CN107828825A - 一种用于分离纯化食管鳞癌肿瘤干细胞的重组载体及其应用 - Google Patents

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Abstract

本发明属分子生物学、基因工程以及生物医药技术领域，为解决肿瘤干细胞和分化细胞很难从形态上区分，难以针对肿瘤干细胞的单一群体进行研究的问题，提供一种用于分离纯化食管鳞癌肿瘤干细胞的重组载体及其应用。用CRISPR/Cas9系统进行基因重组，在食管鳞癌细胞转录因子SOX2基因5’‑UTR区域插入绿色荧光蛋白表达基因和嘌呤霉素抗性基因，构建重组载体组合。当细胞有绿色荧光时细胞处于干细胞状态，能找到干细胞存在的位置；在培养基中加入嘌呤霉素，能去除已分化细胞，保留食管鳞癌肿瘤干细胞。达到分离纯化肿瘤干细胞的目的。解决食管鳞癌肿瘤干细胞研究的瓶颈，推动食管鳞癌肿瘤干细胞乃至所有类型肿瘤干细胞的研究。

Description

一种用于分离纯化食管鳞癌肿瘤干细胞的重组载体及其应用
技术领域
本发明属于分子生物学、基因工程技术以及生物医药技术领域，具体涉及一种用于分离纯化食管鳞癌肿瘤干细胞的重组载体及其应用。
背景技术
食管鳞状细胞癌是一种多发于我国、特别是太行山地区的消化道肿瘤，在我国的肿瘤死亡率中位居第四位，且术后五年存活率只有14%，而导致这一现象的首要原因就是肿瘤的复发与转移。肿瘤干细胞在肿瘤的起源、转移和复发中起着重要作用，但限于实验技术对肿瘤干细胞分化状态的监测能力，人们对肿瘤干细胞的研究比较困难。
对于肿瘤干细胞研究的瓶颈在于，肿瘤干细胞能够自发的分化，从而形成由肿瘤干细胞和已分化癌细胞组成的细胞群。在实验过程中，由于肿瘤干细胞和分化细胞很难从形态上区分，所以难以针对肿瘤干细胞这个单一的群体进行研究。另外，已有文献报道，在食管鳞癌肿瘤干细胞中，SOX2基因在调节干细胞特性方面起到主要的作用，因此SOX2的表达，能表明细胞处于干细胞状态。
SOX2是重要转录因子，在哺乳动物器官早期发育中发挥重要的作用，也是维持胚胎干细胞自我更新和多潜能性的必要条件。有文献报道，在鳞癌中，SOX2具有调节肿瘤干细胞特性的作用，表明其在鳞癌中能够代表细胞的分化程度，即处于肿瘤干细胞状态。但目前为止，限于实验方法，没有根据SOX2筛选食管鳞癌肿瘤干细胞的报道。
CRISPR/Cas9 (Clustered Regularly Interspaced Short PalindromicRepeats/CRISPR associated protein 9)是一个核酸表达载体系统，可以快速及高效的在目标区域进行基因改造，比现在已有的基因编辑技术（ZFN 和 TALE）具有更大优势。简而言之，在细胞中，CRISPR/Cas9载体可以利用一个载体同时表达Cas9核酸酶和引导RNA（gRNA），形成复合物，从而为核酸酶提供了由18-22个碱基的目标区域，进而实施对目标核酸区域的切割，利用RNA引导Cas9核酸酶可在特定的基因组位点上进行切割，修饰。
发明内容
本发明为了解决目前肿瘤干细胞和分化细胞很难从形态上区分，所以难以针对肿瘤干细胞这个单一的群体进行研究的问题，提供了一种用于分离纯化食管鳞癌肿瘤干细胞的重组载体及其应用。
本发明由如下技术方案实现的：一种用于分离纯化食管鳞癌肿瘤干细胞的重组载体，利用CRISPR系统进行基因重组，在食管鳞癌细胞转录因子SOX2的5’-UTR区域插入绿色荧光蛋白GFP表达基因和嘌呤霉素抗性基因Puror，构建重组载体组合，该重组载体组合由gRNA载体pRP[CRISPR]-hCas9-U6>{hSOX2[gRNA]}和pDONOR载体pDonor-{hSOX2-L}:{EGFP:IRES:Puro}:{hSOX2-R}组成。所述重组载体pRP[CRISPR]-hCas9-U6>hSOX2[gRNA]的靶点序列为：gtacatgcgggcgctgtgcg。所述gRNA载体的基因序列如SEQ ID NO.1；所述pDONOR载体的序列如SEQ ID NO.2。
具体制备方法为：
（1）构建gRNA载体pRP[CRISPR]-hCas9-U6>{hSOX2[gRNA]}：用Oligo DNA退火的方法，将DNA oligo-F 5’-caccggtacatgcgggcgctgtgcg-3’和DNA oligo-R 5’-aaaccgcacagcgcccgcatgtacc-3’退火结合，酶切载体pLV.shRNA.P/EGFP/T2A/Puro(single gRNA)，连接pLV.shRNA.P/EGFP/T2A/Puro 与退火的Oligo DNA片段，所获得的连接反应物转化 STBL3 E. coli得到重组gRNA载体；
（2）构建pDONOR载体pDonor-{hSOX2-L}:{EGFP:IRES:Puro}:{hSOX2-R}：采用Gateway载体构建方法：
a、利用重叠PCR扩增attB1-EGFP:IRES:Puro-attB2：以上游引物5’-actttgtacaaaaaagcaggctgccaccatggtgagcaagg-3’和下游引物5’-actttgtacaagaaagctgggttcaggcaccgggcttgcg -3’为引物对，以含EGFP:IRES:Puro片段的骨架载体为底物，扩增基因序列EGFP:IRES:Puro，长度为1935bp；
b、利用Gateway Technology构建pDown：以扩增的attB1-EGFP:IRES:Puro-attB2为模板，与Gateway目的载体进行有效重组，获得重组BP反应产物，然后将其转染STBL3 E. coli得到重组pDown载体；
c、构建pUP-hSOX2-L：采用gateway载体构建方法：以attB4- hSOX2-L–attB1 为模板，与Gateway目的载体进行有效重组，获得重组BP反应产物，然后将其转染STBL3 E. coli得到重组pUP-hSOX2-L载体；
d、利用 Gateway载体构建方法构建 pTail- hSOX2-R：以attB2- hSOX2-R –attB3为模板，与Gateway目的载体进行有效重组，获得重组BP反应产物，然后将其转染STBL3 E. coli得到重组pTail- hSOX2-R载体；
e、利用Gateway Technology构建表达载体pDonor-{hSOX2-L}:{EGFP:IRES:Puro}:{hSOX2-R}：提取质粒pDown-和骨架载体，利用pUP-hSOX2-L载体、pDown- EGFP:IRES:Puro、pTail- hSOX2-R为模板，与Gateway目的载体进行LR反应，获得重组LR反应产物，然后转化LR反应产物到STBL3 E. coli得到重组pDonor-{hSOX2-L}:{EGFP:IRES:Puro}:{hSOX2-R}载体。
将所述用于分离纯化食管鳞癌肿瘤干细胞的重组载体用于筛选、分离、纯化食管鳞癌肿瘤干细胞。
与现有技术相比，本发明利用CRISPR/Cas9系统进行基因重组，在食管鳞癌细胞转录因子SOX2基因5’-UTR区域插入绿色荧光蛋白（GFP）表达基因和嘌呤霉素抗性基因（Puror）。根据基因表达原理，当GFP表达时，指示SOX2基因表达，即细胞仍然处于干细胞状态；而不表达GFP的细胞，即为已分化的食管鳞癌细胞；实验检测显示，当细胞有绿色荧光时，该细胞为干细胞状态存在；另外，由于同时又插入了嘌呤霉素抗性基因，即SOX2基因表达时，嘌呤霉素抗性基因也会同时表达，因此在细胞培养基中加入嘌呤霉素时，处于干细胞状态的细胞就存在抵抗嘌呤霉素的作用，而已分化的细胞就被嘌呤霉素杀死，从而达到了去除已分化细胞的目的，只留下食管鳞癌肿瘤干细胞，从而分离纯化出食管鳞癌肿瘤干细胞。这样能够解决食管鳞癌肿瘤干细胞研究中难以区分肿瘤干细胞和分化细胞的瓶颈，推动食管鳞癌肿瘤干细胞的研究，乃至所有类型肿瘤干细胞的研究。
