CN107502618B - 可控载体消除方法及易用型CRISPR-Cas9工具 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种可控载体消除方法及易用型CRISPR‑Cas9工具。本发明提供了可控载体消除工具，由控制模块(包括：含有严谨调控型启动子和归巢核酸内切酶编码基因的核心区域，分别位于核心区域两端的终止子，及分别位于两终止子外端的归巢核酸内切酶识别序列)和消除模块(包括：抗生素抗性基因表达盒，及位于两端的归巢核酸内切酶识别序列)组成。本发明可简单、快速及高效的一步去除质粒载体，进一步开发的易用型CRISPR‑Cas9系统可实现Cas9和sgRNA编码质粒一步从宿主细胞中快速消除。该易用型CRISPR‑Cas9系统非常方便、实用，极大节约实验时间，减少实验强度，是非常实用的基因编辑工具。

Description

可控载体消除方法及易用型CRISPR-Cas9工具

技术领域

本发明属于基因工程领域，涉及一种可控的载体消除方法及易用型的CRISPR-Cas9基因编辑工具。

背景技术

载体是重要的分子生物学操作平台，基因操作工具多是基于载体平台而开发的。这些基因操作工具，比如基因编辑类，大片段染色体整合类，以及实验进化类等，极大地方便了遗传操作。然而，如何快速在遗传改造完成之后，将其所在的载体从宿主细胞中消除，却是一个制约后续遗传改造或应用的难题。

工具载体残留在宿主细胞中，会给细胞造成不必要的代谢负担，劫持细胞资源。而某些遗传操作工具，其功能元件对宿主细胞是有毒性的，更需要将其快速消除。同时，将工具载体从菌体细胞中消除，回收了工具载体所使用的复制元件和抗生素标记，便于以后针对该菌株的其他遗传操作。

目前常用的载体消除方法，包括物理方法(如微波)，化学方法，利用反向筛选标记，以及利用温度敏感型的复制子等。其中，物理、化学的方法，效率较低，操作繁琐，需要较长的实验周期和大量的筛选工作，并不适合经常性需求的工具载体的消除。另一方面，物理、化学的方法往往具有一定的诱变性，增加了DNA突变的风险。而基于反筛选标记的载体消除方法，往往需要构建一个突变菌株，即将反筛选标记在基因组上的拷贝先敲除，并在载体上进行互补。比如Clostridium cellulolyticum菌株，敲除了基因组上本身的pyfF基因(编码orotidine 5-phosphate decarboxylase)，并在工具载体上互补，实现了利用这一反筛选标记去除Clostridium中的ClosTron系统的目的[1]。但是使用这一方法的缺陷是将以后的操作都限制在该突变菌株内，无法在其他pyfF野生型的菌株内使用该系统。利用温度敏感型复制子的方法，虽然与物理、化学方法，以及基于反筛选标记的方法相比较要简单，但是温度敏感型复制子是菌株特异的，并不是每个菌株都开发出这样的温度敏感型复制子。同时，获得温度敏感的复制子，往往需要通过对初始载体的复制子区域进行突变，并通过大量筛选来获得温度敏感的表型，这一过程极其繁琐。并且，突变获得的复制子，其某些基础性状有变化，比如质粒稳定性，拷贝数等[2]。因此，通过突变获得的温敏复制子，需要对载体性质进行重新表征。

成簇间隔短回文重复序列技术(Clustered regularly interspaced shortpalindromic repeats,CRISPR)是重要的基因编辑技术[3]。该系统由成簇间隔的短回文重复序列和Cas基因形成，CRISPR-Cas复合体与靶向序列互补配对，引导核酸内切酶Cas对靶向序列进行双链DNA切割。II型Cas9蛋白也是基因编辑中使用最多的一种，其可以定向于几乎全部染色体位置，唯一需要的因素是Protospacer-adjacent motif(PAM)序列。在嗜热链球菌中，PAM序列多为NGG，用于靶向DNA序列的定位。切割的过程需要另外两个RNA的引导，分别是CRISPR RNA(crRNA)和反式CRISPR RNA(trans-activating CRISPR RNA,tracrRNA)。也可以将这两个RNA合并成一个向导RNA(single-guide RNA,sgRNA)，这样就只需要表达单个sgRNA就可以介导Cas9实现靶向位点的切割的目的，这一设计使得定位靶向序列比同时分别表达crRNA和tracrRNA更加方便。

在细菌中应用CRISPR-Cas9高效基因编辑，最早是Zhang Feng课题组在大肠杆菌和肺炎链球菌中实现的[4]。2015年，Jakociunas等利用CRISPR-Cas9技术在酿酒酵母中实现了多元代谢途径工程改造[5]。Jan-Peter van Pijkeren课题组在2014年在乳酸菌Lactobacillus reuteri中实现了染色体编辑[6]。在所有细菌中，大肠杆菌中开发的CRISPR-Cas9系统版本最多[7-11]。然而，如何在基因编辑完成之后，将CRISPR-Cas9系统快速消除却是一个亟待解决的问题。合成生物学工作者Jan-Peter Van Pijkeren在Lactobacillus reuteri中发现，其构建的CRISPR-Cas9系统在大约70代传代后，大约30％的细胞中CRISPR-Cas9系统所在的载体可以被消除，他特别指出CRISPR载体的去除需要进一步提高效率。而许多其他细菌开发的CRISPR-Cas9系统并没有给出载体消除的解决方案。

在模式菌株大肠杆菌中，已经有科学工作者注意到这一问题，并给出了基于温度敏感型的复制子的解决方案。Jiang等在其为大肠杆菌构建的CRISPR-Cas9系统中设计了载体消除的办法，以期实现对基因编辑的重复操作[8]。具体的策略是，在温度敏感型复制子pSC101的基础上构建Cas9表达载体，其上同时有用P_Trc启动子控制表达的sgRNA-pMB1，这段sgRNA靶向于pTarget载体(sgRNA表达载体)的复制起点。通过IPTG诱导sgRNA-pMB1表达，就可以引导Cas9切割sgRNA表达的pTarget载体的复制起始位点，从而将其消除；再通过改变培养温度将Cas9所在的载体消除掉。然而这种策略是逐步的，实验的工作量和时间较大。

Reisch等也开发出了另一套基于温度敏感型复制子pSC101的CRISPR-Cas9系统[12]。该系统中，将sgRNA置于温度敏感型复制子pSC101所在的载体上。在基因编辑完成之后，转入一个靶向Cas9蛋白所在的载体的sgRNA表达载体，将Cas9蛋白所在载体消除掉，再通过改变培养温度，将sgRNA载体消除掉。以上所述的CRISPR-Cas9系统都是需要逐步进行消除操作的。

因此，开发一种可以快速使质粒载体一步消除的方法是非常必要的，将这种方法应用于CRISPR-Cas9系统将有助于其快速高效的消除。

发明内容

本发明的目的是提供一种可控载体消除方法及易用型CRISPR-Cas9工具。

本发明提供了可控的载体消除工具，其具有控制模块和消除模块。单独的控制模块也属于本发明的保护范围。本发明所提供的易用型CRISPR-Cas9基因编辑工具，较传统的CRISPR-Cas9系统更容易从宿主细胞中消除，便于快速基因改造。

本发明首先提供了一种DNA片段A(即控制模块)，包括如下结构：含有严谨调控型启动子和由所述严谨调控型启动子控制表达的归巢核酸内切酶的编码基因的核心区域，分别位于所述核心区域两端的两个终止子，以及分别位于所述两个终止子外端的两个所述归巢核酸内切酶的识别序列。

本发明还提供了一成套DNA片段，由DNA片段B(即消除模块)和上述DNA片段A(即控制模块)组成；所述DNA片段B包含有如下结构：抗生素抗性基因表达盒，以及位于所述抗生素抗性基因表达盒两端的所述归巢核酸内切酶的识别序列。

在本发明的一个实施例中，所述归巢核酸内切酶具体为归巢核酸内切酶I-SceI。相应的，所述归巢核酸内切酶的识别序列为归巢核酸内切酶I-SceI的识别序列，具体为5′-TAGGGATAACAGGGTAAT-3′。

在本发明的一个实施例中，在所述DNA片段A(即控制模块)中，所述严谨调控型启动子具体为P_Bad启动子，其所对应的调控蛋白具体为AraC。

在本发明的一个实施例中，在所述DNA片段A(即控制模块)中，所述两个终止子分别具体为TET终止子和T1T2终止子。

含有所述DNA片段A或所述成套DNA片段的重组载体或重组菌也属于本发明的保护范围。

所述DNA片段A或所述成套DNA片段或所述重组载体或重组菌在可控消除外源工具载体中的应用也属于本发明的保护范围。

本发明提供了一种可控消除外源工具载体的方法。

本发明所提供的可控消除外源工具载体的方法，具体可为如下(A)或(B)：

(A)当待消除的外源工具载体为一个质粒载体时，所述方法包括如下步骤：将所述DNA片段A(即控制模块)组装到所述待消除的外源工具载体中。需要启动消除时，外源加入能够诱导所述严谨调控型启动子启动转录的诱导物，从而使所述归巢核酸内切酶得以表达，进而识别所述控制模块中的识别位点并进行切割，形成双链DNA断裂。DNA断裂的载体进而从菌体细胞中降解、消除。

(B)当待消除的外源工具载体为多个载体时，所述方法包括如下步骤(B1)或(B2)：

(B1)将所述DNA片段A(即控制模块)克隆到其中一个所述待消除的外源工具载体中，将所述DNA片段B(即消除模块)组装到其余所述待消除的外源工具载体中。需要启动消除时，外源加入能够诱导所述严谨调控型启动子启动转录的诱导物，从而使所述归巢核酸内切酶得以表达，进而识别所述控制模块和所述消除模块中的识别位点并进行切割，形成双链DNA断裂。DNA断裂的载体进而从菌体细胞中降解、消除。

(B2)将所述DNA片段A(即控制模块)分别组装到每一个所述待消除的外源工具载体中，需要启动消除时，外源加入能够诱导所述严谨调控型启动子启动转录的诱导物，从而使所述归巢核酸内切酶得以表达，进而识别所述控制模块中的识别位点并进行切割，形成双链DNA断裂。DNA断裂的载体进而从菌体细胞中降解、消除。

本发明还提供了一种可控消除的易用型的基因编辑工具。

本发明所提供的可控消除的基因编辑工具，具体可为如下(C)或(D)：

(C)当所述可控消除的基因编辑工具为一个重组载体时，所述可控消除的基因编辑工具上存在两个独立的结构单元，分别为用于基因编辑的结构单元，以及用于可控消除载体的结构单元；所述用于可控消除载体的结构单元为所述DNA片段A(即控制模块)；

(D)当所述可控消除的基因编辑工具为多个重组载体时，所述可控消除的基因编辑工具中的每个重组载体上均存在两个独立的结构单元，分别为用于基因编辑的结构单元，以及用于可控消除载体的结构单元；所有重组载体上的所述用于可控消除载体的结构单元具体为如下(D1)或(D2)：

