KR100958293B1 - 테오필린에 의해 표적 특이적 ｒｎａ 치환 활성이 조절되는알로스테릭 트랜스―스플라이싱 그룹 ｉ 리보자임 - Google Patents

테오필린에 의해 표적 특이적 ｒｎａ 치환 활성이 조절되는알로스테릭 트랜스―스플라이싱 그룹 ｉ 리보자임 Download PDF

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Abstract

본 발명은 테오필린에 의해 표적 특이적 RNA 치환 활성이 조절되는 알로스테릭 트랜스-스플라이싱 그룹 I 리보자임에 관한 것으로서, 더욱 상세하게는 암에 특이적인 RNA 전사체인 hTERT(human Telomerase reverse transcriptase)의 mRNA를 인지하여 트랜스-스플라이싱하는 능력이 검증된 hTERT 표적 트랜스-스플라이싱 리보자임에 테오필린(theophylline) 앱타머(aptamer)를 교류 모듈(communication module)을 통해 결합시킨 테오필린 의존성 알로스테릭 트랜스-스플라이싱 리보자임에 관한 것이다.
본 발명의 리보자임은 테오필린에 의존적으로 RNA 치환 활성이 조절되어 트랜스-스플라이싱 반응을 통해 표적 hTERT RNA를 보정함으로써, 표적 hTERT RNA를 발현하는 암세포만을 선택적으로 진단하거나, 세포사를 유도하여 치료할 수 있다.
테오필린, 알로스테릭 트랜스―스플라이싱 그룹 Ｉ 리보자임, hTERT, 앱타머, 유전자 치료

Description

테오필린에 의해 표적 특이적 ＲＮＡ 치환 활성이 조절되는 알로스테릭 트랜스―스플라이싱 그룹 Ｉ 리보자임{Allosteric trans―splicing group I ribozyme whose activity of target-specific RNA replacement is controlled by theophylline}
본 발명은 테오필린에 의해 표적 특이적 ＲＮＡ 치환 활성이 조절되는 알로스테릭 트랜스-스플라이싱 그룹 Ｉ 리보자임에 관한 것이다.
유전자 돌연변이에 의한 인체의 난치성 질환의 분자유전학적 원인과 인자들에 대한 연구로 그러한 질병의 새로운 치료 기술로서 유전자 치료 기술이 활발히 개발되고 있다. 그러나, 현존하는 유전자 치료 기술에는 아직 극복해야 할 문제점들이 있다.
유전병의 경우에 주로 이용되는 유전자 치료 방법은 돌연변이 유전자에 상응하는 정상유전자를 환자의 적절한 세포에 전달하는 방법을 꾀하고 있다(Morgan, R.A. and Anderson, W.F. 1993, Human gene therapy. Annu Rev Biochem . 62: 191-217). 이론적으로 이러한 치료 방법을 통해 효과를 얻으려면 원하는 유전 산물의 생성을 생체의 올바른 조절 기작 하에서 얻어야만 한다. 그러나, 바이러스 입 자(virus particle)의 전달 유전자 크기에서의 제한성 때문에 거의 모든 유전자 치료 방법은 여러 다른 종류의 프로모터 혹은 단편의 그 유전자 자신의 프로모터의 조절 하에 cDNA 형태로 원하는 유전자를 전달하는 방식을 꾀하고 있다. 따라서, 전달 유전자의 조절을 자연 그대로 조절해줄 수 있는 여러 유전 인자들이 포함되어 있지 않으며, 원하고자 하는 질병 치료 효과를 극대화하지 못하고 있는 실정이다.
또한, 유전자 발현을 위해 이용하는 프로모터 등이 다른 종류의 프로모터를 활성화시킬 우려가 있고 크로마틴(chromatin) 구조를 변화시켜 유전자가 전달된 세포가 갖고 있는 다른 유전자의 발현(예를 들면 protooncogene)을 증가시킬 수 있는 문제점이 있다. 또한, 정상적인 유전자의 전달이 환자 세포 내의 돌연변이 유전자 산물의 감소에는 아무 영향을 끼칠 수 없다. 만약 돌연변이 유전자 산물이 도미넌트 네가티브(dominant negative)한 기능을 가진 경우 기존의 방법으로는 치료효과를 극대화하지 못 할 것이다. 따라서, 정상적인 유전자의 잘 조절된 발현을 이끌어내고 동시에 돌연변이 유전자 발현을 억제할 수 있는 새로운 유전자 치료법 개발이 필요하다(Lan, N., Howrey, R.P., Lee, S.W., Smith, C.A., and Sullenger, B.A. 1998, Ribozyme-Mediated Repair of Sickle b-Globin mRNAs in Erythrocyte Precursors. Science 280: 1593; Phylactou, L.A., Darrah, C., and Wood, M.J. 1998, Ribozyme-mediated trans-splicing of a trinucleotide repeat. Nat. Genet. 18: 378-381; Rogers, C.S., Vanoye, C.G., Sullenger, B.A., and George, A.L.Jr. 2002, Functional repair of a mutant chloride channel using a trans-splicing ribozyme, J. Clin . Invest. 110: 1783-1789; Shin, K.S., Sullenger, B.A., and Lee, S.W. 2004, Ribozyme-mediated induction of apoptosis in human cancer cells by targeted repair of mutant p53 RNA. Mol Ther . 10: 365-372; Ryu, K.J., Kim, J.H., and Lee, S.W. 2003, Ribozyme-mediated selective induction of new gene activity in hepatitis C virus internal ribosome entry site-expressing cells by targeted trans-splicing. Mol . Ther . 7; 386-395).
테트라하이메나 써모필라(Tetrahymena thermophila)로부터의 그룹 I 인트론 리보자임이 실험관 내에서 뿐만 아니라 박테리아 나아가 인체 세포 내에서 트랜스-스플라이싱 반응을 수행함으로써 두 별도로 존재하는 전사체를 서로 연결시킬 수 있음이 보고되었다(Been, M. and Cech, T. 1986, One binding site determines sequence specificity of Tetrahymena pre-rRNA self-splicing, trans-splicing, and RNA enzyme activity. Cell 47: 207-216; Sullenger, B.A. and Cech, T.R. 1994, Ribozyme-mediated repair of defective mRNA by targeted, trans-splicing. Nature 371: 619-622; Jones, J.T., Lee, S.W., and Sullenger, B.A. 1996, Tagging ribozyme reaction sites to follow trans-splicing in mammalian cells. Nat Med . 2: 643-648). 따라서, 그룹 I 인트론을 기초로 한 트랜스-스플라이싱 리보자임에 의해 질환과 관련된 유전자 전사체 또는 정상세포에서는 발현이 안 되고 질병 세포에서만 특이적으로 발현되는 특정 RNA가 표적이 된 후 그 RNA가 정상적인 RNA로 보정되거나 또는 새로운 치료용 유전자 전사체로 치환되도록 재 프로그램을 유발함으로써 매우 질환 특이적이며 안전한 유전자 치료 기술이 될 수 있다. 즉, 단지 표적 유전자 전사체가 존재 시에만 RNA 치환이 일어날 것이므로 결과적으 로 단지 적절한 시간과 공간에서만 우리가 원하는 유전자 산물이 만들어 질 것이다. 특히, 세포 내 발현되는 RNA를 표적으로 한 후 원하는 유전자 산물로 대치하는 방법이므로 도입하고자 하는 유전자 발현 양이 조절될 수 있다. 또한, 트랜스-스플라이싱 리보자임은 질환 특이 RNA를 제거함과 동시에 우리가 원하는 치료용 유전자 산물의 발현을 유도할 수 있으므로 치료 효과를 배가시킬 수 있다.
RNA는 인위적으로나 자연적으로 스위치로써의 역할을 하기에 적합한 화학적, 구조적 특성을 지니고 있다(Mandal, M., Boese, B., Barrick, J.E., Winkler, W.C., and Breaker, R.R. 2003, Riboswitches control fundamental biochemical pathways in Bacillus subtilis and other bacteria. Cell 113: 577-586). 이러한 특성을 이용하여 효소 활성을 갖는 RNA인 리보자임에 소 분자(small molecule)나 단백질의 특정 구조나 서열을 인지하여 특이적으로 결합하는 앱타머를 결합시킨 것을 앱타자임이라 한다(Breaker, R.R. 2002, Engineered allosteric ribozymes as biosensor components. Curr . Opin . Biotechnol . 13: 31-39). 앱타자임은 리보자임과 앱타머가 주로 교류 모듈(communication module)을 통하여 연결된다. 교류 모듈은 앱타머에서 발생된 신호를 리보자임으로 전달하는 중간 매개체의 역할을 하는 구조이다(Kertsburg, A. and Soukup, G.A. 2002, A versatile communication module for controlling RNA folding and catalysis. Nucleic Acids Res. 30: 4599-4606).
앱타머에 의해 리간드가 센싱(sensing)되면 이러한 신호가 교류 모듈을 통하여 리보자임으로 전달되어 비활성 상태로 존재하던 리보자임이 알로스테 릭(allosteric)하게 그 활성이 유도되거나 억제된다. 즉, 외부나 내부의 특정 리간드에 의해 리보자임의 활성이 조절 가능하다.
현재의 암 치료 방법에서는 암세포만을 특이적으로 제거할 수 있는 기술의 개발이 필요하다. 알로스테릭 리보자임(allosteric ribozyme, aptazyme)은 RNA가 다른 리간드 등과의 결합에 의해 그 구조가 변하는 것을 이용하여 리보자임과 앱타머를 결합시킨 것이다. 저분자를 리간드로 하는 알로스테릭 리보자임의 정확한 메카니즘은 알려지지 않았는데 리간드 결합에 의해 리보자임이 구조적으로 안정화 또는 불안정화 됨으로 인해 이루어지는 것으로 생각되어진다(Kertsburg, A. and Soukup, G.A. 2002, A versatile communication module for controlling RNA folding and catalysis. Nucleic Acids Res. 30: 4599-4606; Jose, A.M., Soukup, G.A., and Breaker, R.R. 2001, Cooperative binding of effectors by an allosteric ribozyme. Nucleic Acids Res. 29: 1631. 1637; Koizumi, M., Soukup, G.A., Kerr, J.N., and Breaker, R.R. 1999, Allosteric selection of ribozymes that respond to the second messengers cGMP and cAMP. Nature Struct . Biol . 6: 1062.1071). 저분자가 리간드로 작용하는 앱타자임이 초기에 연구되어졌고 최근 단백질 또는 올리고와 상호작용하는 앱타자임에 대한 연구가 진행되어지고 있다.
hTERT(human Telomerase reverse transcriptase)는 암 세포의 영속성(immortality) 및 증식(proliferation) 능력을 조절하는 가장 중요한 효소 중의 하나로, 이 텔로머라제(telomerase)는 무한히 복제되는 생식세포, 조혈세포 및 암세포에서 80 내지 90%의 텔로머라제 활성을 가지고 있지만, 암세포 주변의 정상세 포들은 그 활성을 가지고 있지 않다(Bryan, T.M. and Cech, T.R. 1999, Telomerase and the maintenance of chromosome ends. Curr . Opin . Cell Biol . 11; 318-324). 텔로머라제의 이런 특성을 이용하여 세포 성장에 관여하는 텔로머라제의 억제자를 개발함으로써 암세포의 증식을 억제하려는 시도가 최근 활발히 진행되고 있다(Bryan, T.M., Englezou, A., Gupta, J., Bacchetti, S., and Reddel, R.R. 1995, Telomere elongation in immortal human cells without detectable telomerase activity. Embo J. 14; 4240-4248; Artandi, S.E. and DePinho, R.A. 2000, Mice without telomerase: what can they teach us about human cancer Nat. Med . 6; 852-855).
본 발명자들은 암세포 특이적인 타겟인 hTERT(human Telomerase reverse transcriptase) RNA를 특이적으로 인지하여 트랜스-스플라이싱하는 능력이 검증된 hTERT 타겟팅 트랜스-스플라이싱 리보자임에 테오필린에 높은 친화력을 갖는 앱타머를 보편화된 교류 모듈을 매개로 결합시킨 다양한 테오필린 의존성 알로스테릭 트랜스-스플라이싱 리보자임(trans-splicing aptazyme)을 개발하였다.
또한, 본 발명을 통하여 이러한 리보자임들이 시험관 및 세포 내에서 테오필린이 존재하는 조건에서만 hTERT RNA를 선택적으로 인지하여 절단하고 표적 사이트의 하단 부위에 리보자임의 3’엑손을 연결하는 것을 in vitro 트랜스-스플라이싱 분석, 루시퍼라제 분석(Luciferase assay), RT-PCR 및 MTT 분석으로 확인하였다.
이러한 알로스테릭 트랜스-스플라이싱 리보자임을 활용, 외부인자인 저분자 화합물에 의해 리보자임 기능을 활성화시킴으로써 특정 질환 특이적인 RNA를 표적 으로 한 후 치료용 유전자 RNA로의 치환을 인위적으로 조절할 수 있는 시스템을 개발할 수 있다. 또한, 질환 세포 특이적으로 치료용 유전자 발현을 인위적으로 조절하여, 새로운 개념의 특이적이며 가역적인 유전자 치료 기술을 개발할 수 있다(도 1).
따라서, 본 발명의 목적은 테오필린에 의해 활성이 조절되는 알로스테릭 트랜스-스플라이싱 그룹 I 리보자임(allosteric trans-splicing group Ⅰ ribozyme)의 선별방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은 hTERT(human Telomerase reverse transcriptase) RNA를 특이적으로 표적하며, 테오필린에 의해 RNA 치환 활성이 조절되는 알로스테릭 트랜스-스플라이싱 그룹 I 리보자임 및 이의 용도를 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 상술한 리보자임을 발현하는 발현벡터 및 이의 용도를 제공하는 것이다.
상기 목적을 달성하기 위하여 본 발명은
테오필린에 의해 활성이 조절되는 알로스테릭 트랜스-스플라이싱 그룹 I 리보자임(allosteric trans-splicing group Ⅰ ribozyme)의 선별방법을 제공한다.
또한, 본 발명은 hTERT(human Telomerase reverse transcriptase) RNA를 특이적으로 표적하며, 테오필린에 의해 RNA 치환 활성이 조절되는 알로스테릭 트랜스-스플라이싱 그룹 I 리보자임 및 이의 용도를 제공한다.
또한, 본 발명은 상술한 리보자임을 발현하는 벡터 및 이의 용도를 제공한다.
