CN108849774B - 一种阻断蚕蛾出茧的方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种阻断蚕蛾出茧的方法。本发明通过敲除溶茧酶基因，育成溶茧酶基因功能缺陷的纯合品系。育成之品系因丧失溶茧能力，致使蚕羽化成蛾后不能破茧而出，从源头上保护了蚕茧，可缓解因蛹期时间短而需要对鲜茧进行冷藏贮存或及时烘茧杀蛹处理所带来的时间压力及对人力、物力和能源等的消耗问题，以提高蚕桑生产效益，具有重要的应用价值。

Description

一种阻断蚕蛾出茧的方法

技术领域

本发明属于家蚕优良品种培育领域，涉及一种阻断蚕蛾出茧的方法。

背景技术

蚕业是中国的传统优势产业，已有5,000多年历史，至今遍及全国26个省区的1,000多个县，拥有1,200多万亩桑园，1,000万户蚕农，丝绸工业年产值逾1,000亿元，蚕农收入每年达200多亿元，是许多区域农民增收的支柱产业，特别是在扶贫攻坚的背景下，栽桑养蚕产茧更是起到了不可低估的作用。同时，中国蚕茧和蚕丝产量占世界总量的80％和70％左右，在国际市场上占有主导地位。

家蚕属于完全变态昆虫，一生经历卵、幼虫、蛹、成虫四个发育阶段大约50天左右的时间，其中经过约10-15天的蛹期阶段，蚕蛹变态为蚕蛾。蚕蛾羽化后会自行破茧而出，造成的破口茧不适合缫丝，因此生产中要赶在羽化前将蚕茧烘干，即烘茧，以便在不破坏蚕茧的情况下将蚕蛹杀死并除去水分用于储存，根据生产需要灵活安排缫丝时间，以此来减缓缫丝压力。然而，烘茧过程耗能之大亦不容忽视，且在高温烘烤时，不免会影响蚕丝蛋白而降低蚕丝的品质，造成解舒低下，影响后加工。可见，人为调控蛹期的发育及变态过程，对于提高蚕桑产业的生产效益是十分必要且迫切的，在此方面也有研究者进行了积极的探索。

如公开号为CN 102250932 B的中国发明专利公布说明书公开了一种控制家蚕蛹期发育的方法，发明者贡成良等人将家蚕核型多角体病毒(BmNPV)蜕皮甾体尿苷二磷酸葡糖转移酶基因(ecdysteroid UDP-glueosyhransferase，EGT)通过转基因导入家蚕体内，用蛹期特异表达的启动子诱导该基因在蛹期表达。因EGT可将UDP-半乳糖基或UDP-葡萄糖基转移给蜕皮激素继而使之失活，而蜕皮激素已被鉴定参与调控多个基因进而推动昆虫的生长、变态及性成熟过程。通过此方法诱导蛹期蜕皮激素水平下调，转基因品系在幼虫期发育正常，而蛹期时间可被延长8-10天。

BmKIT₃ ^R是东亚钳蝎神经毒素基因的一种，其表达产物-蝎毒素具有对昆虫专一选择性的神经麻痹致死作用。贡成良等人通过双元转基因系统，将BmKIT₃ ^R基因导入家蚕体内，在蛹期特异表达的溶茧酶基因的启动子PDP的驱动下诱导该基因在蛹期表达，引起蚕蛹自身的神经麻痹，中止蚕蛹发育，可使蛹期延长7-10天。