(D1)其中一个重组载体上的所述用于可控消除载体的结构单元为所述DNA片段A(即控制模块)，其余重组载体上的所述用于可控消除载体的结构单元为所述DNA片段B(即消除模块)；

(D2)所有重组载体上的所述用于可控消除载体的结构单元均为所述DNA片段A(即控制模块)。

在本发明的一个实施例中，所述可控消除的基因编辑工具具体为“易用型”CRISPR-Cas9系统。在本发明的“易用型”CRISPR-Cas9系统中，Cas9蛋白承载质粒含有DNA片段B(即消除模块)；sgRNA承载质粒含有DNA片段A(即控制模块)。

具体而言，所述“易用型”CRISPR-Cas9系统中含有用于表达Cas9的重组质粒pCAS92和用于表达sgRNA的重组质粒pGRNA2；所述重组质粒pCAS92中Cas9蛋白的编码基因置于IPTG诱导的P_Lac启动子之下，同时在该质粒上的还有所述DNA片段B(即消除模块)；所述重组质粒pGRNA2中sgRNA的骨架置于强启动子P_J23119的控制之下，同时在该质粒上还含有所述DNA片段A(即控制模块)。进一步，所述重组质粒pCAS92中的复制子具体为p15A复制子；所述重组质粒pGRNA2中的复制子具体为ColE1复制子。

本发明利用归巢内切酶以及其识别位点，设计了一个全新的可控质粒载体消除基因线路(命名为EXIT)，实验结果表明，该基因线路是一种简单、可靠、快速以及高效的一步去除质粒载体的方法。本发明进一步以大肠杆菌为例，开发出一新型的易用型(Easy-to-use)CRISPR-Cas9系统。将EXIT基因线路与CRISPR-Cas9系统结合起来，使得其在完成基因编辑之后，一步将系统的两个载体同时从宿主细胞中消除，极大地方便了基因编辑和后续应用。发明人利用该易用型CRISPR-Cas9系统进行基因组插入等操作，并成功的在三天之内构建了一株无痕染色体整合、无载体残留的atrazine降解菌株。实验结果表明，该易用型CRISPR-Cas9系统是一种非常方便、实用的基因编辑工具，极大的节约了实验时间，减少了实验强度，是一种非常实用的基因编辑工具。

附图说明

图1为合成可控载体消除基因线路示意图。Cm^R：氯霉素，Amp^R：氨苄青霉素，Kan^R：卡那霉素。

图2为大肠杆菌可控载体消除基因线路控制模块的示意图。终止子：TET，T1T2；调控蛋白araC；L-arabinose诱导型启动子P_BAD。

图3为I-SceI-GFPmut3b融合蛋白质粒pEC001对不同浓度L-arabinose的响应。

图4为利用GFP作为指示对质粒消除进行表征。CmR：氯霉素抗性。

图5为群体水平下利用GFPmut3b为指示对控制模块的表征。

图6为单细胞水平下利用GFPmut3b作为指示对控制模块的表征。

图7为利用抗生素敏感性实验对控制模块的表征。其中，A为质粒消除效率统计；B为12小时后抗性平板生长展示。

图8为EXIT基因线路应用于不同类型载体的消除效率。

图9为EXIT基因线路应用于不同类型载体消除的PCR扩增验证。其中，DDW表示灭菌去离子水；C-表示质粒未消除细胞。A为质粒pEC101消除验证；B质粒pEC102消除验证；C质粒pEC103消除验证；D质粒pEC104消除验证；E质粒pEC105消除验证。

图10为多个质粒载体同时消除的模型展示。

图11为多个载体同时去除特性的表征。其中，A为多载体消除效率；B为载体上含有的不同抗生素抗性的敏感性实验。

图12为多个载体同步消除的PCR扩增验证。DDW表示灭菌去离子水；C-表示质粒未消除细胞。1表示利用pEC101特异性引物扩增；2表示pEC106特异性引物扩增。

图13为同时利用EXIT线路的控制模块来消除多个载体。

图14为易用型CRISPR-Cas9系统的组成。

图15为易用型CRISPR-Cas9系统进行基因编辑的流程。

图16为插入位点的选择和sgRNA表达质粒的构建。

图17为细胞拯救数目随着修复模板浓度的提高而增加。

图18为LacZ的基因组整合效率以及PCR扩增验证。

图19为易用型CRISPR-Cas9系统的消除。其中，上幅为pCAS92特异性引物扩增；中幅为pGRNA2特异性引物扩增；下幅为pKD46特异性引物扩增。C-：为质粒未消除的母代细胞作为PCR扩增模板；M：DNAmarker

图20为易用型CRISPR-Cas9系统与逐步消除系统的比较。

图21为Atrazine降解菌株的构建。A.atrazine脱氯水解酶可以将atrazine水解；B.水解圈的形成；C：水解圈直径统计

具体实施方式

下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。

下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

实施例1、可控载体消除基因线路的设计、构建及应用

一、材料与方法

1、菌株、质粒及培养方法

本实施例中所有用到的菌株和质粒都列于表1中。其中，大肠杆菌NEB10β用作克隆菌株，以及基因线路的表型验证。所有的大肠杆菌都培养在LB培养基中。除含有质粒pKD46的菌株培养于30℃之外，其他的菌株均培养于37℃下。LB培养基的组成为：蛋白胨10g/L，酵母粉5g/L，NaCl 10g/L。固体培养基中加入15g/L琼脂。

以上菌株根据需要加入抗生素：100μg/mL的氨苄霉素，50μg/mL的卡那霉素，20μg/mL氯霉素，以及200μg/mL红霉素。L-arabinose作为诱导剂，按照文中所标注的浓度加入到培养基中。

将菌株置于培养箱中静置培养，或者于摇床中以200rpm进行振荡培养。细菌生长用BioSpec-1601紫外分光光度计(Shimadzu公司，日本)测定波长600nm处的光吸收值(OD600)测定。

表1本发明所用到的菌株和质粒

2、序列分析

大肠杆菌菌株MG1655基因组的全序列数据获取自GenBank(登录号：NC_000913)。

3、DNA操作

大肠杆菌全基因组通过E.Z.N.A全基因组DNA提取试剂盒(OMEGA，北京，中国)提取。质粒通过E.Z.N.A质粒小量提取试剂盒(OMEGA，北京，中国)提取。所有用于质粒构建的DNA片段都通过E.Z.N.A胶回收试剂盒(OMEGA，北京，中国)切胶纯化。PCR扩增所用的酶，Gibson反应液配制所用的酶，以及限制性内切酶均购置于NEB公司(NEB，北京，中国)。Q5High-Fidelity DNA聚合酶用于扩增质粒构建所用到的片段，PCR验证使用OneTaq 2XMaster Mix。以上实验操作均按照产品说明书使用。

4、DNA测序

构建的质粒，以及PCR验证扩增的产物，均进行测序验证，以确定是目的载体或者PCR产物。测序由Genewiz公司(北京，中国)或者睿博公司(北京，中国)完成。

5、大肠杆菌电转化感受态的制备

1)从E.coli生长的LB平板中挑取单菌落，转接到含有100mL LB液体培养基的三角瓶中，于摇床150rpm培养到OD₆₀₀达到0.6的时候，取出摇瓶，冰浴25min，期间每隔5min轻轻的振荡一次。

2)收菌，在超净工作台将菌液分装到50mL离心管中，配平后于4℃以4000rpm离心15min。

3)弃掉上清液，用冰浴预冷的10％甘油悬浮细胞，用移液枪轻轻吹打悬浮细胞，彻底悬浮、离散沉淀的细胞后，离心收菌。

4)重复第3)步一次。

5)离心，弃掉上清，用1mL的10％甘油重新悬浮细胞。将感受态细胞以每管100μL分装到预冷的EP管中，冷冻于-80℃下备用。

6、DNA连接

构建质粒的方法主要通过Gibson连接的方式。

1)制备6mL的5X ISO Buffer，组分如下：

3mL 1M Tris-HCL(pH 7.5)

+150μL 2M MgCl₂

+240μL 2M 100mM dNTP mix(25mM each:dGTP,dCTP,dATP,dTTP)

+300μL 1M DTT

+1.5g PEG-8000

+300μL的100mM NAD

+ddH₂O至6mL，分装成160μL储藏于-20℃下备用。

2)制备600μL的Gibson连接MIX，组分如下：

160μL 5X ISO Buffer

+0.32μL 10U/μL T5exonuclease

+10μL 2U/μL Q5DNA polymerase

+80μL 40U/μL Taq DNA ligase

+ddH₂O至1.2mL，分装成15μL于PCR管中，储藏于-20℃下备用。

3)使用的时候，取出一支15μL的Gibson连接MIX，置于冰上溶解、待用。

4)制备质粒构建的片段，并利用NanoDrop(Thermo)测定DNA浓度(ng/μL)。

5)将100ng的质粒载体骨架，和等摩尔的其他片段混合，用移液枪多次吸打，与Gibson连接MIX充分混匀，达到终体积20μL，不足的部分用ddH₂O补足。

6)温浴于50℃之下至少60分钟。

7)取出反应的MIX，吸取1-5μL反应液到大肠杆菌感受态中，电转。

7、电转化步骤

1)将质粒或者Gibson反应液，与感受态充分混匀后，转移到2mm的电转杯中，静置冰上5分钟。

2)将电转仪(Bio-rad)设置到2.5KV的条件下电击，之后立即加入1mL LB培养基，上下颠倒混匀。

3)将悬浮于LB培养基中的细胞转移到1mL的EP管中，复苏1小时后，涂布于相应抗性的平板上，置于温箱中倒置培养。

8、质粒构建

质粒构建所用到的引物列于表2中。

表2本研究中所使用的引物

质粒pEC100的构建过程如下：将终止子TET以及T1T2从质粒pCP202(质粒pCP202的全序列如序列表中序列1所示)中扩增出来，将L-arabinose调控元件araC-P_Bad整体从质粒pKD46中扩增出来，将I-SceI编码基因从合成的模板(Genewiz，北京，中国)中扩增出来，他们按照设计的顺序，一步连接到质粒pACYC184中。

将GFPmut3b报告基因扩增，并克隆到质粒pEC100中I-SceI下游，构建I-SceI-GFPmut3b融合质粒pEC001，该质粒被用于表征I-SceI在P_Bad启动子下的表达水平。

构建可控载体消除基因线路的控制模块(Control Module)是将I-SceI识别序列分别引入质粒pEC100上的TET-araC-P_BAD-I-SceI-T1T2结构的两端，生成质粒pEC101。

利用GFPmut3b报告基因，指示载体消除效率的质粒pEC201的构建过程如下：将GFPmut3b报告基因置于强启动子P_J23119控制之下，并插入到质粒pEC101中。将控制模块从质粒pEC101中扩增出来，插入到质粒pbeloBac11生成质粒pEC105，插入到质粒pET-19(b)(pBR322复制子)生成质粒pEC102，插入到质粒pIC202(ColE1复制子)(质粒pIC202的全序列如序列表中序列2所示)中生成质粒pEC103，插入到质粒pUC-EM(pMB1)(质粒pUC-EM的全序列如序列表中序列3所示)生成质粒pEC104。

