JP2003530855A

JP2003530855A - 遺伝子治療のためのベクター

Info

Publication number: JP2003530855A
Application number: JP2001577485A
Authority: JP
Inventors: ジェイン・フェリシティ・アパーレー; マリーナ・イマキュラーダ・ガリン
Original assignee: インペリアル・カレッジ・イノベイションズ・リミテッド
Priority date: 2000-04-13
Filing date: 2001-04-13
Publication date: 2003-10-21
Also published as: EP1268812A2; WO2001079502A2; GB0008966D0; WO2001079502A3; US20040166559A1

Abstract

(57)【要約】チミジンキナーゼをコードする領域が機能的な受容体スプライス・サイトおよび／またはスプライス・ドナー・サイトを含まないチミジンキナーゼをコードするポリヌクレオチド。このポリヌクレオチドを含む発現ベクター。ポリヌクレオチドおよび発現ベクターは遺伝子治療に有用である。ポリヌクレオチドおよびベクターは、ガンシクロビルなどの実質的に無毒な薬剤（チミジンキナーゼにより有毒薬剤に転換される）と組み合わせて使用されたとき、細胞を破壊するのに有用である。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【発明の属する技術分野】

本発明は、遺伝子治療のためのベクターに関する。特に、本発明は、チミジン
キナーゼ遺伝子をコードする遺伝子治療のためのベクターに関するものであり、
中でも特に、この遺伝子をコードするレトロウイルス・ベクターに関する。

【０００２】

【従来の技術】

癌遺伝子治療において、腫瘍治療のために代謝自殺遺伝子を使用することに大
きな関心がもたれている。哺乳類細胞中では通常発現しない自殺遺伝子を腫瘍細
胞中に送り込むと、無毒なプロドラッグを活性化してその細胞毒性形にすること
ができる。これは、遺伝子操作した腫瘍細胞を殺して腫瘍の退縮を引き起こすで
あろう（Ｍｕｌｌｅｎ１９９４，Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．Ｔｈｅｒａｐｅｕｔ．
６３，１９９−２０７）。ＨＳＶ−ｔｋ／ＧＣＶシステムは自殺遺伝子治療で最
も広く用いられているアプローチの１つである（ＭｏｏｌｔｅｎＦＬ，Ｗｅｌ
ｌｓＪＭ，ＣａｎｃｅｒＲｅｓ．４６：５２７６，１９８６；Ｍｏｏｌｔｅ
ｎＦＬ，ＣａｎｃｅｒＧｅｎｅＴｈｅｒ．１：２７９，１９９４）。ＨＳ
Ｖ−ｔｋ遺伝子を発現する細胞はＧＣＶをリン酸化することが可能で、最終的に
はＤＮＡ複製能力に干渉する結果として細胞死をもたらす。このアプローチは、
ヒトの様々な癌の遺伝子治療に対する３０例を超える臨床試験で現在使用されて
いる（Ｒｏｓｓｅｔａｌ，１９９６；Ｈｕｍ．ＧｅｎｅＴｈｅｒ．：７，
１７８２−９０）。

【０００３】同種（Ａｌｌｏｇｅｎｅｉｃ）骨髄移植（ａｌｌｏ−ＳＣＴ）は、多くの造血
器悪性腫瘍（ｈａｅｒｍａｔｏｌｏｇｉｃａｌｍａｌｉｇｎａｎｃｉｅｓ）の
治療アプローチとして広く使用される。しかし、ａｌｌｏ−ＳＣＴの成功は多く
の要因によって制限されており、その中には免疫適格ドナー由来のＴリンパ球に
よって仲介され臨床的に移植片対宿主病（ＧｖＨＤ）とされるもの（ｃｌｉｎｉ
ｃａｌｅｎｔｉｔｙ）も含まれる。ＧｖＨＤの予防戦略としては、移植後にお
ける免疫抑制の使用および／またはｅｘｖｉｖｏもしくはｉｎｖｉｖｏでの
移植片のＴ細胞消耗除去法等がある。前者は、ＧｖＨＤの予防に部分的には効果
があるが、免疫の再構築が遅れ、それにより、重度な病的状態や死に至る可能性
がある。後者には、移植片拒絶および白血病再発率の増加が伴う。場合によって
は、ドナーリンパ細胞（ＤＬＩ；ＫｏｌｂＨＪｅｔａｌ：Ｂｌｏｏｄ８
６：２０４１，１９９５）をさらに注入することによって再発の治療に成功する
こともあるが、これらはさらに重く致命的なおそれのあるＧｖＨＤをもたらす場
合もある。

【０００４】最近、同種造血幹細胞移植後における同種異系反応性（ａｌｌｏｒｅａｃｔｉ
ｖｅ）ドナーＴ細胞の特異的かつ調整された除去（ａｂｌａｔｉｏｎ）のために
ＨＳＶ−ｔｋ／ＧＣＶシステムを用いることが提案されている（Ｂｏｒｄｉｇｎ
ｏｎＣｅｔａｌＨｕｍ．ＧｅｎｅＴｈｅｒ．６：８１３，１０９５；
ＴｉｂｅｒｇｈｉｅｎＰ，ｅｔａｌＨｕｍ．ＧｅｎｅＴｈｅｒ．８：
６１５，１９９７；Ｌｉｎｋｅｔａｌ，ＨｕｍａｎＧｅｎｅＴｈｅｒ．
１９９８，９，１１５−１３４）。これは、移植片対白血病効果（ＧｖＬ）を保
持しつつ移植片対宿主病（ＧｖＨＤ）を調整する可能性を有している。

【０００５】白血病再発およびエプスタイン−バー・ウイルスに伴うａｌｌｏ−ＳＣＴ後の
リンパ増殖性疾患の予防と管理においては、ＨＳＶ−ｔｋを発現するドナーＴ細
胞が用いられてきた。臨床研究では、これらのドナー細胞によって引き起こされ
たＧｖＨＤはＧＣＶに反応した（ＢｏｎｉｎｉＣ，ｅｔａｌＳｃｉｅｎｃ
ｅ２７６：１７１９，１９９７）。しかし、この研究では、１例の患者は、形
質導入されたドナーＴ細胞のＧＣＶ媒介消耗に対して部分的な耐性を示した。Ｈ
ＳＶ−ｔｋ形質導入された細胞のＧＣＶ耐性は、このアプローチの効果を制限す
るおそれがあるため、これは重要な問題である。この臨床観察結果は前臨床試験
で得られたデータを確認するものである。野生型のＨＳＶ−ｔｋ遺伝子を使用す
ることにより、ＧＣＶ治療後の細胞増殖阻止率は８０％から９０％の範囲に及ぶ
。多くの場合、遺伝子操作された腫瘍細胞を完全に根絶することはできない。Ｇ
ＣＶ治療に耐性の細胞はＨＳＶ−ｔｋ形質導入集団内に見出された。ある場合に
は、ＧＣＶをより多い大量に用いることで細胞死を引き起こしてきた。しかし、
ヒトにおいてはＧＣＶの毒性が累積的なため、このアプローチを臨床的な状況に
適用できないであろう。これらの新規なアプローチが引き起こした大きな期待に
もかかわらず、ＨＳＶ−ｔｋ遺伝子は、最適化された場合に、これらの制限のう
ちのいくつかを回避する助けにはなるという程度である。理想的には、ＨＳＶ−
ｔｋ／ＧＣＶシステムを用いて成果を挙げるには、効率を高め（１００％殺害率
）、効果を改善する（必要とするＧＣＶをより低い投与量にする）ことが望まし
い。そのような違いは、自殺遺伝子を臨床に用いる際の選択に影響するであろう
。

【０００６】遺伝子組換えドナーＴリンパ球に関する我々の研究中に、我々は、ＨＳＶ−ｔ
ｋ形質導入細胞のＧＣＶ耐性の少なくとも１つの原因を特定した。予想外なこと
に、レトロウイルス産生細胞では、プロウイルスに由来するｔｋｍＲＮＡの一
部がベクター由来のｍＲＮＡ中にスプライシングされるようになることがわかっ
た。これはスプライス・サイトとして機能するｔｋｍＲＮＡの中のヌクレオチ
ド配列（これらは「隠れたスプライス・サイト」と呼べるかもしれない）の存在
により、異常な形のＨＳＶ−ｔｋ遺伝子を有するウイルス粒子が少数（残りは全
長形式を含む）が生産されるためだと考えられる。このメカニズムにより、トラ
ンケートされた（ｔｒｕｎｃａｔｅｄ）プロウイルスＨＳＶ−ｔｋ遺伝子が目標
細胞へ挿入されることが説明される。我々は、スプライス・サイトが除かれ、異
常な形のチミジンキナーゼ遺伝子の産生をもたらさないチミジンキナーゼ遺伝子
の変異体を作製した。これらは、チミジンキナーゼを正確に発現する形質導入し
た目標細胞をより大きな割合でもたらす。

【０００７】生物（酵素）活性を増加させるチミジンキナーゼ遺伝子の変異体が作られてい
る。例えば、Ｋｏｋｏｒｉｓｅｔａｌ（１９９９）ＧｅｎｅＴｈｅｒａｐ
ｙ６，１４１５−１４２６は、ｉｎｖｉｔｒｏでのＧＣＶおよびアシクロビ
ル（ＡＣＶ）に対する細胞の感受性を増強する能力を備えた酵素のための変異体
ＨＳＶ−ｔｋ遺伝子の大きなライブラリの作成およびスクリーニングについて記
載している。このライブラリから得られたある特定のチミジンキナーゼ（これは
、活性部位またはその近傍において６個のアミノ酸の変化を含む）の酵素動力学
から、チミジンのＫｍが３５倍に増加し、その結果、プロドラッグとチミジンの
活動部位における競合が減少することが明らかになった。変異体はＡ１５１Ｖ、
Ｌ１５９Ｉ、Ｉ１６０Ｌ、Ｆ１６１Ａ、Ａ１６８ＹおよびＬ１６９Ｆである。Ｗ
Ｏ９５／３０００７、米国特許第５，８７７，０１０号およびＷＯ９９／１９４
６６（これらのすべては参照によって本願に組込まれる）は、酵素活動を増加さ
せたと称するＨＳＶ−ｔｋ変異体について記載している。例えば、ＷＯ９９／１９４６６は、ｔｋ変異体Ｐ１５５Ａ／Ｆ１６１Ｖ、Ｐ１
５５Ａ／Ｆ１６１Ｖ、Ｐ１５５Ａ／Ｄ１６２Ｅ、Ｉ１６０Ｌ／Ｆ１６１Ｌ／Ａ１
６８Ｖ／Ｌ１６９ＭおよびＦ１６１Ｌ／Ａ１６８Ｖ／Ｌ１６９Ｙ／Ｌ１７０Ｃに
ついて記載している。仏国特許第２７４４７３１号、ＷＯ９７／２９１９６およ
び仏国特許２７５１９８８は、ＡＴＰ結合サイト中に変異を有するＨＳＶ−ｔ
ｋ変異体に関する。ＷＯ９５／１４１０２は、遺伝子治療で使用されるｔｋをコ
ードする組換えアデノウイルスに関する。しかし、これらの文書のいずれも、チ
ミジンキナーゼＲＮＡの異常なスプライシング、またはｔｋｍＲＮＡからスプ
ライス・サイトを取り除く変異について記載していない。

【０００８】遺伝子治療においてｔｋ遺伝子を使用する方法は、ＷＯ９０／０７９３６、米
国特許第５，８３７，５１０号、米国特許第５，８６１，２９０号、ＷＯ９８／
０４２９０、ＷＯ９７／３７５４２および米国特許第５，６３１，２３６号（こ
れらは言及によって本願に組み込まれる）に開示されている。

【０００９】

【発明が解決しようとする課題および課題を解決するための手段】

本発明の第１の態様は、チミジンキナーゼのコード領域が機能的スプライス・
アクセプター・サイトおよび／またはスプライス・ドナー・サイトを含まないチ
ミジンキナーゼをコードするポリヌクレオチドを提供する。

【００１０】以下により詳細に記載するように、スプライス・ドナー・サイトおよびスプラ
イス・アクセプター・サイト（これらは「隠れた」スプライス・ドナー・サイト
またはスプライス・アクセプター・サイトと呼ぶこともできる）は、チミジンキ
ナーゼ遺伝子（またはｃＤＮＡ／ｍＲＮＡ）の天然のコード領域で識別され得る
ものであり、遺伝子操作により、これらのサイトの１つ以上を潰し、目標細胞中
で望ましくないスプライシングが起こらないようにすることができる。

【００１１】ポリヌクレオチドはＤＮＡでもＲＮＡでもよく、また、本発明でＤＮＡ分子の
中のスプライス・アクセプター・サイトまたはドナー・サイトと言う場合は、Ｒ
ＮＡに転写されたときに、所与のスプライス・アクセプター・サイトまたはドナ
ー・サイトを含むＤＮＡ分子（またはその相補鎖）の一部を意味することは明ら
かであろう。典型的には、レトロウイルス・ベクター（下記の本発明の好適実施
態様）中に存在する場合は、ポリヌクレオチドはＲＮＡであるが、、ＤＮＡ（例
えば、レトロウイルス・ベクターがプラスミドＤＮＡの形である場合、またはそ
れが形質導入された細胞のゲノムに統合される場合）、あるいは、適当な細胞中
に導入されるとＲＮＡへ転写される別のタイプのベクター中のＤＮＡでもよいこ
とは理解されるであろう。

【００１２】ポリヌクレオチドのｔｋコード領域はスプライスされないし、スプライスされ
得ない。したがって、前記コード領域の一部は除去されない。

【００１３】チミジンキナーゼは、天然のヌクレオシド基質およびヌクレオシド・アナログ
をリン酸化するサルベージ経路酵素である（Ｂａｌａｕｂｒａｍａｎｉａｍｅ
ｔａｌ（１９９０）Ｊ．ＧｅｎＶｉｒｏｌ．７１，２９７９−２９８７）。
これはチミジンキナーゼを発現する細胞を殺すことができる有毒産物を生成する
アシクロビルまたはガンシクロビルなどの比較的無毒なヌクレオシド・アナログ
をリン酸化する能力を有するため、遺伝子治療や細胞を選択的に破壊することが
望ましいその他の用途に有用である。

【００１４】ヘルペス・ウイルス科（Ｈｅｒｐｅｓｖｉｒｉｄａｅ）は、そのゲノムにおい
てチミジンキナーゼをコードする。他の単純疱疹ウイルス遺伝子の場合と同様に
、ＨＳＶ−ｔｋ遺伝子は本来イントロンがない遺伝子である（Ｂｏｒｄｏｎａｒ
ｏｅｔａｌ（１９９４）Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍ
ｍ．２０３，１２８−１３２；Ｏｔｅｒｏｅｔａｌ（１９９８）Ｊ．Ｖｉｒ
ｏｌ．７２，９８８９−９８９６；Ｌｅｅｅｔａｌ（１９９８）Ｊ．Ｃｅｌ
ｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．６９，１０４−１１６）。チミジンキナーゼはヘルペスビ
リダエ・チミジンキナーゼであることが好ましい。適当なヘルペスビリダエ（Ｈ
ｅｒｐｅｓｖｉｒｉｄａｅ）・チミジンキナーゼ酵素の代表的な例は単純疱疹ウ
イルス（ＨＳＶ）タイプ１チミジンキナーゼ、ＨＳＶタイプ２チミジンキナーゼ
、水痘ゾスター・ウィルス・チミジンキナーゼ、およびマーモセット疱疹ウイル
ス、ネコ疱疹ウイルスタイプ１、シュードラビエスウイルス（ｐｓｅｕｄｏｒａ
ｂｉｅｓｖｉｒｕｓ）、ウマ疱疹ウイルスタイプ１、ウシ疱疹ウイルスタイプ１
、七面鳥疱疹ウイルス、マレーク（Ｍａｒｅｋ）病ウイルス、疱疹ウイルス・サ
イミリ（ｓａｉｍｉｒｉ）およびエプスタイン・バー・ウイルスのチミジンキナ
ーゼを含む。チミジンキナーゼがＨＳＶタイプ１またはＨＳＶタイプ２に由来す
る場合が好ましい。

【００１５】ＨＳＶチミジンキナーゼのｃＤＮＡ配列を図１１に示す。ＨＳＶ−ｔｋタイプ
１遺伝子（ＡＴＰ：チミジン’５ホスホトランスフェラーゼ、ＥＣ２．７．１
．２１；受託番号Ｖ００４６７（ＥＭＢＬデータ・ベース））の完全な配列は、
ＭｃＫｎｉｇｈｔＳＬ（ＮｕｃｌｅｉｃＡｃｉｄｓＲｅｓ．，７７：２４
４−２４８；１９８０）およびＷａｇｎｅｒｅｔａｌ（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ
．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．７８（３）１４４１−４５；１９８０）によって記述され
た。このナンバリング・スキームによれば、実施例１のレトロウイルス・ベクタ
ーの構築に使用されるＨＳＶ−ｔｋ遺伝子配列は、５’端が５１６番の位置、３
’端が１６４６番目の位置にそれぞれ位置する。ＨＳＶ−ｔｋ遺伝子の削除され
た断片は、５’端と３’端で８４４番と１０７１番の位置の間に位置した（実施
例１、図１１）。

【００１６】スプライス・ドナー・サイトはＲＮＡ中のサイトであり、ＲＮＡの５’側に位
置し、スプライシング・プロセス中に削除され、また、切断されて、スプライス
・アクセプター・サイト内のヌクレオチド残基に再結合されるサイトを含む。し
たがって、スプライス・ドナー・サイトは、典型的にはジヌクレオチドＡＧで終
端するイントロンの端と次のエクソンの開始部位間の結合（ｊｕｎｃｔｉｏｎ）
である。

【００１７】スプライス・アクセプター・サイトはＲＮＡ中のサイトであり、ＲＮＡの３’
側に位置し、スプライシング・プロセス中に削除され、切断され、スプライス・
ドナー・サイト内のヌクレオチド残基に再結合されるサイトを含む。したがって
、スプライス・アクセプター・サイトはエクソンの端と、典型的にはジヌクレオ
チドＧＴで始まる下流のイントロンの開始部位間の結合（ｊｕｎｃｔｉｏｎ）で
ある。

【００１８】スプライシング中に削除される（すなわち「スプライス・アウトされる」）Ｒ
ＮＡの部分は典型的にはイントロンと呼ばれ、スプライシングによって連結され
るイントロンの両側の２個のＲＮＡ片は典型的にはエクソンと呼ばれる。

【００１９】スプライス・サイトを記載し、また恐らくは識別するために用いられる「コン
センサス」配列が生産されているが、コンセンサス配列には適合しないがスプラ
イス・サイトとして機能する「隠れた」スプライス・サイトが存在することはよ
く知られている。念のために言えば、本発明においては、スプライス・サイトと
いう場合、隠れたスプライス・サイトも含む。したがって、特に、本発明のポリ
ヌクレオチドは、隠れたスプライス・ドナー・サイトおよび／または隠れたスプ
ライス・アクセプター・サイトを含まない。隠れたスプライス・サイトは本物の
スプライス結合サイトに類似しており、場合によってはＲＮＡスプライシング反
応に加わることのある配列である。

【００２０】「機能的なスプライス・アクセプター・サイトを含まない」という場合、ポリ
ヌクレオチド中のコード領域（場合によっては発現ベクター）は、ポリヌクレオ
チドまたは発現ベクター中に存在するスプライス・ドナー・サイトとの組み合わ
せでスプライス・アクセプター・サイトとして機能することができるＲＮＡ（ま
たはＲＮＡもしくはその相補鎖に転写され得るＤＮＡ）の部分を含まないという
意味を含む。

【００２１】「機能的なスプライス・ドナー・サイトを含まない」という場合、ポリヌクレ
オチド中のコード領域（場合によっては発現ベクター）は、ポリヌクレオチドま
たは発現ベクター中に存在するスプライス・アクセプター・サイトとの組み合わ
せでスプライス・ドナー・サイトとして機能することができるＲＮＡ（またはＲ
ＮＡもしくはその相補鎖に転写され得るＤＮＡ）の部分を含まないという意味を
含む。

【００２２】本発明のポリヌクレオチドはｔｋのコード領域中にスプライス・アクセプター
・サイトを含んでもよいが、その場合、それはスプライス・ドナー・サイトを含
まず、コード領域部分でスプライシング・アウトは起こらない。

【００２３】ポリヌクレオチドはｔｋのコード領域にスプライス・ドナー・サイトを含んで
を含んでもよいが、その場合、それはスプライス・アクセプター・サイトを含ま
ず、コード領域部分でスプライシング・アウトは起こらない。好ましくは、ポリ
ヌクレオチドはｔｋのコード領域内にスプライス・アクセプター・サイトを含ま
ず、スプライス・ドナー・サイトを含んでいない。

【００２４】オリゴヌクレオチド部位特異的突然変異生成またはポリメラーゼ連鎖反応に基
づく方法などの標準的な突然変異生成技術を使用して、機能的なスプライス・ア
クセプター・サイトおよび／またはスプライス・ドナー・サイトを含まないチミ
ジンキナーゼをコードするコード領域は、容易に作成することができる。

【００２５】オリゴヌクレオチド部位特異的突然変異生成は、要するに、所望の変異をコー
ドするオリゴヌクレオチドを、変異させるべき領域を含む１本鎖ＤＮＡとハイブ
リダイズさせ、この１本鎖ＤＮＡをオリゴヌクレオチド伸張用のテンプレートと
して用いて変異を含むストランドを生産するものである。この技術は様々な形で
ＺｏｌｌｅｒａｎｄＳｍｉｔｈ（１９８２）Ｎｕｃｌ．ＡｃｉｄｓＲ
ｅｓ．１０，６４８７に記載されている。

【００２６】ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）は、本質的に、ｉｎｖｉｔｒｏで配列特異
的オリゴヌクレオチドを使用して、指数関数的にＤＮＡを増幅することを含んで
いる。所望であれば、オリゴヌクレオチドは配列変更を組込むことができる。ポ
リメラーゼ連鎖反応技術はＭｕｌｌｉｓａｎｄＦｕｌｏｏｎａ（１９８７）
Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚ．１５５，３３５に記載されている。ＰＣＲを使用する突然変
異生成の例はＨｏｅｔａｌ（１９８９）Ｇｅｎｅ７７，５１に記載されて
いる。

【００２７】チミジンキナーゼのコード配列するコード領域におけるスプライス・サイトの
存在は、例えば、実施例１に記載した方法を使用して決定することができる。実
施例１においてｔｋに関して、より詳細に記載するように、形質導入されたバル
ク集団をサブクローニングし、得られたサブクローンの同定を、配列分析などの
分子技術によって行なうことにより、ウイルス産生細胞のスプライシング機構に
よって認識される可能性の高いコンセンサス配列（いわゆる隠れたスプライス・
サイト）を同定することができる。これらのコンセンサス配列、特に、コード領
域中に直接位置するものまたは導入遺伝子の調節要素は、新しいベクター構築物
を設計する際、ここに述べるように１つまたは複数のスプライス・サイトを変更
することによって回避できる。

【００２８】いったんスプライス・サイト（複数可）が同定されれば、スプライス・サイト
（複数可）がもはや機能しないようにその／それらの配列を修飾することが可能
である。

【００２９】スプライス・サイトの変異は不適当なスプライシングを廃止することで容易に
示すことができる。実施例１において例証されるように、細胞がＧＣＶに曝露さ
れたとき、欠損ＨＳＶ−ｔｋ遺伝子を有するサブクローンは遺伝子の不適当な発
現を示した。³Ｈチミジンの取り込みによって評価される細胞増殖は、形質導入
されていない細胞（対照）で観察されるものと同様であった。ＧＣＶに対して耐
性を示す分子機構の同定により、形質導入されたバルク集団内の欠損ＨＳＶ−ｔ
ｋ遺伝子を特定的に増幅するＰＣＲを開発することができた。主要なヒトのＴ細
胞もＣＥＭ（正常なヒトＴ細胞株）と同様にスプライス修正されたＨＳＶ−ｔｋ
遺伝子（つまり、スプライス・サイトが変異生成により除去された遺伝子）を有
するベクターを使用して形質導入した。これらの集団で実行されたＰＣＲ分析は
、トランケートされた（ｔｒｕｎｃａｔｅｄ）ＨＳＶ−ｔｋ遺伝子に予想される
バンドを増幅しなかった。形質導入されたバルク集団は、修正済でないＨＳＶ−
ｔｋ遺伝子のために行なったのと同じ方法でサブクローニングした。修正済でな
いＨＳＶ−ｔｋ遺伝子を備えたクローンは、いずれも、分析により、ＨＳＶ−ｔ
ｋ配列の位置８４２番および１０７０番で予期された削除を示した。

【００３０】したがって、本発明のさらなる実施形態は、本発明の第１の実施形態によるポ
リヌクレオチドを作製する方法、すなわち、（１）チミジンキナーゼのコード領
域が機能的なスプライス・アクセプター・サイトおよび／またはドナー・サイト
を含んでいるかを決定すること、（２）含む場合には、スプライス・アクセプタ
ー・サイトおよび／またはドナー・サイトの少なくとも１つを変化させてそれら
を非機能性にすることを含む方法を提供する。典型的には、ステップ（１）は、
スプライシング・イベントがコード領域内のスプライス・サイトを使用して生じ
たことをｍＲＮＡが示すかどうか決めるために、天然のコード領域の少なくとも
一部から転写されたｍＲＮＡを分析することを含む。これは本願に記載するよう
なＰＣＲ方法を使用して適宜実行してもよい。典型的には、ステップ（２）にお
ける変異は、例えば、不一致のオリゴヌクレオチドを使用することにより、部位
特異的変異生成を使用して導入される。

