KR101825844B1

KR101825844B1 - 색소를 발현하는 바실러스 속 균주 및 이의 제조 방법

Info

Publication number: KR101825844B1
Application number: KR1020160154299A
Authority: KR
Inventors: 박상진; 이대상; 송동현; 김창환
Original assignee: 국방과학연구소
Priority date: 2016-11-18
Filing date: 2016-11-18
Publication date: 2018-02-07

Abstract

본 발명은 노란색 카로테노이드(carotenoid)계 색소로 4,4'-디아포뉴로스포렌(4,4'-diaponeurosporene)을 발현하는 바실러스 속 균주에 관한 것으로, 더욱 상세하게는 이를 위한 색소 발현 유전자인 crtM-crtN 유전자를 클로닝한 트란스포존 전달 벡터를 이용하여 트란스포존 돌연변이 방법으로 바실러스 속 균주의 염색체상의 BMB171_C4312 유전자 좌위에 삽입하여 색소를 발현하는 바실러스 속 균주 및 이의 제조 방법에 관한 것이다. 본 발명에 따라 제조된 바실러스 속 균주는 특이적으로 노란색 색소를 발현함으로써 다른 미생물과 혼재되었을 경우 쉽게 구별이 가능하므로, 이를 생물작용제의 탐지 등의 실험에 모의작용제로 효율적으로 사용할 수 있다.

Description

색소를 발현하는 바실러스 속 균주 및 이의 제조 방법{RECOMBINANT BACILLUS EXPRESSING PIGMENT AND METHOD FOR PREPARATION THEREOF}

본 발명은 색소를 발현하는 바실러스(Bacillus) 속 균주 및 이의 제조방법에 관한 것으로, 더욱 상세하게는 노란색의 카로테노이드(carotenoid)계 색소(pigment)인 4,4'-디아포뉴로스포렌(4,4'-diaponeurosporene)을 생성하는 스타필로코커스 아우레우스(Staphylococcus aureus)의 crtM-crtN 유전자가 염색체상의 BMB171_C4312 좌위에 1개 카피(copy)로 삽입된 바실러스(Bacillus) 속 균주를 제조함으로써 다른 세균과 혼재되었을 경우 육안으로 용이하게 구별할 수 있는 노란색 색소를 발현하는 모의작용제에 관한 것이다.

모의작용제(simulant 또는 surrogate이라고도 함)는 모사하고자 하는 생물무기나 생물테러의 수단으로 악용되는 병원체인 생물작용제(biological agent)와 유사한 특성을 갖되 인체와 환경에는 해가 없는 미생물로, 실제 생물작용제를 사용하여 시험하여야 가장 정확한 데이터를 얻을 수 있지만 인체 감염의 우려와 환경오염의 위험 때문에 이를 대신할 모의작용제가 생물방어 연구(biodefense research)의 다양한 분야에서 널리 이용되어오고 있다.

예를 들어, 생물작용제 탐지장비의 시험평가에 있어 실제 생물작용제를 에어로졸로 분사하여 평가하기에는 너무 위험도가 크기 때문에 통상 모의작용제를 대신 분사하여 시험평가를 실시하며, 탐지장비 시험 외에도 모의작용제는 생물작용제의 에어로졸(aerosol) 특성 연구, 제독 장비(decontamination equipment)의 성능시험, 제독제의 제독효능 평가 등에 이용되고 있다. 이때, 모의작용제는 평가하고자 하는 항목에 대해 생물작용제와 가능한 유사한 특성을 보이되, 인체에 무해해야 하며, 누출시 환경에 무해해야 하고, 낮은 비용으로 대량생산이 가능하며, 다른 세균으로부터 구별이 용이해야 한다.

그러므로 인체와 환경에 큰 해가 없으며, 대량생산이 용이하다는 점 그리고 쉽게 구별 가능한 색소를 발현한다는 점 때문에 전통적으로 그람양성 포자생성세균(탄저균 등)에 대한 모의작용제는 주황색 색소를 발현하는 바실러스 아트로파에우스(Bacillus atrophaeus 또는, 이와 다른 명칭으로 'Bacillus globigii'라고도 함)를, 그람음성세균에 대한 모의작용제는 노란색 색소를 발현하는 판토아 에글로메란스(Pantoea agglomerans 또는, 이와 다른 명칭으로 'Erwinia herbicola'라고도 함)를 널리 이용해왔다.

그러나 널리 이용해온 B. atrophaues와 P. agglomerans가 여러 장점에도 불구하고 대상 생물 작용제의 특성을 정확하게 모사하기에는 물리적 특성이 달라 미흡한 점들이 있다는 보고들이 제기되어 왔으며(Tufts et al., 2014), 이러한 점들을 개선하기 위한 모의작용제 개발이 진행되어 왔다. 특히 탄저균을 모사하는 모의작용제의 경우, 탄저균과 가까운 친척이면서 인체와 환경에 무해한 것으로 알려진 바실러스 쑤린지엔시스(Bacillus thuringiensis)가 미국과 영국에 의해 모의작용제로 개발되고 있다(Bishop et al., 2014).

그러나 B. atrophaues와 P. agglomerans 외의 연구되는 다른 모의작용제 균주들은 위에서 서술한 모의작용제로서의 요건들 중 목표 병원체와의 유사한 특성, 인체 및 환경 안전성과 대량생산 용이성을 잘 충족시키는 반면 색소 유전자를 가지지 않아 특정한 콜로니 색(colony color)을 나타내지 않는 경우가 많다.

예를 들어 B. atrophaeus 대신 바실러스 서브틸리스(Bacillus subtilis)를 모의작용제로 사용하기도 하고, 최근에는 바실러스 쑤린지엔시스(Bacillus thuringiensis)를 모의작용제로 개발하고 있으나 이들 균주는 흰색(white) 콜로니를 나타낸다. 이러한 흰색 콜로니의 경우, 환경에 상재하는 많은 미생물들이 흰색 콜로니를 나타내기 때문에 혼재될 경우 콜로니의 모양만으로는 유사한 경우가 많아 구별이 매우 어렵다. 예를 들어 모의작용제 살포 후 일정시간이 경과된 다음에 토양에 모의작용제가 어느 정도 잔존하는지 확인하고자 토양을 채집하여 분석할 경우, 이러한 특징 없는 콜로니 색상은 토양에 혼재해있는 다른 세균과의 구별을 어렵게 할 수 있다. 이들을 분자생물학적인 방법으로 구별 할 수는 있으나 분석해야 하는 시료의 수가 많은 경우 긴 소요시간과 큰 노동력이 요구되므로 모의작용제 균주는 쉽게 육안으로 구별이 가능한 색상을 나타내는 콜로니로 자라는 게 바람직하나 아직까지 인위적으로 색소를 부여하는 모의작용제의 제조 연구는 미진한 실정이다.

Tufts, J.A., et al., Bacillus thuringiensis as a surrogate for Bacillus anthracis in aerosol research. World J Microbiol Biotechnol, 2014. 30(5): p. 1453-61. Bishop, A.H. and C.V. Robinson, Bacillus thuringiensis HD-1 Cry- : development of a safe, non-insecticidal simulant for Bacillus anthracis. J Appl Microbiol, 2014. 117(3): p. 654-62. Peng, D., et al., Elaboration of an electroporation protocol for large plasmids and wild-type strains of Bacillus thuringiensis. J Appl Microbiol, 2009. 106(6): p. 1849-58. Yousten, A.A. and M.H. Rogoff, Metabolism of Bacillus thuringiensis in relation to spore and crystal formation. J Bacteriol, 1969. 100(3): p. 1229-36. Schaeffer, P. et al., Catabolic repression of bacterial sporulation. Proc. Natl Acad. Sci. USA, 1965. 54: p. 704-11.

이에 상기와 같은 점을 감안한 본 발명은 스타필로코커스 아우레우스(Staphylococcus aureus)로부터 기원한 색소 유전자인 crtM - crtN 유전자를 트란스포존을 이용하여 바실러스 속 균주의 염색체에 무작위로 삽입한 후 가장 진한 노란색을 나타내는 콜로니를 선별하여 구별이 용이한 바실러스 속 균주를 제조함으로써, 생물작용제의 탐지 등의 생물방어 분야 실험에 모의작용제로 사용시 다른 미생물과 쉽게 구별이 가능하도록 한 바실러스 속 균주의 제공에 목적이 있다.

본 발명의 또 다른 목적은 박테리아는 한 종내 또는 같은 그룹 내의 균주(strain)들은 거의 동일한 유전체 구성을 갖는다는 점을 이용하여 차세대 염기서열 분석으로 crtM - crtN 유전자의 삽입 좌위 BMB171_C4312를 규명함으로써 본 발명의 실시예에서 사용한 바실러스 쑤린지엔시스(Bacillus thuringiensis) 균주뿐 아니라 바실러스 속 균주 특히, BMB171_C4312 유전자의 상동유전자를 갖는 바실러스 세레우스(Bacillus cereus) 그룹에 속하는 균주에서 색소를 발현하는 바실러스 속 균주를 제조할 수 있는 방법을 제공하는 것이다.

상기와 같은 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 스타필로코커스 아우레우스(Staphylococcus aureus) 유래의 색소 유전자인 crtM - crtN 유전자가 클로닝된 트란스포존 전달 벡터(transposon delivery vector)를 바실러스 속 균주에 형질전환시켜, 노란색의 카로테노이드(carotenoid)계 색소로 4,4'-디아포뉴로스포렌(4,4'-diaponeurosporene) 색소를 발현하는 바실러스 속 균주를 제공한다.

바람직하게 상기 crtM - crtN 유전자는 서열번호 1의 염기서열로 이루어진 색소 유전자로 287개의 아미노산으로 이루어진 데히드로스콸렌 합성효소(dehydrosqualene synthase) 및 502개의 아미노산으로 이루어진 데하이드로스콸렌 불포화효소(dehydrosqualene desaturase)를 코딩한다.