附图说明
图1为本发明所述用于分离纯化食管鳞癌肿瘤干细胞的重组基因的构建示意图；图2为gRNA载体构建图；图3为gRNA载体琼脂糖凝胶电泳验证图；图4为pDONOR载体构建图；图5为pDONOR载体琼脂糖凝胶电泳验证图；图6为制备好的载体转染的细胞在荧光显微镜下镜检结果图，标尺为100μm,图中：显示绿色的细胞处于干细胞状态，而不显示绿色荧光的细胞为已分化细胞；图7为在添加了嘌呤霉素的培养基中，培养1周后荧光显微镜下镜检结果图，,标尺为100μm，图中：BF为明视野，GFP为绿色荧光蛋白；图8为纯的绿色细胞与混合细胞群体中的SOX2基因表达水平检测结果图。
具体实施方式
下面通过具体实施例并结合附图对本发明进一步阐述，但并不限制本发明。
一种用于分离纯化食管鳞癌肿瘤干细胞的重组载体，利用CRISPR系统进行基因重组，在食管鳞癌细胞转录因子SOX2的5’-UTR区域插入绿色荧光蛋白GFP表达基因和嘌呤霉素抗性基因Puror，构建重组载体组合，该重组载体组合由gRNA载体pRP[CRISPR]-hCas9-U6>{hSOX2[gRNA]}和pDONOR载体pDonor-{hSOX2-L}:{EGFP:IRES:Puro}:{hSOX2-R}组成。所述重组载体pRP[CRISPR]-hCas9-U6>hSOX2[gRNA]的靶点序列为：gtacatgcgggcgctgtgcg。
具体制备方法为：
（1）构建如图2所示的gRNA载体pRP[CRISPR]-hCas9-U6>{hSOX2[gRNA]}：用Oligo DNA退火的方法，将DNA oligo-F 5’-caccggtacatgcgggcgctgtgcg-3’和DNA oligo-R 5’-aaaccgcacagcgcccgcatgtacc-3’退火结合，酶切载体pLV.shRNA.P/EGFP/T2A/Puro(single gRNA)，连接pLV.shRNA.P/EGFP/T2A/Puro 与退火的Oligo DNA片段，所获得的连接反应物转化 STBL3 E. coli得到重组gRNA载体。
退火合成gRNA 片段：用Oligo DNA退火的方法，将DNA oligo-F 5’-caccggtacatgcgggcgctgtgcg-3’和DNA oligo-R 5’-aaaccgcacagcgcccgcatgtacc-3’退火结合。
把合成并待退火DNA oligo用DEPC处理的水配置成 50μM ， 溶 解 AnnealingBuffer for DNA Oligos (5×)，混匀备用。设置反应体系如表1。
表1
按照上述反应体系依次加入各种试剂，混匀。设置 PCR 仪进行退火反应如下：95℃、2min，每8s下降0.1℃，降至25℃约90min；酶切载体pLV.shRNA.P/EGFP/T2A/Puro (singlegRNA)，酶切体系设置如表2。37℃酶切3个小时，6×loading buffer 终止反应，用 1%的琼脂糖凝胶进行电泳并切胶回收。DNA 琼脂糖凝胶电泳回收参照天根的 DNA 琼脂糖凝胶电泳回收试剂盒进行回收，回收后再次电泳，并测浓度。
表2
连接pLV.shRNA.P/EGFP/T2A/Puro 与退火的Oligo DNA片段，连接体系设置如表3。4℃连接过夜。
表3
转化 stb13 细菌：把 10μL 连接反应物加入到 100μL STBL3 Chemically CompetentE. coli 中，冰上孵育 30 分钟；42℃热击细胞 30 秒；立即转移到冰上孵育 2 分钟；加入250μL S.O.C. medium，在 37℃、 225 RPM.的摇床里孵育 1 小时；把 100μL 转化物涂到含有 100 μg/mL Amp 的 LB 平板上， 37℃孵育过夜。鉴定：PCR筛选阳性重组子。PCR 反应体系见表4。PCR 扩增程序：98℃ 5 min，94℃ 30s；60℃ 30s；72℃ 30s（ 2kb/min）；29个循环，72℃ 3min。挑取阳性克隆质粒，阳性克隆测序鉴定。
表4
（2）构建如图4所示的pDONOR载体pDonor-{hSOX2-L}:{EGFP:IRES:Puro}:{hSOX2-R}：采用gateway载体构建方法：a、利用重叠PCR扩增attB1-EGFP:IRES:Puro-attB2：以上游引物5’- actttgtacaaaaaagcaggctgccaccatggtgagcaagg-3’和下游引物5’-actttgtacaagaaagctgggttcaggcaccgggcttgcg -3’为引物对，以含EGFP:IRES:Puro片段的骨架载体为底物，扩增基因序列EGFP:IRES:Puro，长度为1935bp；b、利用GatewayTechnology构建pDown：以扩增的attB1-EGFP:IRES:Puro-attB2为模板，与Gateway目的载体进行有效重组，获得重组BP反应产物，然后将其转染STBL3 E. coli得到重组pDONOR载体。
1) 利用重叠PCR扩增attB1 - EGFP:IRES:Puro -attB2：以上游引物5’-actttgtacaaaaaagcaggctgccaccatggtgagcaagg-3’和下游引物5’-actttgtacaagaaagctgggttcaggcaccgggcttgcg -3’为引物对，以含EGFP:IRES:Puro片段的骨架载体为底物，扩增基因序列EGFP:IRES:Puro，长度为1904bp。反应体系见表5，扩增程序见表6。然后用 1%的琼脂糖凝胶进行电泳。DNA 琼脂糖凝胶电泳回收参照 QIAquick 的琼脂糖凝胶电泳回收试剂盒进行回收。
表5
表6
2) 利用 Gateway Technology 构建 pDown：25℃， BP重组反应 3 h。反应体系见表7。反应完成后加入蛋白酶K终止反应10 min。转化BP反应产物到大肠杆菌Stbl3：冰上溶解1管感受态；把2 μL BP 反应物加入到One Shot stb13 Chemicallly Competent Cells中，冰上孵育30分钟；42℃热击细胞90秒；立即转移到冰上孵育2分钟；加入300 μL S.O.C.medium，在37℃、225 RPM.的摇床里孵育1小时；把100μL转化物涂到含有50 μg/mL Kan的LB平板上，37℃孵育过夜。
表7
获得的菌落进行PCR筛选阳性克隆：PCR反应体系见表8，PCR扩增程序见表9，扩增好后挑取阳性克隆质粒，阳性克隆进行测序。
表8
表9
3) 利用 Gateway Technology 构建 pUP- hSOX2-L：以attB4- hSOX2-L–attB1 为模板，与Gateway目的载体进行有效重组，获得重组BP反应产物，然后将其转染STBL3 E. coli得到重组pUP-hSOX2-L载体。
25℃，BP 反应3 h。反应体系见表10，反应完成后加入蛋白酶 K 终止反应 10min。转化 BP 反应产物到大肠杆菌 Stbl3：冰上溶解 1 管感受态；把 2 μL BP 反应物加入到 One Shot stb13 Chemicallly Competent Cells 中，冰上孵育 30 分钟；42℃热击细胞90秒；立即转移到冰上孵育2分钟；加入300 μL S.O.C. medium，在37℃、 225 RPM.的摇床里孵育1小时；把100μL转化物涂到含有50 μg/mL Kan的LB平板上， 37℃孵育过夜。获得的菌落进行PCR筛选阳性克隆，PCR反应体系见表11，PCR扩增程序见表9，扩增完成后挑取阳性克隆质粒进行测序。