【００３１】本発明の好ましい実施形態では、スプライス・サイト（複数可）が、同じアミ
ノ酸残基をコードする縮退コドンにコドンが変更されるような遺伝暗号に着目し
て修正される。このように、野生型蛋白質をコードするが機能的なスプライス・
アクセプター・サイトおよび／またはスプライス・ドナー・サイトを含まない、
興味のある蛋白質をコードする領域を作成することが可能である。

【００３２】本発明のさらなる好適実施形態では、チミジンキナーゼをコードする領域は、
野生型に比べて酵素活性を増強する変異を含む酵素をコードするように修正され
る。

【００３３】チミジンキナーゼの変異体は例えば、Ｋｏｋｏｒｉｓｅｔｄｌ（１９９９
）ＧｅｎｅＴｈｅｒａｐｙ６，１４１５−１４２６、ＷＯ９５／３０００７
、米国特許第５，８７７，０１０号、ＷＯ９９／１９４６６、仏国特許第２７４
４７３１号、ＷＯ９７／２９１９６および仏国特許第２７５１９８８号（これら
のすべては参照によって本願に組込まれる）に記載されている。したがって、本
発明は、チミジンキナーゼをコードするポリヌクレオチドおよび発現ベクターを
含み、ここでチミジンキナーゼをコードする領域は機能的なスプライス・アクセ
プター・サイトおよび／またはスプライス・ドナー・サイトを含まず、野生型と
比較して、酵素活性が増強する変異を含むチミジンキナーゼをコードする。特に
好ましい変異は、前記論文並びに特許出願および特許に記載されている変異であ
る。

【００３４】本発明のポリヌクレオチドはチミジンキナーゼをコードする領域のみを含むも
のでもよいことが理解されるであろう。しかし、ポリヌクレオチドがさらに目標
細胞内のコード配列の効率的な翻訳を可能にする核酸部分を、操作可能なリンケ
ージ中に含む場合が好ましい。さらに、ポリヌクレオチド（ＤＮＡの形である場
合）が、コード領域の転写、および目標細胞のコード領域の効率的な翻訳を可能
にする核酸部分を含むプロモーターを操作可能なリンケージ中にさらに含む場合
が好ましい。プロモーターは、ＲＮＡポリメラーゼが結合して転写が起こること
を可能にするＤＮＡ配列によって形成された発現制御要素である。

【００３５】ポリヌクレオチドは、発現ベクター（これは、次いで、チミジンキナーゼの発
現および生産のための適切な宿主または目標細胞を形質転換するために使用され
る）を構築するため、本願による教示を考慮して適切に修正された既知の技術に
従って使用してもよい。こうした技術は、１９８４年４月３日にＲｕｔｔｅｒら
に対して発行された米国特許第４，４４０，８５９号、１９８５年７月２３日に
Ｗｅｉｓｓｍａｎに対して発行された米国特許第４，５３０，９０１号、１９８
６年４月１５日にＣｒｏｗｌに対して発行された米国特許第４，５８２，８００
号、１９８７年６月３０日にＭａｒｋらに対して発行された第４，６７７，０６
３号、１９８７年７月７日にＧｏｅｄｄｅｌに対して発行された米国特許第４，
６７８，７５１号、１９８７年１１月３日にＩｔａｋｕｒａらに対して発行され
た米国特許第４，７０４，３６２号、１９８７年１２月１日にＭｕｒｒａｙらに
対して発行された米国特許第４，７１０，４６３号、１９８８年７月１２日にＴ
ｏｏｌｅ，Ｊｒ．らに対して発行された米国特許第４，７５７，００６号、１９
８８年８月２３日にＧｏｅｄｄｅｌらに対して発行された米国特許第４，７６６
，０７５号および１９８９年３月７日にＳｔａｌｋｅｒに対して発行された米国
特許第４，８１０，６４８号（これらはすべて言及によって本願に組込まれる）
の開示に含まれている。

【００３６】ポリヌクレオチド（典型的にはＤＮＡの形）は、適切な宿主中に導入するため
に種々様々の他のＤＮＡ配列に結合してもよい。相手ＤＮＡは、宿主の性質、宿
主中へのＤＮＡの導入方法、またエピゾームの維持あるいは統合のいずれが望ま
れるかに依存する。

【００３７】一般に、ポリヌクレオチド（ＤＮＡ）は、発現のための適切な方向および正確
なリーディング・フレームで、レトロウイルス・ベクター・プラスミドなどの発
現ベクターに挿入される。必要ならば、ＤＮＡは、所望の宿主によって認識され
る適切な転写と翻訳を調節制御するヌクレオチド配列に結合させてもよい（但し
、このような制御は一般には発現ベクターによって得られる）。その後、ベクタ
ーは標準的技術によって宿主（または目標細胞）内に導入される。一般に、宿主
または目標細胞は、すべてベクターによって形質転換されるとは限らない。した
がって、形質転換された宿主または目標細胞のために選択することが必要であろ
う。１つの選択技術は、発現ベクターを、任意の必要な制御要素と共に、形質転
換された（または形質導入された）細胞の選択可能な特性（抗生物質耐性など）
をコードするＤＮＡ配列に組み込むことを含む。あるいは、そのような選択可能
な特性の遺伝子は、所望の宿主細胞を同時形質転換（または同時形質導入）する
ために使用される別のベクター上にあってもよい。興味のある蛋白質がｔｋであ
る場合、ｔｋの存在は、例えば、ｔｋ酵素活動の測定により、またはｔｋ発現を
免疫学的に検知することにより形質転換された細胞において検知することができ
る。新たに合成されるＤＮＡ中に³Ｈ−チミジンを取り込ませることにより評価
される細胞増殖の阻害を測定することにより、ＨＳＶ−ｔｋ遺伝子の発現を適宜
決定してもよい。

【００３８】したがって、本発明の第２の態様は、本発明の第１の態様のポリヌクレオチド
を含む発現ベクターを提供する。発現ベクターは、ｔｋが目標細胞によって取り
込まれ、かつコード領域が転写され翻訳されることを可能にするベクターである
。本発明においては、目標細胞は典型的には、スプライシングを行なうことがで
きる細胞である。好ましくは、細胞は哺乳類の細胞であり、より好ましくはヒト
の細胞である。したがって、本発明の好適実施形態は、哺乳類細胞、特にヒトの
細胞で、ｔｋの効率的な発現を可能にする発現ベクターである。

【００３９】本発明のベクターは、遺伝子治療に用いるのに適合したものとするのが適当で
ある。典型的には、ベクターは好ましくは哺乳類の細胞、好ましくはヒトの細胞
中での発現を可能にするものである。ベクターが、破壊することが望まれる細胞
を選択的に目標とすることができるものである場合が特に好ましい。ベクターが
目標とする細胞タイプで選択的に働くプロモーター配列の使用により、目標細胞
中での選択的な発現を可能にするものである場合がさらに好ましい。これらの実
施形態は以下により詳細に記述される。

【００４０】発現ベクターはウイルスのベクターが便利であり、特に、ベクターがレトロウ
イルス・ベクターであることが好ましい。しかし、本発明のポリヌクレオチド、
発現ベクターおよび方法は、レトロウイルス、アデノウイルス、レンチウイルス
その他、当業者には知られたウイルスなど伝染性のウイルス粒子の合成の間にウ
イルス生産細胞のスプライシング機構が干渉し得る発現ベクターを含む。したが
って、本発明は、ベクター由来のプレＲＮＡが宿主細胞のスプライシング機構に
よって認識され続いて処理されることにより導入遺伝子の不適当な発現（すなわ
ち、興味のある蛋白質）をもたらすことができる任意の発現ベクターに関する。

【００４１】本発明のポリヌクレオチドおよび発現ベクターは、任意の適切な方法によって
作製することができる。例えば、操作しやすく相補的な粘着末端を介してＤＮＡ
をベクターに操作可能にリンクするために様々な方法が開発されている。例えば
、相補的なホモポリマー領域（ｔｒａｃｔ）を、組換えベクターＤＮＡに挿入す
べきＤＮＡセグメントに加えることができる。その後、ベクターとＤＮＡセグメ
ントは、相補的ホモポリマー尾部間の水素結合によって連結されて組換えＤＮＡ
分子を形成する。

【００４２】１つ以上の制限部位を含む合成リンカーは、ベクターにＤＮＡセグメントをつ
なぐ別の方法を提供する。前述のエンドヌクレアーゼ制限消化によって生成され
たＤＮＡセグメントは、バクテリオファージＴ４ＤＮＡポリメラーゼまたは大
腸菌ＤＮＡポリメラーゼＩ酵素で処理される。これらはその３’−５’−エクソ
ヌクレアーゼ活性によって、突出部分、３’−１本鎖端を除去し、後退した３’
−端をそのポリメラーゼ活性で満たす。

【００４３】したがって、これらの活性の組み合わせは平滑末端ＤＮＡセグメントを生成す
る。その後、平滑末端セグメントを、バクテリオファージＴ４ＤＮＡリガーゼ
などの平滑末端ＤＮＡ分子のライゲーションに触媒作用を及ぼすことができる酵
素の存在下で過剰モル量のリンカー分子をインキュベートする。したがって、反
応産物はそれらの端に重合性リンカー配列を担持するＤＮＡセグメントである。
その後、このＤＮＡセグメントを適当な制限酵素で開裂させておいて、ＤＮＡセ
グメントの端部と適合する端部を生成する酵素により発現ベクターにライゲート
する。

【００４４】様々な制限エンドヌクレアーゼ・サイトを含む合成リンカーが多数の発売元（
たとえば、ＩｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓＩ
ｎｃ，ＮｅｗＨａｖｅｎ，ＣＮ，ＵＳＡ）から市販されている。

【００４５】本発明のポリペプチドをコードするＤＮＡを修正する望ましい方法は、Ｓａｉ
ｋｉｅｔａｌ（１９８８）Ｓｃｉｅｎｃｅ２３９，４８７−４９１によっ
て示されるようなポリメラーゼ連鎖反応を使用するものである。

【００４６】この方法では、２つの特異的オリゴヌクレオチドプライマーが酵素で増幅され
るＤＮＡに隣接し、これらのプライマー自体は、増幅されたＤＮＡに組み入れら
れる。前記特異的プライマーは、当業者に知られた方法を用いて発現ベクター中
にクローニングするために使用することができる制限酵素認識サイトを含んでい
てもよい。

【００４７】本発明のポリヌクレオチドまたは本発明の発現ベクターは、Ｓａｍｂｒｏｏｋｅｔａｌ（１９８９）．Ｍｏｌｅｃｕｌａｒｃｌｏｎｉｎｇ，ｌａｂ
ｏｒａｔｏｒｙｍａｎｕａｌ，２^nd ｅｄｉｔｉｏｎ，ＣｏｌｄＳｐｒｉｎ
ｇＨａｒｂｏｒＰｒｅｓｓ，ＣｏｌｄＳｐｒｉｎｇＨａｒｂｏｒ，Ｎｅ
ｗＹｏｒｋに記載されているものなど、当業者にはよく知られた分子生物学的
技術を使用して、容易に作製し得ることが理解されるであろう。

【００４８】本発明の第３の態様は、本発明の第１の態様のポリヌクレオチドまたは本発明
の第２の態様の発現ベクターを含む宿主細胞を提供する。

【００４９】宿主細胞は、ポリヌクレオチドまたは発現ベクターを増殖するために使用され
る細胞であり、これにより、ポリヌクレオチドや発現ベクターをさらに使用する
ために十分な量を作成することができる。例えば、宿主細胞はＤＮＡを生産する
ために使用されるバクテリアの細胞（例えば、大腸菌）でもよい。したがって、
例えば、レトロウイルス・ベクターのプラスミドＤＮＡ形式は大腸菌中で生産で
きる。

【００５０】宿主細胞は、当業者にはよく知られたレトロウイルス・パッケージング細胞株
のようなウイルスをパッケージにし増殖させるための細胞でもよい。

【００５１】宿主細胞は、破壊が望まれる動物または患者（ヒトでも動物でもよい）の細胞
でもよい。以下、より詳細に論じるように、本発明のポリヌクレオチドおよびベ
クターは、破壊しようとする細胞を標的とすること、および実質的に無毒だがｔ
ｋによって毒性の形に変換される薬剤と接触させるべき細胞（それらはある条件
の下のｔｋを発現する）に有用である。

【００５２】本発明の組換えＤＮＡまたはＲＮＡによって形質転換された宿主細胞は、当業
者にはよく知られた方法を使用して作成することもできる。

【００５３】本発明の第４の態様は、本発明の第１の態様のポリヌクレオチドまたは本発明
の第２の態様の発現ベクターを含み、さらに薬剤として許容される担体を含む医
薬組成物を提供する。

【００５４】薬剤として許容される担体は、本発明のポリヌクレオチドまたは発現ベクター
の物理的および生物学的形態と適合するようにこれらの形態に従って選択される
。典型的には、それは無菌であり発熱物質を含まない。ベクターがウイルス・ベ
クターである場合、典型的には、医薬組成物は、低濃度の非イオン性洗剤または
蛋白質（例えば、血清アルブミン）などのウイルスを安定させる何らかの薬剤を
含んでもよい。その処方は、単位投薬形式で提供されるのが便利であるが、遺伝
子治療や薬学ではよく知られた方法のいずれかによって準備できるものでもよい
。そのような方法は、ポリヌクレオチドまたは発現ベクターを担体（これは１種
または複数の補助成分となる）と結合させるステップを含んでいる。

【００５５】非経口投与にふさわしい処方は、水ならびに抗酸化剤、バッファ、静菌剤およ
び意図するレシピエントの血液と等張にするための溶質を含んでもよい非水性の
無菌注射用溶液；ならびに、懸濁剤および増粘剤を含んでもよい水性または非水
性の無菌懸濁液である。処方は例えば単位服用量または多数回分服用量容器、例
えば、密封アンプルおよびバイアルとして提供することができ、また、使用直前
に、注射用の水などの無菌の液体の担体の追加だけを必要とするフリーズドライ
（凍結乾燥）状態に保存してもよい。前述したタイプの無菌粉末、顆粒および錠
剤から即席の注入溶液および懸濁液を調製することもできる。

【００５６】好ましい単位投薬処方は、活性成分を、１日当たり服用量または単位を含むも
の、１日数回の各服用量またはこれらを適当に分けたものである。

【００５７】本発明の第５の態様は、本発明の第１の態様のポリヌクレオチドまたは本発明
の第２の態様の発現ベクターを医学での使用のために供給する。すなわち、ポリ
ヌクレオチドまたは発現ベクターはパッケージ化され、医学用に提供される。

【００５８】本発明のポリペプチドと発現ベクターは、破壊する標的細胞を持っている患者
（特にヒトの患者）の治療において有用である。

【００５９】本発明の第６の態様は、細胞の破壊方法を提供するが、これは、本発明の第１
の態様によるポリヌクレオチドまたは本発明の第２の態様による発現ベクターを
細胞内に導入すること、細胞にチミジンキナーゼを発現させること、実質的に無
毒であるがチミジンキナーゼによって毒性の薬剤に変換される薬剤と細胞を接触
させることを含む。ポリヌクレオチドまたは発現ベクターの細胞内への導入およ
び実質的に無毒な薬剤に細胞を接触させることは任意の順番でよい。

【００６０】細胞の破壊は、培養中の細胞などｉｎｖｉｔｒｏで行なってもよいし、動物
（ヒトを含む）の一部である細胞でもよい。様々な理由から細胞を破壊すること
が望ましい場合がある。例えば、細胞が癌細胞であるかそうなる可能性を有する
ために細胞を破壊することが望ましい場合がある。さらなる実施形態としては、
産生が望まれない細胞株の前駆細胞であるために細胞を破壊することが望ましい
場合がある。例えば、細胞は実験系で使用している動物の幹細胞でもよい。幹細
胞に由来する細胞株が産生されない場合に幹細胞を破壊することができる。

【００６１】ポリヌクレオチドまたは発現ベクターは、標的細胞によって取り込まれるよう
に、細胞に接触させる。いったん細胞に入った後は、ポリヌクレオチドまたは発
現ベクターに由来する遺伝物質は、安定して細胞のゲノムに統合されてもよいし
、あるいは、エピゾームとして維持されてもよい。いずれの方法でも、また、ど
のような場合でも、細胞はチミジンキナーゼを発現する（但し、システムによっ
ては、これは細胞が刺激にさらされているか否かに依存する場合もある。下記参
照）。標的細胞（それらはチミジンキナーゼを発現している）を殺すために、そ
れらを実質的に無毒であるがチミジンキナーゼによって毒性の薬剤に変換される
薬剤と接触させる。

【００６２】本発明の第７の態様は、破壊を必要とする細胞を持つ患者を治療する方法を提
供するものであり、これは、本発明の第１の態様によるポリヌクレオチドまたは
本発明の第２の態様による発現ベクターを患者に導入すること、ポリヌクレオチ
ドまたは発現ベクターを細胞に取り込ませること、細胞にチミジンキナーゼを発
現させること、および、実質的に無毒であるがチミジンキナーゼによって毒性の
薬剤に変換される薬剤を患者に投与することを含む。実質的に無毒であるがチミ
ジンキナーゼによって毒性の薬剤に変換される薬剤は、ポリヌクレオチドまたは
発現ベクターの導入前、導入の間、またはその導入の後に投与してもよい。

【００６３】好ましくは、遺伝的構築体（これによって、我々は本発明のポリヌクレオチド
または発現ベクターを意味する）は細胞、好ましくはヒトの細胞への送達に適し
たものにする。より好ましくは、遺伝的構築体は、動物の体、より好ましくは哺
乳類の体への送達に適したものにする。最も好ましくは、遺伝的構築体を、人体
の細胞への送達に適したものにする。

【００６４】遺伝的構築体を動物の体中の細胞に導入する手段および方法は、当該分野では
知られている。例えば、本発明の構築体を、適宜な方法、例えばレトロウイルス
を含む方法により標的細胞中に導入するものでもよく、これによって構築体を腫
瘍細胞のゲノムに挿入する。例えば、Ｋｕｒｉｙａｍａｅｔａｌ（１９９１
）ＣｅｌｌＳｔｒｕｃ．ａｎｄＦｕｎｃ．１６，５０３−５１０では、精製
されたレトロウイルスが投与された。レトロウイルスは癌細胞を選択的に感染さ
せることが可能な手段である。なぜなら、レトロウイルスは分裂中の細胞におい
てのみゲノムと一体になることができるが、癌を取り囲むほとんどの正常な細胞
は、細胞成長の静止状態、つまり、受容力がない段階にあるか、または腫瘍細胞
ほどには急速に分裂していないからである。適当なプロモーターセグメントおよ
びここに述べるようなチミジンキナーゼをコードするポリヌクレオチドを含むレ
トロウイルスＤＮＡ構築体は、当業者にはよく知られた方法を使用して作製され
るものでもよい。このような構築体から活性なレトロウイルスを産生するために
は、両種性（ａｍｐｈｏｔｒｏｐｈｉｃ）パッケージング細胞株が通常使用され
る。細胞株のトランスフェクションはリン酸カルシウム共沈殿物により行なうの
が便利であり、最終的濃度が１ｍｇ／ｍｌとなるようにＧ４１８を添加すること
によって安定な形質転換体が選択される（レトロウイルスはｎｅｏ^R遺伝子を含
んでいるものとする）。独立した形質導入コロニーを分離し、選択および展開し
、培養上清を取り出し、孔サイズ０．４５μｍのフィルターでろ過し、−７０℃
で保存した。腫瘍細胞中にレトロウイルスをｉｎｖｉｔｒｏで導入するために
は、１０μｇ／ｍｌのポリブレン（Ｐｏｌｙｂｒｅｎｅ）を腫瘍細胞に加えて、
レトロウイルス上清をインキュベートするのが便利である。レトロウイルスを腫
瘍にｉｎｓｉｔｕで導入するためには、腫瘍領域にレトロウイルス上清を注入
するのが通常である。直径１０ｍｍを超える腫瘍については、適当な力価のレト
ロウイルス上清０．１ｍｌ〜１ｍｌ、好ましくは０．５ｍｌを注入するのが適切
である。

【００６５】あるいは、Ｃｕｌｖｅｒｅｔａｌ（１９９２）Ｓｃｉｅｎｃｅ２５６，
１５５０−１５５２に記載されているように、レトロウイルスを産生する細胞を
腫瘍などの標的細胞部位に注入する。このように導入したレトロウイルス産生細
胞は、レトロウイルス・ベクター粒子を活発に生産するように遺伝子操作されて
いるため、腫瘍塊内においてｉｎｓｉｔｕでベクターの連続的生産が起こる。
したがって、レトロウイルス・ベクターを生産する細胞と混じり合うと、腫瘍細
胞などの増殖する標的細胞は成功裡にｉｎｖｉｖｏで形質導入することができ
る。したがって、「本発明の第１の態様によるポリヌクレオチドまたは本発明の
第２の態様による発現ベクターを患者に導入する」というとき、我々は、ここに
述べるようなレトロウイルス生産細胞を患者に導入することを含む。

【００６６】本発明では、また、標的とされたレトロウイルスも利用可能である。例えば、
特定の拘束親和性を付与する配列を、既存のウイルスｅｎｖ遺伝子に遺伝子操作
で組み込むことができる（遺伝子治療のためのこのまたは他の標的とされたベク
ターに関してはＭｉｌｌｅｒ＆Ｖｉｌｅ（１９９５）ＦａｓｅｂＪ．９，１９
０−１９９参照）。レトロウイルス・ベクターの屈性（ｔｒｏｐｉｓｍ）は外来
またはハイブリッドのエンベロープ蛋白質を組み込むことで変更できる（Ｂａｔ
ｔｉｎｉＪＬ，ｅｔａｌＪ．Ｖｉｒｏｌ．６６：１４６８−１４７５；１
９９２）。これは、単クローン抗体をマウスの自己指向性（ｅｃｏｔｒｏｐｉｃ
）レトロウイルス粒子に挿入することで実現できる。あるいは、ウイルス粒子に
結合するラクトースなどの化学的修飾も、形質導入の可能な標的細胞の範囲を増
加させ、または予測可能に変更された認識特異性を付与することができる。非ウ
イルス性ポリペプチドを提示するレトロウイルス粒子は、非ウイルス部分によっ
て特定の標的細胞用に使用することができる。

【００６７】他の方法は、遺伝的構築体を単純に細胞内に送達し、限定された時間またはゲ
ノムへの統合後、より長い時間、そこで発現させる。後者のアプローチの例は（
好ましくは腫瘍細胞標的とされた）リポソームを含む（Ｎａｓｓａｎｄｅｒｅ
ｔａｌ（１９９２）ＣａｎｃｅｒＲｅｓ．５２，６４６−６５３）。

【００６８】イムノリポソーム（ｉｍｍｕｎｏｌｉｐｏｓｏｍｅ）（抗体特異的リポソーム
）は、その抗体が利用可能な細胞表面蛋白質を過剰発現している癌細胞のタイプ
を標的とする場合には特に有用である（例に関しては表を参照）。イムノリポソ
ームの調製のために、ＭＰＢ−ＰＥ（Ｎ−［４−（ｐ−マレイミドフェニル）−
ブチリル］−ホスファチジルエタノールアミン）を、Ｍａｒｔｉｎ＆Ｐａｐａｈ
ａｄｊｏｐｏｕｌｏｓ（１９８２）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２５７，２８６−
２８８の方法によって合成する。ＭＰＢＰＥはリポソームの二分子層に組み入れ
られ、リポソーム表面への抗体、またはそれの断片の共有結合を可能にする。リ
ポソームに、本発明のＤＮＡまたは他の遺伝的構築体を結合させ標的細胞に送達
させるのが便利である。これは、例えば、ＤＮＡまたは他の遺伝的構築体溶液中
で前記リポソームを形成し、０．８ＭＰａ以下の窒素圧力の下、孔サイズが０．
６μｍと０．２μｍのポリカーボネート膜フィルタを通して連続押し出しする。
押出し後、８００００×ｇ、４５分の超遠心分離でトラップしたＤＮＡ構築体を
遊離ＤＮＡから分離する。酸素が除去されたバッファ中、調製したばかりのＭＰ
Ｂ−ＰＥ−リポソームを新たに調製した抗体（またはそれの断片）と混合し、４
℃の窒素雰囲気下、一定のエンド・オーバー・エンド回転を一夜続けつつ結合反
応を行なう。８００００×ｇ、４５分の超遠心分離によって、イムノリポソーム
を結合していない抗体から分離する。イムノリポソームは、腹腔内に注入しても
よいし、腫瘍に直接に注入してもよい。

【００６９】イムノリポソームを使用してもよいが、標的細胞に結合可能なペプチド部分を
含むことにより細胞を標的とするリポソームを使用することも可能である。この
ようなペプチド部分は、標的細胞上で選択的に発現（または過剰発現）され得る
受容体用リガンドを含む。

