CN110343698B - 构建B2m定点敲入人B2M cDNA小鼠模型的方法 - Google Patents

构建B2m定点敲入人B2M cDNA小鼠模型的方法 Download PDF

Info

Publication number
CN110343698B
CN110343698B CN201810305819.7A CN201810305819A CN110343698B CN 110343698 B CN110343698 B CN 110343698B CN 201810305819 A CN201810305819 A CN 201810305819A CN 110343698 B CN110343698 B CN 110343698B
Authority
CN
China
Prior art keywords
mouse
sequence
seq
cdna
human
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Active
Application number
CN201810305819.7A
Other languages
English (en)
Other versions
CN110343698A (zh
Inventor
张雅鸥
王子强
王松茂
许乃寒
张佩琢
谢伟东
张世宽
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Suzhou Genepharma Co ltd
Shenzhen Graduate School Tsinghua University
Original Assignee
Suzhou Genepharma Co ltd
Shenzhen Graduate School Tsinghua University
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Suzhou Genepharma Co ltd, Shenzhen Graduate School Tsinghua University filed Critical Suzhou Genepharma Co ltd
Priority to CN201810305819.7A priority Critical patent/CN110343698B/zh
Publication of CN110343698A publication Critical patent/CN110343698A/zh
Application granted granted Critical
Publication of CN110343698B publication Critical patent/CN110343698B/zh
Active legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Images

Classifications

    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
    • A01K—ANIMAL HUSBANDRY; AVICULTURE; APICULTURE; PISCICULTURE; FISHING; REARING OR BREEDING ANIMALS, NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; NEW BREEDS OF ANIMALS
    • A01K67/00—Rearing or breeding animals, not otherwise provided for; New or modified breeds of animals
    • A01K67/027—New or modified breeds of vertebrates
    • A01K67/0275—Genetically modified vertebrates, e.g. transgenic
    • A01K67/0278—Knock-in vertebrates, e.g. humanised vertebrates
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K49/00—Preparations for testing in vivo
    • A61K49/0004—Screening or testing of compounds for diagnosis of disorders, assessment of conditions, e.g. renal clearance, gastric emptying, testing for diabetes, allergy, rheuma, pancreas functions
    • A61K49/0008—Screening agents using (non-human) animal models or transgenic animal models or chimeric hosts, e.g. Alzheimer disease animal model, transgenic model for heart failure
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/46—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates
    • C07K14/47—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates from mammals
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
    • C12N15/113—Non-coding nucleic acids modulating the expression of genes, e.g. antisense oligonucleotides; Antisense DNA or RNA; Triplex- forming oligonucleotides; Catalytic nucleic acids, e.g. ribozymes; Nucleic acids used in co-suppression or gene silencing
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/87—Introduction of foreign genetic material using processes not otherwise provided for, e.g. co-transformation
    • C12N15/90—Stable introduction of foreign DNA into chromosome
    • C12N15/902—Stable introduction of foreign DNA into chromosome using homologous recombination
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
    • A01K—ANIMAL HUSBANDRY; AVICULTURE; APICULTURE; PISCICULTURE; FISHING; REARING OR BREEDING ANIMALS, NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; NEW BREEDS OF ANIMALS
    • A01K2217/00—Genetically modified animals
    • A01K2217/07—Animals genetically altered by homologous recombination
    • A01K2217/072—Animals genetically altered by homologous recombination maintaining or altering function, i.e. knock in
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
    • A01K—ANIMAL HUSBANDRY; AVICULTURE; APICULTURE; PISCICULTURE; FISHING; REARING OR BREEDING ANIMALS, NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; NEW BREEDS OF ANIMALS
    • A01K2227/00—Animals characterised by species
    • A01K2227/10—Mammal
    • A01K2227/105—Murine
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
    • A01K—ANIMAL HUSBANDRY; AVICULTURE; APICULTURE; PISCICULTURE; FISHING; REARING OR BREEDING ANIMALS, NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; NEW BREEDS OF ANIMALS
    • A01K2267/00—Animals characterised by purpose
    • A01K2267/03—Animal model, e.g. for test or diseases
    • A01K2267/0337—Animal models for infectious diseases
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2310/00—Structure or type of the nucleic acid
    • C12N2310/10—Type of nucleic acid
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2310/00—Structure or type of the nucleic acid
    • C12N2310/10—Type of nucleic acid
    • C12N2310/20—Type of nucleic acid involving clustered regularly interspaced short palindromic repeats [CRISPRs]

Landscapes

  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Environmental Sciences (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Toxicology (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Endocrinology (AREA)
  • Diabetes (AREA)
  • Rheumatology (AREA)
  • Urology & Nephrology (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Pathology (AREA)
  • Animal Husbandry (AREA)
  • Biodiversity & Conservation Biology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Mycology (AREA)
  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)

Abstract

本发明公开了一种构建B2m定点敲入人B2M cDNA小鼠模型的方法。该方法包括如下步骤：利用CRISPR/Cas9技术在目的小鼠的基因组中B2m基因的起始密码子处定点敲入缺失起始密码子ATG的人源B2M cDNA。将Cas9mRNA、gRNA和同源重组载体(包含2kb 5’同源臂、Human B2M cDNA‑3×polyA和2kb 3’同源臂)显微注射到C57BL/6J小鼠的受精卵中，进而获得相应的小鼠模型。人源B2M cDNA小鼠对HSV‑1病毒或其它疱疹类DNA病毒易感，可用作动物模型筛查抗病毒药物或研究病毒与宿主相互作用的机理。