表10
表11
（4）利用 Gateway clone 构建 pTail- hSOX2-R：以attB2- hSOX2-R –attB3为模板，与Gateway目的载体进行有效重组，获得重组BP反应产物，然后将其转染STBL3 E. coli得到重组pTail- hSOX2-R载体。
25℃， BP 反应 3 h。反应体系见表12，反应完成后加入蛋白酶 K 终止反应 10min，转化 BP 反应产物到大肠杆菌 Stbl3：冰上溶解 1 管感受态；把 2 μL BP 反应物加入到 One Shot stb13 Chemicallly Competent Cells 中，冰上孵育 30 分钟；42℃热击细胞90秒；立即转移到冰上孵育2分钟；加入300 μL S.O.C. medium，在37℃、 225 RPM.的摇床里孵育1小时；把100 μL转化物涂到含有50 μg/mL Kan的LB平板上， 37℃孵育过夜。菌落进行PCR筛选阳性克隆，PCR反应体系见表13，PCR扩增程序见表9，扩增完成后挑取阳性克隆质粒进行测序。
表12
表13
（5）利用Gateway Technology构建表达载体pRP[CRISPR]-hCas9-U6>hSOX2[gRNA]：提取质粒pDown-和骨架载体，利用pUP-hSOX2-L载体、pDown- EGFP:IRES:Puro、pTail-hSOX2-R为模板，与Gateway目的载体进行LR反应，获得重组LR反应产物，然后转化LR反应产物到STBL3 E. coli得到重组pRP[CRISPR]-hCas9-U6>hSOX2[gRNA]载体。
小量提取质粒 pDown- 和骨架载体。25℃，LR 反应 3 h。反应体系见表14，反应完成后加入蛋白酶 K 终止反应 10 min。转化 LR 反应产物到 Stbl3。菌落 PCR 筛选阳性克隆。挑取阳性克隆质粒进行测序。
表14
将该重组载体经酶切加以鉴定，用1.2%的琼脂糖凝胶进行电泳分离，鉴定结果合格，见图5中的p33泳道。该载体可以在gRNA载体引导下，将载体上携带的{EGFP:IRES:Puro}基因片段插入到指定的位置。
实验例1：对制备好的载体转染细胞，显微镜检：
（1）将gRNA载体和pDONOR载体转染到细胞。转染前一天把4×105细胞培养到六孔板内，转染时将六孔板内换成无血清培养基，体积2 mL；将lipofectamine 2000脂质体转染试剂轻轻摇匀；
（2）各取两个离心管，其中一个离心管加入4 ug质粒DNA到250 uL DMEM溶液，用枪轻轻吹打；另一个离心管加入250 uL DMEM溶液再加入12 uL lipofiter，用枪轻轻吹匀，室温放置5min；
（3）将以上两管溶液混合，用枪轻轻吹打；室温孵育20分钟；
（4）将500 uL的混合液加入六孔板内，培养6小时去除原有培养液，加入含血清的培养液继续培养；继续培养24小时后，用荧光显微镜观察表达GFP基因，继续培养24小时后，加入嘌呤霉素进行筛选。
结果显示：
1.由于在SOX2基因的启动子下游导入绿色荧光蛋白表达基因，所以当SOX2表达，绿色荧光蛋白就会表达，也就是说，只要绿色荧光表达，细胞就是处于干细胞状态的，能够指示细胞群中肿瘤干细胞的存在位置。
2.当细胞中SOX2不表达，绿色荧光蛋白就不会表达，也就是说细胞不是干细胞状态，已经分化，所以我们能通过绿色荧光蛋白的表达，知道其分化状态；同理，嘌呤霉素抗性基因的表达也是与SOX2的表达相关，如果细胞处于干细胞状态，就具有嘌呤霉素抗性，而分化细胞不具有嘌呤霉素抗性，能够被培养液中的嘌呤霉素杀死。这样，就可以用嘌呤霉素去除混杂细胞群中的分化细胞，只留下肿瘤干细胞，方便对这个单一细胞群进行研究。
稳定转染的食管鳞癌干细胞可以自由分化，已分化的细胞，由于SOX2基因处于沉默状态，所以其启动子后的绿色荧光蛋白和嘌呤霉素抗性基因不能启动表达，因此细胞既不显示绿色荧光，也不具有嘌呤霉素抗性（图6）；反之，处于干细胞状态的细胞，由于SOX2的表达，既显示绿色荧光，又能够在添加了嘌呤霉素的培养基中生存下来（图7）。
收集这些表达绿色荧光的细胞，用RT-qPCR检测SOX2基因的表达，对比图6中的混合细胞，发现图7中纯绿色的细胞，SOX2的表达要高许多（图8），说明在绿色细胞群体中的干细胞比混合细胞群体中的多，暗示绿色细胞为干细胞状态。
因此，利用CRISPR/Cas9系统进行基因重组，在食管鳞癌细胞转录因子SOX2基因5’-UTR区域插入绿色荧光蛋白（GFP）表达基因和嘌呤霉素抗性基因（Puror）（图1）。根据基因表达原理，当GFP表达时，指示SOX2基因表达，即细胞仍然处于干细胞状态；这样一来，当细胞有绿色荧光时，我们可以找到干细胞存在的位置，同时表明SOX2已经表达，表明细胞处于干细胞状态；另外，我们同时又插入了嘌呤霉素抗性基因，因此在培养基中加入嘌呤霉素，能够去除已经分化的细胞，只留下食管鳞癌肿瘤干细胞。这样，达到了分离纯化肿瘤干细胞的目的。
这样就能够解决食管鳞癌肿瘤干细胞研究的瓶颈，推动食管鳞癌肿瘤干细胞的研究，乃至所有类型肿瘤干细胞的研究。
序列表
<110> 山西医科大学
<120> 一种用于分离纯化食管鳞癌肿瘤干细胞的重组载体及其应用
<160> 2
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 8508
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
gagggcctat ttcccatgat tccttcatat ttgcatatac gatacaaggc tgttagagag 60
ataattggaa ttaatttgac tgtaaacaca aagatattag tacaaaatac gtgacgtaga 120
aagtaataat ttcttgggta gtttgcagtt ttaaaattat gttttaaaat ggactatcat 180
atgcttaccg taacttgaaa gtatttcgat ttcttggctt tatatatctt gtggaaagga 240
cgaaacaccg gtacatgcgg gcgctgtgcg gttttagagc tagaaatagc aagttaaaat 300
aaggctagtc cgttatcaac ttgaaaaagt ggcaccgagt cggtgctttt ttgttttaga 360
gctagaaata gcaagttaaa ataaggctag tccgttttta gcgcgtgcgc caattctgca 420
gacaaatggc tctagaggta cccgttacat aacttacggt aaatggcccg cctggctgac 480
cgcccaacga cccccgccca ttgacgtcaa tagtaacgcc aatagggact ttccattgac 540
gtcaatgggt ggagtattta cggtaaactg cccacttggc agtacatcaa gtgtatcata 600
tgccaagtac gccccctatt gacgtcaatg acggtaaatg gcccgcctgg cattgtgccc 660
agtacatgac cttatgggac tttcctactt ggcagtacat ctacgtatta gtcatcgcta 720