여기서 서열번호 1의 'crtM - crtN 유전자'는 crtM - crtN 유전자 고유의 프로모터를 포함하지 않으며, crtM와 crtN 각각의 리보솜 결합 부위(ribosome binding site, RBS)만을 포함하며 두 유전자는 하나의 mRNA(bicistronic mRNA)로 전사되어 작용한다.

여기서 crtM 유전자는 서열번호 2로 표시되는 염기서열로 이루어진 데히드로스콸렌 합성효소(dehydrosqualene synthase)를 코딩하는 유전자이고, crtN 유전자는 서열번호 3의 염기서열로 이루어진 데하이드로스콸렌 불포화효소(dehydrosqualene desaturase)를 코딩하는 유전자이다.

상기 crtM - crtN 유전자는 스타필로코커스 아우레우스(Staphylococcus aureus)의 다양한 균주(strain)들로부터 약간씩 변이를 보이는 crtM - crtN 유전자들이 보고되었으며, 모두 동일하게 색소를 발현하는 기능을 하므로 이에 한정하지 않고 다양한 crtM-crtN 유전자 모두를 사용 가능하다.

즉, 본 발명의 crtM - crtN 유전자는 상기 서열번호 1의 염기 서열뿐만 아니라, 실질적으로 색소를 발현하는 염기 서열이라면, 일부 서열이 결실, 변형, 치환 또는 부과된 염기 서열을 갖는 경우도 본 발명의 범위에 포함됨은 자명하다.

상기 crtM - crtN 유전자는 바실러스 속 균주의 염색체 상의 BMB171_C4312 좌위 또는 BMB171_C4312 상동유전자 좌위에 삽입되는 것을 특징으로 한다.

본 명세서에서 기술된 유전자로 "BMB171_C4312", "YBT020_04715"라는 용어는 특정 유전자를 가리키는 유전자 심볼(gene symbol) 또는 로커스 태그(locus tag)를 나타내며, 이에 대한 정보는 NCBI(National Center for Biotechnology Information)의 GenBank와 같은 공지의 데이터베이스로 홈페이지(http://www.ncbi.nlm.nih.gov)를 통해 유전자 정보 및 서열에 대해 조회될 수 있다. 그리고 이러한 방법은 당업자에가 자명할 것이다.

또한, 본 발명에서 상기 바실러스 속 균주는 바실러스 쑤린지엔시스(Bacillus thuringiensis), 바실러스 안트라시스(Bacillus anthracis), 바실러스 세레우스(Bacillus cereus), 바실러스 마이코이데스(Bacillus mycoides), 바실러스 토요넨시스(Bacillus toyonensis) 및 바실러스 위헨스테파넨시스(Bacillus weihenstephanensis) 중에서 선택되는 어느 하나 이상을 사용할 수 있다.

이렇게 상기 색소를 발현하는 바실러스 속 균주는 본 발명자들에 의해 개발 제작되어 2016년 2월 29일자로 한국생명공학연구원 생물자원센터에 기탁된 균주로 수탁번호가 KCTC18453P인 바실러스 쑤렌지시스 BT-001이다.

또한, 상기와 같은 목적을 달성하기 위한 본 발명은 스타필로코커스 아우레우스(Staphylococcus aureus) 유래의 서열번호 1로 표시되는 crtM - crtN 유전자를 클로닝한 트란스포존 전달 벡터와 항생제 저항성 유전자를 제거하기 위한 FLP 재조합효소(FLP recombinase) 발현 벡터를 제조하고, 상기 벡터들을 바실러스 속 균주에 형질전환하여 색소를 발현하는 바실러스 속 균주를 제조하는 방법을 제공한다.

구체적으로 서열번호 1로 표시되는 염기서열로 이루어진 crtM - crtN 유전자가 클로닝된 트란스포존 전달 벡터 및 항생제 저항성 유전자 제거용 FLP 재조합효소(FLP recombinase) 발현 벡터를 제조하는 벡터 제조 단계, 상기 트란스포존 전달 벡터를 바실러스 속 균주에 형질전환하고 형질전환된 상기 트란스포존 전달 벡터를 사용하여 트란스포존 돌연변이(transposon mutagenesis) 방법으로 crtM - crtN 유전자를 염색체에 무작위로 삽입하고 노란색 색소 발현 균주를 선별(screening)한 후 고온(40℃) 배양으로 벡터를 제거(curing)하는 단계 및 FLP 재조합효소 발현벡터를 형질전환하여 항생제 저항성 유전자를 제거(deletion)한 후 고온(40℃) 배양으로 벡터를 제거(curing)하는 단계를 포함하여 색소를 발현하는 바실러스 속 균주를 제조한다.

상기 형질전환 균주를 얻는 단계에서는 바실러스 속 균주의 염색체의 BMB171_C4312 좌위 또는 BMB171_C4312 상동유전자 좌위에 상기 crtM-crtN 유전자가 삽입될 수 있다.

그리고 상기 색소를 나타내는 균주를 선별하는 과정 이후에는 선별된 재조합 바실러스 속 균주를 상기 항생제 저항성 유전자 제거용 FLP 재조합효소 발현 벡터로 형질전환시켜 상기 선별된 재조합 바실러스 속 균주의 염색체에 삽입된 항생제 저항성 유전자를 제거하는 단계를 통해 색소를 발현하는 최종적인 바실러스 속 균주를 제조한다.

상기 항생제 저항성 유전자를 제거하는 단계는 상기 FLP 재조합효소 발현 벡터를 제조된 색소 발현 바실러스 속 균주에 형질전환하여 FLP 재조합효소(FLP recombinase)를 발현시킴으로 FLP 재조합효소의 인식서열인 FRT 서열(Flippase Recognition Target)에 둘러싸인 염색체에 삽입된 항생제 저항성 유전자를 제거할 수 있다.

앞서 설명한 바와 같은 색소를 발현하는 바실러스 속 균주의 제조 방법을 통해 제조된 바실러스 속 균주는 생물작용제의 탐지 등의 생물방어 분야 실험에 모의작용제로 사용될 수 있다.

모의작용제로 여러 가지 면에서 특성이 부합하지만 콜로니에 특정한 색을 나타내지 않은 많은 미생물들이 있어 그들의 활용 범위가 제한되고 있으나 본 발명은 생물작용제의 탐지 등의 실험에 사용되는 모의작용제에 색소를 부여하여 다른 미생물과 혼재 시에도 쉽게 육안으로 구별이 가능하도록 함으로써, 특히 생물작용제 탐지 장비의 평가에 있어 평가의 효율을 높이고, 비용과 시간을 줄일 수 있는 효과가 있다.

또한, 본 발명의 방법을 이용하면 더 많은 미생물을 모의작용제로 개발할 수 있도록 촉진할 수 있어 모의작용제로 개발되는 미생물의 범주와 수를 대폭 증가시킬 수 있는 효과가 있다.

도 1은 본 발명의 일 실시예에 따른 색소를 발현하는 바실러스 속 균주의 제조방법 순서도이다.
도 2는 색소유전자로 crtM-crtN 유전자를 균주의 염색체에 삽입하기 위한 재조합 트란스포존 전달 벡터(pAD06)의 맵(map)을 나타낸 것이다.
도 3은 스펙티노마이신 항생제 저항성 유전자(Spc ^r )를 균주의 염색체에서 제거하기 위한 FLP 재조합효소 발현벡터(pAD03)의 맵(map)을 나타낸 것이다.
도 4는 본 발명의 실시예에 따른 Bacillus thuringiensis BT-001 균주의 제조 과정을 나타낸 모식도이다.
도 5는 본 발명의 실시예에 따라 제조된 노란색 색소를 발현하는 Bacillus thuringiensis BT-001 균주와 이의 모균주인 Bacillus thuringiensis BMB171의 콜로니를 비교한 사진이다.
도 6은 본 발명의 실시예에 따라 제조된 노란색 색소를 발현하는 Bacillus thuringiensis BT-001 균주의 염색체를 분석하여 crtM-crtN 유전자의 삽입부위를 규명한 그림이다.
도 7은 본 발명의 실시예에 따라 제조된 노란색 색소를 발현하는 Bacillus thuringiensis BT-001 균주와 그람음성 세균인 대장균(Escherichia coli)을 혼합하여 배양한 사진이다.
도 8은 본 발명의 실시예에 따라 제조된 노란색 색소를 발현하는 Bacillus thuringiensis BT-001 균주와 그람양성 세균인 바실러스 세레우스(Bacillus cerues)를 혼합하여 배양한 사진이다.
도 9는 본 발명의 실시예에 따라 제조된 노란색 색소를 발현하는 Bacillus thuringiensis BT-001 균주와 그람음성 세균인 대장균(Escherichia coli), 그리고 그람양성 세균인 바실러스 세레우스(Bacillus cerues)를 혼합하여 배양한 사진이다.
도 10은 본 발명의 실시예에 따라 제조된 노란색 색소를 발현하는 Bacillus thuringiensis BT-001 균주를 토양에서 분리한 미생물들과 혼합하여 배양한 사진이다.

이하에서 첨부된 예시도면을 참조로 본 발명을 보다 구체적으로 설명하지만, 이들 설명은 본 발명의 예시일 뿐이며 본 발명의 범위가 이들 설명에 한정되는 것은 아니다.

도 1은 본 발명의 색소를 발현하는 바실러스 속 균주의 제조방법의 순서도이다.

도 1에 도시된 바와 같이, 색소를 발현하는 바실러스 속 균주의 제조방법은 스타필로코커스 아우레우스(Staphylococcus aureus) 유래의 crtM-crtN 유전자가 클로닝된 트란스포존 전달 벡터 및 항생제 저항성 유전자 제거용 FLP 재조합효소 발현 벡터를 제조하는 단계(S10), 트란스포존 전달 벡터를 바실러스 속 균주에 형질전환하고 색소를 나타내는 균주를 선별한 후 트란스포존 전달 벡터를 제거하는 단계(S20), FLP 재조합효소 발현벡터를 선별된 균주에 형질전환하여 염색체 상의 항생제 저항성 유전자를 제거하고 이후 FLP 재조합효소 발현벡터를 제거하는 단계(S30)를 포함한다.

