CN107190001A - 一种基因合成方法 - Google Patents

Abstract

本发明提供了一种基因合成方法，所述方法包括：(1)将待合成基因序列分成55‑100bp长度的第一连续片段，将所述第一连续片段设计成正向引物；将与所述第一连续片段错开15‑20bp长度处的基因序列作为第二连续片段，在所述第二连续片段的反向互补序列上设计连续的反向引物；(2)将所述正向引物和反向引物混合，得到引物混合物；(3)将所述引物混合物煮沸，退火，加入T4DNA连接酶，将引物连成两端带长粘性末端的双链DNA基因；(4)将合成的双链DNA基因连接到pUC57‑GFP‑Amp载体上，所述pUC57‑GFP‑Amp载体的序列如序列表1所示，转化大肠杆菌细胞，反向筛选不发荧光的菌落，测序验证。本发明不依赖PCR扩增，规避了PCR扩增中繁琐的实验步骤和PCR技术错误率高等缺陷。

Description

一种基因合成方法

技术领域

本发明涉及基因合成领域，具体涉及一种基因合成方法。

背景技术

目前基因合成技术普遍利用DNA聚合酶，在体外模拟DNA复制，彼此带有 同源序列的引物在DNA聚合酶的作用下能彼此延伸得到目的DNA片段，最终将 得到的DNA片段分离纯化后克隆到指定载体中测序验证，这一技术我们称之为 基于PCR的基因合成技术。该技术原理简单、易用，但操作过程十分复杂，整个 过程需要经历PCR体系的配制、上机扩增、电泳检测回收、酶切连接、转化等繁 琐的实验操作步骤；同时PCR过程会将引物本身带有的突变放大导致合成出错； 并且高度重复序列、高GC、高AT、反向重复、回文等高级结构因PCR不能正常 扩增而导致合成的失败，成为基于PCR的基因合成技术的一大难点和瓶颈。与之 对应的是大量的人力，物力和时间的耗费，因此极大了限制了合成的通量和人均 产能。随着基因研究的不断深入，目前“读基因”(基因测序)拥有全自动的高通 量测序仪，但“写基因”(基因合成)全都依赖人工合成，因此繁琐的实验步骤、 目前技术手段的内在短板成为了写基因的限速步骤。

发明内容

针对现有技术中的上述缺陷，本发明的主要目的在于提供一种基因合成方 法，不依赖PCR扩增，规避了PCR扩增中繁琐的实验步骤；同时规避了PCR技 术错误率高，难以扩增高度重复、高GC、高AT含量、发卡结构等难度序列的缺 陷；本发明能将具有相同或不同来源的基因同步组合合成，构建基因突变库，具 有灵活性。

为了解决上述缺陷，本发明采用如下技术方案：一种基因合成方法，所述方 法包括：

(1)将待合成基因序列分成55-100bp长度的第一连续片段，将所述第一连 续片段设计成正向引物；将与所述第一连续片段错开15-20bp长度处的基因序列 作为第二连续片段，在所述第二连续片段的反向互补序列上设计连续的反向引 物；

(2)将所述正向引物和反向引物混合，得到引物混合物；

(3)将所述引物混合物煮沸，退火，得到含有多个缺刻的双链DNA片段；

(4)将合成的双链DNA片段连接到pUC57-GFP-Amp载体上，所述载体的 序列如序列表1所示，转化大肠杆菌细胞，反向筛选不发荧光的菌落，测序验证。

作为进一步的优选，所述正向引物中，最靠近基因5’端的引物在5’端含有接 头序列；所述反向引物中，最靠近基因3’端的引物在3’端含有接头序列。

作为进一步的优选，所述接头序列包括载体序列的粘性末端序列和含金门克 隆反应的接头序列。

作为进一步的优选，所述正向引物和反向引物完全覆盖基因的正向序列和反 向互补序列，并在所述引物混合物煮沸退火时在上一引物和下一引物之间配对形 成约15-20bp长度的双链。

作为进一步的优选，所述步骤(1)中，根据待合成基因的长度大小，进行 基因分组，每组长度为700-800bp，再将700-800bp长度的基因序列分成长度 55-100bp连续片段。

作为进一步的优选，所述步骤(3)中，将所述引物混合物经T4多聚核苷酸 激酶磷酸化处理后煮沸、退火，再由T4 DNA连接酶处理，将引物连成两端带长 粘性末端的双链DNA片段。