ttaccatggt cgaggtgagc cccacgttct gcttcactct ccccatctcc cccccctccc 780
cacccccaat tttgtattta tttatttttt aattattttg tgcagcgatg ggggcggggg 840
gggggggggg gcgcgcgcca ggcggggcgg ggcggggcga ggggcggggc ggggcgaggc 900
ggagaggtgc ggcggcagcc aatcagagcg gcgcgctccg aaagtttcct tttatggcga 960
ggcggcggcg gcggcggccc tataaaaagc gaagcgcgcg gcgggcggga gtcgctgcgc 1020
gctgccttcg ccccgtgccc cgctccgccg ccgcctcgcg ccgcccgccc cggctctgac 1080
tgaccgcgtt actcccacag gtgagcgggc gggacggccc ttctcctccg ggctgtaatt 1140
agctgagcaa gaggtaaggg tttaagggat ggttggttgg tggggtatta atgtttaatt 1200
acctggagca cctgcctgaa atcacttttt ttcaggttgg accggtgcca ccatggacta 1260
taaggaccac gacggagact acaaggatca tgatattgat tacaaagacg atgacgataa 1320
gatggcccca aagaagaagc ggaaggtcgg tatccacgga gtcccagcag ccgacaagaa 1380
gtacagcatc ggcctggaca tcggcaccaa ctctgtgggc tgggccgtga tcaccgacga 1440
gtacaaggtg cccagcaaga aattcaaggt gctgggcaac accgaccggc acagcatcaa 1500
gaagaacctg atcggagccc tgctgttcga cagcggcgaa acagccgagg ccacccggct 1560
gaagagaacc gccagaagaa gatacaccag acggaagaac cggatctgct atctgcaaga 1620
gatcttcagc aacgagatgg ccaaggtgga cgacagcttc ttccacagac tggaagagtc 1680
cttcctggtg gaagaggata agaagcacga gcggcacccc atcttcggca acatcgtgga 1740
cgaggtggcc taccacgaga agtaccccac catctaccac ctgagaaaga aactggtgga 1800
cagcaccgac aaggccgacc tgcggctgat ctatctggcc ctggcccaca tgatcaagtt 1860
ccggggccac ttcctgatcg agggcgacct gaaccccgac aacagcgacg tggacaagct 1920
gttcatccag ctggtgcaga cctacaacca gctgttcgag gaaaacccca tcaacgccag 1980
cggcgtggac gccaaggcca tcctgtctgc cagactgagc aagagcagac ggctggaaaa 2040
tctgatcgcc cagctgcccg gcgagaagaa gaatggcctg ttcggaaacc tgattgccct 2100
gagcctgggc ctgaccccca acttcaagag caacttcgac ctggccgagg atgccaaact 2160
gcagctgagc aaggacacct acgacgacga cctggacaac ctgctggccc agatcggcga 2220
ccagtacgcc gacctgtttc tggccgccaa gaacctgtcc gacgccatcc tgctgagcga 2280
catcctgaga gtgaacaccg agatcaccaa ggcccccctg agcgcctcta tgatcaagag 2340
atacgacgag caccaccagg acctgaccct gctgaaagct ctcgtgcggc agcagctgcc 2400
tgagaagtac aaagagattt tcttcgacca gagcaagaac ggctacgccg gctacattga 2460
cggcggagcc agccaggaag agttctacaa gttcatcaag cccatcctgg aaaagatgga 2520
cggcaccgag gaactgctcg tgaagctgaa cagagaggac ctgctgcgga agcagcggac 2580
cttcgacaac ggcagcatcc cccaccagat ccacctggga gagctgcacg ccattctgcg 2640
gcggcaggaa gatttttacc cattcctgaa ggacaaccgg gaaaagatcg agaagatcct 2700
gaccttccgc atcccctact acgtgggccc tctggccagg ggaaacagca gattcgcctg 2760
gatgaccaga aagagcgagg aaaccatcac cccctggaac ttcgaggaag tggtggacaa 2820
gggcgcttcc gcccagagct tcatcgagcg gatgaccaac ttcgataaga acctgcccaa 2880
cgagaaggtg ctgcccaagc acagcctgct gtacgagtac ttcaccgtgt ataacgagct 2940
gaccaaagtg aaatacgtga ccgagggaat gagaaagccc gccttcctga gcggcgagca 3000
gaaaaaggcc atcgtggacc tgctgttcaa gaccaaccgg aaagtgaccg tgaagcagct 3060
gaaagaggac tacttcaaga aaatcgagtg cttcgactcc gtggaaatct ccggcgtgga 3120
agatcggttc aacgcctccc tgggcacata ccacgatctg ctgaaaatta tcaaggacaa 3180
ggacttcctg gacaatgagg aaaacgagga cattctggaa gatatcgtgc tgaccctgac 3240
actgtttgag gacagagaga tgatcgagga acggctgaaa acctatgccc acctgttcga 3300
cgacaaagtg atgaagcagc tgaagcggcg gagatacacc ggctggggca ggctgagccg 3360
gaagctgatc aacggcatcc gggacaagca gtccggcaag acaatcctgg atttcctgaa 3420
gtccgacggc ttcgccaaca gaaacttcat gcagctgatc cacgacgaca gcctgacctt 3480
