CN103205449B - 一种使用通用缓冲液快速克隆基因的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种使用通用缓冲液快速克隆基因的方法，属于基因克隆技术领域。本发明方法首先配制一种通用缓冲液，Taq DNA聚合酶和T4噬菌体DNA连接酶在该缓冲液中都具有酶活性。将待连接的DNA双链分子加入通用缓冲液中，用Taq DNA聚合酶对DNA做加A处理后，再直接加入T4噬菌体DNA连接酶和线性载体，得到连接产物，进行转化后完成克隆反应。本发明方法省略了Taq DNA聚合酶和T4噬菌体DNA连接酶反应之间DNA分子核酸的纯化步骤，极大提高了实验效率。
Description
技术领域
本发明涉及一种使用通用缓冲液快速克隆基因的方法，属于基因克隆领域。
背景技术
遗传工程涉及大量将DNA片段在不同的物种或细胞间转移的操作，其中一个基本的步骤，就是将得到的DNA片段——无论它们是经过PCR扩增还是别的手段产生——插入到克隆载体中形成重组质粒。该重组质粒能够在细胞或者微生物的体内增殖，使得该DNA片段能长期保存，扩增，以便于后续研究。
1991年，Holton.T.A和Graham M.W.等发明了“T-A”克隆方法。其原理是，用taq DNA聚合酶扩增的DNA，其3端都有突出一个腺嘌呤脱氧核苷酸（简称A）；因此，研究人员研制出一种3端有突出一个胸腺嘧啶脱氧核苷酸（简称T）的线性载体。载体和PCR产物的末端形成一对互补碱基，经T4DNA连接酶作用，两个线性DNA分子形成一个闭合的环状分子。这种闭合的环状分子成功转化感受态的大肠杆菌后，就能得到稳定的重组质粒。这种预制的线性载体被称简称为T载体。T载体的使用大大提高了DNA的连接效率，长期以来得到广泛的使用，但是也有几个明显的缺点：
第一，连接时间长。为了在转化后得到更多的克隆数和更高的阳性率，通常T载体和插入片段需要用T4DNA连接酶在室温连接12-16个小时。这一步花费了很长的实验时间。
第二，只有taq DNA聚合酶扩增的DNA片段带有悬挂的A，而对高保真DNA聚合酶的扩增产物，是不含悬挂A的平端PCR产物。这类DNA分子需要用taq酶处理，使其3端加上一个腺嘌呤脱氧核苷酸，才能和T载体连接（通常简称为加A反应）。因此，在用T4噬菌体DNA连接酶作用之前，平端PCR产物要经过加A反应和核酸纯化两个步骤。这两步操作耗时长达3－5个小时，同时也损耗了一部分DNA，极大地降低了克隆效率。
上述的加A反应和连接反应，必须经过两步处理，是因为加A反应使用的taq DNA聚合酶，反应缓冲液最佳pH在8.3－9.0之间，连接反应使用的T4噬菌体DNA聚合酶，反应缓冲液最佳pH在7.5－8.0之间。这两种酶在对方的工作缓冲液都没有活性。因此，针对上述缺点，我们产生了本发明。
发明内容
本发明的目的是提出一种使用通用缓冲液快速克隆基因的方法，使用一种通用缓冲液，将双链DNA片段快速连接到克隆载体上，省略已有的两个酶反应之间DNA分子的核酸的纯化步骤，以提高实验效率。
本发明提出的使用通用缓冲液快速克隆基因的方法，包括以下步骤：
（1）制备一种通用缓冲液，该通用缓冲液中各组分的摩尔浓度为：
三羟甲基氨基甲烷（Tris），浓度为250－500毫摩尔/升，
氯化镁（MgCl2），浓度为10－20毫摩尔/升，
二硫苏糖醇（DTT），浓度为10－20毫摩尔/升，