作为进一步的优选，所述待合成基因序列的长度为500-800bp。

作为进一步的优选，所述步骤(4)中，所述pUC57-GFP-Amp载体的制备方 法包括：提供一pUC57载体，将所述pUC57载体改造获得含GFP基因、无SapI 酶切位点的pUC57-SapIfree-Amp载体，通过双酶切和T4 DNA外切酶活性得到线 性化的两端为长粘性末端的载体。

作为进一步的优选，所述步骤(4)中，将合成的双链DNA基因连接到所述 pUC57-GFP-Amp载体上，包括：通过同源重组的方法将含粘性末端的基因连接到 含有对应长粘性末端的载体上，通过GFP荧光进行反向筛选转化该质粒的大肠杆 菌。

作为进一步的优选，还包括：将克隆到所述载体的基因片段质粒通过1到3 轮金门克隆反应进行拼接，得到全长基因。

本发明的有益效果是：本发明基因合成方法不需要基因扩增仪，整个合成过 程只需要电热水壶、水浴锅等简单廉价的设备，是一个能迅速复制的生产路线。 另外，本发明设计的pUC57-GFP-Amp载体具有以下优点：a、载体骨架更符合客 户选择，背景清晰使用方便，一步合成的小基因可直接发货给客户。b、载体只 需要T4 DNA聚合酶在相应保护碱基存在的条件下处理一次即可，大大简化实验 操作，且无需转化Rosetta(DE3)pLysS菌株，GFPORF带有Prrn组成型启动子，在 常见的大肠杆菌TOP10中也能表达绿色荧光蛋白，菌体在蓝光仪下呈绿色，可 用于反向筛选。而且，本发明中设计引物的长度设计在70nt甚至更长，一步合 成的典型长度可以达到500bp以上，进一步扩展了合成小基因的范围，如果待合 成的基因在500bp以内可以通过提高引物长度一步合成；引物之间可以在退火时 互相配对验证，降低错误合成的引物被引进基因序列的问题，保证了克隆进载体 基因的正确率。

综上所述，本发明基因合成方法不依赖PCR扩增，规避了PCR扩增中繁琐 的实验步骤，极大地提升了人均产能，降低合成的成本；同时该技术完美规避了 PCR技术错误率高(实验数据表明800bp序列一步合成正确率达到99％以上)， 难以扩增高度重复、高GC、高AT含量、发卡结构等难度序列的缺陷；因其灵活 性，能将具有相同或不同来源的基因同步组合合成，构建基因突变库，是组合生 物合成技术(Combinatorial Biosynthesis)的最佳选择，对筛选功能药物等生理活 性物质，研究生物代谢途径以及生物进化具有非常重要的意义。

附图说明

图1为本发明实施例的引物组装克隆示意图。

图2为本发明实施例2金门克隆反应示意图。

图3为本发明实施例pUC57-GFP-Amp载体的示意图。

图4a-1至4a-2为16083A的测序结果示意图。

图4b-1至4b-2为16083B的测序结果示意图。

图4c-1至4c-2为16083C的测序结果示意图。

图5-1至5-2为16083测序比对结果图。

图6a-1至6a-2为16128A的测序结果示意图。

图6b-1至6b-3为16128B的测序结果示意图。

图6c-1至6c-3为16128C的测序结果示意图。

图7-1至7-2为16128测序比对结果图。

具体实施方式

本发明通过提供一种基因合成方法，克服了现有基于PCR的基因合成技术的 缺陷。

为了解决上述问题，本发明实施例的主要思路是：

本发明实施例基因合成方法，所述方法包括：

(1)将待合成基因序列分成55-100bp长度的第一连续片段，将所述第一连 续片段设计成正向引物；将与所述第一连续片段错开15-20bp长度处的基因序列 作为第二连续片段，在所述第二连续片段的反向互补序列上设计连续的反向引 物；

(2)将所述正向引物和反向引物混合，得到引物混合物；

(3)将所述引物混合物煮沸，退火，得到含有多个缺刻的双链DNA片段；

(4)将合成的双链DNA片段连接到pUC57-GFP-Amp载体上，所述载体的 序列如序列表1所示，转化大肠杆菌细胞，反向筛选不发荧光的菌落，测序验证。

所述步骤(4)中，所述载体的制备方法包括：

提供一pUC57载体，对pUC57载体上的SapI位点进行诱变，去掉SapI位点。 然后对MCS(多克隆位点)处进行改造只保留两端的EcoRI和HindIII位点，同时分 别在EcoRI位点前面和HindIII后面分别设计一段序列，达到T4 DNA聚合酶处理 一次就得到比较长的黏性末端的效果。在EcoRI和HindIII位点中间填充一个GFP 的ORF(开放阅读框架)，载体命名为pUC57-GFP-Amp。

