KR102176556B1 - 스쿠알렌 생산이 증대된 균주 및 이를 이용한 스쿠알렌 생산방법 - Google Patents

Abstract

본 발명은 C6 징크 클러스터 전사인자의 활성이 감소 또는 불활성화된, 스쿠알렌 생산이 증대된 재조합 미생물 및 이를 이용한 스쿠알렌 생산 방법에 관한 것이다. 본 발명의 스쿠알렌 생산이 증대된 재조합 미생물은 효모의 대사 경로 내 탄소 흐름(carbon-flux)을 변화시켜, 기존 비변형 균주에 비해 고수율의 스쿠알렌 생산이 가능하다.

Description

스쿠알렌 생산이 증대된 균주 및 이를 이용한 스쿠알렌 생산방법{Strain with increased squalene production and method for producing squalene using the same}

본 발명은 C6 징크 클러스터 전사인자의 활성이 감소 또는 불활성화된, 스쿠알렌 생산이 증대된 재조합 미생물 및 이를 이용한 스쿠알렌 생산방법에 관한 것이다.

스쿠알렌은 탄소 30개, 수소 50개가 여섯 개의 이중 결합으로 연결된 트리테르페노이드(triterpenoid)계의 불포화 탄화수소로 인체와 동식물성 유지에 함유되어 있다. 심해상어 간유(肝油)에 특히 많이 함유되어 있으며 올리브오일, 야자유, 밀배아유 등에도 함유되어 있고, 인체 내에서는 아세틸보조효소 A로부터 메발론산을 거쳐 합성되며(도 1), 콜레스테롤, 생식 호르몬, 비타민 D, 담즙산 생산 등에 사용되는 것으로 알려져 있다(비특허문헌 1).

스쿠알렌은 항산화 작용의 기능성이 인정되어 있다. 기능성을 나타내는 정확한 기전은 아직 밝혀지지 않았으나, Senthilkumar S et al.은 시클로포스파미드(cyclophosphamide)로 손상을 가한 쥐에게 스쿠알렌을 섭취시킨 결과, 심장 조직과 적혈구에서 항산화 관련 효소가 증가하며, 조직 손상 시 방출되는 효소는 혈액에서는 감소하고 심장 조직에서는 증가한다고 보고되었다(비특허문헌 2). 또한, 건강한 남자대학생 13명을 대상으로 하여 4주 동안 10g의 스쿠알렌을 섭취시킨 연구에서 스쿠알렌 섭취 후 지질과산화물인 MDA가 감소하는 것이 관찰되었다(비특허문헌 3). 이상의 결과들을 종합하여, 스쿠알렌은 항산화 효소를 증가시키고 과산화물을 감소시키는 등의 항산화 작용을 할 수 있는 것으로 여겨진다.

스쿠알렌은 상어 간에서 추출하기도 하나 효모를 통해 생합성하기도 한다. Chang et al.은 다량의 스쿠알렌과 몇몇 다가불포화 지방산을 생성하는 야생형 효모, 슈도지마(Pseudozyma) 속 JCC207의 발견을 개시한다(비특허문헌 4). 미국 특허 5,460,949호는 효모에서 스쿠알렌의 축적 및 특정 스테롤을 증가시키는 방법을 개시하며 스쿠알렌 및 스테롤 축적은 HMG-CoA 환원효소 활성을 갖는 폴리펩타이드를 코딩하는 유전자의 발현 수준을 증가시킴으로써 증가된다는 것이 개시된다. 효모는 일반적으로 안전한 생물체로, 약학적으로 이용하기 유용하다. 게다가, 스쿠알렌은 병원체, 프리온 및 환경 독소에 의한 오염없이 제조될 수 있는데, 예를 들면, 효모는 선천적으로 수은이 없다. 백신 분야에서 효모는 이미 이용되고 있으며(예: B형 간염 바이러스 표면 항원의 재조합 발현을 위해 이용), 어떤 특정한 조절 염려가 없으므로, 즉 효모 유래 스쿠알렌은 특히 면역학적 아쥬번트 제조에 사용되기에 적당하다. 최종적으로 효모 배양 기술은 널리 퍼져 있고 기술이전이 용이하다.

이러한 배경하에서, 본 발명자들은 효모 유래 유전자 조절을 통해서 균주의 스쿠알렌 생산량이 획기적으로 향상됨을 확인함으로써 본 발명을 완성하였다.

George C K et al., Measurement of cholesterol synthesis in man by isotope kinetic squalene. Proc Nat Acad Sci 72(11):4612-4616, 1975년. Senthilkumar S et al., Attenuation of cyclophosphamide induced toxicity by squalene in experimental rats. Chem Biol Interact 160:252-260, 2006년. 박현 외. 스쿠알렌 복용이 혈액성분과 항산화 기능에 미치는 영향. 운동영양학회지 6(3):197-203, 2002년. Chang et al., The isolation and characterization of Pseudozyma sp. JCC 207, a novel producer of squalene. Appl . Microbiol . Biotechnol . , 2008, 78, 963-72.

본 발명의 하나의 목적은 C6 징크 클러스터 전사인자(C6 zinc cluster transcription factor)의 활성이 감소 또는 불활성화된, 스쿠알렌 생산이 증대된 재조합 미생물을 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 C6 징크 클러스터 전사인자의 활성이 감소 또는 불활성화된, 스쿠알렌 생산이 증대된 재조합 미생물을 배지에서 배양하는 단계를 포함하는, 스쿠알렌 생산방법을 제공하는 것이다.

이를 구체적으로 설명하면 다음과 같다. 한편, 본 발명에서 개시된 각각의 설명 및 실시형태는 각각의 다른 설명 및 실시 형태에도 적용될 수 있다. 즉, 본 발명에서 개시된 다양한 요소들의 모든 조합이 본 발명의 범주에 속한다. 또한, 하기 기술된 구체적인 서술에 의하여 본 발명의 범주가 제한된다고 볼 수 없다.

상기 목적을 달성하기 위한 본 발명의 하나의 양태는, C6 징크 클러스터 전사인자(C6 zinc cluster transcription factor)의 활성이 감소 또는 불활성화된, 스쿠알렌 생산이 증대된 재조합 미생물을 제공하는 것이다.

본 발명에서 용어, "스쿠알렌(squalene)"은 트리테르페노이드(triterpenoid)계의 불포화 탄화수소로 인체와 동식물성 유지에 함유되어 있다. 심해상어 간유(肝油)에 특히 많이 함유되어 있으며 올리브오일, 야자유, 밀배아유 등에도 함유되어 있고, 인체 내에서는 아세틸보조효소 A로부터 메발론산을 거쳐 합성되며(도 1), 콜레스테롤, 생식 호르몬, 비타민 D, 담즙산 생산 등에 사용되는 것으로 알려져 있다.

본 발명에서 용어, "C6 징크 클러스터 전사인자(C6 zinc cluster transcription factor)"는 다양한 균주에서 탄소원-반응 요소(carbon source-responsive element, CSRE)를 포함하는 포도당신생합성(gluconeogenesis) 관련 유전자의 발현에 관여하는 전사인자로써, 포도당신생합성 유전자의 CSRE에 결합하여 포도당신생합성을 상향 조절하는데 관여한다. 상기 전사인자는 다양한 종류가 존재하며, 예를 들면, 사카로마이세스 세레비지에(Saccharomyces cerevisiae) 유래의 SIP4, Gal4p, Leu3p, Hap1p, Put3p 및 Cha4p, 아스퍼질러스(Aspergillus) 유래의 qutA 및 amdR, 뉴로스포라(Neurospora) 유래의 nit4, 쉬조사카로미세스 폼베(Schizosaccharomyces pombe) 유래의 Ntf1 등이 있다(Schjerling P et al. Nucleic Acids Res. 1996 Dec 1;24(23):4599-607.). 이 중, SIP4는 Snf1p 단백질 키아나제(protein kinase)에 의해 조절되며, 주로 핵 내에 위치하는 것으로 알려져 있다.

본 발명에서 용어, "포도당신생합성(gluconeogenesis)"은 해당과정(glycolysis)의 역반응을 의미한다. SIP4를 통한 포도당신생합성 조절은 관련 유전자 발현의 억제 해제(derepression), 즉 활성화를 통해 이루어진다고 알려져 있으며, 그 과정은 도 2에 나타낸 바와 같다. 카나아제인 Snf1과 단백질 복합체를 이루는 Snf4와 Sip1(혹은, Sip2 또는 Gal83)이 결합하여 CAT8 유전자의 발현을 억제하고 있던 Mig1 효소의 활성을 억제한다. Snf1의 단백질 복합체는 발효당(fermentable sugar)에 의해 활성 억제되므로, 세포 내의 발효당 농도가 낮을 경우 CAT8 유전자의 발현이 이루어진다. CAT8 효소는 SIP4 효소의 발현을 활성화시키며, SIP4 효소와 함께 포도당신생합성 유전자들의 발현을 활성화시킨다.

상기 C6 징크 클러스터 전사인자는 구체적으로, 서열번호 1의 아미노산 서열을 포함하는 단백질일 수 있다. 상기 서열번호 1의 아미노산 서열을 포함하는 단백질은 서열번호 1의 아미노산 서열을 가지는 단백질, 서열번호 1의 아미노산 서열로 구성되는 단백질과 혼용하여 사용될 수 있다.

본 발명에서 상기 서열번호 1은 C6 징크 클러스터 전사인자 활성을 갖는 아미노산 서열을 의미한다. 구체적으로, 상기 서열번호 1은 sip4 유전자에 의해 코딩되는 C6 징크 클러스터 전사인자 활성을 갖는 단백질 서열이다. 상기 sip4 유전자는 서열번호 2의 염기서열로 이루어진 것일 수 있으나, 이로 제한되지 않는다. 상기 서열번호 1의 아미노산 또는 서열번호 2의 염기는 공지의 데이터 베이스인 NCBI의 GenBank에서 그 서열을 얻을 수 있다. 일 예로, 효모 유래일 수 있으나, 이에 제한되지 않으며 상기 아미노산 또는 염기와 동일한 활성을 갖는 서열은 제한 없이 포함될 수 있다. 또한, 본 발명에서의 C6 징크 클러스터 전사인자 활성을 갖는 단백질은 비록 서열번호 1의 아미노산을 포함하는 단백질이라고 정의하였으나, 서열번호 1의 아미노산 서열 앞뒤로의 무의미한 서열 추가 또는 자연적으로 발생할 수 있는 돌연변이, 혹은 이의 잠재성 돌연변이(silent mutation)를 제외하는 것이 아니며, 서열번호 1의 아미노산 서열을 포함하는 단백질과 서로 동일 또는 상응하는 활성을 가지는 경우라면, 본 발명의 C6 징크 클러스터 전사인자에 해당됨은 당업자에게 자명하다. 구체적으로, 본 발명의 C6 징크 클러스터 전사인자는 서열번호 1의 아미노산 서열 또는 이와 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 이상의 상동성 또는 동일성을 갖는 아미노산 서열로 구성되는 단백질일 수 있다. 또한, 이러한 상동성 또는 동일성을 가지며 상기 단백질에 상응하는 효능을 나타내는 아미노산 서열이라면, 일부 서열이 결실, 변형, 치환 또는 부가된 아미노산 서열을 갖는 단백질도 본 발명의 변이 대상이 되는 단백질의 범위 내에 포함됨은 자명하다.

