Pro Gly Thr Asn Ile Val Leu Gly Ala Leu 195 200 205 CCG GAG GAC AGA CAC ATC GAC CCC CTG GCC AAA CGC CAG CGC CCC GGC 672 Pro Glu Asp Arg His Ile Asp Arg Leu Ala Lys Arg Gin Arg Pro Gly 210 215 220
GAG CGG CTG GAC CTG GCT ATG CTG GCT GCG ATT CGC CGC GTT TAC GGG 720 Glu Arg Leu Asp Leu Ala Met Leu Ala Ala Ile Arg Arg Val Tyr Gly 225 230 235 240
CTA CTT GCC AAT ACG GTG CGG TAT CTG CAG TGC GGC GGG TCG TGG CGG 768 Leu Leu Ala Asn Thr Val Arg Tyr Leu Gin Cys Gly Gly Ser Trp Arg 245 250 255
GAG GAC TGG GGA CAG CTT TCG GGG ACG GCC GTG CCG CCC CAG GGT GCC 816 Glu Asp Trp Gly Gin Leu Ser Gly Thr Ala Val Pro Pro Gin Gly Ala 260 265 270
GAG CCC CAG AGC AAC GCG GGC CCA CGA CCC CAT ATC GGG GAC ACG TTA 864 Glu Pro Gin Ser Asn Ala Gly Pro Arg Pro His Ile Gly Asp Thr Leu 275 280 285
TTT ACC CTG TTT CGG GCC CCC GAG TTG CTG GCC CCC AAC GGC GAC CTG 912
Phe Thr Leu Phe Arg Ala Pro Glu Leu Leu Ala Pro Asn Gly Asp Leu 290 295 300
TAT AAC GTG TTT GCC TGG GCC TTG GAC GTC TTG GCC AAA CGC CTC CGT 960
Tyr Asn Val Phe Ala Trp Ala Leu Asp Val Leu Ala Lys Arg Leu Arg
305 310 315 320
TCC ATG CAC GTC TTT ATC CTG GAT TAC GAC CAA TCG CCC GCC GGC TGC 1008
Ser Met His Val Phe Ile Leu Asp Tyr Asp Gin Ser Pro Ala Gly Cys 325 330 335
CGG GAC GCC CTG CTG CAA CTT ACC TCC GGG ATG GTC CAG ACC CAC GTC 1056
Arg Asp Ala Leu Leu Gin Leu Thr Ser Gly Met Val Gin Thr His Val 340 345 350
ACC ACC CCC GGC TCC ATA CCG ACG ATA TGC GAC CTG GCG CGC ACG TTT 1104 Thr Thr Pro Gly Ser Ile Pro Thr Ile Cys Asp Leu Ala Arg Thr Phe 355 360 365 GCC CGG GAG ATG GGG GAG GCT AAC TGA 1131
Ala Arg Glu Met Gly Glu Ala Asn *
370 375
(2) INFORMATIONS POUR LA SEQ ID NO: 4:
(l) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE: (A) LONGUEUR: 30 paires de bases (B) TYPE: nucléotide
(C) NOMBRE DE BRINS: simple
(D) CONFIGURATION: linéaire
(il) TYPE DE MOLECULE: ADNc (xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID NO: 4:
TTATGAΛTTC ATATGGCTTC GTACCCCGGC 30
(2) INFORMATIONS POUR LA SEQ ID NO: 5:
(i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE:
(A) LONGUEUR: 27 paires de bases
(B) TYPE: nucléotide
(C) NOMBRE DE BRINS: simple (D) CONFIGURATION: linéaire
(n) TYPE DE MOLECULE: ADNc
(xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID NO: 5:
TTATTTCTAG AGGTCGAAGA TGAGGGT 27
(2) INFORMATIONS POUR LA SEQ ID NO: 6:
(i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE:
(A) LONGUEUR: 1131 paires de bases
(B) TYPE: nucléotide (C) NOMBRE DE BRINS: simple
(D) CONFIGURATION: linéaire
(n) TYPE DE MOLECULE: ADNc
(xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID NO: 6:
ATG GCT TCG TAC CCC AGC CAT CAA CAC GCG TCT GCG TTC GAC CAG GCT 48 Met Ala Ser Tyr Pro Ser His Gin His Ala Ser Ala Phe Asp Gin Ala 1 5 10 15
GCG CGT TCT CGC GGC CAT AGC AAC CGA CGT ACG GCG TTG CGC CCT CGC 96 Ala Arg Ser Arg Gly His Ser Asn Arg Arg Thr Ala Leu Arg Pro Arg 20 25 30
CGG CAG CAA GAA GCC ACG GAA GTC CGC CCG GAG CAG AAA ATG CCC ACG 144 Arg Gin Gin Glu Ala Thr Glu Val Arg Pro Glu Gin Lys Met Pro Thr 35 40 45 CTA CTG CGG GTT TAT ATA GAC GGT CCC CAC GGG ATA GGG AAA ACC ACC 192 Leu Leu Arg Val Tyr Ile Asp Gly Pro His Gly lie Gly Lys Thr Thr 50 55 60
ACC ACG CAA CTG CTG GTG GCC CTG GGT TCG CGC GAC GAT ATC GTC TAC 240 Thr Thr Gin Leu Leu Val Ala Leu Gly Ser Arg Asp Asp lie Val Tyr 65 70 ~5 80
GTA CCC GAG CCG ATG ACT TAC TGG CGG GTG CTG GGG GCT TCC GAG ACA 288 Val Pro Glu Pro Met Thr Tyr Trp Arg Val Leu Gly Ala Ser Glu Thr 85 90 95
ATC GCG AAC ATC TAC ACC ACA CAA CAC CGC CTC GAC CAG GGT GAG ATA 336 Ile Ala Asn Ile Tyr Thr Thr Gin His Arg Leu Asp Gin Gly Glu Ile 100 105 110
TCG GCC GGG GAC GCG GCG GTG GTA ATG ACA AGC GCC CAG ATA ACA ATG 384 Ser Ala Gly Asp Ala Ala Val Val Met Thr Ser Ala Gin Ile Thr Met 115 120 125
GGC ATG CCT TAT GCC GTG ACC GAC GCC GTT CTG GCT CCT CAT ATC GGG 432 Gly Met Pro Tyr Ala Val Thr Asp Ala Val Leu Ala Pro His Ile Gly 130 135 140 GGG GAG GCT GGG AGC TCA CAT GCC CCG CCC CCG GCC CTC ACC CTC ATC 480 Gly Glu Ala Gly Ser Ser His Ala Pro Pro Pro Ala Leu Thr Leu Ile 145 150 155 160
TTC GAC CGC CAT CCC ATC GCC GCC CTC CTG TGC TAC CCG GCC GCG CGG 528 Phe Asp Arg His Pro Ile Ala Ala Leu Leu Cys Tyr Pro Ala Ala Arg
165 170 175
TAC CTT ATG GGC AGC ATG ACC CCC CAG GCC GTG CTG GCG TTC GTG GCC 576 Tyr Leu Met Gly Ser Met Thr Pro Gin Ala Val Leu Ala Phe Val Ala 180 185 190
CTC ATC CCG CCG ACC TTG CCC GGC ACC AAC ATC GTG CTT GGG GCC CTT 624 Leu Ile Pro Pro Thr Leu Pro Gly Thr Asn Ile Val Leu Gly Ala Leu 195 200 205
CCG GAG GAC AGA CAC ATC GAC CGC CTG GCC AAA CGC CAG CGC CCC GGC 672
Pro Glu Asp Arg His Ile Asp Arg Leu Ala Lys Arg Gin Arg Pro Gly 210 215 220 GAG CGG CTG GAC CTG GCT ATG CTG GCT GCG ATT CGC CGC GTT TAC GGG 720
Glu Arg Leu Asp Leu Ala Met Leu Ala Ala Ile Arg Arg Val Tyr Gly
225 230 235 240
CTA CTT GCC AAT ACG GTG CGG TAT CTG CAG TGC GGC GGG TCG TGG CGG 768 Leu Leu Ala Asn Thr Val Arg Tyr Leu Gin Cys Gly Gly Ser Trp Arg
245 250 255
GAG GAC TGG GGA CAG CTT TCG GGG ACG GCC GTG CCG CCC CAG GGT GCC 816
Glu Asp Trp Gly Gin Leu Ser Gly Thr Ala Val Pro Pro Gin Gly Ala 260 265 270