所述步骤(1)-(4)中，对于小于500bp左右长度的基因片段，用去离子 水将每条引物稀释成浓度为10poml，分别取每条引物1ul于一干净的EP管中， 加入2.5ul TH buffer(500mM NaCl，100mM Tris-Cl(PH8.0),1mM EDTA)，补去离子 水至总体积25ul充分混匀。将混合物至于沸水中10min然后缓慢降温至室温； 对于大于500bp小于800bp的基因片段，在引物混合后需要加入ATP和T4多聚 核苷酸激酶，使引物5’端磷酸化。

退火产物与载体的孵育：取退火产物3ul，预处理的pUC57-GFP-Amp载体1ul， 混合均匀后37℃保温15min后常规转化大肠杆菌TOP10细胞，涂布LB/Amp抗 性平板过夜培养。

在蓝光仪下观察过夜培养的转化子，用记号笔圈出发光的菌(空载体)，随 机挑取8个菌落进行PCR验证。

阳性克隆送测序：

基因合成连接载体示意图见图1，其中P1、P3、P5、Pn-1等连接起来为完 整的基因序列。P2、P4、P6、Pn连接起来为基因的反向互补序列。另外Pn 3’末 端为和载体突出的粘性末端互补序列，P15’末端为和载体突出的粘性末端互补序 列。

基因拼接：对于长度超过800bp的基因，先将长片段基因进行分组，每组长 度在所合成片段范围内，然后将克隆到表达载体的基因片段质粒通过1到3轮金 门克隆反应进行拼接。

为了更加清晰地理解本发明的目的、技术方案及优点，以下结合实施例，对 本发明进行进一步详细说明。此处所描述的具体例子所涉及的具体数据仅用以解 释本发明，并不用于限定本发明。

实施例1

pUC57-GFP-Amp载体的制备方法包括：

1、提供一pUC57载体，对pUC57载体上的SapI位点进行诱变，去掉SapI 位点。然后对MCS(多克隆位点)处进行改造只保留两端的EcoRI和HindIII位点， 同时分别在EcoRI位点前面和HindIII后面分别设计一段序列，达到T4 DNA聚合 酶处理一次就得到比较长的黏性末端的效果。在EcoRI和HindIII位点中间填充一 个GFP的ORF(开放阅读框架)，载体命名为pUC57-GFP-Amp。

具体地步骤如下：

1.1 SapI位点的诱变：设计引物(带下划线为突变碱基)

pUC57-SapImut-F:5'GCGTATTGGGCGCACTTCCGCTTCCTCGCTCACTGACTC3'

pUC57-SapImut-R:5'GCGAGGAAGCGGAAGTGCGCCCAATACGCAAAC 3'

以pUC57-Amp载体为模板扩增，扩增产物用DpnI消化之后回收转化大肠杆 菌TOP10，随机挑选3个转化子用M13-47引物测序，突变正确的载体标记为 pUC57-SapI free-Amp。

1.2 MCS的改造：设计引物(下划线为载体重组臂；波浪线为设计的接头以 及酶切位点)

MCS-F:AAAACGACGGCCAGTAGT TCTTCGGATACGCCGTTCGCTGTG

MCS-R:TATGACCATGATTACGCC AATTGTGAGCGCTCTAGAGGATAC

1.3 以申请人公司保留的含GFP的质粒为模板扩增得到GFP ORF；

pUC57-SapI free-Amp载体用EcoRI/HindIII酶切回收载体骨架与扩增回收得到的GFP ORF在Gisbon重组酶的作用下进行体外重组。反应条件如下：

50℃反应1h，反应产物常规转化大肠杆菌TOP10感受态细胞(转化实验步 骤见分子克隆手册)，涂布LB/Amp抗性平板，37℃过夜培养。

1.4 在蓝光仪下观察过夜培养的转化子，随机挑选3个发光的重组子送测序 验证。测序验证，之后的载体即为pUC57-GFP-Amp载体，接种提质粒备用。

2.pUC57-GFP-Amp线性化载体的制备：

2.1 pUC57-GFP-Amp的酶切线性化，酶切体系如下：

水浴锅37℃反应2h，电泳检测回收(操作方法参考Axygen凝胶回收试剂盒)

2.2 pUC57-GFP-Amp线性化载体的T4 DNA聚合酶处理，反应体系如下

12℃反应30min，电泳检测回收(操作方法参考Axygen凝胶回收试剂盒)

pUC57-GFP-Amp载体经EcoRI和HindIII酶切后在T4 DNA聚合酶3’-5’外切酶 活性的作用下，在保护碱基dTTP存在的条件下于12℃处理30min得到含有长黏 性末端的载体备用。处理之后得到的载体示意图如图3所示。