벡터 제조 단계(S10)는 색소 유전자를 도입한 트란스포존 전달 벡터 및 제조된 재조합 바실러스 속 균주에서 항생제 저항성 유전자를 제거하기 위한 FLP 재조합효소 발현 벡터를 제조하는 단계로, 먼저 색소 유전자로서 스타필로코커스 아우레우스(Staphylococcus aureus) 균주로부터 유래된 색소 유전자인 crtM-crtN 유전자를 트란스포존 전달 벡터에 클로닝하여 벡터를 제조하고, FLP 재조합 발현 벡터를 제조한다.

그 다음 crtM-crtN 유전자가 클로닝 된 트란스포존 전달 벡터를 숙주세포인 바실러스 속 균주에 형질전환하여 트란스포존 돌연변이(transposon mutagenesis) 방법으로 crtM-crtN 유전자를 숙주세포의 염색체에 무작위로 도입하여 재조합 바실러스 속 균주를 제조한다. 제조된 재조합 바실러스를 항생제를 함유하는 배지에 배양한 후, 가장 강한 노란색을 나타내는 콜로니(colony)를 육안으로 선별하고 계대 배양하여 색소를 나타내는 균주를 선별한다. 트란스포존 전달 벡터는 온도 감수성 복제원점(Temperature sensitive replication origin)을 가지고 있어 항생제 없이 고온(40℃)에서 배양시 쉽게 제거(curing)되며, 이후의 과정에는 트란스포존 전달 벡터가 더 이상 불필요하므로 제거한다(S20).

본 발명에서 사용되는 벡터는 하나 이상의 선택성 마커를 포함하는데, 상기 마커는 통상적으로 화학적인 방법으로 선택될 수 있는 특성을 갖는 핵산 서열로 바람직하게 테트라사이클린(tetracycline), 스펙티노마이신(spectinomycin), 암피실린(ampicillin)과 같은 항생제 저항성 유전자가 있으나 이에 한정된 것은 아니다.

염색체에 항생제 저항성 유전자가 잔존하는 것은 바람직하지 않으므로, FLP 재조합효소를 이용하여 항생제 저항성 유전자를 제거하는 단계(S30)를 수행한다. 항생제 저항성 유전자를 제거하는 단계(S30)는 선별된 색소발현 바실러스 속 균주의 염색체 상에 삽입된 항생제 저항성 유전자를 제거하기 위해서 FLP 재조합효소 발현 벡터를 상기 바실러스 속 균주에 형질전환하고 FLP 재조합효소를 발현시켜 색소발현 바실러스 속 균주의 염색체에 삽입된 항생제 저항성 유전자를 제거한다.

항생제 저항성 유전자를 제거하는 단계(S30)는 FLP-FRT 재조합 시스템(FLP-FRT recombination system)을 이용한 것으로, 두 개의 FRT 서열 및 플립파아제(flippase, FLP) 효소로 구성된다. FLP 재조합효소는 방향이 동일한 두 개의 FRT(Flippase Recognition Target) 부위가 있을 경우 FRT 부위를 인식하여 두 개의 FRT 사이의 염기서열을 제거(deletion)하며, 하나의 FRT 부위만을 남긴다. 이와 같은 FLP 재조합효소의 작용으로 두 개의 방향이 동일한 FRT 부위 사이에 위치하는 항생제 저항성 유전자가 제거된다. FLP 재조합효소 발현벡터는 온도 감수성 복제원점(Temperature sensitive replication origin)을 가지고 있어 항생제 없이 고온(40℃)에서 배양시 쉽게 제거(curing)되며, 이후 과정에서는 FLP 재조합효소 발현벡터는 불필요하므로 이를 제거한다.

본 발명에서 사용되는 용어 "FLP 재조합효소"는 플립파아제 재조합효소(flippase recombonase)를 의미하며, 이는 FRT(Flippase Recognition Target) 부위를 인식하는 효소이다.

본 발명에서 사용되는 용어 "숙주세포"란 색소발현을 위한 유전적 변형(genetic modification)이 일어나는 미생물 세포로 이를 위한 벡터가 숙주세포에 도입됨으로써 숙주세포 내에서 다양한 유전적 또는 분자적 영향을 미치게 되는 세포를 의미한다. 숙주세포는 외부 DNA를 받아들일 수 있는 상태에서, 벡터와 같은 외부 DNA가 도입될 수 있는데, 벡터가 숙주세포에 성공적으로 도입되면, 해당 벡터의 유전형질을 숙주세포에 제공하게 된다.

본 발명의 숙주세포로는 바실러스(Bacillus) 속 균주로 바람직하게 바실러스 세레우스(Bacillus cereus) 그룹에 속하는 미생물로 바실러스 쑤린지엔시스(Bacillus thuringiensis), 바실러스 안트라시스(Bacillus anthracis), 바실러스 세레우스(Bacillus cereus), 바실러스 마이코이데스(Bacillus mycoides), 바실러스 토요넨시스(Bacillus toyonensis) 및 바실러스 위헨스테파넨시스(Bacillus weihenstephanensis) 중에서 선택되는 어느 하나인 균주를 사용할 수 있다.

본 발명의 노란색 색소를 발현하는 바실러스 쑤린제엔시스(Bacillus thuringiensis) 균주의 제조에 대하여 이하에서 설명한다.

본 발명에서는 색소 유전자를 도입한 재조합 바실러스 속 균주를 제작하기 위해 한국생명공학연구원 생물자원센터(KCTC)로부터 분양받은 스타필로코커스 아우레우스 KCTC 3881(Staphylococcus aureus KCTC 3881) 균주의 genomic DNA로부터 증폭 대상이 되는 색소 유전자인 서열번호 1의 crtM - crtN 유전자를 전방향 프라이머 AD06-3(5'-GGGGGGgaattcTAAAAGAGATGGAGGTAACTTATGACAATGATGGATATGAATTT-3', 서열번호 4)와 역방향 프라이머 AD06-4(5'-GGGGGGgtcgacTTATACGCCCCGCTCAATATC-3', 서열번호 5)로 구성된 프라이머 쌍을 이용하여 중합효소연쇄반응(Polymerase chain reaction, PCR)로 증폭한다.

상술한 바와 같이 프라이머 AD06-3의 서열에서 소문자로 표시된 서열은 EcoRI 제한 효소 인식서열, 밑줄로 표시된 서열은 리보솜 결합부위(ribosome binding site, RBS)를 나타내며, 프라이머 AD06-4에서 소문자로 표시된 서열은 SalⅠ 제안효소 인식서열을 나타낸다.

그 다음 증폭된 crtM-crtN 유전자 삽입용 재조합 벡터인 트란스포존 전달 벡터에 클로닝하여 pAD06 벡터를 완성하였다.

본 명세서에서 사용된 용어, "트란스포존(transposon)"은 염색체나 플라스미드 상에서 움직일 수 있는 염기서열로서 전이효소(transposase)에 의해 인식되는 2개의 역방향 반복서열(inverted repeat) 및 이들 사이에 위치한 염기서열을 의미한다. 트란스포존은 전이효소에 의해 숙주세포의 염색체에 무작위로 삽입되어 무작위 돌연변이(random mutagenesis)를 일으킨다. 바람직하게 본 발명의 트란스포존은 색소 유전자인 crtM-crtN 유전자 및 양 말단에 전위효소(transposase) 인식 부위를 포함할 수 있다. 또한, 트란스포존 삽입 클론을 선별하기 위한 마커 유전자로 항생제 저항성 유전자를 포함할 수 있다.

본 발명에서 crtM-crtN 유전자를 포함하는 색소 유전자 삽입용 트란스포존 전달 벡터인 pAD06 벡터는 Bacillus-대장균 셔틀벡터(shuttle vector)로 도 2와 서열번호 6으로 표시되는 pAD06 벡터의 염기서열에 나타낸 바와 같이, 트란스포존으로 하여금 자신의 사본을 다른 곳에 삽입할 수 있게 해주는 효소인 전이효소(transposase)를 암호화하는 유전자로서 마리너(mariner) 계열 트란스포존으로부터 기원한 Himar1 전이효소(transposase) 유전자가 포함되고, 바실러스 속 미생물에서 작동하는 온도 감수성 복제원점(Temperature sensitive replication origin), 대장균에서 작동하는 복제가 개시되는 특정 핵산 서열인 복제원점 및 대장균과 바실러스 속 균주 양쪽에서 작동하는 테트라사이클린 항생제 저항성 유전자 등을 포함한다.

서열번호 6의 염기서열로 구성되는 pAD06 벡터를 구체적으로 살펴보면, 서열번호 7 내지 서열번호 14의 염기서열로 이루어진다. 서열번호 6의 염기서열 중에서 1283번째 내지 1635번째 염기로 서열번호 7로 표시되는 온도 감수성 복제원점(Temperature sensitive replication origin) 서열을 포함하고, 2162번째 내지 3538번째 염기로 항생제 저항성 유전자인 서열번호 8의 테트라사이클린 저항성 유전자 서열을 포함하고, 3796번째 내지 4842번째 염기로 서열번호 9의 Himar1 전이효소(Himar1 transposase) 서열을 포함하고, 4926번째 내지 4952번째 염기와 9245번째 내지 9271번째 염기로 각각 서열번호 10과 서열번호 14로 표시되는 역방향 반복 서열(inverted repeat)을 포함하고, 4953번째 내지 4986번째 염기와 6794번째 내지 6827번째 염기로 서열번호 11의 FRT 인식서열을 포함하고, 5048번째 내지 5636번째 염기로 대장균에서 작동하는 서열번호 12의 복제원점(replication origin) 서열을 포함하고, 5974번째 내지 6756번째 염기로 항생제 저항성 유전자인 서열번호 13의 스펙티노마이신 저항성 유전자 서열을 포함하고, 6834번째 내지 8342번째 염기로 서열번호 3의 crtN 유전자 서열을 포함하고, 8354번째 내지 9217번째 염기로 서열번호 2의 crtM 유전자 서열을 포함하여 이루어진다.

