CN106282157A

CN106282157A - 一种由短链核苷酸介导的dna组装方法及其应用

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Publication number: CN106282157A
Application number: CN201510268154.3A
Authority: CN
Inventors: 娄春波; 陶勇; 赵学金; 张莎莎; 张丽华; 翟春华; 柳振宇
Original assignee: Nanjing Jinsirui Science and Technology Biology Corp
Current assignee: Nanjing Jinsirui Science and Technology Biology Corp
Priority date: 2015-05-22
Filing date: 2015-05-22
Publication date: 2017-01-04
Anticipated expiration: 2035-05-22
Also published as: US20160340670A1; CN106282157B

Abstract

本发明公开了一种由短链核苷酸介导的DNA组装方法及其应用。本发明组装方法包括：“长序列”的合成，模块载体的准备及组装，骨架载体的改造及组装，短序列的准备，模块载体、改造过的骨架载体、“短序列”的酶切连接一体化反应等步骤。在本发明中，“短序列”为启动子和RBS等调节元件，“长序列”为基因或者载体的复制起始原点等。“短序列”被设计为可以合成的双链DNA链，在组装过程中既可以连接“长序列”又可以作为条码序列决定组装顺序。操纵子中基因的顺序可以通过合成带有不同粘性末端的“短序列”来实现。本发明方法允许多个因子同时参与通路中基因的调控，可以用来构建生物合成通路的组合文库，达到通量优化通路的目的。

Description

一种由短链核苷酸介导的DNA组装方法及其应用

技术领域

本发明属于生物技术领域中合成生物学方向，涉及一种由短链核苷酸介导的DNA组装方法及其应用，尤其涉及代谢工程中通过短链核苷酸介导的DNA组装技术实现高通量优化代谢通路的方法。

背景技术

在工业上，微生物可以用来生产一些可再生性化学物质(Keasling,2010)。当今生物技术特别是代谢工程和合成生物学的迅猛发展，通过调节通路大大地推进了工业界以微生物为平台的产品生产(Alper等,2005；Juminaga等,2012；Na等,2013；Smanski等,2014)。然而在代谢工程通路调节中，通路中酶的表达不平衡会导致有毒中间产物的积累，影响细胞的生长，进而导致目标产物的产量下降(Coussement等，2014)。因此，平衡各个酶的活性和表达水平是优化通路的关键所在(Farasat等,2014；Jones等,2014)。通过调节酶的表达来实现通路优化，可以从以下四个层面进行：1)通过替换载体上复制原点来改变基因拷贝数(Jensen和Hammer，1998)；2)通过引入一些调节元件(如启动子、核糖体结合位点等)来调节基因的表达水平(Salis等,2009和2011)；3)通过改变细菌基因操纵子中基因的排列顺序(Lim等,2011；Nishizaki等，2007)；4)利用种属差异带来的酶动力学特性和底物的特异性，选择来自不同物种的基因(Rodriguez等,2014)。根据片段的长短，可以将上述涉及的DNA片段分为两大类：“短序列”(<50bp)和“长序列”(>200bp)，其中“短序列”包括启动子和核糖体结合位点(Ribosome-binding site，RBS)，“长序列”包括载体的复制原点(origin of replication)和基因(如编码酶的基因)等。当前对于通路的调节，绝大部分都局限于针对某一个因子，同时调节多因子鲜有报道，其瓶颈在于多基因组装的难度。

近年来发展起来的DNA组装技术，如Gibson组装、金门反应等方法可以用来组装多个DNA片段(Gibson等，2009；Weber等，2011)。绝大部分方法适用于单基因或者两个基因的操作；通过将“短序列”设计在PCR引物中，通过PCR扩增来获得“长序列”。因此，在一定程度上受限于PCR扩增的能力。同时，在一些较长的片段(>2kb)PCR扩增中通常会带来一些不必要的突变。金门反应虽然可以避免PCR扩增带来的突变，但是它需要将每一段序列亚克隆至模块载体，通过设定特定条码序列(barcode sequence)来实现特定顺序的组装；对于多顺序的组装，金门反应针对不同的组装顺序需设定不同的条码序列进行亚克隆，增加了人力和财力成本。因此，一种免PCR反应、免条码序列的DNA组装技术的开发显得尤为重要，通过实现通量的组装，进而通量优化通路，大大地提高代谢工程通路优化的效率。