引物退火一步组装合成基因16083：

1.基因分组(下划线为与载体退火序列，波浪线为SapI位点)

16083A:(519bp)

caagagagaatt atgaattcatgaccgacgtgagcacgacgaatcagcgctacatgacccagacggacttcatgtcgtggcggatggaggaggacccgatcctccggtcgaccatcgtggcggtcgcactgctcgaccgcagtccggatcagagccgattcgtcgacatgatgcgcagggcggtcgacctggttcccctcttccggcggacggcgatcgaggctccgatgggctttgcgccgccgaggtgggcggacgatcacgatttcgatctcagctggcacctgcgccgctacaccctccccgaaccacgaacatgggacggggttctcgacttcgcccggaccgccgagatgaccgccttcgacaagcgccgtccgctctgggagttcaccgttctcgacggactccacgacggcaggtccgccctcgtgatgaaggtgcatcactctctcaccgacggtgtcagtggaatgcagattgcccggg agcttttggcgt

16083B:(527bp)

caagagagaatt gggagatcgtggatttcacccgcgatggcgggccacggccggaccggaccgaccaccgcacggccgcgccgaacggtgaatcgcccactccgccgggccgcctctcctggtaccggaacacggccaccgacgtggcccgccgggcatcgaacacgctgggccgcaacagtgttcgactggttcggactccgagggccacctggcgcgacgcagccgcactagccggctccacactgcgcctcacgcgtcccgtggtctccacactgtccccggtcatgaaaaaacgcagcacgcggcgtcactgtgcggtgctcgacgtgccggtggaggcgctcgctcaggcggccgcggcgggtgccggttcgatcaacgacgcgtttctcgctgctgtcctgctgggaatggcgaagtaccaccgactgcacggcgccgagatcagcgaactgcggatgacgctgccgatcagcctgcgtgccgagacggacaagcttttggcgt

16083C:(536bp)

caagagagaatt gacccggtgggaggcaaccgcatcaccctggcacgttttgcactacccgccgacatcgacgaccccgccgagttgatgcaccgggtgcacgccacggtggatgcctggcgccacgagcccgcgattccgctgtcaccgacgatcgccggcgccttgaacctgcttccggcctcgacactcggaaacatgctcaaacacgtcgacttcgtcgcctcgaacgtcgtcggatctccggtaccactgttcatcgccgggtcggaggttctgcactactacgcgttcagccccacactcggatcggcgttcaacgtcaccttgatgtcctacaccacgcgatgctgtgtcgggatcaacgccgacacggacgcaatcccggacctcgcaaccctgaccgattcgatagcggacgggtttcgcgccgtcctcggactgtgcacgaagacaaccgatacgagggtggtcgtggcctcgactcgagtaa agcttttggcgt

2.引物设计(overlap数20bp)

3.用去离子水将每条引物稀释成浓度为10pmol，分别取每条引物1ul于一干 净的EP管中，加入2.5ul TH buffer(500mM NaCl，100mMTris-Cl(PH8.0),1mM EDTA)， 补去离子水至总体积25ul充分混匀。将混合物至于沸水中10min然后缓慢降温至 室温。

4.退火产物与载体的孵育：取退火产物3ul，预处理的pUC57-GFP-Amp载体 1ul，混合均匀后37℃保温15min后常规转化大肠杆菌TOP10细胞，涂布LB/Amp抗 性平板过夜培养。

5.在蓝光仪下观察过夜培养的转化子，用记号笔全出发光的菌(空载体)， 随机挑取8个菌落进行PCR验证。

6.阳性克隆送测序。测序结果如图4a-4c所示。

7.基因拼接

7.1 基因拼接反应程序为

7.2 基因拼接测序结果比对，见图5。

实施例2

pUC57-GFP-Amp载体的制备方法与实施例1类似，不再赘述。

1、基因分组(下划线为与载体退火序列，波浪线为BbsI位点，斜体部分为金 门克隆反应位点)