Description

构建B2m定点敲入人B2M cDNA小鼠模型的方法
技术领域
本发明涉及生物技术领域，具体涉及一种构建B2m定点敲入人B2M cDNA小鼠模型的方法。
背景技术
人的B2M的RNA转录本与鼠的不同，能促进HSV-1病毒的繁殖，因而人源B2M cDNA小鼠对HSV-1病毒或其它疱疹类DNA病毒易感，可用作动物模型筛查抗病毒药物或研究病毒与宿主相互作用的机理。
CRISPR-Cas9本是细菌用于对抗入侵的病毒及外源DNA一种适应性免疫防御机制，经科研人员的努力目前已发展成为最有力的基因编辑技术。目前，来自Streptococcuspyogenes的CRISPR-Cas9系统应用最为广泛。Cas9蛋白(含有两个核酸酶结构域，可以分别切割DNA两条单链。Cas9首先与crRNA及tracrRNA结合成复合物，然后通过PAM序列结合并侵入DNA，形成RNA-DNA复合结构，进而对目的DNA双链进行切割，使DNA双链断裂。由于PAM序列结构简单(5’-NGG-3’)，几乎可以在所有的基因中找到大量靶点，因此得到广泛的应用。CRISPR-Cas9系统已经成功应用于植物、细菌、酵母、鱼类及哺乳动物细胞，是目前最高效的基因组编辑系统。
发明内容
本发明的目的是提供一种构建B2m定点敲入人源B2M cDNA的小鼠模型的方法。
本发明所提供的构建B2m定点敲入人源B2M cDNA的小鼠模型的方法，包括如下步骤：利用CRISPR/Cas9技术在目的小鼠的基因组中B2m基因的起始密码子处定点敲入缺失起始密码子ATG的人源B2M cDNA。缺失了ATG才能只表达人源B2M mRNA，但不会转录出B2M蛋白，以非编码核酸的形式发挥作用。
在本发明的一个实施例中，具体是利用CRISPR/Cas9技术将目的小鼠的基因组中自B2m基因的起始密码子起向3’端延伸包括B2m基因的起始密码子在内共计13个核苷酸替换为缺失起始密码子ATG的人源B2M cDNA及3xpolyA片段。只要是在目的小鼠的基因组中B2m基因的起始密码子处定点敲入缺失起始密码子ATG的人源B2M cDNA理论上即可实现发明目的，ATG的缺失确保转录出的人源B2M以非编码RNA的形式起作用，而3xpolyA片段的加入，使跟在人源B2M cDNA后面的鼠的B2m基因不会转录。
在所述方法中，作为被Cas9核酸酶切割的靶序列是所述目的小鼠的基因组中B2m基因中符合5’-NX-NGG-3’或5’-CCN-NX-3’序列排列规则的片段；N表示A、G、C和T中的任一种，14≤X≤30，且X为整数(如X＝23)，NX表示X个连续的脱氧核糖核苷酸。
进一步地，所述靶序列为SEQ ID No.1或SEQ ID No.2。
在所述方法中，作为定点敲入工具的同源重组载体上含有如下DNA片段A；所述DNA片段A自上游到下游依次包含5’同源臂、缺失起始密码子ATG的人源B2M cDNA、3个连续的polyA(3xpolyA片段)、3’同源臂；所述5’同源臂为位于所述目的小鼠的基因组中B2m基因的起始密码子上游的2kb序列；所述3’同源臂为位于所述目的小鼠的基因组中B2m基因的起始密码子下游的2kb序列。
进一步地，所述5’同源臂的序列为SEQ ID No.3的第1-2000位；所述缺失起始密码子ATG的人源B2M cDNA的序列为SEQ ID No.3的第2001-2984位；所述3个连续的polyA的序列为SEQ ID No.3的第3008-3758位；所述3’同源臂的序列为SEQ ID No.3的第3781-5780位。
更进一步地，所述DNA片段A的序列具体为SEQ ID No.3。
具体而言，本发明所提供的构建B2m定点敲入人源B2M cDNA小鼠模型的方法，可包括如下步骤：
(1)将Cas9mRNA、gRNA和前文所述的同源重组载体注射到所述目的小鼠的受精卵胞质中，得到F0代小鼠；
所述gRNA的序列为将SEQ ID No.1或SEQ ID No.2中的T替换为U后得到的序列；
(2)将步骤(1)获得的所述F0代小鼠与所述目的小鼠进行杂交，从F1代小鼠中获得B2m定点敲入人源B2M cDNA的杂合体小鼠。
根据需要，在步骤(2)之后，还可包括如下步骤：将雄性的所述杂合体小鼠与雌性的所述杂合体小鼠进行一次或多次杂交，从杂交后代中获得B2m定点敲入人源B2M cDNA的纯合体小鼠。
在步骤(1)中，所述Cas9mRNA和所述gRNA可为体外转录所得。
在步骤(1)中，所述Cas9mRNA的序列具体为SEQ ID No.4。所述同源重组载体具体为将SEQ ID No.3所示DNA片段插入到NM-322载体的第702位和第703位之间后得到的重组质粒。所述NM-322载体的全序列具体为SEQ ID No.5，由生工生物工程(上海)股份有限公司全基因合成。
在本发明中，所述目的小鼠具体为C57BL/6J小鼠。
另外，本发明还要求保护用于构建B2m定点敲入人源B2M cDNA小鼠模型的试剂盒。
本发明所要求保护的用于构建B2m定点敲入人源B2M cDNA小鼠模型的试剂盒，包括前文所述的Cas9mRNA、前文所述的gRNA和前文所述的同源重组载体。
所述试剂盒中还可包含记载有前文所述“构建B2m定点敲入人源B2M cDNA的小鼠模型的方法”相关内容的说明书。
再有，“利用全文所述方法构建得到的小鼠模型在筛查抗病毒药物或研究病毒与宿主相互作用的机理中的应用”，以及“利用全文所述方法构建得到的小鼠模型在作为筛查抗病毒药物或研究病毒与宿主相互作用的机理的动物模型中的应用”也属于本发明的保护范围。
本发明采用CRISPR/Cas9技术，通过同源重组的方式，在B2m基因ATG位点定点敲入人源B2M cDNA的表达框。将Cas9mRNA、gRNA和同源重组载体(包含2kb5’同源臂、Human B2McDNA-3×polyA和2kb 3’同源臂)显微注射到C57BL/6J小鼠的受精卵中，获得F0代小鼠。经长片段PCR鉴定，共获得3只正确同源重组的F0代小鼠；F0代小鼠与C57BL/6J小鼠交配获得6只阳性F1代小鼠。人源B2M cDNA小鼠对HSV-1病毒或其它疱疹类DNA病毒易感，可用作动物模型筛查抗病毒药物或研究病毒与宿主相互作用的机理。
附图说明
图1为B2m定点敲入人B2M cDNA小鼠模型的构建策略示意图。
图2为同源重组载体(donor vector)的质粒图谱。
图3为同源重组载体酶切鉴定及线性化电泳图。E：EcoRI酶切鉴定结果，理论条带大小为5.7kb、2.2kb、1.7kb、644bp、210bp、138bp和108bp(644bp、210bp、210bp、138bp和108bp条带因为产物量太少，无条带显示)；M：1kb DNA ladder。
图4为体外转录所得gRNA1和gRNA2的电泳结果图。
图5为F0代小鼠基因型鉴定策略示意图(F1代小鼠PCR产物测序验证示意图)。
图6为同源重组阳性F0代小鼠PCR鉴定电泳图。25、30和38号为阳性F0小鼠，WT为野生型基因组；5arm为5’同源臂的PCR结果，3arm为3’同源臂的PCR结果；M为1kb DNA marker。
图7为同源重组阳性F1代小鼠PCR鉴定电泳图。数字为阳性F1小鼠，WT为野生型基因组；5arm为5’同源臂的PCR结果，3arm为3’同源臂的PCR结果；M为1kb DNA marker。
图8为F1代小鼠5’同源臂和3’同源臂PCR鉴定测序比对结果。A和B为F1代小鼠5’同源臂PCR鉴定测序比对结果，A为1#测序反应比对结果，B为2#测序反应比对结果；C和D为F1代小鼠3’同源臂PCR鉴定测序比对结果，C为3#测序反应比对结果，D为4#测序反应比对结果。
图9为接种HSV-1后，B2M KI鼠皮肤病变出现早(上图)，皮损重(下图)。WT：野生型小鼠。
具体实施方式
下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。
下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
实施例1、B2m定点敲入人B2M cDNA小鼠模型的构建
本发明设计策略示意图如图1所示。
目的基因名称(MGI号)：B2m(88127)
目的基因MGI网址链接：http://www.informatics.jax.org/marker/MGI:88127
目的基因Ensembl网址链接：
http://asia.ensembl.org/Mus_musculus/Gene/Summary？db＝core；g＝ENSMUSG00000060802；r＝2:122147686-122153083；t＝ENSMUST00000102476
方案针对的转录本(Ensembl号)：B2m-001(ENSMUST00000102476)
敲入位置：ATG处
敲入片段名称：人源B2M cDNA+3×polyA
一、小鼠B2m基因的靶位点的选择与gRNA的设计
利用CRISPER/Cas9技术敲除的靶标双链中的一条链具有如下结构：5’-CCN-NX-3’，PAM(NGG)中的N表示A、T、C和G中的任一种，Nx中的N表示A、T、C和G中的任一种，x＝23。B2m基因的靶序列(gRNA)如表1所示，带下划线的碱基为PAM。
表1 B2m基因的靶序列(gRNA)
gRNA 序列(5’-3’)
gRNA1 GGTCGCTTCAGTCGTCAGCA <u>TGG</u>(SEQ ID No.1)
gRNA2 AGTCGTCAGCATGGCTCGCT <u>CGG</u>(SEQ ID No.2)
二、同源重组载体(donor vector)
同源重组载体(donor vector)的结构描述：将SEQ ID No.3所示DNA片段插入到NM-322载体的全序列(SEQ ID No.5)的第702位和第703位之间后得到的重组质粒。所述NM-322载体序列具体为SEQ ID No.5，由生工生物工程(上海)股份有限公司全基因合成。
同源重组载体(donor vector)的质粒图谱如图2所示，元件信息如表2所示。同源重组载体酶切鉴定及线性化电泳图如图3所示。
表2同源重组载体(donor vector)的元件信息
元件 名称
Amp 氨苄抗性筛选基因
5’arm 5’同源臂
Human B2M cDNA-3×PolyA 插入片段
3’arm 3’同源臂
三、Cas9mRNA和gRNA的体外转录
Cas9mRNA和gRNA来自IDT公司。
最终经体外转录所得的Cas9mRNA的核苷酸序列为SEQ ID No.4。
最终经体外转录所得的gRNA1的核苷酸序列为SEQ ID No.1中的T替换为U后得到的序列。
最终经体外转录所得的gRNA2的核苷酸序列为SEQ ID No.2中的T替换为U后得到的序列。
其中，gRNA1和gRNA2的电泳结果如图4所示。
四、注射受精卵获得F0代嵌合体小鼠