본 발명의 리보자임은 테오필린에 의존적으로 활성이 조절되어 트랜스-스플라이싱 반응을 통해 표적 hTERT RNA를 보정함으로써, 표적 hTERT RNA를 발현하는 암세포만을 선택적으로 진단하거나, 세포사를 유도하여 치료할 수 있다.
본 발명은
트랜스-스플라이싱 리보자임의 P6과 P8 도메인에 각각 또는 모두 테오필린 앱타머와 교류 모듈을 결합시킨 앱타자임, P9 도메인의 일부가 제거된 트랜스-스플라이싱 리보자임의 P6과 P8 도메인에 각각 또는 모두 테오필린 앱타머와 교류 모듈을 결합시킨 앱타자임 또는 P9 도메인의 일부가 변이된 트랜스-스플라이싱 리보자임의 P6과 P8 도메인에 각각 또는 모두 테오필린 앱타머와 교류 모듈을 결합시킨 앱타자임을 제작하는 단계;
테오필린과 카페인을 사용하여 in vitro에서 상기 제작된 앱타자임의 알로스테릭 조절을 비교하여 테오필린 의존성 트랜스-스플라이싱 여부를 확인하는 단계; 및
포유류의 세포에서 0.1 ~ 1 mM의 테오필린 존재 하에서 루시퍼라제 활성으로 테오필린 의존성 트랜스진 발현 여부를 확인하는 단계
를 포함하는 것을 특징으로 하는 테오필린에 의해 활성이 조절되는 알로스테릭 트랜스-스플라이싱 그룹 I 리보자임(allosteric trans-splicing group Ⅰ ribozyme)의 선별방법을 포함한다.
이때, 상기 앱타자임을 제작하는 단계에서, hTERT RNA에 대한 안티센스 100 ~ 300 nt가 부착된 앱타자임을 추가로 제작한다.
또한, 본 발명은 hTERT(human Telomerase reverse transcriptase) RNA를 특이적으로 표적하며, 3' 엑손에는 반딧불 유래 루시퍼라제 수용체 유전자를 함유하는 테오필린에 의해 RNA 치환 활성이 조절되는 알로스테릭 트랜스-스플라이싱 그룹 I 리보자임을 포함한다.
이때, 상기 리보자임은 바람직하기로는 서열번호 1로 표시되는 AS300 △P9 8T, 서열번호 2로 표시되는 AS100 Mu-P9 6T8T 또는 서열번호 3으로 표시되는 AS300 W-P9 6T8T이다.
또한, 본 발명은 상기 리보자임을 발현하는 벡터를 포함한다.
이때, 상기 발현벡터는 바람직하기로는 서열번호 4로 표시되는 pSEAP AS300 Delta P9 8T-Luci, 서열번호 5로 표시되는 pSEAP AS100 Mu-P9 6T8T-Luci 또는 서열번호 6으로 표시되는 pSEAP AS300 W-P9 6T8T-Luci이다.
또한, 본 발명은 hTERT(human Telomerase reverse transcriptase) RNA를 특이적으로 표적하며, 3' 엑손에는 HSV-TK(herpes simplex virus thymidine kinase) 세포사 유전자를 함유하는 테오필린에 의해 RNA 치환 활성이 조절되는 알로스테릭 트랜스-스플라이싱 그룹 I 리보자임을 포함한다.
이때, 상기 리보자임은 바람직하기로는 서열번호 7로 표시되는 AS300 W-P9 6T8T-TK이다.
또한, 본 발명은 상기 리보자임을 포유류 세포에서 발현하는 벡터를 포함한다.
이때, 상기 발현벡터는 바람직하기로는 서열번호 8로 표시되는 pAvQ-Theo-Rib21AS-TK(KCCM 10935P)이다.
또한, 본 발명은 상기 리보자임 및 테오필린을 함유하는 유전자 발현 유도제, 암 진단제 또는 유전자 치료제를 포함한다.
또한, 본 발명은 상기 발현벡터 및 테오필린을 함유하는 유전자 발현 유도제, 암 진단제 또는 유전자 치료제를 포함한다.
이하, 본 발명을 더욱 상세하게 설명하면 다음과 같다.
본 발명의 알로스테릭 트랜스-스플라이싱 그룹 I 리보자임은 이하, 앱타자임(aptazyme) 또는 테오필린 의존적인 앱타자임이라고도 한다.
본 명세서 전체에 걸쳐 언급된 테오필린 앱타머는 테오필린에 특이적으로 결합하는 앱타머를 의미한다.
본 발명의 알로스테릭 트랜스-스플라이싱 그룹 I 리보자임은 리보자임의 기질 결합 부위 및 촉매 코어 부위에 앱타머와 같이 특정 리간드와 결합하는 부위를 연결하는 경우, 특정 리간드와 앱타머가 결합되어 리간드가 센싱되면 이러한 신호가 교류 모듈을 통하여 리보자임으로 전달되어 리보자임의 구조적 변이가 발생됨으로써, 리보자임의 트랜스-스플라이싱 활성이 알로스테릭하게 증가 또는 저해될 수 있는 분자이다.
본 발명자들은 그룹 I 인트론을 바탕으로 기존에 개발한 hTERT 타겟팅 트랜스-스플라이싱 리보자임에 테오필린 앱타머를 교류 모듈을 매개로 결합시켜, hTERT가 있는 암 세포에서만 트랜스-스플라이싱이 유도될 뿐 아니라 이러한 트랜스-스플 라이싱 리보자임의 활성이 테오필린에 의해 조절 가능한 앱타자임을 개발하였다.
이때, 트랜스-스플라이싱 리보자임의 P6과 P8 도메인에 각각 또는 모두 테오필린 앱타머를 결합시키거나, P9 도메인을 일부 제거한 트랜스-스플라이싱 리보자임의 P6과 P8 도메인에 각각 또는 모두 테오필린 앱타머를 결합시킨 앱타자임을 제작하였다(도 3 참조). 여기서, 앱타머와 리보자임을 연결하는 부위는 가장 보편화된 교류 모듈을 사용하였다. 또한, PCR을 이용하여 클로닝하는 과정에서 P9 도메인이 다른 시퀀스로 변이된 mu-P9 6t8t를 얻었으며 이 구조체 역시 같이 실험을 진행하였다(도 4 참조). 모든 실험은 테오필린에 대한 결과임을 확인하기 위하여 테오필린과 잔기가 하나 다른 카페인과 이들을 녹이는데 사용한 같은 부피의 용매(dH2O 또는 PBS)를 대조군으로 사용하여 비교하였다.
in vitro에서 앱타자임의 알로스테릭 조절을 비교·확인한 결과, mu-P9 6t8t와 △P9 6t가 테오필린에 의존적으로 트랜스-스플라이싱됨을 확인할 수 있었다(도 5 참조). 또한, mu-P9 6t8t가 △P9 6t와 비교할 때 PCR을 통한 트랜스-스플라이싱 산물의 양이 40%이상 높게 나타났다. 이를 실시간 PCR을 이용하여 mu P9 6t8t에서 dH2O와 비교 시 테오필린이 있는 조건에서 12배 이상의 트랜스-스플라이싱 산물이 생성됨을 확인하였다(도 6 참조). 또한, 확장된 IGS를 가진 리보자임에 대해 in vitro에서 앱타자임의 알로스테릭 조절을 비교·확인한 결과, 같은 리보자임 기본 골격을 가지더라도 안티센스 시퀀스 존재 여부에 따라 활성에 차이를 보일 수 있음을 확인하였다(도 7 참조).
포유류의 세포에서도 확인을 하였는데 in vitro와 세포 내에서 각 앱타자임 의 알로스테릭 조절 결과가 일치하지 않을 수 있음을 고려하여 in vitro에서 수행하였던 앱타자임 모두를 검증하였다.
이 실험에 앞서서 테오필린의 최적 농도를 세포에서 확인하기 위하여 농도별로 세포에 처리해 본 결과, 테오필린의 농도가 바람직하게는 0.1 ~ 1.0 mM, 더욱 바람직하게는 0.7 mM가 최적임을 확인하였다(도 9 참조)
이어서 세포 내에서 트랜스-스플라이싱 산물이 발현되며, 발현된 트랜스진이 그 기능을 하는지 여부를 확인하고자 루시퍼라제 분석을 수행하였다.
세포 실험에서는 전체적으로 테오필린이나 카페인을 넣어주지 않고 동일한 부피의 PBS(용매)만 넣어준 조건에서도 루시퍼라제가 발현되었다. 이는 트랜스-스플라이싱 앱타자임의 3'-엑손에 갖는 루시퍼라제 유전자가 트랜스-스플라이싱 없이 리키(leaky)하게 발현되는 것으로 예측하여 타겟이 존재하지 않는 것으로 알려진 세포(SK-LU I)에서 리보자임을 트랜스펙션하여 확인한 결과, 예측대로 타겟이 없는 조건에서도 리키하게 루시퍼라제가 발현되는 것을 확인하였다(도 11 참조).
이러한 배경을 보완하기 위하여 안티센스를 증가시키게 되었는데, 안티센스의 증가로 인하여 이러한 비특이적 발현은 줄어들고 효율은 더욱 증가시킬 수 있을 것으로 예측하고, 리보자임의 안티센스를 100개에서 300개로 증가시키는 개질(modify)을 진행하였고, 다시 세포 내에서 이를 확인하였다. 그 결과 전체적으로 효율이 증가하는 패턴을 보였다. 결과적으로 AS-100 Mu-P9 6t8t, AS-300 W-P9 6t8t와 AS-300 △P9 8t의 경우 hTERT+ 세포 내에서 테오필린 의존적으로 효과적인 루시퍼라제 활성 유도를 관찰할 수 있었다(도 10 및 도 12 참조). 세포에서 트랜 스-스플라이싱을 검증하기 위하여 세포의 총 RNA를 얻어서 RNA 수준에서 트랜스-스플라이싱 산물을 확인하여 AS300 WT과 테오필린이 있는 경우의 AS300 W-P9 6T8T에서 트랜스-스플라이싱 산물 밴드가 나타나는 것을 확인하였다(도 13 참조).
3'-엑손을 루시퍼라제에서 HSV-TK(herpes simplex virus thymidine kinase)로 바꾼, 즉 hTERT RNA를 특이적으로 표적하며, 3' 엑손에는 HSV-TK 세포사 유전자를 함유하는 알로스테릭 트랜스-스플라이싱 그룹 I 리보자임을 제작하고, 이 리보자임을 인코딩하는 발현벡터(pAvQ-Theo-Rib21AS-TK)를 제작한 다음 이를 이용하여 아데노바이러스를 만들어 실험을 진행하였다.
hTERT 양성 세포주(HT-29, HepG2, Capan-1)와 음성 세포주(IMR90)에서 다양한 아데노바이러스를 처리한 다음 GCV와 테오필린과 카페인을 5일 동안 처리한 후 MTT 분석을 통하여 세포사를 관찰하였다. 이때, 양성 대조군으로 Ad-TK(CMV promoter 하에 HSVtk를 발현하는 adenoviral vector)를 이용하였으며 hTERT+ 세포에서의 양성 대조군으로서 Ad-Rib-TK(hTERT 특이적이며 HSVtk가 태깅(tagging)되어 있는 아데노바이러스성 벡터)를 이용하였다. 음성 대조군으로는 Ad-LacZ(CMV promoter 하에 LacZ를 발현하는 adenoviral vector)를 이용하였다. 그 결과, hTERT + 세포주에서는 Ad-TK와 Ad-Rib-TK는 조절화합물의 여부에 관계없이 GCV를 처리하였을 때 죽지만, Ad-TheoRib-TK는 테오필린이 있을 경우에서만 특이적으로 세포사가 일어나는 것을 볼 수 있었다(도 15 내지 도 17 참조). 그리고 음성 대조군인 Ad-LacZ는 모든 경우에서 세포사가 일어나지 않았다.
이와 같은 특이적 세포사가 타겟 RNA에 의해 조절이 되는지 보기 위해 hTERT -세포주인 IMR90에서 실험한 결과 Ad-TK는 GCV를 처리하였을 때 세포사가 일어났지만, Ad-Rib-TK과 Ad-TheoRib-TK, Ad-LacZ는 세포사가 일어나지 않은 것으로 보아 hTERT 타겟 RNA에 의해 세포사가 조절되는 것으로 확인되었다(도 18 참조).
hTERT +세포인 HT-29에 MTT 분석을 통해 가장 세포사가 잘 유도되었던 아데노바이러스 100 M.O.I, 화학물질 100 μM을 처리한 뒤 총 RNA를 얻은 후 실시간 PCR을 수행하였다. 그 결과, 테오필린 존재시 Ad-Theo-CRT가 도입된 HT-29 세포에서만 측정된 트랜스-스플라이싱 산물이 나타나고, 특히 트랜스-스플라이싱 산물의 양이 거의 Ad-Rib-TK를 처리하였을 경우와 비슷한 것으로 확인되었다. 카페인에서는 트랜스-스플라이싱의 양이 어느 정도 보이긴 하였으니 테오필린을 처리하였을 경우에 비교하여 78%나 그 양이 적었다(도 20 참조). 이는 카페인이 테오필린 앱타머에 테오필린 보다 1000배 약하긴 하지만 어느 정도 결합을 하기 때문이라 생각된다. 이러한 결과로부터 본 발명의 알로스테릭 리보자임에 의해 유발된 테오필린 의존적 표적 특이적인 세포사 유도는 세포 내에서의 테오필린 의존적이며 표적 RNA 특이적인 트랜스-스플라이싱 반응에 의한 것임을 알 수 있었다.
이하, 본 발명을 실시예에 의거하여 더욱 상세하게 설명하겠는 바, 본 발명이 이에 한정되는 것은 아니다.