16128A(747bp)

caagagagaattcccatggcaacaggaactgagaaaaagcaccaagaaaagctttatatccctaagctaaaggttcatcagatcaagctagagctcttttatgaggccggtcatggacaggtggcctttgataacctttctttgagagaggctggtgataagccaagtgatgacatcaaggttgcttcacatcacttagaggagcaaatcgtcctgcctttaaataagcactacctcatggaaatggctgactatcactatcagattgcagcggagtccagcaacattgtgcgcgtggaaaatggtcttttgattcctttgtctcacgggaaaacgcttttagaggtgttggatcaagaggggcaaagagtagcaacagtgccggttgagattttagcagcagaggaccctcaaacaacctccttgatcacaaagtggtgtgaggtgattttgggggctgaaaactttgaccgatcaagtccagctatggtggcattaaaccaaaaactggacgacagtgtgagcaaaaatctagttcaaatatgtatccgctcatgagacaataaccctgataaatgcttcaataatattgaaaaaggaagagtcctgaggcggaaagaaccagctgtggaatgtgtgtcagttagggtgtggaaagtccccaggctccccagcaggcagaagtatgcaaagcatgcatctcaattagtcagcaaccaaagcttttggcgt

16128B(817bp)

caagagagaattcaccaggtgtggaaagtccccaggctccccagcaggcagaagtatgcaaagcatgcatctcaattagtcagcaaccatagtcccgcccctaactccgcccatcccgcccctaactccgcccagttccgcccattctccgccccatggctgactaattttttttatttatgcagaggccgaggccgcctcggcctctgagctattccagaagtagtgaggaggcttttttggaggcctaggcttttgcaaagatcgatcaagagacaggatgaggatcgtttcgcatgattgaacaagatggattgcacgcaggttctccggccgcttgggtggagaggctattcggctatgactgggcacaacagacaatcggctgctctgatgccgccgtgttccggctgtcagcgcaggggcgcccggttctttttgtcaagaccgacctgtccggtgccctgaatgaactgcaagacgaggcagcgcggctatcgtggctggccacgacgggcgttccttgcgcagctgtgctcgacgttgtcactgaagcgggaagggactggctgctattgggcgaagtgccggggcaggatctcctgtcatctcaccttgctcctgccgagaaagtatccatcatggctgatgcaatgcggcggctgcatacgcttgatccggctacctgcccattcgaccaccaagcgaaacatcgcatcgagcgagcacgtactcggatggaagccggtcttgtcgatcaggatgatctggacgaagagcatcaggggaagcttttggcgt

16128C(873bp)

caagagagaattcggggctcgcgccagccgaactgttcgccaggctcaaggcgagcatgcccgacggcgaggatctcgtcgtgacccatggcgatgcctgcttgccgaatatcatggtggaaaatggccgcttttctggattcatcgactgtggccggctgggtgtggcggaccgctatcaggacatagcgttggctacccgtgatattgctgaagagcttggcggcgaatgggctgaccgcttcctcgtgctttacggtatcgccgctcccgattcgcagcgcatcgccttctatcgccttcttgacgagttcttctgactgatctaatcaaggatcaaagcagcacatacctttggagtgatttggcggatcttcatcaatcgtctcagatgacagccacctgtaggcgcttggaggaaatggcaaggcaggtgagcagcttagcctctaagtattatcaggataaggagctgataagactgatcaaggataaattggcctggctgacgcttaactactatcatccacaaaaggatattgaaggtaaggctaattggtgggattttgaaattggtaccccaagagctattgtcaataccctagcctttctttacccttatgtcactcaagaggagatcaagcgctacactaaagggatttctcactttgttcctaatcctagacaatttcgctcaacccttgtgaatccttttaaggctatcggaggtaaccttgttgatatgggacgaataaagattattgaggctctgttaaggcatgataagaaagcacttcaagacagtatagcagccctagataccttatttgcttttcagcctaataagcttttggcgt

2、设计引物合成

3、引物的磷酸化：用去离子水将引物稀释成50pmol，每组引物分别取0.5ul 于单独的离心管中，加入10×T4Polynucleotide Kinase buffer 2ul；T4PolynucleotideKinase 1ul(NEB 10U)；ATP(NEB 1mM)；补去离子水至20ul。充分混匀之后将反应体 系置于37℃反应1h。

4、16128-A/B/C，磷酸化引物退火：分别将每组磷酸化引物在50℃条件下保 温10min后置于沸水中10min后缓慢降至室温。

5、磷酸化产物与载体的连接：取磷酸化产物8ul于一干净的PCR管中，加 入T4 DNALigase 1ul(NEB 40U)，加入预处理的pUC57-GFP-Amp载体1ul，16℃ 反应1h。