用水将步骤二构建的同源重组载体和步骤三体外转录获得的Cas9mRNA和gRNA(gRNA1或gRNA2)配制成100-500μl体系，使其中同源重组载体、Cas9mRNA和gRNA(gRNA1或gRNA2)的终浓度分别为0.1-50ng/μl，0.1-20ng/μl，0.1-100ng/μl。将配置好的样品注射到C57BL/6J小鼠的受精卵胞质中，于37℃培养24小时至二细胞期后移植到代孕雌鼠中，至F0代小鼠出生。
五、F0代小鼠基因型的鉴定
1、F0代小鼠基因组制备
F0代小鼠出生14天剪取鼠尾0.3cm，加400μl裂解液(由上海南方模式生物研究中心提供，产品目录号：NMS014)及40μl蛋白酶K(浓度为10mg/ml)，56℃消化过夜。离心取上清，两倍体积无水乙醇沉淀，75％乙醇洗涤，稍晾干后溶解于100μl纯水中，50℃烘箱助溶1小时。
2、F0代小鼠基因型鉴定
F0代小鼠基因型鉴定策略示意图如图5所示。同源重组阳性小鼠PCR鉴定方案：5’臂同源重组阳性基因组应扩增出3.3kb片段，阴性基因组无条带。3’同源重组阳性基因组应扩增出5.0kb和3.8kb的片段，阴性基因组仅能扩增出5.0kb的片段。
(1)5’同源臂重组阳性F0代小鼠PCR鉴定方法
引物信息如表3所示。反应体系如表4所示。反应条件如表5所示。
表3 5’同源臂重组阳性F0代小鼠PCR鉴定引物
引物 序列(5’-3’) 引物类型
I TCCTTCTATTTCTGATGCTCCTT 正向
II ACCTCCATGATGCTGCTTACA 反向
表4 5’同源臂重组阳性F0代小鼠PCR鉴定反应体系
组分 体积(μl)
ddH<sub>2</sub>O 13.2
PrimeStar MAX PCR Buffer 2
2.5mM dNTP 2
引物I(10pmol/μl) 0.5
引物II(10pmol/μl) 0.5
PrimeStar MAX DNA Polymerase* 0.8
基因组DNA 1
总体积 20
注：*PrimeStar MAX(TaKaRa，Code No：R045A)。
表5 5’同源臂重组阳性F0代小鼠PCR鉴定反应条件：
步骤 温度(℃) 时间 备注
1 94 3min -
2 98 15sec -
3 56 15sec -
4 72 2min 重复步骤2-4共35个循环
5 72 5min -
6 12 - 保温
(2)3’同源臂重组阳性F0代小鼠PCR鉴定方法
引物信息如表6所示。反应体系如表7所示。反应条件如表8所示。
表6 3’同源臂重组阳性F0代小鼠PCR鉴定引物信息
引物 序列(5’-3’) 引物类型
III CTGGGTAGACACTGTAGGATTG 正向
IV TTGTAAGCAGTAAGGCAGATAGA 反向
表7 3’同源臂重组阳性F0代小鼠PCR鉴定反应体系
组分 体积(μl)
ddH<sub>2</sub>O 13.2
PrimeStar MAX PCR Buffer 2
2.5mM dNTP 2
引物III(10pmol/μl) 0.5
引物IV(10pmol/μl) 0.5
PrimeStar MAX DNA Polymerase* 0.8
基因组DNA 1
总体积 20
注：*PrimeStar MAX(TaKaRa，Code No：R045A)。
表8 3’同源臂重组阳性F0代小鼠PCR鉴定反应条件
步骤 温度(℃) 时间 备注
1 94 3min -
2 98 15sec -
3 56 15sec -
4 72 2min 重复步骤2-4共32个循环
5 72 5min -
6 12 - 保温
结果显示：经受精卵显微注射，本项目共获得41只F0代小鼠。通过长片段PCR的方式，对F0代小鼠的基因型进行鉴定，PCR结果经测序确认，该项目共获得3只正确同源重组的阳性F0代小鼠。双臂同源重组阳性的F0代小鼠为25、30和38号(所用gRNA为gRNA1)，长片段PCR鉴定电泳结果如图6所示。
六、F1代小鼠获得及基因型鉴定
F0代阳性小鼠与野生型C57BL/6J小鼠交配，繁育获得F1代小鼠。
PCR鉴定策略及方法同F0代小鼠鉴定部分。F1代阳性小鼠PCR鉴定产物测序，共进行了4个测序反应。测序反应对应的区域，如图5所示。其中，5’同源臂鉴定，PCR产物测序共进行了2个测序反应，分别标注为：1、2；3’同源臂鉴定，PCR产物测序共进行了2个测序反应，分别标注为：3、4。
F1代小鼠5’和3’同源臂PCR鉴定电泳结果如图7所示。PCR鉴定阳性小鼠为：50、51、52、53、54、55号；经测序确认均为阳性。
测序比对结果以50号阳性小鼠为例：
(1)F1代小鼠5’同源臂PCR鉴定测序比对结果：1#测序反应比对结果如图8中A所示；2#测序反应比对结果如图8中B所示。
(2)F1代小鼠3’同源臂PCR鉴定测序比对结果：3#测序反应比对结果如图8中C所示；4#测序反应比对结果如图8中D所示。
F1代阳性小鼠编号和基本信息见表9。
表9 F1代阳性小鼠基本信息
编号 来源F0 性别 出生日期
50 38# ♂ 2015/9/14
51 38# ♀ 2015/9/14
52 38# ♀ 2015/9/14
53 38# ♀ 2015/9/14
54 38# ♀ 2015/9/14
55 38# ♀ 2015/9/14
实施例2、B2m定点敲入人源B2M cDNA小鼠(hB2M KI鼠)加重HSV-1感染所致的皮肤损伤
实验分为C57野生型小鼠和hB2M KI鼠(即实施例1构建并鉴定为阳性的B2m定点敲入人源B2M cDNA小鼠)两组，每组3只小鼠。每只小鼠于胸部正中皮肤处接种105感染复数的HSV-1病毒(毒株名：hsvlsz2055，保有编号：hsvlsz2055，深圳市疾病控制中心)，观查两组小鼠间出现HSV-1感染所致的皮肤损伤的时间及皮损的严重程度有无差异。
接种HSV-1三天后，hB2M KI组小鼠开始出现明显的皮肤损伤，表现为皮肤红肿，而野生型小鼠观察不到明显的病变。五天以后hB2M KI组小鼠皮肤病变明显加重，出现严重的溃烂，而且皮损难以愈合，野生型小鼠也出现了皮肤病变但病变程度远轻于hB2M KI组小鼠(图9)，很快自行愈合。实验结果显示，hB2M KI鼠对HSV-1病毒易感，感染所致的皮肤损伤出现早，程度重，持续时间长，是筛查抗病毒药物或研究病毒与宿主相互作用的机理的良好动物模型。实验在P3实验室完成。
<110> 清华大学深圳研究生院；苏州吉玛基因股份有限公司
<120> 构建B2m定点敲入人B2M cDNA小鼠模型的方法
<130> GNCLN180364
<160> 5
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 23
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<400> 1
ggtcgcttca gtcgtcagca tgg 23
<210> 2
<211> 23
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<400> 2
agtcgtcagc atggctcgct cgg 23
<210> 3
<211> 5780
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<400> 3
aaatttattt atttgttgac tgtgtatgcc tgagtgcatg tgtgtgtgtg tgtgtacctg 60
tgtgtaagtg tgtgtgtgaa gttgtcaaag gtcaacttgg cagacgttgg ttctctcctt 120
tcactatgtg ggttcagggg actgaattct ggctgtcagg cttggcgtca gtctcaccag 180
cactcttgcc agttaaacaa taaatagttt tcctttcgtt ttcattaccc acataagtca 240
taaatggaag tccaagaaaa cacagaaatc tccacatcca gaaagctgaa agtacttctt 300
cgcctctggc tcttatttga gacaaggcct tatggaactg tccagactgg cctggacctt 360
ctggtctgaa gcaatccttc tctcagcttc cccagtgcca ggcactggaa tgtgtgcctc 420
ctctcagttt ccccacgatg acttatttct tactggtttt aaagttggtt ttataagtga 480
ccagaataga ctctatcttt aatgaactta aattaagtgt tattttctgt gacatagtaa 540
atcagaaaca aaacaaaaca aaacagccat ataatgttct attttcttaa agcatttcct 600
agtacagttc aacacagtgt ttagtataat ttaatattaa catttcaggt ctttaatgta 660
ttaaatgagt ttttcttttt aattagatga agtatcttaa ctcacacctt tatacataaa 720
aattattctt atatttcagt tacaaaaagg gatagcaaaa taacataaat gattatgatt 780
cttaaacatt actggatcaa aatactatat gctgggtaga cactgtagga ttgggtctct 840
gtttattatc tcattaatgt ccgtggagac tattttattt ttttctagtt tagacacagc 900
ctccacacta gagattgtta aaggttttta aaaatatgtt caagaaatcc agaagttatg 960
ttgttctcct tggggaagcc aaggccaaag ccacttcaac tgcaagcatg gccatttctc 1020
catgtcctga tgccccatgc cctcttccta cccttcctca ctcgagctgc ttgcggtggt 1080
gtctccctgt gctcacagcc tgcctctgtc ctggcttttg gccaggggtt taacttctct 1140
actgggtcca ccgctgatgt aatatacatt ctgagtaaaa ctatggcagc ctttgtcttc 1200
cgagccgata agcagaaacc ccaagggaat gcatctcaag gtttatctcc tcatccagaa 1260
aaaataattt attcggggat tcacttcact tggtcactta gtttaccaat ggccctgttc 1320