通过以上专利中的发明方法可以控制家蚕蛹期的发育，一定程度上延长蛹期的发育阶段，但目前还不足以达到不烘茧所需的时间长度。吐丝结茧是大多数鳞翅目昆虫的本能之一，为蛹期提供蔽护场所，用以防御和躲避敌害及不利环境。家蚕作为鳞翅目的模式生物，其老熟幼虫亦会寻找合适的场所进行泌丝并形成全封闭的茧，待蛹羽化为蛾，蛾分泌溶茧酶，经过吐出液的浸润使得茧层先端湿润，在溶茧酶的作用下分解丝素及部分丝胶，继而用胸足拨开松散的茧丝，蚕蛾即可脱茧而出(图1)。基于这一特殊的生理过程，我们设想可以通过敲除或敲低家蚕的溶茧酶基因，阻断蚕蛾出茧的生理过程，使蚕蛾丧失溶茧能力而困死于茧中，培育出茧层不破口的家蚕品种。基因敲低与基因敲除两种调控基因表达的分子生物学技术的兴起和发展有望使这一设想成为可能。

基因敲低(Gene knock-down)是通过降解具有同源序列靶基因的mRNA，达到降低或沉默基因表达的作用。在实际操作中，常采用一种具有高度特异性的转录后水平的基因沉默机制，即RNA干扰(RNA interference，RNAi)。在昆虫中，可以直接将制备的dsRNA(double strand RNA)、siRNA(small interfering RNA)和siRNA的表达载体形式shRNA(short hairpin RNA)注射进卵、血液系统、局部组织或直接添食等方式来诱导RNAi，或构建可遗传的转基因干涉系统。

基因组编辑技术是指在基因组水平上对目的基因序列甚至是单个核苷酸进行替换、删除，或插入外源DNA序列的基因工程技术。早期的基因组编辑技术主要依赖于同源重组(homologous recombination，HR)及干细胞全能性来完成对个体特定基因的改造，但因自发的同源重组的效率极低，且在基因组中会出现随机整合的现象而限制了其应用。靶向核酸酶的开发与应用为基因编辑带来了新的曙光，包括归巢核酸内切酶(meganucleases)、锌指核酸酶(zinc finger nucleases，ZFNs)、类转录激活效应子核酸酶(transcriptionactivator-like effector nucleases，TALENs)和成簇规律间隔短回文重复序列系统(clustered regularly interspaced short palindromic repeat/CRISPR-associatednuclease，CRISPR/Cas)，这类人工核酸酶均可在基因组的特定位点介导双链断裂(double-stranded break，DSB)，从而引发机体自身的修复机制-同源重组介导的修复(homology-directed repair，HDR)或非同源末端连接(non-homologous end joining，NHEJ)。存在同源序列(外源引入或同源染色体)的情况下，HDR修复方式可实现外源基因的插入即敲入(knock-in)或基因的靶向修复；没有同源序列存在的情况下，细胞趋向于NHEJ修复路径，这种修复方式虽然高效，但易出错，会出现小的插入或缺失，这些插入或缺失会导致基因发生移码突变，致使其mRNA降解或产生无功能的蛋白，实现基因敲除(knock-out)的目的。归巢核酸内切酶、ZFNs和TALEN均通过蛋白质-DNA的相互作用特异识别靶标序列，其中归巢核酸内切酶本身含有DNA结合结构域和切割结构域；ZFNs由特异性的DNA结合结构域-锌指结构域和非特异性的切割结构域-FokI核酸酶两部分融合而成；TALENs由用于DNA结合的类转录激活效应物(TALE)和FokI核酸酶组成，三者在靶向新的序列时都需要依据靶标序列重新设计蛋白。与这些可编程的核酸酶明显不同，CRISPR-Cas系统为RNA引导的核酸酶，即使用RNA分子(guide RNA)通过碱基互补配对实现与靶DNA的特异结合，简单地改变指导RNA序列的一部分即可使改造的CRISPR-Cas靶向与原间隔区相邻基序(PAM)相邻的基因组序列，而cas蛋白家族中的Cas9蛋白广泛的应用于该系统中，它具有HNH和RuvC两个核酸酶结构域，分别切割DNA的两条链。CRISPR/Cas9基因编辑系统具有操作简单、效率高、脱靶效率低等优点，是目前应用最为广泛的基因编辑技术。