三磷酸腺嘌呤脱氧核苷酸（ATP），浓度为5—10毫摩尔/升，
三磷酸腺嘌呤脱氧核苷酸（dATP），浓度为100－200微摩尔/升，
氯化六氨合高钴（Hexamminecobalt(III)Chloride），浓度为50—100微摩尔/升，
用盐酸将通用缓冲液的pH值调至8.0；
（2）用高保真DNA聚合酶（如pfu DNA polymerase）通过聚合酶链式反应（PCR）得到双链DNA片段溶液；
（3）取2微升步骤（1）的通用缓冲液，加入5微升步骤（2）得到的双链DNA溶液，再加入1微升体积浓度为3单位/微升的Taq DNA聚合酶，在68－74℃下作用5—10分钟，形成含有3末端含有未配对的三磷酸腺嘌呤脱氧核苷酸（dATP）的粘端DNA分子溶液；
（4）在步骤（3）的反应体系中加入1微升浓度为50纳克/微升的三磷酸胸腺嘧啶脱氧核苷酸载体（T载体）和1微升浓度为5单位/微升的T4噬菌体DNA连接酶，室温下反应5－30分钟，使粘端DNA分子和载体DNA分子形成环状的DNA质粒，成为连接产物；
（5）取5微升步骤（4）得到的连接产物，置于50微升感受态大肠杆菌细胞溶液，冰浴30分钟，在42℃热处理90秒，冰浴2分钟，再加入200－500微升细菌液体培养基，在37℃摇床上以200转/分的速度培养45分钟后，从中取出200－400微升菌液涂布于含有1毫克异丙基β—D—硫代半乳糖苷（IPTG）和0.8毫克5-溴-4-氯-3-吲哚-6-D-半乳糖苷（Xgal）的固体培养基平板上，在37℃温箱培养12－16小时，在平板上克隆出白色和蓝色的大肠杆菌细菌菌落。
本发明提出的使用通用缓冲液快速克隆基因的方法，其优点是：
（1）本发明方法中配制和使用的通用缓冲液，其中含有Taq DNA聚合酶和T4噬菌体DNA连接酶，这两种酶在本溶液中都单独具有活性。因此，如果一个DNA双链分子要经过两个酶处理，这两个酶可以先后加入同一个缓冲液中，不需要在两步酶处理反应之间对DNA做纯化处理，这样不仅节省了近1-3个小时的操作时间，而且也减少了DNA在纯化过程中的损耗。
（2）传统的T4噬菌体DNA连接酶缓冲液反应时间比较长，需要的实验条件从几个小时到几十个小时不等，而聚乙二醇，六氨合高钴等添加剂加入到T4噬菌体DNA连接酶的工作缓冲液中，能极大的缩短反应时间。将这类添加剂加入到通用缓冲液中，更进一步缩短了克隆连接的时间。
（3）使用本发明方法得到的连接产物，进行转化后的分析表明，无论转化子的数目，蓝白斑的比例，白斑的阳性率，都能达到传统的克隆反应的结果，极大提高了实验效率。
具体实施方式
本发明提出的使用通用缓冲液快速克隆基因的方法，包括以下步骤：
（1）制备一种通用缓冲液，该通用缓冲液中各组分的摩尔浓度为：
三羟甲基氨基甲烷（Tris），浓度为250－500毫摩尔/升，
氯化镁（MgCl2），浓度为10－20毫摩尔/升，
二硫苏糖醇（DTT），浓度为10－20毫摩尔/升，
三磷酸腺嘌呤脱氧核苷酸（ATP），浓度为5—10毫摩尔/升，
三磷酸腺嘌呤脱氧核苷酸（dATP），浓度为100－200微摩尔/升，
氯化六氨合高钴（Hexamminecobalt(III)Chloride），浓度为50—100微摩尔/升，
用盐酸将通用缓冲液的pH值调至8.0；
（2）用高保真DNA聚合酶（如pfu DNA polymerase）通过聚合酶链式反应（PCR）得到双链DNA片段溶液；
