CN107988202B - 一种敲除酿酒酵母染色体的方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及生物技术领域，具体公开了一种敲除酿酒酵母染色体的方法。本发明利用Vika/vox技术切除酵母完整染色体，使染色体着丝粒通过位点特异性重组成环，从而实现整条染色体的敲除。本发明与现有通过减数分裂等方式实现整条染色体丢失的方法相比，更加简单、高效、快速地实现酿酒酵母染色体的切割：避免姐妹染色单体的交叉互换，获得染色体敲除后的酿酒酵母纯合二倍体菌株。

Description

一种敲除酿酒酵母染色体的方法

技术领域

本发明涉及生物技术领域，更具体的说是涉及一种敲除酿酒酵母染色体的方法。

背景技术

生物基因组携带了决定生物基本性状的遗传信息，人工DNA合成技术和DNA大片段操作技术推动了基因组人工合成研究的进步。合成生物学的发展推动了通过人工设计合成来“写”基因组信息标志着“人造生命”的开始。

基因组DNA长度过大，而且绝大多数真核生物具有多条染色体，且染色体长度都较大，涉及到染色体疾病或以染色体为单位的功能整合等都需要对整条染色体进行操作。如何实现整条染色体的敲除是一个值得探讨的问题。酿酒酵母是与人类关系最广泛的一种酵母，它用于制作面包和馒头等食品以及酿酒，同时还可以作为微生物发酵生产化学品的工程菌。酿酒酵母有单倍体和双倍体两种生活形态，由于双倍体酿酒酵母营养细胞大，生活能力强，工业上多用双倍体进行生产。为了能够进一步提高酿酒酵母的生产能力，需要对酵母的基因组进行改造，如果直接用二倍体改造，可能得到优良菌株是杂合的，遗传性状不稳定，而单倍体就成为一种很好地选择。通过将单倍体酵母改造为一种优良菌株，而后再通过交配重新形成优势的二倍体。

但是，酿酒酵母在形成二倍体的过程中会形成杂合二倍体。因此，对不需要的染色体及时进行敲除，能够避免这种问题的出现(单倍体酵母染色体因含有大量必需基因，无法直接敲除，必须在二倍体状态下敲除才能够存活)。此外，通过染色体的完整敲除可以实现不同单倍体来源染色体的组合，比如可以通过酵母交配和拆孢过程结合染色体敲除技术把两条合成型的染色体组合在一个单倍体细胞中。染色体完整敲除技术还可以应用于二倍体中特定表型的靶点定位(mapping)，锁定与表型关联的染色体。

在酿酒酵母中，还未发现对整条染色体的敲除技术。目前在酵母中常用的敲除技术是基因敲除技术，它是以达到定点修饰改造染色体上某一基因的目的的一种技术，仅能对基因进行操作。现有利用减数分裂时酵母染色体染色体的不均等分配来实现染色体的丢失的方法，在减数分裂过程中，酵母的同源染色体之间会发生同源重组，不能保证单条染色体的完整性。通过这种方法要得到完整染色体的工作量大且效率低。

发明内容

有鉴于此，本发明的目的在于提供一种敲除酿酒酵母染色体的方法，使得所述方法能够提高敲除整条染色体的效率，达到80％以上的敲除率，避免姐妹染色单体交叉互换对染色体的影响，确保酿酒酵母整条染色体的敲除，获得染色体敲除后的纯合二倍体酵母。

为实现上述发明目的，本发明提供如下技术方案：

一种敲除酿酒酵母染色体的方法，包括：

步骤1、人工合成待敲除的染色体上的着丝粒序列，并在两端添加vox序列，获得片段1；人工合成待敲除的染色体着丝粒上游同源臂和下游同源臂；同时，在所述上游同源臂的3’端添加片段1的5’端同源序列以及在其5’端添加载体同源臂序列，获得片段2；在所述下游同源臂5’端添加片段1的3’端同源序列以及在其3’端添加载体同源臂序列，获得片段3；

步骤2、将所述片段1-3分别形成完全互补的双链DNA，通过酶切和Gibson组装技术，与所述载体组装，获得质粒1；酶切质粒1获得片段2+片段1+片段3的完整片段4；