CRISPR/Cas系统自被用于基因编辑以来，其发展日新月异，不同来源的Cas蛋白不断被发掘并利用，相应蛋白的变体也在不断的开发中，如来源于金黄色酿脓葡萄球菌的SaCas9，其分子量仅为酿脓链球菌SpCas9分子量的2/3，较小的分子量更易操作也易于导入细胞内；SpCas9的变体dCas9丧失了DNA切割活性，但与gRNA结合后仍可与特异的DNA序列相结合，利用该特性，将不同功能的原件与之融合可实现对靶标基因的激活、抑制或进行表观遗传修饰，对基因的表达进行精细的调控。

CRISPR/Cas系统的两个组分Cas蛋白和gRNA可以用DNA(两者各自的表达载体或共表达载体)、RNA(体外分别转录为mRNA)和蛋白复合物(CAS蛋白和gRNA)等形式通过多种方式导入机体或细胞内，如直接注射、化学试剂转染、电转等方法。除此之外，还可分别构建Cas蛋白和gRNA的转基因系，通过两者间的杂交实现对靶标基因的敲除，而且通过时空特异表达的启动子诱导Cas蛋白的表达还可实现对靶基因的条件性敲除。为实现对溶茧酶基因的敲除，考虑到在表型观察及筛选过程中的便利性，选取来源于酿脓链球菌的SpCas9，并分别构建Cas9与靶标溶茧酶基因的gRNA的转基因系，通过系统间杂交达到敲除溶茧酶基因的目的。

发明内容

有鉴于此，本发明的目的之一在于提供一种敲除或敲低家蚕溶茧酶基因阻断蚕蛾出茧的方法；本发明的目的之二在于提供敲除或敲低家蚕溶茧酶基因在制备阻断家蚕蛾出茧的家蚕品种中的应用。

为实现上述发明目的，本发明提供如下技术方案：

1.一种阻断蚕蛾出茧的家蚕品种，所述家蚕品种通过敲除或敲低家蚕溶茧酶基因获得，所述家蚕溶茧酶基因如SEQ ID NO.3所示。

优选的，所述敲除或敲低家蚕溶茧酶基因方法为转基因干涉，ZFNs、TALENs和CRISPR/Cas9或其变体介导溶茧酶基因的敲除或表达量的下调敲低。

优选的，所述敲除或敲低家蚕溶茧酶基因由CRISPR/Cas系统介导。更优选的，所述敲除或敲低家蚕溶茧酶基因由Cas9与靶标溶茧酶基因sgRNA表达载体构成的双元转基因系统介导。

2.敲除或敲低家蚕溶茧酶基因阻断蚕蛾出茧的方法，构建基于piggyBac的Cas9表达载体，并制备Cas9转基因家蚕；然后构建靶标溶茧酶基因的sgRNA表达载体，并制备sgRNA转基因家蚕；接着将sgRNA转基因家蚕和Cas9转基因家蚕进行杂交、荧光筛选不可再继续产生编辑的个体进行PCR分型检测，筛选到杂合体，杂合体自交，经过对突变序列的分型检测及克隆测序鉴定出后代中的纯合突变个体，扩大饲养，继而获得阻断蚕蛾出茧的品系。

优选的，所述基于piggyBac的Cas9表达载体由以下方法构建：以SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2所述序列为引物扩增IE1启动子，然后将扩增产物用Ngo MIV和Kpn I酶切后连入经同样酶切的pCS7-Cas9载体，获得pCS7-{IE1-Cas9}中间载体，使用酶切位点Ngo MIV和Not I将Cas9的完整表达盒切下，经平末端连接于由Asc I线性化的piggyBac-{3xp3-EGFP}载体中，获得基于piggyBac的Cas9表达载体，命名为piggyBac-{3xp3-EGFP，IE1-Cas9}。