taagaaagta ctactaagag aatggacagg aaacccagct aagccattgt ccttccccaa 1380
aacccatgga cagaacaaag aaaattacct aaatttttca agggtacccg attaagttct 1440
ccatccaaag ctctaaaagg agaaacctgc tagaagcaag gtcagaaatc ctctcagttg 1500
cctttaggac aggagggtct ttttacacac ggaatcctga aactgccttt gtatttctgg 1560
gctgagatta taaactaagg gttgagttct gccagttaat gctcttaatt gtcctggctt 1620
tagttttcaa gaatgcaaac ttcaggtcct aagtcctttt ctgagtggga tattgtcagc 1680
aattgaataa atgaaggcgg tcccaggctg aacgaccaga tacaccaaac tcaagagcac 1740
accctagata gtagggcacc aagggtccag cccaggctgt ttgaaatatc acgggacttt 1800
ataagaacat gaaactgaaa atgggaaagt ccctttgtaa cctagttcag catcaacagc 1860
taggagactg gtgacgacct ccggatctga gtccggattg gctgtgagtt caggaactat 1920
ataagagcgc gcgccctggc tggctctcat ttcagtggct gctactcggc gcttcagtcg 1980
cggtcgcttc agtcgtcagc aatataagtg gaggcgtcgc gctggcgggc attcctgaag 2040
ctgacagcat tcgggccgag tctcgctccg tggccttagc tgtgctcgcg ctactctctc 2100
tttctggcct ggaggctatc cagcgtactc caaagattca ggtttactca cgtcatccag 2160
cagagaatgg aaagtcaaat ttcctgaatt gctatgtgtc tgggtttcat ccatccgaca 2220
ttgaagttga cttactgaag aatggagaga gaattgaaaa agtggagcat tcagacttgt 2280
ctttcagcaa ggactggtct ttctatctct tgtactacac tgaattcacc cccactgaaa 2340
aagatgagta tgcctgccgt gtgaaccatg tgactttgtc acagcccaag atagttaagt 2400
gggatcgaga catgtaagca gcatcatgga ggtttgaaga tgccgcattt ggattggatg 2460
aattccaaat tctgcttgct tgctttttaa tattgatatg cttatacact tacactttat 2520
gcacaaaatg tagggttata ataatgttaa catggacatg atcttcttta taattctact 2580
ttgagtgctg tctccatgtt tgatgtatct gagcaggttg ctccacaggt agctctagga 2640
gggctggcaa cttagaggtg gggagcagag aattctctta tccaacatca acatcttggt 2700
cagatttgaa ctcttcaatc tcttgcactc aaagcttgtt aagatagtta agcgtgcata 2760
agttaacttc caatttacat actctgctta gaatttgggg gaaaatttag aaatataatt 2820
gacaggatta ttggaaattt gttataatga atgaaacatt ttgtcatata agattcatat 2880
ttacttctta tacatttgat aaagtaaggc atggttgtgg ttaatctggt ttatttttgt 2940
tccacaagtt aaataaatca taaaacttga tgtgttatct cttatgagac aactaagact 3000
ttgccttagt cctcacagtc tgttcatgat cataatcagc cataccacat ttgtagaggt 3060
tttacttgct ttaaaaaacc tcccacacct ccccctgaac ctgaaacata aaatgaatgc 3120
aattgttgtt gttaacttgt ttattgcagc ttataatggt tacaaataaa gcaatagcat 3180
cacaaatttc acaaataaag catttttttc actgcattct agttgtggtt tgtccaaact 3240
catcaatgta tcttatcatg tctggatcat aatcagccat accacatttg tagaggtttt 3300
acttgcttta aaaaacctcc cacacctccc cctgaacctg aaacataaaa tgaatgcaat 3360
tgttgttgtt aacttgttta ttgcagctta taatggttac aaataaagca atagcatcac 3420
aaatttcaca aataaagcat ttttttcact gcattctagt tgtggtttgt ccaaactcat 3480
caatgtatct tatcatgtct ggatcataat cagccatacc acatttgtag aggttttact 3540
tgctttaaaa aacctcccac acctccccct gaacctgaaa cataaaatga atgcaattgt 3600
tgttgttaac ttgtttattg cagcttataa tggttacaaa taaagcaata gcatcacaaa 3660
tttcacaaat aaagcatttt tttcactgca ttctagttgt ggtttgtcca aactcatcaa 3720
tgtatcttat catgtctgga tccactagtt ctagctagct gggtagacac tgtaggattg 3780
tgaccctggt ctttctggtg cttgtctcac tgaccggcct gtatgctatc cagagtgagt 3840
gcctctttcc cctctcttgg cattaaattt ttagttctcc ttagttctcc ttcccgacgg 3900
gattggccag ggctgcgtct ctcgggaaag gagtgggcgt cccgctgctt acagctttga 3960
ggctacaggg tggatgcgcc tgtttgcgag tgtgctgacg gtcagcgctg aagatgggga 4020
aggcttctct ttttctcctc tgctggcggg agcccctaga ctccctgagc gcaaaaggag 4080
ggtggggctg cctggaaagt gcagggtgga gggctatggg cacgcggaag ctgagccccg 4140
accacgggaa gtcagaccgc cgctgcgcag cttcatttgc actcgcagag aggctcgatc 4200
caaccgaagt cgagagaaaa tgggcttggg tcccagactc tgcgatgttt ccaaagcttt 4260
ctgatcatta actttgtatc tagtaataac cttaaaggtc gccgggcagt ggtggctcac 4320
gcctttcatg ccagcacttg ggaggcagag gtaggcggat ttctgaattc gaggccagcc 4380
tggtctacag agtgagttcc aggacagcca gggttacaca aagaaaccct gtctcgaaaa 4440
aataaataaa ggtctctggg tatgaggctt attgcaatgc tgaggacctt gtgagcttct 4500
taagtttgaa agtacgtcta caatgtaaat gttatggttc cccgtgtatt aagacaggga 4560
actagaggag gcatcgagat ttaaagtaac ttattcacac gatagactaa tggcagtcgg 4620
agctggaatt gaggccgatc aatgcccagg cctttggact gtaaccgcca tttgtttcta 4680
gaagtgtcta ggccttcctg ggtcatggtc tgtgaagcag tctgagatgc cttggaccct 4740
tggtacctca cacagcgctt cctttttggc acactgcctg gttctttccg cgatagagcc 4800
tctgctttca gttttgagac aactaagact ttgccttaag tcaaggtggt tatgaactct 4860
ggagtgagga ttatttcagt gtggtgacca agactcgtga ggataactag taactaccaa 4920
agtcgtggag gtagaaatat ggcagagacc agatttaaac ctgacccaac actggactta 4980
attgtggaag ggatggttct tgtccagaga attccaggca tgatgaacct gtggcattta 5040
gcatgttctt gtttccaaaa cctcaaatgc aaggaaaaat gtggtttatg ctaatttaaa 5100
tttatgggga caaaaagaat tcaaagcttt actgagacct tcattctagc tggccacagt 5160
tttcaggttt tcctctccct actgccttcc atgggtgaat aagaggctgc tcttcagaga 5220