步骤3、将所述完整片段4转化到待敲除染色体的单倍体酿酒酵母菌株中，通过同源重组替换原有序列；然后与交配型不同得酿酒酵母菌株进行融合，构建二倍体酿酒酵母菌株；

步骤4、向所述二倍体酿酒酵母菌株中转化含有vika基因的Vika质粒，通过Vika质粒上的诱导调控序列开启Vika蛋白表达，Vika蛋白诱导待敲除的染色体着丝两端的vox序列重组并丢失着丝粒，完成对整条染色体的敲除。整体流程示意图见图1。

针对现有利用减数分裂使酵母染色体染色体的不均等分配来实现染色体丢失的方法工作量大、效率低的缺陷，本发明依靠Vika/vox技术，使染色体着丝粒产生同源重组，从而实现整条染色体的敲除，整个方法更稳定有效，成功率更高。

作为优选，所述载体同源臂为载体上酶切位点两端的同源臂；其中，更优选地，所述载体为pUC19质粒，而所述酶切位点选择EcoRI和HindIII酶切位点，质粒图谱见图2，序列如SEQ ID NO:3所示。在本发明具体实施方式中，本发明选择pUC19质粒作为载体，同时选择其上EcoRI上游和HindIII下游两个同源臂序列，更为具体地EcoRI上游20bp和HindIII下游20bp的两个同源臂序列，而本发明步骤2可具体为：

将片段1-3形成完全互补的双链DNA，通过EcoRI和HindIII酶切和Gibson组装技术，与pUC19质粒组装，获得质粒1；EcoRI和HindIII酶切质粒1获得片段2+片段1+片段3的完整片段4。

本发明所述Vika质粒为在商用质粒基础上，通过在多克隆位点以酶切连接的方式插入vika基因获得的质粒，所述商用质粒还可包含筛选标签，便于后续筛选。在本发明的具体实施方式中，所述商用质粒选择为pRS415质粒，其上含有Leu筛选标签，构建后的Vika质粒图谱见图3。

作为优选，所述通过Vika质粒上的诱导调控序列开启Vika蛋白表达为：通过Vika质粒上的乳糖操纵子序列，加入半乳糖诱导物开启Vika蛋白表达。在本发明具体实施方式上，商用pRS415质粒上带有乳糖操纵子。也可以在其他商用质粒基础上通过基因工程技术导入乳糖操纵子或其他通过加入诱导物控制调控开启/关闭的基因元件。

根据本发明的技术方案，本发明以敲除商用BY4742酿酒酵母待敲除的X号染色体为例进行了举例说明，则本发明步骤1为：

人工合成BY4742酿酒酵母待敲除的X号染色体上的着丝粒序列，并在两端添加vox序列，获得片段1；人工合成BY4742酿酒酵母待敲除的X号染色体着丝粒1000bp上游同源臂和1000bp下游同源臂；同时，在所述着丝粒上游同源臂的3’端添加片段1的5’端20bp同源序列以及在其5’端添加20bp载体同源臂序列，获得片段2；在所述着丝粒下游同源臂5’端添加片段1的3’端20bp同源序列以及在其3’端添加20bp载体同源臂序列，获得片段3。

具体地，在上述BY4742酿酒酵母例子中，所述片段1的序列如SEQ ID NO:1所示；其中，1-34bp以及375-408bp为两个vox序列，中间序列为X号染色体着丝粒序列，该中间序列根据所要敲除的染色体不同，而相应的改变。

为了方便验证本发明所述方法对目标染色体敲除的效率，本发明上述技术方案中还包括在所述片段1的一端添加筛选标签作为片段1的组成部分，所述的一端可以是片段1上游也可以是片段1下游；一个总的原则，该筛选标签需要位于vox序列和着丝粒上游同源臂之间，或在vox序列和着丝粒下游同源臂之间，例如加入了筛选标签的片段1为筛选标签+vox序列+着丝粒序列+vox序列或vox序列+着丝粒序列+vox序列+筛选标签。在本发明具体实施方式中，该筛选标签选择为KanMX标签，序列如SEQ ID NO:2所示。