이와 같이 pAD06 벡터에는 서열번호 9로 표시되는 Himar1 전이효소(Himar1 transposase)가 포함됨으로서 클로닝 부위인 crtM-crtN 유전자의 업스트림(upstream)에 위치한 제1 역방향 반복 서열(inverted repeat 1)부터 서열번호 13으로 표시되는 항생제 저항성 유전자인 스펙티노마이신(spectinomycin) 저항성 유전자(Spc ^r )의 다운스트림(downstream)에 위치한 제2 역방향 반복 서열까지 무작위적으로 숙주세포의 염색체에 삽입할 수 있다.

구체적으로 전위효소(transposase) 인식 부위는 서로 각각 역상보적인 서열인 역방향 반복 서열(inverted repeat)을 이룬다. 상기 역방향 반복 서열(inverted repeat)은 27 bp 크기로 서열번호 10의 염기서열(5'-ACAGGTTGGCTGATAAGTCCCCGGTCT-3')로 이루어져 crtM - crtN 유전자의 업스트림(upstream)에 위치하는 제1 역방향 반복 서열(inverted repeat 1)과, 또 다른 하나로 상기 서열번호 10의 제1 역방향 반복 서열과 염기서열은 동일하나 진행 방향은 반대인 서열번호 14의 염기서열(5'-AGACCGGGGACTTATCAGCCAACCTGT-3')로 이루어져 스펙티노마이신(spectinomycin) 저항성 유전자(Spc ^r )의 다운스트림(downstream)에 위치하는 제2 역방향 반복 서열(inverted repeat 2)로 구성되며, 이 두 역방향 반복 서열을 Himar1 전이효소가 인식하여 역방향 반복 서열과 함께 이 둘 사이에 위치한 crtM-crtN 유전자와 스펙티노마이신(spectinomycin) 저항성 유전자(Spc ^r )를 숙주의 게놈에 무작위로 삽입하게 되어, DNA 재조합 반응을 일으킨다.

한편, 역방향 반복 서열에서 "제1", "제2" 등과 같은 용어는 다양한 구성요소를 사용되는 것으로, 상기 구성요소들은 상기 용어들에 의해 권리범위가 한정되지는 않으며, 상기 용어들은 하나의 구성요소를 다른 구성요소로부터 구별하는 목적으로만 사용한다.

그리고 Himar1 전이효소는 역방향 반복 서열 바깥에 위치하므로 숙주세포 유전체(genome)에는 crtM-crtN 유전자와 스펙티노마이신 저항성 유전자(Spc ^r )만이 삽입되며, Himar1 전이효소 유전자는 트란스포존 전달 벡터에 그대로 남는다. Himar1 전이효소 유전자가 함께 삽입되지 않고 트란스포존 전달 벡터에 남기 때문에 트란스포존 전달 벡터만 숙주세포로부터 제거(curing)하면 Himar1 전이효소 유전자도 제거되어 유전체에 삽입된 crtM-crtN 유전자와 스펙티노마이신 저항성 유전자(Spc ^r )는 더 이상 이동하지 않게 된다.

한편, pAD06 벡터는 pUCTV2(GenBank : AJ810977.1)로부터 기원한 온도 감수성 복제원점(Temperature sensitive replication origin) 서열 및 테트라사이클린(tetracycline) 저항성 유전자(Tet ^r )를 가지고 있어 항생제로 테트라사이클린이 첨가된 배지에서 벡터의 유지가 가능하며, 이와 반대로 항생제가 없는 배지에서 40℃ 정도의 고온에서 배양할 경우 벡터의 제거(curing)가 가능하다.

따라서 한 번 숙주세포의 게놈에 삽입된 crtM-crtN 유전자와 스펙티노마이신 저항성 유전자(Spc ^r )가 Himar1 전이효소에 의해 다시 다른 좌위로 옮겨지는 일이 발생하지 않도록, 재조합 반응 후에 항생제가 없는 배지에서 40℃ 정도의 고온에서 배양하여 pAD06 벡터를 제거(curing)할 수 있다.

pAD06 벡터에서 crtM-crtN 유전자의 다운스트림(downstream)에 위치한 항생제 스펙티노마이신(spectinomycin)에 대한 저항성을 숙주세포에 부여하는 스펙티노마이신 저항성 유전자(Spc ^r )는 프로모터가 없이 리보솜 결합부위(ribosomal binding site, RBS)만을 가지고 있다.

따라서 이 스펙티노마이신 저항성 유전자(Spc ^r )는 업스트림(upstream)에 위치한 crtM-crtN 유전자가 발현되는 경우에만 다시스트론 mRNA(polycistronic mRNA)로서 전사되어 발현된다. crtM-crtN 유전자 또한 리보솜 결합부위만을 가지며 프로모터를 가지고 있지 않아 Himar1 전이효소에 의해 숙주세포의 염색체에 삽입되어 삽입부위 또는 그 인근의 프로모터에 의해 전사되는 경우에만 발현될 수 있다.

이러한 설계로 인해 pAD06 벡터를 숙주세포에 형질전환시 pAD06 벡터를 가지고 있는 형질전환체들(transformants)은 노란색 색소를 발현하지 않으며 스펙티노마이신 항생제에 대해서도 저항성이 없고, 오직 Himar1 전이효소에 의해 crtM-crtN 유전자와 스펙티노마이신 저항성 유전자(Spc ^r )가 염색체에 삽입되어 발현되는 균주만 스펙티노마이신 항생제에 대해서 저항성을 가질 수 있어 pAD06 벡터 형질전환체들을 배양한 다음 스펙티노마이신을 함유한 배지에 도말하면 색소 유전자인 crtM-crtN 유전자가 염색체에 삽입된 균주만을 자리게 할 수 있어 선별과정을 용이하게 할 수 있다.

crtM-crtN 유전자가 바실러스 속 균주의 염색체에 삽입이 되면, crtM-crtN이 발현되더라도 삽입된 균주 모두가 육안으로 보일 정도의 색소를 형성하는 것은 아니며, 삽입위치에 따라 극히 일부만이 육안으로 식별 가능한 노란색 콜로니를 나타내기 때문에 이처럼 프로모터가 없는 스펙티노마이신 저항성 유전자를 사용함으로서 재조합 균주 선별에 소요되는 노동력과 시간을 대폭 절감할 수 있다.

도 3은 본 발명의 재조합 균주의 염색체에서 항생제 저항성 유전자를 제거하기 위해 사용된 FLP 재조합효소 발현벡터(pAD03)를 나타낸 것이다.

본 발명에서 항생제 저항성 유전자를 제거하기 위해 사용된 벡터 pAD03은 도 3과 pAD03 벡터의 전체 염기서열로 서열번호 17에 나타내었다. 이 pAD03 벡터에 포함되는 서열번호 19의 염기서열로 표시되는 slpA의 유전자(YBT020_04715)의 프로모터는 Bacillus Genetic Stock Center(BGSC)에서 분양받은 바실러스 쑤린지엔시스 YBT-020(Bacillus thuringiensis YBT-020) 균주의 genomic DNA로부터 전방향 프라이머인 AD03-1(5'-GGGGGGtctagaTAAAAGAGATGGAGGTAACTTATGCCACAATTTGATATATTATGTAAA-3', 서열번호 15)와 역방향 프라이머인 AD03-2(5'-GGGGGGctgcagTTATATGCGTCTATTTATGTAGGATG-3', 서열번호 16)로 구성된 프라이머 쌍을 이용하여 중합효소연쇄반응(Polymerase chain reaction, PCR)로 증폭한다.

여기서 프라이머 AD03-1의 서열에서 소문자로 표시된 서열은 XbaⅠ제한효소 인식서열이고, 밑줄로 표시된 서열은 리보솜 결합부위(ribosome binding site, RBS)를 나타내며, 프라이머 AD06-2에서 소문자로 표시된 서열은 PstⅠ제한효소 인식서열을 나타낸다.

그 다음 증폭한 slpA 유전자(YBT020_04715)의 프로모터를 FLP 재조합효소(FLP recombinase) 유전자가 포함된 벡터에 클로링하여 FLP 재조합효소 발현 벡터인 pAD03 벡터를 완성하였다.

서열번호 17의 염기서열로 구성되는 pAD03 벡터를 살펴보면 서열번호 17의 염기서열 중에서 146번째 내지 407번째 염기와 2078번째 내지 2095번째 염기로 서열번호 18과 서열번호 21의 lacZ 알파(lacZ-alpha) 서열을 포함하고, 408번째 내지 778번째 염기로 서열번호 19의 slpA 유전자 서열을 포함하고, 806번째 내지 2077번째 염기로 서열번호 20의 FLP 재조합효소(FLP recombinase) 유전자 서열을 포함하고, 3372번째 내지 3724번째 서열로 서열번호 7의 온도 감수성 복제원점(Temperature sensitive replication origin) 서열을 포함하고, 4251번째 내지 5627번째 염기로 항생제 저항성 유전자인 서열번호 8의 테트라사이클린 저항성 유전자 서열을 포함하고, 5703번째 내지 5719번째 염기로 서열번호 22의 lacZ 알파 5'(lacZ-alpha 5')서열을 포함하고, 6117번째 내지 6705번째 염기로 대장균에서 작동하는 서열번호 12의 복제원점(replication origin) 서열을 포함하고, 6876번째 내지 7736번째 염기로 항생제 저항성 유전자인 서열번호 23의 암피실린 저항성 유전자 서열을 포함하여 이루어진다.