发明内容

本发明的目的在于针对现有技术的上述不足，提供一种由短链核苷酸介导的DNA组装方法。

本发明的另一种目的是提供该方法在实现高通量优化代谢通路中的应用。

本发明的目的可通过以下技术方案实现：

一种由短链核苷酸介导的DNA组装方法，包括以下步骤：

I)“长序列”的合成：克隆待组装DNA片段作为“长序列”；

II)“短序列”的准备：根据“长序列”的末端序列的4个碱基和组装顺序来设计长度小于50bp的正向和反向引物，引物合成后，退火形成3’黏性末端和5‘黏性末端的长度分别为4bp的双链DNA片段并磷酸化处理，作为“短序列”，其中短序列的3’黏性末端与其所连接的“长序列”的5’黏性末端互补，5’黏性末端则决定其排列顺序；

III)连接反应：将包括所述的“长序列”、所述的“短序列”的反应体系混合，加入T4连接酶进行连接反应，实现组装目的。

本发明所述的由短链核苷酸介导的DNA组装方法，优选包括以下步骤：

1)“长序列”的合成：克隆序列内部所用到的II类限制性核酸内切酶位点已无义突变的待组装DNA片段作为“长序列”；

2)准备模块载体：无义突变模块载体骨架中的所用的II类限制性核酸内切酶位点；

3)将步骤1)中得到的“长序列”克隆至步骤2)的模块载体，构建各“长序列”的模块载体，每个待组装DNA片段的5’和3’端均为所用的II类限制性核酸内切酶位点；

4)对骨架载体序列中所用II类限制性核酸内切酶位点进行无义突变；

5)将ccdB操纵子基因克隆至骨架载体，且ccdB基因两末端引入所用的II类限制性核酸内切酶位点；ccdB插入位置为待组装的片段最终插入的位置；

6)“短序列”的准备：根据“长序列”的末端序列的4个碱基和组装顺序来设计长度小于50bp的正向和反向引物，引物合成后，退火形成3’黏性末端和5‘黏性末端的长度分别为4bp的双链DNA片段并磷酸化处理(使用T4多聚核苷酸激酶,Cat.#M0201L,NEB)，作为“短序列”，其中短序列的3’黏性末端与其所连接的“长序列”的5’黏性末端互补，5’黏性末端则决定其排列顺序；

7)酶切连接一体化反应：将步骤3)获得的“长序列”的模块载体、步骤5)中改造过的骨架载体、步骤6)中的“短序列”混合，加入对应的II类限制性核酸内切酶和T4连接酶进行酶切连接进行一体化反应。

在构建组合文库时，对于每一个排列顺序，为一个酶切连接一体化反应，即混合“长序列”和“短序列”时，需要根据不同的“长序列”排列顺序加入对应的“短序列”片段。

本发明方法还优选包括以下步骤：

8)对步骤7)中的反应产物进行质粒安全核酸酶(Plasmid-Safe^TM ATP-Dependent DNase,Cat#.3101K,EPICENTRE)处理；

9)将8)中的质粒转化至高效价感受态细胞；

10)所得阳性克隆可通过测序方法来鉴定“长序列”和“短序列”的组装顺序；

11)上述阳性克隆所得质粒DNA用于转化目的菌株。

其中，步骤1)和步骤6)的”长序列”和”短序列”的分类；一般将待组装的组件根据片段的长度来分类，“长序列”一般为基因或长度大于等于200bp的DNA片段；“短序列”一般为小于等于50bp的序列，且一般通过化学方法合成，即通过合成正向引物和反向引物，通过退火形成双链DNA分子。所述的待组装DNA片段为基因时，“短序列”选自包括启动子和/或RBS在内的调节元件。