taaagaggac atccagaaag cccaggtgtc cggccagggc gatagcctgc acgagcacat 3540
tgccaatctg gccggcagcc ccgccattaa gaagggcatc ctgcagacag tgaaggtggt 3600
ggacgagctc gtgaaagtga tgggccggca caagcccgag aacatcgtga tcgaaatggc 3660
cagagagaac cagaccaccc agaagggaca gaagaacagc cgcgagagaa tgaagcggat 3720
cgaagagggc atcaaagagc tgggcagcca gatcctgaaa gaacaccccg tggaaaacac 3780
ccagctgcag aacgagaagc tgtacctgta ctacctgcag aatgggcggg atatgtacgt 3840
ggaccaggaa ctggacatca accggctgtc cgactacgat gtggaccata tcgtgcctca 3900
gagctttctg aaggacgact ccatcgacaa caaggtgctg accagaagcg acaagaaccg 3960
gggcaagagc gacaacgtgc cctccgaaga ggtcgtgaag aagatgaaga actactggcg 4020
gcagctgctg aacgccaagc tgattaccca gagaaagttc gacaatctga ccaaggccga 4080
gagaggcggc ctgagcgaac tggataaggc cggcttcatc aagagacagc tggtggaaac 4140
ccggcagatc acaaagcacg tggcacagat cctggactcc cggatgaaca ctaagtacga 4200
cgagaatgac aagctgatcc gggaagtgaa agtgatcacc ctgaagtcca agctggtgtc 4260
cgatttccgg aaggatttcc agttttacaa agtgcgcgag atcaacaact accaccacgc 4320
ccacgacgcc tacctgaacg ccgtcgtggg aaccgccctg atcaaaaagt accctaagct 4380
ggaaagcgag ttcgtgtacg gcgactacaa ggtgtacgac gtgcggaaga tgatcgccaa 4440
gagcgagcag gaaatcggca aggctaccgc caagtacttc ttctacagca acatcatgaa 4500
ctttttcaag accgagatta ccctggccaa cggcgagatc cggaagcggc ctctgatcga 4560
gacaaacggc gaaaccgggg agatcgtgtg ggataagggc cgggattttg ccaccgtgcg 4620
gaaagtgctg agcatgcccc aagtgaatat cgtgaaaaag accgaggtgc agacaggcgg 4680
cttcagcaaa gagtctatcc tgcccaagag gaacagcgat aagctgatcg ccagaaagaa 4740
ggactgggac cctaagaagt acggcggctt cgacagcccc accgtggcct attctgtgct 4800
ggtggtggcc aaagtggaaa agggcaagtc caagaaactg aagagtgtga aagagctgct 4860
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caagggctac aaagaagtga aaaaggacct gatcatcaag ctgcctaagt actccctgtt 4980
cgagctggaa aacggccgga agagaatgct ggcctctgcc ggcgaactgc agaagggaaa 5040
cgaactggcc ctgccctcca aatatgtgaa cttcctgtac ctggccagcc actatgagaa 5100
gctgaagggc tcccccgagg ataatgagca gaaacagctg tttgtggaac agcacaagca 5160
ctacctggac gagatcatcg agcagatcag cgagttctcc aagagagtga tcctggccga 5220
cgctaatctg gacaaagtgc tgtccgccta caacaagcac cgggataagc ccatcagaga 5280
gcaggccgag aatatcatcc acctgtttac cctgaccaat ctgggagccc ctgccgcctt 5340
caagtacttt gacaccacca tcgaccggaa gaggtacacc agcaccaaag aggtgctgga 5400
cgccaccctg atccaccaga gcatcaccgg cctgtacgag acacggatcg acctgtctca 5460
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gtaagaattc ctagagctcg ctgatcagcc tcgactgtgc cttctagttg ccagccatct 5580
gttgtttgcc cctcccccgt gccttccttg accctggaag gtgccactcc cactgtcctt 5640
tcctaataaa atgaggaaat tgcatcgcat tgtctgagta ggtgtcattc tattctgggg 5700
ggtggggtgg ggcaggacag caagggggag gattgggaag agaatagcag gcatgctggg 5760
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ctcactgagg ccgggcgacc aaaggtcgcc cgacgcccgg gctttgcccg ggcggcctca 5880
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catctgtgcg gtatttcaca ccgcatacgt caaagcaacc atagtacgcg ccctgtagcg 6000
gcgcattaag cgcggcgggt gtggtggtta cgcgcagcgt gaccgctaca cttgccagcg 6060
ccttagcgcc cgctcctttc gctttcttcc cttcctttct cgccacgttc gccggctttc 6120
cccgtcaagc tctaaatcgg gggctccctt tagggttccg atttagtgct ttacggcacc 6180
tcgaccccaa aaaacttgat ttgggtgatg gttcacgtag tgggccatcg ccctgataga 6240
cggtttttcg ccctttgacg ttggagtcca cgttctttaa tagtggactc ttgttccaaa 6300