（3）取2微升步骤（1）的通用缓冲液，加入5微升步骤（2）得到的双链DNA溶液，再加入1微升体积浓度为3单位/微升的Taq DNA聚合酶，在68－74℃下作用5—10分钟，形成含有3末端含有未配对的三磷酸腺嘌呤脱氧核苷酸（dATP）的粘端DNA分子溶液；
（4）在步骤（3）的反应体系中加入1微升浓度为50纳克/微升的三磷酸胸腺嘧啶脱氧核苷酸载体（T载体）和1微升浓度为5单位/微升的T4噬菌体DNA连接酶，室温下反应5－30分钟，使粘端DNA分子和载体DNA分子形成环状的DNA质粒，成为连接产物；
（5）取5微升步骤（4）得到的连接产物，置于50微升感受态大肠杆菌细胞溶液，冰浴30分钟，在42℃热处理90秒，冰浴2分钟，再加入200－500微升细菌液体培养基，在37℃摇床上以200转/分的速度培养45分钟后，从中取出200－400微升菌液涂布于含有1毫克异丙基β—D—硫代半乳糖苷（IPTG）和0.8毫克5-溴-4-氯-3-吲哚-6-D-半乳糖苷（Xgal）的固体培养基平板上，在37℃温箱培养12－16小时，在平板上克隆出白色和蓝色的大肠杆菌细菌菌落。
以下结合具体实施例，对本发明方法作进一步说明，但不作为对本发明的限制。
实施例1：比较通用缓冲液和其它缓冲液对平端PCR产物连接到T载体的效率
（1）制备通用缓冲液，含有下列成份：三羟甲基氨基甲烷（Tris）浓℃是250毫摩尔/升，氯化镁（MgCl2）浓℃是10毫摩尔/升，二硫苏糖醇（DTT）浓℃是10毫摩尔/升，三磷酸腺苷（ATP）浓℃是5毫摩尔/升，三磷酸脱氧腺苷（dATP）浓℃是100微摩尔/升，氯化六氨合高钴（Hexamminecobalt(III)Chloride）是50微摩尔/升。将溶液分成5份，分别用盐酸将溶液的pH值调整为7.6，7.8，8.0，8.2，8.4；
制备taq DNA聚合酶的工作缓冲液，其成份为：三羟甲基氨基甲烷（Tris浓℃是500毫摩尔/升，氯化镁（MgCl2）浓℃是10毫摩尔/升，氯化钾（KCl）浓℃是50毫摩尔/升，三磷酸脱氧腺苷（dATP）浓℃是100微摩尔/升，盐酸将溶液的pH值调整为8.3。
制备T4DNA聚合酶的工作缓冲液，其成份为：三羟甲基氨基甲烷（Tris）浓℃是200毫摩尔/升，氯化镁（MgCl2）浓℃是20毫摩尔/升，二硫苏糖醇（DTT）浓℃是50毫摩尔/升,三磷酸腺苷（ATP）浓℃是5毫摩尔/升，用盐酸将溶液的pH值调整为7.6；
（2）用高保真DNA聚合酶（pfu DNA polymerase）通过聚合酶链式反应（PCR）制备长度为1kb的平端双链DNA分子，整个反应体系中依次加入下列物质：19微升去离子水，25微升含有pfu DNA聚合酶的预制PCR反应液，2.5微升浓度为10微摩尔/升的上游引物（其序列为5－CCGGTACCTCTGCTGAAGCCAGTTACCTTC－3），取2.5微升浓度为10微摩尔/升的下游引物（其序列为5－CCGGTACCCAAATATGTATCCGCTCATG－3），1毫升浓度为10纳克/毫升的质粒pet28a溶液。聚合酶链式反应的反应条件为94℃下反应5分钟，9℃下反应30秒，5℃下反应30秒，7℃下反应90秒，共30个循环，7℃下延伸10分钟。反应得到1000个碱基长度的双链DNA片段，经过琼脂糖凝胶电泳，进行胶回收，定量为60纳克/微升；