ccgtgcacac tgaatagatg tgtatctggg agtatattat ggctgggcat agttgtgcac 5280
atctataatc tcagtattta ggagactgag gcaggtggat ctctgaattt gagaccaacc 5340
tgatctacaa agtgcatcca ggacagaaaa acgctgtctt gaaaaaccaa agaaagaaag 5400
aaagaaagaa aagaaagtgt tttataagcc aagtgtgttg agtcatgctg tgacctcaga 5460
gctggggagg ctgagacagg cgttcaaggc cagcctggaa gacagtcaga ctgtatctca 5520
aattaaataa taagcatata agtaaatgaa ggggaaaaca caaaaagagc cagtgaaatg 5580
gctcagcagg tacaggcgct taccactaag cctgagtgta tctcagatcc cacttggtgg 5640
acggagagaa ctgactttta aatccacaca tgagctacgt ttcgtgcatg tgcacacaca 5700
cacacacaca cacacacaca cacacacaca catatatact ctctcagtaa aacaataatt 5760
tttttaagaa agtagatata 5780
<210> 4
<211> 4272
<212> RNA
<213> Artificial sequence
<400> 4
auggacuaua aggaccacga cggagacuac aaggaucaug auauugauua caaagacgau 60
gacgauaaga uggccccaaa gaagaagcgg aaggucggua uccacggagu cccagcagcc 120
gacaagaagu acagcaucgg ccuggacauc ggcaccaacu cugugggcug ggccgugauc 180
accgacgagu acaaggugcc cagcaagaaa uucaaggugc ugggcaacac cgaccggcac 240
agcaucaaga agaaccugau cggagcccug cuguucgaca gcggcgaaac agccgaggcc 300
acccggcuga agagaaccgc cagaagaaga uacaccagac ggaagaaccg gaucugcuau 360
cugcaagaga ucuucagcaa cgagauggcc aagguggacg acagcuucuu ccacagacug 420
gaagaguccu uccuggugga agaggauaag aagcacgagc ggcaccccau cuucggcaac 480
aucguggacg agguggccua ccacgagaag uaccccacca ucuaccaccu gagaaagaaa 540
cugguggaca gcaccgacaa ggccgaccug cggcugaucu aucuggcccu ggcccacaug 600
aucaaguucc ggggccacuu ccugaucgag ggcgaccuga accccgacaa cagcgacgug 660
gacaagcugu ucauccagcu ggugcagacc uacaaccagc uguucgagga aaaccccauc 720
aacgccagcg gcguggacgc caaggccauc cugucugcca gacugagcaa gagcagacgg 780
cuggaaaauc ugaucgccca gcugcccggc gagaagaaga auggccuguu cggaaaccug 840
auugcccuga gccugggccu gacccccaac uucaagagca acuucgaccu ggccgaggau 900
gccaaacugc agcugagcaa ggacaccuac gacgacgacc uggacaaccu gcuggcccag 960
aucggcgacc aguacgccga ccuguuucug gccgccaaga accuguccga cgccauccug 1020
cugagcgaca uccugagagu gaacaccgag aucaccaagg ccccccugag cgccucuaug 1080
aucaagagau acgacgagca ccaccaggac cugacccugc ugaaagcucu cgugcggcag 1140
cagcugccug agaaguacaa agagauuuuc uucgaccaga gcaagaacgg cuacgccggc 1200
uacauugacg gcggagccag ccaggaagag uucuacaagu ucaucaagcc cauccuggaa 1260
aagauggacg gcaccgagga acugcucgug aagcugaaca gagaggaccu gcugcggaag 1320
cagcggaccu ucgacaacgg cagcaucccc caccagaucc accugggaga gcugcacgcc 1380
auucugcggc ggcaggaaga uuuuuaccca uuccugaagg acaaccggga aaagaucgag 1440
aagauccuga ccuuccgcau ccccuacuac gugggcccuc uggccagggg aaacagcaga 1500
uucgccugga ugaccagaaa gagcgaggaa accaucaccc ccuggaacuu cgaggaagug 1560
guggacaagg gcgcuuccgc ccagagcuuc aucgagcgga ugaccaacuu cgauaagaac 1620
cugcccaacg agaaggugcu gcccaagcac agccugcugu acgaguacuu caccguguau 1680
aacgagcuga ccaaagugaa auacgugacc gagggaauga gaaagcccgc cuuccugagc 1740
ggcgagcaga aaaaggccau cguggaccug cuguucaaga ccaaccggaa agugaccgug 1800
aagcagcuga aagaggacua cuucaagaaa aucgagugcu ucgacuccgu ggaaaucucc 1860
ggcguggaag aucgguucaa cgccucccug ggcacauacc acgaucugcu gaaaauuauc 1920
aaggacaagg acuuccugga caaugaggaa aacgaggaca uucuggaaga uaucgugcug 1980
acccugacac uguuugagga cagagagaug aucgaggaac ggcugaaaac cuaugcccac 2040
cuguucgacg acaaagugau gaagcagcug aagcggcgga gauacaccgg cuggggcagg 2100
cugagccgga agcugaucaa cggcauccgg gacaagcagu ccggcaagac aauccuggau 2160
uuccugaagu ccgacggcuu cgccaacaga aacuucaugc agcugaucca cgacgacagc 2220
cugaccuuua aagaggacau ccagaaagcc cagguguccg gccagggcga uagccugcac 2280
gagcacauug ccaaucuggc cggcagcccc gccauuaaga agggcauccu gcagacagug 2340
aagguggugg acgagcucgu gaaagugaug ggccggcaca agcccgagaa caucgugauc 2400
gaaauggcca gagagaacca gaccacccag aagggacaga agaacagccg cgagagaaug 2460
aagcggaucg aagagggcau caaagagcug ggcagccaga uccugaaaga acaccccgug 2520
gaaaacaccc agcugcagaa cgagaagcug uaccuguacu accugcagaa ugggcgggau 2580
auguacgugg accaggaacu ggacaucaac cggcuguccg acuacgaugu ggaccauauc 2640
gugccucaga gcuuucugaa ggacgacucc aucgacaaca aggugcugac cagaagcgac 2700
aagaaccggg gcaagagcga caacgugccc uccgaagagg ucgugaagaa gaugaagaac 2760
uacuggcggc agcugcugaa cgccaagcug auuacccaga gaaaguucga caaucugacc 2820
aaggccgaga gaggcggccu gagcgaacug gauaaggccg gcuucaucaa gagacagcug 2880
guggaaaccc ggcagaucac aaagcacgug gcacagaucc uggacucccg gaugaacacu 2940
aaguacgacg agaaugacaa gcugauccgg gaagugaaag ugaucacccu gaaguccaag 3000
cugguguccg auuuccggaa ggauuuccag uuuuacaaag ugcgcgagau caacaacuac 3060
caccacgccc acgacgccua ccugaacgcc gucgugggaa ccgcccugau caaaaaguac 3120
ccuaagcugg aaagcgaguu cguguacggc gacuacaagg uguacgacgu gcggaagaug 3180
aucgccaaga gcgagcagga aaucggcaag gcuaccgcca aguacuucuu cuacagcaac 3240
aucaugaacu uuuucaagac cgagauuacc cuggccaacg gcgagauccg gaagcggccu 3300
cugaucgaga caaacggcga aaccggggag aucguguggg auaagggccg ggauuuugcc 3360