优选的，所述sgRNA序列由SEQ ID NO.5和SEQ ID NO.6所示核苷酸序列退火后形成双链，然后克隆至Bbs I线性化的PUC57-{BmU6-gRNA}载体中，获得PUC57-{BmU6-gRNAC2}中间载体，然后将PUC57-{BmU6-gRNAC2}中间载体经Age I和Sac II切下后经平末端连接于piggyBac-{3xp3-DsRED}经Bgl II线性化的空载中，终获得sgRNA表达载体，命名为piggyBac-{3xp3-DsRED，BmU6-gRNAC2}表达载体。

优选的，所述荧光筛选不可再继续产生编辑的个体为筛选眼部带有红色和绿色荧光的双元转基因个体，将F1代中双元转基因个体自交或双元转基因个体与非转基因个体进行杂交获得其后代F2，选取F2代中仅携带红色荧光或仅携带绿色荧光的个体。

优选的，所述PCR分型检测为将筛选的个体饲养至蛾羽化，提取蚕蛾的翅基因组，用SEQ ID NO.7和SEQ ID NO.8所示序列为引物进行测序，测序峰图于PAM基序附近出现套峰，即为杂合体。

3.敲除或下调家蚕溶茧酶基因在制备阻断家蚕蛾出茧的家蚕品种中的应用，所述家蚕溶茧酶基因如SEQ ID NO.3所示。

本发明的有益效果在于：本发明公开了一种阻断蚕蛾出茧的方法及其家蚕品种，即通过敲除或敲低家蚕溶茧酶基因，育成溶茧酶基因功能缺失的纯合品系。育成之品系因丧失溶茧能力，致使蚕羽化成蛾后不能破茧而出，从源头上保护了蚕茧，可缓解因蛹期时间短而需要对鲜茧进行冷藏贮存加工或及时进行烘茧处理所带来的时间压力及对人力、物力和能源等的消耗问题，以提高蚕桑生产效益，具有重要的应用价值。

附图说明

为了使本发明的目的、技术方案和有益效果更加清楚，本发明提供如下附图进行说明：

图1为蚕蛾破茧过程图片(A：茧层破口；B：蚕蛾脱茧中；C：蚕蛾脱茧完成)。

图2为构建成功的Cas9表达载体骨架图。

图3为溶茧酶基因靶位点与sgRNA scaffold的序列及最终的表达载体骨架图。

图4为双元转基因阳性个体图片(a：白光下拍摄图片；b：绿色荧光标记的Cas9转基因个体；c：红色荧光标记的sgRNA转基因个体)。

图5为杂合个体测序峰图。

图6为纯合突变个体的序列鉴定及测序峰图(a：序列鉴定结果；b：测序峰图)。

图7为纯合突变个体的表型图(a：正常家蚕蛾羽化脱茧后形成的蛾口茧；b：纯合突变不破口的茧；c：茧壳内羽化的蚕蛾)。

具体实施方式

下面将结合附图，对本发明的优选实施例进行详细的描述。实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，例如分子克隆实验指南(第三版，J.萨姆布鲁克等著)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。

实施例1 Cas9稳定转基因系的获得

将来自北京唯尚立德生物科技有限公司的pCS7-Cas9原始表达载体进行改造，用BmNP-V极早期蛋白IE1的启动子替换原pCMV启动子，具体方法如下：扩增引物为IE1-1：5'-gcgcgccggcatcaatgtctttgtgatgcgc-3'(SEQ ID NO.1，下划线为Ngo MIV限制性内切酶位点)和IE1-2：5'-gcgcggtaccttgcgtcatagtcgtttggtt-3'(SEQ ID NO.2，下划线为Kpn I限制性内切酶位点)。扩增产物用Ngo MIV和Kpn I酶切后与pCS7-Cas9载体经过同样酶切的载体骨架连接，获得pCS7-{IE1-Cas9}中间载体。使用酶切位点Ngo MIV和Not I将Cas9的完整表达盒经平末端连接于piggyBac-{3xp3-EGFP}载体中，其中piggyBa-c载体由Asc I限制性内切酶进行线性化，最终获得piggyBac-{3xp3-EGFP，IE1-Cas9}表达载体，如图2所示。