즉, 본 발명에서 '특정 서열번호로 기재된 아미노산 서열을 갖는 단백질 또는 폴리펩티드', '특정 서열번호로 기재된 아미노산 서열을 포함하는 단백질 또는 폴리펩티드'라고 기재되어 있다 하더라도, 해당 서열번호의 아미노산 서열로 이루어진 폴리펩티드와 동일 혹은 상응하는 활성을 가지는 경우라면, 일부 서열이 결실, 변형, 치환 또는 부가된 아미노산 서열을 갖는 단백질도 본 발명에서 사용될 수 있음은 자명하다. 예를 들면, '서열번호 1의 아미노산 서열로 이루어진 폴리펩티드'는, 이와 동일 혹은 상응하는 활성을 가지는 경우라면 '서열번호 1의 아미노산 서열로 이루어진 폴리펩티드'에 속할 수 있음은 자명하다.

본 발명에서 용어 '상동성(homology)' 또는 '동일성(identity)'은 두 개의 주어진 아미노산 서열 또는 염기서열과 관련된 정도를 의미하며 백분율로 표시될 수 있다. 용어, 상동성 및 동일성은 종종 상호교환적으로 이용될 수 있다.

보존된 (conserved) 폴리뉴클레오티드 또는 폴리펩티드의 서열 상동성 또는 동일성은 표준 배열 알고리즘에 의해 결정되며, 사용되는 프로그램에 의해 확립된 디폴트 갭 페널티가 함께 이용될 수 있다. 실질적으로, 상동성을 갖거나 (homologous) 또는 동일한 (identical) 서열은 일반적으로 서열 전체 또는 전체-길이의 적어도 약 50%, 60%, 70%, 80% 또는 90%를 따라 중간 또는 높은 엄격한 조건(stringent conditions)에서 하이브리드할 수 있다. 하이브리드화는 폴리뉴클레오티드에서 코돈 대신 축퇴 코돈을 함유하는 폴리뉴클레오티드 또한 고려된다.

임의의 두 폴리뉴클레오티드 또는 폴리펩티드 서열이 상동성, 유사성 또는 동일성을 갖는지 여부는, 예를 들면, Pearson et al (1988)[Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85]: 2444에서와 같은 디폴트 파라미터를 이용하여 "FASTA" 프로그램과 같은 공지의 컴퓨터 알고리즘을 이용하여 결정될 수 있다. 또는, EMBOSS 패키지의 니들만 프로그램(EMBOSS: The European Molecular Biology Open Software Suite, Rice et al., 2000, Trends Genet. 16: 276-277)(버전 5.0.0 또는 이후 버전)에서 수행되는 바와 같은, 니들만-운치(Needleman-Wunsch) 알고리즘(Needleman and Wunsch, 1970, J. Mol. Biol. 48: 443-453)이 사용되어 결정될 수 있다(GCG 프로그램 패키지 (Devereux, J., et al, Nucleic Acids Research 12: 387 (1984)), BLASTP, BLASTN, FASTA (Atschul, [S.] [F.,] [ET AL, J MOLEC BIOL 215]: 403 (1990); Guide to Huge Computers, Martin J. Bishop, [ED.,] Academic Press, San Diego,1994, 및 [CARILLO ETA/.](1988) SIAM J Applied Math 48: 1073을 포함한다). 예를 들면, 국립 생물공학 정보 데이터베이스 센터의 BLAST, 또는 ClustalW를 이용하여 상동성, 유사성 또는 동일성을 결정할 수 있다.

폴리뉴클레오티드 또는 폴리펩티드의 상동성, 유사성 또는 동일성은, 예를 들면, Smith and Waterman, Adv. Appl. Math (1981) 2:482 에 공지된 대로, 예를 들면, Needleman et al. (1970), J Mol Biol. 48:443과 같은 GAP 컴퓨터 프로그램을 이용하여 서열 정보를 비교함으로써 결정될 수 있다. 요약하면, GAP 프로그램은 두 서열 중 더 짧은 것에서의 기호의 전체 수로, 유사한 배열된 기호(즉, 뉴클레오티드 또는 아미노산)의 수를 나눈 값으로 정의한다. GAP 프로그램을 위한 디폴트 파라미터는 (1) 일진법 비교 매트릭스(동일성을 위해 1 그리고 비-동일성을 위해 0의 값을 함유함) 및 Schwartz and Dayhoff, eds., Atlas Of Protein Sequence And Structure, National Biomedical Research Foundation, pp. 353-358 (1979)에 의해 개시된 대로, Gribskov et al(1986) Nucl. Acids Res. 14: 6745의 가중된 비교 매트릭스 (또는 EDNAFULL(NCBI NUC4.4의 EMBOSS 버전) 치환 매트릭스); (2) 각 갭을 위한 3.0의 페널티 및 각 갭에서 각 기호를 위한 추가의 0.10 페널티 (또는 갭 개방 패널티 10, 갭 연장 패널티 0.5); 및 (3) 말단 갭을 위한 무 페널티를 포함할 수 있다.

또한, 임의의 두 폴리뉴클레오티드 또는 폴리펩티드 서열이 상동성, 유사성 또는 동일성을 갖는지 여부는 정의된 엄격한 조건하에서 써던 혼성화 실험에 의해 서열을 비교함으로써 확인할 수 있으며, 정의되는 적절한 혼성화 조건은 해당 기술 범위 내이고, 당업자에게 잘 알려진 방법(예컨대, J. Sambrook et al., Molecular Cloning, A Laboratory Manual, 2nd Edition, Cold Spring Harbor Laboratory press, Cold Spring Harbor, New York, 1989; F.M. Ausubel et al., Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, Inc., New York)으로 결정될 수 있다.

본 발명에서 용어, "폴리뉴클레오티드"는 뉴클레오티드 단위체(monomer)가 공유결합에 의해 길게 사슬모양으로 이어진 뉴클레오티드의 중합체(polymer)로 일정한 길이 이상의 DNA 또는 RNA 가닥으로서, 보다 구체적으로는 상기 변이체를 코딩하는 폴리뉴클레오티드 단편을 의미한다.

본 발명의 C6 징크 클러스터 전사인자를 코딩하는 유전자 또는 폴리뉴클레오티드는, 본 발명의 C6 징크 클러스터 전사인자를 코딩하는 폴리뉴클레오티드 서열이라면 제한없이 포함될 수 있다. 본 발명에서 C6 징크 클러스터 전사인자의 아미노산 서열을 코딩하는 유전자는 sip4 유전자이며, 상기 유전자는 효모 유래일 수 있으나, 이로 제한되는 것은 아니다. 또한, 상기 유전자는 서열번호 1의 아미노산 서열을 코딩하는 염기서열일 수 있으며, 구체적으로는 서열번호 2의 염기서열로 이루어질 수 있으나, 이로 제한되지 않는다.

구체적으로, 본 발명의 폴리뉴클레오티드는 코돈의 축퇴성(degeneracy)으로 인하여 또는 상기 폴리펩티드를 발현시키고자 하는 생물에서 선호되는 코돈을 고려하여, 폴리펩티드의 아미노산 서열을 변화시키지 않는 범위 내에서 코딩 영역에 다양한 변형이 이루어질 수 있다. 또한 공지의 유전자 서열로부터 조제될 수 있는 프로브, 예를 들면, 상기 염기서열의 전체 또는 일부에 대한 상보 서열과 엄격한 조건 하에 하이드리드화하여, C6 징크 클러스터 전사인자를 코딩하는 서열이라면 제한없이 포함될 수 있다. 상기 "엄격한 조건(stringent condition)"이란 폴리뉴클레오티드 간의 특이적 혼성화를 가능하게 하는 조건을 의미한다. 이러한 조건은 문헌(예컨대, J. Sambrook et al., 상동)에 구체적으로 기재되어 있다. 예를 들면, 상동성 또는 동일성이 높은 유전자끼리, 40% 이상, 구체적으로는 90% 이상, 보다 구체적으로는 95% 이상, 더욱 구체적으로는 97% 이상, 특히 구체적으로는 99% 이상의 상동성 또는 동일성을 갖는 유전자끼리 하이브리드화하고, 그보다 상동성 또는 동일성이 낮은 유전자끼리 하이브리드화하지 않는 조건, 또는 통상의 써던 하이브리드화(southern hybridization)의 세척 조건인 60℃, 1ХSSC, 0.1% SDS, 구체적으로는 60℃, 0.1ХSSC, 0.1% SDS, 보다 구체적으로는 68℃, 0.1ХSSC, 0.1% SDS에 상당하는 염 농도 및 온도에서, 1회, 구체적으로는 2회 내지 3회 세정하는 조건을 열거할 수 있다.

혼성화는 비록 혼성화의 엄격도에 따라 염기 간의 미스매치 (mismatch)가 가능할지라도, 두 개의 핵산이 상보적 서열을 가질 것을 요구한다. 용어, "상보적"은 서로 혼성화가 가능한 뉴클레오티드 염기 간의 관계를 기술하는데 사용된다. 예를 들면, DNA에 관하여, 아데노신은 티민에 상보적이며 시토신은 구아닌에 상보적이다. 따라서, 본 발명은 또한 실질적으로 유사한 핵산 서열뿐만 아니라 전체 서열에 상보적인 단리된 핵산 단편을 포함할 수 있다.

구체적으로, 상동성 또는 동일성을 가지는 폴리뉴클레오티드는 55℃의 Tm 값에서 혼성화 단계를 포함하는 혼성화 조건을 사용하고 상술한 조건을 사용하여 탐지할 수 있다. 또한, 상기 Tm 값은 60℃, 63℃ 또는 65℃일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니고 그 목적에 따라 당업자에 의해 적절히 조절될 수 있다.