这一系列质粒被用于表征可控载体消除基因线路在不同拷贝数、不同类型质粒上的效果。

可控载体消除基因线路的消除模块(Exit Module)的编码质粒pEM106的构建是将两个I-SceI限制性酶切位点分别引入到pET-19(b)质粒的氨苄抗性的两端。

9、载体的消除以及消除效率的测定

1)需要进行质粒消除的大肠杆菌菌株，按照0.5％的接种量接种到新鲜的无抗性的LB液体培养基中，同时按照文中标定的浓度加入L-arabinose诱导剂。经过一定时间的诱导后，取出一定量的菌液，稀释，涂布于无抗性的平板上。

2)待菌落形成之后，挑取100个(3个重复)单克隆，划到相应抗性的LB平板上，如果载体已经丢失，则相应的克隆将失去载体上相应抗生素标记的抗性。

消除效率记为“不能生长的克隆数/总测试克隆数目”。对于通过抗生素敏感性试验的克隆，再利用质粒特异性的引物进行PCR扩增验证，如果是阳性的话不能产生特异性的条带。最后采用质粒提取的方式进行验证，与对照相比，得不到任何质粒条带。

10、细菌菌体生长以及荧光的测定

过夜培养的E.coli NEB10β/pEC001或者E.coli NEB10β/pEC201被转接到新鲜的LB培养基中，并添加相应浓度的L-arabinose诱导剂。取出200μL置入96孔板(CorningCostar,cat.#3603)的培养孔中，置于酶标仪(BioTek,SynergyH4)中，于37℃下连续培养，并测定生长(吸收光600nm)和GFP绿色荧光(激发光波长488nm；检测波长520nm)。

11、流式细胞仪单细胞荧光测定

1)过夜培养的E.coli NEB10β/pEC201被转接到LB培养基中，并添加100mM的L-arabinose诱导，在加入诱导剂后每隔6小时，取出1mL样品，放在冰上存储。

2)待样品取完之后，4000rpm转速下离心，并用1mL PBS缓冲液重新悬浮。上样到流式细胞仪(BD FACS Calibur cytometer)进行分析。每个样品，分析30,000个细胞。

3)数据使用Flowjo7.5软件进行分析。

二、实验结果

(一)可控载体消除基因线路(EXIT)的设计

为了实现不能类型载体的快速消除，本发明设计了基于归巢内切酶以及其识别位点的可控载体消除基因线路(以下简称EXIT)，该基因线路的模块将能够像一个“DNA插头”一样，模块化的嵌入到不同类型的载体中去，从而赋予这些载体快速消除的能力。

如图1所示，EXIT基因线路包括两个模块：控制模块(Control Module)和消除模块(Exit Module)。控制模块由一个严谨调控的启动子来控制归巢核酸内切酶的表达，并在整个结构的两端分别安上一个终止子，将其与相邻序列绝缘；在两个终止子的外端，分别加上该归巢核酸内切酶的识别序列。消除模块是由含抗生素抗性基因表达结构，并在其两端加上归巢核酸内切酶的识别位点所构成。消除模块可以用来取代载体上本来的抗生素抗性基因。

EXIT基因线路的工作原理是：当严谨调控的启动子被诱导剂激活，诱导表达归巢核酸内切酶。归巢内切酶同时识别控制模块和消除模块的识别位点并进行切割，形成双链DNA断裂。DNA断裂的载体进而从菌体细胞中降解、消除。EXIT基因线路的所有需要元素都集中在线路内，其模块化的构建允许其很快的被整合到不同类型的载体中，从而有效地将载体从它的宿主中消除。

(二)EXIT基因线路在大肠杆菌中的构建

为了验证以上可控载体消除设计，并表征其功能，本发明在E.coli中利用归巢核酸内切酶I-SceI构建该EXIT基因线路(图2)。首先，利用内切酶I-SceI及其切割位点来构建EXIT基因线路的控制模块。在该模块中，核酸内切酶I-SceI被置于L-arabinose诱导的启动子P_Bad之下，并在两端加上终止子Tet和T1T2以与临近的序列绝缘，防止核酸内切酶I-SceI的泄漏表达，同时也防止对邻近序列的干扰。归巢内切酶I-SceI的识别序列被分别安放在两端。模块化的装配方式允许EXIT线路可以用“即插即用”的方式被移动到不同类型的载体上。

元件的选择在构建EXIT线路的控制模块中显得比较关键，选用P_Bad启动子是因为其是已知的E.coli中最为严谨的启动子之一。将归巢内切酶I-SceI置于其控制之下，避免了I-SceI的泄漏表达而导致的载体非目的消除。终止子Tet的安放也是必须的，避免了EXIT基因线路上游的启动子可能的对I-SceI的表达；而终止子T1T2的安放，避免了P_Bad启动子在诱导下对下游基因的非目标的表达。

1、启动子P_Bad控制下归巢内切酶I-SceI的表达

为了确认最佳的L-arabinose浓度以诱导归巢内切酶I-SceI的高效表达，本发明构建了I-SceI-GFPmut3b融合蛋白质粒pEC001，并通过其来表征不同浓度的L-arabinose对I-SceI-GFPmut3b融合蛋白的激活表达(图3)。不同浓度的L-arabinose被加入到培养基中，其中，在100mM浓度的时候，L-arabinose可以实现最快的I-SceI表达响应，其也是最强的表达水平之一。

2、EXIT基因线路在群体水平的表征

为了表征EXIT基因线路在经过L-arabinose诱导剂激活之后，其在质粒消除中的作用，本发明首先利用GFPmut3b作为指示指标，强组成型启动子J23119被用来表达GFPmut3b蛋白，表征其质粒消除的效率。其原理如图4所示，当EXIT线路被激活，归巢内切酶I-SceI被诱导出来并切割识别位点。切割导致载体丢失，从而导致载体上的GFPmut3b荧光蛋白水平的降低。

从结果(图5)中发现，1mM诱导剂L-arabinose已经导致GFPmut3b绿色荧光蛋白表达的显著下降。随着L-arabinose作为诱导剂浓度的不断升高，GFPmut3b指示绿色荧光蛋白的表达也不断下降，说明其质粒的消除比例也随着诱导剂的浓度的增加而不断增大。另外，从GFPmut3b荧光曲线的斜率可以发现，随着L-arabinose浓度的升高，其斜率变缓的速度越快，说明其质粒消除的速度越快。其中在100mM的水平下最甚。

3、单细胞水平EXIT基因线路的表征

之后本发明进一步在单细胞水平上表征了EXIT基因线路的性质。结果(图6)显示：GFPmut3b荧光从0时到6小时取样点有了显著的下降，在12小时之时更为下降。但是需要注意的是，在12小时诱导之后，仍然可以检测到荧光，这可能是因为残余的荧光蛋白或者是有些细胞里没有全部去掉而导致的。在单细胞水平上的测试与群体水平上的测试，结果是吻合的。在最初的6个小时诱导中，是质粒消除效率最快的时间段。

4、抗生素抗性对EXIT基因线路的表征

进一步，本发明利用质粒载体上携带的抗生素抗性基因，来对EXIT基因线路的控制模块进行表征。如果质粒载体丢失了，其菌体细胞将丢失在含有相应的抗生素培养基上生长的能力(敏感)。于是，本发明对菌株E.coli NEB10β/pEC101进行表征，在不同的时间点取样并进行氯霉素抗性的测试。结果如图7所示。发现，其质粒消除的概率是非常高的，在所测时间的数百个克隆中，没有克隆可以在氯霉素抗性的平板上生长，其消除效率可以达到100％(图7中A)。12小时点的平板如图7中B所示。经过3个小时的诱导之后，其消除效率的结果已经接近100％了。在上面利用GFP作为指示进行表征的时候，3小时时间点荧光水平并没有下降很多，可能是因为荧光残留的缘故，而利用抗生素抗性的作为标记来进行表征，则不会有这样的延迟效应。实验结果表明，EXIT基因线路的控制模块消除质粒载体的效率是非常高的。

(三)EXIT基因线路在不同质粒上的鲁棒性

上面的实验结果说明，嵌入有EXIT基因线路控制模块的质粒pEC101，其在L-arabinose激活之后，质粒的消除效率是非常高的。EXIT基因线路的模块化构建方式和元件的正交性，赋予了EXIT基因线路可以应用到更广泛的载体类型上，而不是局限于某一种特定的质粒。

1、抗生素敏感性实验对EXIT基因线路在不同载体上的表征

为了验证这一点特性，本发明将EXIT基因线路的控制模块拼接到不同拷贝数种类的载体上去，包括单拷贝数的pBelobac11，中拷贝的pBR322，高拷贝的colE1和更高拷贝的pMB1，得到了四个载体pEC105、pEC102、pEC103和pEC104。这些嵌入控制模块的载体被用来表征载体消除的效率。

结果如图8所示，EXIT基因线路也赋予了这四个载体快速消除的能力。在3个小时诱导之后，质粒载体已经从大多数细胞中消除了。到12个小时的时候，几乎100％的质粒都已经从细胞中消除了。这一结果说明，EXIT基因线路可以被广泛的应用到不同类型的质粒上去，赋予不同质粒快速消除的能力，展示了其在不同载体上很好的的鲁棒性。

2、载体消除的PCR验证

综合上述的结果，本发明发现，EXIT基因线路可以赋予从单拷贝到多拷贝不同类型的载体快速消除的能力，并能达到100％的消除效率，测试的载体种类如表3所示，涵盖了大肠杆菌中常用的载体类型。

表3 EXIT基因线路测试的不同类型载体的列表

为了进一步验证这一结果，本发明分别利用载体特异的引物进行PCR扩增验证，结果发现，载体消除的克隆无法得到特异性的条带，而他们的母细胞(Parent strain)，即EXIT基因线路未激活的细胞可以扩增到特异性的条带。这一结果进一步证明了质粒载体的消除(图9)。

(四)EXIT基因线路同时消除多个载体

1、EXIT基因线路消除多个载体的设计

EXIT基因线路的模块化构建方式，允许其作为一个“零件”，整合到载体中，成为载体骨架的一个部分。作为一非激活状态下沉默的零件，它可以被整合到相互兼容的不同载体中去，并在激活之后实现不同载体的一步消除。为了实现这一功能，本发明可以将EXIT基因线路的控制模块嵌入到多个载体中去。但是为了简化设计，本发明在需要消除多个载体的情况下，利用了消除模块(Exit module)来完成这一使命。消除模块是一个两端为归巢内切酶I-SceI识别位点的抗生素抗性基因，可以用来取代载体上原来的抗生素抗性基因。

如图10所示，本发明将EXIT基因线路的控制模块和消除模块分别连接到两个相互兼容的载体上去。推测当归巢内切酶I-SceI被诱导之后，它将可以同时切割控制模块和消除模块，实现其嵌入的多个载体同时消除。