已构建成功的piggyBac-{3xp3-EGFP，IE1-Cas9}表达载体与helper质粒以1:1的比例混合后经显微注射注入家蚕卵中，记为G0代。所述家蚕卵为非滞育卵，且在产卵2h内进行注射。注射后的卵经催青并饲养至蛾羽化(图4中a)，G0代自交产生G1代，对G1代进行绿色荧光的筛查，眼部表现绿色荧光的即为成功表达Cas9的转基因个体，如图4中b所示。

实施例2 sgRNA稳定转基因系的获得

从GenBank(EF428980)获得家蚕溶茧酶基因的cDNA全长序列(SEQ ID NO.3)，并在CRISPRdirect网站依据GN₁₉NGG的规则设计其sgRNA位点，获得的sgRNA位点序列为gaaactattggtttccgggtggg(SEQ ID NO.4，ggg为PAM基序)。合成序列sg-C2F(SEQ ID NO.5，5'-aagtgaaactattggtttccgggt-3')与sg-C2R(SEQ ID NO.6，5'–aaacacccggaaaccaatagtttc-3')，上、下游引物经过变性及梯度退火过程形成寡核苷酸链，随后克隆至经Bbs I线性化的PUC57-{BmU6-gRNA}载体(BmU6启动子及gRNA scaffold序列由公司合成并克隆于PUC57-simple载体中，两者间由两个Bbs I内切酶连接，用于靶位点的无缝连接，SEQ ID NO.7)中，获得PUC57-{BmU6-gRNA_C2}中间载体。完整的gRNA表达盒经AgeI和Sac II切下后经平末端连接于piggyBac-{3xp3-DsRED}空载中，其中piggyBac载体由Bgl II限制性内切酶进行线性化，最终获得piggyBac-{3xp3-DsRED,BmU6-gRNA_C2}表达载体。图3即为sgRNA转录后的示意图与表达载体结构图。

已构建成功的gRNA表达载体与helper质粒以1:1的比例混合后经显微注射注入家蚕卵中，记为G0代，所述家蚕卵为非滞育卵，且在产卵2h内进行注射。注射后的卵经催青并饲养至蛾羽化，雌雄自交产生G1代，其中眼部表现红色荧光的即为成功表达gRNA的转基因个体，如图4中c所示。

实施例3杂合突变体的获得

将实施例1和2获得的Cas9转基因个体与gRNA转基因个体进行杂交，获得后代F1。根据红色和绿色荧光的存在情况，F1代中存在4种类型：眼部仅携带红色荧光的Cas9转基因个体、眼部仅携带绿色荧光的gRNA转基因个体、眼部带有红色和绿色荧光的双元转基因个体以及不携带荧光蛋白标记的个体，其中双元转基因个体为敲除溶茧酶基因的嵌合体。

杂合突变个体通过如下方式获得：将F1代中双元转基因个体自交或双元转基因个体与非转基因个体进行杂交(本实施例为F1代中双元转基因个体间进行自交)获得其后代F2，为后续筛选的方便及品系的固定，选取F2代中非双元转基因的个体(不可再继续产生编辑)，即仅携带红色荧光、仅携带绿色荧光或者不携带荧光蛋白标记的个体进行后续筛选(本实施例以仅携带红色荧光的个体进行说明)。筛选F2代中仅携带红色荧光的个体，并将之以新鲜桑叶饲养至蛾羽化，剪取蚕蛾的翅提取基因组，剪去翅之后的蚕蛾做好标记后保存于4℃环境下留待制种。用检测引物C2F-5'ggtggctcatccgaaatacaat3'(SEQ ID NO.8)和C2R-5'ttctcgaccttattacgttcgaag3'(SEQ ID NO.9)对位点处的序列进行分型检测，并将扩增产物进行测序分析。若为杂合个体，其扩增产物的测序结果鉴定为杂合，在测序峰图中于PAM基序附近出现套峰，如图5所示。值得注意的是，本实施例中的检测引物必须特异，无非特异性扩增现象出现，其PCR产物可直接用于测序分析。