구체적으로 pAD03 벡터는 증폭한 slpA의 유전자(YBT020_04715)의 프로모터를 사용하여 FLP 재조합효소(FLP recombinase)를 지속적으로 발현하며, 또한 앞서 설명한 pAD06 벡터와 동일하게 pUCTV2(GenBank : AJ810977.1)로부터 기원한 서열번호 7로 표시되는 온도 감수성 복제원점(Temperature sensitive replication origin) 서열 및 서열번호 8로 표시되는 테트라사이클린(tetracycline) 저항성 유전자(Tet ^r )를 가지고 있어, 항생제 테트라사이클린이 첨가된 배지에서 벡터의 유지가 가능하며, 이와 반대로 항생제 테트라사이클린이 없는 배지에서 40℃ 정도의 고온에서 배양할 경우 벡터의 제거(curing)가 가능하다. 또한, pAD03 벡터는 pAD06 벡터와 마찬가지로 Bacillus-대장균 셔틀벡터(shuttle vector)로 서열번호 12로 표시되는 대장균에서 작동하는 복제원점과 항생제 저항성 유전자인 서열번호 23로 표시되는 암피실린(ampicillin) 항생제 저항성 유전자를 가지고 있다.

pAD03 벡터는 FLP 재조합효소 유전자가 FRT(Flippase Recognition Target) 부위를 인식하여 재조합을 일으킴으로써 이전 과정으로 숙주세포인 바실러스 쑤린제엔시스(Bacillus thuringiensis) 균주의 염색체에 삽입된 스펙티노마이신 저항성 유전자(Spc ^r )를 제거할 수 있다.

도 4는 본 발명의 일례로 색소를 발현하는 바실러스 속 균주의 제조 과정을 간략하게 나타낸 도식도이다.

도 4의 1번 과정에 도시된 바와 같이 먼저 트란스포존 전달 벡터인 pAD06 벡터를 이용하여 crtM-crtN 유전자와 스펙티노마이신 저항성 유전자(Spc ^r )를 숙주세포인 바실러스 속 균주의 염색체로 삽입시킨 균주를 제조한다. 이를 위해 먼저 pAD06 벡터를 숙주세포에 형질전환하여 배양한 배양액을 스펙티노마이신(spectinomycin)이 함유된 Luria-Bertani(LB) 평판배지에 도말하고 30℃에서 배양함으로 Himar1 전이효소에 의해 색소 유전자인 crtM-crtN 유전자와 스펙티노마이신 저항성 유전자가 염색체에 삽입된 균주만이 자라도록 하며, crtM-crtN 유전자의 삽입부위에 따라 노란색 색소 발현의 정도는 천차만별이므로 자라난 콜로니 중 가장 진한 노란색을 나타내는 콜로니를 선별한다. 이후, 선별된 균주를 항생제 없이 40℃에서 배양함으로 더 이상 필요 없는 pAD06 벡터를 제거(curing)한다.

그리고 선별된 재조합 균주의 염색체에서 스펙티노마이신 저항성 유전자(Spc ^r )를 제거하기 위해 도 4의 2번 과정으로 FLP 재조합효소 발현 벡터인 pAD03 벡터를 도입하여 FLP 재조합효소(FLP recombinase)를 발현함으로써 FLP 재조합효소(FLP recombinase)에 의해 인식되는 34 bp의 FRT 인식서열(5'-GAAGTTCCTATTCTCTAGAAAGTATAGGAACTTC-3', 서열번호 11)을 양 쪽에 가진 서열번호 13으로 표시되는 스펙티노마이신(spectinomycin) 저항성 유전자(Spc ^r )를 제거할 수 있다.

상기 FRT 인식서열로 둘러싸인 스펙티노마이신 저항성 유전자를 제거하고, 40℃ 정도의 고온에서 배양함으로써 사용된 pAD03 벡터를 제거하여 최종적으로 색소를 발현하는 균주를 제조한다.

이하 구체적인 실시예에 의거하여 본 발명의 색소 발현 모의작용제의 제조 방법에 대해 구체적으로 설명한다.

본 발명의 실시예 및 실험예에서 사용한 바실러스 속 균주로는 바실러스 쑤린제엔시스(Bacillus thuringiensis) 균주로서 상세하게는 Cry 단백질 유전자를 가지고 있는 플라스미드를 상실한 바실러스 쑤린제엔시스 BMB171(Bacillus thuringiensis BMB171, 또는 'B. thuringiensis BMB171'라고도 함) 균주를 Bacillus Genetic Stock Center(BGSC)로부터 분양받아 사용하였다.

그리고 Bacillus thuringiensis BMB171 균주의 게놈 정보는 공지의 데이터 베이스인 NCBI(National Center for Biotechnology Information)의 GenBank에서 공지된 GenBank CP001903.1 서열을 사용하였으며, 아울러 이하에서 설명될 BMB171_C4312 유전자 명칭과 색소 유전자 삽입 위치 등과 같은 유전자의 구체적인 염기서열 및 단백질 정보는 모두 NCBI에 공지된 정보에 따른 것이다.

실시예 1은 앞서 설명한 바와 같은 방법으로 색소 발현하는 B. thuringiensis BMB171를 제조하는 것이다.

상기의 pAD06 벡터를 B. thuringiensis BMB171 균주에 Peng 등(2009)의 방법을 사용하여 형질전환하고, 테트라사이클린(20ug/ml)을 함유한 LB 고체배지에 도말하여 30℃에서 하룻밤 배양 후, 10개의 콜로니(형질전환체)를 골라 1 ml의 LB 액체배지에 현탁하고, 이를 5 ul 취하여 테트라사이클린을 함유한 5 ml의 LB 액체배지에 접종하고 30℃, 200rpm으로 하룻밤 진탕배양 한다. 다음날 배양액을 50 ul 취하여 스펙티노마이신(200ug/ml)을 함유한 LB 액체배지에 접종하고(1/100 계대), 30℃, 200 rpm으로 하룻밤 진탕배양 한다. 또 다음날 배양액을 적절히 희석하여 스펙티노마이신을 함유한 Tryptic soy agar(TSA) 고체배지 20장에 도말하고, 30℃에서 하룻밤 배양한다.

배양 후, 고체 배지를 육안으로 확인하여 노란색을 나타내는 콜로니들을 선별하고, 이들을 TSA 고체배지에서 계대배양하여 가장 강한 노란색을 나타내는 콜로니를 최종 선정한다. 선정된 균주를 5 ml LB 액체배지에 접종하고 40℃에서 8시간 배양후 배양액을 적절히 희석하여 LB 고체배지에 도말하고 30℃에서 하룻밤 배양함으로 pAD06 벡터를 제거(curing)한다. 그리고 다음날 자란 콜로니들을 테트라사이클린이 함유된 LB 고체배지에 획선도말(streaking)하여 자라지 않음을 확인하여 pAD06 벡터가 제거되었음을 확인한다.

확인된 균주에 상기 pAD03 벡터를 Peng 등(2009)의 방법을 사용하여 형질전환하며, 테트라사이클린(20ug/ml)을 함유한 LB 고체배지에 도말한다. 30℃에서 하룻밤 배양 후 얻어진 형질전환체들을 매일 1회씩 스펙티노마이신을 함유한 LB 고체배지에 계대하면서 스펙티노마이신 저항성 유전자의 상실 유무를 확인한다.

스펙티노마이신 저항성 유전자가 제거된 것으로 확인된 균주를 선별하여 5 ml LB 액체배지에 접종하고 40℃에서 8시간 배양함으로서 pAD03 벡터를 제거(curing)한다. 이후 배양액을 적절히 희석하여 LB 고체배지에 도말하고 30℃에서 하룻밤 배양한다. 다음날 자란 콜로니들을 테트라사이클린을 함유한 LB 고체배지에 획선 도말(streaking)하여 자라지 않음을 확인하여 pAD03 벡터가 제거되었음을 확인한다.

이렇게 제조된 본 발명의 재조합 바실러스 속 균주인 색소를 발현하는 균주는 바실러스 쑤렌지시스 BMB171(B. thuringiensis BMB171) 균에서 서열번호 1로 기재된 crtM - crtN 유전자를 염색체에 포함하는 균주로 2016년 2월 29일자로 한국생명공학연구원 미생물자원센터(KCTC)에 Bacillus thuringiensis BT-001(기탁번호 : KCTC18453P)로 기탁되었다.

앞서 설명한 바와 같이 실시예 1을 통해 제조되어 최종 선별한 균주인 B. thuringiensis BT-001 균주를 crtM-crtN 유전자의 염색체상 삽입부위를 규명하고자 차세대 염기서열 분석(Next generation sequencing, NGS)방법을 이용하여 염기서열을 분석하였으며, 다음과 같이 실시하였다.

제조된 Bacillus thuringiensis BT-001 균주의 genomic DNA를 추출하고, Illumina TruSeq Nano DNA Sample preparation kit를 사용하여 라이브러리(library)를 제조한다. 제조한 라이브러리의 품질은 2100 Bioanalyzer(Agilent)의 DNA 1000 chip을 사용하여 확인하며, 7500 Real time PCR system(Life technologies)으로 라이브러리 정량(library quantification)을 하고, MiSeq instrument(Illumina)로 염기서열분석을 실시한다.

이와 같이 실시한 차세대 염기서열 분석(NGS) 결과의 분석으로 de novo assembly 방법을 실시하였고 총 244개의 콘틱(contig)들을 얻었다. 얻어진 콘틱(contig)들을 서열번호 2로 표시되는 crtM 유전자 ORF(open reading frame)의 염기서열과 서열번호 3으로 표시되는 crtN 유전자 ORF(open reading frame)의 염기서열로 BLAST 분석을 실시하여 어느 콘틱(contig)에 crtM-crtN 유전자가 삽입되어있는지 확인하였으며, 그 결과 두 유전자 모두 87번 콘틱(contig)에 위치하였으며, 이 87번 콘틱(contig)을 분석한 결과 crtM-crtN 유전자가 BMB171_C4312(hypothetical protein) 유전자의 중앙에 삽입되어 있음을 확인하였다.