GAG CCC CAG AGC AAC GCG GGC CCA CGA CCC CAT ATC GGG GAC ACG TTA 864
Glu Pro Gin Ser Asn Ala Gly Pro Arg Pro His Ile Gly Asp Thr Leu 275 280 285
TTT ACC CTG TTT CGG GCC CCC GAG TTG CTG GCC CCC AAC GGC GAC CTG 912 Phe Thr Leu Phe Arg Ala Pro Glu Leu Leu Ala Pro Asn Gly Asp Leu 290 295 300 TAT AAC GTG TTT GCC TGG GCC TTG GAC GTC TTG GCC AAA CGC CTC CGT 960
Tyr Asn Val Phe Ala Trp Ala Leu Asp Val Leu Ala Lys Arg Leu Arg 305 310 315 320
TCC ATG CAC GTC TTT ATC CTG GAT TAC GAC CAA TCG CCC GCC GGC TGC 1008 Ser Met His Val Phe Ile Leu Asp Tyr Asp Gin Ser Pro Ala Gly Cys
325 330 335
CGG GAC GCC CTG CTG CAA CTT ACC TCC GGG ATG GTC CAG ACC CAC GTC 1056
Arg Asp Ala Leu Leu Gin Leu Thr Ser Gly Met Val Gin Thr His Val 340 345 350
ACC ACC CCC GGC TCC ATA CCG ACG ATA TGC GAC CTG GCG CGC ACG TTT 1104 Thr Thr Pro Gly Ser Ile Pro Thr Ile Cys Asp Leu Ala Arg Thr Phe 355 360 365
GCC CGG GAG ATG GGG GAG GCT AAC TGA 1131 Ala Arg Glu Met Gly Glu Ala Asn * 370 375
(2) INFORMATIONS POUR LA SEQ ID NO: 7:
(i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE:
(A) LONGUEUR: 1131 paires de bases
(B) TYPE: nucléotide
(C) NOMBRE DE BRINS: simple (D) CONFIGURATION: linéaire
(li) TYPE DE MOLECULE: ADNc
(xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID NO: 7:
ATG GCT TCG TAC CCC GGC CAT CAA CAC ACA TCT GCG TTC GAC CAG GCT 48 Met Ala Ser Tyr Pro Gly His Gin His Thr Ser Ala Phe Asp Gin Ala 1 5 10 15
GCG CGT TCT CGC GGC CAT AGC AAC CGA CGT ACG GCG TTG CGC CCT CGC 96 Ala Arg Ser Arg Gly His Ser Asn Arg Arg Thr Ala Leu Arg Pro Arg 20 25 30 CGG CAG CAA GAA GCC ACG GAA GTC CGC CCG GAG CAG AAA ATG CCC ACG 144
Arg Gin Gin Glu Ala Thr Glu Val Arg Pro Glu Gin Lys Met Pro Thr 35 40 45
CTA CTG CGG GTT TAT ATA GAC GGT CCC CAC GGG ATA GGG AAA ACC ACC 192 Leu Leu Arg Val Tyr Ile Asp Gly Pro His Gly Ile Gly Lys Thr Thr 50 55 60
ACC ACG CAA CTG CTG GTG GCC CTG GGT TCG CGC GAC GAT ATC GTC TAC 240
Thr Thr Gin Leu Leu Val Ala Leu Gly Ser Arg Asp Asp lie Val Tyr 65 70 75 80
GTA CCC GAG CCG ATG ACT TAC TGG CGG GTG CTG GGG GCT TCC GAG ACA 288
Val Pro Glu Pro Met Thr Tyr Trp Arg Val Leu Gly Ala Ser Glu Thr
85 90 95
ATC GCG AAC ATC TAC ACC ACA CAA CAC CGC CTC GAC CAG GGT GAG ATA 336 Ile Ala Asn lie Tyr Thr Thr Gin His Arg Leu Asp Gin Gly Glu Ile 100 105 110 TCG GCC GGG GAC GCG GCG GTG GTA ATG ACA AGC GCC CAG ATA ACA ATG 384 Ser Ala Gly Asp Ala Ala Val Val Met Thr Ser Ala Gin Ile Thr Met 115 120 125
GGC ATG CCT TAT GCC GTG ACC GAC GCC GTT CTG GCT CCT CAT ATC GGG 432 Gly Met Pro Tyr Ala Val Thr Asp Ala Val Leu Ala Pro His Ile Gly 130 135 140