【００７０】また、ＤＮＡは、例えば、下記のように、ＤＮＡをアデノウイルス粒子内に存
在させることによりアデノウイルスによって送達してもよい。

【００７１】送達の他の方法は、抗体ポリリシンブリッジ（ＣｕｒｉｅｌＰｒｏｇ．Ｍｅ
ｄ．Ｖｉｒｏｌ．４０，１−１８参照）を介し、およびトランスフェリン−ポリ
カチオン結合体を担体とすることによって外来ＤＮＡを運ぶアデノウイルスを含
む（Ｗａｇｎｅｒｅｔａｌ（１９９０）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．
Ｓｃｉ．ＵＳＡ８７，３４１０−３４１４）。これらの方法のうち最初のもの
は、ポリカチオン−抗体複合体を本発明のＤＮＡ構築体その他の遺伝的構築体と
ともに形成し、ここで抗体は、野生型のアデノウイルスまたは抗体に結合する新
しいエピトープが導入された変種アデノウイルスのいずれかに特異的である。ポ
リカチオン部分は静電気的相互作用によってＤＮＡをリン酸塩骨格に結合する。
ポリカチオンがポリリシンである場合が好ましい。

【００７２】これらの方法の２番めでは、細胞内にＤＮＡ巨大分子を運ぶために受容体を媒
介としたエンドシトーシスを用いる高い効率の核酸送達システムが使用される。
これは、鉄輸送の蛋白質トランスフェリンを核酸に結合するポリカチオンに結合
（ｃｏｎｊｕｇａｔｅ）させることにより遂行される。ヒト・トランスフェリン
、またはニワトリのホモローグであるコンアルブミン（ｃｏｎａｌｂｕｍｉｎ）
、またはこれらの組み合わせを小さなＤＮＡ結合性蛋白質プロタミンまたは様々
なサイズのポリリシンにジスルフィド結合によって、共有結合させる。これらの
修飾されたトランスフェリン分子は、それらの同系統の受容体に結合し、細胞内
に効率的に鉄輸送を仲介するその能力を維持する。トランスフェリン−ポリカチ
オン分子は、核酸サイズに関わらず（短いオリゴヌクレオチドから２１キロ塩基
対のＤＮＡまで）本発明のＤＮＡ構築体または本発明のその他の遺伝的構築体と
電気泳動に対して安定した複合体を形成する。トランスフェリン−ポリカチオン
とＤＮＡ構築体その他の遺伝的構築体との複合体を腫瘍細胞に供給する場合には
、細胞内において構築体からの高レベルの発現が期待される。

【００７３】受容体を媒介とした本発明のＤＮＡ構築体またはＣｏｔｔｅｎｅｔａｌ（
１９９２）Ｐｒｏｃ．ＮａｔＩ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ８９，６０９４−
６０９８の方法によってつくり出した、不完全なまたは化学上不活性化されたア
デノウイルス粒子のエンドソーム混乱（ｅｎｄｏｓｏｍｅ−ｄｉｓｒｕｐｔｉｏ
ｎ）活性を使用するその他の遺伝的構築体の高効率の送達を使用してもよい。こ
のアプローチは、例えば、本発明のＤＮＡ構築体またはその他の遺伝的構築体と
結合したトランスフェリンの存在下に、エンドソームからそれらのＤＮＡをリゾ
ソームを通すことなしに放出させるようにアデノウイルスが適応され、アデノウ
イルス粒子と同じ経路で細胞により構築体が取り込まれるという事実によると思
われる。

【００７４】このアプローチは、複雑なレトロウイルス・構築体を用いる必要がない、レト
ロウイルス感染の場合のようにゲノムが永久的に修正されることがない、また、
標的とされた発現システムが標的とされた送達システムと結び付けられ、このた
め、他の細胞タイプへの毒性が低減するという長所を有する。

【００７５】標的細胞が腫瘍中にある場合、遺伝的構築体を含む適当な送達用担体を、一定
時間、腫瘍に局所的に潅流し、さらに、あるいはまたは、送達用担体または遺伝
的構築体をアクセス可能な腫瘍に直接注入することが望ましい。

【００７６】標的に対する別の送達システムとしては、さらにＷＯ９４／１０３２３に記
載された修正されたアデノウイルス・システムも知られている。この方法では、
典型的には、ＤＮＡはアデノウイルス内、またはアデノウイルス状粒子によって
運ばれる。Ｍｉｃｈａｅｌｅｔａｌ（１９９５）ＧｅｎｅＴｈｅｒａｐｙ
２，６６０−６６８は、繊維状蛋白質に細胞選択的部分を加えるアデノウイル
スの修正について記載している。Ｂｉｓｃｈｏｆｆｅｔａｌ（１９９６）Ｓ
ｃｉｅｎｃｅ２７４，３７３３７６に記載されたものなど、ｐ５３−欠損ヒト
腫瘍細胞中で選択的に増殖する変異体アデノウイルスは、本発明の遺伝的構築体
を細胞に送達するのに役立つ。したがって、本発明のさらなる実施形態が、本発
明の遺伝的構築体を含むウイルスまたはウイルス状粒子を提供することは理解さ
れるであろう。他の適当なウイルスまたはウイルス状粒子は、ＨＳＶ、ＡＡＶ、
牛痘およびパーボウイルス病を含む。

【００７７】本発明の第１および第２の態様では、ポリヌクレオチドまたは発現ベクターが
、チミジンキナーゼの発現を駆動する標的細胞選択的プロモーターを有するもの
である必要はないが、選択性を与えるためそれがある場合が好ましいということ
は理解されるであろう。

【００７８】標的細胞選択的なプロモーターは、本発明のポリヌクレオチド、発現ベクター
および方法を腫瘍治療に使用する場合は、腫瘍細胞選択的なプロモーターである
。さらに、他の適用例では他のタイプの標的細胞選択的プロモーターも有用であ
る。

【００７９】本発明のポリヌクレオチド、発現ベクターおよび方法が治療の遺伝生成物が、
所望の標的細胞中でのみ治療用遺伝的産物がつくられることを保証するために使
用される場合は、標的細胞選択的なプロモーターは好ましくは、細胞選択的なプ
ロモーターである。これは、転写制御要素または組織特異的プロモーターを使用
することにより遺伝子発現を制限することにより達成することができる。遺伝子
のプロモーター領域内に存在する特定の調節要素を認識する転写因子の可用性（
すなわち、存在または欠如）によって遺伝子発現を調節することができる。組織
特異的発現を付与する調節要素は、ベクター本体内またはウイルス・プロモータ
ーもしくは調節要素に加え、あるいはそれに代えてウイルス・ベクター内に含め
ることができる。組織特異的遺伝子発現は造血幹細胞の形質導入の中で要求され
てもよい（目標が区別された細胞血統（例えば、赤血球、Ｔ細胞またはマクロフ
ァージ）中でのみ治療遺伝子を発現する）ことである場合（Ｇｒａｎｄｅ−Ａ
ｅｔａｌＢｌｏｏｄ１９９９，１５；９３：３２７６−８５））。特定の
組織で特異的にまたは優先的に発現する遺伝子から単離された利用可能な多くの
プロモーターが存在する（Ｈｕｂｅｒｅｔａｌ１９９１；Ｐｒｏｃ．Ｎａ
ｔｌ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ８８：８０３９−４３；Ｈａｆｅｎｒｉｃｈｔｅｒｅ
ｔａｌ，１９９４；Ｂｌｏｏｄ８４：３３９４３４０４）。

【００８０】宿主細胞ゲノム中の発現ベクター統合部位によっては、プロモーターに与えら
れた組織特異的調節機能が、統合部位近傍に位置する強い細胞調節要素によって
乗り越えられ無視されるかもしれない。場所によらず高レベルの導入遺伝子発現
を実現するためには、遺伝子座制御領域（ＬＣＲ：ｌｏｃｕｓｃｏｎｔｒｏｌ
ｒｅｇｉｏｎ）と名付けられたＤＮＡ配列を使用することができる（Ｄｉｌｌ
ｏｎａｎｄＧｒｏｖｅｌｄ，１９９３；ＴｒｅｎｄｓＧｅｎｅｔ．９：１
３４−７）。

【００８１】発現ベクター中の遺伝子の位置独立的発現を保証する別の戦略は、統合部位近
傍に位置するエンハンサーやレプレッサーの影響からこれら遺伝子を保護するこ
とである（Ｄｕｃｈｅｔａｌ，１９９４；Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．６８：５５９６
−５６０１）。このようなインシュレーター（ｎｓｕｌａｔｏｒ）は、哺乳類お
よび哺乳類以外の細胞中で多数のものが識別されており、これらは将来のベクタ
ー設計統合サイトにこれらを組み入れることができるであろう（Ｋａｌｏｓａ
ｎｄＦｏｕｒｎｉｅｒ，１９９５；Ｍｏｌ．ＣｅｌｌＢｉｏｌ．１５：１９
８−２０７；Ｒｏｓｅｍａｎｅｔａｌ，１９９５；Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ
，１２１：３５７３−３５８２）。

【００８２】細胞選択的なプロモーターである有用な遺伝的要素は、以下のものであるが、
新しいものが常に発見されており、それらも本発明のこの実施形態において有用
であろう。

【００８３】チロシナーゼおよびＴＲＰ−１遺伝子は両者とも、メラニン色素、メラニン細
胞の特定の産物の合成に重要な役割を果たす蛋白質をコードする。チロシナーゼ
およびチロシナーゼ関連蛋白質（ＴＲＰ−１）遺伝子の５’端は、これらのプロ
モーター要素の下流にクローン化された遺伝子に対し発現上の組織特異性を付与
する。

【００８４】これらの遺伝子の５’配列はＢｒａｄｌ，Ｍ．ｅｔａｌ（１９９１）Ｐｒｏ
ｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ８８，１６４−１６８およびＪａ
ｃｋｓｏｎ，Ｉ．Ｊ．ｅｔａｌ（１９９１）ＮｕｃｌｅｉｃＡｃｉｄｓＲ
ｅｓ．１９，７９９−３８０４に記載されている。

【００８５】前立腺特異的抗原（ＰＳＡ）はヒトの前立腺分泌物中の主要な蛋白質要素のう
ちの１つである。これは前立腺癌の検知およびモニタリングのための有用なマー
カーになっている。ＰＳＡをコードする遺伝子およびＰＳＡの前立腺特異的発現
を指図するそのプロモーター領域が記載されている（Ｌｕｎｄｗａｌｌ（１９８
９）Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍ．１６１，１１５１−
１１５９；Ｒｉｅｇｍａｎｅｔａｌ（１９８９）Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐ
ｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍ．１５９，９５−１０２；Ｂｒａｗｅｒ（１９９１）
ＡｃｔａＯｎｃｏｌ．３０，１６１−１６８）。

【００８６】癌胎児性抗原（ＣＥＡ）は、腫瘍マーカーとして広く用いられており、特に結
腸癌患者の監視に用いられている。ＣＥＡはいくつかの正常な組織中にもあるが
、明らかに、対応する正常な組織でよりも腫瘍組織中で高レベルに発現される。
ＣＥＡをコードする完全な遺伝子がクローン化され、そのプロモーター領域が分
析されている。ＣＥＡ遺伝子プロモーター・構築体は、翻訳開始点から上流にお
よそ４００個のヌクレオチドを含んでおり、ヒーラー・細胞株と比較して、腺癌
細胞株ＳＷ３０３中で９倍以上の高い活性を示した。これは、細胞タイプ特異的
発現性を担持するｃｉｓ−作用性（ｃｉｓ−ａｃｔｉｎｇ）配列が、この領域内
に含まれていることを示す（Ｓｃｈｒｅｗｅｅｔａｌ（１９９０）Ｍｏｌ．
Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．１０，２７３８−２７４８）。

【００８７】ムチン遺伝子（ＭＵＣ１）は、胸および膵臓の細胞株中では発現を選択的に指
図することができるが、非上皮でない細胞株ではそうではない５’側に位置する
配列を含む（ＷＯ９１／０９８６７。

【００８８】アルファフェトプロテイン（ＡＦＰ）エンハンサーは、膵臓の腫瘍選択的な発
現の駆動源として有用である（Ｓｕｅｔａｌ（１９９６）Ｈｕｍ．Ｇｅｎｅ
Ｔｈｅｒ．７，４６３４７０）。

【００８９】細胞内で前記チミジンキナーゼの発現を一時的に規制できれば望ましいという
ことが理解されるであろう。これはチミジンキナーゼをコードするポリヌクレオ
チドまたは発現ベクターが、患者や動物体内の細胞に導入される場合は特にそう
である。したがって、前記チミジンキナーゼの発現が、例えば小さな分子の濃度
により調節できるプロモーターによって直接または間接にコントロールされるこ
とが望ましい。小分子は、（小分子が前記プロモーターの活性化または抑制を達
成するかどうかに依存して）前記チミジンキナーゼの発現の活性化や抑制が望ま
れる場合に、動物または患者に投与される。発現構築体が安定している場合、つ
まり、少なくとも１週間、１、２、３、４、５、６、８カ月間または１年以上の
間、前記細胞中で前記チミジンキナーゼを発現することができる場合、これは特
に有益であることが理解されるであろう。本発明の好ましい構築体は、調節可能
なプロモーターを含んでもよい。調節可能なプロモーターの例には、以下の文献
中で引用されているものを含む：Ｒｉｖｅｒａｅｔａｌ（１９９９）Ｐｒｏ
ｃＮａｔｌＡｃａｄＳｃｉＵＳＡ９６（１５），８６５７−６２（経
口で生物利用可能な薬剤であるラパマイシンによる制御。２種の分離されたアデ
ノウイルスまたはアドノウイルス関連ウイルス（ＡＡＶ）ベクターによるコント
ロールを用いる。一方は、誘致可能なヒト成長ホルモン（ｈＧＨ）標的遺伝子を
コードし、他方は、２つの部分から成るラパマイシンにより調節される転写因子
）；Ｍａｇａｒｉｅｔａｌ（１９９７）ＪＣｌｉｎＩｎｖｅｓｔ１０
０（１１），２８６５−７２（ラパマイシンによる制御）；Ｂｕｅｌｅｒ（１９
９９）ＢｉｏｌＣｈｅｍ３８０（６），６１３−２２（アデノウイルス関連
ウイルス・ベクターの総説）；Ｂｏｈｌｅｔａｌ（１９９８）Ｂｌｏｏｄ
９２（５），１５１２−７（アデノ関連ウイルス中のデオキシサイクリンによる
制御）；Ａｂｒｕｚｚｅｓｅｅｔａｌ（１９９６）ＪＭｏｌＭｅｄ７
４（７），３７９−９２（誘導要因、すなわち、ホルモン、成長因子、サイトカ
イニン、細胞増殖抑止剤、放射、熱ショックまたは関連する応答要素について総
説する）。

【００９０】ポリヌクレオチドまたは発現ベクターは、任意の適当な方法で治療される患者
に導入される。標的細胞がポリヌクレオチドか発現ベクターを受け取り、かつ細
胞により取り込まれチミジンキナーゼを発現するには十分な時間が許容される。
次いで、患者に、チミジンキナーゼによって有毒薬剤に変換される無毒な薬剤を
――無毒な薬剤が、チミジンキナーゼを発現する標的細胞と接触してこれに入り
、酵素によってそれが標的細胞を殺すのに十分な有毒薬剤の量に変換されるのに
――十分な量投与する。

【００９１】チミジンキナーゼによって有毒薬剤に変換される実質的に無毒な薬剤は、ガン
シクロビル、アシクロビル、トリフルオロチミジン、１−［２−デオキシ，２−
フルオロ，β−Ｄ−アラビノフラノシル］−５−ヨードウラシル、ａｒａ−Ａ、
ａｒａ１、１−β−Ｄ−アラビノフラノシルチミン、５−エチル−２’−デオ
キシウリジン、５−ヨード−５’−アミノ−２，５’−ジデオキシウリジン、ヨ
ードキシウリジン、ＡＺＴ、ＡＩＶ、ジデオキシシチジン、ＡｒａＣのいずれ
か１つである。ブロモビニルデオキシウリジン（ＢＶＤＵ）も用いることができ
る。ｔｋにより代謝され得る任意のヌクレオシド・アナログまたは関連しない化
合物であって遺伝子操作された細胞およびプロドラッグの代謝産物に曝された細
胞の殺害に結びつくものも適宜使用できる。好ましくは、実質的に無毒な薬剤は
ガンシクロビルである。ガンシクロビルは、９−｛［２−ヒドロキシ−１−（ヒ
ドロキシメチル）エトキシメチル｝グアノシン）である。アシクロビルは（９−
［２−ヒドロキシエトキシメチル］グアノシン）である。ＡｒａＡは（アデノシ
ンアラビノシド、ビブラバイン）である。ＡＺＴは３’−ａｚｉｏｄ−３’チミ
ジンである。ＡＩＵは５−ヨード−５’アミノ２’，５’−ジデオキシウリジン
である。ＡｒａＣはシチジンアラビノシドである。

【００９２】本発明の第８の態様は（１）患者またはドナーから細胞を取り出すこと、（２
）細胞内にｅｘｖｉｖｏで本発明の第１の態様によるポリヌクレオチドまたは
本発明の第２の態様による発現ベクターを導入すること、（３）修飾した細胞を
チミジンキナーゼの発現の有無によらず患者に導入すること、（４）このような
発現がない場合には任意選択で細胞にチミジンキナーゼを発現させること、およ
び（５）チミジンキナーゼにより毒性の薬剤に変換される実質的に無毒の薬剤を
患者に投与することを含む、破壊の必要な細胞を有する患者の治療方法を提供す
る。

【００９３】ステップ（１）に関して、標的細胞は、望まれた治療の戦略により様々な出所
から得ることができる。癌の遺伝子治療では、腫瘍の軽減は、患者に由来する細
胞を含むであろう。同種骨髄移植では、細胞は、適当な受容者に移植すべきドナ
ーから得られるであろう。腫瘍塊中へのポリヌクレオチドまたは発現ベクターの
ｉｎｖｉｖｏ投与は、細胞のｉｎｖｉｔｒｏ遺伝子操作に対する実現可能な
代替案となるであろう。

【００９４】本発明の第９の態様は、本発明の第１の態様によるポリヌクレオチドまたは本
発明の第２の態様による発現ベクターの、患者中の細胞を破壊するための薬剤製
造における使用を提供する。ここで、患者は実質的に無毒な薬剤であるがチミジ
ンキナーゼによって有毒薬剤に変換される薬剤の投与を受けていたか、現に受け
ているか、あるいは将来受ける。

【００９５】本発明の第１０の態様は、実質的に無毒な薬剤であるがチミジンキナーゼによ
って有毒薬剤に変換される薬剤の、患者中の細胞を破壊するための薬剤製造にお
ける使用を提供する。ここで、患者は本発明の第１の態様によるポリヌクレオチ
ドまたは本発明の第２の態様による発現ベクターの投与を受けていたか、現に受
けているか、あるいは将来受ける。

【００９６】本発明の第１１の態様は、本発明の第１の態様によるポリヌクレオチドまたは
本発明の第２の態様による発現ベクター、および実質的に無毒な薬剤であるがチ
ミジンキナーゼによって有毒薬剤に変換される薬剤を含む治療システム（あるい
は、これは「部品キット」と呼んでもよい）を提供する。実質的に無毒な薬剤は
チミジンキナーゼの作用によって有毒形に変換される前記の薬剤のいずれかでも
よい。好ましくは、無毒な薬剤はガンシクロビルである。

【００９７】以下、実施例および図面（これは例示のためのみのものである）によって、本
発明をより詳細に説明する。

【００９８】ここで、図１は、ＣＥＭ細胞および主要Ｔリンパ球の形質導入のために使用さ
れた、ＳＦＣＭＭ３（Ａ）およびＧ１Ｔｋ１ＳｖＮａ（Ｂ）ベクターのプロウイ
ルス形を示す模式図である。ＬＴＲ、長い末端反復配列はモロニー（Ｍｏｌｏｎ
ｅｙ）ネズミ白血病ウイルス（ＭＬＶ）およびＭｏｌｏｎｅｙ肉腫ウイルス（Ｍ
ＳＶ）に由来する。ＨＳＶ−Ｔｋは単純疱疹ウイルス遺伝子配列である。ＳＶ４
０はサルウイルス４０の初期プロモーターである。ΔＬＮＧＦＲは、細胞質領域
中でトランケートされた低親和性神経成長因子受容体ｃＤＮＡである。Ｎｅｏ^R
：ネオマイシンホスホトランスフェラーゼｃＤＮＡである。ＣＥＭ−Ｔｋサブク
ローンに由来するゲノムＤＮＡの消化のために使用したＥｃｏＲＩとＳａｃＩの
ための制限酵素サイトが示されている。Ｔｋ１とＮＧＦのプローブは、ゲノムＤ
ＮＡ中のプロウイルス配列を識別するために使用した。Ｔｋ２プローブもＰＣＲ
産物の特異性を確認するために使用した。ＳＦＣＭＭ３を増幅することを目指し
たＰＣＲプライマーの位置およびＧ１Ｔｋ１ＳｖＮａプロウイルス配列を、ＰＣ
Ｒ産物のサイズとともに示す。

【００９９】図２はレトロウイルスによって形質導入されたＴ細胞株であり、ＦＡＣＳ分析
によるΔＬＮＧＦＲ発現の検出結果を示す。ＣＥＭおよびＪｕｒｋａｔ細胞（ヒ
トの細胞株）は未選択の集団（それぞれＡおよびＣ）を形質導入した。磁気ビー
ズ（それぞれＢおよびＤ）による１回のポジティブなイムノマグネティック選択
後、ΔＬＮＧＦＲ発現ＣＥＭおよびＪｕｒｋａｔ細胞の豊富化。示された結果は
、１つの代表的な実験に相当する。

【０１００】図３は、ＴＫ−ＣＥＭ（Ａ）およびＴＫ−Ｊｕｒｋａｔ（Ｂ）誘導サブクロー
ン中でのΔＬＮＧＦＲ導入遺伝子のＦＡＣＳ分析による発現を示す。細胞は、非
結合性（ｕｎｃｏｎｊｕｇａｔｅｄ）マウス抗ヒトＬＮＧＦＲＭｏＡｂとイン
キュベートし、次いでＦＩＴＣで標識されたヤギ抗マウスＭｏＡｂで染色した。

【０１０１】図４は、ＴＫ−ＣＥＭ由来のサブクローン中でＨＳＶ−ｔｋ導入遺伝子を測定
するためのＧＣＶ誘導細胞毒素の分析結果を示す。細胞は、ＧＣＶの濃度を増加
させ（０．０５μｇ／ｍＬから１２．５μｇ／ｍＬまでの範囲）、４日間インキ
ュベートした。細胞増殖は細胞ＤＮＡの中への³Ｈ−チミジンの取り込みによっ
て測定した。結果をＧＣＶが存在しない状態で得られた³Ｈ−チミジンの取込量
に対する各ＧＣＶ濃度における³Ｈ−チミジンの取込量によってパーセンテージ
で表わす。（◆）は形質導入されていないＣＥＭ細胞であり、（■）はＳＦＣＭ
Ｍ３形質導入ＴＫ−ＣＥＭサブクローンである。

【０１０２】図５は、ＴＫ−ＣＥＭ（ＡおよびＢ）およびＴＫ−Ｊｕｒｋａｔ（ＣおよびＤ
）サブクローンのサザン・ブロット分析結果を示す。ゲノムＤＮＡをＳａｃＩ制
限酵素で消化した。サザン・ブロットは、ＴＫ（ＡおよびＣ）およびΔＬＮＧＦ
Ｒ（ＢおよびＤ）特異的プローブでハイブリダイズした。

【０１０３】図６は、ＴＫ−ＣＥＭ（ＡおよびＢ）およびＴＫ−Ｊｕｒｋａｔ（ＢおよびＣ
）サブクローンのサザン・ブロット分析結果を示す。ゲノムＤＮＡはＥｃｏＲＩ
制限酵素で消化した。サザン・ブロットは、ＴＫ（ＡおよびＣ）およびΔＬＮＧ
ＦＲ（ＢおよびＤ）特異的プローブでハイブリダイズした。

【０１０４】図７は、ＴＫ−ＣＥＭおよびＴＫ−Ｊｕｒｋａｔサブクローンに由来するゲノ
ムＤＮＡからのＳＦＣＭＭ３プロウイルス配列のＰＣＲ増幅を示す。プロウイル
スの異なる４つの領域を特定のプライマーを使用して、ＰＣＲによって増幅した
（図１を参照）。断片１：ＬＴＲ⁺／ＨＴＫ５^-（９１２ｂｐ）；断片２：ＨＴＫ
４⁺／ＨＴＫ１^-（９９８ｂｐ）；断片３：ＨＴＫ１⁺およびＮＧＦ２^-（７５３ｂ
ｐ）および断片４：ＮＧＦ２⁺およびＮＧＦ３^-（８５２ｂｐ）。

【０１０５】図８は、形質導入され選択された主要Ｔリンパ球から得られたゲノムＤＮＡか
らＨＳＶ−ｔｋ遺伝子配列（断片２：ＨＴＫ４⁺／ＨＴＫ１^-；９９８ｂｐ）の
ＰＣＲ増幅を示す。ＴＫ−ＣＥＭおよびＴＫ−Ｊｕｒｋａｔサブクローンからの
ポジティブおよびネガティブ・コントロールを使用した。