2、EXIT基因线路消除多个载体的验证

为了验证本发明的设计，本发明将嵌入有消除模块的载体pEM106和嵌入有控制模块的载体pEC101同时转入到E.coli NEB10β中，并表征其同时消除的效率。

结果显示：经过12小时的诱导，通过载体相应的抗生素抗性敏感性实验进行表征，如图11所示，两个质粒同时从75％的细胞中全部消除了，其中pEC101从100％的细胞中消除了(氯霉素抗性)，而pEM106从75％的细胞中消除了(氨苄抗性)。这一结果进一步通过载体特异的引物进行了PCR扩增验证(图12)。

3、同时利用控制模块来消除消除多个载体

从步骤2的结果可以得出结论，利用EXIT基因线路的控制模块和消除模块可以实现不同载体的同步消除。可以发现，含有I-SceI表达元件的控制模块所在的载体，消除效率要较只含有I-SceI识别位点的消除模块所在的载体消除效率要高。这可能是在质粒消除过程中，I-SceI的表达蛋白随着控制模块所在的载体不断减少、不断被稀释造成的。但是尽管如此，其效率也足够高，可以直接通过PCR筛选的方式从平板上得到多载体同时消除的克隆。

为了提高多载体同时消除的效率，本发明进一步在不同载体上同时嵌入EXIT基因线路的控制模块，将载体pEC101(p15A+Cm^R)，pEC102(pBR322+Amp^R)转入到E.coli NEB10β中，并通过L-arabinose诱导EXIT基因线路工作。结果如图13所示，经过3小时的诱导之后，其消除效率已经接近100％。实验表面，同时嵌入控制模块可以实现更高效率的载体消除。

总之，本实施例设计了一个全新的可控载体消除基因线路(EXIT)，并通过实验验证了它的功能。EXIT基因线路由控制模块和消除模块构成，利用归巢内切酶及其识别位点构建。研究证明，通过即插即用的方式，将EXIT基因线路插入到一个或多个不同类型的载体上去，可以实现一个或多个载体的同时高效消除。

基于质粒载体的遗传操作工具或者基因改造策略给科学工作者带来了极大的方便，也是一种强大的合成生物学的工具。发展新的工具和策略是合成生物学一项重要的研究方向。然而过去的研究主要是着重于功能模块的研究，而忽略了对质粒载体骨架本身的改造。本发明设计构建的EXIT线路较传统的使用温度敏感型复制子来消除载体有诸多优势。比如，EXIT基因线路允许选择不同类型的复制子；可以实现多个载体同时消除；可以允许正常温度下培养，并且在较短的时间内达到较高的消除效率。

实施例2、大肠杆菌中易用型CRISPR-Cas9系统的建立与应用

一、材料与方法

1、菌株、质粒与培养条件

本实施例用的菌株与质粒列于表5中，其培养条件同实施例1步骤一1中所述。野生型E.coli MG1655用于构建atrazine降解菌株。L-arabinose与IPTG作为诱导剂，按照文中所标注的浓度加入到培养基中。5-Bromo-4-chloro-3-indolyl-β-D-galactopyranoside(X-gal)涂布于LB固体平板表面，用于蓝白斑筛选。

表5本研究所用的菌株与质粒

2、序列分析

序列分析同实施例1步骤一2。用搜索基因组的方式，确定sgRNA的N20序列。

3、DNA操作

DNA操作见前述实施例1步骤一3。

4、质粒构建

本实施例中用到的引物列于表6中。

为了构建“易用型”CRISPR-Cas9系统，首先，归巢内切酶I-SceI识别序列被分别引入到载体pICK1(载体pICK1的全序列如序列表中序列4所示)的卡那霉素抗性的两端，生成中间质粒pICK2；Cas9蛋白被从载体pCAS9扩增出来，并用于取代pICK1载体的GFP的编码基因，置于P_Lac启动子的控制之下，生成质粒pCAS92。sgRNA的骨架，以及其表达启动子P_J23119由Genewiz公司合成，并被扩增出来，插入到质粒pEC103中，生成质粒pGRNA2。N20序列通过搜索基因组确定之后，通过内部PCR(Inverse PCR)的方法，引入到sgRNA骨架之中。并通过此方法，构建了靶向于ompW以及yciE的sgRNA表达质粒pGRNA2-1。所有构建的质粒，都通过限制性内切酶酶切，以及测序验证。

表6本实施例中用到的引物

5、修复模板的制备

本实施例中所用到的DNA修复方式是DNA同源重组(HR)。通过重叠区扩增基因拼接法(Gene splicing by overlap extension,gene SOEing)来实现，采用的同源臂的长度是600bp。先将插入位点上下游同源序列分别从总基因组中扩增出来，将目标序列P_TEF1-lacZ-T1T2从质粒pCM1001(质粒pCM1001的全序列如序列表中序列5所示)扩增出来，与上下游同源臂通过SOEing PCR拼接在一起，形成修复模板；将P_CN23-atzA-T1T2从质粒pCT100(质粒pCT100的全序列如序列表中序列6所示)扩增出来，与上下游同源臂拼接在一起，形成修复模板。

6、基因编辑流程

1)制备E.coli电转化感受态，共转入质粒pCAS92和质粒pKD46，涂布卡那霉素与氨苄青霉素双抗性平板上，30℃温箱静置培养。

2)待菌落形成之后，挑取单菌落于含有卡那霉素与氨苄青霉素双抗性的LB小管液体培养基中，于200rpm摇床培养。待细菌菌体生长浓度达到OD₆₀₀ 0.8-1.0以上(目测)，转接于100mL LB培养基中(1％，v/v)，于150rpm的摇床上培养。

3)待菌体细胞生长OD₆₀₀达到0.25-0.3左右，加入10mM的L-arabinose用于诱导质粒pKD46上的λ-Red重组酶系统表达；加入1mM IPTG用于诱导pCAS92质粒上的Cas9蛋白表达。注意：加入诱导剂的时间点在实现高效基因编辑的目的上非常关键。可以将摇床转速降到100-130rpm，以便对细菌菌体生长的控制。加入诱导剂的时间过早，由于Cas9蛋白的毒性，会降低整个菌体的生长速度，同时可能会导致功能蛋白包涵体的产生；加入时间过晚，则没有足够的时间用于诱导功能蛋白的表达。

4)当菌体生长达到OD₆₀₀ 0.55-0.60的时候，收菌、制备电转化感受态。

5)50μL电转感受态与100ng的sgRNA表达质粒，以及不同浓度(0-1000ng)的线性PCR修复模板混合，使用移液枪充分混匀，电转，加入1mL LB培养基置于30℃摇床复苏。

6)经过1-3个小时复苏之后，将复苏的菌体稀释，涂布于含有氯霉素和卡那霉素抗性的LB平皿上。待菌体生长之后，通过菌落PCR验证，并提交PCR产物于公司测序确认。

7、易用型CRISPR-Cas9系统的消除

基因编辑验证为阳性的克隆，用于消除菌体细胞里的质粒pCAS92、pGRNA2和质粒pKD46。在无抗生素抗性的LB培养基中，加入L-arabinose诱导，在37℃经过6-12小时诱导之后，取出菌体样品，稀释，涂布于无抗性的LB平板上。待菌体长起来之后，分别利用三个质粒特异的引物CON.PCAS92F/R,CON.PGRNA2F/R,和CON.PKD46F/R进行PCR扩增验证。注意：因为质粒消除效率较高，无需进行抗生素敏感性测试。

8、基因组整合效率

含有载体pCAS92和载体pKD46的菌株E.coli NEB10β制备感受态，共转入DNA修复模板(P_TEF1-lacZ-T1T2)与质粒pGRNA2-1，经过1-3小时复苏之后，复苏的细胞涂布在含有X-gal的LB平板上进行蓝白斑筛选(Blue-white selection)。整合效率计为“显蓝色CFU/总CFU”。拯救效率记录为单位数量的修复模板DNA所形成的CFU总数目，以只转化sgRNA质粒(无修复模板)为空白对照。

9、Atrazine降解菌的构建

含有质粒pCAS92和pKD46野生型E.coli MG1655制备电转感受态，共转入sgRNA表达质粒pGRNA2-1和修复模板(P_CN23-atzA-T1T2)。得到的克隆通过菌落PCR的方式进行验证，引物为基因组上同源臂上下游的引物以及atzA内部的引物，验证为阳性的克隆再消除其细胞内辅助工具载体。

Atrazine的水解脱氯实验是在涂布有100μg/mL的LB平板上进行的，将浓缩菌液点在平板中央，当atrazine水解发生后，悬浮的atrazine小颗粒被降解之后，在其周围形成一个清晰的水解圈。

二、结果与分析

(一)易用型CRISPR-Cas9系统的建立

CRISPR-Cas9系统可以快速、高效的进行基因编辑，在大肠杆菌中CRISPR-Cas9系统多个版本被开发出来，但是传统的CRISPR-Cas9系统在完成基因编辑的任务之后，并不容易从宿主细胞内消除。

本发明将CRISPR-Cas9重新建立在含有EXIT基因线路的载体骨架上，允许CRISPR-Cas9系统可以一步从宿主细胞内消除，实现高效的、无质粒残留的基因编辑的目的。该系统的组成如图14所示，在这一系统中，Cas9蛋白置于IPTG诱导的P_Lac启动子之下，同时在这一质粒上的还有EXIT线路的消除模块，这两者都与p15A复制子拼接，这一质粒命名为pCAS92(2^nd generation Cas9)；sgRNA的骨架置于强启动子P_J23119的控制之下，和EXIT基因线路的控制模块一起拼装到ColE1复制子上，这一质粒被命名为pGRNA2(2^nd generation sgRNA)。这一套新的CRISPR-Cas9系统因为其容易被消除的特性，而被称为易用型CRISPR-Cas9。

(二)易用型CRISPR-Cas9系统进行基因编辑

1、易用型CRISPR-Cas9系统的基因编辑流程

根据报道λ-Red重组酶系统可以提高DNA修复模板的重组效率，从而提高基因编辑的效率。因此，在应用易用型CRISPR-Cas9系统进行基因编辑的时候，λ-Red重组酶系统也被引入，提高基因编辑的效率。

应用易用型CRISPR-Cas9系统进行基因编辑的流程如图15所示，质粒PCAS92和质粒pKD46被共转入大肠杆菌细胞中；作为DNA修复模板的双链DNA是通过SOEing PCR产生的，以基因插入为例，目标插入位点的上下游一定长度的序列(不包括sgRNA结合位点和PAM序列)被PCR扩增出来，与待插入DNA片段通过SOEing PCR拼接在一起，成为DNA修复模板(dsDNA donor)；同时sgRNA表达质粒pGRNA2被构建出来，为了增加靶向特异性，本发明采用20个bp的seed序列作为配对序列。第二天，转入有质粒pCAS92和质粒pKD46的大肠杆菌细胞被诱导Cas9蛋白和λ-Red重组酶的表达，并被制备感受态；sgRNA表达质粒pGRNA2和DNA修复模板被混合在一起，共同电转大肠杆菌细胞中，复苏后涂布于含有相应抗性的LB平板上进行筛选。第三天，当验证了基因编辑完成之后，本发明通过在37℃一步诱导的方式，将所含有的三个质粒pCAS92、pGNA2和pKD46一步去除，从而实验了对基因组的无痕、无质粒残留的基因编辑。