本发明以敲除BY4742酿酒酵母待敲除的X号染色体为例，利用KanMX标签和含G418的培养板翻印初步验证敲除效率，敲除效率高达95％，达到了极高水平。

由以上技术方案可知，本发明利用Vika/vox技术，通过Vika蛋白诱导vox在着丝粒附近发挥作用，两个vox位点发生重组，使酵母染色体着丝粒丢失，从而实现酿酒酵母整条染色体的简单、高效、快速和完整敲除，同时可避免姐妹染色单体的交叉互换，获得染色体敲除后的酿酒酵母为纯合二倍体菌株，也能够为酿酒酵母整合16条合成染色体提供技术指导。

附图说明

图1所示为本发明所述方法的流程示意图；其中，KanMX标签的加入为本发明优选的方案，并非限定必须加入；a-c表示本发明所述方法的不同阶段；

图2所示pUC19质粒图谱；

图3所示为以商用pRS415质粒为基础构建的Vika质粒图谱；

图4所示为SC-Leu+G418翻印验证结果；其中，左列两个平板为翻印前的SC-Leu培养结果；右列两个平板为翻印后的SC-Leu+G418培养结果；翻印后平板上的英文标记为实际试验的区分标记，对陈述试验结果无影响，不代表任何含义；

图5所示为敲除商用BY4742酿酒酵母X号染色体后PCR验证凝胶电泳图。

具体实施方式

本发明公开了一种敲除酿酒酵母染色体的方法，本领域技术人员可以借鉴本文内容，适当改进工艺参数实现。特别需要指出的是，所有类似的替换和改动对本领域技术人员来说是显而易见的，它们都被视为包括在本发明。本发明所述方法已经通过较佳实施例进行了描述，相关人员明显能在不脱离本发明内容、精神和范围内对本文所述方法进行改动或适当变更与组合，来实现和应用本发明技术。

在本发明技术方案中，可以在适当的载体、基因元件中插入筛选标签(如氨基酸营养标签或抗性标签)，用于敲除过程中对正确菌株的筛选验证，也可采用本领域其他方式进行验证。

下面结合实施例，进一步阐述本发明。

实施例1：敲除商用BY4742酿酒酵母待敲除的X号染色体

1、片段构建

设计上、下游引物PCR扩增合成KanMX抗性基因，以及两vox位点间基因(20bp同源KanMX抗性基因+vox+X号染色体着丝粒序列+vox)，两vox位点间基因左端(vox上游)与KanMX抗性基因有20bp同源；

提取BY4742菌株基因组，设计上游引物左端带20bp pUC19质粒EcoRI酶切位点上游同源和右端带20bpKanMX抗性基因同源序列、下游引物右端带20bp pUC19质粒HindIII酶切位点下游同源和左端带20bp vox同源序列，PCR扩增野生型BY4742酿酒酵母X号染色体着丝粒两端1000bp同源序列；

利用Gibson组装将线性化质粒和双链DNA进行组装，获得片段2+片段1+片段3的完整片段4，即着丝粒上游1000bp同源臂+KanMX抗性基因+vox+X号染色体着丝粒序列+vox+着丝粒下游1000bp同源臂，再通过两端的pUC19质粒EcoRI和HindIII酶切位点上/下游同源臂连接到pUC19质粒上；

将上述反应体系转化如DH5α大肠杆菌的感受态细胞中，涂布于LB+Carb平板上，37℃培养12h；挑取6个单菌落接种于5mL LB+Carb液体培养基中，37℃过夜培养后，提取质粒，酶切验证，正确的进行Sanger测序；测序正确的质粒命名为bYW0190。

酶切质粒bYW0190，获得片段4，将片4转化入BY4742菌株，与X号染色体发生同源重组，在YPD+G418培养平板上筛选成功导入片段的菌株(G418是一种抗性药，菌体中有KanMX基因表达才能在有G418平板上生长)，验证正确的菌株命名为yYW0258；

yYW0258(MATα)与synX人工酵母yYW0117(MAT a，其中X号染色体为人工合成)进行杂交，把两种酵母菌平板划线活化后，同时接种到5mlYPD液体培养基中，30℃过夜培养后，将菌液划线到YPD平板上，利用酵母显微操作仪，手动挑取酵母二倍体细胞，或者通利用两种酵母细胞杂交后营养缺陷型的互补，30℃培养2-3d后，涂布SC缺陷型培养基筛选出阳性杂交细胞。待显微镜挑出或平板筛选出的细胞在30℃长出单菌落，用菌落PCR法验证该二倍体细胞的交配型，若同时具有MAT a和MATα两种交配型，并且合成型X号染色体和野生型X号染色体的PCRtag都在，则证明杂交成功，挑选出表型稳定的一株，将正确菌株命名为yYW0259。