ctggaacaac actcaactct atctcgggct attcttttga tttataaggg attttgccga 6360
tttcggtcta ttggttaaaa aatgagctga tttaacaaaa atttaacgcg aattttaaca 6420
aaatattaac gtttacaatt ttatggtgca ctctcagtac aatctgctct gatgccgcat 6480
agttaagcca gccccgacac ccgccaacac ccgctgacgc gccctgacgg gcttgtctgc 6540
tcccggcatc cgcttacaga caagctgtga ccgtctccgg gagctgcatg tgtcagaggt 6600
tttcaccgtc atcaccgaaa cgcgcgagac gaaagggcct cgtgatacgc ctatttttat 6660
aggttaatgt catgataata atggtttctt agacgtcagg tggcactttt cggggaaatg 6720
tgcgcggaac ccctatttgt ttatttttct aaatacattc aaatatgtat ccgctcatga 6780
gacaataacc ctgataaatg cttcaataat attgaaaaag gaagagtatg agtattcaac 6840
atttccgtgt cgcccttatt cccttttttg cggcattttg ccttcctgtt tttgctcacc 6900
cagaaacgct ggtgaaagta aaagatgctg aagatcagtt gggtgcacga gtgggttaca 6960
tcgaactgga tctcaacagc ggtaagatcc ttgagagttt tcgccccgaa gaacgttttc 7020
caatgatgag cacttttaaa gttctgctat gtggcgcggt attatcccgt attgacgccg 7080
ggcaagagca actcggtcgc cgcatacact attctcagaa tgacttggtt gagtactcac 7140
cagtcacaga aaagcatctt acggatggca tgacagtaag agaattatgc agtgctgcca 7200
taaccatgag tgataacact gcggccaact tacttctgac aacgatcgga ggaccgaagg 7260
agctaaccgc ttttttgcac aacatggggg atcatgtaac tcgccttgat cgttgggaac 7320
cggagctgaa tgaagccata ccaaacgacg agcgtgacac cacgatgcct gtagcaatgg 7380
caacaacgtt gcgcaaacta ttaactggcg aactacttac tctagcttcc cggcaacaat 7440
taatagactg gatggaggcg gataaagttg caggaccact tctgcgctcg gcccttccgg 7500
ctggctggtt tattgctgat aaatctggag ccggtgagcg tggaagccgc ggtatcattg 7560
cagcactggg gccagatggt aagccctccc gtatcgtagt tatctacacg acggggagtc 7620
aggcaactat ggatgaacga aatagacaga tcgctgagat aggtgcctca ctgattaagc 7680
attggtaact gtcagaccaa gtttactcat atatacttta gattgattta aaacttcatt 7740
tttaatttaa aaggatctag gtgaagatcc tttttgataa tctcatgacc aaaatccctt 7800
aacgtgagtt ttcgttccac tgagcgtcag accccgtaga aaagatcaaa ggatcttctt 7860
gagatccttt ttttctgcgc gtaatctgct gcttgcaaac aaaaaaacca ccgctaccag 7920
cggtggtttg tttgccggat caagagctac caactctttt tccgaaggta actggcttca 7980
gcagagcgca gataccaaat actgttcttc tagtgtagcc gtagttaggc caccacttca 8040
agaactctgt agcaccgcct acatacctcg ctctgctaat cctgttacca gtggctgctg 8100
ccagtggcga taagtcgtgt cttaccgggt tggactcaag acgatagtta ccggataagg 8160
cgcagcggtc gggctgaacg gggggttcgt gcacacagcc cagcttggag cgaacgacct 8220
acaccgaact gagataccta cagcgtgagc tatgagaaag cgccacgctt cccgaaggga 8280
gaaaggcgga caggtatccg gtaagcggca gggtcggaac aggagagcgc acgagggagc 8340
ttccaggggg aaacgcctgg tatctttata gtcctgtcgg gtttcgccac ctctgacttg 8400
agcgtcgatt tttgtgatgc tcgtcagggg ggcggagcct atggaaaaac gccagcaacg 8460
cggccttttt acggttcctg gccttttgct ggccttttgc tcacatgt 8508
<210> 2
<211> 5806
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
cgtacgggcg cgccgcggcc gccaactttg tatagaaaag ttgtgacaca ccaactcctg 60
cactggctgt ttccagaaat acgagttgga cagccgccct gagccaccca ctgtgccctg 120
ccccaccccc gcaccttagc tgcttcccgc gtcccatcct catttaagta ccctgcacca 180
aaaagtaaat caatattaag tttaaagaaa aaaaaaccca cgtagtctta gtgctgttta 240
cccacttcct tcgaaaaggc gtgtggtgtg acctgttgct gcgagagggg atacaaaggt 300
ttctcagtgg ctggcaggct ggctctggga gcctcctccc cctcctcgcc tgccccctcc 360
tcccccggcc tcccccgcgc ggccggcggc gcgggaggcc ccgccccctt tcatgcaaaa 420
cccggcagcg aggctgggct cgagtggagg agccgccgcg cgctgattgg tcgctagaaa 480