2、LacZ的基因组定点插入

为了验证易用型CRISPR-Cas9的基因编辑功能，本发明首先在大肠杆菌E.coliNEB10β基因组中插入一个lacZ表达单元。菌株E.coli NEB10β自身的lacZ基因是不完整的，因此可以通过蓝白斑筛选的方式，确认基因组插入效率。

本发明选择了大肠杆菌基因组中中性位置作为插入位点。如图16所示，紧邻PAM序列AGG的20个碱基“CGTAATATACGGGGTCAATA”用来构建sgRNA表达质粒pGRNA2-1。

插入位点的上、下游600bp长度的DNA被扩增出来，与lacZ表达单元融合起来，作为DNA修复模板。当不同浓度DNA修复模板与sgRNA质粒混合并共同转化，本发明发现随着DNA修复模板浓度的提高，能够从被Cas9蛋白基因切割下拯救的大肠杆菌细胞越多；而当修复模板DNA浓度很低时，大多数被Cas9蛋白切割的大肠杆菌细胞不能通过同源重组的方式拯救，而大肠杆菌又缺少有效的非同源重组修复方式。如图17所示，随着修复模板DNA浓度的提高，越多的菌落形成。

如图18所示，易用型CRISPR-Cas9系统可以高效的进行基因插入，在X-gal平板上。大约99％的克隆都是蓝色的，说明了lacZ的基因整合。本发明随机选取了47个蓝色克隆用同源臂两端的引物进行扩增，发现所有的蓝色克隆都是阳性的。

(三)易用型CRISPR-Cas9质粒的消除

易用型CRISPR-Cas9系统较传统的CRISPR-Cas9系统相比，其优势在于容易消除的特性。本发明中的易用型CRISPR-Cas9缺可以将系统中的两个质粒同时去除，一步得到没有质粒的、改造后的细胞。为了验证此功能，在L-arabinose诱导于37℃培养.之后，本发明分别利用三个质粒特异的PCR引物来进行扩增筛选，发现在全部23个克隆中，pCAS92和pKD46都已经完全消除，同时pGRNA2的质粒去除了21个(图19)。这一实验结证明，易用型CRISPR-Cas9是非常容易从宿主细胞内消除的。

与之前其他研究小组开发的逐步去除的CRISPR-Cas9系统相比，本发明的系统可以实现两组分一步消除。如图20所示，本发明将易用型CRISPR-Cas9系统的消除方式与之前系统的消除方式做了比较。Chris版本的CRISPR-Cas9系统是先通过转入一个在pSC101上的sgRNA去除Cas9所在的质粒，再去除pSC101所在的sgRNA质粒。Jiang版本的CRISPR-Cas9系统，是通过诱导表达在Cas9质粒上的靶向于sgRNA质粒的一个sgRNA的表达来去除sgRNA质粒，再将pSC101所承载的Cas9质粒消除。

(四)Atrazine降解菌株的构建

大肠杆菌仍然是最常用的合成生物学底盘，旨在环境应用的合成生物学工程中，改造过的工程菌是倾向于不带有抗生素标记，不带有质粒载体的。因此，为了展示本发明构建的易用型CRISPR-Cas9系统在环境应用中的作用，本发明构建了一株atrazine降解菌。本发明选择野生型大肠杆菌E.coli MG1655作为初始菌株，atrazine脱氯水解酶atzA可以将atrazine脱氯水解成2-hydroxyatrazine，2-hydroxyatrazine被认为是非环境污染物的一类化合物。本发明将脱氯水解酶atzA置于强启动子P_CN23的控制之下，并将其无痕整合入基因之中，再将质粒载体消除干净，这样本发明就得到了一株无痕整合、无质粒残留的atrazine降解菌株。实验结果显示，整合atrazine脱氯水解酶的E.coli MG1655获得了对atrazine的脱氯水解能力。如图21所示，在atrazine悬浊的平板上会形成一个清晰的水解圈，并且这个圈的直径会随着时间不断扩大。

本发明利用易用型CRISPR-Cas9系统，在三天之内得到了一株无痕改造、无质粒残留的atrazine降解工程改造菌，进一步证明了易用型CRISPR-Cas9系统较传统的CRISPR-Cas9的优势。

本发明构建的易用型CRISPR-Cas9系统虽然是针对大肠杆菌开发的，但是通过替换功能元件(启动子等)，也可以将其推广到其他不同细菌的CRISPR-Cas9版本中。工具载体的开发必须有一个易于消除的方法，允许工具载体的快速消除，而不是在工具完成使命后残留在宿主菌体中，本发明也给这类工作做了一个示范。

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<130> GNCLN171196

<160> 6

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 5727

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223>

<400> 1

ctcgggccgt ctcttgggct tgatcggcct tcttgcgcat ctcacgcgct cctgcggcgg 60

cctgtagggc aggctcatac ccctgccgaa ccgcttttgt cagccggtcg gccacggctt 120

ccggcgtctc aacgcgcttt gagattccca gcttttcggc caatccctgc ggtgcatagg 180

cgcgtggctc gaccgcttgc gggctgatgg tgacgtggcc cactggtggc cgctccaggg 240

cctcgtagaa cgcctgaatg cgcgtgtgac gtgccttgct gccctcgatg ccccgttgca 300

gccctagatc ggccacagcg gccgcaaacg tggtctggtc gcgggtcatc tgcgctttgt 360

tgccgatgaa ctccttggcc gacagcctgc cgtcctgcgt cagcggcacc acgaacgcgg 420

tcatgtgcgg gctggtttcg tcacggtgga tgctggccgt cacgatgcga tccgccccgt 480

acttgtccgc cagccacttg tgcgccttct cgaagaacgc cgcctgctgt tcttggctgg 540

ccgacttcca ccattccggg ctggccgtca tgacgtactc gaccgccaac acagcgtcct 600

tgcgccgctt ctctggcagc aactcgcgca gtcggcccat cgcttcatcg gtgctgctgg 660

ccgcccagtg ctcgttctct ggcgtcctgc tggcgtcagc gttgggcgtc tcgcgctcgc 720

ggtaggcgtg cttgagactg gccgccacgt tgcccatttt cgccagcttc ttgcatcgca 780

tgatcgcgta tgccgccatg cctgcccctc ccttttggtg tccaaccggc tcgacggggg 840

cagcgcaagg cggtgcctcc ggcgggccac tcaatgcttg agtatactca ctagactttg 900

cttcgcaaag tcgtgaccgc ctacggcggc tgcggcgccc tacgggcttg ctctccgggc 960

ttcgccctgc gcggtcgctg cgctcccttg ccagcccgtg gatatgtgga cgatggccgc 1020

gagcggccac cggctggctc gcttcgctcg gcccgtggac aaccctgctg gacaagctga 1080

tggacaggct gcgcctgccc acgagcttga ccacagggat tgcccaccgg ctacccagcc 1140

ttcgaccaca tacccaccgg ctccaactgc gcggcctgcg gccttgcccc atcaattttt 1200

ttaattttct ctggggaaaa gcctccggcc tgcggcctgc gcgcttcgct tgccggttgg 1260

acaccaagtg gaaggcgggt caaggctcgc gcagcgaccg cgcagcggct tggccttgac 1320

gcgcctggaa cgacccaagc ctatgcgagt gggggcagtc gaaggcgaag cccgcccgcc 1380

tgccccccga gcctcacggc ggcgagtgcg ggggttccaa gggggcagcg ccaccttggg 1440

caaggccgaa ggccgcgcag tcgatcaaca agccccggag gggccacttt ttgccggagg 1500

gggagccgcg ccgaaggcgt gggggaaccc cgcaggggtg cccttctttg ggcaccaaag 1560

aactagatat agggcgaaat gcgaaagact taaaaatcaa caacttaaaa aaggggggta 1620

cgcaacagct cattgcggca ccccccgcaa tagctcattg cgtaggttaa agaaaatctg 1680

taattgactg ccacttttac gcaacgcata attgttgtcg cgctgccgaa aagttgcagc 1740

tgattgcgca tggtgccgca accgtgcggc accctaccgc atggagataa gcatggccac 1800

gcagtccaga gaaatcggca ttcaagccaa gaacaagccc ggtcactggg tgcaaacgga 1860

acgcaaagcg catgaggcgt gggccgggct tattgcgagg aaacccacgg cggcaatgct 1920

gctgcatcac ctcgtggcgc agatgggcca ccagaacgcc gtggtggtca gccagaagac 1980

actttccaag ctcatcggac gttctttgcg gacggtccaa tacgcagtca aggacttggt 2040

ggccgagcgc tggatctccg tcgtgaagct caacggcccc ggcaccgtgt cggcctacgt 2100

ggtcaatgac cgcgtggcgt ggggccagcc ccgcgaccag ttgcgcctgt cggtgttcag 2160

tgccgccgtg gtggttgatc acgacgacca ggacgaatcg ctgttggggc atggcgacct 2220

gcgccgcatc ccgaccctgt atccgggcga gcagcaacta ccgaccggcc ccggcgagga 2280

gccgcccagc cagcccggca ttccgggcat ggaaccagac ctgccagcct tgaccgaaac 2340

ggaggaatgg gaacggcgcg ggcagcagcg cctgccgatg cccgatgagc cgtgttttct 2400

ggacgatggc gagccgttgg agccgccgac acgggtcacg ctgccgcgcc ggtagcactt 2460

gggttgcgca gcaacccgta agtgcgctgt tccagactat cggctgtagc cgcctcgccg 2520

ccctatacct tgtctgcctc cccgcgttgc gtcgcggtgc atggagccgg gccacctcga 2580

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<211> 1706

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223>

<400> 2

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<213> 人工序列

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<223>

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tccagatgga gttctgaggt cattactgga tctatcaaca ggagtccaag cgagctcgta 120

aacttggtct gacagttacc aatgcttaat cagtgaggca cctatctcag cgatctgtct 180

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aactttaaaa gtgctcatca ttggaaaacg ttcttcgggg cgaaaactct caaggatctt 840