폴리뉴클레오티드를 혼성화하는 적절한 엄격도는 폴리뉴클레오티드의 길이 및 상보성 정도에 의존하고 변수는 해당기술분야에 잘 알려져 있다(Sambrook et al., supra, 9.50-9.51, 11.7-11.8 참조).

본 발명에서 용어, "단백질 활성의 감소 또는 불활성화"는 상기 미생물이 내재적 또는 변형 전에 나타내는 단백질의 활성과 비교하였을 때, 그 활성이 내재적 활성에 비하여 약화되거나, 감소되거나, 없는 것을 모두 포함하는 개념이다. 상기 감소 또는 불활성화는 단백질의 활성이 약화되도록 변이된 것일 수 있고, 상기 변이는 비자연적으로 발생된 것일 수 있고, 유전적 변이를 포함하는 것일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

구체적으로, 본 발명에서 단백질 활성의 감소 또는 불활성화는 상기 단백질을 코딩하는 염색체상의 유전자의 전체 또는 일부를 결실시키는 방법; 상기 단백질의 활성이 감소되도록 돌연변이된 유전자로, 염색체상의 상기 단백질을 코딩하는 유전자를 대체하는 방법; 상기 단백질을 코딩하는 염색체상의 유전자의 발현 조절 서열에 변이를 도입하는 방법; 상기 단백질을 코딩하는 유전자의 발현 조절 서열을 활성이 약하거나 없는 서열로 교체하는 방법; 상기 염색체상의 유전자의 전사체에 상보적으로 결합하여 상기 mRNA로부터 단백질로의 번역을 저해하는 안티센스 올리고뉴클레오티드를 도입하는 방법; 상기 단백질을 코딩하는 유전자의 SD 서열 앞단에 SD 서열과 상보적인 서열을 인위적으로 부가하여 2차 구조물을 형성시켜 리보솜(ribosome)의 부착이 불가능하게 만드는 법 및 해당 서열의 ORF(open reading frame)의 3' 말단에 역전사되도록 프로모터를 부가하는 RTE(Reverse transcription engineering) 방법으로 이루어지는 군에서 선택되는 어느 하나 이상의 방법으로 수행될 수 있으나, 이에 제한되지 않으며, 단백질 활성을 감소 또는 불활성화시키는 방법이라면 어떠한 것이라도 적용될 수 있음은 당업자에게 자명하다. 본 발명의 목적상, 상기 단백질은 C6 징크 클러스터 전사인자일 수 있다. 상기 "내재적 활성"은 자연적, 또는 인위적 요인에 의한 유전적 변이로 미생물의 형질이 변화하는 경우, 형질 변화 전 모균주가 본래 가지고 있던 특정 단백질의 활성을 의미한다.

본 발명에서 용어 "비변형 미생물"은 미생물에 자연적으로 발생할 수 있는 돌연변이를 포함하는 균주를 제외하는 것이 아니며, 천연형 균주 자체이거나, 상기 단백질의 결실 또는 과발현을 포함하지 않는 미생물, 상기 단백질을 결실 또는 과발현하도록 제작된 벡터로 형질전환되지 않은 미생물, 또는 형질전환 등의 변형 전 미생물을 의미한다.

본 발명에서 상기 C6 징크 클러스터 전사인자의 활성이 감소 또는 불활성화된, 스쿠알렌 생산이 증대된 재조합 미생물은, 상기 C6 징크 클러스터 전사인자를 코딩하는 유전자를 결손한 벡터로 형질전환되어 제조되는 재조합 미생물일 수 있으나, 이로 제한되지 않는다.

본 발명에서 용어 "형질전환"은 표적 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 결손한 벡터 또는 표적 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 벡터를 숙주세포 내에 도입하여 숙주세포 내에서 상기 폴리뉴클레오티드가 코딩하는 단백질이 결손 또는 발현(과발현)할 수 있도록 하는 것을 의미한다. 상기 형질전환하는 방법에는 열충격(heat shock), 리튬 아세테이트 처리 또는 전기천공법(Electroporation) 등이 있으나, 이로 제한되지 않으며, 공지되어 있는 형질전환 방법이라면 제한 없이 사용할 수 있다.

형질전환된 폴리뉴클레오티드는 숙주세포 내에서 발현될 수 있기만 한다면, 숙주세포의 염색체 내에 삽입되어 위치하거나 염색체 외에 위치하거나 상관없이 이들 모두를 포함할 수 있다. 또한, 상기 폴리뉴클레오티드는 표적 단백질을 코딩하는 DNA 및 RNA를 포함한다. 상기 폴리뉴클레오티드는 숙주세포 내로 도입되어 발현될 수 있는 것이면, 어떠한 형태로 도입되는 것이든 상관없다. 예를 들면, 상기 폴리뉴클레오티드는 자체적으로 발현되는데 필요한 모든 요소를 포함하는 유전자 구조체인 발현 카세트 (expression cassette)의 형태로 숙주세포에 도입될 수 있다. 상기 발현 카세트는 통상 상기 폴리뉴클레오티드에 작동 가능하게 연결되어 있는 프로모터 (promoter), 전사 종결신호, 리보좀 결합부위 및 번역 종결신호를 포함할 수 있다. 상기 발현 카세트는 자체 복제가 가능한 발현 벡터 형태일 수 있다. 또한, 상기 폴리뉴클레오티드는 그 자체의 형태로 숙주세포에 도입되어 숙주세포에서 발현에 필요한 서열과 작동 가능하게 연결되어 있는 것일 수도 있으며, 이에 한정되지 않는다.

또한, 상기에서 용어 "작동 가능하게 연결"된 것이란 본 발명의 목적 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드의 전사를 개시 및 매개하도록 하는 프로모터 서열과 상기 유전자 서열이 기능적으로 연결되어 있는 것을 의미한다.

본 발명에서 사용된 용어 "벡터"는 적합한 숙주 내에서 목적 폴리펩티드를 발현시킬 수 있도록 적합한 조절 서열에 작동 가능하게 연결된 상기 목적 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드의 염기서열을 함유하는 DNA 제조물을 의미한다. 상기 조절 서열은 전사를 개시할 수 있는 프로모터, 그러한 전사를 조절하기 위한 임의의 오퍼레이터 서열, 적합한 mRNA 리보좀 결합부위를 코딩하는 서열, 및 전사 및 해독의 종결을 조절하는 서열을 포함할 수 있다. 벡터는 적당한 숙주세포 내로 형질전환된 후, 숙주 게놈과 무관하게 복제되거나 기능할 수 있으며, 게놈 그 자체에 통합될 수 있다.

본 발명에서 사용되는 벡터는 숙주세포 내에서 복제 가능한 것이면 특별히 한정되지 않으며, 당업계에 알려진 임의의 벡터를 이용할 수 있다. 통상 사용되는 벡터의 예로는 천연 상태이거나 재조합된 상태의 플라스미드, 코스미드, 바이러스 및 박테리오파지를 들 수 있다. 예를 들면, 파지 벡터 또는 코스미드 벡터로서 pWE15, M13, MBL3, MBL4, IXII, ASHII, APII, t10, t11, Charon4A, 및 Charon21A 등을 사용할 수 있으며, 플라스미드 벡터로서 pRS416, pRS426, pRS415, pRS425, YEp13, YEp24, YCp50, pBR계, pUC계, pBluescriptII계, pGEM계, pTZ계, pCL계 및 pET계 등을 사용할 수 있다.

일례로 세포 내 염색체 삽입용 벡터를 통해 염색체 내에 목적 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 염색체 내로 삽입할 수 있다. 상기 폴리뉴클레오티드의 염색체 내로의 삽입은 당업계에 알려진 임의의 방법, 예를 들면, 상동재조합(homologous recombination)에 의하여 이루어질 수 있으나, 이에 한정되지는 않는다. 상기 염색체 삽입 여부를 확인하기 위한 선별 마커(selection marker)를 추가로 포함할 수 있다. 선별 마커는 벡터로 형질전환된 세포를 선별, 즉 목적 핵산 분자의 삽입 여부를 확인하기 위한 것으로, 약물 내성, 영양 요구성, 세포 독성제에 대한 내성 또는 표면 폴리펩티드의 발현과 같은 선택가능 표현형을 부여하는 마커들이 사용될 수 있다. 선택제(selective agent)가 처리된 환경에서는 선별 마커를 발현하는 세포만 생존하거나 다른 표현 형질을 나타내므로, 형질전환된 세포를 선별할 수 있다.

본 발명에서 용어, "스쿠알렌 생산이 증대된 재조합 미생물"은 자연적 또는 인위적으로 유전적 변형이 일어난 미생물을 모두 포함하며, 외부 유전자가 삽입되거나 내재적 유전자의 활성이 강화되거나 불활성화되는 등의 원인으로 인해서 특정 기작이 약화되거나 강화된 미생물로서, 목적하는 스쿠알렌 생산을 위하여 유전적 변이가 일어나거나 활성을 강화시킨 미생물일 수 있다. 본 발명의 목적상, 상기 스쿠알렌울 생산하는 미생물은 상기 C6 징크 클러스터 전사인자를 코딩하는 유전자를 결손하여, C6 징크 클러스터 전사인자의 활성을 감소 또는 불활성화시킴으로써, 배지 중의 탄소원으로부터 목적하는 스쿠알렌을 야생형이나 비변형 미생물과 비교하여 과량으로 생산할 수 있는 미생물을 의미할 수 있다. 구체적으로, C6 징크 클러스터 전사인자를 코딩하는 유전자인 sip4 유전자를 결손시킴으로써 포도당신생합성 관련 유전자의 발현을 억제하여 해당(Glycolysis), 피루브산 탈수소효소 우회 (pyruvate dehydrogenase Bypass, PDH Bypass), 메발론산염(Mevalonate) 경로를 지나 에르고스테롤(Ergosterol) 생합성 경로로 이어지는 효모의 대사 경로 내 탄소 흐름(carbon-flux)을 변화시킬 수 있으며, 그 결과 글리세롤 및 에탄올의 생산량이 증가하고, 축적된 글리세롤 및 에탄올은 세포 성장 및 스쿠알렌 생산에 사용되어, 스쿠알렌 생산이 증대된다. 본 발명에서 상기 "스쿠알렌 생산이 증대된 재조합 미생물"은 "스쿠알렌 생산능을 갖는 미생물" 또는 "스쿠알렌 생산 미생물"과 혼용되어 사용될 수 있다.