步骤1)通过PCR或者基因合成方法克隆序列内部所用到的II类限制性核酸内切酶位点已无义突变的“长序列”。

本发明方法步骤3)中，对于不同种属来源的同一基因，优选使用同一套5’ 和3’黏性末端。

本发明方法还优选包括对步骤3)所得各基因片段或待组装DNA片段的模块载体进行测序，经鉴定基因序列和插入位点正确的载体进入进一步操作。

本方法步骤6)中若对于同一个基因需设计多个“短序列”，则该多个“短序列”使用同一套5’和3’黏性末端；只有当组装顺序变换时，5’黏性末端才会变化。

步骤7)中一体化反应的反应条件为10x(37℃/5min+16℃/10min)+37℃/15min+50℃/5min+80℃/5min。

上述步骤8)所用试剂为商业试剂盒，具体操作遵循产品说明。

本发明所述的方法在构建组合文库中的应用。

所述的组合文库，在研究多个组件的生物作用时，将被研究的组件及其可变量作为文库的最小组成部分，通过DNA组装的方法构建质粒库。

将该方法应用于构建组合文库时，“长序列”为内部所用到的II类限制性核酸内切酶位点已无义突变的基因或者载体的起始复制原点。“短序列”为基因的调节元件，所述的调节元件包括启动子或RBS等。“短序列”的3’黏性末端和与之连接的“长序列”5’黏性末端互补，而“短序列”5’端的黏性末端可以根据其拟组装顺序设计不同的序列。对于不同种属来源的同一基因，优选使用同一套5’和3’黏性末端。当按照本发明方法进行组装时，由于“短序列”5’端的黏性末端的序列不同，实现“长序列”的不同组装顺序。组装过程中通过“长序列”和“短序列”5’和3’黏性末端的同源互补，实现无需通过PCR而进行组装的目的。且对于每个组装顺序各实施一个一体化反应。

本发明所述的方法在生物合成代谢通路的组合文库中的应用。

一种高通量优化代谢通路的方法，按照本发明所述的方法生物合成代谢通路的组合文库，不同通路的目的产物通过特定的方法来检测。

所述的方法中“短序列”为启动子和RBS等调节元件；“长序列”为基因，如编码酶的基因。

有益效果：

先前的众多组装方法中，很多都是基于PCR扩增长片段来实现组装的，本发明旨在解决上述问题，开发出一种免PCR免条码序列的DNA组装技术，通过黏性末端的同源互补实现基因或组合文库的组装。将该方法应用于生物合成代谢通路的组合文库，通过通量组装来实现通路的通量调节。短链核苷酸介导的DNA组装技术(Oligonucleotide Linker-mediated DNA Assembly，简称OLMA)是基于II类限制性核酸内切酶开发的DNA片段组装技术，允许多个因子同时参与通路中基因的调控。该技术可以用来构建生物合成通路的组合文库，达到通量优化通路的目的。此类组合文库的多样性源自：(1)不同强度的RBS；(2)不同种属来源的基因；(3)基因的不同排列顺序。该技术实现了无缝组装且无需任何PCR反应，在十天内建立高通量组合文库，达到通量优化代谢通路的目的。在本发明中，“短序列”可以为启动子和RBS等调节元件，“长序列”可以为基因或者载体的复制起始原点。“短序列”被设计为可以合成的双链DNA链，在组装过程中既可以连接“长序列”又可以作为条码序列决定组装顺序。操纵子中基因的顺序可以通过合成带有不同粘性末端的“短序列”来实现。此外，引入II类限制性核酸内切酶来实现无缝链接，避免了其它组装方法中常见的“疤”的残留。因此，该“短序列”的应用为本发明的亮点。

