CN109371007A - 一种快速简便的基因合成方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种快速简便的基因合成方法，包括如下步骤：将待合成基因序列分成若干正向寡核苷酸链和相对应的反向互补寡核苷酸链，相邻两条反向互补链之间相互错开4‑8nt，其余部分完全反向互补；合成正反寡核苷酸链；使用限制性内切酶酶切或PCR扩增线性化载体；正向寡核苷酸链和反向互补寡核苷酸链分别混合，退火，得到含有多个缺刻的双链DNA片段；将缺刻的双链DNA片段与线性化载体混合，利用T4连接酶将多个双链DNA片段与目标载体连接成环；将步骤五中连接产物转移至感受态细胞，菌检，测序验证。本发明无需经过PCR及胶回收纯化的过程，大大减少了因步骤繁多带来的人为错误和交叉污染，节约了时间和成本。
Description
技术领域
本发明涉及基因工程领域，具体是一种快速简便的基因合成方法。
背景技术
随着计算机、生物信息、基因测序等技术的不断发展，使全基因乃至基因组人工合成 成为可能，基因合成是指运用生物学方法在体外合成所需DNA双链的技术，它不仅可以对已有基因进行改造，还能创造出自然界中不存在的基因，即“改造生命”和“人造生命”。
目前基因的从头合成的主要方法是基于PCR技术的聚合酶循环组装PCA(Polymerase cycling assembly)法，PCA法需将基因序列正向链与其反向互补链分别分割成多个寡核苷酸 链(40-80nt)，且相邻的正向与反向寡核苷酸链之间有15-25nt的重叠区，利用重叠延 伸PCR技术原理将含有同源序列的DNA连接在一起，并在DNA聚合酶的作用下延伸， 最终获得基因全序列。这种方法虽然成本较低，原理简单易用，但缺陷明显，如整个流程 操作繁琐，需要经过PCR反应、产物回收、组装载体、转化等操作；对于复杂DNA序列 (高GC、高AT、重复序列、Poly结构、回文结构)，往往因PCR难以扩增而导致合成 失败；由于PCR中酶的保真性、离子浓度、循环条件等因素的影响，及PCR本身会将引 物中错误渗入的碱基放大而导致合成的错误率较高。
本发明基于上述PCA法缺陷，提供了一种快速简便基因合成的方法。
发明内容
本发明的目的在于提供一种快速简便的基因合成方法，以解决上述背景技术中提出的 问题。
为实现上述目的，本发明提供如下技术方案：
一种快速简便的基因合成方法，包括如下步骤：
步骤一将待合成基因序列分成若干正向寡核苷酸链和相对应的反向互补寡核苷酸链， 相邻两条反向互补链之间相互错开4-8nt，其余部分完全反向互补。
步骤二合成步骤一中正反寡核苷酸链。
步骤三使用限制性内切酶酶切或PCR扩增线性化载体。
步骤四将步骤三中正向寡核苷酸链和反向互补寡核苷酸链分别混合，退火，得到含 有多个缺刻的双链DNA片段。
步骤五将步骤四得到的缺刻的双链DNA片段与步骤三得到的线性化载体混合，利用 T4连接酶将多个双链DNA片段与目标载体连接成环。
步骤六将步骤五中连接产物转移至感受态细胞，菌检，测序验证。
步骤四中，退火过程中加入的正向寡核苷酸链和反向互补寡核苷酸链的量相同。
步骤五中，连接过程中加入的多个缺刻的双链DNA片段量相同，线性化载体浓度为10-50ng/μL。
步骤四中退火过程，按照如下体系在0.2mL PCR管内配置组装反应。反应体系按如下进行配制：
退火过程，具体包括以下步骤：将5μL正向寡核苷酸片段，5μL反向互补寡核苷酸片段，2.5μL 10×TH Buffer，补水至25μL，加入到200μL PCR管中，混合瞬离后，置 于PCR仪上98℃变性10min，缓慢冷却至室温。
步骤五中连接过程，按照如下体系在0.2mL PCR管内配置组装反应。反应体系按如下进行配制：
连接过程，具体包括以下步骤：将从步骤四中得到的含有多个缺刻的双链DNA片段各取2μL，加入2μL 10×T4Buffer，1μL T4ligase，0.5-1μL线性化载体，补充水至20μL， 22℃反应30min。