accgugcgga aagugcugag caugccccaa gugaauaucg ugaaaaagac cgaggugcag 3420
acaggcggcu ucagcaaaga gucuauccug cccaagagga acagcgauaa gcugaucgcc 3480
agaaagaagg acugggaccc uaagaaguac ggcggcuucg acagccccac cguggccuau 3540
ucugugcugg ugguggccaa aguggaaaag ggcaagucca agaaacugaa gagugugaaa 3600
gagcugcugg ggaucaccau cauggaaaga agcagcuucg agaagaaucc caucgacuuu 3660
cuggaagcca agggcuacaa agaagugaaa aaggaccuga ucaucaagcu gccuaaguac 3720
ucccuguucg agcuggaaaa cggccggaag agaaugcugg ccucugccgg cgaacugcag 3780
aagggaaacg aacuggcccu gcccuccaaa uaugugaacu uccuguaccu ggccagccac 3840
uaugagaagc ugaagggcuc ccccgaggau aaugagcaga aacagcuguu uguggaacag 3900
cacaagcacu accuggacga gaucaucgag cagaucagcg aguucuccaa gagagugauc 3960
cuggccgacg cuaaucugga caaagugcug uccgccuaca acaagcaccg ggauaagccc 4020
aucagagagc aggccgagaa uaucauccac cuguuuaccc ugaccaaucu gggagccccu 4080
gccgccuuca aguacuuuga caccaccauc gaccggaaga gguacaccag caccaaagag 4140
gugcuggacg ccacccugau ccaccagagc aucaccggcc uguacgagac acggaucgac 4200
cugucucagc ugggaggcga caaaaggccg gcggccacga aaaaggccgg ccaggcaaaa 4260
aagaaaaagu aa 4272
<210> 5
<211> 2944
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<400> 5
ctaaattgta agcgttaata ttttgttaaa attcgcgtta aatttttgtt aaatcagctc 60
attttttaac caataggccg aaatcggcaa aatcccttat aaatcaaaag aatagaccga 120
gatagggttg agtgttgttc cagtttggaa caagagtcca ctattaaaga acgtggactc 180
caacgtcaaa gggcgaaaaa ccgtctatca gggcgatggc ccactacgtg aaccatcacc 240
ctaatcaagt tttttggggt cgaggtgccg taaagcacta aatcggaacc ctaaagggag 300
cccccgattt agagcttgac ggggaaagcc ggcgaacgtg gcgagaaagg aagggaagaa 360
agcgaaagga gcgggcgcta gggcgctggc aagtgtagcg gtcacgctgc gcgtaaccac 420
cacacccgcc gcgcttaatg cgccgctaca gggcgcgtcc cattcgccat tcaggctgcg 480
caactgttgg gaagggcgat cggtgcgggc ctcttcgcta ttacgccagc tggcgaaagg 540
gggatgtgct gcaaggcgat taagttgggt aacgccaggg ttttcccagt cacgacgttg 600
taaaacgacg gccagtgaat tgtaatacga ctcactatag ggcgaattgg gtaccgggcc 660
ccccctcgag gtcgacggta tcgataagct tgatatcgaa ttgatccact agttctagag 720
cggccgccac cgcggtggag ctccagcttt tgttcccttt agtgagggtt aatttcgagc 780
ttggcgtaat catggtcata gctgtttcct gtgtgaaatt gttatccgct cacaattcca 840
cacaacatac gagccggaag cataaagtgt aaagcctggg gtgcctaatg agtgagctaa 900
ctcacattaa ttgcgttgcg ctcactgccc gctttccagt cgggaaacct gtcgtgccag 960
ctgcattaat gaatcggcca acgcgcgggg agaggcggtt tgcgtattgg gcgctcttcc 1020
gcttcctcgc tcactgactc gctgcgctcg gtcgttcggc tgcggcgagc ggtatcagct 1080
cactcaaagg cggtaatacg gttatccaca gaatcagggg ataacgcagg aaagaacatg 1140
tgagcaaaag gccagcaaaa ggccaggaac cgtaaaaagg ccgcgttgct ggcgtttttc 1200
cataggctcc gcccccctga cgagcatcac aaaaatcgac gctcaagtca gaggtggcga 1260
aacccgacag gactataaag ataccaggcg tttccccctg gaagctccct cgtgcgctct 1320
cctgttccga ccctgccgct taccggatac ctgtccgcct ttctcccttc gggaagcgtg 1380
gcgctttctc atagctcacg ctgtaggtat ctcagttcgg tgtaggtcgt tcgctccaag 1440
ctgggctgtg tgcacgaacc ccccgttcag cccgaccgct gcgccttatc cggtaactat 1500
cgtcttgagt ccaacccggt aagacacgac ttatcgccac tggcagcagc cactggtaac 1560
aggattagca gagcgaggta tgtaggcggt gctacagagt tcttgaagtg gtggcctaac 1620
tacggctaca ctagaagaac agtatttggt atctgcgctc tgctgaagcc agttaccttc 1680
ggaaaaagag ttggtagctc ttgatccggc aaacaaacca ccgctggtag cggtggtttt 1740
tttgtttgca agcagcagat tacgcgcaga aaaaaaggat ctcaagaaga tcctttgatc 1800
ttttctacgg ggtctgacgc tcagtggaac gaaaactcac gttaagggat tttggtcatg 1860
agattatcaa aaaggatctt cacctagatc cttttaaatt aaaaatgaag ttttaaatca 1920
atctaaagta tatatgagta aacttggtct gacagttacc aatgcttaat cagtgaggca 1980
cctatctcag cgatctgtct atttcgttca tccatagttg cctgactccc cgtcgtgtag 2040
ataactacga tacgggaggg cttaccatct ggccccagtg ctgcaatgat accgcgagac 2100
ccacgctcac cggctccaga tttatcagca ataaaccagc cagccggaag ggccgagcgc 2160
agaagtggtc ctgcaacttt atccgcctcc atccagtcta ttaattgttg ccgggaagct 2220
agagtaagta gttcgccagt taatagtttg cgcaacgttg ttgccattgc tacaggcatc 2280
gtggtgtcac gctcgtcgtt tggtatggct tcattcagct ccggttccca acgatcaagg 2340
cgagttacat gatcccccat gttgtgcaaa aaagcggtta gctccttcgg tcctccgatc 2400
gttgtcagaa gtaagttggc cgcagtgtta tcactcatgg ttatggcagc actgcataat 2460
tctcttactg tcatgccatc cgtaagatgc ttttctgtga ctggtgagta ctcaaccaag 2520
tcattctgag aatagtgtat gcggcgaccg agttgctctt gcccggcgtc aatacgggat 2580
aataccgcgc cacatagcag aactttaaaa gtgctcatca ttggaaaacg ttcttcgggg 2640
cgaaaactct caaggatctt accgctgttg agatccagtt cgatgtaacc cactcgtgca 2700
cccaactgat cttcagcatc ttttactttc accagcgttt ctgggtgagc aaaaacagga 2760
aggcaaaatg ccgcaaaaaa gggaataagg gcgacacgga aatgttgaat actcatactc 2820
ttcctttttc aatattattg aagcatttat cagggttatt gtctcatgag cggatacata 2880
tttgaatgta tttagaaaaa taaacaaata ggggttccgc gcacatttcc ccgaaaagtg 2940
ccac 2944