참조예 1: 기질( hTERT ) RNA 제조
타겟 RNA을 제작하기 위해서 hTERT의 -1부터 +218까지 포함되어 있는 pCl- neo 벡터(exon1-2)를 서열번호 9로 표시되는 프라이머 5'-GGGGAATTCTAATACGACTCACTATAGGGCAGGCAGCGCTGCGTCCT-3'과, 서열번호 10로 표시되는 프라이머 5'-CGGGATCCCTGGCGGAAGGAGGGGGCGGCGGG-3'을 이용해서 PCR로 증폭시켜 hTERT RNA을 코딩하는 DNA를 제조하였다. 이렇게 제조된 DNA를 in vitro 전사를 통해서 RNA을 만들게 되는데 DNA 주형(3 ㎍), 10x 전사 버퍼, 10 mM DTT(Sigma), 0.5 mM ATP, GTP, CTP, UTP(Roche), 80U RNase 억제제(Kosco), 200U T7 RNA 중합효소(Ambion), DEPC-H20를 최종 100 ㎕까지 넣어 섞은 후 37 ℃에서 3시간 동안 반응시키고, 5U DNase Ι(Promega)를 37 ℃에서 30분간 더 처리하여 DNA 주형을 완전히 제거한 후 페놀 추출(pH 7.0), 에탄올 침전으로 RNA를 정제한 후 RNA를 6% 변성 아크릴아마이드 겔 상에서 RNA 밴드를 용출한 후 정제하여 TE 버퍼(10 mM Tris-HCl pH 7.5, 1 mM EDTA)에 녹였다.
참조예 　2:　테오필린 의존성 hTERT 타겟팅 트랜스- 스플라이싱 (T/S) 앱타자임 클로닝
알로스테릭 리보자임 개발을 위한 기본 트랜스-스플라이싱 리보자임 골격은 hTERT의 +21 nt 부위를 특이적으로 인지하고 P1, P10 그리고 표적 RNA에 대한 300 개의 안티센스 시퀀스가 첨가된 확장된 IGS를 가진 그룹 I 인트론 리보자임을 이용하였다(Kwon, B.S., Jung, H.S., Song, M.S., Cho, K.S., Kim, S.C., Kimm, K., Jeong, J.S., Kim, I.H., and Lee, S.W. 2005, Specific regression of human cancer cells by ribozyme-mediated targeted replacement of tumor-specific transcript. Mol . Ther. 12: 824-834; Hong, S.H., Jeong, J.S., Lee, Y.J., Jung, H.I., Cho, K.S., Kim, C.M., Kwon, B.S., Sullenger, B.A., Lee, S.W.*, and Kim, I.H.* 2008, In vivo reprogramming of hTERT by trans-splicing ribozyme to target tumor cells. Mol Ther . 16: 74-80).
hTERT 타겟팅 리보자임의 P6 도메인과 P8 도메인에 각각 그리고 모두에 테오필린 앱타머를 교류 모듈을 매개로 하여 클로닝하였다. 또한, 리보자임의 P9 도메인을 결손시킨 △P9 리보자임에도 위와 동일하게 P6, P8 도메인을 개질(modify)하였다. 테오필린 앱타머가 교류 모듈을 통하여 연결된 자가 스플라이싱 리보자임(self splicing ribozyme)으로부터 hTERT를 타겟할 수 있는 IGS가 포함된 서열번호 11(5'-GGGGAATTCTAATACGACTCACTATAGGCAGGAAAAGTTATCAGGCA-3')의 프라이머와 리보자임의 3' 엑손 전까지 증폭할 수 있는 서열번호 12(5'-CGAGTACTCCAAAACTAATCAA-3')의 프라이머를 이용하여 테오필린 앱타머가 결합된 hTERT 타겟팅 트랜스-스플라이싱 리보자임을 Hind III와 Nru I을 이용하여 SEAP 프로모터 벡터에 클로닝하였다. 그 후 루시퍼라제 유전자를 서열번호 13(5'-CGATGATCACGAAGACGC-3')의 프라이머, 서열번호 14(5'-AAGGAAAAAAGCGGCCGCTTATTACAATTTGGACTTT-3')의 프라이머를 사용하여 PCR하여 Nru I과 Xba I로 리보자임 뒤에 클로닝하였다. 그런데 PCR을 이용한 클로닝 과정 중에 P9 도메인이 의도하지 않은 시퀀스로 변이된 구조체(construct)를 얻었다. 이 구조체를 포함하여 wild P9 6t, wild P9 8t, 2개의 wild 구조체와 △P9 6t, △P9 8t, △P9 6t8t 3개의 결손 구조체 그리고 mu P9 6t8t를 제작하였으며 대조군으로 앱타머가 없는 wild P9와 △P9을 포함하여 총 8종류의 구조체를 제작하였다.
제작된 테오필린 의존성 hTERT 타겟팅 T/S 앱타자임의 염기서열은 터미네이터 레디 반응 혼합물(terminator ready reaction mixture, PE applied Biosystems) 3 ㎕, 정량된 DNA 100 ng, 서열번호 15(5'-CGGGATCCCTGGCGGAAGGAGGGGGCGGCGGG-3')의 프라이머 3.2 pmol을 총 10㎕ 반응으로 (96℃-10’, 50℃-5’, 60℃-4’)x 25 사이클 반응 한 후 정제를 위하여 dH2O 40㎕ 첨가한 후 3M NaoAC(1/10 volume), 100% EtOH(2 volume)를 넣고 보르텍스(vortex) 후 13000 rpm, 4 ℃에서 30분간 원심분리하고 70% EtOH(400㎕) 로 세척한 다음 EtOH를 제거하고 진공건조기(speed-vacuum)로 말린 후 주형 억제 시약(template suppression reagent) 15 ㎕에 녹였다. 다음 보르텍스와 스핀 다운 후 시퀀싱 튜브에 옮겨 자동 서열분석기(ABI 310 Genetic Analyzer)로 시퀀싱을 확인하였다.
참조예 3: 테오필린 의존성 hTERT 타겟팅 T/S 앱타자임 RNA의 제조
T7 중합효소 프로모터가 포함된 서열번호 16(5'-GGGGAATTCTAATACGACTCACTATAGGCAGGAAAAGTTATCAGGCA-3' )의 프라이머와 리보자임의 3' 엑손의 중간을 잡는 서열번호 17(5'-CCCAAGCTTGCGCAACTGCAACTCCGATAA-3')의 프라이머를 사용하여 PCR하여 DNA 주형(3 ㎍), NTP 양을 1.5 mM로 늘려서 자가 스플라이싱을 최대한 방지하며, 1x 스플라이싱 버퍼(40mM Tris-HCl pH 7.5, 5 mM MgCl2, 10 mM DTT, 4 mM spermidine), 0.5 mM ATP, GTP, CTP, UTP(Roche), 80U RNase 억제제(Kosco), 200U T7 RNA 중합효소(Ambion), DEPC-H20을 최종 100 ㎕까지 넣어 섞은 후 37 ℃에서 3시간 동안 전사시키고, 5U DNase Ι(Promega)를 37 ℃에서 30분간 더 처리하여 DNA 주형을 완전히 제거한 후 페놀 추출(pH 7.0), 에탄올 침전으로 RNA를 정제한 후 RNA를 4% 변성 아크릴아마이드 겔 상에서 RNA 밴드를 용출한 후 정제하여 TE 버퍼(10 mM Tris-HCl pH 7.5, 1 mM EDTA)에 녹였다.
참조예 　4: In vitro 트랜스- 스플라이싱 반응
테오필린(500 μM) 또는 테오필린과 잔기 하나가 다른 카페인(500 μM) 또는 같은 부피의 dH2O 각각이 존재하는 상태에서 리보자임(50 nM)과 기질 RNA인 hTERT RNA(10 nM)를 스플라이싱 조건(50 mM HEPES, pH 7.0/150 mM NaCl/5 mM MgCl2/100 μM guanosine) 하에서 37 ℃ 3시간 반응 후 형성된 산물을 RT-PCR 반응을 통하여 분석하였다. 이때, RT를 위한 프라이머는 루시퍼라제 인지부위 (5’-CCCAAGCTTGCGCAACTGCAACTCCGATAA-3', 서열번호 18)이며 PCR을 위한 5‘ 프라이머는 hTERT RNA의 5’ 말단을 (5‘-GGAATTCGCAGCGCTGCGTCCTGCT-3', 서열번호 19), 3’ 프라이머는 루시퍼라제를 인지하는 부위 (5'-CCCAAGCTTTCACTGCATACGACGATT-3', 서열번호 20)를 이용하였다.
참조예 5: 반 정량적(Semi-quantitative) PCR
In vitro 트랜스-스플라이싱 반응 후 트랜스-스플라이싱 산물을 실시간 PCR을 사용하여 반 정량적 PCR을 수행하였다. 각각의 샘플을 트리플렛으로 진행하여 평균값을 구하였으며 녹는점을 확인하고 아가로스 겔 상에서 확인하였다. 이때, SYBR 그린을 이용하여 검출하였으며 반 정량적으로 샘플을 비교할 수 있도록 RT 반응부터 정량이 된 표준 대조군을 사용하였다. 보정을 위하여 RT 반응 시 각 샘플에 동량의 임의의 RNA(ras RNA)를 넣어주었으며 RT 프라이머 제작 시 트랜스-스플라이싱 산물과 내부 대조군(internal control)인 ras RNA가 하나의 프라이머로 RT될 수 있도록 디자인하여 서열번호 21(5'-GCCCAACACCGGCATAAAGTTACATAATTACACACTT-3')의 프라이머를 제작하였다. 따라서, RT된 샘플의 정량적인 비교에 있어서 ras cDNA의 양으로 그 값을 보정하였다.
PCR 조건은 예열(preheating) 96℃ 10 분, 변성(denaturation) 96℃ 5 분, 연결(annealing) 60℃ 15 초, 연장(extension) 72℃ 30 초로 수행하였다. 이때, 5' 프라이머는 hTERT 인지 부위를 (5'-CCCGAATTCTGCGTCCTGCTCGA, 서열번호 22) 3' 프라이머는 루시퍼라제 인지 부위를 (5'-CCCAAGCTTTCACTGCATACACGATT, 서열번호 23) 사용하였다. internal control인 ras cNDA의 PCR 프라이머는 다음과 같다; 5' 프라이머 (5'-ATGACTGAATATAAACTT, 서열번호 24), 3' 프라이머 (5'-CCCAAGCTTTACATAATTACACACTT, 서열번호 25).
참조예 6: 특이성 증가시킨 특이 T/S 앱타자임 제작
hTRET 서열상에서 IGS에 의해 인지되는 곳으로부터 3' 말단 쪽으로 상보적인 100 nt의 안티센스 가닥을 서열번호 26(5'-AATTCAAGCTTCGTTTTGCGGCAGCAGGAAAAGTTATCAGGCATG-3'), 서열번호 27(5'-CCTGATAACTTTTCCTGCCGCAAAACGAAGCTTG-3')의 프라이머를 이용하고, 300 nt의 안티센 스 가닥을 서열번호 28(5'-GGGAAGCTTGGGAAGCCCTGGCCC-3'), 서열번호 29(5'-GGGAAGCTTAAGGCCAGCACGTTCTT-3')의 프라이머를 이용하여 PCR하였으며, 이를 제작한 리보자임 구조체의 리보자임 앞에 Hind III 효소 사이트로 클로닝하였다.
참조예 7: 세포 배양
hTERT 양성 세포주는 293(human kidney / normal), HT-29(colon / colorectal adenocarcinoma), Capan-1(pancreas / adenocarcinoma), HepG2(liver / hepatocellular carcinoma), hTERT 음성 세포주는 IMR-90(lung / fibroblast / normal), SK-LU1(lung / adenocarcinoma) ATCC를 참조하여 37℃ 5% CO₂인큐베이터에서 배양하였다.
참조예 8: 세포주에서의 트랜스- 스플라이싱 앱타자임의 특이성, 효율성 검증
1) 테오필린의 최적 농도 시험
293 세포를 3×105로 35 mm 디쉬에 세포를 씨딩하여 80% 정도 자랐을 때 mu P9 6t8t 구조체 1 ㎍을 LipofectAMINE(Invitrogen)을 이용해 트랜스펙션하였으며 테오필린 또는 카페인이 각각 0.1 mM, 0.3 mM, 0.5 mM, 0.7 mM, 1 mM인 조건으로 18시간 배양 후 루시퍼라제 분석을 수행하였다. 대조군으로 같은 부피의 PBS를 사용하였다.
2) 듀얼 루시퍼라제 분석
35 mm 디쉬에 트랜스펙션한 각각 세포의 배지를 제거하고 1x PBS로 잘 닦아주었다. 여기서 1x 비활성 용해 버퍼(passive lysis buffer)를 200 ㎕ 넣고 상온에서 15분간 용해시킨 후 세포를 얻은 뒤 13000 rpm으로 1분간 원심분리하여 상층액 만을 새 튜브에 옮겼다. 발광시료측정장치(Luminometer) 튜브에 LARII(Luciferase assay reagent II)을 100 ㎕를 넣고 여기에 세포 파쇄물 20 ㎕를 넣어 섞은 후 발광시료측정장치로 읽었다. 다시 여기에 Stop & Glo reagent mix(Stop & Glo 20㎕ + Stop & Glo buffer 1㎖)를 100 ㎕ 넣고 섞은 후 발광시료측정장치(TD+20/20)로 읽었다. 지연 시간은 3초, 통합 시간(integrate time)은 12초로 하고, 감도는 각각의 세포에 알맞게 45%로 설정하였다.
트랜스펙션 시 테오필린, 카페인은 PBS에 녹여서 세포에 처리하였다. 또한, 세포에 트랜스펙션 작업이 끝나고 MEM 배지로 갈아주는 단계에서 각 화학물질을 처리하여 18시간동안 배양한 후 루시퍼라제 분석을 수행하였다.
3) 세포 내 트랜스- 스플라이싱 반응
세포 내에 리보자임 벡터 1 ㎍을 293 세포에 리포펙타민(Lipofectamine) 4 ㎕를 이용하여 transient하게 트랜스펙션하였다. 트랜스펙션 후 5 시간 후 0.7 mM 테오필린 또는 카페인이 들어 있는 배지로 교체한 후 18 시간 후에 세포 파쇄물을 획득하고 총 RNA를 정제하였다. 이때, RNA를 추출 시 in vitro 상에서의 트랜스-스플라이싱 반응 가능성을 최소화하기 위하여 20 mM EDTA가 포함된 구아노신 이소시아네이트 세포 파쇄물 용액(guanosine isocyanate cell lysate solution)을 이용하여 RNA를 추출하였다. RNA를 루시퍼라제 부위를 인지하는 프라이머를 이용하여 (5'-CCCAAGCTTGCGCAACTGCAACTCCGATAA, 서열번호 30) 역전사 반응 후 cDNA를 중첩 루시퍼라제 프라이머(nested luciferase primer)를 3' 프라이머(5'- CCCAAGCTTGCCCAACACCGGCATAAAG, 서열번호 31)로 hTERT 5' 말단을 인지하는 부위를 5' 프라이머로 (5'-AGCGCTGCGTCCTGCT, 서열번호 32) 각각 이용하여 PCR 증폭하였다. PCR 조건은 예열 96℃ 10 분, 변성 96℃ 5분, 결합 58℃ 30 초, 신장 72℃ 20 초로 40 사이클 수행하였다. 이때, 반응 산물의 반응 대조군으로서 추출된 RNA를 올리고 dT로 역전사한 후 GAPDH 5' 프라이머(5'-TGACATCAAGAAGGTGGTGA, 서열번호33) 및 GAPDH 3' 프라이머 (5'-TCCACCACCCTGTTGCTGTA, 서열번호 34)를 이용하여 GAPDH RNA 발현도를 관찰하여 내부 대조군으로 이용하였다.