与现有技术相比，本发明的有益效果是：
本发明不仅能用于普通基因的合成，同样适用于因高GC、高AT、高重复序列、Poly结构等PCR难以扩增而导致的基因合成低效的困难基因的合成；相较于基于PCR的基 因合成法，本发明无需经过PCR及胶回收纯化的过程，大大减少了因步骤繁多带来的人 为错误和交叉污染，同时也节约了时间；正反寡核苷酸链在合成之初已经5’磷酸化处理， 无需在连接过程中再用磷酸化酶处理，规避了磷酸化酶及其缓冲液中离子浓度对连接反 应的影响，同时也节约了成本。总之，本发明是一种快速简便，适用范围较广的基因合 成方法。
说明书附图
图1所示为实施例1的随机挑选8个菌落的菌检图，菌检引物为载体引物M13-47/48。
图2所示为实施例2的随机挑选8个菌落的菌检图，菌检引物为载体引物M13-47/48。
图3所示为实施例3的随机挑选8个菌落的菌检图，菌检引物为载体引物M13-47/48。
图4所示为实施例4的随机挑选8个菌落的菌检图，菌检引物为载体引物M13-47/48。
图5所示为实施例1的测序结果。
图6所示为实施例2的测序结果。
图7所示为实施例3的测序结果。
图8所示为实施例4的测序结果。
具体实施方式
下面将结合说明书附图及具体实施例对本发明做进一步阐述。
实施案例1
本实施合成的是一段505bp的普通基因序列。
本实施例的具体过程如下：
1)用软件将该基因分割成8对60-100nt的正向寡核苷酸链及其对应的反向互补寡核 苷酸链，第一个正向寡核苷酸链的5’端多出与Xba I的粘性末端互补的4个碱基，最后一个反向互补寡核苷酸链的5’端多出与HindIII粘性末端互补的4个碱基，相邻两条寡核苷酸之间相互错开5nt，合成并进行5’端磷酸化修饰；
2)按照如下体系在0.2mL PCR管内配置组装反应。反应体系按如下进行配制：
将上述反应体系混合后瞬时离心，置于PCR仪上98℃变性10min，缓慢冷却至室温。
3)连接过程按照如下体系在0.2mL PCR管内配置组装反应。反应体系如下：
将上述反应体系混合后瞬时离心，置于PCR仪上22℃反应30min。
4)将步骤3中的连接产物转移至DH5a感受态细胞中
A.在2mL离心管中加入50μL冰上融化的DH5a感受态细胞和5μL连接产物，轻 轻混匀。
B.将离心管在冰上放置30min后，于42℃水浴中热激60s，立即将离心管置于冰 上冷却2min。
C.加入600μL LB液体培养基，轻轻混匀，37℃，200rpm，恒温振荡培养45min。
D.5000rpm离心5min，留200μL菌液涂于IPTG及X-gal的LB固体培养基上， 其中固体培养基中含50mg/L氨苄霉素。
E.涂板正放于37℃恒温箱中5min，再倒置培养12h长出单克隆。
5)重组克隆的鉴定
挑取多个单克隆于4mL LB液体培养基中，其中液体培养基中含50mg/L氨苄霉素，37℃振荡培养12h至菌液浑浊，如图1所示，阳性率为100％，抽提质粒测序全部正确， 测序图谱如图6所示。
实施案例2
本实施合成的是一段260bp，含有高度重复的基因序列。
本实施例的具体过程如下：
1)用软件将该基因分割成3对80-100nt的正向寡核苷酸链及其对应的反向互补寡核 苷酸链，第一个正向寡核苷酸链的5’端多出与Xba I的粘性末端互补的4个碱基，最后一个反向互补寡核苷酸链的5’端多出与HindIII粘性末端互补的4个碱基，相邻两条寡核苷酸之间相互错开5nt，送去合成，5’端磷酸化修饰；
2)同实施案例1步骤(2)。
3)同实施案例1步骤(3)。
4)将步骤3中的连接产物转移至DH5a中，同实施案例1步骤(4)。
5)重组克隆的鉴定
挑取多个单克隆于4mL LB液体培养基中，其中液体培养基中含50mg/L氨苄霉素，37℃振荡培养12h至菌液浑浊，如图2所示，阳性率为100％，抽提质粒测序全部正确， 测序图谱如图7所示。