综上所述，本发明通过创建高效多用的组合文库来实现不同层次的基因表达的调节，以筛选最优调节方案；实现了在10日内完成组合文库的构建。

本发明与现有的组装技术在代谢通路优化上的应用相比，优点在于：

1)引入“短序列”参与组装，既可以用来连接“长序列”，又可以作为可调控的元件参与调节基因的表达调控；

2)引入II类限制性核酸内切酶位点，实现无缝连接；且通过引入II类限制性核酸内切酶位点，将酶切产生的4个碱基的黏性末端作为条码标签，利用“短序列”5’粘性末端的变化来实现不同的组装顺序；

3)同时从三个层面来实现平衡通路中多个关键基因的表达，包括引入调节元件、改变基因的顺序、利用基因的种属差异，进而实现了通量化调节；

4)无需PCR反应，避免了由PCR反应带来的“长序列”的突变；

5)一体化反应，易操作，节约人力财力。

本发明已经成功应用于番茄红素生物合成通路的优化，有望拓展至更多的代谢通路。本发明对于代谢工程中通量优化代谢通路具有重要的意义。

附图说明

图1为OLMA技术的相关准备工作

图2为OLMA技术的操作流程

图3为LacZ基因被分割成不同数目的片段的组装演示图

图4为不同来源的crtE、crtB、crtI基因的模块载体及各自的黏性末端分配

图5为番茄红素生物合成通路优化中6种不同组装顺序的短核苷酸设计示意图

图6为骨架载体pYC1k-ccdB-idi质粒图谱。

具体实施方式

以下的实施例便于更好地理解本发明，但不限定本发明。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为自常规生化试剂商店购买得到的。

一种由短链核苷酸介导的DNA组装方法，包括以下步骤：

5)将ccdB操纵子基因(SEQ ID NO.15)克隆至骨架载体，且ccdB基因两末端引入所用的II类限制性核酸内切酶位点；ccdB插入位置为待组装的片段最终插入的位置；

6)“短序列”的准备：根据“长序列”的末端序列的4个碱基和组装顺序来设计长度小于50bp的正向和反向引物，引物合成后，退火形成3’黏性末端和5‘黏性末端的长度分别为4bp的双链DNA片段并磷酸化处理(T4多聚核苷酸激酶,Cat.#M0201L,NEB)作为“短序列”，其中短序列的3’黏性末端与其所连接的“长序列”的5’黏性末端互补，5’黏性末端则决定其排列顺序；

7)酶切连接一体化反应：将步骤3)获得的“长序列”的模块载体、步骤5)中改造过的骨架载体、步骤6)中的“短序列”混合，加入对应的II类限制性核酸内切酶和T4连接酶进行酶切连接进行一体化反应；在构建组合文库时，对于每一个排列顺序，为一个酶切连接一体化反应，即混合“长序列”和“短序列”时，需要根据不同的“长序列”排列顺序加入对应的“短序列”片段；

9)将8)中的质粒转化至高效价感受态细胞；

11)上述阳性克隆所得质粒DNA用于转化目的菌株。

以下两实施例都是按照该方法进行的，只是实施例1中“长序列”为LacZ基因中亚克隆至模块载体中的片段，“短序列”为LacZ基因中大小小于50bp的DNA片段；实施例2中“长序列”为不同的基因，“短序列”为各RBS。

实施例1.大肠杆菌MG1655LacZ基因的组装

本实施例通过LacZ基因的组装来验证OLMA技术的组装效率。

克隆用大肠杆菌DH5α购自北京全式金生物技术有限公司。LB固体或液体培养基(卡那霉素50μg/ml)用于所有模块载体pHD(pUC57△LacZ，即将LacZ基因敲除的pUC57)质粒的扩繁。LB液体培养基(卡那霉素50μg/ml)用于骨架载体pUC57△LacZ-ccdB(即LacZ基因敲除的pUC57，并在多克隆位点引入ccdB基因)的扩繁。在骨架载体上引入ccdB基因辅助筛选以提高阳性克隆率，且ccdB基因两端引入BsaI酶切位点。LacZ显色遵循常规IPTG和X-gal显色方法。