4) 테오필린 의존성 hTERT 타겟팅 T/S 앱타자임을 발현하는 아데노바이러스 제작
pAvQ 셔틀 벡터에 AS300 WT P9-TK와 AS300 W-P9 6T8T-TK를 BamHⅠ과 BstBⅠ으로 클로닝하여 리보자임을 CMV 프로모터 하에 포유류 세포에서 발현하는 벡터를 제작하였다. 제작된 벡터를 PmeI으로 선형화(linearization)시켜 타입 5 아데노바이러스 게놈 DNA 플라스미드인 ΔE1/E3 pAdenovector(Qbiogene)와 함께 BJ5183 박테리아에 전기천공(Electroporation)법을 이용하여 코트랜스펙션(cotransfection)시켰다. 박테리아 세포 내에서 상동 재조합을 통하여 획득한 재조합 아데노바이러스성 벡터 구조체를 분리, 정제하여 miniprep으로 확인 후 PacI으로 선형화한 후 패키징 세포주인 293 세포에 트랜스펙션하였다. 바이러스 증식에 의해 형성되는 플라크 클론(plaque clone)들을 획득한 후 세포 파편(cell debris)을 제거한 바이 러스 상층액을 얻어서 293 세포에 다시 한 번 감염하여 세포의 용혈이 일어나는지 검증하였다.
AS300 WT P9-TK(original T/S ribozyme)와 AS300 W-P9 6T8T-TK (allosteric T/S ribozyme)를 CMV 프로모터 하에 발현하는 아데노바이러스성 벡터를 각각 Ad-Rib-TK, Ad-TheoRib-TK로 명명하였다.
재조합 아데노바이러스(Ad-Rib-TK, Ad-TheoRib-TK) 가 성공적으로 제작되었는지는 재조합 바이러스 게놈 DNA가 트랜스펙션된 293으로부터 얻은 상층액을 293 세포에 감염 후 CPE 관찰을 통하여 검증하였으며, 또한 세포 용해를 유발하는 플라크 클론으로부터의 바이러스 상층액으로부터 DNA를 얻어 PCR 실험(TK 및 바이러스 ITR 부위)을 통하여 검증하였다.
바이러스 감염된 세포의 파쇄물로부터 RNA를 추출 후 RT-PCR을 수행하여(TK RNA) 재조합 바이러스 구조체가 제대로 형성되고, 또한 이러한 바이러스로부터 트랜스진이 발현될 수 있음을 검증하였다. 각 재조합 아데노바이러스 클론을 감염시킨 293 세포의 상층액으로부터 얻은 재조합 바이러스들을 여러번 293 세포에 재감염하여 바이러스의 양을 증폭하였고 Vivapure® AdenoPACK ™을 이용하여 재조합 아데노바이러스성 벡터를 분리, 정제하였다. 획득한 재조합 바이러스를 연속 희석 후 TCID50 분석을 함으로써 각 정제된 바이러스 벡터의 PFU 타이터를 결정하였다.
5) MTT 분석
세포를 96 웰 플레이트(TPP)에 씨딩한 후 1일 후에 Ad-TK(CMV 프로모터 하에 TK 유전자를 발현하는 adenoviral vector), Ad-Rib-TK, Ad-TheoRib-TK, Ad-LacZ(CMV promoter 하에 LacZ를 발현하는 adenoviral vector) 아데노바이러스를 각각 감염하였다. 바이러스 감염 다음 날부터 5일 동안 GCV와 화학물질(theophylline, caffeine)이 함유된 배지를 2일에 한 번씩 갈아 주었다. 세포 수는 HT-29는 3X103/well, HepG2는 3X103/well, Capan-1은 5X103/well, IMR90은 5X103/well로 씨딩하였다. 5일 후 CellTiter 96®AQueous ONE Solution Cell Proliferation Assay (Promega)를 각 배지에 20%로 첨가하여 96 웰에 각 웰당 100 ㎕로 처리하여 Microplate reader model 550 (BioRad)으로 490 ㎚ 파장으로 측정하여 세포의 세포 생존율을 관찰하였다.
6) 반 정량적 PCR
35 mm 디쉬에 아데노바이러스를 감염한 뒤 24시간 후 화학물질(theophylline, caffeine)이 포함된 배지로 갈아 주고 또 24시간 뒤 세포에서 TriZol 반응시약(Invitrogen)을 이용하여 RNA를 정제하여 RT 한 후, 실시간 PCR을 사용하여 t/s 산물에 대한 반 정량적 PCR을 수행하였다. T/S PCR 산물의 양을 GAPDH를 PCR한 양으로 보정하였다.
RNA를 올리고(dT)를 이용하여 역전사 반응 후 cDNA를 TK 프라이머를 3‘ 프라이머(5'-CCCATGCACGTCTTTATCCTGGAT-3', 서열번호 35)로 hTERT 5' 말단을 인지하는 부위를 5’ 프라이머로 (5'-GGAATTCGCAGCGCTGCGTCCTGCT-3', 서열번호 36) 각각 이용하여 실시간 PCR 증폭하였다. 반응 산물의 반응 대조군으로서 올리고 dT로 역전사한 RNA를 GAPDH 5‘ 프라이머(5'-TGACATCAAGAAGGTGGTGA, 서열번호 37) 및 GAPDH 3‘ 프라이머(5'-TCCACCACCCTGTTGCTGTA, 서열번호 38)를 이용하여 GAPDH RNA 발현도를 관찰하여 내부 대조군으로 이용하였다.
실시예 1: 테오필린 앱타머가 부착되어 있으며 hTERT RNA를 특이적으로 표적하는 트랜스- 스플라이싱 리보자임 제조
알로스테릭 리보자임 개발을 위한 기본 트랜스-스플라이싱 리보자임 골격은 hTERT의 +21 nt 부위를 특이적으로 인지하고 P1, P10 그리고 표적 RNA에 대한 300 개의 안티센스 시퀀스가 첨가된 확장된 IGS를 가진 그룹 I 인트론 리보자임을 이용하였다(도 2). 이러한 리보자임은 이미 세포 및 동물모델에서 hTERT RNA 특이적으로 트랜스진을 발현시킴으로써 hTERT 발현 암세포 특이적인 세포사를 유도함을 관찰하였다(Mol . Ther . 2005;12:824, Mol Ther . 2008;16:74).
테오필린 의존성 알로스테릭 리보자임을 제작하기 위해 테오필린의 수용체 도메인으로서 테오필린 RNA 앱타머(Science 1994;263:1425)를 본 연구팀에서 개발한 hTERT-특이 T/S 리보자임의 촉매 기능을 위한 RNA 접힘에 주요한 역할(Nucleic Acis Res. 2002;30:4599)을 하는 P6 또는 P8 도메인에, 또는 P6, P8 도메인에 두 곳에 동시에 부착시켰다. 또한, P9 도메인을 최소화시킨 △P9 도메인이 치환된 리보자임 또는 P9이 변이되어 있는 리보자임의 P6, P8, 또는 P6+P8 도메인에 테오필린 앱타머를 부착시킨 T/S 리보자임을 제조하였다. 도 3은 트랜스-스플라이싱 리보자임의 근간 구조인 그룹 I 인트론의 구조 및 염기서열, 그리고 테오필린 앱타머 및 앱타머를 리보자임에 연결시키는 교류 모듈 구조(Nucleic Acis Res. 2002;30:4599) 등을 표시하였다.
제작한 트랜스-스플라이싱 리보자임 구조체들은 다음과 같다.
- hTERT 특이적 트랜스-스플라이싱 리보자임 (WT)
- WT의 P6 또는 P8에 앱타머가 부착된 리보자임 (W-P9 6t, WT-P9 8t)
- 변이 P9의 P6와 P8 도메인에 앱타머가 부착된 리보자임 (Mu-P9 6t8t)
- WT 리보자임의 P9 부위가 △P9로 치환된 리보자임 (△P9)
- △P9 리보자임에 P6. P8, P6+P8에 앱타머가 부착된 리보자임 (△P9 6t, △P9 8t, △P9 6t8t)
- hTERT에 대한 안티센스 300 nt가 부착된 WT 리보자임 (AS-300 WT)
- P1, P10 헬릭스를 함유하고 P6+P8에 앱타머 함유한 WT 리보자임 (IGS W-P9 6t8t)
- 안티센스 300 nt가 부착되어 있으며 P6+P8에 앱타머 함유한 WT 리보자임 (AS-300 W-P9 6t8t)
- 안티센스 300 nt가 부착되어 있으며 P6+P8에 앱타머 함유한 Mu-P9 리보자임(AS-300 Mu-P9 6t8t)
변이 P9의 구조는 리보자임 벡터를 제조하는 PCR 과정 중에 우연히 제작된 구조체로서 in vitro 상에서의 표적 RNA(hTERT RNA)와의 트랜스-스플라이싱 반응을 수행한 결과, 리보자임의 활성에는 영향을 끼치지 않는 부위임을 알 수 있었다. 따라서, 본 발명에서의 알로스테릭 리보자임 제작을 위한 후보로서 이러한 변이 P9를 기반으로 한 리보자임 구조체도 함께 제작하였고 그 기능을 관찰하였다. 도 4는 야생형 P9 시퀀스와 변이 P9(Mu-P9) 시퀀스를 표기하였다. 다른 부분은 굵은체와 밑줄로 표시하였다.
실시예 2: 리보자임들의 테오필린 의존성 RNA 치환 기능을 정량적으로 분석
상기에서 제작한 리보자임과 기질 RNA인 hTERT RNA를 스플라이싱 조건 하에서 37 ℃ 3시간 반응 후 형성된 산물을 RT-PCR 반응을 통하여 분석하였다. 스플라이싱 반응시 물 또는 0.5 mM 카페인(테오필린 구조 유사체, 알로스테릭 효과의 특이성에 대한 음성 대조군), 또는 0.5 mM 테오필린과 함께 반응시킴으로써 트랜스-스플라이싱 반응이 테오필린 특이적으로 알로스테릭하게 턴 온(turn on)되는지 관찰하였다. 도 5에서 RT-PCR 산물의 결과를 보여 주고 있다.
도 5를 참조하면, WT 및 △P9 리보자임은 예상과 같이 카페인, 테오필린, 물에 상관 없이 항상 트랜스-스플라이싱 반응을 유발하였으며 W-P9 6t의 경우에도 화합물 상관 없이 반응이 유발됨을 알 수 있었다. 또한, W-P9 8t의 경우에도 테오필린 특이적으로 트랜스-스플라이싱 반응이 일어나지 않으며 △P9 8t 및 △P9 6t8t의 경우에는 아예 트랜스-스플라이싱 반응 자체가 매우 비효율적으로 수행되고 있음을 알 수 있었다. 반면에, Mu-P9 6t8t와 △P9 6t 리보자임의 경우엔 테오필린 특이적으로 319 bp 사이즈의 트랜스-스플라이싱 산물이 in vitro 상에서 생성됨을 알 수 있었다. 따라서, 그룹 I 인트론의 P6 또는 P8 도메인이 리보자임의 P9 시퀀스 혹은 구조적 성질에 따라 테오필린 의존적으로 알로스테릭하게 리보자임 활성을 조절할 수 있는 주요 도메인임을 알 수 있었다.
알로스테릭 리보자임에 의한 테오필린 의존성 트랜스-스플라이싱 반응의 유도 조절 정도를 비교 분석하기 위하여 트랜스-스플라이싱 산물에 대한 실시간 PCR 분석(분석기기; Corbett Research RG 6)을 수행하였다. 상기 트랜스-스플라이싱 반응을 통하여 테오필린 의존적으로 효소 활성이 조절되는 Mu-P9 6t8t 리보자임과 또는 저분자 화합물과는 무관하게 구조적으로 효소활성을 가진 WT 리보자임을 hTERT RNA과 함께 스플라이싱 반응 후 RT 반응을 수행하였다. RT된 샘플의 정량적인 비교에 있어서 ras cDNA의 양으로 그 값을 보정하였고, 그 결과를 도 6에 나타내었다. 도 6을 참조하면, WT 리보자임의 경우엔 스플라이싱 버퍼 상에 물, 테오필린, 카페인 존재와 무관하게 동량의 트랜스-스플라이싱 산물을 생성하는 것을 알 수 있었다. 또한, △P9 6t 리보자임의 경우 실시간으로 반응 산물을 정량 분석한 결과 테오필린 의존성 트랜스-스플라이싱 반응 결과를 나타내진 않았다. 그러나, 앞선 실험을 통하여 확인한 in vitro상에서 테오필린에 의존적으로 조절되는 Mu-P9 6t8t 리보자임의 경우 내부 대조군으로 각 RT 샘플의 값을 보정하여 비교 하였을 때 카페인에 비해 테오필린이 존재하는 조건에서 4.3배 차이를 보였으며 같은 부피의 dH2O와는 12.16배의 차이를 보였다. 따라서, Mu-P9 6t8t 리보자임은 in vitro 상에서 효과적으로 테오필린에 의존적으로 트랜스-스플라이싱 반응이 조절될 수 있는 알로스테릭 리보자임임을 알 수 있었다.