Claims (12)

1.一种构建B2m定点敲入人源B2M cDNA的小鼠模型的方法，包括如下步骤：利用CRISPR/Cas9技术在目的小鼠的基因组中B2m基因的起始密码子处定点敲入缺失起始密码子ATG的人源B2M cDNA；
在所述方法中，作为定点敲入工具的同源重组载体上含有如下DNA片段A；所述DNA片段A自上游到下游依次包含5’同源臂、缺失起始密码子ATG的人源B2M cDNA、3个连续的polyA、3’同源臂；所述5’同源臂为位于所述目的小鼠的基因组中B2m基因的起始密码子上游的2kb序列；所述3’同源臂为位于所述目的小鼠的基因组中B2m基因的起始密码子下游的2kb序列。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：在所述方法中，作为被Cas9核酸酶切割的靶序列是所述目的小鼠的基因组中B2m基因中符合5’-NX-NGG-3’或5’-CCN-NX-3’序列排列规则的片段；N表示A、G、C和T中的任一种，14≤X≤30，且X为整数，NX表示X个连续的脱氧核糖核苷酸。
3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于：所述靶序列为SEQ ID No.1或SEQ IDNo.2。
4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述5’同源臂的序列为SEQ ID No.3的第1-2000位；所述缺失起始密码子ATG的人源B2M cDNA的序列为SEQ ID No.3的第2001-2984位；所述3个连续的polyA的序列为SEQ ID No.3的第3008-3758位；所述3’同源臂的序列为SEQ ID No.3的第3781-5780位。
5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于：所述DNA片段A的序列为SEQ ID No.3。
6.根据权利要求1-5中任一所述方法，其特征在于：所述方法包括如下步骤：
(1)将Cas9 mRNA、gRNA和权利要求1-5任一中所述的同源重组载体注射到所述目的小鼠的受精卵胞质中，得到F0代小鼠；
所述gRNA的序列为将SEQ ID No.1或SEQ ID No.2中的T替换为U后得到的序列；
(2)将步骤(1)获得的所述F0代小鼠与所述目的小鼠进行杂交，从F1代小鼠中获得B2m定点敲入人源B2M cDNA的杂合体小鼠。
7.根据权利要求6所述方法，其特征在于：在步骤(2)之后，还包括如下步骤：将雄性的所述杂合体小鼠与雌性的所述杂合体小鼠进行一次或多次杂交，从杂交后代中获得B2m定点敲入人源B2M cDNA的纯合体小鼠。
8.根据权利要求6所述的方法，其特征在于：所述Cas9 mRNA的序列为SEQ ID No.4。
9.根据权利要求6所述的方法，其特征在于：所述同源重组载体为将SEQ ID No.3所示DNA片段插入到NM-322载体的第702位和第703位之间后得到的重组质粒；所述NM-322载体的全序列为SEQ ID No.5。
10.用于构建B2m定点敲入人源B2M cDNA小鼠模型的试剂盒，包括权利要求6或8中所述的Cas9 mRNA、权利要求6中所述的gRNA和权利要求6或9中所述的同源重组载体。
11.由权利要求1-9中任一所述方法构建得到的小鼠模型在筛查抗病毒药物或研究病毒与宿主相互作用的机理中的应用。
12.由权利要求1-9中任一所述方法构建得到的小鼠模型在作为筛查抗病毒药物或研究病毒与宿主相互作用的机理的动物模型中的应用。
CN201810305819.7A 2018-04-08 2018-04-08 构建B2m定点敲入人B2M cDNA小鼠模型的方法 Active CN110343698B (zh)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201810305819.7A CN110343698B (zh) 2018-04-08 2018-04-08 构建B2m定点敲入人B2M cDNA小鼠模型的方法