GGG GAG GCT GGG AGC TCA CAT GCC CCG CCC CCG GCC CTC ACC CTC ATC 480 Gly Glu Ala Gly Ser Ser His Ala Pro Pro Pro Ala Leu Thr Leu Ile 145 150 155 160
TTC GAC CGC CAT CCC ATC GCC GCC CTC CTG TGC TAC CCG GCC GCG CGG 528 ?ne Asp Arg His Pro Ile Ala Ala Leu Leu Cys Tyr Pro Ala Ala Arg 165 170 ï~5 TAC CTT ATG GGC AGC ATG ACC CCC CAG GCC GTG CTG GCG TTC GTG GCC 576 Tyr Leu Met Gly Ser Met Thr Pro Gin Ala Val Leu Ala Phe Val Ala 180 185 190
CTC ATC CCG CCG ACC TTG CCC GGC ACC AAC ATC GTG CTT GGG GCC CTT 624 Leu Ile Pro Pro Thr Leu Pro Gly Thr Asn Ile Val Leu Gly Ala Leu 195 200 205 CCG GAG GAC AGA CAC ATC GAC CGC CTG GCC AAA CGC CAG CGC CCC GGC 672 Pro Glu Asp Arg His Ile Asp Arg Leu Ala Lys Arg Gin Arg Pro Gly 210 215 220
GAG CGG CTG GAC CTG GCT ATG CTG GCT GCG ATT CGC CGC GTT TAC GGG 720 Glu Arg Leu Asp Leu Ala Met Leu Ala Ala Ile Arg Arg Val Tyr Gly 225 230 235 240
CTA CTT GCC AAT ACG GTG CGG TAT CTG CAG TGC GGC GGG TCG TGG CGG 768 Leu Leu Ala Asn Thr Val Arg Tyr Leu Gin Cys Gly Gly Ser Trp Arg 245 250 255
GAG GAC TGG GGA CAG CTT TCG GGG ACG GCC GTG CCG CCC CAG GGT GCC 816 Glu Asp Trp Gly Gin Leu Ser Gly Thr Ala Val Pro Pro Gin Gly Ala 260 265 270
GAG CCC CAG AGC AAC GCG GGC CCA CGA CCC CAT ATC GGG GAC ACG TTA 864 Glu Pro Gin Ser Asn Ala Gly Pro Arg Pro His Ile Gly Asp Thr Leu 275 280 285 TTT ACC CTG TTT CGG GCC CCC GAG TTG CTG GCC CCC AAC GGC GAC CTG 912 Phe Thr Leu Phe Arg Ala Pro Glu Leu Leu Ala Pro Asn Gly Asp Leu 290 295 300
TAT AAC GTG TTT GCC TGG GCC TTG GAC GTC TTG GCC AAA CGC CTC CGT 960 Tyr Asn Val Phe Ala Trp Ala Leu Asp Val Leu Ala Lys Arg Leu Arg 305 310 315 320
TCC ATG CAC GTC TTT ATC CTG GAT TAC GAC CAA TCG CCC GCC GGC TGC 1008 Ser Met His Val Phe Ile Leu Asp Tyr Asp Gin Ser Pro Ala Gly Cys 325 330 335
CGG GAC GCC CTG CTG CAA CTT ACC TCC GGG ATG GTC CAG ACC CAC GTC 1056 Arg Asp Ala Leu Leu Gin Leu Thr Ser Gly Met Val Gin Thr His Val 340 345 350
ACC ACC CCC GGC TCC ATA CCG ACG ATA TGC GAC CTG GCG CGC ACG TTT 1104 Thr Thr Pro Gly Ser Ile Pro Thr Ile Cys Asp Leu Ala Arg Thr Phe 355 360 365 GCC CGG GAG ATG GGG GAG GCT AAC TGA 1131
Ala Arg Glu Met Gly Glu Ala Asn * 370 375
(2) INFORMATIONS POUR LA SEQ ID NO: 8:
(i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE:
(A) LONGUEUR: 1131 paires de bases (B) TYPE: nucléotide
(C) NOMBRE DE BRINS: simple
(D) CONFIGURATION: linéaire in) TYPE DE MOLECULE: ADNc (xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID NO: 8:
ATG GCT TCG TAC CCC GGC CAT CAA CAC ACA TCT GCG TTC GAC CAG GCT 48 Met Ala Ser Tyr Pro Gly His Gin His Thr Ser Ala Phe Asp Gin Ala 1 5 10 15