实施例4纯合突变体的获得

将实施例3中鉴定到的杂合样品所对应的蚕蛾个体从4℃中取出，雌雄间杂交获得F3代，从中即可鉴定到溶茧酶基因敲除的纯合突变个体。鉴定方法为PCR产物测序和克隆测序相结合，具体实施步骤如下：F3代个体饲养至蚕蛾羽化，剪取蚕蛾的翅提取基因组，剪去翅之后的蚕蛾则在做好标记后保存于4℃环境下留待制种；用实施例3中的检测引物以提取的基因组为模板对位点处的序列进行扩增、测序；对于测序结果鉴定为杂合的样品进行T-A克隆，挑取单菌落进行菌检后，将阳性菌送去测序以鉴定其为杂合还是纯合。依照此方法，在本实施例中鉴定到的溶茧酶敲除的纯合突变体的序列形式为：与正常序列相比，纯合突变的序列在PAM基序附近缺失1bp和7bp，如图6中a所示，b为对应的测序峰图。

实施例5纯合突变体的表型观察

纯合突变品系用新鲜的桑叶进行饲养，并在饲养过程中进行观察，发现，突变体均能正常地吐丝结茧；待上蔟10天左右，可观察到正常家蚕品系的蚕蛾脱茧而出，而突变品系未见破茧而出的蚕蛾；至第二天，正常家蚕品系的蚕蛾均已破茧而出，留下蛾口茧，如图7中a所示，而突变品系仍未见到破茧而出的蚕蛾，如图7中b所示，用刀片小心削开茧壳，发现茧内为羽化的家蚕蛾，如图7中c所示，说明突变体可成功羽化为蛾，但因其溶茧酶基因受到破坏，而使蚕蛾丧失溶茧能力，不能破茧而出，与预期一致。

本发明实施例中以Cas9介导靶标溶茧酶基因敲除或敲低，本领域技术人员公知，只要能够敲除或敲低溶茧酶基因的任何手段均可实现本发明的发明目的，如：转基因干涉，ZFNs、TALENs和CRISPR/Cas9或其变体介导靶标溶茧酶基因的敲除或敲低。

最后说明的是，以上优选实施例仅用以说明本发明的技术方案而非限制，尽管通过上述优选实施例已经对本发明进行了详细的描述，但本领域技术人员应当理解，可以在形式上和细节上对其作出各种各样的改变，而不偏离本发明权利要求书所限定的范围。

序列表

<110> 西南大学

<120> 一种阻断蚕蛾出茧的方法

<160> 9

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 31

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial sequence )

<400> 1

gcgcgccggc atcaatgtct ttgtgatgcg c 31

<210> 2

<211> 31

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial sequence )

<400> 2

gcgcggtacc ttgcgtcata gtcgtttggt t 31

<210> 3

<211> 1046

<212> DNA

<213> 家蚕(Bombyx mori)

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<213> 人工序列(Artificial Sequence)

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<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

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gttaagggat tttggtcatg agattatcaa aaaggatctt cacctagatc cttttaaatt 2340

aaaaatgaag ttttaaatca atctaaagta tatatgagta aacttggtct gacagttacc 2400

aatgcttaat cagtgaggca cctatctcag cgatctgtct atttcgttca tccatagttg 2460

cctgactccc cgtcgtgtag ataactacga tacgggaggg cttaccatct ggccccagtg 2520

ctgcaatgat accgcgagac ccacgctcac cggctccaga tttatcagca ataaaccagc 2580

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ttaattgttg ccgggaagct agagtaagta gttcgccagt taatagtttg cgcaacgttg 2700