向二倍体菌株yYW0259中转化Vika质粒，在SC-Leu培养平板上筛选，并在SC-Leu划线传代。

接菌于5mL Sc-Leu液体培养基过夜培养，转接SG-Leu液体培养基(20％棉籽糖，20％D-半乳糖)诱导24h,在SC-Leu培养平板表面涂布。

Vika/vox系统表达，将SC-Leu培养平板上的菌翻印到SC-Leu+G418，能初步验证野生型X号染色体的丢失(G418是一种抗性药，菌体中有KanMX基因表达才能在有G418平板上生长，如果发生染色体删除，则KanMX标签丢失，菌体不生长)；计算方法为：100％-在SC-Leu+G418上生长的菌的数量/在SC-Leu培养平板上的菌的数量，结果为95％，见附图4；

也可利用PCR反应进行每株菌验证，挑取SC-Leu培养平板上生长的单菌落在SC-Leu培养平板上划线分纯，选取菌株提取基因组并使用GoTaqGreen Master Mix利用PCR反应进行验证。利用特异性区分合成型X(SYN PCRTags)和野生型X(WT PCRTags)的引物进行PCR反应，结果显示存在染色体合成型X染色体，而不存在野生型X染色体，证明成功切割了整条染色体，验证结果见附图5。

以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

序列表

<110> 天津大学

<120> 一种敲除酿酒酵母染色体的方法

<130> MP1701572

<160> 3

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 408

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

aataggtctg agaacgccca ttctcagacg tattgtacag tacctataca tttcataaac 60

atggcatggc gatcagcgcc aaacaatatg gaaaatccac agaaagctat tcattgaaaa 120

aatagtacaa ataagtcaca tgatgatatt tgattttatt atatttttaa aaaaagtaaa 180

aaataaaaag tagtttattt ttaaaaaata aaatttaaaa tattagtgta tttgatttcc 240

gaaagttaaa aaagaaatag taagaaatat atatttcatt gaatggatat atgaaacgtt 300

tactggtgga agttttgctc atatattatt attcaataga agtaataaag agttgcaaat 360

gctccgtcga cgggaatagg tctgagaacg cccattctca gacgtatt 408

<210> 2

<211> 1357

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

gacatggagg cccagaatac cctccttgac agtcttgacg tgcgcagctc aggggcatga 60

tgtgactgtc gcccgtacat ttagcccata catccccatg tataatcatt tgcatccata 120

cattttgatg gccgcacggc gcgaagcaaa aattacggct cctcgctgca gacctgcgag 180

cagggaaacg ctcccctcac agacgcgttg aattgtcccc acgccgcgcc cctgtagaga 240

aatataaaag gttaggattt gccactgagg ttcttctttc atatacttcc ttttaaaatc 300

ttgctaggat acagttctca catcacatcc gaacataaac aaccatgggt aaggaaaaga 360

ctcacgtttc gaggccgcga ttaaattcca acatggatgc tgatttatat gggtataaat 420

gggctcgcga taatgtcggg caatcaggtg cgacaatcta tcgattgtat gggaagcccg 480

atgcgccaga gttgtttctg aaacatggca aaggtagcgt tgccaatgat gttacagatg 540

agatggtcag actaaactgg ctgacggaat ttatgcctct tccgaccatc aagcatttta 600

tccgtactcc tgatgatgca tggttactca ccactgcgat ccccggcaaa acagcattcc 660

aggtattaga agaatatcct gattcaggtg aaaatattgt tgatgcgctg gcagtgttcc 720

tgcgccggtt gcattcgatt cctgtttgta attgtccttt taacagcgat cgcgtatttc 780

gtctcgctca ggcgcaatca cgaatgaata acggtttggt tgatgcgagt gattttgatg 840

acgagcgtaa tggctggcct gttgaacaag tctggaaaga aatgcataag cttttgccat 900

tctcaccgga ttcagtcgtc actcatggtg atttctcact tgataacctt atttttgacg 960

aggggaaatt aataggttgt attgatgttg gacgagtcgg aatcgcagac cgataccagg 1020

atcttgccat cctatggaac tgcctcggtg agttttctcc ttcattacag aaacggcttt 1080

ttcaaaaata tggtattgat aatcctgata tgaataaatt gcagtttcat ttgatgctcg 1140

atgagttttt ctaatcagta ctgacaataa aaagattctt gttttcaaga acttgtcatt 1200

tgtatagttt ttttatattg tagttgttct attttaatca aatgttagcg tgatttatat 1260