GCG CGT TCT CGC GGC CAT AGC AAC CGA CGT ACG GCG TTG CGC CCT CGC 96 Ala Arg Ser Arg Gly His Ser Asn Arg Arg Thr Ala Leu Arg Pro Arg 20 25 30
CGG CAG CAA GAA GCC ACG GAA GTC CGC CCG GAG CAG AAA ATG CCC ACG 144 Arg Gin Gin Glu Ala Thr Glu Val Arg Pro Glu Gin Lys Met Pro Thr 35 40 45
CTA CTG CGG GTT TAT ATA GAC GGT CCC CAC GGG ATA GGG AAA ACC ACC 192 Leu Leu Arg Val Tyr Ile Asp Gly Pro His Gly Ile Gly Lys Thr Thr 50 55 60 ACC ACG CAA CTG CTG GTG GCC CTG GGT TCG CGC GAC GAT ATC GTC TAC 240
Thr Thr Gin Leu Leu Val Ala Leu Gly Ser Arg Asp Asp Ile Val Tyr 65 70 75 80
GTA CCC GAG CCG ATG ACT TAC TGG CGG GTG CTG GGG GCT TCC GAG ACA 288 Val Pro Glu Pro Met Thr Tyr Trp Arg Val Leu Gly Ala Ser Glu Thr
85 90 95
ATC GCG AAC ATC TAC ACC ACA CAA CAC CGC CTC GAC CAG GGT GAG ATA 336
Ile Ala Asn Ile Tyr Thr Thr Gin His Arg Leu Asp Gin Gly Glu Ile 100 105 110
TCG GCC GGG GAC GCG GCG GTG GTA ATG ACA AGC GCC CAG ATA ACA ATG 384
Ser Ala Gly Asp Ala Ala Val Val Met Thr Ser Ala Gin Ile Thr Met 115 120 125
GGC ATG CCT TAT GCC GTG ACC GAC GCC GTT CTG GCT CCT CAT ATC GGG 432 Gly Met Pro Tyr Ala Val Thr Asp Ala Val Leu Ala Pro His Ile Gly 130 135 140 GGG GAG GCT GGG AGC TCA CAT GCC CCG CCC CCG GCC CTC ACC CTC ATC 480
Gly Glu Ala Gly Ser Ser His Ala Pro Pro Pro Ala Leu Thr Leu Ile
145 150 155 160
TTC GAC CGC CAT CCC ATC GCC GCC CTC CTG TGC TAC CCG GCC GCG CGG 528 Phe Asp Arg His Pro Ile Ala Ala Leu Leu Cys Tyr Pro Ala Ala Arg
165 170 175
TAC CTT ATG GGC AGC ATG ACC CCC CAG GCC GTG CTG GCG TTC GTG GCC 576
Tyr Leu Met Gly Ser Met Thr Pro Gin Ala Val Leu Ala Phe Val Ala 180 185 190
CTC ATC CCG CCG ACT TTG CCC GGC ACC AAC ATC GTG CTT GGG GCC CTT 624
Leu Ile Pro Pro Thr Leu Pro Gly Thr Asn Ile Val Leu Gly Ala Leu 195 200 205
CCG GAG GAC AGA CAC ATC GAC CGC CTG GCC AAA CGC CAG CGC CCC GGC 672 Pro Glu Asp Arg His Ile Asp Arg Leu Ala Lys Arg Gin Arg Pro Gly 210 215 220 GAG CGG CTG GAC CTG GCT ATG CTG GCT GCG ATT CGC CGC GTT TAC GGG 720
Glu Arg Leu Asp Leu Ala Met Leu Ala Ala Ile Arg Arg Val Tyr Gly 225 230 235 240
CTA CTT GCC AAT ACG GTG CGG TAT CTG CAG TGC GGC GGG TCG TGG CGG "68 Leu Leu Λ.a Asn Thr Val Arg Tyr Leu Gin Cys Gly Gly Ser Trp Arg 245 250 255
GAG GAC TGG GGA CAG CTT TCG GGG ACG GCC GTG CCG CCC CAG GGT GCC 816 Glu Asp Trp Gly Gin Leu Ser Gly Thr Ala Val Pro Pro Gin Gly Ala 260 265 270
GAG CCC CAG AGC AAC GCG GGC CCA CGA CCC CAT ATC GGG GAC ACG TTA 864 Glu Pro Gin Ser Asn Ala Gly Pro Arg Pro His Ile Gly Asp Thr Leu 275 280 285