본 출원의 목적상 상기 C6 징크 클러스터 전사인자의 활성이 감소 또는 불활성화된 재조합 미생물의 경우, 스쿠알렌 생산량이 증가하는 것을 특징으로 한다. 이는 야생형 또는 비변형 미생물이 스쿠알렌을 생산하지 못하거나, 스쿠알렌을 생산하더라도 미량을 생산할 수 있는 것에 반해, 본 발명의 유전자 발현 조절을 통해 스쿠알렌 생산량을 증가시킬 수 있다는 것에 의의가 있다.

상기 스쿠알렌 생산이 증대된 재조합 미생물은 스쿠알렌을 생산할 수 있다면 그 종류가 특별히 제한되지 않으나, 구체적으로 효모일 수 있고, 보다 구체적으로 피치아 파스토리스(Pichia pastoris), 사카로마이세스 세레비지에(Saccharomyces cerevisiae), 쉬조사카로마세스(Schizosaccharomyces), 뉴로스포라 크라사(Neurosporacrassa) 등일 수 있고, 보다 구체적으로는 사카로마이세스 세레비지에일 수 있으나, 스쿠알렌을 생산할 수 있는 효모에 속하는 미생물은 제한 없이 포함될 수 있다.

또한, 본 발명에서 상기 C6 징크 클러스터 전사인자의 활성이 감소 또는 불활성화된 재조합 미생물의 모균주는 스쿠알렌을 생산하는 미생물이라면 특별히 제한되지 않으며, 상기 스쿠알렌을 생산하는 미생물은 스쿠알렌의 생산량을 증가시키기 위해, 스쿠알렌의 생합성 경로를 약화시키는 유전자를 불활성화시키거나, 및/또는 스쿠알렌의 생합성 경로 또는 스쿠알렌의 전구체 생산을 강화시킨 미생물일 수 있다.

상기 미생물의 모균주는 β-하이드록시 β-메틸글루타릴-CoA 환원효소(β-Hydroxy β-methylglutaryl-CoA reductase) 및 파르네실 피로포스페이트 합성효소(Farnesyl pyrophosphate synthetase) 중 어느 하나 이상의 단백질의 활성을 추가로 강화시킨 것일 수 있으나, 이로 제한되지 않는다.

구체적으로, 상기 미생물의 모균주는 포스포리보실안트라닐레이트 이소머라아제(Phosphoribosylanthranilate isomerase), 3-이소프로필말레이트 탈수소효소(3-isopropylmalate dehydrogenase) 및 이미다졸글리세롤-포스페이트 탈수효소(Imidazoleglycerol-phosphate dehydratase)가 불활성화되어 있는 효모(Saccharomyces cerevisiae) CEN.PK2-1D 야생형 균주[(MATα ura3-52; trp1-289; leu2-3,112; his3△ AL2-8; SUC2) EUROSCARF accession number: 30000B]일 수 있으나, 이로 제한되지 않는다.

상기 미생물의 모균주는 스쿠알렌의 생합성 경로 또는 스쿠알렌의 전구체 생산을 강화하기 위해, 상기 불활성화된 포스포리보실안트라닐레이트 이소머라아제, 3-이소프로필말레이트 탈수소효소 및 이미다졸글리세롤-포스페이트 탈수효소 위치에 β-하이드록시 β-메틸글루타릴-CoA 환원효소(β-Hydroxy β-methylglutaryl-CoA reductase) 및 파르네실 피로포스페이트 합성효소(Farnesyl pyrophosphate synthetase) 중 어느 하나 이상의 단백질을 삽입하여 이들의 활성을 강화시킬 수 있으며, 상기 유전자의 발현 강화를 위해 유전자의 상위 영역에 강한 프로모터를 도입하거나 유전자 변이를 도입할 수 있으나, 이로 제한되지 않는다.

또한, 스쿠알렌에 대한 피드백 저해를 해제시키거나, 스쿠알렌 관련 오페론 발현을 증가시키거나, 스쿠알렌 유사체에 대한 내성을 부여하는 방법 등을 사용할 수 있다. 그러나, 이에 제한되지 않고 당업계에 공지된 유전자 발현 조절 방법으로 스쿠알렌 생산능을 강화할 수 있다.

즉, 상기 C6 징크 클러스터 전사인자의 활성이 감소 또는 불활성화된 재조합 미생물의 모균주는 포스포리보실안트라닐레이트 이소머라아제, 3-이소프로필말레이트 탈수소효소, 이미다졸글리세롤-포스페이트 탈수효소의 활성을 감소 또는 불활성화시키고; β-하이드록시 β-메틸글루타릴-CoA 환원효소 및 파르네실 피로포스페이트 합성효소 중 어느 하나 이상의 단백질의 활성을 강화시킨 것을 더 포함하는 것일 수 있으며, 바람직하게는 포스포리보실안트라닐레이트 이소머라아제를 코딩하는 유전자를 결손하고 β-하이드록시 β-메틸글루타릴-CoA 환원효소를 코딩하는 유전자를 포함하는 벡터, 3-이소프로필말레이트 탈수소효소를 코딩하는 유전자를 결손하고 파르네실 피로포스페이트 합성효소를 코딩하는 유전자를 포함하는 벡터 및 이미다졸글리세롤-포스페이트 탈수효소를 코딩하는 유전자를 결손하고 β-하이드록시 β-메틸글루타릴-CoA 환원효소를 코딩하는 유전자를 포함하는 벡터로 이루어지는 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상의 벡터로 형질전환된 것일 수 있고, 더욱 바람직하게는 상기 3종의 벡터로 모두 형질전환된 것일 수 있으나, 이로 제한되지 않는다.

또한, 상기 C6 징크 클러스터 전사인자의 활성이 감소 또는 불활성화된 재조합 미생물의 모균주는 상기 벡터로 형질전환된 것뿐만 아니라, β-하이드록시 β-메틸글루타릴-CoA 환원효소 및 파르네실 피로포스페이트 합성효소를 코딩하는 유전자가 유전체 내에 삽입된 것을 포함할 수 있으며, 이로 제한되지 않는다. 상기 유전체 내에 삽입된 β-하이드록시 β-메틸글루타릴-CoA 환원효소 및 파르네실 피로포스페이트 합성효소를 코딩하는 유전자는 카피수가 하나 이상일 수 있으며, 이로 제한되지 않는다.

구체적으로, 상기 포스포리보실안트라닐레이트 이소머라아제, 3-이소프로필말레이트 탈수소효소 및 이미다졸글리세롤-포스페이트 탈수효소의 활성을 감소 또는 불활성화시키고; β-하이드록시 β-메틸글루타릴-CoA 환원효소 및 파르네실 피로포스페이트 합성효소 중 어느 하나 이상의 단백질의 활성을 강화시킨 것을 더 포함하는 미생물은, 상기 C6 징크 클러스터 전사인자의 활성이 감소 또는 불활성화된, 스쿠알렌 생산이 증대된 재조합 미생물의 모균주일 수 있다.

상기 β-하이드록시 β-메틸글루타릴-CoA 환원효소(β-Hydroxy β-methylglutaryl-CoA reductase) 및 파르네실 피로포스페이트 합성효소(Farnesyl pyrophosphate synthetase) 중 어느 하나 이상의 단백질의 활성을 강화시키는 것은, 상기 재조합 미생물의 모균주에 전술한 바와 같은 변이를 도입한 것일 수 있고, 또는 C6 징크 클러스터 전사인자의 활성이 감소 또는 불활성화된 재조합 미생물에 전술한 바와 동일한 방법으로 추가로 변이를 도입한 것일 수 있으나, 이로 제한되지 않는다.

본 발명에서 용어, "포스포리보실안트라닐레이트 이소머라아제(Phosphoribosylanthranilate isomerase)"은 트립토판 생합성에 관여하는 단백질로, 포스포리보실안트라닐레이트 이성질체를 화학식은 같으나 구조식이 다른 이성질체로 변화시키는 과정을 촉매하는 효소를 의미한다. 상기 포스포리보실안트라닐레이트 이소머라아제는 구체적으로, trp1 유전자에 의해 코딩되는 포스포리보실안트라닐레이트 이소머라아제 활성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 단백질일 수 있으며, 상기 아미노산 서열은 서열번호 3으로 이루어진 것일 수 있으나, 이로 제한되지 않는다. 또한, 상기 trp1 유전자는 서열번호 4의 염기서열로 이루어지는 것일 수 있으나, 이로 제한되지 않는다.

본 발명에서 용어, "3-이소프로필말레이트 탈수소효소(3-isopropylmalate dehydrogenase)"는 류신(leucine) 생합성 및 글리옥실산염 사이클(glyoxylate cycle)에 관여하는 단백질로, 베타(beta)-이소프로필말레이트 탈수소효소로도 명명되며, 베타(beta)-이소프로필말레이트의 알파-케토이소카프로에이트(alpha-ketoisocaproate)로의 전환을 촉매하는 것으로 알려져 있다. 상기 3-이소프로필말레이트 탈수소효소는 구체적으로, leu2 유전자에 의해 코딩되는 3-이소프로필말레이트 탈수소효소 활성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 단백질일 수 있으며, 상기 아미노산 서열은 서열번호 5로 이루어진 것일 수 있으나, 이로 제한되지 않는다. 또한, 상기 leu2 유전자는 서열번호 6의 염기서열로 이루어지는 것일 수 있으나, 이로 제한되지 않는다.

본 발명에서 용어, "이미다졸글리세롤-포스페이트 탈수효소(Imidazoleglycerol-phosphate dehydratase)"는 히스티딘 생합성의 제 6 단계를 촉매하는 단백질로, 이에 발생된 돌연변이는 히스티딘 영양 요구성 및 Cu, Co 및 Ni 염에 대한 민감성 등을 유발할 수 있다. 상기 3-이미다졸글리세롤-포스페이트 탈수효소는 구체적으로, his3 유전자에 의해 코딩되는 이미다졸글리세롤-포스페이트 탈수효소 활성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 단백질일 수 있으며, 상기 아미노산 서열은 서열번호 7로 이루어진 것일 수 있으나, 이로 제한되지 않는다. 또한, 상기 his3 유전자는 서열번호 8의 염기서열로 이루어지는 것일 수 있으나, 이로 제한되지 않는다.