cccatttatt ccctgacagc ccccgtcaca tggatggttg tctattaact tgttcaaaaa 540
agtatcagga gttgtcaagg cagagaagag agtgtttgca aaagggggaa agtagtttgc 600
tgcctcttta agactaggac tgagagaaag aagaggagag agaaagaaag ggagagaagt 660
ttgagcccca ggcttaagcc tttccaaaaa ataataataa caatcatcgg cggcggcagg 720
atcggccaga ggaggaggga agcgcttttt ttgatcctga ttccagtttg cctctctctt 780
tttttccccc aaattattct tcgcctgatt ttcctcgcgg agccctgcgc tcccgacacc 840
cccgcccgcc tcccctcctc ctctcccccc gcccgcgggc cccccaaagt cccggccggg 900
ccgagggtcg gcggccgccg gcgggccggg cgggcgcaca gcgcccgcca agtttgtaca 960
aaaaagcagg ctgccaccat ggtgagcaag ggcgaggagc tgttcaccgg ggtggtgccc 1020
atcctggtcg agctggacgg cgacgtaaac ggccacaagt tcagcgtgtc cggcgagggc 1080
gagggcgatg ccacctacgg caagctgacc ctgaagttca tctgcaccac cggcaagctg 1140
cccgtgccct ggcccaccct cgtgaccacc ctgacctacg gcgtgcagtg cttcagccgc 1200
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ggcaacatcc tggggcacaa gctggagtac aactacaaca gccacaacgt ctatatcatg 1440
gccgacaagc agaagaacgg catcaaggtg aacttcaaga tccgccacaa catcgaggac 1500
ggcagcgtgc agctcgccga ccactaccag cagaacaccc ccatcggcga cggccccgtg 1560
ctgctgcccg acaaccacta cctgagcacc cagtccgccc tgagcaaaga ccccaacgag 1620
aagcgcgatc acatggtcct gctggagttc gtgaccgccg ccgggatcac tctcggcatg 1680
gacgagctgt acaagtaagc ccctctccct cccccccccc taacgttact ggccgaagcc 1740
gcttggaata aggccggtgt gcgtttgtct atatgttatt ttccaccata ttgccgtctt 1800
ttggcaatgt gagggcccgg aaacctggcc ctgtcttctt gacgagcatt cctaggggtc 1860
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cacctggcga caggtgcctc tgcggccaaa agccacgtgt ataagataca cctgcaaagg 2040
cggcacaacc ccagtgccac gttgtgagtt ggatagttgt ggaaagagtc aaatggctct 2100
cctcaagcgt attcaacaag gggctgaagg atgcccagaa ggtaccccat tgtatgggat 2160
ctgatctggg gcctcggtgc acatgcttta catgtgttta gtcgaggtta aaaaaacgtc 2220
taggcccccc gaaccacggg gacgtggttt tcctttgaaa aacacgatga taatatggcc 2280
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gccgtacgca ccctcgccgc cgcgttcgcc gactaccccg ccacgcgcca caccgtcgat 2400
ccggaccgcc acatcgagcg ggtcaccgag ctgcaagaac tcttcctcac gcgcgtcggg 2460
ctcgacatcg gcaaggtgtg ggtcgcggac gacggcgccg cggtggcggt ctggaccacg 2520
ccggagagcg tcgaagcggg ggcggtgttc gccgagatcg gcccgcgcat ggccgagttg 2580
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aaggagcccg cgtggttcct ggccaccgtc ggcgtctcgc ccgaccacca gggcaagggt 2700
ctgggcagcg ccgtcgtgct ccccggagtg gaggcggccg agcgcgccgg ggtgcccgcc 2760
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accgccgacg tcgaggtgcc cgaaggaccg cgcacctggt gcatgacccg caagcccggt 2880
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ccgggcccgc agcaaacttc ggggggcggc ggcggcaact ccaccgcggc ggcggccggc 3000
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ctggcccccg gcggcaatag catggcgagc ggggtcgggg tgggcgccgg cctgggcgcg 3360
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agcatgatgc aggaccagct gggctacccg cagcacccgg gcctcaatgc gcacggcgca 3480
gcgcagatgc agcccatgca ccgctacgac gtgagcgccc tgcagtacaa ctccatgacc 3540
agctcgcaga cctacatgaa cggctcgccc acctacagca tgtcctactc gcagcagggc 3600
acccctggca tggctcttgg ctccatgggt tcggtggtca agtccgaggc cagctccagc 3660
ccccctgtgg ttacctcttc ctcccactcc agggcgccct gccaggccgg ggacctccgg 3720
gacatgatca gcatgtatct ccccggcgcc gaggtgccgg aacccgccgc caactttatt 3780
atacatagtt gttaattaag gcgctcttcc gcttcctcgc tcactgactc gctgcgctcg 3840