实施案例3
本实施合成的是一段259bp，GC含量为81％的基因。
1)用软件将该基因分割成3对60-80nt的正向寡核苷酸链及其对应的反向互补寡核苷 酸链，第一个正向寡核苷酸链的5’端多出与Xba I的粘性末端互补的4个碱基，最后一个 反向互补寡核苷酸链的5’端多出与HindIII粘性末端互补的4个碱基，相邻两条寡核苷酸 之间相互错开5nt，送去合成，5’端磷酸化修饰。
2)同实施案例1步骤(2)。
3)同实施案例1步骤(3)。
4)将步骤3中的连接产物转移至DH5a中，同实施案例1步骤(4)。
5)重组克隆的鉴定
挑取多个单克隆于4mL LB液体培养基中，其中液体培养基中含50mg/L氨苄霉素，37℃振荡培养12h至菌液浑浊，如图3所示，阳性率为100％，抽提质粒测序全部正确， 测序图谱如图8所示。
实施案例4
本实施合成的是一段348bp，AT含量为78％的基因序列。
1)用软件将该基因分割成4对60-80nt的正向寡核苷酸链及其对应的反向互补寡核苷 酸链，第一个正向寡核苷酸链的5’端多出与Xba I的粘性末端互补的4个碱基，最后一个 反向互补寡核苷酸链的5’端多出与HindIII粘性末端互补的4个碱基，相邻两条寡核苷酸 之间相互错开5nt，合成并进行5’端磷酸化修饰。
2)同实施案例1步骤(2)。
3)同实施案例1步骤(3)。
4)将步骤3中的连接产物转移至DH5a中，同实施案例1步骤(4)。
5)重组克隆的鉴定
挑取多个单克隆于4mL LB液体培养基中，其中液体培养基中含50mg/L氨苄霉素，37℃振荡培养12h至菌液浑浊，如图4所示，阳性率为100％，抽提质粒测序全部正确。
四个实施例核苷酸序列信息说明如下：
(1)实施例1中的大小为505bp基因序列:
(2)实施例2中高度重复的260bp基因序列:
(3)实施例3中GC含量为81％的259bp基因序列:
(4)实施例4中AT含量为78％的348bp基因序列:
Claims (5)
1.一种快速简便的基因合成方法，其特征在于，包括如下步骤：
步骤一 将待合成基因序列分成若干正向寡核苷酸链和相对应的反向互补寡核苷酸链，相邻两条反向互补链之间相互错开4-8nt，其余部分完全反向互补；
步骤二 合成步骤一中正反寡核苷酸链；
步骤三 使用限制性内切酶酶切或PCR扩增线性化载体；
步骤四 将步骤三中正向寡核苷酸链和反向互补寡核苷酸链分别混合，退火，得到含有多个缺刻的双链DNA片段；
步骤五 将步骤四得到的缺刻的双链DNA片段与步骤三得到的线性化载体混合，利用T4连接酶将多个双链DNA片段与目标载体连接成环；
步骤六 将步骤五中连接产物转移至感受态细胞，菌检，测序验证。
2.根据权利要求1所述的快速简便的基因合成方法，其特征在于，步骤四中，退火过程中加入的正向寡核苷酸链和反向互补寡核苷酸链的量相同。
3.根据权利要求1所述的快速简便的基因合成方法，其特征在于，步骤五中，连接过程中加入的多个缺刻的双链DNA片段量相同，线性化载体浓度为10-50ng/μL。
4.根据权利要求1所述的快速简便的基因合成方法，其特征在于，步骤四中退火过程，具体包括以下步骤：将5μL正向寡核苷酸片段，5μL反向互补寡核苷酸片段，2.5μL 10×THBuffer，补水至25μL，加入到200μL PCR管中，混合瞬离后，置于PCR仪上98℃变性10min，缓慢冷却至室温。
5.根据权利要求1所述的快速简便的基因合成方法，其特征在于，步骤五中连接过程，具体包括以下步骤：将从步骤四中得到的含有多个缺刻的双链DNA片段各取2μL，加入2μL10×T4 Buffer，1μL T4 ligase，0.5-1μL线性化载体，补充水至20μL，22℃反应30min。
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