본 발명에서 용어, "β-하이드록시 β-메틸글루타릴-CoA 환원효소(β-Hydroxy β-methylglutaryl-CoA reductase)"는 메발론산 경로 및 케톤체생성 경로의 대사 중간생성물인 β-하이드록시 β-메틸글루타릴-CoA(β-hydroxy β-methylglutaryl-CoA, HMG-CoA) 또는 3-하이드록시 3-메틸글루타릴-CoA(3-hydroxy 3-methylglutaryl-CoA)를 환원시키는 효소를 의미한다. 상기 β-하이드록시 β-메틸글루타릴-CoA 환원효소는 구체적으로, tHMG1 유전자에 의해 코딩되는 β-하이드록시 β-메틸글루타릴-CoA 환원효소 활성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 단백질일 수 있으며, 상기 아미노산 서열은 서열번호 9으로 이루어진 것일 수 있으나, 이로 제한되지 않는다. 또한, 상기 tHMG1 유전자는 서열번호 10의 염기서열로 이루어지는 것일 수 있으나, 이로 제한되지 않는다.

본 발명에서 용어, "파르네실 피로포스페이트 합성효소(Farnesyl pyrophosphate synthetase)"는 이소프레노이드(isoprenoid) 및 스테롤(sterol) 생합성을 위한 C15 파르네실 피로포스페이트 단위의 형성을 촉매하는 효소로, 디메틸알릴트랜스퍼라제(dimethylallyltranstransferase) 및 게라닐트랜스 전이 효소(geranyltranstransferase) 활성을 모두 가진다. 상기 파르네실 피로포스페이트 합성효소는 구체적으로, ERG20 유전자에 의해 코딩되는 파르네실 피로포스페이트 합성효소 활성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 단백질일 수 있으며, 상기 아미노산 서열은 서열번호 11로 이루어진 것일 수 있으나, 이로 제한되지 않는다. 또한, 상기 ERG20 유전자는 서열번호 12의 염기서열로 이루어지는 것일 수 있으나, 이로 제한되지 않는다.

상기 아미노산 또는 유전자는 공지의 데이터 베이스인 NCBI의 GenBank에서 그 서열을 얻을 수 있다. 일 예로, 효모 유래일 수 있으나, 이에 제한되지 않으며, 상기 아미노산 또는 유전자와 동일한 활성을 갖는 서열은 제한 없이 포함될 수 있다. 상기 아미노산 서열 또는 염기서열에 대해서는 전술한 바와 같다.

또한, 상기 아미노산 서열 또는 염기서열을 갖는 상기 단백질, 이를 코딩하는 유전자 또는 폴리뉴클레오타이드 및 이의 상동성에 대해서는 전술한 바와 같다.

본 발명에서 용어, "단백질 활성의 강화"는 상기 미생물이 내재적 또는 변형 전에 나타내는 단백질의 활성과 비교하였을 때, 그 활성이 내재적 활성에 비하여 증가 또는 향상된 것을 모두 포함하는 개념이다. 상기 강화는 단백질이 미생물 내에 도입되거나, 미생물 내에서 발현되도록 변형된 상태를 의미하는 것일 수 있고, 상기 단백질이 미생물 내 존재하는 유전자 또는 단백질인 경우 내재적 또는 변형 전에 비하여 그 활성이 증가된 상태를 의미한다. 상기 "단백질의 도입"은, 미생물이 본래 가지고 있지 않았던 특정 단백질의 활성을 나타나게 되는 것 또는 해당 단백질의 내재적 활성 또는 변형 전 활성에 비하여 향상된 활성을 나타나게 되는 것을 의미한다. 예를 들면, 특정 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드가 미생물 내 염색체로 도입되거나, 특정 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 벡터가 미생물 내로 도입되어 이의 활성이 나타나는 것일 수 있다. 상기 "내재적 활성"은 자연적, 또는 인위적 요인에 의한 유전적 변이로 미생물의 형질이 변화하는 경우, 형질 변화 전 모균주가 본래 가지고 있던 특정 단백질의 활성을 의미한다.

구체적으로, 본 발명에 따른 단백질의 활성 강화는 상기 단백질을 코딩하는 유전자의 세포 내 카피수 증가; 상기 단백질을 코딩하는 유전자의 발현 조절 서열에 변이를 도입하는 방법; 상기 단백질을 코딩하는 유전자 발현 조절 서열을 활성이 강력한 서열로 교체하는 방법; 상기 단백질의 활성이 강화되도록 상기 단백질을 코딩하는 유전자에 변이를 추가적으로 도입시키는 방법; 및 미생물에 단백질을 도입하는 방법으로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상의 방법으로 이루어질 수 있으나, 이에 제한되지 않으며, 단백질 활성을 강화시키는 방법이라면 어떠한 것이라도 적용될 수 있음은 당업자에게 자명하다.

상기에서 유전자의 카피수 증가는, 특별히 이에 제한되지 않으나, 벡터에 작동 가능하게 연결된 형태로 수행되거나, 숙주세포 내의 염색체 내로 삽입됨으로써 수행될 수 있다. 구체적으로, 본 발명의 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드가 작동 가능하게 연결된, 숙주와 무관하게 복제되고 기능할 수 있는 벡터가 숙주세포 내에 도입되는 것일 수 있다. 또는, 상기 폴리뉴클레오티드가 작동 가능하게 연결된, 숙주세포 내의 염색체 내로 상기 폴리뉴클레오티드를 삽입시킬 수 있는 벡터가 숙주세포의 염색체 내에 도입되는 것일 수 있다. 상기 폴리뉴클레오티드의 염색체 내로의 삽입은 당업계에 알려진 임의의 방법, 예를 들면, 상동재조합에 의하여 이루어질 수 있다.

다음으로, 폴리뉴클레오티드의 발현이 증가하도록 발현 조절서열을 변형하는 것은, 특별히 이에 제한되지 않으나, 상기 발현 조절서열의 활성을 더욱 강화하도록 핵산 서열을 결실, 삽입, 비보전적 또는 보전적 치환 또는 이들의 조합으로 서열상의 변이를 유도하여 수행하거나, 더욱 강한 활성을 갖는 핵산 서열로 교체함에 의하여 수행될 수 있다. 상기 발현 조절서열은, 특별히 이에 제한되지 않으나, 프로모터, 오퍼레이터 서열, 리보좀 결합부위를 코딩하는 서열, 전사 및 해독의 종결을 조절하는 서열 등을 포함할 수 있다.

상기 폴리뉴클레오티드 발현 단위의 상부에는 본래의 프로모터 대신 강력한 프로모터가 연결될 수 있으며 이에 한정되는 것은 아니다. 원핵 생물에 대해 공지된 강력한 프로모터의 예에는 cj1 내지 cj7 프로모터(대한민국 등록특허 제10-0620092호), lac 프로모터, trp 프로모터, trc 프로모터, tac 프로모터, 람다 파아지 PR 프로모터, PL 프로모터, tet 프로모터, gapA 프로모터, SPL7 프로모터, SPL13(sm3) 프로모터(대한민국 등록특허 제10-1783170호), O2 프로모터(대한민국 등록특허 제10-1632642), tkt 프로모터 및 yccA 프로모터 등이 있고, 진행 생물에 대해 공지된 프로모터의 예에는 번역 신장 인자 1(TEF1), 글리세롤-3-인산 탈수소 효소 1(GPD1), 3-포스포글리세레이트 키나제 또는 다른 글리콜분해 효소, 예컨대 에놀라제, 글리세르알데히드-3-포스페이트 데히드로게나제, 헥소키나제, 피루베이트 데카르복실라제, 포스포프룩토키나제, 글루코스-6-포스페이트 이소머라제, 3-포스포글리세레이트 뮤타제, 피루베이트 키나제, 트리오스포스페이트 이소머라제, 포스포글루코스 이소머라제, 및 글루코키나제에 대한 프로모터를 포함할 수 있고, 성장 조건에 의해 제어되는 전사의 추가의 이점을 갖는 유도성 프로모터인 다른 효모 프로모터의 예에는 알콜 데히드로게나제 2, 이소시토크로뮴 C, 산 포스파타제, 질소 대사와 연관된 분해 효소, 메탈로티오네인, 글리세르알데히드-3-포스페이트 데히드로게나제, 및 말토스 및 갈락토스 이용을 담당하는 효소에 대한 프로모터가 있고, 효모 발현에 사용하기에 적합한 벡터 및 프로모터는 EP 073657에 추가로 기재되어 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다. 또한, 효모 인핸서도 효모 프로모터와 함께 유리하게 사용된다.

아울러, 염색체상의 폴리뉴클레오티드 서열의 변형은, 특별히 이에 제한되지 않으나, 상기 폴리뉴클레오티드 서열의 활성을 더욱 강화하도록 핵산 서열을 결실, 삽입, 비보전적 또는 보전적 치환 또는 이들의 조합으로 발현 조절서열상의 변이를 유도하여 수행하거나, 더욱 강한 활성을 갖도록 개량된 폴리뉴클레오티드 서열로 교체함에 의하여 수행될 수 있다.

이와 같은 단백질 활성의 도입 및 강화는, 상응하는 단백질의 활성 또는 농도가 야생형이나 비변형 미생물 균주에서의 단백질의 활성 또는 농도를 기준으로 하여 일반적으로 최소 1%, 10%, 25%, 50%, 75%, 100%, 150%, 200%, 300%, 400% 또는 500%, 최대 1000% 또는 2000%까지 증가되는 것일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

본 발명에서 용어 "비변형 미생물"은 미생물에 자연적으로 발생할 수 있는 돌연변이를 포함하는 균주를 제외하는 것이 아니며, 천연형 균주 자체이거나, 상기 단백질의 결실 또는 과발현을 포함하지 않는 미생물, 상기 단백질을 결실 또는 과발현하도록 제작된 벡터로 형질전환되지 않은 미생물, 또는 형질전환 등의 변형 전 미생물을 의미한다.

본 발명에서 용어, "유전자를 불활성화(gene inactivation)시키는" 것은 유전자를 전사할 수 없게 하여 이에 따라 기능할 수 없는 상태로 만드는 것을 의미한다. 예를 들면, 유전자를 결손시키는 방법, 상동재조합을 이용하여 일정한 DNA 단편을 게놈상의 유전자 내에 삽입하여 불활성화시키는 방법, T-DNA 또는 트랜스포손(transposon)으로 DNA를 표지(tagging)하여 불활성화시키는 방법, RNA, RNAi 또는 마이크로RNA(microRNA)의 안티센스(antisense)가 전사된 후에 분해시키는 안티센스 방법이 있다.

본 발명의 또 하나의 양태로서, C6 징크 클러스터 전사인자의 활성이 감소 또는 불활성화된, 스쿠알렌 생산이 증대된 재조합 미생물을 배지에서 배양하는 단계를 포함하는, 스쿠알렌 생산방법을 제공한다.

상기 C6 징크 클러스터 전사인자 및 스쿠알렌 생산이 증대된 재조합 미생물에 대해서는 전술한 바와 같다.