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atattgcggt agacaactcc cagttcgtac atggaaatac ctctttgctt tgacgttatt 2040

gaatccaaaa agtgagctgg tagcgcttgt cattcatcag atttgaatag ttttcttatt 2100

gaaaaccttt cagaccgtac gctagcagct ctcttttttg agaagttata aaaagatgtt 2160

gacagcttgt tctgatgatg ataaacttta atagttgcgt tgcggccgca aggcgcgcca 2220

ttaaagagga gaaatactag atgaccatga ttacggattc actggccgtc gttttacaac 2280

gtcgtgactg ggaaaaccct ggcgttaccc aacttaatcg ccttgcagca catccccctt 2340

tcgccagctg gcgtaatagc gaagaggccc gcaccgatcg cccttcccaa cagttgcgca 2400

gcctgaatgg cgaatggcgc tttgcctggt ttccggcacc agaagcggtg ccggaaagct 2460

ggctggagtg cgatcttcct gaggccgata ctgtcgtcgt cccctcaaac tggcagatgc 2520

acggttacga tgcgcccatc tacaccaacg tgacctatcc cattacggtc aatccgccgt 2580

ttgttcccac ggagaatccg acgggttgtt actcgctcac atttaatgtt gatgaaagct 2640

ggctacagga aggccagacg cgaattattt ttgatggcgt taactcggcg tttcatctgt 2700

ggtgcaacgg gcgctgggtc ggttacggcc aggacagtcg tttgccgtct gaatttgacc 2760

tgagcgcatt tttacgcgcc ggagaaaacc gcctcgcggt gatggtgctg cgctggagtg 2820

acggcagtta tctggaagat caggatatgt ggcggatgag cggcattttc cgtgacgtct 2880

cgttgctgca taaaccgact acacaaatca gcgatttcca tgttgccact cgctttaatg 2940

atgatttcag ccgcgctgta ctggaggctg aagttcagat gtgcggcgag ttgcgtgact 3000

acctacgggt aacagtttct ttatggcagg gtgaaacgca ggtcgccagc ggcaccgcgc 3060

ctttcggcgg tgaaattatc gatgagcgtg gtggttatgc cgatcgcgtc acactacgtc 3120

tgaacgtcga aaacccgaaa ctgtggagcg ccgaaatccc gaatctctat cgtgcggtgg 3180

ttgaactgca caccgccgac ggcacgctga ttgaagcaga agcctgcgat gtcggtttcc 3240

gcgaggtgcg gattgaaaat ggtctgctgc tgctgaacgg caagccgttg ctgattcgag 3300

gcgttaaccg tcacgagcat catcctctgc atggtcaggt catggatgag cagacgatgg 3360

tgcaggatat cctgctgatg aagcagaaca actttaacgc cgtgcgctgt tcgcattatc 3420

cgaaccatcc gctgtggtac acgctgtgcg accgctacgg cctgtatgtg gtggatgaag 3480

ccaatattga aacccacggc atggtgccaa tgaatcgtct gaccgatgat ccgcgctggc 3540

taccggcgat gagcgaacgc gtaacgcgaa tggtgcagcg cgatcgtaat cacccgagtg 3600

tgatcatctg gtcgctgggg aatgaatcag gccacggcgc taatcacgac gcgctgtatc 3660

gctggatcaa atctgtcgat ccttcccgcc cggtgcagta tgaaggcggc ggagccgaca 3720

ccacggccac cgatattatt tgcccgatgt acgcgcgcgt ggatgaagac cagcccttcc 3780

cggctgtgcc gaaatggtcc atcaaaaaat ggctttcgct acctggagag acgcgcccgc 3840

tgatcctttg cgaatacgcc cacgcgatgg gtaacagtct tggcggtttc gctaaatact 3900

ggcaggcgtt tcgtcagtat ccccgtttac agggcggctt cgtctgggac tgggtggatc 3960

agtcgctgat taaatatgat gaaaacggca acccgtggtc ggcttacggc ggtgattttg 4020

gcgatacgcc gaacgatcgc cagttctgta tgaacggtct ggtctttgcc gaccgcacgc 4080

cgcatccagc gctgacggaa gcaaaacacc agcagcagtt tttccagttc cgtttatccg 4140

ggcaaaccat cgaagtgacc agcgaatacc tgttccgtca tagcgataac gagctcctgc 4200

actggatggt ggcgctggat ggtaagccgc tggcaagcgg tgaagtgcct ctggatgtcg 4260

ctccacaagg taaacagttg attgaactgc ctgaactacc gcagccggag agcgccgggc 4320

aactctggct cacagtacgc gtagtgcaac cgaacgcgac cgcatggtca gaagccgggc 4380

acatcagcgc ctggcagcag tggcgtctgg cggaaaacct cagtgtgacg ctccccgccg 4440

cgtcccacgc catcccgcat ctgaccacca gcgaaatgga tttttgcatc gagctgggta 4500

ataagcgttg gcaatttaac cgccagtcag gctttctttc acagatgtgg attggcgata 4560

aaaaacaact gctgacgccg ctgcgcgatc agttcacccg tgcaccgctg gataacgaca 4620

ttggcgtaag tgaagcgacc cgcattgacc ctaacgcctg ggtcgaacgc tggaaggcgg 4680

cgggccatta ccaggccgaa gcagcgttgt tgcagtgcac ggcagataca cttgctgatg 4740

cggtgctgat tacgaccgct cacgcgtggc agcatcaggg gaaaacctta tttatcagcc 4800

ggaaaaccta ccggattgat ggtagtggtc aaatggcgat taccgttgat gttgaagtgg 4860

cgagcgatac accgcatccg gcgcggattg gcctgaactg ccagctggcg caggtagcag 4920

agcgggtaaa ctggctcgga ttagggccgc aagaaaacta tcccgaccgc cttactgccg 4980

cctgttttga ccgctgggat ctgccattgt cagacatgta taccccgtac gtcttcccga 5040

gcgaaaacgg tctgcgctgc gggacgcgcg aattgaatta tggcccacac cagtggcgcg 5100

gcgacttcca gttcaacatc agccgctaca gtcaacagca actgatggaa accagccatc 5160

gccatctgct gcacgcggaa gaaggcacat ggctgaatat cgacggtttc catatgggga 5220

ttggtggcga cgactcctgg agcccgtcag tatcggcgga attccagctg agcgccggtc 5280

gctaccatta ccagttggtc tggtgtcaaa aataatacta gagggcgcgc ctactagagc 5340

caggcatcaa ataaaacgaa aggctcagtc gaaagactgg gcctttcgtt ttatctgttg 5400

tttgtcggtg aacgctctct actagagtca cactggctca ccttcgggtg ggcctttctg 5460

cgtttatacc gtgtacgtca atgatcatct tcaagctccg ttaaaaaata attcgtctat 5520

caaaaagttc agtgcgcgcc gcccaggccc agcatggagg tgcgcggtgc gccgccggca 5580

tagcggttct tgaccagcag cgccagcgcg gcgatgacac cgggaatggc aaccaccata 5640

aagacctgcg gcagctccag gtgacggcgc gacagctcgg ccaccaggaa agagcctgca 5700

atgccgccaa agcggccgat gcccagcatc caggacacgc cgctggcgcg gcattccgtg 5760

gggtagtact cggcagccag cgcctgcatg gacgactgtg ccgcattcat cagcaaaccg 5820

gcaatgaaga ccgaagccac cagcatgccc acgccaccgc cgagcacctg gccgatgaag 5880

gccacgccca ggctggtcag gaagtagccc gtcgcgatga tcagattggc attccagcgg 5940

tccatcagca aaccgacgaa gatcgcgccc acgccgccga gctggaacaa cgcggcaatc 6000

acggccgcct ggctggcggg cacgcctgct tccttgaaca gcacaggcat ccagttgacc 6060

aggccataga cgatcaccag gcccatgaaa tacgtcaccc acagggccag cgtgccgacc 6120

agatatttct gcgagaacac cagacgcagg ccctgaggac cttgctgtgc ctgggcagcc 6180

gcctcgccgc cgtcgttcag cacaaaacgc gctgcattgc gcgtgccggc ggcgatgcgc 6240

accatcacct tgcgcacgcg gtcggccgag tagttcttga gcaccatgaa acgcaccgac 6300

tcgggcagca tcacaatcat cagcacggcc aggatcaggg gcaccacgcc gcccacgatc 6360

agcaggctgc gccagccgaa atgcggaatc atccaggccg cgataaagcc gccgaaggcc 6420

gagccgatgg ggaagccgca gaacatgcag ttggtgatga aggaacgctt gctgtcaggg 6480

cagtattcta gggataacag ggtaatctag gcagaagtgg tcagcttggc tgccattttt 6540

ggggtgaggc cgttcgcggc cgaggggcgc agcccctggg gggatgggag gcccgcgtta 6600

gcgggccggg agggttcgag aagggggggc accccccttc ggcgtgcgcg gtcacgcgca 6660

cagggcgcag ccctggttaa aaacaaggtt tataaatatt ggtttaaaag caggttaaaa 6720

gacaggttag cggtggccga aaaacgggcg gaaacccttg caaatgctgg attttctgcc 6780

tgtggacagc ccctcaaatg tcaataggtg cgcccctcat ctgtcagcac tctgcccctc 6840

aagtgtcaag gatcgcgccc ctcatctgtc agtagtcgcg cccctcaagt gtcaataccg 6900

cagggcactt atccccaggc ttgtccacat catctgtggg aaactcgcgt aaaatcaggc 6960

gttttcgccg atttgcgagg ctggccagct ccacgtcgcc ggccgaaatc gagcctgccc 7020

ctcatctgtc aacgccgcgc cgggtgagtc ggcccctcaa gtgtcaacgt ccgcccctca 7080

tctgtcagtg agggccaagt tttccgcgag gtatccacaa cgccggcggc cgcggtgtct 7140

cgcacacggc ttcgacggcg tttctggcgc gtttgcaggg ccatagacgg ccgccagccc 7200

agcggcgagg gcaaccagcc cggtgagcgt cggaaagggt cgacggatct tttccgctgc 7260

ataaccctgc ttcggggtca ttatagcgat tttttcggta tatccatcct ttttcgcacg 7320

atatacagga ttttgccaaa gggttcgtgt agactttcct tggtgtatcc aacggcgtca 7380

gccgggcagg ataggtgaag taggcccacc cgcgagcggg tgttccttct tcactgtccc 7440

ttattcgcac ctggcggtgc tcaacgggaa tcctgctctg cgaggctggc cggctaccgc 7500

cggcgtaaca gatgagggca agcggatggc tgatgaaacc aagccaacca ggaagggcag 7560

cccacctatc aaggtgtact gccttccaga cgaacgaaga gcgattgagg aaaaggcggc 7620

ggcggccggc atgagcctgt aggcctacct gctggccgtc ggccagggct acaaaatcac 7680

gggcgtcgtg gactatgagc acgtccgcga gctggcccgc atcaatggcg acctgggccg 7740

cctgggcggc ctgctgaaac tctggctcac cgacgacccg cgcacggcgc ggttcggtga 7800

tgccacgatc ctcgccctgc tggcgaagat cgaagagaag caggacgagc ttggcaaggt 7860

catgatgggc gtggtccgcc cgagggcaga gccatgactt ttttagccgc taaaacggcc 7920