LacZ编码区序列同大肠杆菌MG1655基因组序列；全基因序列如SEQ ID NO.1所示，包括组成型启动子pJ23101,LacZ编码区(Genbank登记号为945006)和rrnB终止子，共3740bp，将该基因克隆至模块载体pUC57△LacZ中。LacZ基因的两端均引入II类限制性核酸内切酶BsaI位点，且两端酶切位点的黏性末端序列不同(图3a)，方便后期的组装；即一条“长序列”和两条“短序列”共3个DNA片段的组装。同时，将LacZ基因打断为7、9和11个DNA片段，分别包括3个长度均等的“长序列”和4个“短序列”(图3b)，4个长度均等的“长序列”和5个“短序列”(图3c)，5个长度均等的“长序列”和6个“短序列”(图3d)；且每个“长序列”片段的两个末端都引入了不同的BsaI识别位点，分别构建模块载体，最终通过本发明OLMA的方法组装为一条完整的LacZ基因。

基于上述组装策略，为每轮组装设计相对应的短链核苷酸链，作为接头来完成组装。若基因被分为n个片段，则需要(n+1)条短核苷酸链来辅助组装，每个相邻的DNA片段(基因的片段和短核苷酸链)的BsaI黏性末端同源互补，保证组装的正确性，并借助于LacZ的显色判断组装的正确性。结果表明，3、7、9和11个DNA片段的组装准确性分别达到了99.9％，95％，43％和10％。

表1.LacZ基因组装中所用“短序列”引物序列

实施例2.通过构建番茄红素生物合成组合文库来优化该通路

实验中所用大肠杆菌DH5α购自北京全式金生物技术有限公司，大肠杆菌感受态Trans-T1购自购自北京全式金生物技术有限公司。

在通路优化组合文库的构建中，选取并合成通路中4个关键基因，前三个基因crtE(PanE(SEQ ID NO.2),PagE(SEQ ID NO.3),PvaE(SEQ ID NO.4),RspE(SEQ ID NO.5)),crtB(PanB(SEQ ID NO.6),PagB(SEQ ID NO.7),PvaB(SEQ ID NO.8),RspB(SEQ ID NO.9)),crtI(PanI(SEQ ID NO.10),PagI(SEQ ID NO.11),PvaI(SEQ ID NO.12),RspI(SEQ ID NO.13))，分别来自Pantoea ananatis，Pantoea agglomerans,Pantoea vagans C9-1,Rhodobacter sphaeroides 2.4.1；基因idi序列(SEQ ID NO.14)同大肠杆菌K12基因组序列，且番茄红素作为一个颜色报告基因来辅助筛选阳性克隆。所有基因序列内部的BsaI位点均无义突变；合成后的基因克隆至pHD(pUC57△LacZ)载体构建模块载体。如图4所示，crtE基因的黏性末端为ACGG，crtB基因的黏性末端为AATA，crtI基因的黏性末端为AAAC，idi基因的黏性末端为CAAA；idi基因只引入RBS参与调节，无其它来源的同源基因，构建骨架载体pYC1k-ccdB-idi(图6，载体全序列见SEQ ID NO.16)。对于每个基因，分别设计20条RBS。图5中演示了6种不同基因排列的顺序，并加入了RBS作为“短序列”组装上述基因的演示。通过OLMA技术实现上述各个基因和RBS的组装，连接产物转至大肠杆菌Trans-T1进行阳性克隆的筛选；阳性克隆混合抽提质粒转至DH5α，展现了不同强度的红色，用于后期番茄红素的产量检测。选取90个单克隆鉴定番茄红素的产量，结果显示，其产量范围在1.15to 11.24mg/g。基于OLMA构建高通量文库用于番茄红素合成通路优化，结果表明，基因的种属差异、RBS的强度以及基因组装的不同顺序都会在一定程度上影响该通路的表达，并能共同作用、平衡整条通路的基因表达。值得一提的是，OLMA技术的应用大大提升了通路优化的效率。