본 발명에서 용어, "배양"은 상기 미생물을 적당히 조절된 환경 조건에서 생육시키는 것을 의미한다. 본 발명의 배양과정은 당업계에 알려진 적당한 배지와 배양조건에 따라 이루어질 수 있다. 이러한 배양 과정은 선택되는 균주에 따라 당업자가 용이하게 조정하여 사용할 수 있다. 구체적으로 상기 배양은 회분식, 연속식 및 유가식일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

본 발명에서 용어, "배지"는 상기 미생물을 배양하기 위해 필요로 하는 영양물질을 주성분으로 혼합한 물질을 의미하며, 생존 및 발육에 불가결한 물을 비롯하여 영양물질 및 발육인자 등을 공급한다. 구체적으로, 본 발명의 미생물의 배양에 사용되는 배지 및 기타 배양 조건은 통상의 미생물의 배양에 사용되는 배지라면 특별한 제한 없이 어느 것이나 사용할 수 있으나, 본 발명의 미생물을 적당한 탄소원, 질소원, 인원, 무기화합물, 아미노산 및/또는 비타민 등을 함유한 통상의 배지 내에서 호기성 조건 하에서 온도, pH 등을 조절하면서 배양할 수 있다.

본 발명에서 상기 탄소원으로는 글루코오스, 프룩토오스, 수크로오스, 말토오스 등과 같은 탄수화물; 만니톨, 소르비톨 등과 같은 당 알코올, 피루브산, 락트산, 시트르산 등과 같은 유기산; 글루탐산, 메티오닌, 리신 등과 같은 아미노산 등이 포함될 수 있다. 또한, 전분 가수분해물, 당밀, 블랙스트랩 당밀, 쌀겨울, 카사버, 사탕수수 찌꺼기 및 옥수수 침지액 같은 천연의 유기 영양원을 사용할 수 있으며, 구체적으로는 글루코오스 및 살균된 전처리 당밀(즉, 환원당으로 전환된 당밀) 등과 같은 탄수화물이 사용될 수 있으며, 그 외의 적정량의 탄소원을 제한 없이 다양하게 이용할 수 있다. 이들 탄소원은 단독으로 사용되거나 2 종 이상이 조합되어 사용될 수 있으며, 이에 한정되는 것은 아니다.

상기 질소원으로는 암모니아, 황산암모늄, 염화암모늄, 초산암모늄, 인산암모늄, 탄산안모늄, 질산암모늄 등과 같은 무기질소원; 글루탐산, 메티오닌, 글루타민 등과 같은 아미노산, 펩톤, NZ-아민, 육류 추출물, 효모 추출물, 맥아 추출물, 옥수수 침지액, 카세인 가수분해물, 어류 또는 그의 분해생성물, 탈지 대두 케이크 또는 그의 분해 생성물 등과 같은 유기 질소원이 사용될 수 있다. 이들 질소원은 단독으로 사용되거나 2 종 이상이 조합되어 사용될 수 있으며, 이에 한정되는 것은 아니다.

상기 인원으로는 인산 제1칼륨, 인산 제2칼륨, 또는 이에 대응되는 소디움-함유 염 등이 포함될 수 있다. 무기화합물로는 염화나트륨, 염화칼슘, 염화철, 황산마그네슘, 황산철, 황산망간, 탄산칼슘 등이 사용될 수 있으며, 그 외에 아미노산, 비타민 및/또는 적절한 전구체 등이 포함될 수 있다. 이들 구성성분 또는 전구체는 배지에 회분식 또는 연속식으로 첨가될 수 있다. 그러나, 이에 한정되는 것은 아니다.

본 발명에서, 미생물의 배양 중에 수산화암모늄, 수산화칼륨, 암모니아, 인산, 황산 등과 같은 화합물을 배지에 적절한 방식으로 첨가하여, 배지의 pH를 조정할 수 있다. 또한, 배양 중에는 지방산 폴리글리콜 에스테르와 같은 소포제를 사용하여 기포 생성을 억제할 수 있다. 또한, 배지의 호기 상태를 유지하기 위하여, 배지 내로 산소 또는 산소 함유 기체를 주입하거나 혐기 및 미호기 상태를 유지하기 위해 기체의 주입 없이 혹은 질소, 수소 또는 이산화탄소 가스를 주입할 수 있으며, 이에 한정되는 것은 아니다.

배지의 온도는 20℃ 내지 50℃, 구체적으로는 30℃ 내지 37℃일 수 있으나 이로 제한되지 않는다. 배양 기간은 유용 물질의 원하는 생성량이 수득될 때까지 계속될 수 있으며, 구체적으로는 10 시간 내지 100 시간일 수 있으나 이로 제한되지 않는다.

상기 배양에 의하여 생산된 스쿠알렌은 배지 중으로 배출되거나 미처 배출되지 못하고 세포 내에 잔류할 수 있다.

상기 스쿠알렌 생산 방법은 배양된 미생물 또는 배지에서 스쿠알렌을 회수하는 단계를 포함할 수 있다.

본 발명의 상기 배양 단계에서 생산된 스쿠알렌을 회수하는 방법은 배양방법에 따라 당해 분야에 공지된 적합한 방법을 이용하여 배양액으로부터 목적하는 스쿠알렌을 수집(collect)하는 것일 수 있다. 예를 들면, 원심분리, 여과, 음이온 교환 크로마토그래피, 결정화 및 HPLC 등이 사용될 수 있으며, 당해 분야에 공지된 적합한 방법을 이용하여 배지 또는 미생물로부터 목적하는 스쿠알렌을 회수 할 수 있다.

또한, 상기 회수 단계는 정제 공정을 포함할 수 있으며, 당해 분야에 공지된 적합한 방법을 이용하여 수행될 수 있다. 따라서, 상기의 회수되는 스쿠알렌은 정제된 형태 또는 스쿠알렌을 함유한 미생물 발효액일 수 있다(Introduction to Biotechnology and Genetic Engineering, A. J. Nair., 2008).

본 발명의 C6 징크 클러스터 전사인자를 코딩하는 유전자를 결손한, 스쿠알렌 생산이 증대된 균주는 효모의 대사 경로 내 탄소 흐름(carbon-flux)을 변화시켜, 기존 비변형 균주에 비해 고수율의 스쿠알렌 생산이 가능하다.

도 1은 스쿠알렌 생합성 대사경로를 나타낸 모식도이다.
도 2는 SIP4를 통한 포도당신생합성 조절을 나타낸 모식도이다.
도 3은 pUC57-URA3Myc 벡터맵이다.
도 4는 pUC57-PGPD1-tHMG1-URA3Myc 벡터맵이다.
도 5는 pUC57-PTEF1-ERG20-URA3Myc 벡터맵이다.
도 6 및 7은 형질전환된 효모의 성장 정도, 글루코오스 농도, 에탄올 농도, 글리세롤 농도 및 세포 내의 스쿠알렌 농도이다.

이하 본 발명을 실시예에 의해 보다 상세하게 설명한다. 그러나 이들 실시예는 본 발명을 예시적으로 설명하기 위한 것으로, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되는 것은 아니며, 본 발명이 속하는 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자에게 있어 명백할 것이다.

실시예 1. 스쿠알렌의 전구체 생산을 강화시킨 균주 제작

효모(Saccharomyces cerevisiae) CEN.PK2-1D 야생형 균주[(MATα ura3-52; trp1-289; leu2-3,112; his3△ AL2-8; SUC2) EUROSCARF accession number: 30000B]의 대사 물질 중 하나인 스쿠알렌(squalene)의 생합성을 증대시키기 위해 메발론산염(mevalonate) 대사 경로를 강화시키고 스쿠알렌의 전구체 생산을 강화시킨 균주를 제작하였다.

구체적으로, 메발론산염 대사 경로를 강화시키고 스쿠알렌의 전구체 생산을 강화시키기 위해, trp1(phosphoribosylanthranilate isomerase, 서열번호 4), leu2(3-isopropylmalate dehydrogenase, 서열번호 6) 및 his3(Imidazoleglycerol-phosphate dehydratase, 서열번호 8)가 불활성화되어 있는 CEN.PK2-1D 야생형 균주의 trp1, leu2 또는 his3 위치에 메발론산염 대사 경로 강화 효소를 코딩하는 유전자인 tHMG1(S. cerevisiae HMG-CoA reductase(β-Hydroxy β-methylglutaryl-CoA reductase), 서열번호 10) 및 스쿠알렌을 생합성하는 전구체 생산을 증대시키는 효소를 코딩하는 유전자인 ERG20(S. cerevisiae Farnesyl pyrophosphate synthetase, 서열번호 12)를 도입하였다.

상기와 같이, S. cerevisiae CEN.PK2-1D 야생형 균주에 trp1 또는 his3을 결손시키고 tHMG1를 도입하기 위해, 기 제작된 pUC57-URA3Myc 벡터(Ju Young Lee, et al. (2015) Engineering cellular redox balance in Saccharomyces cerevisiae for improved production of L-lactic acid. Biotechnol. Bioeng., 112, 751-758., 서열번호 13, 도 3)의 제한효소를 처리하고 같은 제한효소가 처리된 PGPD1-tHMG1의 PCR 산물을 결합시켜 pUC57-PGPD1-tHMG1-URA3Myc 벡터(도 4)를 수득하였다. 그 후, trp1 또는 his3의 서열 부위에 PGPD1-tHMG1-URA3Myc 서열을 상동재조합시키기 위하여, trp1 또는 his3 서열과 상동서열을 가지는 프라이머(서열번호 14 및 서열번호 15, 서열번호 16 및 서열번호 17)를 제작하고, pUC57-PGPD1-tHMG1-URA3Myc 벡터를 주형으로 trp1 또는 his3 서열과 상동서열을 가지는 PGPD1-tHMG1-URA3Myc PCR 산물을 수득하였다.

leu2를 결손시키고 스쿠알렌을 생합성하는 전구체 생산을 증대시키는 효소를 암호화하는 유전자인 ERG20를 도입하기 위해, pUC57-URA3Myc 벡터의 제한효소를 처리하고 같은 제한효소가 처리된 PTEF1-ERG20의 PCR 산물을 결합시켜 pUC57-PTEF1-ERG20-URA3Myc 벡터(도 5)를 수득하였다. 그 후 leu2의 서열 부위에 PTEF1-ERG20-URA3Myc 서열을 상동재조합시키기 위하여, leu2 서열과 상동서열을 가지는 프라이머(서열번호 18 및 서열번호 19)를 제작하여 pUC57-PTEF1-ERG20-URA3Myc 벡터를 주형으로 leu2 서열과 상동서열을 가지는 PTEF1-ERG20-URA3Myc의 PCR 산물을 수득하였다.