【０１０６】図９は、ＴＫ−ＣＥＭおよびＴＫ−Ｊｕｒｋａｔサブクローンに由来するゲノ
ムＤＮＡからのトランケートされたＨＳＶ−ｔｋ遺伝子のＰＣＲ増幅結果を示す
。ＰＣＲは、耐ＧＣＶ性のＴＫ−ＣＥＭおよびＴＫ−Ｊｕｒｋａｔクローン中の
ＨＳＶ−ｔｋ遺伝子のスプライスされた形を特異的に増幅するプライマー（ＨＴ
Ｋ８⁺／ＨＴＫ１^-；６４０ｂｐ）を使用してセット・アップした。

【０１０７】図１０は、形質導入され選択された主要Ｔリンパ球から得られたゲノムＤＮＡ
からのトランケートされたＨＳＶ−ｔｋ遺伝子のＰＣＲ増幅結果を示す。ＰＣＲ
は、耐ＧＣＶ性のＴＫ−ＣＥＭおよびＴＫ−Ｊｕｒｋａｔクローン中のＨＳＶ−
ｔｋ遺伝子のスプライスされた形を特異的に増幅するプライマー（ＨＴＫ８⁺／
ＨＴＫ１^-；６４０ｂｐ）を使用してセット・アップした。

【０１０８】図１１はＨＳＶ−ｔｋ遺伝子（Ｖ００４６７と呼ぶ）の野生型配列、実施例で
用いた発現ベクター中の完全長ＨＳＶ−ｔｋ遺伝子（ｔｋｇｅｎｅ）および実施
例記載の実験で見出された削除された遺伝子（ｔｋｇｅｎｅ−ｄｅｌ）を示す。

【０１０９】図１２は、癌遺伝子治療、および骨髄移植の後に、同種異系反応性（ａｌｌｏ
ｒｅａｃｔｉｖｉｔｙ）の調整のために用いるドナーＴリンパ球によって腫瘍細
胞を殺すために提案された、ＨＳＶ−ｔｋ／ＧＣＶシステムを示す模式図である
。

【０１１０】図１３は、部位特異的突然変異生成によるｍＳＦＣＭＭ−３ベクターの修正を
示す。トランスフェクタント（ｔｒａｎｓｆｅｃｔａｎｔ）＃２および＃６の制
限酵素分析。ＥｃｏＮＩおよびＭｖａＩ制限酵素はベクターの位置１９９４およ
び２２２１で引き起こされた変化をそれぞれ検知するために使用した。野生型の
ＨＳＶ−ｔｋ遺伝子配列を含む未修正ベクターを、ネガティブ・コントロールと
して使用した。

【０１１１】図１４。ＧＣＶを含むまたはＧＣＶを含まない培養液中で形質導入された主要
なＴ細胞からのｐＴＫ／ＲＴＫ２ＰＣＲ（３５サイクル）産物のサザン・ブロ
ット。（Ａ）形質導入されたか未選択のＴ細胞（ＴＫ０）中のＨＳＶ−Ｔｋ配列
のＰＣＲ増幅、形質導入されたかＧＣＶがない状態で、および１μｇ／ｍＬＧ
ＣＶで７日間培養したＧ４１８選択のＴ細胞（ＴＫ８００＋ＧＣＶ）。（Ｂ）Ｇ
ＣＶの存在（１μｇ／ｍｌ）または不存在培地で８、１１、１６日間の培養後の
形質導入された主要なＴ細胞。ポジティブ（Ｇ１Ｔｋ１ＳｖＮａベクター生産細
胞からのＤＮＡ）およびネガティブ・コントロール（形質導入されていない主要
なＴ細胞）を使用した。

【０１１２】図１５。ＧＣＶ治療中のＧｖＨＤ（３０日目には同種移植片（ａｌｌｏｇｒａ
ｆｔ）を記入する）時における臨床試験の代表的な患者からの抹消血単核細胞の
ＴＫＰＣＲ産物のサザン・ブロット分析。レーンＡ〜Ｄ：ＧＣＶ治療開始後、
ＧＶＨＤ（Ａ）、２日目（Ｂ）、４日目（Ｃ）、１１日目（Ｄ）の時点で患者の
ＰＢＭＣから抽出されたＤＮＡサンプル。レーンＥ：ネガティブ・コントロール
（形質導入されていない主要なＴ細胞）；レーンＦ：ポジティブ・コントロール
（Ｇ１Ｔｋ１ＳｖＮａベクター生産細胞からのＤＮＡ）。

【０１１３】図１６は、Ｇ１Ｔｋ１ＳｖＮａベクターで形質導入された異なる細胞集団の相
対的な細胞成長を示す代表的な実験の結果を示す。Ｃ０：形質導入されておらず
選択されていない細胞；Ｃ８００：形質導入されておらずＧ４１８（８００ｍ
ｇ／ｍｌ）で選択された細胞；ＴＫ０：形質導入されて、選択されていない細胞
；ＴＫ８００：形質導入しＧ４１８−選択した。

【０１１４】図１７。Ｔ細胞株および訂正されているか訂正されていないＨＳＶ−７ｋベク
ターで形質導入した主要なＴ細胞のＰＣＲ分析結果。（Ａ）訂正されていないベ
クターＧ１Ｔｋ１ＳｖＮａまたはＳＦ／Ｔｋ／ｗｔで、または訂正されたベクタ
ーｐＳＦ／Ｔｋ／ｍｕｔで形質導入された、ＧＣＶ濃度（０、１、２または５μ
Ａｇ／ｍｌ）の増加が存在する、Ｈｕｔ−７８細胞株からのＨＳＶ−ＴｋＰＣ
Ｒ産物のサザン・ブロット分析。（＋）および（−）は、ＰＣＲ反応のポジティ
ブ・コントロールおよびネガティブ・コントロールである。

【０１１５】ＭＷは、明るいバンドを有する６００ｂｐ（１００ｂｐＤＮＡｌａｄｄｅ
ｒ、ＬｉｆｅＴｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）に等しい分子量マーカーを表わす。
ＨＳＶ−Ｔｋ遺伝子の両方のかたち（白い矢印＝全長、黒い矢印はトランケート
された遺伝子を示す）に対するプライマーを用いたＰＣＲによる増幅結果。（Ｂ
）またはＨＳＶ−７ｋ遺伝子のトランケートされた形式に特異的なプライマーを
用いた。（Ｃ）訂正されていないＳＣＦＭＭ３（ｗｔ）または訂正されたｓｃ−
ＳＣＦＭＭ３（ｍｕｔ）ベクターで形質導入した主要なＴ細胞のバルク集団。Ｔ
ｋ−ＣＥＭ＃２およびＴｋ−ＣＥＭ＃３はトランケートされていないＰＣＲコン
トロールおよびトランケートされたＰＣＲコントロールを表わす。形質導入され
ていないＴ細胞をネガティブ・コントロールとして用いた。

【０１１６】図１８。Ｔ細胞株および訂正されたＨＳＶ−Ｔｋベクターまたは訂正されてい
ないＨＳＶ−Ｔｋベクターで形質導入した主要なＴ細胞のＧＣＶ感度。訂正され
たＳＦ／Ｔｋ／ｍｕｔ（？）または訂正されていないベクターＧ１Ｔｋ１ＳｖＮ
ａ（○）またはＳＦ／Ｔｋ／ｗｔ（△）で形質導入されたＨｕｔ−７８（Ａ）お
よびＣＥＭ（Ｂ）細胞株のＧＣＶ感度を形質導入されていないＴ細胞株（■）と
比較して示す。データは、細胞活力の阻害を表わし、ＣＥＭおよびＨｕｔ−７８
細胞株について、それぞれ８つおよび３つの異なる独立した実験の平均±ＳＤで
ある。（Ｃ）訂正されたｓｃ−ＳＦＣＭＭ３（△）または訂正されていないＳＦ
ＣＭＭ３ベクター（？）で形質導入された主要なＴ細胞のＧＣＶ感度を形質導入
されていないＴ細胞（■）と比較して示す。

【０１１７】

【実施例】

実施例１：単純疱疹ウイルス・チミジンキナーゼ遺伝子を有するレトロウイルス
・ベクターで形質導入されたヒトＴリンパ球におけるガンシクロビル耐性の分子
メカニズム我々は、形質導入されたＣＥＭおよびＪｕｒｋａｔ細胞、２種のリンパ芽球状
ヒトＴ細胞株におけるＧＣＶ耐性に関わるメカニズムを検討する。使用するレト
ロウイルス・ベクター（ＳＦＣＭＭ３）は、５’ＬＴＲコントロール下にあるＨ
ＳＶ−ＴＫ遺伝子、およびサルウイルス４０プロモーターによって調節されるΔ
ＬＮＧＦＲ遺伝子を含む（Ｖｅｒｚｅｌｅｔｔｉｅｔａｌ（１９９８）Ｈｕ
ｍａｎＧｅｎｅＴｈｅｒ．９，２２４３−２２５１）。形質導入され選択さ
れたＣＥＭおよびＪｕｒｋａｔ細胞に由来する１５種のサブクローンを、ＨＳＶ
−ｔｋおよびΔＬＮＧＦＲ導入遺伝子を発現させるために同定した。我々の得た
結果は、ΔＬＮＧＦＲ遺伝子を発現するサブクローン内では、いくつかの耐ＧＣ
Ｖ性のサブクローンが識別されたことを示した。ＧＣＶ耐性の基礎となる分子メ
カニズムは、ＨＳＶ−ｔｋ遺伝子配列中での２２７ｂｐ断片の削除を含んでいる
。トランケートされたＨＳＶ−ｔｋ遺伝子のマッピングは、ＨＳＶ−ｔｋ配列内
の生産細胞のベクターＲＮＡの隠れたスプライシングによって削除が引き起こさ
れたことを示した。サブクローンのうちのいくつかで見つかった、削除されたＨ
ＳＶ−ｔｋ遺伝子は、ＧＣＶのためのＨＳＶ−ｔｋ遺伝子の再発に関係している
。これらの知見は、癌遺伝子治療およびａｌｌｏ−ＢＭＴの中でＨＳＶｔｋ／Ｇ
ＣＶアプローチを使用した従来の多くの研究でなされた観察結果を説明するであ
ろう。

【０１１８】材料および方法Ｒｅｔｒｏｖｉｒａｌベクターおよび産生株ＳＦＣＭＭ３ベクターは、Ｃｌ．Ｂｏｒｄｉｇｎｏｎ博士（Ｍｉｌａｎ，Ｉｔ
ａｌｙ）から提供されたもので、以前にも記載されている（Ｖｅｒｚｅｌｅｔｔ
ｉ１９９８）。簡単に言えば、レトロウイルス・ベクターは、長い末端繰返し
（ＬＴＲ）の転写制御下の完全長ＨＳＶ−ＴＫ遺伝子配列および内部プロモータ
ーであるサルウイルス４０制御下のΔＬＮＧＦＲを含む。ベクターＤＮＡは、リ
ン酸カルシウム共沈により、Ｅ８６自己指向性パッケージング細胞株に感染させ
た。感染したＥ８６細胞から得られた上清を用いてＧＰ＋ｅｎｖＡｍ１２両
種性細胞株を感染させた。形質導入したＡｍ１２細胞中でのΔＬＮＧＦＲの発現
は、ネズミ抗ヒトΔＬＮＧＦＲ単クローン抗体（ＨＢ６７８７，ｃｌｏｎｅ
２０．４，ＡＴＣＣ，Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ，ＭＤ）および第２抗体としてＦＩＴ
Ｃ標識をしたヤギ抗マウスＩｇＧｉ単クローン抗体（Ｂｅｃｔｏｎ−Ｄｉｃｋｉ
ｎｓｏｎ，ＭｏｕｎｔａｉｎＶｉｅｗ，ＣＡ）を使用してＦＡＣＳ分析によっ
て評価した。我々の実験で使用したレトロウイルス生産クローンはＳＦＣＭＭ３
＃１６として特定され、加熱して不活性化した１０％のウシ胎児血清（ＦＣＳ，
ＨａｒｌａｎＳｅｒａ− ＬａｂＬｔｄ．，Ｌｏｕｇｈｂｏｒｏｕｇｈ，Ｕ
Ｋ）、Ｌ−グルタミン２０ｍＭ、ストレプトマイシン１００μｇ／ｍＬ、ペニシ
リン（ＧｉｂｃｏＢＲＬ；ＬｉｆｅＴｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｓｃｏｔｌａ
ｎｄ）１００Ｕ／ｍＬを添加したＤｕｌｂｅｃｃｏの修正イーグル培地（ＧＩＢ
ＣＯ−ＢＲＬ，Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ，ＭＤ）中に維持した。

【０１１９】ウイルス上清の収穫生産細胞を３７℃に維持して拡張させる。培養が９０％の密集状態となった時
点で、上清を新鮮なＤ−１０培地と取り替え、細胞を３２℃で１６時間維持する
。ウイルスを含んでいる上清を収穫し、０．４５μｍメッシュのフィルターを通
して、離れている生産細胞および細胞断片を除去する。上清を液体窒素で瞬間冷
凍し、次いで、使用まで−８０℃で保存する。ウイルス力価は、ウイルスを含む
上清を１０倍無菌稀釈し、これを用いてＮＩＨ−３Ｔ３細胞を感染させ、しかる
後、ＦＡＣＳ分析によって評価した。

【０１２０】ヒトの主要Ｔ細胞リンパ球およびＴ細胞株の単離および培養抹消血の単核細胞（ＰＢＭＮＣ）を健康なドナーからヘパリン処理したチュー
ブ中に得た。低密度ＭＮＣ（＜１．００７ｇ／ｍＬ）を遠心分離（１５００ｇ、
３０分、２０℃）によりリンフォプレップ（Ｌｙｍｐｈｏｐｒｅｐ）（Ｎｙｃｏ
ｍｅｄ，Ｏｓｌｏ，Ｎｏｒｗａｙ）上に単離した。熱で不活性化した１０％ＦＣ
Ｓ、５μＭ β−メルカプトエタノール、２５μＭＨｅｐｅｓ（両者ともＳｉ
ｇｍａ（ＳｔＬｏｕｉｓ，ＭＯ）より入手）、グルタミン、１００μｇ／ｍＬ
ストレプトマイシン、１００Ｕ／ｍｌペニシリンおよび１００Ｕ／ｍＬ組換えヒ
トインターロイキン２（ｒｈＩＬ−２）（Ｒｅｓｅａｒｃｈ＆Ｄｅｖｅｌｏｐｍ
ｅｎｔＳｙｓｔｅｍＥｕｒｏｐｅＬｔｄ．（Ａｂｉｎｇｄｏｎ，ＵＫ）お
よびＰｒｅｐｏｔｅｃｈＥＣＬｔｄ．（Ｌｏｎｄｏｎ，ＵＫ）（Ｔ−ＲＦ１
０）から入手）を含むＲＰＭｌ（ＧｉｂｃｏＢＲＬ；ＬｉｆｅＴｅｃｈｎｏｌ
ｏｇｉｅｓ，Ｓｃｏｔｌａｎｄ）からなるＴ−ＲＦ１０培地上で、２×１０⁶細
胞／ｍＬの濃度でＰＢＭＮＣを培養した。ＣＥＭおよびＪｕｒｋａｔ、２種のヒ
トＴ細胞株を、熱で不活性化した１０％ＦＣＳ、２０ｍＭのグルタミン、１００
μｇ／ｍＬのストレプトマイシンおよび１００Ｕ／ｍｌのペニシリンを添加した
ＲＰＭＩ中で培養した。

【０１２１】主要Ｔリンパ球およびヒトのＴ細胞株の形質導ＰＢＭＮＣを、１μｇ／ｍＬＰＨＡおよび１００Ｕ／ｍＬｒｈＩＬ−２で
４８時間刺激した。非接着細胞を遠心分離によって回収し、２×１０⁶細胞／ｍ
ＬでＴ−ＲＦ１０中に再懸濁した。ＣＥＭおよびＪｕｒｋａｔ細胞に、ＲＦ１０
を感染前に２４時間与えた。ＳＦＣＭＭ３生産細胞から得た、４μｇ／ｍＬポ
リブレン（Ｓｉｇｍａ；ＳｔＬｏｕｉｓ，ＭＯ，ＵＳＡ）を含む細胞を含まな
いウイルス上清を細胞培養物に加え、ＣＯ₂インキュベーター中３７℃で１６時
間インキュベートした。感染は２日連続で繰り返された。最後の感染の後２４時
間、細胞を新鮮な培地で洗浄した。形質導入された細胞をさらに２〜３日間培養
してからＦＡＣＳ分析によって遺伝子転送効率を決定した。

【０１２２】 ΔＬＮＧＦＲ発現量測定のためのＦＡＣＳ分析形質導入した細胞を、非結合性ネズミ抗ヒトΔＬＮＧＦＲ単クローン抗体（Ｈ
Ｂ８７３７、クローン２０．４、ＡＴＣＣ）とともに室温で４０分間インキュベ
ートした。細胞は、１％のＢＳＡ−ＰＢＳで２回洗い、４℃で２０分、ヤギ抗Ｉ
ｇＧ₁マウスＦＩＴＣ結合抗体（Ｂｅｃｔｏｎ−Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ，Ｍｏｕｎ
ｔａｉｎｖｉｅｗ，ＣＡ）で染色した。２重色分析のために、細胞を４℃で２
０分間、ＰＥ結合抗ＣＤ３単クローン抗体（ＭｏＡｂ）（Ｂｅｃｔｏｎ−Ｄｉｃ
ｋｉｎｓｏｎ，Ｍｏｕｎｔａｉｎｖｉｅｗ，ＣＡ）で染色し、１％ＢＳＡ−Ｐ
ＢＳで２回洗った。最後にパラホルムアルデヒド−ＰＢＳ緩衝液を用いて細胞を
固定した。ＦＡＣＳ分析は、フロー・サイトメーター（ｃｙｔｏｍｅｔｅｒ）（
ＦＡＣＳＳｃａｎ；Ｂｅｃｔｏｎ−Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ）で行なった。ΔＬＮ
ＧＦＲ発現量はＣｅｌｌＱｕｅｓｔ（登録商標）ソフトウェア（Ｂｅｃｔｏｎ−
Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ）を使用して、ＣＤ３ポジティブな集団で測定した。読みご
とに少なくとも２０，０００イベントをカウントした。

【０１２３】磁気ソートによる形質導入された細胞の選択形質導入した細胞を、メーカーの指示によってＭｉｎｉＭＡＣＳシステムを使
用して、細胞表面上のΔＬＮＧＦＲの発現に基づいて選択した。免疫的選択（ｉ
ｍｍｕｎｏｓｅｌｅｃｔｉｏｎ）のために、細胞を室温で、４０分間、ネズミ抗
ヒトΔＬＮＧＦＲＭｏＡｂとともにインキュベートした。細胞をＭＡＣＳバッ
ファ（０．５％ＢＳＡおよび２ｍＭＥＤＴＡを添加したＰＢＳ）で洗い、ヤギ
抗マウスＩｇＧマイクロビーズ（ＭＡＣＳ，ＭｉｌｔｅｎｙｉＢｉｏｔｅｃ
，Ｇｅｒｍａｎｙ）とともに４℃で１５分間インキュベートした。細胞を洗った
後に、ΔＬＮＧＦＲを発現する細胞をＭｉｎｉＭＡＣＳＭＳ⁺分離カラム（Ｍ
ＡＣＳ，ＭｉｌｔｅｎｙｉＢｉｏｔｅｃ，Ｇｅｒｍａｎｙ）で選択した。

【０１２４】形質導入したＴ細胞株のクローニング形質導入され選択されたヒトＴ細胞株のサブクローニングを３５ｍｍペトリ皿
中、メチルセルロース（ＭｅｔｈｏＣｕｌｔＨ４３３０；ＳｔｅｍＣｅｌｌ
Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｖａｎｃｏｕｖｅｒ，Ｃａｎａｄａ）１ｍＬ当た
り４００個の細胞に植菌することにより行なった。半固体の培養物をＣＯ₂イン
キュベーター中３７℃で１２日間インキュベートした。１３日目に、コロニーを
採取し、９６ウェル・プレートにおいて１００μＬのＲＦ１０中に接種した。ク
ローンの成長は顕微鏡でモニターした。上清が黄色になった時点でクローンに新
鮮な培地を加えることによって拡張し、体積の大きな容器にクローンを移して行
くことにより、１Ｘ１０⁶細胞／ｍＬの細胞密度を維持した。

【０１２５】ガンシクロビル細胞毒素の分析全量２ｘ１０⁴細胞／ウェルを９６ウェル・プレートの１００μＬ培地中に接
種した。細胞は、ＧＣＶ（Ｃｙｍｅｖｅｎｅ（登録商標）、Ｈｏｆｆｉｎａｎ−
ＬａＲｏｃｈｅＡＧ，Ｇｅｒｍａｎｙ）の濃度を増加させて（０．０５〜１
２．５μｇ／ｍＬ）で４日間行なった。しかる後、１μＣｉ／ウェルの３重水素
化チミジン（メチル³Ｈ−チミジン、ＴＲＡ．１２０、１．０ＭＢｑ／ｍＬ、Ａ
ｍｅｒｓｈａｒｎＩｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ，Ｅｎｇｌａｎｄ）を、細胞収
穫器（Ｗａｌｌａｃ、Ｇａｉｔｈｅｒｂｕｒｇ、ＭＤ）によって細胞ＤＮＡを収
穫する１８時間前に加えた。ＤＮＡ中への³Ｈ−チミジンの取込量をβシンチレ
ーション計数器（Ｗａｌｌａｃ１４１０、Ｇａｉｔｈｅｒｂｕｒｇ、ＭＤ）で
測定した。すべてのＧＣＶ濃度は３回試験した。結果は、ＧＣＶがない状態で得
られた取込量に対する各ＧＣＶ濃度での³Ｈ−チミジン取込量をパーセンテージ
で表わす。

【０１２６】サザン・ブロット分析ゲノムＤＮＡはメーカーによる推薦に従いＱＩＡａｍｐ血液キット（Ｑｉａｇ
ｅｎＬｔｄ．Ｇｅｒｍａｎｙ）を用いて抽出した。制限酵素ＳａｃＩおよびＥ
ｃｏＲＩ（ＮｅｗＥｎｇｌａｎｄＢｉｏｌａｂｓＬｔｄ．；ＵＫ）を用い
てゲノムＤＮＡ１０μｇを一夜消化した後、試料を０．８％のアガロース・ゲ
ルの電気泳動によりサイズ分離した。ＤＮＡはサプライヤーの指示に従って、Ｈ
ｙｂｏｎｄＮナイロン・フィルター（ＡｍｅｒｓｈａｍｄｅｓＵｌｌｉｓ
，Ｆｒａｎｃｅ）上に移した。ブロットは、ＨＳＶ−ＴＫ遺伝子配列については
、α−³²Ｐ−ｄＣＴＰランダム・プライム標識がされた１．１ｋｂのＭｌｕＩ
−ＸｈｏＩ断片と、ＬＮＧＦＲ遺伝子については０．９ｋｂのＲｓｒＩＩ断片と
ハイブリダイズした。最後に、ブロットを−８０℃で少なくとも１６時間、Ｘ線
写真フィルム（Ｂｉｏｍａｘ，Ｋｏｄａｋ，ＵＳＡ）に露出させた。

【０１２７】ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）および配列決定分析形質導入された細胞から抽出されたゲノムＤＮＡにおいてＳＦＣＭＭ３プロウ
イルス配列の有無を調べた。プロウイルスの異なる４つの領域を特定のペアのプ
ライマー（図１）を使用して、ＰＣＲによって増幅した：断片１：ＬＴＲ１⁺（５’ＧＧＴＣＴＣＣＴＣＴＧＡＧＴＧＡＴＴＧＡＣＴＡ３’）およ
びＨＴＫ５^- （ＡＡＣＧＡＡＴＴＣＣＧＧＣＧＣＣＴＡＧＡＧＡＡ）；断片２：ＨＴＫ４⁺（ＴＴＣＴＣＴＡＧＧＣＧＣＣＧＧＡＡＴＴＣＧＴＴ）およびＨＴＫ２^- （ＡＴＣＣＡＧＧＡＴＡＡＡＧＡＣＧＴＧＣＡＴＧＧ）断片３：ＨＴＫ１⁺ （ＣＣＡＴＧＣＡＣＧＴＣＴＴＴＡＴＣＣＴＧＧＡＴ）およびＮＧＦ２^- （ＴＴＧＣＡＧＣＡＣＴＣＡＣＣＧＣＴＧＴＧＴＧＴ）および断片４：ＧＦ２⁺ （ＡＣＡＣＡＣＡＧＣＧＧＴＧＡＧＴＧＣＴＧＣＡＡ）およびＮＧＦ３^- （ＡＴＡＧＡＡＧＧＣＧＡＴＧＣＧＣＴＧＣＧＡＡＴ）。ＰＣＲはゲノムＤＮＡを５０ｎｇ、ならびに１５ｍＭＭｇＣｌ₂（Ｂｏｅｈ
ｒｉｎｇｅｒＭａｎｎｈｅｉｎＬｔｄ．，Ｌｅｗｅｓ，ＵＫ）、ｄＡＴＰ、
ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰ、ｄＴＴＰ各２５０μＭ、センス・プライマーおよびアンチ
センス・プライマー各０．２５μＭ、および０．０２５Ｕ／μＬのＴａｑポリメ
ラーゼ（ＢｏｅｈｒｉｎｇｅｒＭａｎｎｈｅｉｎＬｔｄ．）を含む１×Ｔａ
ｑポリメラーゼ・バッファを含む２０μＬ反応混合物で行なった。断片１および
２を増幅するための熱サイクル条件は、９６℃、３０秒間の変性、６０℃、３０
秒間のアニーリング、および７２℃、１分間の伸張を３５サイクル、最後に７２
℃、１０分間の伸張とした。断片３および４を増幅するために使用した熱サイク
ル条件は、９６℃、３０秒間の変性、６４℃、５０秒間のアニーリング、および
７２℃、１分間の伸張を３１サイクル、最後に７２℃、１０分間の伸張とした。
ＰＣＲ産物（１０μＬ）は、エチジウム・ブロマイドを含む１％アガロース・ゲ
ル上で電気泳動にかけた。