여기서 유전자 삽입은 전방향 프라이머 C4312-F(5'-TGG GATTAACACATGTGGAACGAG-3', 서열번호 24)와 역방향 프라이머 C4312-R (5'-AGCAGCTGCAATAATTAAGAAATC-3', 서열번호 25)로 구성된 프라이머 쌍을 이용하여 중합효소연쇄반응(PCR)으로 증폭하여 염기서열분석을 실시하여 확인한다.

그 결과 도 6에 도시된 바와 같이, Bacillus thuringiensis BT-001 균주는 최종적으로 색소 유전자인 crtM - crtN 유전자를 포함하는 서열번호 26로 표시되는 2507 bp의 염기서열이 BMB171_C4312 좌위에 BMB171_C4312 유전자의 전사 방향에 대해 역방향으로 삽입되었음을 확인할 수 있었다.

여기서 상기 서열번호 26의 염기서열은 양 말단에 서열번호 10 및 14의 역방향 반복 서열(inverted repeat)과 이 역방향 반복 서열 사이의 서열번호 26의 염기서열 중에서 55번째 내지 2438번째 염기서열로 crtM-crtN 유전자를 포함하고 또한 상기 서열번호 14의 역방향 반복 서열의 바로 업스트림(upstream) 위치에 FLP 재조합효소(FLP recombinase)에 의해 인식되는 서열번호 11번의 FRT 인식서열을 포함하고 있음을 확인하였다.

노란색 색소의 발현은 crtM-crtN 유전자에 의한 것으로 BMB171_C4312 유전자에 의한 것이 아니며, BMB171_C4312 좌위는 발현 좌위(expression locus)의 역할을 한다. 그러나, 단순히 프로모터가 강하다고 콜로니의 색소 발현이 강한 것은 아니며, 또한 삽입부위 및 생성되는 색소의 양이 세포의 성장과 포자형성에 영향을 주지 않아야 하므로 crtM-crtN 유전자가 염색체의 어느 부위에나 삽입된다고 하여서 노란색 색소를 강하게 발현하는 콜로니가 형성되는 것은 아니다.

실제로 트란스포존으로 crtM-crtN을 무작위적으로 삽입한 결과, 삽입된 균주들 중 육안으로 인식될 정도의 노란색의 콜로니를 형성하는 균주는 극히 일부였다. 즉, 염색체 상의 어느 부위나 crtM-crtN 유전자의 최적의 발현좌위가 될 수 있는 것이 아니며, 본 실시예에서 crtM-crtN 삽입부위 규명을 통해 색소 발현 모의작용제 제조에 최적의 발현좌위는 BMB171_C4312이라는 것을 밝혔다.

상기 BMB171_C4312 좌위는 BLAST 검색(www.ncbi.nlm.nih.gov/blast) 프로그램을 사용하여 비교 분석한 결과 다양한 바실러스(Bacillus) 속 미생물에서 발견되었다. 이에 따라 동일한 BMB171_C4312 좌위 또는 BMB171_C4312 상동유전자 좌위를 갖는 바실러스 속 미생물에서 해당 유전자 좌위는 동일한 역할을 할 것으로 예상되는 바, 본 발명의 일 실시예에서 사용된 바실러스 쑤린지엔시스(Bacillus thuringiensis) 균주 이외의 또 다른 바실러스 속 균주에 crtM-crtN 유전자를 삽입할 경우 색소 발현이 가능함을 알 수 있다.

이하의 실험예에서는 실험을 통해 본 발명에서 제조된 B. thuringiensis BT-001 균주의 모의작용제로서의 효과와 색소의 발현성을 입증하도록 한다.

실험예 1과 실험예 2는 상기 실시예 1을 통해 제조된 B. thuringiensis BT-001 균주의 포자생산량을 평가하여 모의작용제로 사용 가능 여부를 확인한 것으로, 실험예 1은 상기 실시예 1을 통해 제조한 균주를 LB 고체배지에 획선도말(streaking)하여 30℃에서 하룻밤 배양하며, 다음날 5 ml LB 배지에 1개의 콜로니를 접종하고 30℃, 200 rpm으로 8시간 진탕 배양한 다음, 이를 125 ml 플라스크에 담은 25 ml의 포자생성 배지(sporulation medium)인 GYS 배지(Yousten & Rogoff, 1969)에 1/100로 접종하고 30℃, 200 rpm으로 48시간 배양하여 포자를 생산한다. 생산된 포자 배양액을 1ml 채취하여 65℃에서 30분간 열처리함으로 잔존할 수 있는 영양세포를 사멸시키며, 이를 인산완충용액인 PBS(Phospho buffer saline) 용액에서 적절하게 희석하여 TSA 고체배지(한일코메드)에 도말하여 세포수를 측정한다.

실험예 2는 포자생성배지로 DSM 배지(Schaeffer et al., 1965)를 사용한 것을 제외하고, 상기 실험예 1과 동일한 방법으로 배양하여 포자생산량을 측정한다.

그 결과를 하기 표 1과 표 2에 나타내었으며, 표 1은 실험예 1로 GYS 배지에서 모균주인 B. thuringiensis BMB171와 본 발명의 색소발현균주인 B. thuringiensis BT-001의 포자생산량 비교한 결과를 나타낸 것이고, 하기 표 2는 실험예 2로 DSM 포자생성배지에서 B. thuringiensis BMB171와 B. thuringiensis BT-001의 포자생산량 비교한 결과를 나타낸 것이다.

균주	반복시험	포자생산량 (c.f.u./ml)
B. thuringiensis BMB171	1	3.4×10⁸
	2	3.5×10⁸
	3	3.6×10⁸
B. thuringiensis BT-001	1	3.9×10⁸
	2	4.1×10⁸
	3	4.2×10⁸

균주	반복시험	포자생산량 (c.f.u./ml)
B. thuringiensis BMB171	1	7.1×10⁸
	2	6.9×10⁸
	3	7.2×10⁸
B. thuringiensis BT-001	1	7.2×10⁸
	2	7.4×10⁸
	3	7.0×10⁸

상기 표 1과 표 2에 나타낸 바와 같이, 모균주인 B. thuringiensis BMB171과 제조한 B. thuringiensis BT-001는 포자생산량에 있어 거의 차이가 없음이 확인되었으며, 이는 B. thuringiensis BT-001에 삽입된 crtM-crtN 유전자의 삽입위치 및 발현 양상이 모의작용제로서 사용에 있어 중요한 요소인 균주의 포자 형성능에는 영향을 주지 않음을 알 수 있었다.

실험예 3은 상기 실시예 1을 통해 제조된 B. thuringiensis BT-001 균주의 색소 발현 여부를 확인하기 위해서, 상기 실시예 1에서 B. thuringiensis BT-001 균주와 모균주인 B. thuringiensis BMB171 균주의 콜로니 색을 비교하였다. 노란색 색소를 발현하는 B. thuringiensis BT-001 균주와 이의 모균주인 B. thuringiensis BMB171 균주를 TSA 고체 평판 배지에 하룻밤 배양하였다. 그 결과 도 5에서 왼쪽의 콜로니는 B. thuringiensis BT-001 균주의 콜로니로, 도 5의 오른쪽에 나타난 모균주 B. thuringiensis BMB171의 흰색 콜로니와 명확히 구별되는 노란색의 콜로니가 형성됨을 확인할 수 있었다.

이하 실험예 4 내지 6은 그람 음성균(gram negative bacteria) 및 그람 양성균(gram positive bacteria)과 색소를 발현하는 B. thuringiensis BT-001 균주의 혼재 시 콜로니의 색과 모양의 특징을 통해 B. thuringiensis BT-001 균주가 육안으로 명확히 구별되는지를 확인한 것이다.

구체적으로 실험예 4는 그람 음성균(gram negative bacteria)과 본 발명의 색소를 발현하는 B. thuringiensis BT-001 균주를 혼재한 경우를 확인하고자, 대표적인 그람 음성균인 대장균(Escherichia coli)과 실시예 1에서 제조된 B. thuringiensis BT-001 균주의 두 세균을 각각 LB 고체 평판배지에 도말하여 37℃에서 하룻밤 배양하고, 그 다음날 평판배지에서 자란 집락의 균체 각각을 하나의 5 ㎖ LB 액체 배지에 접종하여 37℃에서 회전진탕 배양하였다. 이를 적절하게 희석하여 LB 고체 배지에 도말하고 37℃에서 하룻밤 배양하였다.

그 결과, 도 7에서와 같이 빨간색 화살표가 가리킨 상대적으로 작은 콜로니를 형성하는 대장균(Escherichia coli)과 노란색 화살표로 가리킨 본 발명의 B. thuringiensis BT-001 균주의 콜로니 모양과 색이 명확하게 구별되어 나타났다.

실험예 5는 그람 양성균(gram positive bacteria)과 본 발명의 색소를 발현하는 B. thuringiensis BT-001 균주를 혼재한 경우로, 상기 실험예 4에서 그람음성 세균 대신 대표적인 그람양성 세균인 바실러스 세리우스(Bacillus cereus)를 사용한 것만 제외하고 실험예 4와 동일한 방법으로 수행하였다.

그 결과 도 8에 도시된 바와 같이, 파란색 화살표로 가리킨 하얀색의 콜로니를 갖는 바실러스 세리우스(Bacillus cereus)와 노란색 화살표로 가리킨 B. thuringiensis BT-001 균주 사이의 색이 명확하게 구별되어 나타났다.

실험예 6은 그람음성 세균, 그람양성 세균과 본 발명의 색소를 발현하는 B. thuringiensis BT-001 균주 모두가 혼재한 경우로, 그람음성 세균으로 대장균(Escherichia coli)과 그람양성 세균으로 바실러스 세리우스(Bacillus cereus)를 모두 사용한 것을 제외하고 실험예 4와 동일한 방법으로 수행하였다.