TTT ACC CTG TTT CGG GCC CCC GAG TTG TTG GCC CCC AAC GGC GAC CTG 912 Phe Thr Leu Phe Arg Ala Pro Glu Leu Leu Ala Pro Asn Gly Asp Leu 290 295 300 TAT AAC GTG TTT GCC TGG GCC TTG GAC GTC TTG GCC AAA CGC CTC CGT 960
Tyr Asn Val Phe Ala Trp Ala Leu Asp Val Leu Ala Lys Arg Leu Arg
305 310 315 320
TCC ATG CAC GTC TTT ATC CTG GAT TAC GAC CAA TCG CCC GCC GGC TGC 1008 Ser Met His Val Phe Ile Leu Asp Tyr Asp Gin Ser Pro Ala Gly Cys
325 330 335
CAA GAC GCC CTG CTG CAA CTT ACC TCC GGG ATG GTC CAG ACC CAC GTC 1056
Gin Asp Ala Leu Leu Gin Leu Thr Ser Gly Met Val Gin Thr His Val 340 345 350
ACC ACC CCC GGC TCC ATA CCG ACG ATA TGC GAC CTG GCG CGC ACC TTT 1104
Thr Thr Pro Gly Ser Ile Pro Thr Ile Cys Asp Leu Ala Arg Thr Phe 355 360 365
GCC CGG GAG ATG GGG GAG GCT AAC TGA 1131 Ala Arg Glu Met Gly Glu Ala Asn *
370 375

Claims

REVENDICATIONS
1- Séquence d'acides nucléiques codant pour une thymidine kinase caractérisée en ce qu'elle possède par rapport à la séquence sauvage au moins une mutation dans la région correspondant au site de fixation de l'ATP associée à au moins une mutation dans la région N-terminale et/ou C-terminale.
2- Séquence d'acides nucléiques caractérisée en ce qu'elle dérive de la séquence codant pour une thymidine kinase sauvage, ladite séquence possédant au moins une mutation dans la région correspondant au site de fixation de l'ATP et au moins une mutation dans la région N-terminale et/ou C-terminale.
3- Séquence d'acides nucléiques selon la revendication 2 caractérisée en ce qu'elle dérive de la séquence codant pour la thymidine kinase du virus de l'herpès simplex de type 1.
4- Séquence d'acides nucléiques selon la revendication 3 caractérisée en ce ladite séquence comprend au moins une substitution d'une guanine en position 180 par une adénine (G180A).
5- Séquence d'acides nucléiques selon la revendication 3 ou 4 caractérisée en ce ladite séquence comprend au moins une substitution d'une guanine en position 180 par une adénine (G 180 A) et au moins une substitution de la guanine en position 16 par une adénine (G16A).
6- Séquence d'acides nucléiques selon la revendication 3 ou 4 caractérisée en ce ladite séquence comprend au moins une substitution d'une guanine en position 180 par une adénine (G180A) et au moins une double substitution des guanines en position 28 et 30 par des adénines (G28A et G30A).
7. Séquence d'acides nucléiques selon l'une des revendications 4 à 6 caractérisée en ce αue ladite séquence comprend en outre au moins une mutation dans sa région C-terminale.