基于上述实验，解决了对一次性调节通路上多个基因的瓶颈问题，即多基因组装的通量化问题。引入“短序列”RBS，作为组装的接头，既实现了组装的功能，又发挥了该元件的调节作用。通过接头的黏性末端来决定不同的组装顺序，在一体化的酶切连接反应中实现通量构建质粒，进而实现通量优化代谢通路，为下游选择理想产量的菌株打下了良好的基础。

参考文献：

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Weber,E.,Gruetzner,R.,Werner,S.,Engler,C.,Marillonnet,S.,2011.Assembly of designer TAL effectors by Golden Gate cloning.PLoS One.6,e19722.。

Claims

1.一种由短链核苷酸介导的DNA组装方法，

I)“长序列”的合成：克隆待组装DNA片段作为“长序列”；

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于包括以下步骤：

6)“短序列”的准备：根据“长序列”的末端序列的4个碱基和组装顺序来设计长度小于50bp的正向和反向引物，引物合成后，退火形成3’黏性末端和5‘黏性末端的长度分别为4bp的双链DNA片段并磷酸化处理，作为“短序列”，其中短序列的3’黏性末端与其所连接的“长序列”的5’黏性末端互补，5’黏性末端则决定其排列顺序；

3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于步骤1)和步骤6)所述的“长序列”为基因或长度大于等于200bp的DNA片段；所述的“短序列”为小于等于50bp的序列，通过化学方法合成正向引物和反向引物，通过退火形成双链DNA分子。

4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于所述的待组装DNA片段为基因时，“短序列”可为上述基因的调控元件，优选启动子、RBS。

5.根据权利要求3所述的方法，其特征在于步骤1)通过PCR或者基因合成方法克隆序列内部所用到的II类限制性核酸内切酶位点已无义突变的“长序列”。

6.根据权利要求2所述的方法，其特征在于步骤3)中，对于不同种属来源的同一基因，使用同一套5’和3’黏性末端。

7.根据权利要求2所述的方法，其特征在于所述的方法还包括对步骤3)所得各“长序列”的模块载体进行测序，经鉴定基因序列和插入位点正确的质粒进入进一步操作。

8.根据权利要求2所述的方法，其特征在于步骤6)中若对于同一个待组装DNA片段需设计多个“短序列”，则该多个“短序列”使用同一套5’和3’黏性末端；只有当组装顺序变换时，5’黏性末端才会变化。

9.根据权利要求2所述的方法，其特征在于步骤7)中一体化反应的反应条件为10x(37℃/5min+16℃/10min)+37℃/15min+50℃/5min+80℃/5min。

10.根据权利要求2所述的方法，其特征在于所述的方法还包括：

8)对步骤7)中的反应产物进行质粒安全核酸酶处理；

9)将8)中的质粒转化至高效价感受态细胞；

11)上述阳性克隆所得质粒DNA用于转化目的菌株。

11.权利要求1～10中任一项所述的方法在构建组合文库中的应用。

12.权利要求1～10中任一项所述的方法在生物合成代谢通路的组合文库中的应用。

13.一种高通量优化代谢通路的方法，其特征在于利用权利要求1～10中任一项所述的DNA组装方法通量组装代谢通路上的各个基因，不同通路的目的产物通过特定的方法来检测。

14.根据权利要求13所述的方法，其特征在于“短序列”可包括启动子或RBS在内的调控元件。

15.根据权利要求13所述的方法，其特征在于“长序列”为基因或载体的复制起始原点。