ttgccattgc tacaggcatc gtggtgtcac gctcgtcgtt tggtatggct tcattcagct 2760

ccggttccca acgatcaagg cgagttacat gatcccccat gttgtgcaaa aaagcggtta 2820

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ttatggcagc actgcataat tctcttactg tcatgccatc cgtaagatgc ttttctgtga 2940

ctggtgagta ctcaaccaag tcattctgag aatagtgtat gcggcgaccg agttgctctt 3000

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cgatgtaacc cactcgtgca cccaactgat cttcagcatc ttttactttc accagcgttt 3180

ctgggtgagc aaaaacagga aggcaaaatg ccgcaaaaaa gggaataagg gcgacacgga 3240

aatgttgaat actcatactc ttcctttttc aatattattg aagcatttat cagggttatt 3300

gtctcatgag cggatacata tttgaatgta tttagaaaaa taaacaaata ggggttccgc 3360

gcacatttcc ccgaaaagtg ccacctgacg tctaagaaac cattattatc atgacattaa 3420

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<210> 8

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 8

ggtggctcat ccgaaataca at 22

<210> 9

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 9

ttctcgacct tattacgttc gaag 24

Claims (4)

1.敲除或敲低家蚕溶茧酶基因阻断蚕蛾出茧的方法，其特征在于：构建基于piggyBac的Cas9表达载体，并制备Cas9转基因家蚕；然后构建靶标溶茧酶基因的sgRNA表达载体，并制备sgRNA转基因家蚕；将sgRNA转基因家蚕和Cas9转基因家蚕进行杂交、荧光筛选不可再继续产生编辑的个体进行PCR分型检测，筛选到杂合体，杂合体自交，经过对突变序列的分型检测及克隆测序鉴定出后代中的纯合突变个体，扩大饲养，继而获得阻断家蚕蛾出茧的品系；

所述基于piggyBac的Cas9表达载体由以下方法构建：以SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2所述序列为引物扩增IE1启动子，然后将扩增产物用Ngo MIV和Kpn I酶切后连入经同样酶切的pCS7-Cas9载体，获得pCS7-{IE1-Cas9} 中间载体，使用酶切位点Ngo MIV和Not I将Cas9的完整表达盒切下，经平末端连接于由Asc I线性化的 piggyBac-{3xp3-EGFP} 载体中，获得基于piggyBac的Cas9表达载体，命名为piggyBac-{3xp3-EGFP，IE1-Cas9}；所述sgRNA表达载体的序列由SEQ ID NO.5和SEQ ID NO.6所示核苷酸序列退火后形成双链，然后克隆至Bbs I线性化的 PUC57-{BmU6-gRNA} 载体中，获得PUC57-{BmU6-gRNA_C2}中间载体，然后将PUC57-{BmU6-gRNA_C2}中间载体经Age I和Sac II切下后经平末端连接于 piggyBac-{3xp3-DsRED}经Bgl II线性化的空载中，获得sgRNA表达载体，命名为 piggyBac-{3xp3- DsRED，BmU6-gRNA_C2}表达载体。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述筛选不可再继续产生编辑的个体的方法为筛选眼部带有红色和绿色荧光的双元转基因个体，将F1代中双元转基因个体自交或双元转基因个体与非转基因个体进行杂交获得其后代F2，选取F2代中仅携带红色荧光或仅携带绿色荧光的个体或不携带荧光蛋白标记的个体。

3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述PCR分型检测为将筛选的不可再继续产生编辑的个体饲养至蛾羽化，提取蚕蛾的翅基因组，用SEQ ID NO.7和SEQ ID NO.8所示序列为引物进行测序，测序峰图于PAM基序附近出现套峰，即为杂合体；杂合体自交，经过对溶茧酶基因序列的克隆鉴定，获得茧酶基因敲除的纯合突变个体，继而扩大饲养，获得阻断蚕蛾出茧的家蚕品系。

4.权利要求1-3任一项所述的方法在制备阻断家蚕蛾出茧的家蚕品种中的应用，其特征在于：所述家蚕溶茧酶基因如SEQ ID NO.3所示。

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