6、连接产物转化：取连接差内5ul常规转化大肠杆菌TOP10细胞，涂布 LB/Amp抗性平板过夜培养。

7、在蓝光仪下观察过夜培养的转化子，用记号笔全出发光的菌(空载体)， 随机挑取8个菌落进行PCR验证。

8、测序结果比对，如图6a-6c所示，

9、测序正确的转化子(16128-A/B/C)分别接种提质粒做金门反应拼接合成 全长基因。拼接体系和反应程序如下：

10、反应体系(pUC57-Kana-GFP为我公司构建保存载体，载体用BbsI线性化)

反应程序为

11、基因拼接测序结果比对

16128测序结果见16128测序比对示意图7。

金门反应拼接全长基因示意图如图2所示。

上述本申请实施例中的技术方案，至少具有如下的技术效果或优点：

本发明基因合成方法不需要基因扩增仪，整个合成过程只需要电热水壶、水 浴锅等简单廉价的设备，是一个能迅速复制的生产路线。另外，本发明设计的 pUC57-GFP-Amp载体具有以下优点：1、载体骨架更符合客户选择，背景清晰使 用方便，一步合成的小基因可直接发货给客户。本发明实施例载体只需要T4 DNA 聚合酶在相应保护碱基存在的条件下处理一次即可，大大简化实验操作，且无需 转化Rosetta(DE3)pLysS菌株，GFP ORF带有Prrn组成型启动子，在常见的大肠杆 菌TOP10中也能表达绿色荧光蛋白，菌体在蓝光仪下呈绿色，可用于反向筛选。

2、本发明中设计引物的长度设计在70nt甚至更长，一步合成的典型长度可以达到500bp以上，进一步扩展了合成小基因的范围，如果待合成的基因在500bp 以内可以通过提高引物长度一步合成。3、本发明实施例引入T4多聚核苷酸激酶 (T4 PolynucleotideKinase；NEB#M0201)和T4 NDA连接酶(T4 DNA Ligase； NEB#M0202)。T4多聚核苷酸激酶在ATP存在的条件下能够催化ATP的γ位磷酸 基团转移到寡核苷酸链(单链或者双链DNA或者RNA)的5’羟基末端，对引物 进行磷酸化处理。处理后的磷酸化引物高温变性低温退火之后与预先处理好的 pUC57-GFP-Amp混合于37℃孵育后在T4 DNA连接酶的作用下进行连接反应， 最后转化大肠杆菌TOP10(感受态效价>108cfu/μg DNA)一步合成DNA片段， 合成的典型长度在800bp左右。4、如果目的基因比较大，一步合成之后可用金 门克隆拼接组装合成。5、引物之间可以在退火时互相配对验证，降低错误合成 的引物被引进基因序列的问题，保证了克隆进载体基因的正确率。

综上所述，本发明基因合成方法不依赖PCR扩增，规避了PCR扩增中繁琐 的实验步骤，极大地提升了人均产能，降低合成的成本；同时该技术完美规避了 PCR技术错误率高(实验数据表明800bp序列一步合成正确率达到99％以上)， 难以扩增高度重复、高GC、高AT含量、发卡结构等难度序列的缺陷；因其灵活 性，能将具有相同或不同来源的基因同步组合合成，构建基因突变库，是组合生 物合成技术(Combinatorial Biosynthesis)的最佳选择，对筛选功能药物等生理活 性物质，研究生物代谢途径以及生物进化具有非常重要的意义。

尽管已描述了本发明的优选实施例，但本领域内的技术人员一旦得知了基本 创造性概念，则可对这些实施例作出另外的变更和修改。所以，所附权利要求意 欲解释为包括优选实施例以及落入本发明范围的所有变更和修改。显然，本领域 的技术人员可以对本发明进行各种改动和变型而不脱离本发明的精神和范围。这 样，倘若本发明的这些修改和变型属于本发明权利要求及其等同技术的范围之 内，则本发明也意图包含这些改动和变型在内。