제조한 균주를 SQ로 명명하였고, SQ 균주를 제조하기 위한 과정에서 제작된 PCR 산물은 모두 열충격 형질전환에 의해서 수행되었다. PCR은 94℃에서 2분간 변성 후, 98℃에서 10초 변성, 54℃에서 30초 어닐링, 68℃에서 60초 중합을 25회 반복한 후, 68℃에서 7분간 중합반응을 수행하였다. 각각의 유전자가 치환되었는지 확인하기 위해서 상기 균주의 각각의 게놈을 주형으로 하고 서열번호 20 내지 서열번호 25의 프라이머 세트를 사용해 PCR로 확인하였다. PCR은 94℃에서 2분간 변성 후, 94℃에서 30초 변성, 54℃에서 30초 어닐링, 72℃에서 2분 중합을 30회 반복한 후, 72℃에서 5분간 중합반응을 수행하였다.

상기 tHMG1 및 ERG20는 효모 유전체 내에 각각 1카피씩 삽입되었으며, 강한 효모의 고유 프로모터인 GPD1과 TEF1로부터 각각 전사되어 발현되었다.

서열번호 14 (Del_trp1_tHMG1_F)

actggccgtcgttttacGTTATTACTGAGTAGTATTTATTTAAGTATT

서열번호 15 (Del_trp1_tHMG1_R)

gtcatagctgtttcctgACTCCAAGCTGCCTTTGTGTGCTTAATCACGTATACTCACGTGCTCAATA

서열번호 16 (Del_his3_tHMG1_F)

actggccgtcgttttacTGACACCGATTATTTAAAGCTGCAGCATACGATATATATACATGTGTATA

서열번호 17 (Del_his3_tHMG1_R)

gtcatagctgtttcctgCTTTGCCTTCGTTTATCTTGCCTGCTCATTTTTTAGTATATTCTTCGAAGAAATCACA

서열번호 18 (Del_leu2_ERG20_F)

actggccgtcgttttacAAAGATTCTCTTTTTTTATGATATTTGTACATAAACTTTATAAATGAAATTCATAATA

서열번호 19 (Del_leu2_ERG20_R)

gtcatagctgtttcctgTAGAATGGTATATCCTTGAAATATATATATATATATTGCTGAAATGTAAAAGGTAAGA

서열번호 20 (Del_trp1_tHMG1_conf_F)

GTATTTATTTAAGTATTGTTTGTGCAC

서열번호 21 (Del_trp1_tHMG1_conf_R)

ACGTATACTCACGTGCTCAATAGTCACC

서열번호 22 (Del_his3_tHMG1_conf_F)

CTATGAATGTCAGTAAGTATGTATAC

서열번호 23 (Del_his3_tHMG1_conf_R)

ATTATGTGATAATGCCAATCGCT

서열번호 24 (Del_leu2_ERG20_conf_F)

GGAATATGTTCATAGGGTAGACGA

서열번호 25 (Del_leu2_ERG20_conf_R)

GACGATTGCTAACCACCTATTGG

실시예 2. sip4 유전자를 결손시킨 SQ 균주 제작

SQ 균주에서 탄소원-반응 요소(carbon source-responsive element, CSRE)를 포함하는 포도당신생합성(gluconeogenesis) 관련 유전자의 발현에 관여하는 C6 징크 클러스터 전사인자(C6 zinc cluster transcription factor)인 SIP4를 코딩하는 유전자인 sip4를 결손시키기 위해, pUC57-URA3Myc 벡터를 주형으로 하고, S. cerevisiae 게놈 상의 sip4 부위의 상동 재조합 서열(서열번호 2)을 서열번호 26 및 서열번호 27의 프라이머 세트로 사용한 PCR에 의하여 sip4를 결손시킨 카세트를 수득하였다. PCR은 95℃에서 5분간 변성 후, 95℃에서 30초 변성, 60℃에서 30초 어닐링, 72℃에서 60초 중합을 25회 반복한 후, 72℃에서 5분간 중합반응을 수행하였다. 제작된 결손 카세트를 SQ 균주에 도입하였다. 도입은 열충격 형질전환(heat shock transformation)에 의하여 수행되었으며, 형질도입 후 우라실 탈락(uracil drop-out) 배지에서 균주를 배양하여 게놈상의 sip4가 URA3(ODCase(Orotidine 5'-phosphate decarboxylase)를 코딩하는 유전자)를 포함하는 상기 카세트로 치환되도록 하였다. 그 결과 제조된 균주에 대하여 sip4 유전자가 결손되었는지 확인하기 위해서, 상기 균주의 각각의 게놈을 주형으로 하고 서열번호 28 및 서열번호 29의 프라이머 세트를 사용한 PCR에 의하여 각각 sip4 유전자의 결손을 확인하였다. PCR은 95℃에서 5분간 변성 후, 95℃에서 30초 변성, 60℃에서 30초 어닐링, 72℃에서 60초 중합을 30회 반복한 후, 72℃에서 5분간 중합반응을 수행하였다. 제작한 균주는 SQ △SIP4::Ura3로 명명하였다.

서열번호 26 (Del_SIP4_F)

TTT TTT TTT TTT TTT GCT TCT TTT TTT CTT CTC GCT ACT CTG AAT AGA CGC CAG TCA CGA CGT TGT AAA A

서열번호 27 (Del_SIP4_R)

TCA CTG CTA TCA GAG GAA GAG CTG AAT GAG TAA TAC GAA GGA GCG TAA TGA GGT TTC CCG ACT GGA AAG C

서열번호 28 (SIP4_conf_F)

AGC GGC TAA TCC TCT TTA CCA TT

서열번호 29 (SIP4_conf_R)

CCA GTT TTT TGT CAT CTC GAA ACG

실시예 3. sip4 유전자를 결손시킨 SQ 균주의 스쿠알렌 생산능 검정

SQ 균주 및 실시예 2에서 제조한 균주를 각각 2% 포도당을 함유한 최소 배지(minimal URA drop-out media) 50ml에 OD600 값이 0.5가 되도록 접종하고, 30℃에서 250 rpm으로 교반하면서 144 시간 동안 호기 조건에서 배양하였다. 배양 중 세포 성장은 분광계(spectrophotometer)를 이용하여 OD600 값을 측정하였다. 배양 중 배지 내 글루코오스(glucose), 에탄올(ethanol), 글리세롤(glycerol) 농도 및 세포 내 스쿠알렌은 HPLC(High performance liquid chromatography)를 이용하여 분석하였다. 균주별 세포 성장을 나타내는 OD600 값 및 글루코오스, 에탄올, 글리세롤 및 스쿠알렌 생산량은 하기 도 6 및 도 7에 나타낸 바와 같았다.

도 6 및 도 7과 같이, sip4가 결손된 SQ 균주는 세포 성장률, 글루코오스, 에탄올, 글리세롤 및 스쿠알렌 생산량이 모두 SQ 균주보다 현저히 높은 것을 확인하였다.

상기 실시예의 결과로부터, sip4 유전자를 결핍시킴으로써 포도당신생합성 관련 유전자의 발현을 억제하여 해당(Glycolysis), 피루브산 탈수소효소 우회 (pyruvate dehydrogenase Bypass, PDH Bypass), 메발론산염(Mevalonate) 경로를 지나 에르고스테롤(Ergosterol) 생합성 경로로 이어지는 효모의 대사 경로 내 탄소 흐름(carbon-flux)을 변화시킬 수 있으며, 그 결과 글리세롤 및 에탄올의 생산량이 증가하고, 축적된 글리세롤 및 에탄올은 세포 성장 및 스쿠알렌 생산에 사용되었음을 확인하였다.

이상의 설명으로부터, 본 발명이 속하는 기술분야의 당업자는 본 발명이 그 기술적 사상이나 필수적 특징을 변경하지 않고서 다른 구체적인 형태로 실시될 수 있다는 것을 이해할 수 있을 것이다. 이와 관련하여, 이상에서 기술한 실시예들은 모든 면에서 예시적인 것이며 한정적인 것이 아닌 것으로 이해해야만 한다. 본 발명의 범위는 상기 상세한 설명보다는 후술하는 청구범위의 의미 및 범위 그리고 그 등가 개념으로부터 도출되는 모든 변경 또는 변형된 형태가 본 발명의 범위에 포함되는 것으로 해석되어야 한다.