상기에서 분석한 리보자임들의 IGS는 단지 6개의 nt 만을 가지고 있으므로 세포 내에서의 표적 RNA 특이적인 트랜스-스플라이싱 반응을 위해선 IGS 기가 확장된 리보자임을 이용해야 한다(Nat. Biotechnol . 1996;15:902, J. Mol . Biol . 1999;185:1935, Mol. Ther . 2003;7:386, Mol . Ther . 2004;10:365; Mol . Ther . 2005;12:824). 이러한 확장된 IGS를 가진 리보자임들을 in vitro 전사를 통하여 제조한 후 hTERT RNA와의 in vitro 상에서의 트랜스-스플라이싱 반응을 수행하였다. 이때, 역시 트랜스-스플라이싱반응이 테오필린에 의존적인지 관찰하였다. 제작한 리보자임들은 hTERT에 대한 안티센스 300 nt가 부착된 WT 리보자임(AS-300 WT), P1, P10 헬릭스를 함유하고 P6+P8에 앱타머 함유한 WT 리보자임(IGS W-P9 6t8t), 안티센스 300 nt가 부착되어 있으며 P6+P8에 앱타머 함유한 WT 리보자임(AS-300 W-P9 6t8t) 및 안티센스 300 nt가 부착되어 있으며 P6+P8에 앱타머 함유한 Mu-P9 리보자임(AS-300 Mu-P9 6t8t) 등이며, 그 반응 결과(trans-splicing product의 RT-PCR 산물)는 도 7에 나타내었다.
도 7을 참조하면, 예상대로 AS-300 WT은 테오필린에 상관없이 스플라이싱 반응을 유발하였다. AS300 W-P9 6t8t의 경우에도 in vitro 상에서는 테오필린에 상관없이 스플라이싱 반응이 유발되었으나 AS300 Mu-P9 6t8t는 AS300이 없는 경우와는 다르게 스플라이싱 반응 자체가 잘 일어나지 않음을 알 수 있었다. 반면에, 안티센스 없이 P1과 P10 헬릭스를 가진 IGS W-P9 6t8t의 경우엔 테오필린이 존재하는 경우에만 트랜스-스플라이싱 반응이 유발될 수 있음을 알 수 있었다. 이러한 결과들은 6 nt의 IGS만 가진 리보자임과 확장된 IGS 시퀀스를 가진 리보자임이 같은 리보자임 기본골격을 가진다 하더라도 안티센스 시퀀스 존재 여부에 따라 활성에 있어 차이를 보일 수 있는 RNA 구조적 차이가 존재할 수 있음을 시사하며, 따라서 이는 각 확장된 IGS를 가진 리보자임들의 in vitro 나아가 세포 내에서의 스플 라이싱 활성을 각각 관찰하여야 함을 시사한다.
상기 결과로부터 테오필린 앱타머가 부착된 일부 리보자임들은 in vitro 상에서 테오필린에 의존적으로 트랜스-스플라이싱 활성이 알로스테릭하게 조절될 수 있음을 알았다. 과연 이러한 트랜스-스플라이싱 산물이 정확한 트랜스-스플라이싱 반응에 의해 생성된 산물인지 검증하기 위하여 획득한 트랜스-스플라이싱 RT-PCR 산물을 pUC19 벡터에 클로닝한 후 그 염기서열을 결정하였다. 도 8과 같이, 트랜스-스플라이싱 반응 산물을 시퀀스한 결과 표적 RNA인 hTERT RNA의 +21 nt 부위 다음과 리보자임의 3’엑손에 부착된 반딧불 루시퍼라제 RNA가 정확히 연결된 산물임을 알 수 있었으며 이러한 결과는 즉 알로스테릭 트랜스-스플라이싱 리보자임의 반응이 매우 정확히 일어남을 의미한다.
실시예 3: 3'엑손에 리포터 유전자가 부착된 알로스테릭 트랜스- 스플라이싱 리보자임들의 제작
테오필린 의존성 알로스테릭 리보자임 발현 벡터를 제작하기 위해 테오필린의 수용체 도메인으로서 테오필린 RNA 앱타머(Science 1994;263:1425)를 본 발명자들에 의해 개발한 hTERT-특이 트랜스-스플라이싱 리보자임의 촉매 기능을 위한 RNA 접힘에 주요한 역할(Nucleic Acis Res. 2002;30:4599)을 하는 P6 또는 P8 도메인에, 또는 P6, P8 도메인에 두 곳에 동시에 부착시켰다. 또한, P9 도메인을 최소화시킨 △P9 도메인이 치환된 리보자임 또는 변이 P9을 함유한 리보자임의 P6, P8, 또는 P6+P8 도메인에 테오필린 앱타머를 부착시킨 트랜스-스플라이싱 리보자임을 제조하였다. 발현 유도를 위한 트랜스진으로서 반딧불 루시퍼라제 유전자를 리보자임의 3‘ 엑손으로 삽입하였으며 SV40 프로모터 시스템을 이용하여 세포 내 리보자임 발현을 도모하였다. 제작한 트랜스-스플라이싱 리보자임 구조체들은 다음과 같다.
벡터의 제조는 in vitro 스플라이싱 반응을 위하여 제조한 알로스테릭 리보자임 구조체들의 리보자임 부위로부터 루시퍼라제 3' 말단까지 PCR 반응을 통하여 증폭한 후 그 DNA를 SV40 프로모터가 함유된 pSEAP 벡터(Clontech)의 HindIII와 XbaI 사이트에 삽입한 후 HindIII 사이트에 hTERT RNA에 대한 안티센스 시퀀스를 삽입함으로써 수행하였다. 이때, 리보자임을 증폭하기 위한 5' 프라이머에는 P1, P10 헬릭스 및 hTERT RNA의 +21 nt를 인지하는 IGS 시퀀스를 함유하고 있다(5'-GGGGAATTCTAATACGACTCACTATAGGCAGGAAAAGTTATCAGGCA-3', 서열번호 39).
① hTERT RNA에 대해 100 nt 안티센스 함유 벡터;
- hTERT 특이적 리보자임(AS-100 WT) 발현 벡터
- WT의 P6, P8에 앱타머가 부착된 리보자임(AS-100 W-P9 6t, AS-100 WT-P9 8t) 발현 벡터
- 변이 P9의 P6+P8 도메인에 앱타머가 부착된 리보자임(AS-100 Mu-P9 6t8t) 발현 벡터(pSEAP AS100 Mu-P9 6T8T-Luci, 서열번호 5)
- △P9 리보자임에 P6. P8, P6+P8에 앱타머가 부착된 리보자임(AS-100 △P9 6t, AS-100 △P9 8t, AS-100 △P9 6t8t) 발현 벡터
② hTERT RNA에 대해 300 nt 안티센스 함유 벡터
- hTERT 특이적 리보자임(AS-300 WT) 발현 벡터
- WT의 P6+P8에 앱타머가 부착된 리보자임(AS-300 W-P9 6t8t) 발현 벡터(pSEAP AS300 W-P9 6T8T-Luci, 서열번호 6)
- 변이 P9의 P6+P8 도메인에 앱타머가 부착된 리보자임(AS-300 Mu-P9 6t8t) 발현 벡터
- △P9 리보자임에 P6에 앱타머가 부착된 리보자임(AS-300 △P9 6t) 발현 벡터
- △P9 리보자임에 P8에 앱타머가 부착된 리보자임(AS-300 △P9 8t) 발현 벡터(pSEAP AS300 Delta P9 8T-Luci, 서열번호 4)
실시예 4: 리보자임들의 세포 내에서의 화합물 의존성 hTERT RNA의 특이적 치환 기능 관찰
1) 테오필린 의존성 트랜스- 스플라이싱 트랜스진 유도 조건 확립
상기에서 제조한 3' 엑손에 루시퍼라제가 부착된 알로스테릭 리보자임들이 어떠한 세포 내 테오필린 농도 조건 하에서 가장 알로스테릭하게 트랜스진 발현을 유도하는지 그 조건을 우선 수립하였다.
in vitro 상에서의 트랜스-스플라이싱 반응을 통하여 테오필린에 의존적으로 트랜스-스플라이싱 반응을 유도하였던 Mu-P9 6t8t 리보자임 발현벡터를 293 세포에 리포펙타민(Lipofectamine)을 이용하여 transient하게 트랜스펙션하였다. 이때, 트랜스펙션 효율을 측정하고 발현산물 활성을 표준화하기 위해 CMV 프로모 터 하에 레닐라 루시퍼라제(renillar Luciferase)를 발현할 수 있는 벡터를 함께 코트랜스펙션하였다. 트랜스펙션한 후 4시간 후에 새 배지로 갈아주었는데, 이때, 새 배지에는 0.1 mM, 0.3 mM, 0.5 mM, 0.7 mM 및 1 mM의 카페인 또는 테오필린을 첨가하여 과연 어느 농도의 테오필린 하에서 가장 테오필린에 의존적으로 루시퍼라제 활성이 유도되는지 검증하였다. 새 배지로 갈아준지 18시간 후 세포 파쇄물을 얻은 후 레닐라 루시퍼라제(Renillar Luciferase) 활성으로 표준화시킨 반딧불 루시퍼라제 활성을 루미노미터 TD-20/20 (Turner Designs Instrument)를 이용하여 측정하였다. 이때, 측정된 루시퍼라제 활성은 SV40 프로모터 하에서 루시퍼라제를 발현하는 벡터(SV40-Luci)를 트랜스펙션 후 생성되는 루시퍼라제 값에 대한 상대값(%)으로 도 9와 같이 나타내었다.
도 9를 참조하면, 0.7 mM의 테오필린 존재시 0.7 mM 카페인 존재와 비교하여 가장 세포 내에서의 테오필린 특이적 루시퍼라제 활성 유도가 증가됨을 알 수 있었다. 따라서, 다양한 리보자임 발현 벡터에 의한 테오필린 의존성 유전자 발현 유도를 위한 테오필린 농도 조건을 0.7 mM로 고정하여 다음 실험을 수행하였다.
2) 100 nt 안티센스 함유 리보자임 발현 벡터에 의한 테오필린 의존성 트랜스진 발현 유도
hTERT RNA에 대한 100 nt 안티센스 시퀀스를 가지고 있고 테오필린 앱타머가 부착된 리보자임들에 의한 세포 내 트랜스진 활성 유도 여부를 역시 루시퍼라제 분석을 통하여 관찰하였다.
이때, 측정된 루시퍼라제 활성은 PBS를 처리한 세포 파쇄물로부터 관찰되 는 루시퍼라제 값에 대한 상대값(%)으로 도 10과 같이 나타내었다.
도 10을 참조하면, in vitro 데이타와 일치하게 AS-100 Mu-P9 6t8t 리보자임의 경우 가장 테오필린 특이적으로 루시퍼라제 활성의 유도를 증진시킴을 알 수 있었다. 그러나, in vitro 데이타와는 상이하게 AS-100 △P9 6t 리보자임 보다는 AS-100 △P9 8t 리보자임 경우가 더 테오필린 특이적으로 트랜스진의 발현을 유도할 수 있을 알았다. 이러한 결과는 IGS 앞에 안티센스 시퀀스가 100 nt 더 부가됨으로써 형성될 수 있는 리보자임 구조적 변이 그리고 세포 내에서의 환경이 in vitro 상에서의 환경과 반드시 일치하지 않기 때문인 것이라고 사료된다. 반면에 WT, W-P9 6t, W-P9 8t 및 △P9, △P9 6t8t 리보자임 경우들은 테오필린 특이적으로 세포 내에서의 트랜스진 활성을 유도한다고는 볼 수 없었다.
3) hTERT -음성 세포에서의 알로스테릭 리보자임 활성
상기 결과로부터 세포 내에서 테오필린 의존적으로 알로스테릭하게 트랜스진 활성을 유도할 수 있는 것으로 관찰된 AS-100 Mu-P9 6t8t 리보자임과 세포 내에서는 알로스테릭 효과를 보지 못한 AS-100 △P9 6t 리보자임들이 과연 hTERT 표적 RNA 특이적으로 트랜스진 활성을 유도하는지 알아보기 위하여 hTERT 음성 세포인 SK-Lu-1 세포에 각 리보자임 벡터들을 DMRIE-C를 이용하여 transient하게 트랜스펙션 후 4시간 후 테오필린이 들어있는 배지로 교체해 주었다. 새 배지로 교체한지 18시간 후 세포 파쇄물을 얻은 후 루시퍼라제 활성을 측정하여 SV40-Luci 벡터에 의한 루시퍼라제 발현 값과의 상대값을 도 11과 같이 측정하였다.
도 11을 참조하면, AS-100 WT 리보자임과 마찬가지로 AS-100 Mu-P9 6t8t 및 AS-100 △P9 6t 리보자임 모두 표적 RNA가 존재하지 않는다면 테오필린 존재와 상관없이 트랜스진 발현 유도가 억제됨을 알 수 있었다. 즉, 테오필린 의존성 알로스테릭 트랜스-스플라이싱 리보자임은 타겟 RNA 특이적으로 트랜스진 발현을 유도할 수 있음을 알 수 있었다.
4) 300 nt 안티센스 함유 리보자임 발현 벡터에 의한 테오필린 의존성 트랜스진 발현 유도
안티센스 시퀀스의 길이를 증가시킴으로써 트랜스-스플라이싱 리보자임의 알로스테릭 트랜스진 발현 유도 효과가 더 증진될 수 있는지 관찰하기 위하여 hTERT RNA에 대하여 300 nt의 안티센스 시퀀스를 함유한 리보자임 벡터들을 제조 후 세포 내에서의 테오필린 의존적 루시퍼라제 활성 유도를 비교 관찰하였다.
본 실험을 위한 테오필린 의존성 대조군으로서 AS-300 WT 리보자임을 이용하였으며 in vitro에서 테오필린에 의존적으로 트랜스-스플라이싱 반응을 유발하였고 AS-100 시퀀스를 함유 시 세포 내에서 테오필린 의존적 트랜스진 활성을 유도하였던 Mu-P9 6t8t 기본골격에 300 nt 안티센스를 함유한 리보자임(AS-300 Mu-P9 6t8t), in vitro 상에서 테오필린에 의존적으로 트랜스-스플라이싱 반응을 유발하였던 △P9 6t 기본골격에 300 nt 안티센스를 함유한 리보자임(AS-300 △P9 6t), AS-100 시퀀스를 함유 시 세포 내에서 테오필린 의존적 트랜스진 활성을 유도하였던 △P9 8t 기본골격에 300 nt 안티센스를 함유한 리보자임(AS-300 △P9 8t), 그리고 확장된 IGS 함유 시(P1+P10 헬릭스) in vitro 상에서 테오필린에 의존적으로 트랜스- 스플라이싱 반응을 유발하였던 W-P9 6t8t 기본골격에 300 nt 안티센스를 함 유한 리보자임(AS-300 W-P9 6t8t) 발현벡터들을 각각 hTERT 양성 세포인 293 세포에 코트랜스펙션 후 루시퍼라제 활성을 측정, 테오필린 의존적 유전자 활성 유도 여부를 상호 비교, 관찰하였다. 이때, 측정된 루시퍼라제 활성은 SV40 프로모터 하에서 반딧불 루시퍼라제를 발현하는 벡터(SV40-Luci)를 트랜스펙션 후 생성되는 루시퍼라제 값에 대한 상대값(%)으로 도 12와 같이 나타내었다.