gtcgttcggc tgcggcgagc ggtatcagct cactcaaagg cggtaatacg gttatccaca 3900
gaatcagggg ataacgcagg aaagaacatg tgagcaaaag gccagcaaaa ggccaggaac 3960
cgtaaaaagg ccgcgttgct ggcgtttttc cataggctcc gcccccctga cgagcatcac 4020
aaaaatcgac gctcaagtca gaggtggcga aacccgacag gactataaag ataccaggcg 4080
tttccccctg gaagctccct cgtgcgctct cctgttccga ccctgccgct taccggatac 4140
ctgtccgcct ttctctcttc gggaagcgtg gcgctttctc atagctcacg ctgtaggtat 4200
ctcagttcgg tgtaggtcgt tcgctccaag ctgggctgtg tgcacgaacc ccccgttcag 4260
cccgaccgct gcgccttatc cggtaactat cgtcttgagt ccaacccggt aagacacgac 4320
ttatcgccac tggcagcagc cactggtaac aggattagca gagcgaggta tgtaggcggt 4380
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aaacaaacca ccgctggtag cggtggtttt tttgtttgca agcagcagat tacgcgcaga 4560
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gacagttacc aatgcttaat cagtgaggca cctatctcag cgatctgtct atttcgttca 4800
tccatagttg cctgactccc cgtcgtgtag ataactacga tacgggaggg cttaccatct 4860
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cgcaacgttg ttgccattgc tacaggcatc gtggtgtcac gctcgtcgtt tggtatggct 5100
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gtgctcatca ttggaaaacg ttcttcgggg cgaaaactct caaggatctt accgctgttg 5460
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gcgacacgga aatgttgaat actcatactc ttcctttttc aatattattg aagcatttat 5640
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atgacattaa cctataaaaa taggcgtatc acgaggccct ttcgtc 5806

Claims (5)

1.一种用于分离纯化食管鳞癌肿瘤干细胞的重组载体，其特征在于利用CRISPR系统进行基因重组，在食管鳞癌细胞转录因子SOX2的5’-UTR区域插入绿色荧光蛋白GFP表达基因和嘌呤霉素抗性基因Puror，构建重组载体组合，该重组载体组合由gRNA载体pRP[CRISPR]-hCas9-U6>{hSOX2[gRNA]}和pDONOR载体pDonor-{hSOX2-L}:{EGFP:IRES:Puro}:{hSOX2-R}组成。
2.根据权利要求1所述的一种用于分离纯化食管鳞癌肿瘤干细胞的重组载体，其特征在于：所述重组载体pRP[CRISPR]-hCas9-U6>hSOX2[gRNA]的靶点序列为：gtacatgcgggcgctgtgcg。
3.根据权利要求1所述的一种用于分离纯化食管鳞癌肿瘤干细胞的重组载体，其特征在于：所述gRNA载体的基因序列如SEQ ID NO.1；所述pDONOR载体的序列如SEQ ID NO.2。
4.根据权利要求1至3所述的任意一种用于分离纯化食管鳞癌肿瘤干细胞的重组载体，其特征在于：具体制备方法为：
（1）构建gRNA载体pRP[CRISPR]-hCas9-U6>{hSOX2[gRNA]}：用Oligo DNA退火的方法，将DNA oligo-F 5’-caccggtacatgcgggcgctgtgcg-3’和DNA oligo-R 5’-aaaccgcacagcgcccgcatgtacc-3’退火结合，酶切载体pLV.shRNA.P/EGFP/T2A/Puro(single gRNA)，连接pLV.shRNA.P/EGFP/T2A/Puro 与退火的Oligo DNA片段，所获得的连接反应物转化 STBL3 E. coli得到重组gRNA载体；
（2）构建pDONOR载体pDonor-{hSOX2-L}:{EGFP:IRES:Puro}:{hSOX2-R}：采用Gateway载体构建方法：
a、利用重叠PCR扩增attB1-EGFP:IRES:Puro-attB2：以上游引物5’-actttgtacaaaaaagcaggctgccaccatggtgagcaagg-3’和下游引物5’-actttgtacaagaaagctgggttcaggcaccgggcttgcg -3’为引物对，以含EGFP:IRES:Puro片段的骨架载体为底物，扩增基因序列EGFP:IRES:Puro，长度为1935bp；
b、利用Gateway Technology构建pDown：以扩增的attB1-EGFP:IRES:Puro-attB2为模板，与Gateway目的载体进行有效重组，获得重组BP反应产物，然后将其转染STBL3 E. coli得到重组pDown载体；
c、构建pUP-hSOX2-L：采用gateway载体构建方法：以attB4- hSOX2-L–attB1 为模板，与Gateway目的载体进行有效重组，获得重组BP反应产物，然后将其转染STBL3 E. coli得到重组pUP-hSOX2-L载体；
d、利用 Gateway载体构建方法构建 pTail- hSOX2-R：以attB2- hSOX2-R –attB3为模板，与Gateway目的载体进行有效重组，获得重组BP反应产物，然后将其转染STBL3 E. coli得到重组pTail- hSOX2-R载体；
e、利用Gateway Technology构建表达载体pDonor-{hSOX2-L}:{EGFP:IRES:Puro}:{hSOX2-R}：提取质粒pDown-和骨架载体，利用pUP-hSOX2-L载体、pDown- EGFP:IRES:Puro、pTail- hSOX2-R为模板，与Gateway目的载体进行LR反应，获得重组LR反应产物，然后转化LR反应产物到STBL3 E. coli得到重组pDonor-{hSOX2-L}:{EGFP:IRES:Puro}:{hSOX2-R}载体。
5.权利要求1所述的用于分离纯化食管鳞癌肿瘤干细胞的重组载体的应用，其特征在于：该重组载体用于筛选、分离、纯化食管鳞癌肿瘤干细胞。
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