tttttttcgc ctcgacatca tctgcccaga tgcgaagtta agtgcgcaga aagtaatatc 1320

atgcgtcaat cgtatgtgaa tgctggtcgc tatactg 1357

<210> 3

<211> 2686

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

tcgcgcgttt cggtgatgac ggtgaaaacc tctgacacat gcagctcccg gagacggtca 60

cagcttgtct gtaagcggat gccgggagca gacaagcccg tcagggcgcg tcagcgggtg 120

ttggcgggtg tcggggctgg cttaactatg cggcatcaga gcagattgta ctgagagtgc 180

accatatgcg gtgtgaaata ccgcacagat gcgtaaggag aaaataccgc atcaggcgcc 240

attcgccatt caggctgcgc aactgttggg aagggcgatc ggtgcgggcc tcttcgctat 300

tacgccagct ggcgaaaggg ggatgtgctg caaggcgatt aagttgggta acgccagggt 360

tttcccagtc acgacgttgt aaaacgacgg ccagtgaatt cgagctcggt acccggggat 420

cctctagagt cgacctgcag gcatgcaagc ttggcgtaat catggtcata gctgtttcct 480

gtgtgaaatt gttatccgct cacaattcca cacaacatac gagccggaag cataaagtgt 540

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tttccccctg gaagctccct cgtgcgctct cctgttccga ccctgccgct taccggatac 1020

ctgtccgcct ttctcccttc gggaagcgtg gcgctttctc atagctcacg ctgtaggtat 1080

ctcagttcgg tgtaggtcgt tcgctccaag ctgggctgtg tgcacgaacc ccccgttcag 1140

cccgaccgct gcgccttatc cggtaactat cgtcttgagt ccaacccggt aagacacgac 1200

ttatcgccac tggcagcagc cactggtaac aggattagca gagcgaggta tgtaggcggt 1260

gctacagagt tcttgaagtg gtggcctaac tacggctaca ctagaagaac agtatttggt 1320

atctgcgctc tgctgaagcc agttaccttc ggaaaaagag ttggtagctc ttgatccggc 1380

aaacaaacca ccgctggtag cggtggtttt tttgtttgca agcagcagat tacgcgcaga 1440

aaaaaaggat ctcaagaaga tcctttgatc ttttctacgg ggtctgacgc tcagtggaac 1500

gaaaactcac gttaagggat tttggtcatg agattatcaa aaaggatctt cacctagatc 1560

cttttaaatt aaaaatgaag ttttaaatca atctaaagta tatatgagta aacttggtct 1620

gacagttacc aatgcttaat cagtgaggca cctatctcag cgatctgtct atttcgttca 1680

tccatagttg cctgactccc cgtcgtgtag ataactacga tacgggaggg cttaccatct 1740

ggccccagtg ctgcaatgat accgcgagac ccacgctcac cggctccaga tttatcagca 1800

ataaaccagc cagccggaag ggccgagcgc agaagtggtc ctgcaacttt atccgcctcc 1860

atccagtcta ttaattgttg ccgggaagct agagtaagta gttcgccagt taatagtttg 1920

cgcaacgttg ttgccattgc tacaggcatc gtggtgtcac gctcgtcgtt tggtatggct 1980

tcattcagct ccggttccca acgatcaagg cgagttacat gatcccccat gttgtgcaaa 2040

aaagcggtta gctccttcgg tcctccgatc gttgtcagaa gtaagttggc cgcagtgtta 2100

tcactcatgg ttatggcagc actgcataat tctcttactg tcatgccatc cgtaagatgc 2160

ttttctgtga ctggtgagta ctcaaccaag tcattctgag aatagtgtat gcggcgaccg 2220

agttgctctt gcccggcgtc aatacgggat aataccgcgc cacatagcag aactttaaaa 2280

gtgctcatca ttggaaaacg ttcttcgggg cgaaaactct caaggatctt accgctgttg 2340

agatccagtt cgatgtaacc cactcgtgca cccaactgat cttcagcatc ttttactttc 2400

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ggggttccgc gcacatttcc ccgaaaagtg ccacctgacg tctaagaaac cattattatc 2640

atgacattaa cctataaaaa taggcgtatc acgaggccct ttcgtc 2686

Claims (13)