8. Séquence d'acides nucléiques selon l'une des revendications 4, 6 et 7 caractérisée en ce qu'elle possède au moins une substitution d'une guanine en position 180 par une adénine (G180A), au moins une double substitution des guanines en position 28 et 30 par des adénines (G28A et G30A) une double substitution des cystosines en position 591 et 892 par des mymines (C591T et C892T) et une double substitution des guanines en position 1010 et 1011 par des adénines (G1010A et G1011A).
9. Séquence d'acides nucléiques codant pour un variant de la thymidine kinase caractérisée en ce qu'elle est choisie parmi:
(a) la séquence SEQ ID n° 3 ou une partie de celle ci portant la mutation
(G180A) ou un de leur brin complémentaire,
(b) les séquences SEQ ID n° 6 et SEQ ID n° 7 ou une partie de celles-ci portant la mutation (G 180 A) et respectivement la mutation G 16 A et la double mutation (G28A ; G30A) ou un de leur brin complémentaire,
(c) la séquence SEQ ID n° 8 ou une partie de celle-ci portant la mutation
(G180A) la double mutation (G28A ; G30A), et la quadruple mutation (C591T; C892T; G1010A; G1011A) ou un de leur brin complémentaire
(d) toute séquence hybridant avec les séquences (a), (b) et/ou (c) et codant pour un variant de la thymidine kinase et telle que définie en revendication 1 ou 2.
(e) les variants de (a), (b), (c) et(d) résultant de la dégénérescence du code génétique.
10. Séquence d'acides nucléiques codant pour un variant d'une thymidine kinase sauvage susceptible d'être obtenue par mutagenese, dirigée ou non, d'une séquence selon l'une des revendications 1 à 9.
11. Séquence d'acides nucléiques selon l'une des revendications précédentes caractérisée en ce qu'elle peut être d'origine eucaryote, bactérienne, virale, synthétique ou semi-synthétique.
12. Variant d'une thymidine kinase sauvage susceptible d'être exprimé à partir d'une séquence d'acides nucléiques selon l'une quelconque des revendications 1 à 11.
13. Variant d'une thymidine kinase comprenant au moins une mutation dans la région correspondant au site de fixation de !'ATP associée à au moins une mutation dans sa région N-terminale et/ou C-terminale.
14. Variant selon la revendication 13 caractérisé en ce que la région impliquée dans la région correspondant au site de fixation de l'ATP est représentée par le consensus GXXXXGK(T/S).
15. Variant selon la revendication 14 caractérisé en ce qu'il s'agit de préférence du motif GPHGMGKT.
16. Variant selon la revendication 15 caractérisé en ce qu'il comprend au moins une substitution en position 60 d'une Méthionine par une Isoleucine.
17. Variant d'une thymidine kinase sauvage caractérisé en ce qu'il s'agit du mutant 1537:E4.
18. Variant selon l'une des revendications 13 à 16 caractérisée en ce que la mutation en région N-terminale est comprise dans les acides aminés 1 à 20 de ladite région.
19. Variant selon la revendication 18 caractérisée en ce que cette mutation est comprise dans les acides aminés 1 à 15 de la région N-terminale.
20. Variant selon la revendication 19 caractérisée en ce que cette mutation est comprise dans les acides aminés 1 à 10 de la région N-terminale.
21. Variant selon la revendication 20 caractérisée en ce que cette mutation est comprise dans les acides aminés 5 à 10 de la région N-terminale.
22. Variant de la thymidine kinase du virus de l'herpès simplex de type 1 comprenant au moins une substitution en position 60 d'une Méthionine par une Isoleucine et une substitution en position 10 d'une Alanine par une Thréonine.
23. Variant de la thymidine kinase du virus herpès simplex de type 1 comprenant au moins une substitution en position 60 d'une Méthionine par une Isoleucine et une substitution en position 6 d'une Glycine par une Serine.
24. Variant d'une thymidine kinase sauvage caractérisé en ce qu'il s'agit du mutant 2-865:H12.
25. Variant d'une thymidine kinase sauvage caractérisé en ce qu'il s'agit du mutant 2-3361 :D3.
26. Variant selon l'une des revendications 14 à 23 comprenant en outre au moins une mutation dans la région C-terminale.
27. Variant selon la revendication 26 caractérisée en ce que cette mutation est comprise dans les acides aminés 320 à 350 de la région C-terminale.