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201810305819.7A CN110343698B (zh) 2018-04-08 2018-04-08 构建B2m定点敲入人B2M cDNA小鼠模型的方法

Publications (2)

Publication Number Publication Date
CN110343698A CN110343698A (zh) 2019-10-18
CN110343698B true CN110343698B (zh) 2021-03-30

Family

ID=68173093

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN201810305819.7A Active CN110343698B (zh) 2018-04-08 2018-04-08 构建B2m定点敲入人B2M cDNA小鼠模型的方法

Country Status (1)

Country Link
CN (1) CN110343698B (zh)

Families Citing this family (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN112458086B (zh) * 2020-10-19 2022-10-11 中国人民解放军总医院第一医学中心 Hspg2基因敲入小鼠动物模型的构建方法和应用
CN113201559B (zh) * 2021-04-08 2023-05-02 中国人民解放军海军军医大学第一附属医院 一种人源胰腺炎相关cel-hyb1基因变异敲入小鼠的构建方法与应用
CN114214360A (zh) * 2021-12-27 2022-03-22 西安英创生物技术有限公司 先天性肌无力小鼠模型、其构建方法及应用
CN115747209A (zh) * 2022-08-03 2023-03-07 赛业（苏州）生物科技有限公司 一段特定的核苷酸序列及其应用

Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN102899327A (zh) * 2012-11-06 2013-01-30 清华大学深圳研究生院 一种抗病毒的小核酸及其温度敏感型凝胶制剂与应用

Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN102899327A (zh) * 2012-11-06 2013-01-30 清华大学深圳研究生院 一种抗病毒的小核酸及其温度敏感型凝胶制剂与应用

Non-Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
Functional prediction of differentially expressed lncRNAs in HSV-1 infected human foreskin fibroblasts;Benxia Hu等;《Virology Journal》;20160805;第13卷;1-12 *
Herpes Simplex Virus Triggers and Then Disarms a Host Antiviral Response;Karen L. Mossman等;《Journal of Virology》;20010131;第75卷(第2期);750-758 *
The Roles of Non-coding RNA in HSV Infection;Yunhao Mao等;《Virology & Retrovirology Journal》;20190211;第2卷(第1期);1-7 *

Also Published As

Publication number Publication date
CN110343698A (zh) 2019-10-18

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CN111909958B (zh) 血管平滑肌细胞条件性敲除Yap1基因小鼠模型的构建
CN110343698B (zh) 构建B2m定点敲入人B2M cDNA小鼠模型的方法
CN107988246A (zh) 一种基因敲除载体及其斑马鱼胶质瘤模型
CN108849774B (zh) 一种阻断蚕蛾出茧的方法
US20050260625A1 (en) Process and system for crosslinking polynucleotide molecules
CN109022374B (zh) 一种塞内卡谷病毒重组质粒、重组病毒及构建方法
CN112746083B (zh) 一种通过单碱基编辑靶基因启动子失活基因的方法
KR20060072145A (ko) 유전자 동정 표시(ｇｉｓ) 분석 방법
KR101755965B1 (ko) Ｉｌ３３ ｎ―말단 도메인 결실을 갖는 염증의 쥣과 모델
CN104762312B (zh) 构建无选择标记的自主发光脓肿分枝杆菌的方法及建立相应体外高通量筛药模型
CN112680477B (zh) 一种基于无缝克隆技术的h9n2亚型禽流感病毒的拯救方法
CN113388612A (zh) 一种针对表位点为iyvlvmlvl的tcr所设计的引物及其应用
CN113215155A (zh) 一种针对表位点为flyalalll的tcr所设计的引物及其应用
CN107674876B (zh) MoKCS基因、该基因编码的酶及其应用
KR102009266B1 (ko) 구제역 sat2형 zim의 방어항원이 발현되는 재조합 바이러스
CN107988202B (zh) 一种敲除酿酒酵母染色体的方法
CN112342216B (zh) 用于提高CHO细胞的表达效率的CRISPR-Cas13d系统以及重组CHO细胞
CN110331164B (zh) Lilra3基因敲入小鼠的打靶载体和lilra3基因敲入小鼠的构建方法
CN113308466A (zh) 一种针对表位点为tygpvfmsl的tcr所设计的引物及其应用
KR102009267B1 (ko) 구제역 sat 3형 zim의 방어항원이 발현되는 재조합 바이러스
CN101899472A (zh) 一种猪内源性反转录病毒载体及其构建方法
CN113493800A (zh) 一种提高酿酒酵母中异源蛋白分泌或表面展示表达的方法
CN112342240B (zh) 用于表达rFC蛋白的59R突变载体及其制备方法和应用
CN112359059B (zh) 用于表达rFC蛋白的84E突变载体及其制备方法和应用
CN111378677A (zh) 一种dna组装的方法及其应用

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
GR01 Patent grant
GR01 Patent grant