1.一种敲除酿酒酵母染色体的方法，其特征在于，包括：

步骤1、人工合成待敲除的染色体上的着丝粒序列，并在两端添加vox序列，获得片段1；人工合成待敲除的染色体着丝粒上游同源臂和下游同源臂；同时，在所述着丝粒上游同源臂的3’端添加片段1的5’端同源序列以及在其5’端添加载体同源臂序列，获得片段2；在所述着丝粒下游同源臂5’端添加片段1的3’端同源序列以及在其3’端添加载体同源臂序列，获得片段3；

步骤2、将所述片段1-3分别形成完全互补的双链DNA，通过酶切和Gibson组装技术，与载体组装，获得质粒1；酶切质粒1获得片段2+片段1+片段3的完整片段4；

步骤3、将所述完整片段4转化到待敲除染色体的单倍体酿酒酵母菌株中，通过同源重组替换原有序列；然后与交配型不同得酿酒酵母菌株进行融合，构建二倍体酿酒酵母菌株；

步骤4、向所述二倍体酿酒酵母菌株中转化含有vika基因的Vika质粒，通过Vika质粒上的诱导调控序列开启Vika蛋白表达，Vika蛋白诱导待敲除的染色体着丝两端的vox序列重组并丢失着丝粒，完成对整条染色体的敲除。

2.根据权利要求1所述方法，其特征在于，所述载体同源臂为载体上酶切位点两端的同源臂。

3.根据权利要求2所述方法，其特征在于，所述载体同源臂为pUC19质粒上酶切位点两端的同源臂。

4.根据权利要求3所述方法，其特征在于，所述载体同源臂为pUC19质粒EcoRI酶切位点上游同源臂和HindIII酶切位点下游同源臂。

5.根据权利要求1所述方法，其特征在于，所述通过Vika质粒上的诱导调控序列开启Vika蛋白表达为：通过Vika质粒上的乳糖操纵子序列，加入半乳糖诱导物开启Vika蛋白表达。

6.根据权利要求5所述方法，其特征在于，所述Vika质粒为在商用质粒基础上，通过在多克隆位点以酶切连接的方式插入vika基因获得的质粒。

7.根据权利要求1所述方法，其特征在于，所述Vika质粒为在商用质粒基础上，通过在多克隆位点以酶切连接的方式插入vika基因获得的质粒。

8.根据权利要求6所述方法，其特征在于，所述商用质粒为pRS415质粒。

9.根据权利要求7所述方法，其特征在于，所述商用质粒为pRS415质粒。

10.根据权利要求1所述方法，其特征在于，步骤1为：

人工合成BY4742酿酒酵母待敲除的X号染色体上的着丝粒序列，并在两端添加vox序列，获得片段1；人工合成BY4742酿酒酵母待敲除的X号染色体着丝粒1000bp上游同源臂和1000bp下游同源臂；同时，在所述着丝粒上游同源臂的3’端添加片段1的5’端20bp同源序列以及在其5’端添加20bp载体同源臂序列，获得片段2；在所述着丝粒下游同源臂5’端添加片段1的3’端20bp同源序列以及在其3’端添加20bp载体同源臂序列，获得片段3。

11.根据权利要求10所述方法，其特征在于，所述片段1的序列如SEQ ID NO:1所示。

12.根据权利要求1所述方法，其特征在于，步骤2为：

将片段1-3形成完全互补的双链DNA，通过EcoRI和HindIII酶切和Gibson组装技术，与pUC19质粒组装，获得质粒1；EcoRI和HindIII酶切质粒1获得片段2+片段1+片段3的完整片段4。

13.根据权利要求1-12任意一项所述方法，其特征在于，还包括在所述片段1的一端添加筛选标签。

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