ggggggtgcg cgtgattgcc aagcacgtcc ccatgcgctc catcaagaag agcgacttcg 7980

cggagctggt attcgtgcag ggcaagattc ggaataccaa gtacgagaag gacggccaga 8040

cggtctacgg gaccgacttc attgccgata aggtggatta tctggacacc aaggcaccag 8100

gcgggtcaaa tcaggaataa gggcacattg ccccggcgtg agtcggggca atcccgcaag 8160

gagggtgaat gaatcggacg tttgaccgga aggcatacag gcaagaactg atcgacgcgg 8220

ggttttccgc cgaggatgcc gaaaccatcg caagccgcac cgtcatgcgt gcgccccgcg 8280

aaaccttcca gtccgtcggc tcgatggtcc agcaagctac ggccaagatc gagcgcgaca 8340

gcgtgcaact ggctccccct gccctgcccg cgccatcggc cgccgtggag cgttcgcgtc 8400

gtctcgaaca ggaggcggca ggtttggcga agtcgatgac catcgacacg cgaggaacta 8460

tgacgaccaa gaagcgaaaa accgccggcg aggacctggc aaaacaggtc agcgaggcca 8520

agcaggccgc gttgctgaaa cacacgaagc agcagatcaa ggaaatgcag ctttccttgt 8580

tcgatattgc gccgtggccg gacacgatgc gagcgatgcc aaacgacacg gcccgctctg 8640

ccctgttcac cacgcgcaac aagaaaatcc cgcgcgaggc gctgcaaaac aaggtcattt 8700

tccacgtcaa caaggacgtg aagatcacct acaccggcgt cgagctgcgg gccgacgatg 8760

acgaactggt gtggcagcag gtgttggagt acgcgaagcg cacccctatc ggcgagccga 8820

tcaccttcac gttctacgag ctttgccagg acctgggctg gtcgatcaat ggccggtatt 8880

acacgaaggc cgaggaatgc ctgtcgcgcc tacaggcgac ggcgatgggc ttcacgtccg 8940

accgcgttgg gcacctggaa tcggtgtcgc tgctgcactg cttccgcgtc ctggaccgtg 9000

gcaagaaaac gtcccgttgc caggtcctga tcgacgagga aatcgtcgtg ctgtttgctg 9060

gcgaccacta cacgaaattc atatgggaga agtaccgcaa gctgtcgccg acggcccgac 9120

ggatgttcga ctatttcagc tcgcaccggg agccgtaccc gctcaagctg gaaaccttcc 9180

gcctcatgtg cggatcggat tccacccgcg tgaagaagtg gcgcgagcag gtcggcgaag 9240

cctgcgaaga gttgcgaggc agcggcctgg tggaacacgc ctgggtcaat gatgacctgg 9300

tgcattgcaa acgctagggc cttgtggggt cagttccggc tgggggttca gcagccagcg 9360

ctttactggc atttcaggaa caagcgggca ctgctcgacg cacttgcttc gctcagtatc 9420

gctcgggacg cacggcgcgc tctacgaact gccgataaac agaggattaa aattgacaat 9480

tctagggcgc gtatagcttg ccggaagtcg ccttgacccg catggcatag gcctatcgtt 9540

tccacgatca gcgatcggct cgttgccctg cgccgctcca aagcccgcga cgcagcgccg 9600

gcaggcagag caagtagagg gcagcgcctg caatccatgc ccacccgttc cacgttgtta 9660

tagaagccgc atagatcgcc gtgaagagga ggggtccgac gatcgaggtc aggctggtga 9720

gcgccgccag tgagccttgc agctgcccct gacgttcctc atccacctgc ctggacaaca 9780

ttgcttgcag cgccggcatt ccgatgccac ccgaagcaag caggaccatg atcgggaacg 9840

ccatccatcc ccgtgtcgcg aaggcaagca ggatgtagcc tgtgccgtcg gcaatcattc 9900

cgagcatgag tgcccgcctt tcgccgagcc gggcggctac agggccggtg atcattgcct 9960

gggcgagtga atgcagaatg ccaaatgcgg caagcgaaat gccgatcgtg gtcgcgtccc 10020

agtgaaagcg atcctcgccg aaaatgaccc aaagcgcggc cggcacctgt ccgacaagtt 10080

gcatgatgaa gaagaccgcc atcagggcgg cgacgacggt catgccccgg gcccaccgga 10140

acgaagcgag cgggttgaga gcctcccggc gtaacggccg gcgttcgcct ttgtgcgact 10200

ccggcaaaag gaaacagccc gtcaggaaat tgaggccgtt caaggctgcc gcggcgaaga 10260

acggagcgtg gggggagaaa ccgcccatca gcccaccgag cacaggtccc gcgaccatcc 10320

cgaacccgaa acaggcgctc atgaagccga agtgccgcgc gcgctcatcg ccatcagtga 10380

tatcggcaat ataagcgccg gctaccgccc cagtcgcccc ggtgatgccg gccacgatcc 10440

gcccgatata gagaacccaa aggaaaggcg ctgtcgccat gatggcgtag tcgacagtgg 10500

cgccggccag cgagacgagc aagattggcc gccgcccgaa acgatccgac agcgcgccca 10560

gcacaggtgc gcaggcaaat tgcaccaacg catacagcgc cagcagaatg ccatagtggg 10620

cggtgacgtc gttcgagtga accagatcgc gcaggaggcc cggcagcacc ggcataatca 10680

ggccgatgcc gacagcgtcg agcgcgacag tgctcagaat tacgatcagg ggtatgttgg 10740

gtttcacgtc tggcctccgg accagcctcc gctggtccga ttgaacgcgc ggattcttta 10800

tcactgataa gttggtggac atattatgtt tatcagtgat aaagtgtcaa tcatgacaaa 10860

gttgcagccg aatacagtga tccgtgccgc cctggacctg ttgaacgagg tcggcgtaga 10920

cggtctgacg acacgcaaac tggcggaacg gttgggggtt cagcagccgg cgctttactg 10980

gcacttcagg aacaagcggg cgctgctcga cgcactggcc gaagccatgc tggcggagaa 11040

tcatacgcat tcggtgccga gagccgacga cgactggcgc tcatttctga tcgggaatgc 11100

ccgcagcttc aggcaggcgc tgctcgccta ccgcgatggc gcgcgcatcc atgccggcac 11160

gcgaccgggc gcaccgcaga tggaaacggc cgacgcgcag cttcgcttcc tctgcgaggc 11220

gggtttttcg gccggggacg ccgtcaatgc gctgatgaca atcagctact tcactgttgg 11280

ggccgtgctt gaggagcagg ccggcgacag cgatgccggc gagcgcggcg gcaccgttga 11340

acaggctccg ctctcgccgc tgttgcgggc cgcgatagac gccttcgacg aagccggtcc 11400

ggacgcagcg ttcgagcagg gactcgcggt gattgtcgat ggattggcga aaaggaggct 11460

cgttgtcagg aacgttgaag gaccgagaaa gggtgctaag aaaccattat tatcatgaca 11520

ttaacctata aaaataggcg tatcacgaa 11549

<210> 6

<211> 6382

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223>

<400> 6

ctcgggccgt ctcttgggct tgatcggcct tcttgcgcat ctcacgcgct cctgcggcgg 60

cctgtagggc aggctcatac ccctgccgaa ccgcttttgt cagccggtcg gccacggctt 120

ccggcgtctc aacgcgcttt gagattccca gcttttcggc caatccctgc ggtgcatagg 180

cgcgtggctc gaccgcttgc gggctgatgg tgacgtggcc cactggtggc cgctccaggg 240

cctcgtagaa cgcctgaatg cgcgtgtgac gtgccttgct gccctcgatg ccccgttgca 300

gccctagatc ggccacagcg gccgcaaacg tggtctggtc gcgggtcatc tgcgctttgt 360

tgccgatgaa ctccttggcc gacagcctgc cgtcctgcgt cagcggcacc acgaacgcgg 420

tcatgtgcgg gctggtttcg tcacggtgga tgctggccgt cacgatgcga tccgccccgt 480

acttgtccgc cagccacttg tgcgccttct cgaagaacgc cgcctgctgt tcttggctgg 540

ccgacttcca ccattccggg ctggccgtca tgacgtactc gaccgccaac acagcgtcct 600

tgcgccgctt ctctggcagc aactcgcgca gtcggcccat cgcttcatcg gtgctgctgg 660

ccgcccagtg ctcgttctct ggcgtcctgc tggcgtcagc gttgggcgtc tcgcgctcgc 720

ggtaggcgtg cttgagactg gccgccacgt tgcccatttt cgccagcttc ttgcatcgca 780

tgatcgcgta tgccgccatg cctgcccctc ccttttggtg tccaaccggc tcgacggggg 840

cagcgcaagg cggtgcctcc ggcgggccac tcaatgcttg agtatactca ctagactttg 900

cttcgcaaag tcgtgaccgc ctacggcggc tgcggcgccc tacgggcttg ctctccgggc 960

ttcgccctgc gcggtcgctg cgctcccttg ccagcccgtg gatatgtgga cgatggccgc 1020

gagcggccac cggctggctc gcttcgctcg gcccgtggac aaccctgctg gacaagctga 1080

tggacaggct gcgcctgccc acgagcttga ccacagggat tgcccaccgg ctacccagcc 1140

ttcgaccaca tacccaccgg ctccaactgc gcggcctgcg gccttgcccc atcaattttt 1200

ttaattttct ctggggaaaa gcctccggcc tgcggcctgc gcgcttcgct tgccggttgg 1260

acaccaagtg gaaggcgggt caaggctcgc gcagcgaccg cgcagcggct tggccttgac 1320

gcgcctggaa cgacccaagc ctatgcgagt gggggcagtc gaaggcgaag cccgcccgcc 1380

tgccccccga gcctcacggc ggcgagtgcg ggggttccaa gggggcagcg ccaccttggg 1440

caaggccgaa ggccgcgcag tcgatcaaca agccccggag gggccacttt ttgccggagg 1500

gggagccgcg ccgaaggcgt gggggaaccc cgcaggggtg cccttctttg ggcaccaaag 1560

aactagatat agggcgaaat gcgaaagact taaaaatcaa caacttaaaa aaggggggta 1620

cgcaacagct cattgcggca ccccccgcaa tagctcattg cgtaggttaa agaaaatctg 1680

taattgactg ccacttttac gcaacgcata attgttgtcg cgctgccgaa aagttgcagc 1740

tgattgcgca tggtgccgca accgtgcggc accctaccgc atggagataa gcatggccac 1800

gcagtccaga gaaatcggca ttcaagccaa gaacaagccc ggtcactggg tgcaaacgga 1860

acgcaaagcg catgaggcgt gggccgggct tattgcgagg aaacccacgg cggcaatgct 1920

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actttccaag ctcatcggac gttctttgcg gacggtccaa tacgcagtca aggacttggt 2040

ggccgagcgc tggatctccg tcgtgaagct caacggcccc ggcaccgtgt cggcctacgt 2100

ggtcaatgac cgcgtggcgt ggggccagcc ccgcgaccag ttgcgcctgt cggtgttcag 2160

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gcgccgcatc ccgaccctgt atccgggcga gcagcaacta ccgaccggcc ccggcgagga 2280