도 12를 참조하면, 예상과 같이 AS-300 WT 리보자임은 테오필린 존재 여부와 상관없이 루시퍼라제 발현을 효과적으로 유도하였다. 안티센스 시퀀스 300 nt를 부착한 리보자임 중 AS-300 Mu-P9 6t8t와 AS-300 △P9 6t 리보자임의 경우 역시 테오필린 의존적 트랜스진 활성 유도를 관찰할 수는 없었다. 반면에 AS-300 W-P9 6t8t와 AS-300 △P9 8t의 경우는 테오필린 의존적으로 효과적인 루시퍼라제 활성 유도를 관찰할 수 있었으며 리보자임의 IGS 앞 부위에 안티센스 시퀀스 100 nt를 삽입하는 경우보다 안티센스 시퀀스 300 nt를 삽입한 경우가 더욱 트랜스진 발현 유도를 증가시킬 수 있음을 관찰할 수 있었다.
5) 알로스테릭 리보자임에 의한 세포 내 트랜스- 스플라이싱 반응
상기 실험을 통하여 세포 내에서 테오필린에 의존적으로 트랜스진의 활성을 유도, 증진시킬 수 있는 리보자임 구조체를 탐색하였다. 이러한 테오필린 의존성 트랜스진 유도가 과연 세포 내 트랜스-스플라이싱 반응의 알로스테릭 효과에 의하여 유발되는지 검증하기 위하여 테오필린 앱타머가 부착된 리보자임 발현 벡터들을 293 세포에 transient하게 트랜스펙션 후 세포 내 트랜스-스플라이싱 반응 산물의 존재 여부를 관찰하였다.
GAPDH RNA 발현도를 관찰하여 내부 대조군으로 이용하였다. RT-PCR 산물을 아가로스 겔로 분석한 결과는 도 13에 나타내었다.
도 13을 참조하면, 예상과 같이 양성 대조군인 WT 리보자임(AS-300 WT)의 경우 hTERT 특이적 트랜스-스플라이싱 반응물을 얻을 수 있었다(lane 3). 테오필린 앱타머 부착 리보자임의 경우 루시퍼라제 활성 유도 결과와 일치하게 AS-300 Mu-P9 6t8t 리보자임 벡터의 경우에는 테오필린, 카페인, PBS 존재 시 배지에 구분 없이 모두 트랜스-스플라이싱 산물이 생성된 반면(lane 7-9), AS-300 W-P9 6t8t 리보자임 벡터의 경우 루시퍼라제 활성 유도 결과와 일치하게 테오필린을 처리한 세포의 경우에만 311 bp의 트랜스-스플라이싱 product가 생성됨을(lane 4) 관찰할 수 있었다. 이러한 결과는 AS-300 W-P9 6t8t 리보자임의 in vitro 트랜스-스플라이싱 결과와 상이하나 이는 in vitro와 세포 내에서의 환경적 상이함에 의할 것으로 사료된다. 이러한 트랜스-스플라이싱 product가 RNA 추출과정 중에 유발되는 in vitro 트랜스-스플라이싱 반응이 아니라 세포 내에서의 트랜스-스플라이싱 반응의 결과임을 검증하기 위하여 293 세포와 AS-300 W-P9 6t8t 리보자임 벡터를 트랜스펙션시킨 SK-Lu-1 세포(hTERT negative)을 혼합한 후 RNA를 추출한 후 RT-PCR reaction을 수행하였다. 그 결과, 도 13에서와 같이 어떠한 트랜스-스플라이싱 산물이 발견되지 않는 것으로 보아(lane 10) 테오필린 존재 시 AS-300 W-P9 6t8t 리보자임이 트랜스펙션된 293 세포에서만 측정된 트랜스-스플라이싱 산물은 세포에서의 테오필린 의존적이며 표적 RNA 특이적인 트랜스-스플라이싱 반응에 의한 것임을 알 수 있었다.
상기 결과들을 종합한 결과, hTERT RNA를 발현하는 세포 특이적으로 테오필 린에 의존적으로 트랜스진 발현을 조절할 수 있는, 즉 테오필린에 의존적으로 세포 내에서 인위적으로 RNA 치환 반응을 조절할 수 있는 알로스테릭 리보자임 후보로서 AS-300 W-P9 6t8t와 AS-300 △P9 8t 등을 개발하였다. 첨가로 in vitro 상에서 효율적인 알로스테릭 리보자임으로서 IGS W-P9 6t8t를 발굴하였다.
실시예 5: 아데노바이러스성 벡터에 의한 hTERT 발현 암세포 특이적인 세포사 조절 기능 관찰
1) HT-29 세포( hTERT +)에서의 테오필린 의존성 세포사 유도
개발한 알로스테릭 리보자임의 3‘ 엑손에 세포사 유전자인 HSV 티미딘 키나제 유전자를 삽입(AS300 W-P9 6T8T-TK)하여 CMV 프로모터 하에서 리보자임을 포유류 세포에서 발현할 수 있는 벡터(pAvQ-Theo-Rib21AS-TK, 서열번호 8)를 제작한 후 재조합 아데노바이러스성 벡터를 제작하였다(도 14).
상기 pAvQ-Theo-Rib21AS-TK를 한국미생물보존센터에 2008년 3월 21일자로 기탁하여 기탁번호 KCCM10935P를 부여받았다.
HSVtk를 3‘엑손으로 갖고 있고 테오필린 의존성 알로스테릭 리보자임을 발현하는 아데노바이러스성 벡터(Ad-TheoRib-TK)가 과연 표적 특이적으로 그리고 테오필린 의존적으로 트랜스진 발현을 유도하는지 관찰하기 위하여 바이러스 처리 후 GCV와 조절 화합물을 처리 후 MTT 분석을 통하여 대장암 세포인 HT-29 세포의 세포 생존율을 관찰하였다. 이때, 양성 대조군으로 Ad-TK(CMV promoter 하에 HSVtk를 발현하는 adenoviral vector)를 이용하였으며, hTERT+ 세포에서의 양성대조군으로 서 Ad-Rib-TK(hTERT 특이적이며 HSVtk가 태깅되어 있는 adenoviral vector)를 이용하였다. 음성 대조군으로는 Ad-LacZ(CMV promoter 하에 LacZ를 발현하는 adenoviral vector)를 이용하였다. Ad-TheoRib-TK를 처리한 경우 테오필린 혹은 카페인을 처리한 후의 생존율을 상호 비교하고, 그 결과를 도 15에 나타내었다.
도 15를 참조하면, Ad-TK 및 Ad-Rib-TK의 경우 GCV 농도가 증가되면서 그리고 아데노바이러스 농도가 증가되면서 세포 생존율이 감소되지만 화학물질 농도에는 영향을 받지 않는 것이 관찰되었다. 반면에 Ad-LacZ의 경우는 어떤 경우에서도 세포 생존율에 영향을 끼치지 않았다. 주목할 점은 알로스테릭 리보자임인 Ad-TheoRib-TK를 감염시킨 경우 카페인 처리에 의해서는 세포 생존율이 GCV, 바이러스, 화학물질 농도를 증가시켜도 세포 생존율에 영향을 끼치지 않았으나 테오필린을 처리한 경우에는 양성 대조군과 같이 바이러스 농도 및 GCV 농도에 비례하게 세포 생존율이 감소되었다. 또한, 테오필린 농도가 증가되면 그에 따라 세포 생존율도 같이 감소됨이 관찰되었다. 이는 Ad-TheoRib-TK는 테오필린에 의해 그 활성이 알로스테릭하게 조절됨으로써 테오필린을 처리해야지만 트랜스진 발현이 유도됨으로써 암세포의 세포사가 유발되었음을 시사한다. 가장 알로스테릭하게 유전자 발현이 유도되는 조건은 100 moi 아데노바이러스, 100 μM 테오필린, 10 μM GCV 처리한 경우이다.
2) HepG2 세포( hTERT +)에서의 테오필린 의존성 세포사 유도
Ad-TheoRib-TK가 과연 표적 특이적으로 그리고 테오필린 의존적으로 트랜스진 발현을 유도하는지 관찰하기 위하여 바이러스 처리 후 GCV와 조절 화합물을 처 리 후 MTT 분석을 통하여 간암 세포인 HepG2 세포에서의 세포 생존율도 관찰하였다. 이때, 양성 대조군으로 Ad-TK를 이용하였으며 hTERT+ 세포에서의 양성 대조군으로서 Ad-Rib-TK를 이용하였다. 음성 대조군으로는 Ad-LacZ 를 이용하였다. Ad-TheoRib-TK를 처리한 경우 테오필린 혹은 카페인을 처리한 후의 생존율을 상호 비교하고, 그 결과를 도 16에 나타내었다.
도 16을 참조하면, HT-29 세포에서와 같이 Ad-TK 및 Ad-Rib-TK의 경우 GCV 농도가 증가되면서 그리고 아데노바이러스 농도가 증가되면서 세포 생존율이 감소되지만 화학물질 농도에는 영향을 받지 않는 것이 관찰되었다. 반면에 Ad-LacZ의 경우는 어떤 경우에서도 세포 생존율에 영향을 끼치지 않았다. 주목할 점은 알로스테릭 리보자임인 Ad-TheoRib-TK를 감염시킨 경우 카페인 처리에 의해서는 세포 생존율이 GCV, 바이러스, 화학물질 농도를 증가시켜도 세포 생존율에 영향을 끼치지 않았으나 테오필린을 처리한 경우에는 양성 대조군과 같이 바이러스 농도 및 GCV 농도에 비례하게 세포 생존율이 감소되었다. 또한, 테오필린 농도가 증가되면 그에 따라 세포 생존율도 같이 감소됨이 관찰되었다. 이는 hTERT+인 HT-29 이외에도 HepG2 세포에서도 Ad-TheoRib-TK는 테오필린에 의해 그 활성이 알로스테릭하게 조절됨으로써 테오필린을 처리해야지만 트랜스진 발현이 유도됨으로써 암세포의 세포사가 유발되었음을 시사한다. 가장 알로스테릭하게 유전자 발현이 유도되는 조건은 10 moi 아데노바이러스, 10 μM 테오필린, 10 μM GCV 처리한 경우이다.
3) Capan -1 세포( hTERT +)에서의 테오필린 의존성 세포사 유도
Ad-TheoRib-TK가 과연 표적 특이적으로 그리고 테오필린 의존적으로 트랜스 진 발현을 유도하는지 관찰하기 위하여 바이러스 처리 후 GCV와 조절 화합물을 처리 후 MTT 분석을 통하여 췌장암 세포인 Capan-1 세포에서의 세포 생존율도 관찰하고, 그 결과를 도 17에 나타내었다.
도 17을 참조하면, HT-29, HepG2 세포에서와 같이 Ad-TK 및 Ad-Rib-TK의 경우 GCV 농도가 증가되면서 그리고 아데노바이러스 농도가 증가되면서 세포 생존율이 감소되지만 화학물질 농도에는 영향을 받지 않는 것이 관찰되었다. 반면에, Ad-LacZ의 경우는 어떤 경우에서도 세포 생존율에 영향을 끼치지 않았다. 주목할 점은 알로스테릭 리보자임인 Ad-TheoRib-TK를 감염시킨 경우 카페인 처리에 의해서는 세포 생존율이 GCV, 바이러스, 화학물질 농도를 증가시켜도 세포 생존율에 영향을 끼치지 않았으나 테오필린을 처리한 경우에는 양성 대조군과 같이 바이러스 농도 및 GCV 농도에 비례하게 세포 생존율이 감소되었다. 또한, 테오필린 농도가 증가되면 그에 따라 세포 생존율도 같이 감소됨이 관찰되었다. 이는 hTERT+인 HT-29, HepG2 이외에도 Capan-1 세포에서도 Ad-TheoRib-TK는 테오필린에 의해 그 활성이 알로스테릭하게 조절됨으로써 테오필린을 처리해야지만 트랜스진 발현이 유도됨으로써 암세포의 세포사가 유발되었음을 시사한다. 가장 알로스테릭하게 유전자 발현이 유도되는 조건은 100 moi 아데노바이러스, 500 μM 테오필린, 50 μM GCV 처리한 경우이다.
4) IMR90 세포 ( hTERT -)에서의 테오필린 의존성 세포사 유도 관찰
hTERT+ 세포에서 Ad-TheoRib-TK 활성이 테오필린 의존적으로 조절되는 것이 표적 특이적인지 관찰하기 위하여 hTERT-인 IMR90 세포에서의 바이러스 감염 후의 세포 생존율을 관찰하고, 그 결과를 도 18에 나타내었다.
도 18을 참조하면, Ad-TK의 경우 바이러스, GCV 농도에 비례하게 세포 생존율이 감소되었고 이러한 현상이 화학물질 농도와는 무관함을 관찰하였다. 그러나, 리보자임을 발현하는 Ad-Rib-TK 및 알로스테릭한 Ad-TheoRib-TK의 경우는 바이러스, GCV, 화학물질 농도와 상관없이 그 농도를 증가시켜도 세포 생존율에는 영향을 끼칠 수 없었다. 이는 Ad-TheoRib-TK의 경우 외부 화합물에 의해 그 활성을 인위적으로 조절할 수 있을 뿐만 아니라 매우 표적 특이적으로 트랜스진을 유발할 수 있음을 시사한다.
실시예 6: 알로스테릭 리보자임 발현 아데노바이러스성 벡터에 의한 테오필린 의존성 세포 내 트랜스- 스플라이싱 반응 조절
테오필린 의존성 트랜스진 유도가 과연 세포 내 트랜스-스플라이싱 반응의 알로스테릭 효과에 의하여 유발되는지 검증하기 위하여 테오필린 앱타머가 부착된 리보자임 발현 아데노바이러스성 벡터(100 moi)를 HT-29 세포에 감염 후 상기실험에서 구축한 알로스테릭 조건인 0.1 mM 테오필린 또는 비대상 화합믈인 카페인을 같은 농도로 처리한 후에 세포 내 트랜스-스플라이싱 반응 산물의 존재 여부를 관찰하였다. GAPDH RNA 발현도를 관찰하여 내부 대조군으로 이용하였다. RT-PCR 산물을 아가로스 겔로 분석하고, 그 결과를 도 19에 나타내었다(도 19).