【０１２８】増幅可能なゲノムＤＮＡの存在を確認するため、別に記載されるようにして（
Ｍｅｌｏｅｔａｌ（１９９４）Ｌｅｕｋｅｍｉａ８，２０８−２１
１）、ネガティブ・クローン上でヒトＡＢＬ遺伝子の８８０ｂｐゲノム断片のＰ
ＣＲ増幅を行なった。

【０１２９】ＰＣＲ産物のクローニングは、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ（Ｇｒｏｎｉｎｇｅｎ，
ＴｈｅＮｅｔｈｅｒｌａｎｄｓ）から得たｐＣＲ２．１ＴＡクローニング・
ベクターを使用して実現された。クローニングは独立したＰＣＲ反応から得たコ
ピーについて行なった。Ｍ１３プライマーを使用する自動蛍光性のＤＮＡ配列分
析は、ＡｄｖａｎｃｅｄＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙＣｅｎｔｒｅ（Ｌｏｎ
ｄｏｎ，ＵＫ）によって行なわれた。

【０１３０】結果ヒトＴ細胞株の形質導入および選択ＣＥＭおよびＪｕｒｋａｔ細胞は、ポリブレン存在下で細胞を含まないウイル
ス上清感染プロトコルに従って形質導入した。遺伝子トランスファー実験の効率
は、細胞表面でのＬＮＧＦＲ発現に基づくＦＡＣＳ分析によって測定した。得ら
れた形質導入効率は、両方の細胞株で類似していた：ＣＥＭ細胞について２０±
５（ｎ＝３）、Ｊｕｒｋａｔ細胞について１７±６（ｎ＝３）（図２Ａおよび２
Ｃ）。形質導入した細胞の選択はイムノマグネティック（ｉｍｍｕｎｏｍａｇｎ
ｅｔｉｃ）な操作手順（ＭＡＣＳＳｙｓｔｅｍ）を用いて行なった。選択後で
は、ＣＥＭの細胞８５％、Ｊｕｒｋａｔ細胞の８３％がＬＮＧＦＲを発現してい
た（図２ＢおよびＤ）。第２ラウンドの選択を実行することにより、ＬＮＧＦＲ
を発現する細胞の豊富化は、さらに９５〜９８％まで改善し得る。

【０１３１】ＴＫ−ＣＥＭおよびＴＫ−Ｊｕｒｋａｔクローン中のＬＮＧＦＲ発現形質導入し、選択したＣＥＭおよびＪｕｒｋａｔ細胞は、半固体培地中、細胞
を平板培養することによりクローンを作成した。１０日目に、コロニーを採取し
、９６−ウェル・プレートに移して液体培養でサブクローンをさらに拡張した。
６週間後に、十分な細胞が得られた時点で、ＬＮＧＦＲ遺伝子の発現をＦＡＣＳ
によって測定した。図３は、各サブクローンについて得られたヒストグラムを示
す。形質導入されたＣＥＭ細胞に由来する大多数のクローン（１５のうち１２）
は、ΔＬＮＧＦＲについて陽性であった。ＴＫ−ＣＥＭクローン＃５および＃７
は、同位体のコントロール（図３Ａ）に関してオーバーラップするプロフィール
によって示されているようにΔＬＮＧＦＲについては発現を示していない。ＴＫ
−Ｊｕｒｋａｔ由来のクローンについて行なったＦＡＣＳ分析では、分析した１
５のサブクローンのうちの７つが陽性で、８つが陰性である（図３Ｂ）ことが明
らかになった。ＴＫ−Ｊｕｒｋａｔクローン１２は、その異なる２つのサブクロ
ーンがこの細胞株に加わっていることを示す２重肩部分を示している。

【０１３２】 ΔＬＮＧＦＲの異なる発現レベルが、ΔＬＮＧＦＲリポーター遺伝子を発現す
るクローンにおいて観察された。ＴＫ−Ｊｕｒｋａｔ＃３および＃１１の中のΔ
ＬＮＧＦＲの発現は、ＴＫ−Ｊｕｒｋａｔ＃４および＃６よりも２桁高かった。
ＴＫ−ＣＥＭのクローンでは、ΔＬＮＧＦＲ発現は、１桁の範囲内に収まってい
た（図３Ａ）。全体として、ＴＫ−Ｊｕｒｋａｔクローンは、形質導入されたＣ
ＥＭの細胞に由来するサブクローンよりΔＬＮＧＦＲの発現についてより広い範
囲を示した。

【０１３３】ＴＫ−ＣＥＭの中のＨＳＶ−ＴＫ遺伝子発現ＴＫ−ＣＥＭサブクローン中のＨＳＶ−ＴＫ遺伝子の発現は、細胞をＧＣＶ濃
度を増加させつつ培養した際に起こる細胞増殖阻害によって決定された。図４は
、ＴＫ−ＣＥＭのクローン中で、ＧＣＶにより引き起こされた細胞毒素の分析に
おいて得られた結果を示す。³Ｈ−チミジンの取込みによって評価された細胞増
殖中のＩＣ₅₀阻害は、クローン＃３、＃８、＃９、＃１１、＃１２、＃１３およ
び＃１５について０．１μｇ／ｍＬＧＣＶ濃度に達した。一方、クローン＃１
、＃２、＃４、＃５、＃７および＃１４中での細胞増殖は、形質導入されていな
い細胞（ネガティブ・コントロール）中で得られた値とパラレルであった。ＴＫ
−ＣＥＭクローン＃６および＃１０は、５０％の細胞増殖阻害を達成するために
はＧＣＶ（０．２５μｇ／ｍＬ）よりも高い濃度を必要とした。これらの２つの
例では、ＧＣＶの濃度を１２．５μｇ／ｍＬまで増加させた時でも、細胞増殖の
完全な阻害は完全には達成されなかった。

【０１３４】挿入したＳＦＣＭＭ３プロウイルスの統合ＣＥＭとＪｕｒｋａｔのクローンから抽出したゲノムＤＮＡについて、挿入さ
れたＳＦＣＭＭ３プロウイルスが統合されているかをサザン・ブロット分析によ
って調べた。ＳａｃＩで消化したゲノムＤＮＡをゲル電気泳動し、次に膜上に移
した。ブロットは、ＨＳＶ−ＴＫおよびＬＮＧＦＲ遺伝子（図１）のための特異
的プローブで順次ハイブリダイズした。ＳａｃＩ制限酵素は、５’ＬＴＲおよび
３’ＬＴＲでのみ切断する。サザン・ブロット分析は２つのプローブのいずれか
を使用して、４．１ｋｂのサイズの単一のバンドとなるはずである。図５Ａは、
１５個のＴＫ−ＣＥＭ由来クローンのうち１３個で、ブロットがＴＫプローブと
ハイブリダイズされた時、統合されたプロウイルスを有することを示す。しかし
、６つのケース（クローン＃３、＃６、＃９、＃１３、＃１４および＃１５）で
は、バンドのサイズは生産細胞と同じである。ほぼ２００−ｂｐのより小さなバ
ンドがＴＫ−ＣＥＭクローン＃１、＃２、＃４、＃８、＃１０、＃１１および＃
１２で観察された。クローン化されていないバルクのＴＫ−ＣＥＭ細胞では、４
．１ｋｂの位置でしみが得られた。ΔＬＮＧＦＲ特異的プローブを使用した場合
（図５Ｂ）、形質導入されていない腸管外ＣＥＭ細胞を含むすべての例で内因性
（ｅｎｄｏｇｅｎｅｏｕｓ）なＮＧＦＲ遺伝子に対応する配列が現われており、
ゲノムＤＮＡがすべて適切に消化されゲルに沿って均一に分配されたことを示す
。ＴＫプローブの使用時に観察されるのと同じサイズの追加的バンドが、プロウ
イルスを運ぶクローン中で観察された。ＳＦＣＭＭ３ベクター配列の不存在が、
ＴＫ−ＣＥＭクローン＃５および＃７でＴＫとΔＬＮＧＦＲのプローブのいずれ
かを使用して確認された。ＴＫ−ＣＥＭクローン＃３、＃６、＃９、＃１３、＃
１４および＃１５中の追加バンドのサイズは、生産細胞の中で得られたそれに似
ている。

【０１３５】ＴＫ−Ｊｕｒｋａｔクローンから抽出されたゲノムＤＮＡ上で行なったサザン
・ブロット分析結果を図５Ｃに示す。ＴＫ−Ｊｕｒｋａｔクローン＃１、＃１１
および＃１２は、ＴＫプローブにより予想されるサイズのバンドを有している。
ＴＫ−Ｊｕｒｋａｔクローン＃６は、予想されるサイズの１本のバンドおよびＴ
Ｋ−Ｊｕｒｋａｔクローン＃３中で観察されたものに似ているより大きなバンド
を１５ｋｂに有している。ＴＫ−Ｊｕｒｋａｔ＃１５は、さらに１８ｋｂのサイ
ズの１本の一バンドを示した。これらの観察結果はＬＮＧＦＲプローブ（図５Ｄ
）を使用して確認された。ＴＫ−ＣＥＭクローンの場合と同様に、内部（ｅｎｄ
ｏｇｅｎｅｏｕｓ）ＮＧＦＲに対応するバンドも現われた。プロウイルスに対応
する追加的バンドが、ＴＫプローブを使用して見出されたのと同じ位置で観察さ
れた。ＴＫ−Ｊｕｒｋａｔクローン＃２、＃７、＃８、＃１０、＃１３および＃
１８は、プロウイルス配列については陰性であった。

【０１３６】ＳＦＣＭＭ３プロウイルス配列の挿入および統合サイトの数各クローン中でのベクターの挿入および統合サイトの数を決定するため、ＴＫ
−ＣＥＭおよびＴＫ−Ｊｕｒｋａｔクローンから抽出したゲノムＤＮＡを、制限
酵素ＥｃｏＲＩで消化した。これはプロウイルス配列内にただ１つの制限部位を
有している（図１）。ＴＫプローブを使用したサザン・ブロット分析は、形質導
入されたＣＥＭの細胞に由来するクローン中で、ＴＫを含む断片の異なる位置が
観察された。これは、細胞ゲノム内のランダムなサイトに単一かつ独立した統合
が起こっていることを示唆する（図６ＡおよびＢ）。ＴＫ−Ｊｕｒｋａｔクロー
ンに由来するゲノムＤＮＡをＥｃｏＲＩ消化した場合も同様の結果が観察されて
いる（図６ＣおよびＤ）。ＴＫ−Ｊｕｒｋａｔ＃６は、異なる位置で２本のバン
ドを有しており、細胞ゲノムへのプロウイルスの多数の統合サイトを示している
。

【０１３７】ＰＣＲによるプロウイルス配列の増幅ＰＣＲによってプロウイルスの全配列（図１）を増幅するために、ＳＦＣＭＭ
３ベクターに沿ってプライマーを設計した。特定のプライマーを用いて断片１（
ＬＴＲ１⁺／ＨＴＫ５^- ０．９３ｋｂ）、断片３（ＨＴＫ１⁺／ＨＴＫ２^- ０．
７７ｋｂ）および断片４（ＨＴＫ１⁺／ＮＧＦ２^- ０．８７ｋｂ）を増幅した時
、ＴＫ−ＣＥＭおよびＴＫ−Ｊｕｒｋａｔクローンから抽出されたゲノムＤＮＡ
のＰＣＲ分析結果は、予想されたサイズのバンドを増幅した。断片３については
、生産細胞（ポジティブ・コントロール）中で増幅されたものより小さなバンド
が、１つのケース（ＴＫ−ＣＥＭ＃４）でのみ得られた。ＨＳＶ−ＴＫ遺伝子配
列に対応するバンド（断片２）はＴＫ−ＣＥＭクローン（＃３、＃６、＃８、＃
９、＃１０、＃１１、＃１３、＃１４および＃１５）およびＴＫ−Ｊｕｒｋａｔ
クローン（＃１、＃６、＃１１および＃１２）については予想されたものであっ
た。より小さな同じ大きさのバンドが、ＴＫ−ＣＥＭクローン（＃１、＃２、＃
４および＃１２）およびＴＫ−Ｊｕｒｋａｔクローン（＃５、＃９および＃１６
）について増幅された。クローン化されていない形質導入されたＣＥＭおよびＪ
ｕｒｋａｔ細胞（バルク集団）では、２本のバンドが、個々の単一のクローン中
で増幅したのと同じサイズに増幅された。１５個のＴＫ−ＣＥＭクローンのうち
の２つ（＃５と＃７）、および１５個のＴＫ−Ｊｕｒｋａｔクローンのうちの９
つのクローン（＃２、＃４、＃５、＃７、＃８、＃１０、＃１３、＃１４および
＃１８）が、ＰＣＲ（結果は図示していない）によってプロウイルスの配列を増
幅しなかった。これらの結果は、ＨＳＶＴＫとＬＮＧＦＲの遺伝子のサザン・ブ
ロット分析および発現分析によって前に観察されたものに一致する。

【０１３８】統合されたプロウイルスのＤＮＡ配列分析プロウイルス配列をさらに分析するため、ＨＳＶ−ＴＫ遺伝子（断片２）を含
むＤＮＡ断片をゲノムＤＮＡから増幅した。生じた断片は、ＴＯＰＯ−Ａベクタ
ー中にクローン化し配列決定した。クローンのうちのいくつかについて行なった
配列分析の結果は、ＰＣＲ（図７）によって増幅された小さなバンドが、ＨＳＶ
−ｔｋ遺伝子配列内の２２８ｂｐの削除に起因することを示した。分析したケー
スでは、結合領域が、隠れたドナー・サイトおよび隠れたスプライス・ドナー・
サイト（レトロウイルス・ベクターの位置１９９４でのＣＡＧＧ／ＧＴＧＡ）、
および隠れたスプライス・アクセプター・サイト（ＣＣＡＧ／ＧＣＣＧ（ＳＦＣ
ＭＭ３ベクターの位置２２２１））の接合によって発生した。この観察結果は両
者が形質導入されたＴ細胞株で確認された。

【０１３９】形質導入された主要Ｔリンパ球の上のＰＣＲ使用したレトロウイルス・ベクターは、当初は、主要Ｔリンパ球の形質導入を
含む多数センター臨床試験のために開発されていた。臨床使用のためのレトロウ
イルス・ベクターの効果に関して、我々は、形質導入され選択されたヒト主要Ｔ
リンパ球から抽出したゲノムＤＮＡから、ＰＣＲによってプロウイルスのＨＳＶ
−ＴＫ遺伝子領域を分析した。図８は６つの異なる実験においてセット・アップ
されたＰＣＲの結果を示している。ＴＫ−ＣＥＭおよびＴＫ−Ｊｕｒｋａｔクロ
ーンのうちのいくつかを使用して、ポジティブ・コントロールとネガティブ・コ
ントロールも平行して確立した。形質導入された主要Ｔ細胞中のＰＣＲによって
、完全長ＨＳＶ−ＴＫ遺伝子に対応する１本の単一バンドが増幅された。ＴＫ−
ＣＥＭおよびＴＫＪｕｒｋａｔのバルク集団は、トランケートされたＨＳＶ−Ｔ
Ｋ遺伝子の形に対応する予想されたサイズのより小さなバンドを示した。これら
の結果は、いくつかのクローン中で観察されたＨＳＶ−ＴＫ遺伝子内での削除は
、クローンが形質導入された細胞においてのみ生じるということを示しているか
もしれない。もっとも、この観察結果については、形質導入された主要細胞中で
のＨＳＶ−ｔｋ遺伝子の削除の頻度はＰＣＲの検知レベル未満であるという別の
説明も可能であろう。

【０１４０】ＴＫ−ＣＥＭおよびＴＫ−Ｊｕｒｋａｔクローン中でのトランケートされたＨ
ＳＶ−ＴＫ遺伝子の特異的増幅ＴＫ−ＣＥＭおよびＴＫ−Ｊｕｒｋａｔサブクローンのうちのいくらかで見出
されたトランケートされたＨＳＶ−ＴＫ遺伝子を特異的に増幅するため、ＨＳＶ
−ＴＫ遺伝子の削除交点（ｄｅｌｅｔｉｏｎｊｕｎｃｔｉｏｎ）においてプラ
イマーが設計された。増幅されたバンドのサイズは６４０ｂｐのはずである。
図９は、サブクローンから抽出されたゲノムＤＮＡを使用してセット・アップさ
れたＰＣＲで得られた結果を示す。ＴＫ−ＣＥＭクローン＃１、＃２、＃４およ
び＃１２ならびにＴＫ−Ｊｕｒｋａｔクローン＃５、＃９および＃１６が予想さ
れたサイズ（６４０ｂｐ）のバンドを増幅した。これらは、完全長ＨＳＶ−Ｔ
Ｋ遺伝子（図７）を増幅するためにプライマーを使用して、ＨＳＶ−ＴＫ遺伝子
について短いバンドを増幅したのと同じクローンである。形質導入されていない
腸管外のＣＥＭおよびＪｕｒｋａｔ細胞を含むすべてのケースで、９００ｂｐ
のより弱いバンドも増幅された。アニーリング温度を高くするなどのＰＣＲ条件
の修正を行なっても、ＰＣＲの特異性は改善されなかった。その後、我々は、Ｐ
ＣＲの結果に影響し得る何らかの汚染が含まれている可能性を排除するために干
渉バンドの配列決定を行なった。分析の結果、この干渉バンドの配列は、ＳＦＣ
ＭＭ３レトロウイルス・ベクターの任意の配列とも、または、ＧｅｎＢａｎｋま
たはＥＭＢＬデータ・ベース（１９９９年１月時点）中に表わされた他のいずれ
の配列とも対応しないことが明らかになった。これは、おそらくは、何らかの細
胞の配列がまだ同定されていないことを示すものである。

【０１４１】形質導入された主要Ｔリンパ球におけるトランケートされたＨＳＶ−ＴＫ遺伝
子の増幅耐ＧＣＶ性のクローン中でトランケートされたＨＳＶ−ＴＫ遺伝子を特異的に
増幅したプライマーを使用するＰＣＲを、形質導入され選択された主要Ｔリンパ
球から抽出されたゲノムＤＮＡを用いてセット・アップした。ポジティブ・コン
トロールとネガティブ・コントロールも平行してセット・アップした。６つの異
なる実験でトランケートされたＨＳＶ−ｔｋ遺伝子について予想されたサイズの
バンドを評価し、増幅した（図１０）。これらの結果は、ＨＳＶ−ＴＫ遺伝子が
、トランケートされた形質導入された主要Ｔリンパ球集団の中にも存在すること
を示す。主要細胞中のこのイベントは、トランケートされたＨＳＶ−ＴＫ遺伝子
の削除結合を増幅する特定のプライマーが使用される場合に限って観察されるた
め、その頻度はヒトＴ細胞株よりも頻度は低い。

【０１４２】考察単純疱疹ウイルス・チミジンキナーゼ・タイプ１（ＨＳＶ−ｔｋ）は、ＧＣＶ
やアシクロビルなどの無毒なプロドラッグを細胞毒性代謝物質に変換できる酵素
をコードする。これおよび他の自殺遺伝子／プロドラッグを使用する遺伝子トラ
ンスファー戦略は、癌治療のための新規な治療法として提案された^1;3;11。最近
になって、自殺遺伝子治療の使用が同種（ａｌｌｏｇｅｎｅｉｃ）骨髄移植（ａ
ｌｌｏ−ＢＭＴ）にも拡げられた。ＧＣＶの制御により、ＨＳＶ−ｔｋ遺伝子で
形質導入されたドナーＴリンパ球を循環（血中）から選択的に取り除くことがで
きる。これにより、相当なＧｖＬおよび免疫再構成を保ちつつＧｖＨＤの治療が
可能になるであろう^8;9。

【０１４３】我々の研究で使用したレトロウイルス・ベクターは、プロウイルスを発現する
細胞についての選択可能なマーカーとして働くΔＬＮＧＦＲ遺伝子を含む。ΔＬ
ＮＧＦＲｃＤＮＡは、神経成長因子に生物学上結合することができず、細胞質領
域を通って何らかの形質導入信号を引き起こすことがないように修正された¹²。
リポーター遺伝子としてのΔＬＮＧＦＲの使用は、形質導入効率をモニターし、
かつ、耐ネオマイシン性遺伝子などの他の遺伝子の発現に基づく一般に使用され
ているシステムより短い時間枠中で形質導入されたＴリンパ球の選択を促進する
ために提案された^13、14。さらに、遺伝子組換え細胞は容易に追跡でき、患者へ
の注入後に多分再選択できる。

【０１４４】ＨＳＶ−ｔｋ／ＧＣＶシステムの効能は、多くのｉｎｖｉｔｒｏとｉｎｖ
ｉｖｏのモデルにおいて実証された。癌治療のためのこのシステムの使用にはい
わゆる傍観者効果に由来する追加的長所があることがさらに示された。この状況
において、ＨＳＶ−ｔｋ形質導入された細胞は、形質導入されていない近隣の細
胞とともにＧＣＶの投与後に死ぬ。このイベントの基礎となるメカニズムは、形
質導入された腫瘍細胞と形質導入されていない細胞までの間のギャップ結合を通
してリン酸化ＧＣＶが転送されることによって仲介されるものと思われる¹⁵。腫
瘍塊中の細胞のいずれかの小片だけが形質導入される場合に腫瘍の完全な退縮に
は傍観者効果は、不可欠なことが示されている¹⁶。Ｔｉｂｅｒｇｈｉｅｎｅｔ
ａｌ（１９９４）¹⁷は形質導入された主要Ｔ細胞では、ＧＣＶによって引き起
こされた成長阻害が傍観者効果によって仲介しないことを実証した。彼らは、形
質導入されたＴ細胞と形質導入されなかったＴ細胞（５０：５０）およびＨＵＴ
−７８細胞（ＣＤ４⁺成熟Ｔ細胞リンパ腫細胞株）の混合物でＧＣＶの影響を検
討した。両方の例では、彼らは、傍観者効果により仲介される殺害を立証すべき
証拠を見出さなかった。ＨＳＶ−ｔｋＴリンパ球での傍観者効果の欠如はａｌ
ｌｏ−ＢＭＴにおいて、自殺遺伝子戦略の成功した適用にとって重要な意味合い
を有する。なぜならば、特にＧｖＨＤの原因であるこれらの細胞の循環（血中）
からの消耗除去が可能になるからである。

【０１４５】ＨＳＶ−ｔｋ遺伝子／ＧＣＶシステムの使用は、ＭｏｏｌｔｅｎおよびＷｅｌ
ｌｓ（１９８６）によって最初に提案された⁴。後になって、彼らは、さらに、
ｉｎｖｉｖｏでの研究においてＧＣＶ治療に対し、ＨＳＶ−ｔｋ形質導入され
た肉腫とリンパ腫の腫瘍細胞の再発を観察した^2;18。同様の観察は、異なる組織
および動物モデルに由来する腫瘍細胞でも確認された。Ｂａｒｂａｅｔａｌ
（１９９３）¹⁹は、ＨＳＶ−ｔｋ遺伝子を発現する遺伝子組換えラット神経膠腫
細胞が１４日間のＧＣＶ治療に続く培養中に死んだと記載している。結局、いく
つかの修正済の腫瘍細胞はＧＣＶに対して耐性を有するようになった。しかし、
傍観者効果のため、ＨＳＶ−ｔｋ遺伝子の不活性化は、ｉｎｖｉｖｏでの分析
結果では干渉せず、ＧＣＶ治療は、脳内の形質導入されていない腫瘍細胞をさら
に殺す結果をもたらした。同様の観察はヒトの腺癌細胞株において記載されてい
る。ｉｎｖｉｔｒｏでの研究は、上皮組織に由来した細胞がＨＳＶ−ｔｋ導入
遺伝子の適当な発現を示すことを明らかにした。一方、ＧＣＶ治療後の腫瘍退縮
は、ＨＳＶ−ｔｋが形質導入された腺癌細胞を含むヌード・マウスでは観察され
なかった。このｉｎｖｉｖｏモデルでは、傍観者効果の欠如は、形質導入され
た腫瘍細胞の小さな部分集合中のＨＳＶ−ｔｋ遺伝子の不完全な発現を排除する
ためには寄与していなかった。