<110> KOREA RESEARCH INSTITUTE OF CHEMICAL TECHNOLOGY <120> Strain with increased squalene production and method for producing squalene using the same <130> KPA190784-KR <160> 29 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 829 <212> PRT <213> Unknown <220> <223> Saccharomyces cerevisiae sip4 <400> 1 Met Ala Lys Arg Lys Tyr Gly Arg Ser Tyr Ser Leu Asp Asp Thr Asp 1 5 10 15 Ser Cys Ser Asn Lys Val Leu Ile Val Pro Thr Gly Gln Ser Ser Ser 20 25 30 Asn Ala Ile Thr Asp Phe Ser Val Arg Lys Ala His Ala Cys Asp Arg 35 40 45 Cys Arg Leu Lys Lys Ile Lys Cys Asp Gly Leu Lys Pro Asn Cys Ser 50 55 60 Asn Cys Ala Lys Ile Asp Phe Pro Cys Lys Thr Ser Asp Lys Leu Ser 65 70 75 80 Arg Arg Gly Leu Pro Lys Gly Tyr Thr Glu Leu Leu Glu Lys Glu Val 85 90 95 Val Arg Leu Thr Asn Met Asn Ala Ser Ser Ser Ala Asn Ala Asn Ser 100 105 110 Asn Leu Pro Phe Ile Asn Asp Thr Phe Tyr Cys Phe Asp Asn Tyr Asn 115 120 125 Thr Gln Ser Glu Asn Gln Arg Phe Leu Gly His Leu Thr Trp Asn Ile 130 135 140 Leu Thr Asn Thr Phe Pro Thr Gln Lys Ala Val Val Phe Thr Asp Asp 145 150 155 160 Arg Asn Asn Ile Asp Leu Gln Leu Gln Leu Leu Thr Asn Phe Leu Asn 165 170 175 Leu Asn Gly Asp Phe Asn His Leu Pro Asn Phe Leu Leu Leu Lys Tyr 180 185 190 Asp Tyr Asn Leu Gln Phe Leu Lys Asn Leu Leu Ser Val Ile Ile Lys 195 200 205 Asp Phe Phe Lys Arg Gln Asn Ser Leu Leu Leu Leu Leu Tyr Pro Thr 210 215 220 Asn Leu Trp Lys Asn Leu Leu Leu Asp Lys Ile Asn Ser Thr Ala Met 225 230 235 240 Thr Gly Glu Pro Ile Thr Leu Leu Ala Leu Leu Tyr Ile Ile Gln Phe 245 250 255 Thr Trp Ser Cys Phe Asp Asp Phe Lys Leu Phe Lys Val Thr Lys Leu 260 265 270 Ile Val Ser Leu Thr Thr Asn Ser Lys Leu Asp Leu Lys Val Leu Gln 275 280 285 Leu Val Asn Leu Ser Ile Phe Tyr Phe Met Gly Ala Ser Val Asp Ser 290 295 300 Cys Lys Ser Lys Ser Ser Leu Thr Glu His Ser Asn Val Asn Ser Val 305 310 315 320 Ile Trp Thr Asn Asp Leu Leu Asn Leu Asn Phe Thr Asn Ile Leu Asn 325 330 335 Met Gly Leu Tyr Ile Asn Pro Lys Asn Leu Ile Pro Ile Ser Gly Asn 340 345 350 Asn Asn Asn Asn Lys Ser Asn Glu Glu Asp Asp Arg Ile Val Thr Phe 355 360 365 Trp Cys Phe Gln Phe Leu Ser Ser Trp Trp Ser Leu Ile Gln Gly Leu 370 375 380 Pro Lys Ser Asn Phe Leu Thr Glu Glu Phe Gln Pro Lys Ser Ile Ser 385 390 395 400 Val Leu Glu Ile Pro Arg Leu Lys Pro Phe Glu Ile Leu Leu Asn Phe 405 410 415 Ile Ile Tyr Ser Leu Asp Gly Cys Asn Leu Leu Asn Ile Ser Ser Leu 420 425 430 Asn Val Ser Asp Pro Asn Phe Gln Phe Phe Gln Asn Glu Leu Glu Ser 435 440 445 Phe Lys Lys Asn Leu Leu Leu Trp Asn Leu Tyr His Asn Leu Ser Asp 450 455 460 His Asp Asn Phe Arg Phe Leu Thr Ser Ser Ser Asn Lys Lys Leu Thr 465 470 475 480 Thr Asn Leu Leu Leu Lys Asn Leu Thr Gly Leu Asn His Lys Leu Asn 485 490 495 Gln Pro Asp Phe Val Glu Ile Gln Leu Thr Leu Phe Tyr Leu Ser Leu 500 505 510 Lys Leu Met Thr Leu Lys Glu Gly Asp Gln Asp Leu Lys Lys Glu Asp 515 520 525 Ile Ser Leu Glu Ile Leu Ser Leu Tyr Phe Leu Ile Leu Thr Asp Asp 530 535 540 Ser Asn Asn Asp Asp Asn Gln Gln Leu Gln Pro Gln Gln Leu Asn Leu 545 550 555 560 Tyr His Phe Thr Pro Phe Asn Ser Ile Asp Ile Ile Asp Leu Cys Leu 565 570 575 Asn Asn Leu Asn Asn Trp Ser Leu Ser Leu Lys Tyr Glu Ser Gly Gln 580 585 590 Asn Gln Pro His Ser Ser Lys Ile Lys Phe Glu Lys Phe Gln Asn Phe 595 600 605 Leu Asn His Trp Cys Pro Ile Trp Tyr Tyr Asp Glu Phe Ser Thr Asn 610 615 620 Pro Phe Leu Gln Ile Leu Lys Ile Asn Phe Lys Leu Leu Pro Phe Glu 625 630 635 640 Thr Ile His Tyr Ser Gln Glu Glu Gln Arg Leu Leu Ile Ser Leu Asn 645 650 655 Lys Leu Arg Tyr Leu Asp Ala Val Ser Ser Phe Asn Ser Ser Ser Val 660 665 670 Lys Ser Asn Phe Ala Ser Lys Val Asn Thr Gln Leu Asn Leu Leu Gln 675 680 685 His Ser Ser Ser Asn Ser Asn Phe Leu Asp Ala Ser Pro Tyr Asp Phe 690 695 700 Asn Lys Ile Phe Met Asn Asn Phe Glu Asn Tyr Asp Tyr Glu Thr Asp 705 710 715 720 Glu Gly Tyr Ala Glu Asp Asp Asp Glu Glu Asp Ser Asp Ser Asp Asn 725 730 735 Ser Leu Pro Leu Glu Ile Pro Phe Lys Lys Ser Lys Asn Lys Cys Lys 740 745 750 Asn Arg Asn Lys Glu Leu Ser Gln Arg Leu Ser Leu Phe Glu Asn Arg 755 760 765 Asp Ser Asn Ser Val Asp Phe Asn Thr Asp Thr Asn Leu Asn Leu Asn 770 775 780 Pro Asp Ser Pro Ser Val Thr Ser Ser Lys Lys Lys Tyr Leu Asp His 785 790 795 800 Ile Ile Leu Asp Asn Arg Asp Ile Val Ser Asn His Asp Ser Ser Lys 805 810 815 Gln Lys Phe Lys Ile Gln Asn Ile Leu Asn Ser Thr Phe 820 825 <210> 2 <211> 2490 <212> DNA <213> Unknown <220> <223> Saccharomyces cerevisiae sip4 <400> 2 atggccaaga ggaaatatgg caggtcttat tccctcgatg atacagattc ctgcagcaat 60 aaagtcctga tagtaccaac cggtcaaagc tcctctaacg caatcactga tttctctgtc 120 agaaaggcgc atgcttgcga tagatgcaga ctgaaaaaaa tcaagtgtga cggtttaaaa 180 ccgaactgtt caaactgtgc gaaaattgac ttcccttgca aaacctcgga taaactgtcg 240 aggagaggtc ttccaaaggg gtatacagaa ctactagaaa aagaggtcgt ccgtttgaca 300 aatatgaatg cgagttccag cgccaatgca aattctaatt tgccgttcat taatgataca 360 ttttattgtt ttgataatta caacactcag tctgaaaatc aaaggttttt gggacatttg 420 acatggaata ttctaactaa tacttttcct actcaaaaag cagtagtttt tacagacgat 480 cgaaataata ttgatctaca actgcaactg ttaacaaatt ttttgaacct gaatggtgac 540 tttaatcatc tcccaaattt 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tgcaagaata ggaataaaga gctttcacaa 2280 aggttatccc tatttgaaaa cagagatagc aattcggtag atttcaacac agatacaaat 2340 ttaaatttaa accctgattc gccatcagtt acgtcttcta agaaaaaata tttagatcat 2400 attattttag ataaccgaga catcgttagc aaccatgact ccagtaaaca aaaattcaag 2460 atccagaata ttttgaactc gaccttctaa 2490 <210> 3 <211> 224 <212> PRT <213> Unknown <220> <223> Saccharomyces cerevisiae trp1 <400> 3 Met Ser Val Ile Asn Phe Thr Gly Ser Ser Gly Pro Leu Val Lys Val 1 5 10 15 Cys Gly Leu Gln Ser Thr Glu Ala Ala Glu Cys Ala Leu Asp Ser Asp 20 25 30 Ala Asp Leu Leu Gly Ile Ile Cys Val Pro Asn Arg Lys Arg Thr Ile 35 40 45 Asp Pro Val Ile Ala Arg Lys Ile Ser Ser Leu Val Lys Ala Tyr Lys 50 55 60 Asn Ser Ser Gly Thr Pro Lys Tyr Leu Val Gly Val Phe Arg Asn Gln 65 70 75 80 Pro Lys Glu Asp Val Leu Ala Leu Val Asn Asp Tyr Gly Ile Asp Ile 85 90 95 Val Gln Leu His Gly Asp Glu Ser Trp Gln Glu Tyr Gln Glu Phe Leu 100 105 110 Gly Leu Pro Val Ile Lys Arg Leu Val Phe Pro Lys Asp Cys Asn Ile 115 120 125 Leu Leu Ser Ala Ala Ser 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Claims (9)

1. C6 징크 클러스터 전사인자(C6 zinc cluster transcription factor)의 활성이 감소 또는 불활성화된, 스쿠알렌 생산이 증대된 재조합 효모.
   
2. 제1항에 있어서, 상기 효모는 β-하이드록시 β-메틸글루타릴-CoA 환원효소(β-Hydroxy β-methylglutaryl-CoA reductase) 및 파르네실 피로포스페이트 합성효소(Farnesyl pyrophosphate synthetase) 중 어느 하나 이상의 단백질의 활성을 추가로 강화시킨, 재조합 효모.
   
3. 제1항에 있어서, 상기 효모는 포스포리보실안트라닐레이트 이소머라아제(Phosphoribosylanthranilate isomerase), 3-이소프로필말레이트 탈수소효소(3-isopropylmalate dehydrogenase) 및 이미다졸글리세롤-포스페이트 탈수효소(Imidazoleglycerol-phosphate dehydratase) 중 어느 하나 이상의 단백질의 활성을 추가로 감소 또는 불활성화시킨, 재조합 효모.
   
4. 제1항에 있어서, 상기 C6 징크 클러스터 전사인자는 서열번호 1의 아미노산 서열을 포함하는 것인, 재조합 효모.
   
5. 제2항에 있어서, 상기 β-하이드록시 β-메틸글루타릴-CoA 환원효소 및 파르네실 피로포스페이트 합성효소는 각각 서열번호 9 및 11의 아미노산 서열을 포함하는 것인, 재조합 효모.
   
6. 제3항에 있어서, 상기 포스포리보실안트라닐레이트 이소머라아제, 3-이소프로필말레이트 탈수소효소 및 이미다졸글리세롤-포스페이트 탈수효소는 각각 서열번호 3, 5 및 7의 아미노산 서열을 포함하는 것인, 재조합 효모.
   
7. 제1항에 있어서, 상기 효모는 사카로마이세스 세레비지에(Saccharomyces cerevisiae)인 것인, 재조합 효모.
   
8. C6 징크 클러스터 전사인자의 활성이 감소 또는 불활성화된, 스쿠알렌 생산이 증대된 재조합 효모를 배지에서 배양하는 단계를 포함하는, 스쿠알렌 생산방법.
   
9. 제8항에 있어서, 상기 방법은 배양된 효모 또는 배지에서 스쿠알렌을 회수하는 단계를 추가로 포함하는 것인, 스쿠알렌 생산방법.

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