도 19를 참조하면, 예상과 같이 음성 대조군인 Ad-LacZ의 경우 저분자 화합물 처리와 상관없이 어떠한 트랜스-스플라이싱 산물 생성이 관찰되질 못하였다. 반면에 Ad-TheoRib-TK(Ad-Theo-Rib2AS-TK)를 hTERT 발현 암세포인 HT-29 세포에 도입 후 카페인 처리 시에는 트랜스-스플라이싱 산물이 거의 형성되질 못하였으나 MTT 분석에서 관찰된 것과 같이 0.1 mM 테오필린 처리시 429 nt의 예상된 트랜스-스플라이싱 산물이 형성되었다. 이러한 트랜스-스플라이싱 산물을 클로닝하고 시퀀싱한 결과 예상과 같이 hTERT의 +21 부위가 스플라이싱된 산물임을 관찰하였다. 반면에 이러한 트랜스-스플라이싱 산물은 같은 조건 하에서 hTERT를 발현 못하는 IMR90 세포에선 형성되질 못하였으며, 이는 곧 본 리보자임이 표적 RNA가 존재 시에만 트랜스-스플라이싱 기능을 할 수 있음을 확인해 주는 결과이다. 이러한 테오필린 의존적 트랜스-스플라이싱 산물이 RNA 추출과정 중에 유발되는 in vitro 트랜스-스플라이싱 반응이 아니라 세포 내에서의 트랜스-스플라이싱 반응의 결과임을 검증하기 위하여 mock 트랜스펙션한 HT-29 세포와 Ad-TheoRib-TK를 도입 후 테오필린을 처리한 IMR90 세포(hTERT negative)를 혼합한 후 RNA를 추출하여 RT-PCR 반응을 수행하였다(mix). 그 결과, 예상된 트랜스-스플라이싱 산물이 발견되지 않는 것으로 보아 테오필린 존재 시 Ad-TheoRib-TK가 도입된 HT-29 세포에서만 측정된 트랜스-스플라이싱 산물 및 세포사는 세포 내에서의 테오필린 의존적이며 표적 RNA 특이적인 트랜스-스플라이싱 반응에 의한 것임을 알 수 있었다.
HT-29 세포에서의 트랜스-스플라이싱 반응 산물의 양을 상대적으로 비교하고자 RT 후 실시간 PCR을 수행하였다. GAPDH의 PCR 산물의 양을 이용하여 보정한 뒤 그래프로 나타내었다(도 20).
도 20을 참조하면, 음성 대조군인 Ad-LacZ의 경우 저분자 화합물 처리와 상 관없이 어떠한 T/S 산물 생성이 관찰되질 못하였다. 반면에, Ad-TheoRib-TK를 세포에 도입 후 PBS를 처리한 경우 T/S 산물이 거의 생성되질 않았으며 카페인을 처리한 경우 PBS 처리한 경우보다 반응 산물이 약간 증가되었으나 테오필린 처리에 비해 78% 그 생성물이 현격히 감소되었다. 반면에, Ad-TheoRib-TK를 세포에 도입 후 테오필린을 처리한 경우에는 Ad-Rib-TK에 의해 형성되는 트랜스-스플라이싱 산물에 육박하게 효과적으로 트랜스-스플라이싱 반응이 유발되었다. 이러한 결과는 알로스테릭 리보자임에 의해 유발된 테오필린 의존적 표적 특이적인 세포사 유도는 테오필린에 의한 표적 특이적인 트랜스-스플라이싱 반응의 활성화에 기인함을 시사한다.
본 발명을 통해 테오필린에 의해 그 활성을 조절할 수 있는 트랜스-스플라이싱 리보자임을 모델 시스템으로 구축함으로써 질환 특이 RNA를 표적하여 유전자 발현을 유도할 수 있는 매우 특이적인 유전자 치료기술인 트랜스-스플라이싱 리보자임과 외부 인자에 의해 유전자 발현을 조절할 수 있는 가역적 유전자 기술의 결합하는데 있어 실험적 토대를 제공할 것이다. 이는 다양한 난치성 질환에 사용될 수 있는 범용적 유전자 치료제로의 활용이 가능할 것이며, 또한 진단제 개발이나 리보자임의 활성 기전 연구를 위한 도구로서의 활용도 가능할 것이다.
도 1은 알로스테릭 트랜스-스플라이싱 리보자임에 의한 RNA로의 치환 조절에 관한 모식도이다.
도 2는 hTERT 타겟팅 T/S 리보자임을 나타낸 것이다.
도 3은 테오필린 의존성 알로스테릭 T/S 리보자임을 나타낸 것이다.
도 4는 WT P9와 Mu-P9의 3' 말단 시퀀스를 나타낸 것이다.
도 5는 in vitro에서 트랜스-스플라이싱 반응을 나타낸 것이다.
도 6은 in vitro에서 트랜스-스플라이싱 반응 산물의 실시간 PCR 분석을 나타낸 것이다.
도 7은 in vitro에서 확장된 IGS를 가진 T/S 리보자임에 의한 트랜스-스플라이싱 반응을 나타낸 것이다.
도 8은 in vitro에서 알로스테릭 트랜스-스플라이싱 리보자임에 의한 트랜스-스플라이싱 반응의 적합성을 나타낸 것이다.
도 9는 알로스테릭 트랜스-스플라이싱 리보자임에 의한 테오필린 의존성 트랜스진(transgene) 유도를 나타낸 것이다.
도 10은 표적 RNA에 대한 100 nt 안티센스 서열을 포함하는 알로스테릭 트랜스-스플라이싱 리보자임에 의한 테오필린 의존성 트랜스진 유도를 나타낸 것이다.
도 11은 hTERT - 세포에서 알로스테릭 트랜스-스플라이싱 리보자임에 의한 트랜스진 억제를 나타낸 것이다.
도 12는 표적 RNA에 대한 300 nt 안티센스 서열을 포함하는 알로스테릭 트랜 스-스플라이싱 리보자임에 의한 테오필린 의존성 트랜스진 유도를 나타낸 것이다.
도 13은 세포에서 알로스테릭 리보자임에 의한 테오필린 의존성 트랜스-스플라이싱 반응을 나타낸 것이다.
도 14는 테오필린 의존성 트랜스-스플라이싱 리보자임을 인코딩하는 발현벡터 pAvQ-Theo-Rib21AS-TK와 아데노바이러스 벡터(Ad-TheoRib-TK, Ad-Theo-CRT)의 기본 구조이다.
도 15는 알로스테릭 트랜스-스플라이싱 리보자임에 의한 hTERT+ HT-29 세포에서의 테오필린 의존성 세포 소퇴를 나타낸 것이다.
도 16은 알로스테릭 트랜스-스플라이싱 리보자임에 의한 hTERT+ HepG2 세포에서의 테오필린 의존성 세포 소퇴를 나타낸 것이다.
도 17은 알로스테릭 트랜스-스플라이싱 리보자임에 의한 hTERT+ Capan-1 세포에서의 테오필린 의존성 세포 소퇴를 나타낸 것이다.
도 18은 알로스테릭 트랜스-스플라이싱 리보자임에 의한 hTERT- IMR90 세포에서의 세포 소퇴가 나타나지 않음을 확인한 것이다.
도 19는 알로스테릭 트랜스-스플라이싱 리보자임에 의한 HT-29 세포의 트랜스-스플라이싱 반응을 나타낸 것이다.
도 20은 알로스테릭 트랜스-스플라이싱 리보자임에 의한 HT-29 세포의 트랜스-스플라이싱 반응을 실시간 PCR 분석으로 나타낸 것이다.
<110> Industry-Academic Cooperation Foundation, Dankook University <120> Allosteric trans-splicing group I ribozyme whose activity of target-specific RNA replacement is controlled by theophylline <160> 39 <170> KopatentIn 1.71 <210> 1 <211> 2347 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> allosteric trans splicing group I ribozyme AS300 Delta P9 8T <400> 1 aaggccagca cguucuucgc gccgcgcucg cacagccucu gcagcacucg ggccaccagc 60 uccuucaggc aggacaccug gcggaaggag ggggcggcgg ggggcggccg ugcgucccag 120 ggcacgcaca ccaggcacug ggccaccagc gcgcggaaag ccgccggguc cccgcgcugc 180 accagccgcc agcccugggg ccccaggcgc cgcacgaacg uggccagcgg cagcaccucg 240 cgguaguggc ugcgcagcag ggagcgcacg gcuaggcagc ggggagcgcg cggcaucgcg 300 gggguggccg gggccagggc uucccaagcu ucguuuugcg gcaggaaaag uuaucaggca 360 ugcaccuggu agcuagucuu uaaaccaaua gauugcaucg guuuaaaagg caagaccguc 420 aaauugcggg aaagggguca acagccguuc aguaccaagu cucaggggaa acuuugagau 480 ggccuugcaa aggguauggu aauaagcuga cggacauggu ccuaaccacg cagccaaguc 540 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cgcggaggag uuguguuugu ggacgaagua ccgaaagguc uuaccggaaa 2280 acucgacgca agaaaaauca gagagauccu cauaaaggcc aagaagggcg gaaaguccaa 2340 auuguaa 2347 <210> 2 <211> 2360 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> allosteric trans-splicing group I ribozyme AS100 Mu-P9 6T8T <400> 2 aaggccagca cguucuucgc gccgcgcucg cacagccucu gcagcacucg ggccaccagc 60 uccuucaggc aggacaccug gcggaaggag ggggcggcgg ggggcggccg ugcgucccag 120 ggcacgcaca ccaggcacug ggccaccagc gcgcggaaag ccgccggguc cccgcgcugc 180 accagccgcc agcccugggg ccccaggcgc cgcacgaacg uggccagcgg cagcaccucg 240 cgguaguggc ugcgcagcag ggagcgcacg gcuaggcagc ggggagcgcg cggcaucgcg 300 gggguggccg gggccagggc uucccaagcu ucguuuugcg gcaggaaaag uuaucaggca 360 ugcaccuggu agcuagucuu uaaaccaaua gauugcaucg guuuaaaagg caagaccguc 420 aaauugcggg aaagggguca acagccguuc aguaccaagu cucaggggaa acuuugagau 480 ggccuugcaa aggguauggu aauaagcuga cggacauggu ccuaaccacg cagccaaguc 540 cuaagggaug auaccagccg aaaggcccuu ggcagcaauu auggaugcag uucacagacu 600 aaaugucggu cggggaugau accagccgaa aggcccuugg cagcaaucau aagauauagu 660 cggaccucuc ccgaaaggga guuggaguac ucgcgaaaac gcccaccaug gaagacgcca 720 aaaacauaaa gaaaggcccg gcgccauucu auccucuaga ggauggaacc gcuggagagc 780 aacugcauaa ggcuaugaag agauacgccc ugguuccugg aacaauugcu uuuacagaug 840 cacauaucga ggugaacauc acguacgcgg aauacuucga aauguccguu cgguuggcag 900 aagcuaugaa acgauauggg cugaauacaa aucacagaau cgucguaugc agugaaaacu 960 cucuucaauu cuuuaugccg guguugggcg cguuauuuau cggaguugca guugcgcccg 1020 cgaacgacau uuauaaugaa cgugaauugc ucaacaguau gaacauuucg cagccuaccg 1080 uaguguuugu uuccaaaaag ggguugcaaa aaauuuugaa cgugcaaaaa aaauuaccaa 1140 uaauccagaa aauuauuauc auggauucua aaacggauua ccagggauuu cagucgaugu 1200 acacguucgu cacaucucau cuaccucccg guuuuaauga auacgauuuu guaccagagu 1260 ccuuugaucg ugacaaaaca auugcacuga uaaugaauuc cucuggaucu acuggguuac 1320 cuaagggugu ggcccuuccg cauagaacug ccugcgucag auucucgcau gccagagauc 1380 cuauuuuugg caaucaaauc auuccggaua cugcgauuuu aaguguuguu ccauuccauc 1440 acgguuuugg aauguuuacu acacucggau auuugauaug uggauuucga gucgucuuaa 1500 uguauagauu ugaagaagag cuguuuuuac gaucccuuca ggauuacaaa auucaaagug 1560 cguugcuagu accaacccua uuuucauucu ucgccaaaag cacucugauu gacaaauacg 1620 auuuaucuaa uuuacacgaa auugcuucug ggggcgcacc ucuuucgaaa gaagucgggg 1680 aagcgguugc aaaacgcuuc caucuuccag ggauacgaca aggauauggg cucacugaga 1740 cuacaucagc uauucugauu acacccgagg gggaugauaa accgggcgcg gucgguaaag 1800 uuguuccauu uuuugaagcg aagguugugg aucuggauac cgggaaaacg cugggcguua 1860 aucagagagg cgaauuaugu gucagaggac cuaugauuau guccgguuau guaaacaauc 1920 cggaagcgac caacgccuug auugacaagg auggauggcu acauucugga gacauagcuu 1980 acugggacga agacgaacac uucuucauag uugaccgcuu gaagucuuua auuaaauaca 2040 aaggauauca gguggccccc gcugaauugg aaucgauauu guuacaacac cccaacaucu 2100 ucgacgcggg cguggcaggu cuucccgacg augacgccgg ugaacuuccc gccgccguug 2160 uuguuuugga gcacggaaag acgaugacgg aaaaagagau cguggauuac guggccaguc 2220 aaguaacaac cgcgaaaaag uugcgcggag gaguuguguu uguggacgaa guaccgaaag 2280 gucuuaccgg aaaacucgac gcaagaaaaa ucagagagau ccucauaaag gccaagaagg 2340 gcggaaaguc caaauuguaa 2360 <210> 3 <211> 2437 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> allosteric trans-splicing group I ribozyme AS300 W-P9 6T8T <400> 3 aagccgaagg ccagcacguu cuucgcgccg cgcucgcaca gccucugcag cacucgggcc 60 accagcuccu ucaggcagga caccuggcgg aaggaggggg cggcgggggg cggccgugcg 120 ucccagggca cgcacaccag gcacugggcc accagcgcgc ggaaagccgc cggguccccg 180 cgcugcacca gccgccagcc cuggggcccc aggcgccgca cgaacguggc cagcggcagc 240 accucgcggu aguggcugcg cagcagggag cgcacggcua ggcagcgggg agcgcgcggc 300 aucgcggggg uggccggggc cagggcuucc caagcuucgu uuugcggcag gaaaaguuau 360 caggcaugca ccugguagcu agucuuuaaa ccaauagauu gcaucgguuu aaaaggcaag 420 accgucaaau ugcgggaaag gggucaacag ccguucagua ccaagucuca ggggaaacuu 480 ugagauggcc uugcaaaggg uaugguaaua agcugacgga caugguccua accacgcagc 540 caaguccuaa gggaugauac cagccgaaag gcccuuggca gcaauuaugg augcaguuca 600 cagacuaaau gucggucggg gaugauacca gccgaaaggc ccuuggcagc aaucauaaga 660 uauagucgga ccucuccuua augggagcua 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cagccaagtc ctaagggatg ataccagccg aaaggccctt ggcagcaatt atggatgcag 840 ttcacagact aaatgtcggt cggggatgat accagccgaa aggcccttgg cagcaatcat 900 aagatatagt cggacctctc ccgaaaggga gttggagtac