【０１４６】形質導入された腫瘍細胞のＨＳＶ−ｔｋ遺伝子の発現欠如の基礎となるメカニ
ズムは、あまり理解されていない。ＧＣＶへの細胞感受性の変化、細胞周期から
の腫瘍の一時的な脱出、ＨＳＶ−ｔｋ遺伝子の不活性化または欠損、ＨＳＶ−ｔ
ｋｍＲＮＡ中の構造変化、および一時的なメチル化が起こっているなど、種々
の説明が、文献において提案されている。ＤｉＩａｎｎｉｅｔａｌ（１９
９７）²⁰は、両シストロンのベクター中でＨＳＶ−ｔｋ遺伝子およびバクテリア
のβ−ガラクトシダーゼ遺伝子（ＬａｃＺ遺伝子）を発現するように遺伝子的に
操作されたＵ９３７細胞（ヒト造血組織悪性腫瘍細胞株）に由来するクローン中
ではＨＳＶ−ｔｋ導入遺伝子の発現が欠如することを報告している。さらに、Ｇ
ＣＶについて耐性を示すサブクローンでは、５−ブロモ−４−クロロ−３−イン
ドリル−β−ガラクトピラノサイト（Ｘ−Ｇａｌ）による組織化学的染色が起こ
らない。彼らはまた、５−アザシチジン（ジメチル化剤）を有する耐性クローン
を培養した。この処理は、２つの導入遺伝子のずれの発現も回復することができ
なかった。著者は、さらに、両シストロンのベクターのＬＴＲで再配置または変
異の可能性を開いた。

【０１４７】ＨＳＶ−ｔｋ遺伝子を運ぶレトロウイルス・ベクターで形質導入されたヒト主
要Ｔリンパ球中のＧＣＶ耐性は、異なるグループによって確証されている。Ｔｉ
ｂｅｒｇｈｉｅｎｅｔａｌ（１９９４，１９９７）^9;17はＩＬ−２応答性で
ある形質導入されたネオマイシン選択性Ｔ細胞のＧＣＶ治療後の成長阻害が８０
％〜９０％の間であると記載している。これらの結果は、形質導入された集団の
少なくとも１０％がＧＣＶによる殺害に抵抗することを示唆しているとも言える
。形質導入されたドナーＴ細胞を使用する最初の臨床試験で、Ｂｏｎｉｎｉｅ
ｔａｌ．（１９９６）¹⁰は、一人の患者が慢性ＧｖＨＤを発症するのを観察し
た。ＧＣＶ投与後、形質導入されたドナー細胞の割合は１１．９％から２．８％
まで低減した。ＧＣＶによる集中的な治療後、循環（血中）からの形質導入され
たドナー由来Ｔ細胞の完全な消耗除去は実現し得ないものであった。これは、ド
ナーＴリンパ球の約２３％がＨＳＶ−ｔｋ遺伝子の適切な発現を欠いていること
を意味するであろう。Ｖｅｒｚｅｌｅｔｔｉｅｔａｌ（１９９８）は、慢性
ＧｖＨＤを発症している患者中で観察されたＧＣＶ耐性をさらに特徴づけた。著
者は、ＨＳＶ−ｔｋ遺伝子配列に生じる分子イベントではなくＨＳＶ−ｔｋ／Ｇ
ＣＶシステムの細胞周期依存を主張した。

【０１４８】レトロウイルス・ベクターを使用することで、我々は、形質導入され選択され
たＴＫ−ＣＥＭおよびＴＫ−Ｊｕｒｋａｔ集団に由来するサブクローンのうちの
いくつかが、ＨＳＶ−ｔｋ遺伝子の適切な発現を示していないことを見出した。
サザン・ブロットは、細胞ゲノム中に統合されたプロウイルスが短縮されている
ことを明らかにした（図５）。クローン中で行なったＰＣＲ分析は、ＧＣＶ耐性
に関わる分子的イベントがプロウイルス（断片２（図７））のＨＳＶ−ｔｋ遺伝
子配列で起こることを明らかにした。配列決定分析は、ＨＳＶ−ｔｋ遺伝子の短
縮型は、ＨＳＶ−ｔｋ遺伝子のＤＮＡ配列における２２８ｂｐの削除によるもの
であることを示した。結合領域のマッピングは、それぞれベクターの位置１９９
３および２２１の隠れたスプライス・ドナー・サイトおよび隠れたスプライス・
アクセプター・サイトの接続に相当する。これらの知見は、生産細胞では、プロ
ウイルスからのｍＲＮＡの一部が、Ａｍ１２細胞のスプライス装置類によって認
識され、スプライスされたベクター由来ＲＮＡをもたらすことを示唆しているか
もしれない。また、これは、異常なＨＳＶ−ｔｋ遺伝子を担う小部分とともに完
全長ＨＳＶ−ｔｋ遺伝子を含むウイルス粒子の生産を引き起こすかもしれない。
このメカニズムは、トランケートされたプロウイルスＨＳＶ−ｔｋ遺伝子が標的
細胞に入り込む道を説明する。ＴＫ−ＣＥＭクローン上で行なったノーザン・ブ
ロット分析は、トランケートされた遺伝子を有するクローン中では異常なＨＳＶ
−ｔｋ転写物が形成されることを明らかにしている（結果は示していない）。非
機能的なタンパク質は異常なＨＳＶ−ｔｋ遺伝子配列によってコードされうる。

【０１４９】削除されたＨＳＶ−ｔｋ遺伝子を含む形質導入された細胞の頻度は、形質導入
されたＴ細胞株より形質導入された主要Ｔ−リンパ細胞の方が低いように見える
。形質導入された主要Ｔリンパ球中でトランケートされたＨＳＶ−ｔｋ遺伝子を
検出するために、ＨＳＶ−ｔｋ遺伝子の削除結合がＰＣＲによって特異的に増幅
されることを可能にするプライマーが考案された。この観察結果は、削除された
ＨＳＶ−ｔｋ遺伝子に由来するウイルス粒子が、形質導入されたＴ細胞より主要
Ｔリンパ球に対しては感染能力が低いということを示しているのかもしれない。
もっとも、形質導入されたＴ細胞株では、機能的なＨＳＶ−ｔｋ酵素が細胞代謝
のどの経路にも干渉しないので、完全長ＨＳＶ−ｔｋ遺伝子を有するものに関し
てｉｎｖｉｔｒｏでの増殖では異常形ＨＳＶ−ｔｋ遺伝子を含むクローンが有
利であるという可能性もある。

【０１５０】Ｙａｎｇと同僚（１９９８）²¹は、ＨＳＶ−ｔｋ形質導入された胃腸腫瘍細胞
において耐性コロニーを見出した。耐性コロニーの同定は、ＨＳＶ−ｔｋ遺伝子
が、ＨＳＶ−ｔｋ形質導入細胞から部分的（２２０ｂｐ削除）または完全に削除
されているかいずれかであることを実証した。興味深いことに、ＧＣＶ耐性に関
与する未知の細胞メカニズムの可能性を排除するために、彼らは、ＨＳＶ−ｔｋ
遺伝子を含むアデノウイルスのベクターでレトロウイルス的に形質導入したＧＣ
Ｖ耐性クローンを感染させた。ＧＣＶ感度は回復し、機能的なＨＳＶ−ｔｋ蛋白
質を発現するこれらの細胞の能力を示唆した。我々の知見とは対照的に、彼らの
結果は、試験した異なる胃腸の腫瘍細胞株中でＧＣＶの細胞毒素の効力が変化す
ることを示している。前に論じたように、ＧＣＶ耐性が形質導入された細胞は、
良好な傍観者効果がある細胞株では識別されなかった。

【０１５１】利用可能な臨床のデータと同様にｉｎｖｉｔｒｏおよびｉｎｖｉｖｏのデ
ータの検討でも、癌遺伝子治療およびａｌｌｏ−ＢＭＴのためのＨＳＶ−ｔｋ遺
伝子／ＧＣＶシステムの使用が臨床において現実的な改善案となることを示唆す
る。しかし、近い将来に解決される必要のある重要な制限がある。これらの結果
は、遺伝子操作された細胞の最適の殺す効率（１００％）を達成するために、新
しい自殺遺伝子またはＨＳＶ−ｔｋ遺伝子などのような現在使用中のものの最適
化されたバージョンが開発されるべきであるという考えを強く支持する。実施例
２において示すように、我々はＨＳＶ−ｔｋＤＮＡ配列を修正し、それが宿主
細胞のスプライシング装置類によって無視されるようにした。この戦略は、臨床
使用のための改善されたＨＳＶ−ｔｋ遺伝子を含むベクターの開発を可能にする
。

【０１５２】実施例２：自殺遺伝子治療用のＨＳＶ−ｔｋ／ＧＣＶシステムの効果を改善す
る野生型ＨＳＶ−ｔｋ遺伝子配列の修正自殺遺伝子は、その作用がなければ無毒である化合物に対し、細胞を感受性に
する酵素をコードする。単純疱疹ウイルス・タイプ１（ＨＳＶ−ｔｋ）によって
コードされたチミジンキナーゼは、ガンシクロビル（ＧＣＶ）を、ＤＮＡの伸張
を阻害する代謝物質に変換する。このイベントは正常な細胞には生ぜず、細胞に
死をもたらす。したがって、ＨＳＶ −ｔｋ遺伝子を人工的にＴリンパ球の中に
送り込むことにより、分裂するＴ細胞を必要な時に殺すシステムを提供すること
ができる。このアプローチは、癌の治療およびＤＬＩによって引き起こされるＧ
ＶＨＤの抑制のために開発され、有効であると分かった。

【０１５３】ＨＳＶ−ｔｋ／ＧＣＶシステムの効果は、多くのｉｎｖｉｔｒｏおよびｉｎ
ｖｉｖｏモデルで実証された。しかし、我々は、形質導入された集団内に、Ｇ
ＣＶによる殺害に対して耐性を有する遺伝子操作された細胞の部分集合が存在す
ることを見出した。形質導入された細胞においてＨＳＶ−ｔｋ遺伝子の発現が欠
如する基礎にあるメカニズムは、よく理解されていない。我々は、形質導入され
選択された細胞に由来する耐ＧＣＶ性のサブクローンを単離した。分析を行なっ
た結果、導入遺伝子の不適切な発現に関与する分子的メカニズムは、少なくとも
ある状況では、ＨＳＶ−ｔｋ遺伝子配列において２２７ｂｐの削除部分があるこ
とを含んでいる、ということが明らかになった。トランケートされたＨＳＶ−ｔ
ｋ遺伝子のマッピングは、結合領域が、それぞれ５’端および３’端の位置８４
４および１０７１にある隠れたスプライス・ドナー・サイトおよび隠れたスプラ
イス・アクセプター・サイトの接着点に相当することを示した（図１１）。

【０１５４】我々の知見は、レトロウイルス生産細胞では、プロウイルスに由来するｍＲＮ
Ａの一部がベクターに由来するｍＲＮＡ中にスプライスされていることを示す。
これは、ＨＳＶ−ｔｋ遺伝子の異常な形式を運ぶ小部分とともに完全長ＨＳＶ−
ｔｋ遺伝子を含むウイルス粒子の生産を引き起こすと考えられる。このメカニズ
ムは、トランケートされたプロウイルスＨＳＶ−ｔｋ遺伝子が標的細胞に入り得
ることを説明する。

【０１５５】我々の結果は、野生型ＨＳＶ−ｔｋ遺伝子配列の隠れたスプライス・ドナーお
よび受容体サイトでの修正によって、最適化された自殺遺伝子がもたらされると
いう考えを強く支持する。この場合、宿主細胞のスプライシング装置類は遺伝子
操作されたｍＲＮＡ転写物を無視するはずである。修正されたＨＳＶ−ｔｋＤ
ＮＡ配列は、遺伝子の野生型の配列に由来するものでありサイトを結合する隠れ
たｍＲＮＡのアブレーションによる。位置８４２（ＧＡＣＣＡＧＧＧＴから
ＧＡＣＣＡＡＧＧＴ）および１０７０（ＣＣＣＣＡＧＧＣＣからＣＣＣＣＡＡＧＣＣ）の２箇所の変異を、突然変異を起こし得るオリゴヌクレオチ
ドの酵素による拡張によって同時に導入した。いずれの例でも、ＨＳＶ−ｔｋ酵
素の野生型アミノ酸配列が保存されている。

【０１５６】部位特異的突然変異生成によって修正されたＨＳＶ−ｔｋ遺伝子は、所望の位
置の隠れたスプライシング・サイトのアブレーションを確認するために配列決定
された。形質導入された細胞の遺伝子操作された蛋白質の発現は、野生型ＨＳＶ
ｔｋ遺伝子が形質導入された細胞の中で得られたそれに似ていることが、細胞増
殖分析における阻害結果によって示されている。形質導入された細胞においてト
ランケートされたＨＳＶ−ｔｋ遺伝子を特異的に増幅するために開発されたＰＣ
Ｒは、修正されたＨＳＶ−ｔｋ遺伝子で形質導入された細胞では、削除されたＨ
ＳＶ−ｔｋ遺伝子が識別されなかったことを示した。我々は、修正された遺伝子
を使用して形質導入された細胞に由来するサブクローンをスクリーニングした。
ベクターのＨＳＶ−ｔｋ遺伝子配列の２２７−ｂｐ削除は、試験されたクローン
のうちのいずれにおいても識別されていない。

【０１５７】上述の位置８４２および１０７０での変異は、ＤｅｎｇおよびＮｉｃｋｏｌｏ
ｆｆ（１９９２；Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．２００：８１）の方法で導され
た。商用キット（Ｔｒａｎｓｆｏｒｍｅｒ（商標）Ｓｉｔｅ−Ｄｉｒｅｃｔｅｄ
ＭｕｔａｇｅｎｅｓｉｓＫｉｔ；Ｃｌｏｎｔｅｃｈ，ＰａｌｏＡｌｔｏ，
ＣＡ，ＵＳＡ）は、レトロウイルス・ベクターの中でＨＳＶ−ｔｋ遺伝子の修正
のために使用された。いずれの例でも、ＨＳＶ−ｔｋ酵素の野生型のアミノ酸配
列が保存されている。この方法は、変性された二本鎖プラスミドＤＮＡの一方の
ストランドに２以上のオリゴヌクレオチドプライマーを同時にアニールすること
によって、任意の二本鎖プラスミドに特異的塩基の変化を導入することを可能に
するものである。我々のケースでは、２つの異なるプライマー（ＭＵＴ１＋：Ｃ
ＣＧＣＣＴＣＧＡＣＣＡＡＧＧＴＧＡＧＡＴＡＴＣおよびＭＵＴ２＋：ＣＡＧＣ
ＡＴＧＡＣＣＣＣＣＣＡＡＧＣＣＧＴＧＣＴＧＧＣＧＴＴＣ）が所望の変化を導
入するために使用された（変異源的プライマーと呼ばれる。）。３番めのプライ
マー（選択プライマー；ＭＵＴ３＋：ＡＧＴＧＣＡＣＣＡＴＧＧＧＣＧＧＴＧＴ
ＧＡＡＡＴは選択酵素消化の目的でプラスミド中のユニークな制限酵素サイト（
ＮｄｅＩ）を変化させる。標準的なＤＮＡの伸張およびライゲーションの後に、
変異ＤＮＡストランドを部分的に豊富化するために１次選択をＮｄｅＩ消化に
よって行なった。ＭｕｔＳ大腸菌細胞（ミスマッチ修復欠損株）は消化された混
合物を使用して形質転換された。プラスミドＤＮＡは混合バクテリアの集団から
抽出され、第２の選択的なＮｄｅＩ消化が行なわれた。この戦略によって、親
の（非変異）ＤＮＡは線形化され、バクテリア細胞の形質転換を遥かにしにくい
ものにした。徹底消化されたＤＮＡのＤＨ５αバクテリアの細胞への最終的な形
質転換が行なわれた。ＤＮＡは個々の形質転換体から分離された。所望の変異の
存在は、第一に、コロニーから抽出されたプラスミドＤＮＡを制限酵素分析によ
って確認された。ＥｃｏＮＩが、レトロウイルス・ベクターの位置１９９３で引
き起こされた変化を検知するために使用された。形質転換体＃２および＃６が、
ＭｖａＩ消化によってレトロウイルス・ベクターの位置２２２１で第２の変異の
ためにさらに同定された（図１２）。突然変異生成実験中にＤＮＡ配列に他の修
正が導入されなかったことを確認するためにこれらのコロニーから分離されたプ
ラスミドＤＮＡ中で、配列分析も行なわれた。

【０１５８】実施例３：単純疱疹ウイルス・チミジンキナーゼ自殺遺伝子からのトランケー
トされたメッセージの除去標的細胞に導入された単純疱疹ウイルス・チミジンキナーゼ（ＨＳＶ−Ｔｋ）
遺伝子は、それらをガンシクロビル（ＧＣＶ）による殺害を受けやすくする。我
々は、造血幹細胞移植においてＨＳＶ−Ｔｋ−形質が導入されたＴリンパ球の使
用を研究している。我々は、以前にｉｎｖｉｔｒｏおよびｉｎｖｉｖｏで、
ＨＳＶ−Ｔｋ遺伝子内の削除によりＧＣＶに耐性を有する形質導入された細胞の
発生を示した。この削除は、隠れたスプライス・ドナーおよび受容体サイトの存
在の結果であり、レトロウイルス生産細胞に由来する。ここに、我々は２つの異
なる方法（それらは隠れたスプライス・サイトに３番目塩基の縮重的変化を導入
し、したがって、スプライシングを防ぐ）を採用する。結果として、ＨＳＶ−Ｔ
ｋタンパク質は変化せず、ＧＣＶへの標的細胞の感度は保存される。また、この
変異されたＨＳＶ−Ｔｋ遺伝子の使用は、臨床試験において、抵抗する遺伝子組
換え細胞の成長の可能性を縮小するはずである。

【０１５９】我々と他の者は、形質導入されたＴ細胞を使用して、同種（ａｌｌｏｇｅｎｅ
ｉｃ）造血幹細胞移植後に同種異系活性（ａｌｌｏｒｅａｃｔｉｖｉｔｙ）を調
整するために単純疱疹ウイルス・チミジンキナーゼ（ＨＳＶ−Ｔｋ）遺伝子を発
現するドナーＴ細胞の使用を評価している^1,2,3。ＨＳＶ−Ｙｋ遺伝子を含むド
ナーＴ細胞の、Ｔ細胞を消耗した移植片の同時注入は、移植片対白血病効果を有
効に保つが、これらのＴ細胞は次いで、移植片−対宿主病が開始した時点で、Ｇ
ＣＶ投与によって除去することができる⁴。他のグループは、エプスタイン・バ
ー・ウイルスに関連するリンパ−増殖性疾患または移植後の白血病再発を治療す
るために、形質導入されたドナーＴ細胞を同様に使用した^2,5,6。

【０１６０】我々は、ｉｎｖｉｔｒｏおよびｉｎｖｉｖｏで、ＨＳＶ−Ｔｋ遺伝子の
トランケートされた形式を含んでいる耐ＧＣＶ性のＨＳＶ−Ｔｋが形質導入され
たヒトＴリンパ球の存在を示した⁷。このトランケーションの出所は、レトロウ
イルス・パッケージング細胞（それらは標的細胞に続いて送られた）内の遺伝子
のスプライシングまでトレースされた。耐ＧＣＶ性細胞の分子の分析は、隠れた
スプライス・ドナー・サイトおよび受容体サイトの存在により２２７−ｂｐ断片
の削除を実証した⁷。ここに、我々は、形質導入されたＴ細胞中のＧＣＶ感度を
保存しつつ、パッケージング細胞株中でのプライシングを防ぐためにＨＳＶ−Ｔ
ｋ遺伝子を変異させることができることを実証する。

【０１６１】材料と方法部位特異的突然変異生成によるドナー・スプライス・サイトおよび受容体スプ
ライス・サイトの両方の訂正スプライスされていない変異生産のための第１の戦略は部位特異的突然変異生
成を用いる（Ｔｒａｎｓｆｏｒｍｅｒ（商標）Ｓｉｔｅ−ｄｉｒｅｃｔｅｄｍ
ｕｔａｇｅｎｅｓｉｓｋｉｔ，Ｃｌｏｎｔｅｃｈ，ＰａｌｏＡｌｔｏ，Ｃａ
．ＵＳＡ）⁸。２つのプライマー、Ｍｕｔｌ（５’−ＣＣＧＣＣＴＣＧＡＣＣＡ
ＡＧＧＴＧＡＧＡＴＡＴＣ−３’）およびＭｕｔ２（５’−ＣＡＧＣＡＴＧＡＣ
ＣＣＣＣＣＡＡＧＣＣＧＴＧＣＴＧＧＣＧＴＴＣ−３’）が、スプライス・ドナ
ー・サイト（２６７）および受容体サイト（４９４）（ＡＴＧである開始コドン
から数た塩基の番号）で所望の第３塩基変異（太字）ｐＳＦＣＭＭ３ベクター内
に含まれるＨＳＶ−Ｔｋ遺伝子中に導入するために用いられた⁹。訂正されたク
ローン（ｐ−ｓｃＳＦＣＭＭ３）からのＤＮＡは、記載されているように配列決
定された⁷。

【０１６２】最小のＰＣＲによるスプライス・アクセプター・サイトの修正スプライス・アクセプター・サイトの側面は、位置４１７と５３４においてＢ
ｇｌＩサイトを有する。１３７個のＤＮＡ塩基対断片は、プライマーＭｕｔ３（
５−ＣＧＴＧＡＣＣＧＡＣＧＣＣＧＴＴＣＴＧＧＣＴＣＣＴ−３）およびＭｕｔ
４（５−ＧＧＣＣＡＣＧＡＡＣＧＣＣＡＧＣＡＣＧＧＣＴＴＧＧＧＧ−３）（Ｂ
ｇｌＩサイト）を使用して増幅された。下流のプライマーは三番目塩基の縮退点
変異（太字）を含んでいる。プラスミド、ｐＢＳＣＫ＋（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ
，ＬａＪｏｌｌａ，ＣＡ．ＵＳＡ）はＢｇｌＩで消化された、平滑末端化され
、ｐＢＳＣｄＢｇｌＩを形成するために再ライゲートされた。ＨＳＶ−Ｔｋ遺伝
子は、Ｂｇｌ１１とＸｈｏ１を使用し、ｐＳＰ６５Ｔｋ（ＧＴＩＧａｉｔｈｅ
ｒｓｂｕｒｇ，ＭＤ，ＵＳＡ）から取り出され、ｐＢＳＣｄＢｇｌのＢａｍＨ／
Ｘｈｏ１サイトへクローン化された。このプラスミドはＢｇｌ１で消化され、増
幅されＢｇｌ１消化されたＨＳＶ−Ｔｋによる変異断片とのライゲーションの前
にゲル精製された。野生型および修正されたＨＳＶ−Ｔｋ遺伝子は配列確認され
た後、Ｎｏｔ１／ｘｈｏ１消化によりレトロウイルス・ベクターｐＳＦ／ＳＶ／
ｎｅｏ（ｐＳＦ１Ｎベクター¹⁰の修正版であり、クローニング・サイトおよび内
部ＳＶ４０プロモーターから発現されたネオマイシンホスホトランフェラーゼ遺
伝子を含んでいる）に転送され、それぞれｐＳＦ／Ｔｋ／ｗｔおよびｐＳＦ／Ｔ
ｋ／ｍｕｔを形成した。

【０１６３】ウイルス生産細胞株の生成ｐ−ｓｃＳＣＭＭ３でトランスフェクトされたＧＰ＋Ｅ８６自己指向性（ｅｃ
ｏｔｒｏｐｉｃ）パッケージング細胞¹¹からの上清を使用してＧＰ＋ｅｎｖＡ
ｍ１２ａｍｐｈｏｔｒｏｐｉｃ細胞株を感染させた¹²。ｐＳＦ／Ｔｋ／ｍｕｔ
およびｐＳＦ／Ｔｋ／ｗｔは、Ψクリップ（ｃｒｉｐ）¹³に感染し、４００μｇ
／ｍｌのＧ４１８（Ｌｉｆｅ−ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｃｅｒｇｙ，Ｐｏｎ
ｔｏｉｓｅ，Ｆｒａｎｃｅ）中で選択された⁷。

【０１６４】形質導入された細胞中でのスプライス分析主要Ｔ細胞およびＴ細胞株、ＨｕＴ７８（ＡＴＣＣＴＩＢ−１６１）および
ＣＥＭ（ＡＴＣＣＣＲＬ２２６５）］がＧ１Ｔｋ１ＳＶＮａ、ＳＦ／Ｔｋ／
ｗｔ、ＳＦ／Ｔｋ／ｍｕｔ、ＳＦＣＭＭ３またはｓｃＳＦＣＭＭ３ベクターで形
質導入された。ＨＳＶ−ＴｋＰＣＲ（上記７に記載されているように）は形質
導入された標的細胞上で行なった。さらに、５’プライマーを使用してＨＳＶ−
Ｔｋ遺伝子の削除形を選択的に増幅するプライマーを使用してＰＣＲを行なった（それは切断ポイントを測る）［ＴｒＴｋ１：５’ＣＴＣＧＡＣＣＡＧＧ§Ｇ
ＣＣＧＴＧＣＴ。（§は結合（ｊｕｎｃｔｉｏｎ）を指す）および前述のＲＴｋ
２３’プライマー⁷。７に記述されるように、形質導入された細胞株からのス
プライシングの量が計られた。

【０１６５】結果と議論我々は、ＨＳＶ−Ｔｋ遺伝子内のスプライシングを除去するために２つの成功
したアプローチを採用した。これは、パッケージング細胞株を含む訂正されたＨ
ＳＶ−Ｔｋによって生産されたウイルスで形質導入されたＴ細胞株または主要な
Ｔ細胞におけるトランケートされたＨＳＶ−Ｔｋ遺伝子の欠如によって証拠づけ
られる。