SEQUENCE LISTING

<110> 武汉金开瑞生物工程有限公司

<120> 一种基因合成方法

<130> 1

<160> 1

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 3696

<212> DNA

<213> Escherichia coli

<400> 1

tcgcgcgttt cggtgatgac ggtgaaaacc tctgacacat gcagctcccg gagacggtca 60

cagcttgtct gtaagcggat gccgggagca gacaagcccg tcagggcgcg tcagcgggtg 120

ttggcgggtg tcggggctgg cttaactatg cggcatcaga gcagattgta ctgagagtgc 180

accatatgcg gtgtgaaata ccgcacagat gcgtaaggag aaaataccgc atcaggcgcc 240

attcgccatt caggctgcgc aactgttggg aagggcgatc ggtgcgggcc tcttcgctat 300

tacgccagct ggcgaaaggg ggatgtgctg caaggcgatt aagttgggta acgccagggt 360

tttcccagtc acgacgttgt aaaacgacgg ccagtagtca agagagaatt ctcttcggat 420

acgccgttcg ctgtgtcgca caattcgtgg acgtgggaaa attgatccca ttctggtgcc 480

ggatccctaa gcccaatgtg tttttttcta gttggatttg ctcccccgcc gtcgttcaat 540

gagaatggat aagaggctcg tgggattgac gtgagggggc agggatggct atatttctgg 600

gagcgaactc cgggcgaata cgaagcgctt ggatagcttc acttgtacag ctcgtccatg 660

ccggtcgact ctagaggatc ctctagattt aagaaggaga tatacatatg agtaaaggag 720

aagaactttt cactggagtt gtcccaattc ttgttgaatt agatggtgat gttaatgggc 780

acaaattttc tgtcagtgga gagggtgaag gtgatgcaac atacggaaaa cttaccctta 840

aatttatttg cactactgga aaactacctg ttccatggcc aacacttgtc actactttcg 900

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agagtgccat gcccgaaggt tatgtacagg aaagaactat atttttcaaa gatgacggga 1020