gccgcccagc cagcccggca ttccgggcat ggaaccagac ctgccagcct tgaccgaaac 2340

ggaggaatgg gaacggcgcg ggcagcagcg cctgccgatg cccgatgagc cgtgttttct 2400

ggacgatggc gagccgttgg agccgccgac acgggtcacg ctgccgcgcc ggtagcactt 2460

gggttgcgca gcaacccgta agtgcgctgt tccagactat cggctgtagc cgcctcgccg 2520

ccctatacct tgtctgcctc cccgcgttgc gtcgcggtgc atggagccgg gccacctcga 2580

cctgaatgga agccggcggc acctcgctaa cggattcacc gtttttatca ggctctggga 2640

ggcagaataa atgatcatat cgtcaattat tacctccacg gggagagcct gagcaaactg 2700

gcctcaggca tttgagaagc acacggtcac actgcttccg gtagtcaata aaccggtaaa 2760

ccagcaatag acataagcgg ctatttaacg accctgccct gaaccgacga ccgggtcgaa 2820

tttgctttcg aatttctgcc attcatccgc ttattatcac ttattcaggc gtagcaccag 2880

gcgtttaagg gcaccaataa ctgccttatc atgaattagt ctcggacatt ctgctcccgc 2940

ccttatggga tttatcttcc ttattctcgc tttgattgtt ctatcgaaag cgaaatcaaa 3000

cgaataattt ataaataaaa aaaccacctc taaaaggtga tttttattta taaattacaa 3060

tttttcagca atatcagtaa ttgctttatc aactgctgct ttttggctat caatcaaagc 3120

aacacgtgct gtaatttgcg catgctcctc tagactcgag gaattcgagc gcagtgcggc 3180

ccaagcggcc cgtttttttc ggcctaggtt cagcggaaac tagcgttttc cctaggtgaa 3240

taagcttcat cgaggacttg acgtggaggt ccttggtccc tagacttcgc tcaattagaa 3300

cgtatacgtc ctataagaag gggcgtatac aggtgctttt tcaccccatc tgcgttgcga 3360

cgtgtaacac actattggag acatatcatg caaacgctca gcatccagca cggtaccctc 3420

gtcacgatgg atcagtaccg cagagtcctt ggggatagct gggttcacgt gcaggatgga 3480

cggatcgtcg cgctcggagt gcacgccgag tcggtgcctc cgccagcgga tcgggtgatc 3540

gatgcacgcg gcaaggtcgt gttacccggt ttcatcaatg cccacaccca tgtgaaccag 3600

atcctcctgc gcggagggcc ctcgcacggg cgtcaattct atgactggct gttcaacgtt 3660

gtgtatccgg gacaaaaggc gatgagaccg gaggacgtag cggtggcggt gaggttgtat 3720

tgtgcggaag ctgtgcgcag cgggattacg acgatcaacg aaaacgccga ttcggccatc 3780

tacccaggca acatcgaggc cgcgatggcg gtctatggtg aggtgggtgt gagggtcgtc 3840

tacgcccgca tgttctttga tcggatggac gggcgcattc aagggtatgt ggacgccttg 3900

aaggctcgct ctccccaagt cgaactgtgc tcgatcatgg aggaaacggc tgtggccaaa 3960

gatcggatca cagccctgtc agatcagtat catggcacgg caggaggtcg tatatcagtt 4020

tggcccgctc ctgccactac cacggcggtg acagttgaag gaatgcgatg ggcacaagcc 4080

ttcgcccgtg atcgggcggt aatgtggacg cttcacatgg cggagagcga tcatgatgag 4140

cggattcatg ggatgagtcc cgccgagtac atggagtgtt acggactctt ggatgagcgt 4200

ctgcaggtcg cgcattgcgt gtactttgac cggaaggatg ttcggctgct gcaccgccac 4260

aatgtgaagg tcgcgtcgca ggttgtgagc aatgcctacc tcggctcagg ggtggccccc 4320

gtgccagaga tggtggagcg cggcatggcc gtgggcattg gaacagataa cgggaatagt 4380

aatgactccg taaacatgat cggagacatg aagtttatgg cccatattca ccgcgcggtg 4440

catcgggatg cggacgtgct gaccccagag aagattcttg aaatggcgac gatcgatggg 4500

gcgcgttcgt tgggaatgga ccacgagatt ggttccatcg aaaccggcaa gcgcgcggac 4560

cttatcctgc ttgacctgcg tcaccctcag acgactcctc accatcattt ggcggccacg 4620

atcgtgtttc aggcttacgg caatgaggtg gacactgtcc tgattgacgg aaacgttgtg 4680

atggagaacc gccgcttgag ctttcttccc cctgaacgtg agttggcgtt ccttgaggaa 4740

gcgcagagcc gcgccacagc tattttgcag cgggcgaaca tggtggctaa cccagcttgg 4800

cgcagcctct aggaaattct agactcgagt actagagcca ggcatcaaat aaaacgaaag 4860

gctcagtcga aagactgggc ctttcgtttt atctgttgtt tgtcggtgaa cgctctctac 4920

tagagtcaca ctggctcacc ttcgggtggg cctttctgcg tttatagaag aactccagca 4980

tgagatcccc gcgctggagg atcatccagc cggcgtcccg gaaaacgatt ccgaagccca 5040

acctttcata gaaggcggcg gtggaatcga aatctcgtga tggcaggttg ggcgtcgctt 5100

ggtcggtcat ttcgaacccc agagtcccgc tcagaagaac tcgtcaagaa ggcgatagaa 5160

ggcgatgcgc tgcgaatcgg gagcggcgat accgtaaagc acgaggaagc ggtcagccca 5220

ttcgccgcca agctcttcag caatatcacg ggtagccaac gctatgtcct gatagcggtc 5280

cgccacaccc agccggccac agtcgatgaa tccagaaaag cggccatttt ccaccatgat 5340

attcggcaag caggcatcgc catgggtcac gacgagatcc tcgccgtcgg gcatgcgcgc 5400

cttgagcctg gcgaacagtt cggctggcgc gagcccctga tgctcttcgt ccagatcatc 5460

ctgatcgaca agaccggctt ccatccgagt acgtgctcgc tcgatgcgat gtttcgcttg 5520

gtggtcgaat gggcaggtag ccggatcaag cgtatgcagc cgccgcattg catcagccat 5580

gatggatact ttctcggcag gagcaaggtg agatgacagg agatcctgcc ccggcacttc 5640

gcccaatagc agccagtccc ttcccgcttc agtgacaacg tcgagcacag ctgcgcaagg 5700

aacgcccgtc gtggccagcc acgatagccg cgctgcctcg tcctgcagtt cattcagggc 5760

accggacagg tcggtcttga caaaaagaac cgggcgcccc tgcgctgaca gccggaacac 5820

ggcggcatca gagcagccga ttgtctgttg tgcccagtca tagccgaata gcctctccac 5880

ccaagcggcc ggagaacctg cgtgcaatcc atcttgttca atcatgcgaa acgatcctca 5940

tcctgtctct tgatcagatc ttgatcccct gcgccatcag atccttggcg gcaagaaagc 6000

catccagttt actttgcagg gcttcccaac cttaccagag ggcgccccag ctggcaattc 6060

cggttcgctt gctgtccata aaaccgccca gtctagctat cgccatgtaa gcccactgca 6120

agctacctgc tttctctttg cgcttgcgtt ttcccttgtc cagatagccc agtagctgac 6180

attcatccca ggtggcactt ttcggggaaa tgtgcgcgcc cgcgttcctg ctggcgctgg 6240

gcctgtttct ggcgctggac ttcccgctgt tccgtcagca gcttttcgcc cacggccttg 6300

atgatcgcgg cggccttggc ctgcatatcc cgattcaacg gccccagggc gtccagaacg 6360

ggcttcaggc gctcccgaag gt 6382

Claims (13)

1.DNA片段A，包括如下结构：含有严谨调控型启动子和由所述严谨调控型启动子控制表达的归巢核酸内切酶的编码基因的核心区域，分别位于所述核心区域两端的两个终止子，以及分别位于所述两个终止子外端的两个所述归巢核酸内切酶的识别序列。

2.根据权利要求1所述的DNA片段A，其特征在于：所述归巢核酸内切酶为归巢核酸内切酶I-SceI。

3.根据权利要求1所述的DNA片段A，其特征在于：所述严谨调控型启动子为P_BAD启动子。

4.根据权利要求1所述的DNA片段A，其特征在于：所述两个终止子分别为TET终止子和T1T2终止子。

5.成套DNA片段，由DNA片段B和权利要求1所述DNA片段A组成；所述DNA片段B包含有如下结构：抗生素抗性基因表达盒，以及位于所述抗生素抗性基因表达盒两端的所述归巢核酸内切酶的识别序列。

6.根据权利要求5所述的成套DNA片段，其特征在于：所述归巢核酸内切酶为归巢核酸内切酶I-SceI。

7.根据权利要求5所述的成套DNA片段，其特征在于：所述严谨调控型启动子为P_BAD启动子。

8.根据权利要求5所述的成套DNA片段，其特征在于：所述两个终止子分别为TET终止子和T1T2终止子。

9.含有权利要求1-4中任一所述DNA片段A或权利要求5-8中任一所述成套DNA片段的重组载体或重组菌。

10.权利要求1-4中任一所述的DNA片段A或权利要求5-8中任一所述的成套DNA片段或权利要求9所述的重组载体或重组菌在可控消除外源工具载体中的应用。

11.一种可控消除外源工具载体的方法，为如下(A)或(B)：

(A)当待消除的外源工具载体为一个载体时，所述方法包括如下步骤：将权利要求1-4中任一所述的DNA片段A克隆到所述待消除的外源工具载体中，需要启动消除时，外源加入能够诱导所述严谨调控型启动子启动转录的诱导物；

(B)当待消除的外源工具载体为多个载体时，所述方法包括如下步骤(B1)或(B2)：

(B1)将权利要求1-4中任一所述的DNA片段A克隆到其中一个所述待消除的外源工具载体中，将权利要求5中所述的DNA片段B克隆到其余所述待消除的外源工具载体中，需要启动消除时，外源加入能够诱导所述严谨调控型启动子启动转录的诱导物；

(B2)将权利要求1-4中任一所述的DNA片段A分别克隆到每一个所述待消除的外源工具载体中，需要启动消除时，外源加入能够诱导所述严谨调控型启动子启动转录的诱导物。

12.一种可控消除的基因编辑工具，为如下(C)或(D)：

(C)当所述可控消除的基因编辑工具为一个重组载体时，所述可控消除的基因编辑工具上存在两个独立的结构单元，分别为用于基因编辑的结构单元，以及用于可控消除载体的结构单元；所述用于可控消除载体的结构单元为权利要求1-4中任一所述的DNA片段A；

(D)当所述可控消除的基因编辑工具为多个重组载体时，所述可控消除的基因编辑工具中的每个重组载体上均存在两个独立的结构单元，分别为用于基因编辑的结构单元，以及用于可控消除载体的结构单元；所有重组载体上的所述用于可控消除载体的结构单元为如下(D1)或(D2)：

(D1)其中一个重组载体上的所述用于可控消除载体的结构单元为权利要求1-4中任一所述的DNA片段A，其余重组载体上的所述用于可控消除载体的结构单元为权利要求5中所述的DNA片段B；

(D2)所有重组载体上的所述用于可控消除载体的结构单元均为权利要求1-4中任一所述的DNA片段A。

13.根据权利要求12所述的基因编辑工具，其特征在于：所述基因编辑工具为“易用型”CRISPR-Cas9系统；所述“易用型”CRISPR-Cas9系统中，Cas9蛋白承载质粒含有所述DNA片段B；sgRNA承载质粒含有所述DNA片段A。

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