【０１６６】図１７Ａでは、ＧＩＴｋ１ＳＶＮａ（ＳＦ／Ｔｋ／ｗｔ＋／−ＧＣＶ）で形質
導入したＨｕｔ７８細胞に由来するＰＣＲ産物のサザン・ブロットが、ＧＣＶの
集中が増すにつれて、完全長ＨＶ−Ｔｋ遺伝子からの信号の減少と削除された遺
伝子からの増加した信号を示す（さらにｉｎｖｉｖｏでの観察結果も参照⁷）
。対照的に、トランケートされた遺伝子は、ＳＦ／Ｔｋ／ｍｕｔで形質導入され
た細胞では検知されない。同一の知見は、ＣＥＭ細胞を標的細胞（データは示し
ていない）として、ＳＦ／ＴＫ／ｗｔ、ＳＦ／Ｔｋ／ｍｕｔおよびＳＦＣＭＭ３
とｓｃＳＦＣＭＭ３のウイルスと同様に使用して観察された。

【０１６７】ＳＦＣＭＭ３またはｓｃＳＦＣＭＭ３ベクターで形質導入された主要Ｔ細胞の
分析でも、訂正された遺伝子で形質導入された細胞中で全長遺伝子を示し、一方
、野生型のベクター（図１７Ｂ）を含む細胞では全長およびトランケートされた
かたちが見られた。トランケーション特異的プライマーを使用するＰＣＲは同様
の結果（図１７Ｃ）を与えた。

【０１６８】我々は、ＳＣＦＭＭ３およびＧ１Ｔｋ１ＳＶＮａのベクターで形質導入された
ＣＥＭ細胞においてはスプライシングの起こる頻度がそれぞれ１５．５％および
９．２％であると以前に報告した⁷。訂正されたベクターの使用は、すべてのス
クリーニングされたコロニーのスプライシングが存在しない（ＳＦ／Ｔｋ／ｍｕ
ｔを含むもの０／４６およびｓｃＳＦＣＭＭ３を含むもの０／１２６）ことを確
認した。

【０１６９】図１８では、我々は、形質導入された細胞のＧＣＶへの感度が、変異によって
も低減しない（これは、ＨＳＶ−Ｔｋアミノ酸配列が保存されていたことから予
想できた）ことを示す。変異したＨＳＶ−Ｔｋ遺伝子を発現する、Ｔ細胞株およ
び主要Ｔ細胞のＧＣＶ感度は、野生型遺伝子によって形質導入された集団と比較
して、わずかに増加したのみであった。このＧＣＶが誘導する細胞増殖の阻害に
ついての特定の分析結果は、野生型の遺伝子を発現する細胞で達成された、８０
〜９０％の阻害以上の増加したＧＣＶ感度を実証するのには最適ではないかもし
れない¹⁴。この仮説と一致するように、ラットＨＳＶ−Ｔｋ遺伝子組換えＴ細胞¹⁵ （ここで、両者とも全長およびトランケートされたメッセージが同じ野生型Ｈ
ＳＶ−Ｔｋ遺伝子から生産される（データは示していない））のＧＣＶ阻害もま
た８０〜９０％であった¹⁶。結局、ｉｎｖｉｖｏでの評価だけが増加したＧＣ
Ｖ感度を実証していると言えるであろう。

【０１７０】ＤＮＡメチル化¹⁷、ｍＲＮＡの転写後のプロセッシングや３ステップ経路での
変異^18、19などのその他のメカニズムでこれらのケース（完全なＨＳＶ−Ｔｋメ
ッセージが形質導入された細胞に検出されている）を説明することも可能である
。

【０１７１】さらに、代替メカニズムによるＧＣＶ耐性が主要Ｔ細胞に生じているのかもし
れない。完全なＨＳＶ−Ｔｋメッセージが生産されているにも拘わらず、形質導
入された細胞は、ＤＮＡメチル化による遺伝子沈黙などのメカニズムによってＧ
ＣＶ耐性を引き起こしているのかもしれない^17、18。さらに、ＧＣＶが細胞周期
からの一時的撤退によってＧＣＶの影響を結局回避しているのかもしれない¹⁹。
最後に、ＧＣＶは３ステップ経路によって代謝されているので²⁰、他の遺伝子に
おける変異も関わっているのかもしれない。

【０１７２】これらの留保にもかかわらず、耐ＧＣＶ性のトランケートされたＨＳＶ−Ｔｋ
発現細胞は、我々の患者においてはＧＣＶ処置後に循環する遺伝子の重要な割合
を構成した⁷。したがって、隠れたスプライシングが廃止された、訂正されたＨ
ＳＶ−Ｔｋ遺伝子の使用が、ＧＣＶ耐性遺伝子に修正されたドナーＴ細胞の数を
ｉｎｖｉｖｏで著しく減少させるであろうと予測することができる。さらに細
胞を発現するＨＳＶ−Ｔｋを使用する臨床試験は、そのような変異させられたＨ
ＳＶ−Ｔｋ遺伝子の使用から利益を得るはずである。

【０１７３】実施例４：治療遺伝子治療は体細胞のゲノムを治療目的のために修正する、臨床的戦略である
。遺伝子的に操作された細胞の受容者にとって直接臨床的利益が焦点となってい
ない場合でも、ヒトの生理学についての価値のある情報が、遺伝子転送（ｔｒａ
ｎｓｆｅｒ）研究から得ることができる。本質的に、遺伝子の転送は、１つまた
は複数の遺伝子とそれらの発現の制御のために必要な配列とを含む発現ベクター
を細胞を標的として送達することを含んでいる。一般に、発現ベクターは、標的
細胞へｉｎｖｉｔｒｏで転送される。その後、発現ベクターを運ぶ修正された
細胞は、受容者に投与される。最近では、個体中で発現ベクターをｉｎｖｉｖ
ｏで細胞投与することが、実現可能な代替案となっている。

【０１７４】大多数の臨床試験では、組換えレトロウイルスが遺伝子送達のためにビヒクル
としてより一般的に使用されるベクター・システムである。遺伝子情報は、ＲＮ
Ａの形をして運ばれ、特定の受容体によって標的細胞に入る。感染した細胞の内
部では逆転写によってＤＮＡに変換される。次いで、ウイルス由来のＤＮＡは宿
主細胞（プロウイルス）ゲノムにランダムに取り込まれ、発現カセットが治療用
遺伝子にコードし始める。

【０１７５】臨床の遺伝子トランスファー研究で使用されるレトロウイルス・ベクターは、
ネズミ白血病ウイルス（ＭＬＶ）に由来する。レトロウイルス・ベクター・シス
テムはほとんどすべて２つの部分から成っている。第１のコンポーネントは治療
の遺伝子を含む発現ベクターである。これは、ＲＮＡの形をしてレトロウイルス
・ベクター粒子のゲノムを構成する。ｇａｇ、ｐｏｌおよびｅｎｖはウイルスか
ら削除され、複製不能になる。システムの第２の部分、パッケージング細胞株は
ベクター・ウイルス粒子の生産のために必要になる。これらの細胞は２種の異な
る発現構築体から失われたレトロウイルス構造のタンパク質（ｇａｇ、ｐｏｌお
よびｅｎｖ）を生産するために遺伝子操作される（第３世代の生成レトロウイル
ス・ベクター・システム）。これらのタンパク質は（形質導入する）標的細胞を
感染させることができるウイルスをパッケージにするために必要とされる。

【０１７６】遺伝子的に操作された哺乳類細胞のＨＳＶ−ｔｋ遺伝子の発現は、それらをプ
ロドラッグＧＣＶに対し感受性にする。ＨＳＶ由来のチミジンキナーゼはＧＣＶ
をリン酸化できる。モノリン酸化されたＧＣＶは、細胞キナーゼによって鎖の終
端（図１３）によってＤＮＡ複製を阻害するＧＣＶ三リン酸塩に形質導入される
。この戦略は様々な動物モデルで移植された腫瘍の軽減を引き起こすために使用
された（ＦｒｅｅｍａｎＳＭｅｔａｌ，１９９６；ＳｅｍｉｎＯｎｃｏ
ｌ２３：３１−４５）。ヒトにおいても脳と腎臓の腫瘍の治療で評価されてい
る（ＣｕｌｖｅｒＫＷ，ＢｌａｅｓｅＲＭＴｒｅｎｄｓ．Ｇｅｎｅｔ．１
０：１７４，１９９４；ＭｏｏｌｔｅｎＦＬ，ＷｅｌｌｓＪＭ：Ｊ．Ｎａｄ
．ＣａｎｃｅｒＩｎｓｔ．８２：２９７，１９９０）。

【０１７７】同種骨髄移後に、造血組織悪性腫瘍の寛解または再発があった患者には、ＨＳ
Ｖ−ｔｋ形質導入されたドナーＴリンパ球を現在注入されている。このアプロー
チは、移植片対宿主病（ＧｖＨＤ）の原因である同種異系活性（ａｌｌｏｒｅａ
ｃｔｉｖｅ）なドナーＴ細胞を循環（血中）から選択的に消耗除去することを可
能にするものである。ＧｖＨＤは、免疫療法採用上の主要な問題である（Ｇｒａ
ｆｔ−ｖｅｒｓｕｓ−ｈｏｓｔ−ｄｉｓｅａｓｅ：Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，ｐａ
ｔｈｏｐｈｙｓｉｏｌｏｇｙａｎｄｔｒｅａｔｍｅｎｔ．ＮｅｗＹｏｒｋ
，ＭａｒｃｅｌＤｅｋｋｅｒ，１９９０）。

【０１７８】本明細書で記載するベクターは、これらのアプローチの中で使用される。

【０１７９】実施例５：臨床試料中のトランケートされたＨＳＶ−ｔｋ遺伝子の識別単純疱疹ウイルス・チミジンキナーゼ遺伝子を運ぶレトロウイルス・ベクター
で形質導入されたドナーヒトＴリンパ球の中のガンシクロビル耐性と同じ分子の
メカニズムが、実施例１に記載したｉｎｖｉｔｒｏ研究での臨床試料において
観察された。

【０１８０】実施例１と同様な検討が、別のレトロウイルス・ベクター（Ｇ１Ｔｋ１ＳｖＮ
ａ；その構造図１参照；ベクターはＨＳＶ−ｔｋおよびＮｅｏ^Rを含む遺伝子）
で形質導入されたｉｎｖｉｖｏの循環（血中）ドナーＴ細胞において行なわれ
た。下記に知見を要約する。また適宜、実施例１と比較して方法論の違いを述べ
る。

【０１８１】レトロウイルス・ベクターＧ１Ｔｋ１ＳｖＮａは多くの治療的臨床試験で使用
されてきた（Ｐａｃｋｅｒｅｔａｌ（２０００）Ｊ．Ｎｅｕｒｏｓｕｒｇ．
９２，２４９−２５４；Ｔｉｂｅｒｇｈｉｅｎｅｔａｌ（１９９６）Ｈｅｍ
ａｔｏｌ．ＣｅｌｌＴｈｅｒ．３８，２２１−２２４）。我々は、Ｔ細胞消
耗除去ａｌｌｏ−ＳＣＴ（Ｔｉｂｅｒｇｈｉｅｎｅｔａｌ（１９９６）Ｈｅ
ｍａｔｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｔｈｅｒ．３８，２２１−２２４）後にＧ１Ｔｋ１Ｓｖ
Ｎａを受け取った患者中のＨＳＶ−ＴｋＲＮＡの隠れたスプライシングにより
２２７のｂｐ削除の存在を識別した。これらの観察は、将来の臨床使用において
必要とされるベクター設計に特に重要である。

【０１８２】材料および方法レトロウイルス・ベクターおよび生産株Ｇ１Ｔｋ１ＳｖＮａレトロウイルス・ベクターを含むＰＡ３１７由来生産細胞
は、ＧｅｎｅｔｉｃＴｈｅｒａｐｙ，Ｉｎｃ．Ｎｏｖａｒｔｉｓ，（Ｇａｉｔ
ｈｅｒｓｂｕｒｇ，ＭＤ，ＵＳＡ）（図１）により提供される。ベクターおよび
それらの生産細胞株は以前に記載されている（Ｔｉｂｅｒｇｈｉｅｎｅｔａ
ｌ（１９９７）Ｈｕｍ．ＧｅｎｅＴｈｅｒ．８，６１５−６２４；Ｖｅｒｚｅ
ｌｅｔｔｉｅｔａｌ（１９９８）Ｈｕｍ．ＧｅｎｅＴｈｅｒ．９，２２４
３−２２５１；Ｌｙｏｎｓｅｔａｌ（１９９５）ＣａｎｃｅｒＧｅｎｅ
Ｔｈｅｒ．２，２７３−２８０）。

【０１８３】ヒトＴ細胞株および主要Ｔリンパ球の単離と培養ＰＢＭＮＣは、ＥＤＴＡチューブに集められた。細胞は、第０日から第３日ま
で１０００Ｕ／ｍｌのペニシリン、５００Ｕ／ｍｌのｒｈＩＬ−２で培養した
。

【０１８４】Ｇ１Ｔｋ１ＳｖＮａレトロウイルス・ベクターによるドナーＴ細胞の形質導入
は、以前に記載されているもの（Ｒｏｂｉｎｅｔｅｔａｌ（１９９８）Ｊ．
Ｈｅｍａｔｏｔｈｅｒ．７，２０５−２１５）と同様に行なった。ＰＢＭＮＣは
、ＯＫＴ３（１０ｎｇ、オルト酸塩）およびｒｈＩＬ−２（５００Ｕ／ｍＬ、Ｃ
ｈｉｒｏｎ）とともに３日間培養した。レトロウイルス上清による感染２４時間
後、形質導入された細胞のＧ４１８（８００ μｇ／ｍＬ，Ｓｉｇｍａ）選択を
７日間行なった。死亡した細胞は除去され、また、有効な形質導入産物は、将来
の使用のために凍結保存された。Ｇ１Ｔｋ１ＳｖＮａベクターによるＣＥＭ細胞
の形質導入は、ＳＦＣＭＭ３ベクターについて記載されているのと同一の感染条
件とし、７〜１４日間、Ｇ４１８（８００μｇ／ｍｌ）中の選択を後に続けた。

【０１８５】Ｇ１Ｔｋ１ＳｖＮａで形質導入された細胞は、７〜１４日間Ｇ４１８（８００
μｇ／ｍｌ）への接触によって選択された。形質導入効率はＮｅｏ^R遺伝子のた
めの競争的ＰＣＲ分析によって評価した。

【０１８６】ポリメラーゼ連鎖反応および配列分析Ｇ１Ｔｋ１ＳｖＮａの形質導入した細胞におけるＨＳＶ−Ｔｋ遺伝子の存在を
プライマー（図１Ｂ）を使用して、以下のＰＣＲによって調べた：ｐＴＫ（５’ＴＡＧＡＣＧＧＴＣＣＴＣＡＣＧＧＧＡＴＧＧＧＧＡ３’）およ
びＲＴＫ２（５’ＧＣＣＡＧＣＡＴＡＧＣＣＡＧＧＴＣＡＡＧ３’）。ＰＣＲ
分析は、ＤＮＡを５００ｎｇ、１５ｍＭＭｇＣｌ₂含有１×Ｔａｑポリメラー
ゼ・バッファ（Ｅｕｒｏｇｅｎｔｅｃ，Ｓｅｒａｉｎｇ，Ｂｅｌｇｉｕｍ）、ｄ
ＮＴＰ各２００μＭ、０．２５μＭの各プライマーおよびＴａｑＤＮＡポリメ
ラーゼ（Ｅｕｒｏｇｅｎｔｅｃ）０．５Ｕを含む５０μｌ反応混合物中で行なっ
た。熱サイクル条件は、９４℃、４５秒間、６０℃、１分間、および７２℃、１
分間を３５サイクル、最後に７２℃、５分間の伸張とした。ＰＣＲ産物（１８μ
ｌ）は、２％のアガロース・ゲル上で電気泳動にかけＥｔＢｒ染色した。標準条
件を使用してナイロン・フィルタにゲノムＤＮＡを移行した。ブロットはα−³² Ｐ−ｄＣＴＰエンド・テイリング標識されたオリゴプローブ：Ｔｋ２プローブ（
５’ＡＴＣＧＴＣＴＡＣＧＴＡＣＣＣＧＡＧＣＣＧＡＴＧＡ３’）でハイブリ
ダイズし、オートラジオグラフィ前に０．１×ＳＣＣ− ０．１％ＳＤＳ中６０
℃で洗った。この分析の感度は、パッケージング細胞株から抽出され希釈された
ＤＮＡ増幅によって決定されたが、１０⁵個の修正されていない細胞中に１個の
形質導入された細胞を検出することができた（ゲノム当たり１つのＴＫ遺伝子コ
ピーと仮定（Ｂｒｏｄｉｅｅｔａｌ（１９９９）Ｎａｔ．Ｍｅｄ．５，３４
−４１）。

【０１８７】ＰＣＲ産物は、Ｐｒｏｍｅｇａ（Ｃｈａｒｂｏｎｎｉｅｒｅｓ，Ｆｒａｎｃｅ
）からのｐＧＥＭＴＥａｓｙｖｅｃｔｏｒ中に複製してクローン化した。自
動蛍光ＤＮＡ配列分析は、ＰＥＢｉｏｓｙｓｔｅｍｓ（ＣＯＵＲＴＡＢＯＥＵ
Ｆ，Ｆｒａｎｃｅ）によって行なわれた。

【０１８８】トランケーション発生頻度Ｇ１Ｔｋ１ＳｖＮａまたはＳＦＣＭＭ３ベクターのいずれかによって形質導入
され、Ｇ４１８またはイムノマグネティックな操作によって選択した３００個の
ＣＥＭ細胞をメチルセルロース（ＭｅｔｈｏＣｕｌｔＨ４３２０；Ｓｔｅｍ
ＣｅｌｌＴｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｖａｎｃｏｕｖｅｒ，Ｃａｎａｄａ）１
ｍＬに対してＲＦ１０の１５０μｌと混合した。その後、細胞は３５ｍｍのペト
リ皿中に三重に植菌され、５％ＣＯ₂中３７℃で１５日間成長し、１５日目に評
点された。個々のコロニーは２４枚のウェル・プレートに取られ、３日間拡張し
た。その後、上記のような全長またはトランケートされたＴｋ遺伝子の存在を調
べるためにＰＣＲによる分析のために細胞を収穫した。

【０１８９】臨床研究増大するＣＤ３⁺量の遺伝子で修正された細胞に、Ｔ細胞消耗除去骨髄を灌注
した。造血組織悪性腫瘍を有する１２人の患者が、２×１０⁵（ｎ＝５）、６×
１０⁵（ｎ＝５）または２０×１０⁵（ｎ＝２）形質導入ドナーＣＤ３⁺細胞／ｋ
ｇを受けた（ＨＬＡ同一の兄弟からの骨髄を用いた）。急性毒性は観察されなか
った。ＮｅＯ^Rについての定量的ＰＣＲは、形質導入Ｔ細胞の循環（血中）が当
初増加し、時間経過により減少していくことを明らかにした。しかし、遺伝子修
正された細胞は、循環（血中）に固執的に長期間（８００日以上）検出された。
３人の患者が急性ＧｖＨＤ等級≧ＩＩであり、一方、１人の患者が慢性のＧｖＨ
Ｄ（皮膚と唾液腺）を発症した。ＧＣＶのみによる治療は急性ＧｖＨＤに罹患し
た２人の患者については完全な寛解（ＣＲ）を伴ったが、最後のケースではＣＲ
を達成するのにステロイドの追加が必要だった。慢性のＧｖＨＤに罹患する患者
においては、長期間のＣＲはＧＣＶ治療に関係していた。ガンシクロビル処理は
、循環（血中）形質導入Ｔ細胞を著しく迅速に減少させた。ＧＣＶを受けた患者
において、ＨＳＶ−Ｔｋ遺伝子の野生型またはＨＳＶ−Ｔｋ遺伝子のトランケー
トされた形式を発現する遺伝子に修正された細胞を検出するための血液サンプル
を、ＧＣＶ治療に先立っておよび規則的に２週間間隔で収穫した。

【０１９０】結果主要細胞の結果形質導入効率Ｇ４１８選択に先立ち、Ｇ１Ｔｋ１ＳｖＮａによる主要Ｔ細胞の形質導入効率
が、ＮｅＯ^Rについて定量的ＰＣＲによって測定され、８．３±１．４％（ｎ＝
１２）であった。Ｇ４１８選択後の細胞のＧＣＶ感度は、８７±１．２％（ｎ＝
１２）であった。１つの代表的な形質導入／選択実験からのコントロールおよび
形質導入された細胞の相対的な細胞成長を、図１６に示す。

【０１９１】形質導入された主要Ｔリンパ球のＰＣＲおよび配列分析Ｇ１Ｔｋ１ＳｖＮａベクターで形質導入されたヒト主要Ｔリンパ球から抽出さ
れたゲノムＤＮＡも、ＨＳＶ−Ｔｋ遺伝子を求めてＰＣＲによって分析された。
この研究では、２本のバンドが、選択された（ＴＫ８００）または未選択の形質
導入された細胞（ＴＫ０）（図１４Ａ）の中で識別された。５６０ｂｐ断片は全
長ＨＳＶ−Ｔｋ遺伝子に相当し、ＨＳＶ−Ｔｋ遺伝子の削除された形式に対応す
る３３３ｂｐのより小さなバンドと比較して、最も強い信号を与えた。より大量
にある標的が優先的に増幅されるのであれば、これは全長とトランケート形とで
Ｔｋ形式間のＰＣＲ分析中の競争によるものかもしれない。しかし、形質導入さ
れた細胞が最初にＧ４１８で選択され、次いで、ＧＣＶ（ＴＫ８００＋ＧＣＶ）
存在下に培養されると、３３３ｂｐバンドはより強くなった。これは、ＧＣＶ処
置が、トランケートされたＨＳＶ−Ｔｋ遺伝子（図１４Ｂ）を発現する細胞の集
団の豊富化をもたらしたことを示す。興味深いことに、３３３ｂｐＰＣＲ産物の
配列決定では、ＨＳＶ−Ｔｋ配列内で、ＣＥＭおよびＳＣＦＭＭ３ベクターで形
質導入した主要なＴ細胞と正確に同一の２２７ｂｐの削除が示された（ドナーと
受容体は、Ｇ１Ｔｋ１ＳｖＮａベクター中の位置でそれぞれ１８７１と２０９８
）。

【０１９２】トランケーションの発生頻度Ｇ１Ｔｋ１ＳｖＮａベクターを用いて、１５３個のＣＥＭが形質導入したコロ
ニーのＰＣＲ分析を行なったところ、１３９個のコロニーが完全長ＨＳＶ−Ｔｋ
遺伝子を有する一方、１４個がＨＳＶ−Ｔｋ遺伝子のトランケートされた形式を
含んだことを示し、９．１５％のトランケーション頻度を与えた。ＳＦＣＭＭ３
ベクターで形質導入された４５個のコロニーがＰＣＲによって分析され、７個が
トランケートされた遺伝子を含むと分かった（頻度１５．５％）。

【０１９３】臨床試料中のトランケートされたＨＳＶ−Ｔｋ遺伝子の識別ＨＳＶ−Ｔｋ遺伝子のトランケートされた形式を含むｉｎｖｉｖｏ循環（血
中）形質導入Ｔ細胞が、移植の後８００日までの注入後早くも３０分後に１２人
の患者すべての観察された。ＨＳＶ−Ｔｋ遺伝子の両方の形式の定量化は行なわ
なかったが、サザン・ブロット分析が後続するＰＣＲでは、トランケートされた
ＨＳＶ−Ｔｋ遺伝子を発現する、ｉｎｖｉｖｏで形質導入されたＴ細胞の割合
がｉｎｖｉｔｒｏでの観察結果と同様またはそれ未満（＜１０％）であること
が示された（図１５（レーンＡ））。１人の患者からの代表的な資料中で例証さ
れるように（図１５）、ＧｖＨＤのための治療として投与されたＧＣＶは、完全
長ＨＳＶ−Ｔｋ遺伝子によって生成された信号を減少させ、一方、ＨＳＶ−Ｔｋ
遺伝子のトランケートされた形式と結び付けられる信号を次第に増加させた。重
要なことは、ＧＣＶ治療は、常に著しくＮｅｏ^R遺伝子¹⁷の定量的ＰＣＲによっ
て決定されるような循環（血中）形質導入されたＴ細胞のパーセンテージを大き
く（８５−９８％）減少させ絶対数（７６−９９．５％）をも減少させることで
ある。したがって、トランケートされたＨＳＶ−Ｔｋ遺伝子を含む、形質導入さ
れたＴ細胞の割合の増加に対しては、循環する形質導入された細胞の減少数の中
にあった。

【０１９４】結論我々は、Ｔ細胞が消耗されたａｌｌｏ−ＳＣＴとともに形質導入されたドナー
Ｔ細胞を受け取った１２人の患者の中に、隠れたスプライス・ドナーおよび受容
体サイトの存在によるＨＳＶ−Ｔｋ遺伝子中の２２７ｂｐの削除が存在すること
を確認した。トランケートされたＨＳＶ−Ｔｋ遺伝子を含むｉｎｖｉｖｏの循
環（血中）形質導入Ｔ細胞は、移植の後８００日以内の注入直後にすべての患者
において識別された。ＧｖＨＤのための治療としてＧＣＶを受けた患者では、削
除されたＨＳＶ−Ｔｋ遺伝子を運ぶ、形質導入されたドナーＴ細胞の割合の漸進
的な増加が観察された。これらの結果は、ＨＳＶ−Ｔｋ／ＧＣＶシステム内の制
限は、ＨＳＶ−Ｔｋを形質導入した細胞を確実に殺害すべく最適化されたレトロ
ウイルス・ベクターを開発することにより、改善することができるということを
示唆する。