그 결과 도 9에 도시된 바와 같이, 파란색 화살표가 가리키는 콜로니는 바실러스 세리우스(Bacillus cereus)이며, 빨간색 화살표는 대장균(Escherichia coli) 콜로니를 가리키며, 노란색 화살표는 본 발명의 B. thuringiensis BT-001 균주로써, 도시된 바와 같이 본 발명의 B. thuringiensis BT-001 균주는 대장균(Escherichia coli)과 바실러스 세리우스(Bacillus cereus)의 콜로니 모양과 색이 명확하게 구별됨을 확인할 수 있었다.

실험예 7은 색소를 발현하는 B. thuringiensis BT-001 균주가 실제로 토양 미생물들과 혼재되었을 때 콜로니의 색과 모양의 특징을 통해 육안으로 명확히 구별되는지 확인한 것이다. 토양 미생물은 흙 10 g을 채취하여 멸균증류수 20 ml에 현탁한 다음, 큰 입자들을 제거하기 위해 Whatman 여과지로 2회 여과하고, 이를 원심분리로 농축하여 1.5 ml의 멸균증류수에 재현탁 후 포자 미생물만을 남기기 위해 70℃에서 30분간 열처리를 실시함으로 확보하였다. 이렇게 얻어진 토양 미생물을 적절하게 희석하여 B. thuringiensis BT-001 균주의 포자와 섞어 TSA 평판배지에 도말하고 30℃에서 하룻밤 배양하였다.

그 결과 도 10에 도시된 바와 같이, 노란색 화살표가 가리키는 진한 노란색을 나타내는 콜로니는 본 발명의 실시예에 따라 제조된 B. thuringiensis BT-001 균주로 이는 상기의 프라이머 C4312-F(5'-TGG GATTAACACATGTGGAACGAG-3', 서열번호 24)와 프라이머 C4312-R (5'-AGCAGCTGCAATAATTAAGAAATC-3', 서열번호 25)로 구성된 프라이머쌍을 이용한 콜로니 중합효소연쇄반응(colony PCR)으로 확인되었으며, 이로써 토양에서 발견되는 다양한 미생물들로부터 본 발명의 실시예에 따라 제조된 B. thuringiensis BT-001 균주가 육안으로 용이하게 구별됨을 확인할 수 있었다.

상기 결과들로부터 본 발명의 색소를 발현하는 B. thuringiensis BT-001 균주가 육안으로 쉽게 구별될 수 있는 진한 노란색의 콜로니 색을 나타냄으로 그람음성 세균인 대장균(Escherichia coli)과 그람양성 세균인 바실러스 세리우스(Bacillus cereus)와 혼재 시에도 쉽게 육안으로 구별되는 효과가 있으며, 실제 토양미생물과 혼재시에도 쉽게 육안으로 구별이 가능함을 확인하였다.

아울러 차세대 염기서열 분석(NGS)으로 색소 유전자인 crtM - crtN 유전자가 염색체의 BMB171_C4312 좌위에 삽입되었음을 확인하였고, 이는 바실러스 쑤린지엔시스(Bacillus thuringiensis) 균주 이외의 또 다른 바실러스 속 균주의 상동 유전자 좌위에 crtM - crtN 유전자를 삽입할 경우 색소 발현이 가능함을 알 수 있는 바, 이로부터 crtM - crtN 유전자를 이용한 모의작용제 제조 시 다른 세균에서도 유용하게 활용될 수 가능성이 있음을 확인하였다.

이상으로 본 발명의 실시예를 상세히 기술하였는바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자(이하 '당업자'라 한다)에게 있어서 이러한 구체적인 기술은 단지 용이하게 실시할 수 있도록 하는 바람직한 구현 예일 뿐이며, 이에 본 발명의 권리범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백하다. 따라서 본 발명의 기술적 사상을 벗어나지 않는 범위 내에서 여러 가지 치환, 변형 및 변경이 가능하다는 것은 당업자에게 있어 명백할 것이며, 당업자에 의해 용이하게 변경 가능한 부분도 본 발명의 권리범위에 포함됨은 자명하다.