28. Variant selon la revendication 27 caractérisée en ce que cette mutation est comprise dans les acides aminés 325 à 345 de la région C-terminale.
29. Variant selon la revendication 28 caractérisée en ce que cette mutation est comprise dans les acides aminés 330 à 343 de la région C-terminale.
30. Variant selon la revendication 29 caractérisée en ce que cette mutation est comprise dans les acides aminés 335 à 340 de la région C-terminale.
31. Variant de la thymidine kinase du virus herpès simplex de type 1 comprenant au moins une substitution en position 60 d'une Méthionine par une Isoleucine, une substitution en position 10 d'une Alanine par une Thréonine et une substitution en position 337 d'une Arginine par une Glutamine.
32. Variant d'une thymidine kinase sauvage caractérisé en ce qu'il s'agit du mutant 3-4216:H2.
33. Variant d'une thymidine kinase sauvage caractérisé en ce qu'il présente les propriétés cinétiques suivantes:
- une diminution substantielle voire totale d'inhibition de l'activité de phosphorylation du ganciclovir contrairement à l'enzyme sauvage pour laquelle l'inhibition est très nette à partir de 15 μM;
-une augmentation d'au moins un facteur de 2 à 2,5 de la vitesse initiale de phosphorylation du GCV à partir de 15-20 μM par rapport à l'enzyme sauvage et
- un rapport Kcat/Km de la thymidine réduit d'un facteur 1 à 6 par rapport à celui de l'enzyme sauvage.
34- Variant d'une thymidine kinase selon les revendications 13 à 25 caractérisé en ce qu'il présente au moins l'une des performances cinétiques suivantes:
- une diminution significative de l'inhibition de la phosphorylation du ganciclovir ou de l'analogue de nucleoside à des concentrations élevées en ganciclovir ou en analogue de nucleoside;
- une vitesse de phosphorylation du ganciclovir ou de l'analogue de nucleoside au moins triplée et/ou
- un rapport Kcat/Km sort inchangé soit de la thymidine réduit d'un facteur supérieur ou égal à 5 par rapport à celui de l'enzyme sauvage.
35. Variant d'une thymidine kinase selon les revendications 26 à 32 caractérisé en ce qu'il présente au moins l'une des performances cinétiques suivantes: une absence l'inhibition de la phosphorylation du ganciclovir ou de l'analogue de nucleoside à des concentrations élevées en ganciclovir ou en analogue de nucleoside,
- une augmentation d'un facteur supérieur à 3,5 de la vitesse initiale de phosphorylation du GCV à partir de 15-20 μM par rapport à l'enzyme sauvage.
- un rapport Kcat/Km de la thymidine diminuée d'un facteur 4 par rapport à celui de l'enzyme sauvage.
36. Cassette d'expression comprenant un acide nucléique selon l'une des revendications 1 à 11, un promoteur permettant son expression et un signal de terminaison de la transcription.
37- Vecteur comprenant un acide nucléique selon l'une des revendications 1 à 11 et ou une cassette selon la revendication 36.
38. Vecteur selon selon la revendication 37 caractérisé en ce qu'il s'agit d'un vecteur viral.
39. Vecteur selon selon la revendication 38 caractérisé en ce qu'il s'agit d'un adénovirus recombinant défectif.
40. Vecteur selon selon la revendication 38 caractérisé en ce qu'il s'agit d'un retrovirus recombinant défectif.
41. Vecteur selon selon la revendication 38 caractérisé en ce qu'il s'agit d'un AAV recombinant défectif.
42. Vecteur selon selon la revendication 38 caractérisé en ce qu'il s'agit d'un HSV recombinant défectif.
43. Vecteur selon selon la revendication 37 caractérisé en ce qu'il s'agit d'un vecteur chimique ou biochimique.
44. Composition pharmaceutique comprenant un acide nucléique selon l'une quelconque des revendications 1 à 11 , et/ou un vecteur selon l'une des revendications
37 à 43.
45. Composition pharmaceutique comprenant un variant selon l'une des revendications 12 à 35.
46. Composition pharmaceuuque selon l'une des revendications 45 ou 46 pour le traitement des désordres hyperprolifératifs.
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