【参考文献】

【図面の簡単な説明】

【図１】ＣＥＭ細胞および主要Ｔリンパ球の形質導入のために使用された
、ＳＦＣＭＭ３（Ａ）およびＧ１Ｔｋ１ＳｖＮａ（Ｂ）ベクターのプロウイルス
形を示す模式図である。ＬＴＲ、長い末端反復配列はモロニー（Ｍｏｌｏｎｅｙ
）ネズミ白血病ウイルス（ＭＬＶ）およびＭｏｌｏｎｅｙ肉腫ウイルス（ＭＳＶ
）に由来する。ＨＳＶ−Ｔｋは単純疱疹ウイルス遺伝子配列である。ＳＶ４０は
サルウイルス４０の初期プロモーターである。ΔＬＮＧＦＲは、細胞質領域中で
トランケートされた低親和性神経成長因子受容体ｃＤＮＡである。Ｎｅｏ^R：ネ
オマイシンホスホトランスフェラーゼｃＤＮＡである。ＣＥＭ−Ｔｋサブクロー
ンに由来するゲノムＤＮＡの消化のために使用したＥｃｏＲＩとＳａｃＩのため
の制限酵素サイトが示されている。Ｔｋ１とＮＧＦのプローブは、ゲノムＤＮＡ
中のプロウイルス配列を識別するために使用した。Ｔｋ２プローブもＰＣＲ産物
の特異性を確認するために使用した。ＳＦＣＭＭ３を増幅することを目指したＰ
ＣＲプライマーの位置およびＧ１Ｔｋ１ＳｖＮａプロウイルス配列を、ＰＣＲ産
物のサイズとともに示す。

【図２】レトロウイルスによって形質導入されたＴ細胞株であり、ＦＡＣ
Ｓ分析によるΔＬＮＧＦＲ発現の検出結果を示す。ＣＥＭおよびＪｕｒｋａｔ細
胞（ヒトの細胞株）は未選択の集団（それぞれＡおよびＣ）を形質導入した。磁
気ビーズ（それぞれＢおよびＤ）による１回のポジティブなイムノマグネティッ
ク選択後、ΔＬＮＧＦＲ発現ＣＥＭおよびＪｕｒｋａｔ細胞の豊富化。示された
結果は、１つの代表的な実験に相当する。

【図３Ａ】ＴＫ−ＣＥＭ（Ａ）およびＴＫ−Ｊｕｒｋａｔ（Ｂ）誘導サブ
クローン中でのΔＬＮＧＦＲ導入遺伝子のＦＡＣＳ分析による発現を示す。細胞
は、非結合性（ｕｎｃｏｎｊｕｇａｔｅｄ）マウス抗ヒトＬＮＧＦＲＭｏＡｂ
とインキュベートし、次いでＦＩＴＣで標識されたヤギ抗マウスＭｏＡｂで染色
した。

【図３Ｂ】ＴＫ−ＣＥＭ（Ａ）およびＴＫ−Ｊｕｒｋａｔ（Ｂ）誘導サブ
クローン中でのΔＬＮＧＦＲ導入遺伝子のＦＡＣＳ分析による発現を示す。細胞
は、非結合性（ｕｎｃｏｎｊｕｇａｔｅｄ）マウス抗ヒトＬＮＧＦＲＭｏＡｂ
とインキュベートし、次いでＦＩＴＣで標識されたヤギ抗マウスＭｏＡｂで染色
した。

【図４】ＴＫ−ＣＥＭ由来のサブクローン中でＨＳＶ−ｔｋ導入遺伝子を
測定するためのＧＣＶ誘導細胞毒素の分析結果を示す。細胞は、ＧＣＶの濃度を
増加させ（０．０５μｇ／ｍＬから１２．５μｇ／ｍＬまでの範囲）、４日間イ
ンキュベートした。細胞増殖は細胞ＤＮＡの中への³Ｈ−チミジンの取り込みに
よって測定した。結果をＧＣＶが存在しない状態で得られた³Ｈ−チミジンの取
込量に対する各ＧＣＶ濃度における³Ｈ−チミジンの取込量によってパーセンテ
ージで表わす。（◆）は形質導入されていないＣＥＭ細胞であり、（■）はＳＦ
ＣＭＭ３形質導入ＴＫ−ＣＥＭサブクローンである。

【図５】ＴＫ−ＣＥＭ（ＡおよびＢ）およびＴＫ−Ｊｕｒｋａｔ（Ｃおよ
びＤ）サブクローンのサザン・ブロット分析結果を示す。ゲノムＤＮＡをＳａｃ
Ｉ制限酵素で消化した。サザン・ブロットは、ＴＫ（ＡおよびＣ）およびΔＬＮ
ＧＦＲ（ＢおよびＤ）特異的プローブでハイブリダイズした。

【図６】ＴＫ−ＣＥＭ（ＡおよびＢ）およびＴＫ−Ｊｕｒｋａｔ（Ｂおよ
びＣ）サブクローンのサザン・ブロット分析結果を示す。ゲノムＤＮＡはＥｃｏ
ＲＩ制限酵素で消化した。サザン・ブロットは、ＴＫ（ＡおよびＣ）およびΔＬ
ＮＧＦＲ（ＢおよびＤ）特異的プローブでハイブリダイズした。

【図７】ＴＫ−ＣＥＭおよびＴＫ−Ｊｕｒｋａｔサブクローンに由来する
ゲノムＤＮＡからのＳＦＣＭＭ３プロウイルス配列のＰＣＲ増幅を示す。プロウ
イルスの異なる４つの領域を特定のプライマーを使用して、ＰＣＲによって増幅
した（図１を参照）。断片１：ＬＴＲ⁺／ＨＴＫ５^-（９１２ｂｐ）；断片２：Ｈ
ＴＫ４⁺／ＨＴＫ１^-（９９８ｂｐ）；断片３：ＨＴＫ１⁺およびＮＧＦ２^-（７５
３ｂｐ）および断片４：ＮＧＦ２⁺およびＮＧＦ３^-（８５２ｂｐ）。

【図８】形質導入され選択された主要Ｔリンパ球から得られたゲノムＤＮ
ＡからＨＳＶ−ｔｋ遺伝子配列（断片２：ＨＴＫ４⁺／ＨＴＫ１^-；９９８ｂｐ
）のＰＣＲ増幅を示す。ＴＫ−ＣＥＭおよびＴＫ−Ｊｕｒｋａｔサブクローンか
らのポジティブおよびネガティブ・コントロールを使用した。

【図９】ＴＫ−ＣＥＭおよびＴＫ−Ｊｕｒｋａｔサブクローンに由来する
ゲノムＤＮＡからのトランケートされたＨＳＶ−ｔｋ遺伝子のＰＣＲ増幅結果を
示す。ＰＣＲは、耐ＧＣＶ性のＴＫ−ＣＥＭおよびＴＫ−Ｊｕｒｋａｔクローン
中のＨＳＶ−ｔｋ遺伝子のスプライスされた形を特異的に増幅するプライマー（
ＨＴＫ８⁺／ＨＴＫ１^-；６４０ｂｐ）を使用してセット・アップした。

【図１０】形質導入され選択された主要Ｔリンパ球から得られたゲノムＤ
ＮＡからのトランケートされたＨＳＶ−ｔｋ遺伝子のＰＣＲ増幅結果を示す。Ｐ
ＣＲは、耐ＧＣＶ性のＴＫ−ＣＥＭおよびＴＫ−Ｊｕｒｋａｔクローン中のＨＳ
Ｖ−ｔｋ遺伝子のスプライスされた形を特異的に増幅するプライマー（ＨＴＫ８⁺ ／ＨＴＫ１^-；６４０ｂｐ）を使用してセット・アップした。

【図１１Ａ】ＨＳＶ−ｔｋ遺伝子（Ｖ００４６７と呼ぶ）の野生型配列、
実施例で用いた発現ベクター中の完全長ＨＳＶ−ｔｋ遺伝子（ｔｋｇｅｎｅ）お
よび実施例記載の実験で見出された削除された遺伝子（ｔｋｇｅｎｅ−ｄｅｌ）
を示す。

【図１１Ｂ】ＨＳＶ−ｔｋ遺伝子（Ｖ００４６７と呼ぶ）の野生型配列、
実施例で用いた発現ベクター中の完全長ＨＳＶ−ｔｋ遺伝子（ｔｋｇｅｎｅ）お
よび実施例記載の実験で見出された削除された遺伝子（ｔｋｇｅｎｅ−ｄｅｌ）
を示す。

【図１１Ｃ】ＨＳＶ−ｔｋ遺伝子（Ｖ００４６７と呼ぶ）の野生型配列、
実施例で用いた発現ベクター中の完全長ＨＳＶ−ｔｋ遺伝子（ｔｋｇｅｎｅ）お
よび実施例記載の実験で見出された削除された遺伝子（ｔｋｇｅｎｅ−ｄｅｌ）
を示す。

【図１２】癌遺伝子治療、および骨髄移植の後に、同種異系反応性（ａｌ
ｌｏｒｅａｃｔｉｖｉｔｙ）の調整のために用いるドナーＴリンパ球によって腫
瘍細胞を殺すために提案された、ＨＳＶ−ｔｋ／ＧＣＶシステムを示す模式図で
ある。

【図１３】部位特異的突然変異生成によるｍＳＦＣＭＭ−３ベクターの修
正を示す。トランスフェクタント（ｔｒａｎｓｆｅｃｔａｎｔ）＃２および＃６
の制限酵素分析。ＥｃｏＮＩおよびＭｖａＩ制限酵素はベクターの位置１９９４
および２２２１で引き起こされた変化をそれぞれ検知するために使用した。野生
型のＨＳＶ−ｔｋ遺伝子配列を含む未修正ベクターを、ネガティブ・コントロー
ルとして使用した。

【図１４】ＧＣＶを含むまたはＧＣＶを含まない培養液中で形質導入され
た主要なＴ細胞からのｐＴＫ／ＲＴＫ２ＰＣＲ（３５サイクル）産物のサザン
・ブロット。（Ａ）形質導入されたか未選択のＴ細胞（ＴＫ０）中のＨＳＶ−Ｔ
ｋ配列のＰＣＲ増幅、形質導入されたかＧＣＶがない状態で、および１μｇ／ｍ
ＬＧＣＶで７日間培養したＧ４１８選択のＴ細胞（ＴＫ８００＋ＧＣＶ）。（
Ｂ）ＧＣＶの存在（１μｇ／ｍｌ）または不存在培地で８、１１、１６日間の培
養後の形質導入された主要なＴ細胞。ポジティブ（Ｇ１Ｔｋ１ＳｖＮａベクター
生産細胞からのＤＮＡ）およびネガティブ・コントロール（形質導入されていな
い主要なＴ細胞）を使用した。

【図１５】ＧＣＶ治療中のＧｖＨＤ（３０日目には同種移植片（ａｌｌｏ
ｇｒａｆｔ）を記入する）時における臨床試験の代表的な患者からの抹消血単核
細胞のＴＫＰＣＲ産物のサザン・ブロット分析。レーンＡ〜Ｄ：ＧＣＶ治療開
始後、ＧＶＨＤ（Ａ）、２日目（Ｂ）、４日目（Ｃ）、１１日目（Ｄ）の時点で
患者のＰＢＭＣから抽出されたＤＮＡサンプル。レーンＥ：ネガティブ・コント
ロール（形質導入されていない主要なＴ細胞）；レーンＦ：ポジティブ・コント
ロール（Ｇ１Ｔｋ１ＳｖＮａベクター生産細胞からのＤＮＡ）。

【図１６】Ｇ１Ｔｋ１ＳｖＮａベクターで形質導入された異なる細胞集団
の相対的な細胞成長を示す代表的な実験の結果を示す。Ｃ０：形質導入されてお
らず選択されていない細胞；Ｃ８００：形質導入されておらずＧ４１８（８０
０ｍｇ／ｍｌ）で選択された細胞；ＴＫ０：形質導入されて、選択されていない
細胞；ＴＫ８００：形質導入しＧ４１８−選択した。

【図１７】Ｔ細胞株および訂正されているか訂正されていないＨＳＶ−７
ｋベクターで形質導入した主要なＴ細胞のＰＣＲ分析結果。（Ａ）訂正されてい
ないベクターＧ１Ｔｋ１ＳｖＮａまたはＳＦ／Ｔｋ／ｗｔで、または訂正された
ベクターｐＳＦ／Ｔｋ／ｍｕｔで形質導入された、ＧＣＶ濃度（０、１、２また
は５μＡｇ／ｍｌ）の増加が存在する、Ｈｕｔ−７８細胞株からのＨＳＶ−ＴｋＰＣＲ産物のサザン・ブロット分析。（＋）および（−）は、ＰＣＲ反応のポ
ジティブ・コントロールおよびネガティブ・コントロールである。ＭＷは、明るいバンドを有する６００ｂｐ（１００ｂｐＤＮＡｌａｄｄｅ
ｒ、ＬｉｆｅＴｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）に等しい分子量マーカーを表わす。
ＨＳＶ−Ｔｋ遺伝子の両方のかたち（白い矢印＝全長、黒い矢印はトランケート
された遺伝子を示す）に対するプライマーを用いたＰＣＲによる増幅結果。（Ｂ
）またはＨＳＶ−７ｋ遺伝子のトランケートされた形式に特異的なプライマーを
用いた。（Ｃ）訂正されていないＳＣＦＭＭ３（ｗｔ）または訂正されたｓｃ−
ＳＣＦＭＭ３（ｍｕｔ）ベクターで形質導入した主要なＴ細胞のバルク集団。Ｔ
ｋ−ＣＥＭ＃２およびＴｋ−ＣＥＭ＃３はトランケートされていないＰＣＲコン
トロールおよびトランケートされたＰＣＲコントロールを表わす。形質導入され
ていないＴ細胞をネガティブ・コントロールとして用いた。

【図１８】Ｔ細胞株および訂正されたＨＳＶ−Ｔｋベクターまたは訂正さ
れていないＨＳＶ−Ｔｋベクターで形質導入した主要なＴ細胞のＧＣＶ感度。訂
正されたＳＦ／Ｔｋ／ｍｕｔ（？）または訂正されていないベクターＧ１Ｔｋ１
ＳｖＮａ（○）またはＳＦ／Ｔｋ／ｗｔ（△）で形質導入されたＨｕｔ−７８（
Ａ）およびＣＥＭ（Ｂ）細胞株のＧＣＶ感度を形質導入されていないＴ細胞株（
■）と比較して示す。データは、細胞活力の阻害を表わし、ＣＥＭおよびＨｕｔ
−７８細胞株について、それぞれ８つおよび３つの異なる独立した実験の平均±
ＳＤである。（Ｃ）訂正されたｓｃ−ＳＦＣＭＭ３（△）または訂正されていな
いＳＦＣＭＭ３ベクター（？）で形質導入された主要なＴ細胞のＧＣＶ感度を形
質導入されていないＴ細胞（■）と比較して示す。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁷ 識別記号ＦＩテーマコート゛(参考）Ａ６１Ｋ 45/00 Ａ６１Ｋ 48/00 ４Ｃ０８７ 48/00 Ａ６１Ｐ 35/00 Ａ６１Ｐ 35/00 43/00 １０５ 43/00 １０５Ｃ１２Ｎ 1/15 Ｃ１２Ｎ 1/15 1/19 1/19 1/21 1/21 9/12 5/10 15/00 ＺＮＡＡ 9/12 5/00 Ａ (72)発明者マリーナ・イマキュラーダ・ガリンイギリス・ロンドン・Ｗ12・０ＮＮ・デュ・ケイン・ロード・（番地なし）・ハマースミス・ホスピタル・インペリアル・カレッジ・スクール・オブ・メディシン・デパートメント・オブ・イミュノロジーＦターム(参考） 4B024 AA01 AA11 AA20 BA10 CA03 CA09 CA20 DA02 DA03 EA02 FA02 GA11 GA25 HA11 HA13 HA14 HA17 4B050 CC04 DD01 EE01 LL01 LL05 4B065 AA01X AA58X AA72X AA93X AA95Y AB01 AC14 AC20 BA02 BA16 BA24 CA29 CA44 4C084 AA13 AA17 AA18 MA02 MA05 NA13 NA14 ZB211 ZB212 ZB261 ZB262 4C086 AA02 CB07 EA17 MA02 MA04 MA05 NA13 NA14 ZB21 ZB26 4C087 AA02 BC83 MA02 MA05 NA13 NA14 ZB21 ZB26

Claims

【特許請求の範囲】

【請求項１】チミジンキナーゼ・コード領域が機能性スプライス・アクセ
プター・サイトおよび／またはスプライス・ドナー・サイトを含まない、チミジ
ンキナーゼをコードするポリヌクレオチド。
【請求項２】チミジンキナーゼがヘルペスビリダエ・チミジンキナーゼで
ある請求項１に記載のポリヌクレオチド。
【請求項３】チミジンキナーゼが単純疱疹ウイルス・チミジンキナーゼで
ある請求項２に記載のポリヌクレオチド。
【請求項４】チミジンキナーゼが単純疱疹ウイルス１型チミジンキナーゼ
である請求項３に記載のポリヌクレオチド。
【請求項５】チミジンキナーゼ・コード領域が野生型チミジンキナーゼを
コードする請求項１ないし４のいずれか一項に記載のポリヌクレオチド。
【請求項６】チミジンキナーゼ・コード領域が野生型チミジンキナーゼと
比べて酵素活性を増強する変異を含むチミジンキナーゼをコードする請求項１か
ら４のいずれか一項に記載のポリヌクレオチド。
【請求項７】野生型配列と比べて、スプライス・サイトが存在しないよう
に図１１の８４２番および１０７０番の位置のヌクレオチドのいずれか１つが別
のヌクレオチドに置換されている請求項４に記載のポリヌクレオチド。
【請求項８】野生型配列のヌクレオチドと比べて、８４２番の位置のスプ
ライス・ドナー・サイトがＧＡＣＣＡＧＧＧＴからＧＡＣＣＡＡＧＧＴ
に変更されている請求項７に記載のポリヌクレオチド。
【請求項９】野生型配列ヌクレオチドと比べて、１０７０番の位置のスプ
ライス・アクセプター・サイトがＣＣＣＣＡＧＧＣＣからＣＣＣＣＡＡＧＣＣに変更されている請求項７に記載のポリヌクレオチド。
【請求項１０】野生型配列ヌクレオチドと比べて、８４２番の位置のスプ
ライス・ドナー・サイトがＧＡＣＣＡＧＧＧＴからＧＡＣＣＡＡＧＧＴ
に変更され、１０７０番の位置のスプライス・アクセプター・サイトがＣＣＣ
ＣＡＧＧＣＣからＣＣＣＣＡＡＧＣＣに変更されている請求項６に記載の
ポリヌクレオチド。
【請求項１１】操作可能に結合してコード領域を発現させるプロモーター
をさらに含む請求項１ないし１０のいずれか一項に記載のポリヌクレオチド。
【請求項１２】請求項１ないし１１のいずれか一項で定義されたポリヌク
レオチドを含む発現ベクター。
【請求項１３】ウイルス・ベクターである請求項１２に記載の発現ベクタ
ー。
【請求項１４】レトロウイルス・ベクターである請求項１３に記載の発現
ベクター。
【請求項１５】患者への送達に適合している請求項１２から１４のいずれ
か一項に記載の発現ベクター。
【請求項１６】請求項１から１１のいずれか一項に記載のポリヌクレオチ
ドまたは請求項１２から１５のいずれか一項に記載の発現ベクターを含む宿主細
胞。
【請求項１７】請求項１から１１のいずれか一項に記載のポリヌクレオチ
ドまたは請求項１２から１５のいずれか一項に記載の発現ベクターおよび薬剤と
して許容される担体を含む医薬組成物。
【請求項１８】医薬に用いるための請求項１から１１のいずれか一項に記
載のポリヌクレオチドまたは請求項１２から１５のいずれか一項に記載の発現ベ
クター。
【請求項１９】請求項１から１１のいずれか一項に記載のポリヌクレオチ
ドまたは請求項１２から１５のいずれか一項に記載の発現ベクターを細胞内に導
入すること、細胞にチミジンキナーゼを発現させること、およびチミジンキナー
ゼにより毒性の薬剤に変換される実質的に無毒の薬剤と細胞を接触させることを
含む細胞の破壊方法。
【請求項２０】請求項１から１１のいずれか一項に記載のポリヌクレオチ
ドまたは請求項１２から１５のいずれか一項に記載の発現ベクターを患者に導入
すること、ポリヌクレオチドまたは発現ベクターを細胞に取り込ませること、そ
の細胞にチミジンキナーゼを発現させること、およびチミジンキナーゼにより毒
性の薬剤に変換される実質的に無毒の薬剤を患者に投与することを含む、破壊の
必要な細胞を有する患者の治療方法。
【請求項２１】（１）患者またはドナーから細胞を取り出すこと、（２）
細胞内にｅｘｖｉｖｏで請求項１から１１のいずれか一項に記載のポリヌクレ
オチドまたは請求項１２から１５のいずれか一項に記載の発現ベクターを導入す
ること、（３）このように導入されたときにチミジンキナーゼを発現していても
していなくてもよい修飾した細胞を患者に導入すること、（４）このように発現
していない場合には任意選択で細胞にチミジンキナーゼを発現させること、およ
び（５）チミジンキナーゼにより毒性の薬剤に変換される実質的に無毒の薬剤を
患者に投与することを含む、破壊の必要な細胞を有する患者の治療方法。
【請求項２２】実質的に無毒の薬剤が、ガンシクロビル、アシクロビル、
トリフルオロチミジン、１−［２−デオキシ，２−フルオロ，β−Ｄ−アラビノ
フラノシル］−５−ヨードウラシル、ａｒａ−Ａ、ａｒａ１、１−β−Ｄ−ア
ラビノフラノシルチミン、５−エチル−２’−デオキシウリジン、５−ヨード−
５’−アミノ−２，５’−ジデオキシウリジン、ヨードキシウリジン、ＡＺＴ、
ＡＩＶ、ジデオキシシチジン、ＡｒａＣおよびブロモビニルデオキシウリジン
（ＢＶＤＵ）のいずれか１つである請求項１９から２１のいずれか一項に記載の
方法。
【請求項２３】患者がチミジンキナーゼにより毒性の薬剤に変換される実
質的に無毒の薬剤の投与を受けてきており、現在受けており、または将来受ける
ものである、患者内で細胞を破壊する医薬の製造における、請求項１から１１の
いずれか一項に記載のポリヌクレオチドまたは請求項１２から１５のいずれか一
項に記載の発現ベクターの使用。
【請求項２４】患者が請求項１から１１のいずれか一項に記載のポリヌク
レオチドまたは請求項１２から１５のいずれか一項に記載の発現ベクターの投与
を受けてきており、現在受けており、または将来受けるものである、患者内で細
胞を破壊する医薬の製造における、チミジンキナーゼにより毒性の薬剤に変換さ
れる実質的に無毒の薬剤の使用。
【請求項２５】請求項１から１１のいずれか一項に記載のポリヌクレオチ
ドまたは請求項１２から１５のいずれか一項に記載の発現ベクターおよびチミジ
ンキナーゼにより毒性の薬剤に変換される実質的に無毒の薬剤を含む治療剤シス
テム。
【請求項２６】実質的に無毒の薬剤が、ガンシクロビル、アシクロビル、
トリフルオロチミジン、１−［２−デオキシ，２−フルオロ，β−Ｄ−アラビノ
フラノシル］−５−ヨードウラシル、ａｒａ−Ａ、ａｒａ１、１−β−Ｄ−ア
ラビノフラノシルチミン、５−エチル−２’−デオキシウリジン、５−ヨード−
５’−アミノ−２，５’−ジデオキシウリジン、ヨードキシウリジン、ＡＺＴ、
ＡＩＶ、ジデオキシシチジン、ＡｒａＣおよびブロモビニルデオキシウリジン
（ＢＶＤＵ）のいずれか１つである請求項２３もしくは２４記載の使用または請
求項２５記載のシステム。
【請求項２７】（１）チミジンキナーゼの天然のコード領域が機能性スプ
ライス・アクセプター・サイトおよび／またはスプライス・ドナー・サイトを含
むか否かを決定すること、および、（２）もし含むのであれば、スプライス・ア
クセプター・サイトおよび／またはスプライス・ドナー・サイトの少なくとも１
つを変異させて非機能性にすることを含む請求項１に記載のポリヌクレオチドの
製造方法。
【請求項２８】ステップ（１）が天然のコード領域の少なくとも１つから
転写されたｍＲＮＡを分析することを含む請求項２７に記載の方法。
【請求項２９】ステップ（２）で変異の導入のために部位特異的変異生成
が用いられる請求項２７または２８に記載の方法。
【請求項３０】本明細書に開示されるすべての新規な遺伝子治療ベクター
またはシステム。