tcgcgaaaac gcccaccatg 960 gaagacgcca aaaacataaa gaaaggcccg gcgccattct atcctctaga ggatggaacc 1020 gctggagagc aactgcataa ggctatgaag agatacgccc tggttcctgg aacaattgct 1080 tttacagatg cacatatcga ggtgaacatc acgtacgcgg aatacttcga aatgtccgtt 1140 cggttggcag aagctatgaa acgatatggg ctgaatacaa atcacagaat cgtcgtatgc 1200 agtgaaaact ctcttcaatt ctttatgccg gtgttgggcg cgttatttat cggagttgca 1260 gttgcgcccg cgaacgacat ttataatgaa cgtgaattgc tcaacagtat gaacatttcg 1320 cagcctaccg tagtgtttgt ttccaaaaag gggttgcaaa aaattttgaa cgtgcaaaaa 1380 aaattaccaa taatccagaa aattattatc atggattcta aaacggatta ccagggattt 1440 cagtcgatgt acacgttcgt cacatctcat ctacctcccg gttttaatga atacgatttt 1500 gtaccagagt cctttgatcg tgacaaaaca attgcactga taatgaattc ctctggatct 1560 actgggttac ctaagggtgt ggcccttccg catagaactg cctgcgtcag attctcgcat 1620 gccagagatc ctatttttgg caatcaaatc attccggata ctgcgatttt aagtgttgtt 1680 ccattccatc acggttttgg aatgtttact acactcggat atttgatatg tggatttcga 1740 gtcgtcttaa tgtatagatt tgaagaagag ctgtttttac gatcccttca ggattacaaa 1800 attcaaagtg cgttgctagt accaacccta ttttcattct tcgccaaaag cactctgatt 1860 gacaaatacg atttatctaa tttacacgaa attgcttctg ggggcgcacc tctttcgaaa 1920 gaagtcgggg aagcggttgc aaaacgcttc catcttccag ggatacgaca aggatatggg 1980 ctcactgaga ctacatcagc tattctgatt acacccgagg gggatgataa accgggcgcg 2040 gtcggtaaag ttgttccatt ttttgaagcg aaggttgtgg atctggatac cgggaaaacg 2100 ctgggcgtta atcagagagg cgaattatgt gtcagaggac ctatgattat gtccggttat 2160 gtaaacaatc cggaagcgac caacgccttg attgacaagg atggatggct acattctgga 2220 gacatagctt actgggacga agacgaacac ttcttcatag ttgaccgctt gaagtcttta 2280 attaaataca aaggatatca ggtggccccc gctgaattgg aatcgatatt gttacaacac 2340 cccaacatct tcgacgcggg cgtggcaggt cttcccgacg atgacgccgg tgaacttccc 2400 gccgccgttg ttgttttgga gcacggaaag acgatgacgg aaaaagagat cgtggattac 2460 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gccgaaaggc ccttggcagc 900 aatcataaga tatagtcgga cctctcctta atgggagcta gcggatgaag tgatgcaaca 960 ctggagccgc tgggaactaa tttgtatgcg aaagtatatt gattagtttt ggagtactcg 1020 cgaaaacgcc caccatggaa gacgccaaaa acataaagaa aggcccggcg ccattctatc 1080 ctctagagga tggaaccgct ggagagcaac tgcataaggc tatgaagaga tacgccctgg 1140 ttcctggaac aattgctttt acagatgcac atatcgaggt gaacatcacg tacgcggaat 1200 acttcgaaat gtccgttcgg ttggcagaag ctatgaaacg atatgggctg aatacaaatc 1260 acagaatcgt cgtatgcagt gaaaactctc ttcaattctt tatgccggtg ttgggcgcgt 1320 tatttatcgg agttgcagtt gcgcccgcga acgacattta taatgaacgt gaattgctca 1380 acagtatgaa catttcgcag cctaccgtag tgtttgtttc caaaaagggg ttgcaaaaaa 1440 ttttgaacgt gcaaaaaaaa ttaccaataa tccagaaaat tattatcatg gattctaaaa 1500 cggattacca gggatttcag tcgatgtaca cgttcgtcac atctcatcta cctcccggtt 1560 ttaatgaata cgattttgta ccagagtcct ttgatcgtga caaaacaatt gcactgataa 1620 tgaattcctc tggatctact gggttaccta agggtgtggc ccttccgcat agaactgcct 1680 gcgtcagatt ctcgcatgcc agagatccta tttttggcaa tcaaatcatt ccggatactg 1740 cgattttaag tgttgttcca ttccatcacg gttttggaat gtttactaca ctcggatatt 1800 tgatatgtgg atttcgagtc gtcttaatgt atagatttga agaagagctg tttttacgat 1860 cccttcagga ttacaaaatt caaagtgcgt tgctagtacc aaccctattt tcattcttcg 1920 ccaaaagcac tctgattgac aaatacgatt tatctaattt acacgaaatt gcttctgggg 1980 gcgcacctct ttcgaaagaa gtcggggaag cggttgcaaa acgcttccat cttccaggga 2040 tacgacaagg atatgggctc actgagacta catcagctat tctgattaca cccgaggggg 2100 atgataaacc gggcgcggtc ggtaaagttg ttccattttt tgaagcgaag gttgtggatc 2160 tggataccgg gaaaacgctg ggcgttaatc agagaggcga attatgtgtc agaggaccta 2220 tgattatgtc cggttatgta aacaatccgg aagcgaccaa cgccttgatt gacaaggatg 2280 gatggctaca ttctggagac atagcttact gggacgaaga cgaacacttc ttcatagttg 2340 accgcttgaa gtctttaatt aaatacaaag gatatcaggt ggcccccgct gaattggaat 2400 cgatattgtt acaacacccc aacatcttcg acgcgggcgt ggcaggtctt cccgacgatg 2460 acgccggtga acttcccgcc gccgttgttg ttttggagca cggaaagacg atgacggaaa 2520 aagagatcgt ggattacgtg gccagtcaag taacaaccgc 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ctgcaacttt atccgcctcc 4260 atccagtcta ttaattgttg ccgggaagct agagtaagta gttcgccagt taatagtttg 4320 cgcaacgttg ttgccattgc tacaggcatc gtggtgtcac gctcgtcgtt tggtatggct 4380 tcattcagct ccggttccca acgatcaagg cgagttacat gatcccccat gttgtgcaaa 4440 aaagcggtta gctccttcgg tcctccgatc gttgtcagaa gtaagttggc cgcagtgtta 4500 tcactcatgg ttatggcagc actgcataat tctcttactg tcatgccatc cgtaagatgc 4560 ttttctgtga ctggtgagta ctcaaccaag tcattctgag aatagtgtat gcggcgaccg 4620 agttgctctt gcccggcgtc aatacgggat aataccgcgc cacatagcag aactttaaaa 4680 gtgctcatca ttggaaaacg ttcttcgggg cgaaaactct caaggatctt accgctgttg 4740 agatccagtt cgatgtaacc cactcgtgca cccaactgat cttcagcatc ttttactttc 4800 accagcgttt ctgggtgagc aaaaacagga aggcaaaatg ccgcaaaaaa gggaataagg 4860 gcgacacgga aatgttgaat actcatactc ttcctttttc aatattattg aagcatttat 4920 cagggttatt gtctcatgag cggatacata tttgaatgta tttagaaaaa taaacaaata 4980 ggggttccgc gcacatttcc ccgaaaagtg ccacctgacg cgccctgtag cggcgcatta 5040 agcgcggcgg gtgtggtggt tacgcgcagc gtgaccgcta 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900 uggagcagaa aaugcccacg cuacugcggg uuuauauaga cgguccucac gggaugggga 960 aaaccaccac cacgcaacug cugguggccc uggguucgcg cgacgauauc gucuacguac 1020 ccgagccgau gacuuacugg caggugcugg gggcuuccga gacaaucgcg aacaucuaca 1080 ccacacaaca ccgccucgac cagggugaga uaucggccgg ggacgcggcg gugguaauga 1140 caagcgccca gauaacaaug ggcaugccuu augccgugac cgacgccguu cuggcuccuc 1200 augucggggg ggaggcuggg aguucacaug ccccgccccc ggcccucacc cucaucuucg 1260 accgccaucc caucgccgcc cuccugugcu acccggccgc gcgauaccuu augggcagca 1320 ugacccccca ggccgugcug gcguucgugg cccucauccc gccgaccuug cccggcacaa 1380 acaucguguu gggggcccuu ccggaggaca gacacaucga ccgccuggcc aaacgccagc 1440 gccccggcga gcggcuugac cuggcuaugc uggccgcgau ucgccgcguu uacgggcugc 1500 uugccaauac ggugcgguau cugcagggcg gcgggucgug gugggaggau uggggacagc 1560 uuucggggac ggccgugccg ccccagggug ccgagcccca gagcaacgcg ggcccacgac 1620 cccauaucgg ggacacguua uuuacccugu uucgggcccc cgaguugcug gcccccaacg 1680 gcgaccugua uaacguguuu gccugggccu uggacgucuu ggccaaacgc cuccguccca 1740 ugcacgucuu uauccuggau uacgaccaau cgcccgccgg cugccgggac gcccugcugc 1800 aacuuaccuc cgggaugguc cagacccacg ucaccacccc aggcuccaua ccgacgaucu 1860 gcgaccuggc gcgcacguuu gcccgggaga ugggggaggc uaacugauua 1910 <210> 8 <211> 9996 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> AS300 W-P9 6T8T-TK expression vector (pAvQ-Theo-Rib21AS-TK) <400> 8 taacatcatc aataatatac cttattttgg attgaagcca atatgataat gagggggtgg 60 agtttgtgac gtggcgcggg gcgtgggaac ggggcgggtg acgtagtagt gtggcggaag 120 tgtgatgttg caagtgtggc ggaacacatg taagcgacgg atgtggcaaa agtgacgttt 180 ttggtgtgcg ccggtgtaca caggaagtga caattttcgc gcggttttag gcggatgttg 240 tagtaaattt gggcgtaacc gagtaagatt tggccatttt cgcgggaaaa ctgaataaga 300 ggaagtgaaa tctgaataat tttgtgttac tcatagcgcg taatactgcg atctatacat 360 tgaatcaata ttggcaatta gccatattag tcattggtta tatagcataa atcaatattg 420 gctattggcc attgcatacg ttgtatctat atcataatat gtacatttat attggctcat 480 gtccaatatg accgccatgt tgacattgat tattgactag ttattaatag taatcaatta 540 cggggtcatt agttcatagc ccatatatgg 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  4. hTERT(human Telomerase reverse transcriptase) RNA를 특이적으로 표적하며, 3' 엑손에는 반딧불 유래 루시퍼라제 수용체 유전자를 함유하는 것을 특징으로 하는 테오필린에 의해 RNA 치환 활성이 조절되는 알로스테릭 트랜스-스플라이싱 그룹 I 리보자임.
  5. 제4항에 있어서, 상기 리보자임은 서열번호 1로 표시되는 AS300 △P9 8T, 서열번호 2로 표시되는 AS100 Mu-P9 6T8T 또는 서열번호 3으로 표시되는 AS300 W-P9 6T8T인 것을 특징으로 하는 리보자임.
  6. 제4항에 따른 리보자임을 인코딩하는 발현벡터.
  7. 제6항에 있어서, 상기 발현벡터는 서열번호 4로 표시되는 pSEAP AS300 Delta P9 8T-Luci, 서열번호 5로 표시되는 pSEAP AS100 Mu-P9 6T8T-Luci 또는 서열번호 6으로 표시되는 pSEAP AS300 W-P9 6T8T-Luci인 것을 특징으로 하는 발현벡터.
  8. hTERT(human Telomerase reverse transcriptase) RNA를 특이적으로 표적하 며, 3' 엑손에는 HSV-TK(herpes simplex virus thymidine kinase) 세포사 유전자를 함유하는 것을 특징으로 하는 테오필린에 의해 RNA 치환 활성이 조절되는 알로스테릭 트랜스-스플라이싱 그룹 I 리보자임.
  9. 제8항에 있어서 상기 리보자임은 서열번호 7로 표시되는 AS300 W-P9 6T8T-TK인 것을 특징으로 하는 리보자임.
  10. 제8항에 따른 리보자임을 포유류 세포에서 발현하는 발현벡터.
  11. 제10항에 있어서, 상기 발현벡터는 서열번호 8로 표시되는 pAvQ-Theo-Rib21AS-TK(KCCM 10935P)인 것을 특징으로 하는 발현벡터.
  12. 제4항 또는 제8항에 따른 리보자임 및 테오필린을 포함하는 것을 특징으로 하는 유전자 발현 유도제.
  13. 제6항 또는 제10항에 따른 발현벡터 및 테오필린을 포함하는 것을 특징으로 하는 유전자 발현 유도제.
  14. 제4항 또는 제8항에 따른 리보자임 및 테오필린을 포함하는 것을 특징으로 하는 암 진단제.
  15. 제6항 또는 제10항에 따른 발현벡터 및 테오필린을 포함하는 것을 특징으로 하는 암 진단제.
  16. 제4항 또는 제8항에 따른 리보자임 및 테오필린을 포함하는 것을 특징으로 하는 유전자 치료제.
  17. 제6항 또는 제10항에 따른 발현벡터 및 테오필린을 포함하는 것을 특징으로 하는 유전자 치료제.
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