한국생명공학연구원

KCTC18453P

20160229

<110> AGENCY FOR DEFENSE DEVELOPMENT <120> RECOMBINANT BACILLUS EXPRESSING PIGMENT AND METHOD FOR PREPARATION THEREOF <130> AD150174 <160> 26 <170> KopatentIn 2.0 <210> 1 <211> 2405 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> crtM-crtN <220> <221> RBS <222> (1)..(21) <220> <221> gene <222> (22)..(885) <223> crtM <220> <221> RBS <222> (886)..(896) <220> <221> gene <222> (897)..(2405) <223> crtN <400> 1 taaaagagat ggaggtaact tatgacaatg atggatatga attttaaata ttgtcataaa 60 atcatgaaga aacattcaaa aagcttttct tacgcttttg acttgttacc agaagatcaa 120 agaaaagcgg tttgggcaat ttatgctgtg tgtcgtaaaa ttgatgacag tatagatgtt 180 tatggcgata ttcaattttt aaatcaaata aaagaagata tacaatctat tgaaaaatac 240 ccatatgaac atcatcactt tcaaagtgat cgtagaatca tgatggcgct tcagcatgtt 300 gcacaacata aaaatatcgc ctttcaatct ttttataatc tcattgatac tgtatataaa 360 gatcaacatt ttacaatgtt tgaaacggac gctgaattat tcggatattg ttatggtgtt 420 gctggtacag taggtgaagt attgacgccg attttaagtg atcatgaaac acatcagaca 480 tacgatgtcg caagaagact tggtgaatcg ttgcaattga ttaatatatt aagagatgtc 540 ggtgaagatt ttgacaatga acggatatat tttagtaagc aacgattaaa gcaatatgaa 600 gttgatattg ctgaagtgta ccaaaatggt gttaataatc attatattga cttatgggaa 660 tattatgcag ctatcgcaga aaaagatttt caagatgtta tggatcaaat caaagtattt 720 agtattgaag cacaaccaat catagaatta gcagcacgta tatatattga aatactggac 780 gaagtgagac aggctaacta tacattacat gaacgtgttt ttgtggataa gcggaaaaag 840 gcaaagttgt ttcatgaaat aaatagtaaa tatcatagaa tataggtggt tgaataatga 900 agattgcagt aattggtgca ggtgtcacag gattagcagc ggcagcccgt attgcttctc 960 aaggtcatga agtgacgata tttgaaaaaa ataataatgt aggcgggcgt atgaatcaat 1020 taaagaaaga cggctttaca tttgatatgg gtcccacaat tgtcatgatg ccagatgttt 1080 ataaagatgt ttttacagcg tgtggtaaaa attatgaaga ttatattgaa ttgagacaat 1140 tacgttatat ttacgatgtg tattttgacc acgatgatcg tataacggtg cctacagatt 1200 tagctgaatt acagcaaatg ctagaaagta tagaacctgg ttcaacgcat ggttttatgt 1260 cctttttaac ggatgtttat aaaaaatatg aaattgcacg tcgctatttc ttagaaagaa 1320 cgtatcgcaa accgagtgac ttttataata tgacgtcact tgtgcaaggt gctaagttaa 1380 aaacgttaaa tcatgcagat cagctaattg aacattatat tgataacgaa aagatacaaa 1440 agcttttagc gtttcaaacg ttatacatag gaattgatcc aaaacgaggc ccgtcactat 1500 attcaattat tcctatgatt gaaatgatgt ttggtgtgca ttttattaaa ggcggtatgt 1560 atggcatggc tcaagggcta gcgcaattaa ataaagactt aggcgttaat attgaactaa 1620 atgctgaaat tgagcaaatt attattgatc ctaaattcaa acgggccgat gcgataaaag 1680 tgaatggtga cataagaaaa tttgataaaa ttttatgtac ggctgatttc cctagtgttg 1740 cggaatcatt aatgccagat tttgcaccta ttaaaaagta tccaccacat aaaattgcag 1800 acttagatta ctcttgttca gcatttttaa tgtatatcgg tatagatatt gatgtgacag 1860 atcaagtgag acttcataat gttatttttt cagatgactt tagaggcaat attgaagaaa 1920 tatttgaggg acgtttatca tatgatcctt ctatttatgt gtatgtacca gcggtcgctg 1980 ataaatcact tgcgccagaa ggcaaaactg gtatttatgt gctaatgccg acgccggaac 2040 ttaaaacagg tagcggaatc gattggtcag atgaagcttt gacgcaacaa ataaaggaaa 2100 ttatttatcg taaattagca acgattgaag tatttgaaga tataaaatcg catattgttt 2160 cagaaacaat ctttacgcca aatgattttg agcaaacgta tcatgcgaaa tttggttcgg 2220 cattcggttt aatgccaacc ttagcgcaaa gtaattatta tcgtccacaa aatgtatcgc 2280 gagattataa agatttatat tttgcaggtg caagtacgca tccaggtgca ggcgttccta 2340 ttgtcttaac gagtgcgaaa ataactgtag atgaaatgat taaagatatt gagcggggcg 2400 tataa 2405 <210> 2 <211> 864 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> crtM ORF <400> 2 atgacaatga tggatatgaa ttttaaatat tgtcataaaa tcatgaagaa acattcaaaa 60 agcttttctt acgcttttga cttgttacca gaagatcaaa gaaaagcggt ttgggcaatt 120 tatgctgtgt gtcgtaaaat tgatgacagt atagatgttt atggcgatat tcaattttta 180 aatcaaataa aagaagatat acaatctatt gaaaaatacc catatgaaca tcatcacttt 240 caaagtgatc gtagaatcat gatggcgctt cagcatgttg cacaacataa aaatatcgcc 300 tttcaatctt tttataatct cattgatact gtatataaag atcaacattt tacaatgttt 360 gaaacggacg ctgaattatt cggatattgt tatggtgttg ctggtacagt aggtgaagta 420 ttgacgccga ttttaagtga tcatgaaaca catcagacat acgatgtcgc aagaagactt 480 ggtgaatcgt tgcaattgat taatatatta agagatgtcg gtgaagattt tgacaatgaa 540 cggatatatt ttagtaagca acgattaaag caatatgaag ttgatattgc tgaagtgtac 600 caaaatggtg ttaataatca ttatattgac ttatgggaat attatgcagc tatcgcagaa 660 aaagattttc aagatgttat ggatcaaatc aaagtattta gtattgaagc acaaccaatc 720 atagaattag cagcacgtat atatattgaa atactggacg aagtgagaca ggctaactat 780 acattacatg aacgtgtttt tgtggataag cggaaaaagg caaagttgtt tcatgaaata 840 aatagtaaat atcatagaat atag 864 <210> 3 <211> 1521 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> crtN ORF <400> 3 atgaagattg cagtaattgg tgcaggtgtc acaggattag cagcggcagc ccgtattgct 60 tctcaaggtc atgaagtgac gatatttgaa aaaaataata atgtaggcgg gcgtatgaat 120 caattaaaga aagacggctt tacatttgat atgggtccca caattgtcat gatgccagat 180 gtttataaag atgtttttac agcgtgtggt aaaaattatg aagattatat tgaattgaga 240 caattacgtt atatttacga tgtgtatttt gaccacgatg atcgtataac ggtgcctaca 300 gatttagctg aattacagca aatgctagaa agtatagaac ctggttcaac gcatggtttt 360 atgtcctttt taacggatgt ttataaaaaa tatgaaattg cacgtcgcta tttcttagaa 420 agaacgtatc gcaaaccgag tgacttttat aatatgacgt cacttgtgca aggtgctaag 480 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gtttaatgcc aactttagcg caaagtaatt attatcgtcc acaaaatgta 1380 tcgcgagatt ataaagattt atattttgca ggtgcaagta cgcatccagg tgcagcgctt 1440 cctattgtct taacgagtgc gaaaataact gtagatgaaa tgattaaaga tattgagcgg 1500 gcgtataagg gagtagtcta a 1521 <210> 4 <211> 56 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> AD06-3 <400> 4 gggggggaat tctaaaagag atggaggtaa cttatgacaa tgatggatat gaattt 56 <210> 5 <211> 33 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> AD06-4 <400> 5 gggggggtcg acttatacgc cccgctcaat atc 33 <210> 6 <211> 9271 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> AD06 <220> <221> rep_origin <222> (1283)..(1635) <223> Temperature sensitive replication origin (from pUCTV2) <220> <221> gene <222> (2162)..(3538) <223> tetracycline resistance gene <220> <221> gene <222> (3796)..(4842) <223> himar1 transposase <220> <221> misc_feature <222> (4926)..(4952) <223> Inverted repeat <220> <221> misc_feature <222> (4953)..(4986) <223> FRT <220> <221> rep_origin <222> (5048)..(5636) <223> replication 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gcatcacacg caaaaaggaa attggaataa atgcgaaatt tgagatgtta attaaagacc 600 tttttgaggt ctttttttct tagatttttg gggttattta ggggagaaaa catagggggg 660 tactacgacc tcccccctag gtgtccattg tccattgtcc aaacaaataa ataaatattg 720 ggtttttaat gttaaaaggt tgttttttat gttaaagtga aaaaaacaga tgttgggagg 780 tacagtgatg gttgtagata gaaaagaaga gaaaaaagtt gctgttactt taagacttac 840 aacagaagaa aatgagatat taaatagaat caaagaaaaa tataatatta gcaaatcaga 900 tgcaaccggt attctaataa aaaaatatgc aaaggaggaa tacggtgcat tttaaacaaa 960 aaaagataga cagcactggc atgctgccta tctatgacta aattttgtta agtgtattag 1020 caccgttatt atatcatgag cgaaaatgta ataaaagaaa ctgaaaacaa gaaaaattca 1080 agaggacgta attggacatt tgttttatat ccagaatcag caaaagccga gtggttagag 1140 tatttaaaag agttacacat tcaatttgta gtgtctccat tacatgatag ggatactgat 1200 acagaaggta ggatgaaaaa agagcattat catattctag tgatgtatga gggtaataaa 1260 tcttatgaac agataaaaat aattacagaa gaattgaatg cgactattcc gcagattgca 1320 ggaagtgtga aaggtcttgt gagatatatg cttcacatgg acgatcctaa taaatttaaa 1380 tatcaaaaag 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ttttttagcg tattaaatga aatggttttg aacgtctcat tacctgatat 2280 tgcaaatgat tttaataaac cacctgcgag tacaaactgg gtgaacacag cctttatgtt 2340 aaccttttcc attggaacag ctgtatatgg aaagctatct gatcaattag gcatcaaaag 2400 gttactccta tttggaatta taataaattg tttcgggtcg gtaattgggt ttgttggcca 2460 ttctttcttt tccttactta ttatggctcg ttttattcaa ggggctggtg cagctgcatt 2520 tccagcactc gtaatggttg tagttgcgcg ctatattcca aaggaaaata ggggtaaagc 2580 atttggtctt attggatcga tagtagccat gggagaagga gtcggtccag cgattggtgg 2640 aatgatagcc cattatattc attggtccta tcttctactc attcctatga taacaattat 2700 cactgttccg tttcttatga aattattaaa gaaagaagta aggataaaag gtcattttga 2760 tatcaaagga attatactaa tgtctgtagg cattgtattt tttatgttgt ttacaacatc 2820 atatagcatt tcttttctta tcgttagcgt gctgtcattc ctgatatttg taaaacatat 2880 caggaaagta acagatcctt ttgttgatcc cggattaggg aaaaatatac cttttatgat 2940 tggagttctt tgtgggggaa ttatatttgg aacagtagca gggtttgtct ctatggttcc 3000 ttatatgatg aaagatgttc accagctaag tactgccgaa atcggaagtg taattatttt 3060 ccctggaaca 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cagatcaagt gagacttcat aatgttattt 1920 tttcagatga ctttagaggc aatattgaag aaatatttga gggacgttta tcatatgatc 1980 cttctattta tgtgtatgta ccagcggtcg ctgataaatc acttgcgcca gaaggcaaaa 2040 ctggtattta tgtgctaatg ccgacgccgg aacttaaaac aggtagcgga atcgattggt 2100 cagatgaagc tttgacgcaa caaataaagg aaattattta tcgtaaatta gcaacgattg 2160 aagtatttga agatataaaa tcgcatattg tttcagaaac aatctttacg ccaaatgatt 2220 ttgagcaaac gtatcatgcg aaatttggtt cggcattcgg tttaatgcca accttagcgc 2280 aaagtaatta ttatcgtcca caaaatgtat cgcgagatta taaagattta tattttgcag 2340 gtgcaagtac gcatccaggt gcaggcgttc ctattgtctt aacgagtgcg aaaataactg 2400 tagatgaaat gattaaagat attgagcggg gcgtataagt cgacgaagtt cctatacttt 2460 ctagagaata ggaacttcag accggggact tatcagccaa cctgtga 2507

Claims

서열번호 1로 표시되는 염기서열로 이루어진 스타필로코커스 아우레우스(Staphylococcus aureus) 유래의 crtM-crtN 유전자가 바실러스 속 균주 염색체의 BMB171_C4312 좌위에 삽입되어, 4,4'-디아포뉴로스포렌(4,4'-diaponeurosporene) 색소를 발현하는 것을 특징으로 하는 색소를 발현하는 바실러스 속 균주.
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제1항에 있어서,
상기 바실러스 속 균주는 바실러스 쑤린지엔시스(Bacillus thuringiensis), 바실러스 안트라시스(Bacillus anthracis), 바실러스 세레우스(Bacillus cereus), 바실러스 마이코이데스(Bacillus mycoides), 바실러스 토요넨시스(Bacillus toyonensis) 및 바실러스 위헨스테파넨시스(Bacillus weihenstephanensis)로 구성된 군으로부터 선택되는 어느 하나인 것을 특징으로 하는 색소를 발현하는 바실러스 속 균주.
제1항에 있어서,
상기 색소를 발현하는 바실러스 속 균주는 기탁번호가 KCTC18453P인 색소를 발현하는 바실러스 속 균주.
서열번호 1로 표시되는 crtM-crtN 유전자를 클로닝한 트란스포존 전달 벡터 및 FLP 재조합효소(FLP recombinase)를 코딩하는 유전자를 발현 벡터 내로 삽입한 항생제 저항성 유전자 제거용 FLP 재조합효소 발현 벡터를 제조하는 벡터 제조 단계;
상기 트란스포존 전달 벡터를 형질전환하여 트란스포존 돌연변이 방법으로 바실러스 속 균주 염색체의 BMB171_C4312 좌위에 crtM-crtN 유전자를 삽입하고 항생제가 포함된 배양배지에 배양하여 4,4'-디아포뉴로스포렌(4,4'-diaponeurosporene) 색소를 나타내는 재조합 바실러스 속 균주를 선별한 후 트란스포존 전달 벡터를 제거하는 단계;
상기 FLP 재조합효소 발현 벡터를 형질전환하여 FLP 재조합효소를 발현함으로 항생제 저항성 유전자를 제거하고 FLP 재조합효소 발현 벡터를 제거하는 단계;를 포함하는 것을 특징으로 하는 색소를 발현하는 바실러스 속 균주의 제조 방법.
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제6항에 있어서,
상기 바실러스 속 균주는 바실러스 쑤린지엔시스(Bacillus thuringiensis), 바실러스 안트라시스(Bacillus anthracis), 바실러스 세레우스(Bacillus cereus), 바실러스 마이코이데스(Bacillus mycoides), 바실러스 토요넨시스(Bacillus toyonensis) 및 바실러스 위헨스테파넨시스(Bacillus weihenstephanensis)로 구성된 군으로부터 선택되는 어느 하나인 것을 특징으로 하는 색소를 발현하는 바실러스 속 균주의 제조 방법.
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제6항 또는 제8항에 따른 제조 방법으로 제조된 바실러스 속 균주를 모의 작용제로 사용하는 것을 특징으로 하는 색소를 발현하는 모의 작용제.