actacaagac acgtgctgaa gtcaagtttg aaggtgatac ccttgttaat agaatcgagt 1080

taaaaggtat tgattttaaa gaagatggaa acattcttgg acacaaattg gaatacaact 1140

ataactcaca caatgtatac atcatggcag acaaacaaaa gaatggaatc aaagttaact 1200

tcaaaattag acacaacatt gaagatggaa gcgttcaact agcagaccat tatcaacaaa 1260

atactccaat tggcgatggc cctgtccttt taccagacaa ccattacctg tccacacaat 1320

ctgccctttc gaaagatccc aacgaaaaga gagaccacat ggtccttctt gagtttgtaa 1380

cagctgctgg gattacacat ggcatggacg agctgtacaa gtgaagtatc ctctagagcg 1440

ctcacaatta agcttttggc gtggcgtaat catggtcata gctgtttcct gtgtgaaatt 1500

gttatccgct cacaattcca cacaacatac gagccggaag cataaagtgt aaagcctggg 1560

gtgcctaatg agtgagctaa ctcacattaa ttgcgttgcg ctcactgccc gctttccagt 1620

cgggaaacct gtcgtgccag ctgcattaat gaatcggcca acgcgcgggg agaggcggtt 1680

tgcgtattgg gcgcacttcc gcttcctcgc tcactgactc gctgcgctcg gtcgttcggc 1740

tgcggcgagc ggtatcagct cactcaaagg cggtaatacg gttatccaca gaatcagggg 1800

ataacgcagg aaagaacatg tgagcaaaag gccagcaaaa ggccaggaac cgtaaaaagg 1860

ccgcgttgct ggcgtttttc cataggctcc gcccccctga cgagcatcac aaaaatcgac 1920

gctcaagtca gaggtggcga aacccgacag gactataaag ataccaggcg tttccccctg 1980

gaagctccct cgtgcgctct cctgttccga ccctgccgct taccggatac ctgtccgcct 2040

ttctcccttc gggaagcgtg gcgctttctc atagctcacg ctgtaggtat ctcagttcgg 2100

tgtaggtcgt tcgctccaag ctgggctgtg tgcacgaacc ccccgttcag cccgaccgct 2160

gcgccttatc cggtaactat cgtcttgagt ccaacccggt aagacacgac ttatcgccac 2220

tggcagcagc cactggtaac aggattagca gagcgaggta tgtaggcggt gctacagagt 2280

tcttgaagtg gtggcctaac tacggctaca ctagaagaac agtatttggt atctgcgctc 2340

tgctgaagcc agttaccttc ggaaaaagag ttggtagctc ttgatccggc aaacaaacca 2400

ccgctggtag cggtggtttt tttgtttgca agcagcagat tacgcgcaga aaaaaaggat 2460

ctcaagaaga tcctttgatc ttttctacgg ggtctgacgc tcagtggaac gaaaactcac 2520

gttaagggat tttggtcatg agattatcaa aaaggatctt cacctagatc cttttaaatt 2580

aaaaatgaag ttttaaatca atctaaagta tatatgagta aacttggtct gacagttacc 2640

aatgcttaat cagtgaggca cctatctcag cgatctgtct atttcgttca tccatagttg 2700

cctgactccc cgtcgtgtag ataactacga tacgggaggg cttaccatct ggccccagtg 2760

ctgcaatgat accgcgagac ccacgctcac cggctccaga tttatcagca ataaaccagc 2820

cagccggaag ggccgagcgc agaagtggtc ctgcaacttt atccgcctcc atccagtcta 2880

ttaattgttg ccgggaagct agagtaagta gttcgccagt taatagtttg cgcaacgttg 2940

ttgccattgc tacaggcatc gtggtgtcac gctcgtcgtt tggtatggct tcattcagct 3000

ccggttccca acgatcaagg cgagttacat gatcccccat gttgtgcaaa aaagcggtta 3060

gctccttcgg tcctccgatc gttgtcagaa gtaagttggc cgcagtgtta tcactcatgg 3120

ttatggcagc actgcataat tctcttactg tcatgccatc cgtaagatgc ttttctgtga 3180

ctggtgagta ctcaaccaag tcattctgag aatagtgtat gcggcgaccg agttgctctt 3240

gcccggcgtc aatacgggat aataccgcgc cacatagcag aactttaaaa gtgctcatca 3300

ttggaaaacg ttcttcgggg cgaaaactct caaggatctt accgctgttg agatccagtt 3360

cgatgtaacc cactcgtgca cccaactgat cttcagcatc ttttactttc accagcgttt 3420

ctgggtgagc aaaaacagga aggcaaaatg ccgcaaaaaa gggaataagg gcgacacgga 3480

aatgttgaat actcatactc ttcctttttc aatattattg aagcatttat cagggttatt 3540

gtctcatgag cggatacata tttgaatgta tttagaaaaa taaacaaata ggggttccgc 3600

gcacatttcc ccgaaaagtg ccacctgacg tctaagaaac cattattatc atgacattaa 3660

cctataaaaa taggcgtatc acgaggccct ttcgtc 3696

Claims (10)

1.一种基因合成方法，其特征在于：所述方法包括：

(1)将待合成基因序列分成55-100bp长度的第一连续片段，将所述第一连续片段设计成正向引物；将与所述第一连续片段错开15-20bp长度处的基因序列作为第二连续片段，在所述第二连续片段的反向互补序列上设计连续的反向引物；

(2)将所述正向引物和反向引物混合，得到引物混合物；

(3)将所述引物混合物煮沸，退火，得到含有多个缺刻的双链DNA片段；

(4)将合成的双链DNA片段连接到pUC57-GFP-Amp载体上，所述载体的序列如序列表1所示，转化大肠杆菌细胞，反向筛选不发荧光的菌落，测序验证。

2.根据权利要求1所述的基因合成方法，其特征在于：所述正向引物中，最靠近基因5’端的引物在5’端含有接头序列；所述反向引物中，最靠近基因3’端的引物在3’端含有接头序列。

3.根据权利要求2所述的基因合成方法，其特征在于：所述接头序列包括载体序列的粘性末端序列和含金门克隆反应的接头序列。

4.根据权利要求1所述的基因合成方法，其特征在于：所述正向引物和反向引物覆盖基因的正向序列和反向互补序列，在所述引物混合物煮沸退火时，上一引物和下一引物之间配对形成15-20bp长度的双链。

5.根据权利要求1所述的基因合成方法，其特征在于：所述步骤(1)中，根据待合成基因的长度大小，进行基因分组，每组长度为700-800bp，再将700-800bp长度的基因序列分成长度55-100bp连续片段。

6.根据权利要求1所述的基因合成方法，其特征在于：所述步骤(3)中，将所述引物混合物经T4多聚核苷酸激酶磷酸化处理后煮沸、退火，再由T4DNA连接酶处理，将引物连成两端带长粘性末端的双链DNA片段。

7.根据权利要求6所述的基因合成方法，其特征在于：所述步骤(1)中，所述待合成基因序列的长度为500-800bp。

8.根据权利要求1所述的基因合成方法，其特征在于：所述步骤(4)中，所述pUC57-GFP-Amp载体的制备方法包括：提供一pUC57载体，将所述pUC57载体改造获得含GFP基因、无SapI酶切位点的pUC57-SapI free-Amp载体，通过双酶切和T4DNA外切酶活性得到线性化的两端为长粘性末端的载体。

9.根据权利要求1所述的基因合成方法，其特征在于：所述步骤(4)中，将合成的双链DNA基因连接到所述pUC57-GFP-Amp载体上，包括：通过同源重组的方法将含粘性末端的基因连接到含有对应长粘性末端的载体上，通过GFP荧光进行反向筛选转化该质粒的大肠杆菌。

10.根据权利要求1所述的基因合成方法，其特征在于：所述方法还包括：将克隆到所述载体的基因片段质粒通过1到3轮金门克隆反应进行拼接，得到全长基因。