（3）将步骤（1）制备的七种缓冲液各取2微升，加入5微升步骤（2）得到的双链DNA溶液，再加入1微升体积浓度为3单位/微升的Taq DNA聚合酶，在72℃下作用10分钟，形成含有3末端含有未配对的三磷酸腺嘌呤脱氧核苷酸（dATP）的粘端DNA分子溶液，置于冰上，
（4）在步骤（3）的反应体系中加入1微升浓度为50纳克/微升的三磷酸胸腺嘧啶脱氧核苷酸载体（T载体）和1微升浓度为5单位/微升的T4噬菌体DNA连接酶，室温下反应30分钟，使粘端DNA分子和载体DNA分子形成环状的DNA质粒，成为连接产物；
（5）取5微升步骤（4）得到的连接产物，置于50微升感受态大肠杆菌细胞溶液，冰浴30分钟，在42℃热处理90秒，冰浴2分钟，再加入200－500微升细菌液体培养基，在37℃摇床上以200转/分的速度培养45分钟后，从中取出200－400微升菌液涂布于含有1毫克异丙基β—D—硫代半乳糖苷（IPTG）和0.8毫克5-溴-4-氯-3-吲哚-6-D-半乳糖苷（Xgal）的固体培养基平板上，在37℃温箱培养12－16小时，在平板上会长出白色和蓝色的细菌菌落
（6）对步骤（5）的平板上的克隆进行计数。如果平板上白斑个数超过20，则每个平板上各挑取20个白色克隆。如果平板上白斑个数不足20，则挑取所以白斑。采用天根的菌落PCR鉴定试剂盒进行鉴定。扩增产物中含有特异性的为阳性克隆，没有扩增产物或者扩增产物长度不同的克隆为阴性克隆。
表一各种pH值下的克隆效果(值取3次平均)
| pH值 | 克隆数（白斑+蓝斑） | 阳性克隆率 |
| taq DNA聚合酶缓冲液 | 0 | 0 |
| T4DNA聚合酶缓冲液 | 22+6 | 33% |
| 通用缓冲液（7.6） | 5+4 | 20% |
| 通用缓冲液（7.8） | 11+8 | 60% |
| 通用缓冲液（8.0） | 78+23 | 80% |
| 通用缓冲液（8.2） | 13+17 | 45% |
| 通用缓冲液（8.4） | 1+2 | 0 |
结论是pH为8的左右通用缓冲液，能兼顾两种酶的活性。其克隆数，阳性率都比较好。
实施例2：比较传统方法和本发明将平端PCR产物连接到T载体的效率
（1）制备通用缓冲液，含有下列成份：三羟甲基氨基甲烷（Tris）浓度是250毫摩尔/升，氯化镁（MgCl2）浓℃是10毫摩尔/升，二硫苏糖醇（DTT）浓度是10毫摩尔/升，三磷酸腺苷（ATP）浓度是5毫摩尔/升，三磷酸脱氧腺苷（dATP）浓度是100微摩尔/升，氯化六氨合高钴（Hexamminecobalt(III)Chloride）是50微摩尔/升。用盐酸将溶液的pH值调整为8.0，
制备taq DNA聚合酶的工作缓冲液，含有下列成份：三羟甲基氨基甲烷（Tris）浓℃是500毫摩尔/升，氯化镁（MgCl2）浓度是10毫摩尔/升，氯化钾（KCl）浓度是50毫摩尔/升，三磷酸脱氧腺苷（dATP）浓度是100微摩尔/升，盐酸将溶液的pH值调整为8.3，
制备T4DNA聚合酶的工作缓冲液，其成份为：三羟甲基氨基甲烷（Tris）浓度是200毫摩尔/升，氯化镁（MgCl2）浓度是20毫摩尔/升，二硫苏糖醇（DTT）浓度是50毫摩尔/升,三磷酸腺苷（ATP）浓度是5毫摩尔/升，用盐酸将溶液的pH值调整为7.6；
（2）用高保真DNA聚合酶（pfu DNA polymerase）通过聚合酶链式反应（PCR）制备长度为1kb的平端双链DNA分子，整个反应体系中依次加入下列物质：19微升去离子水，25微升含有pfu DNA聚合酶的预制PCR反应液，2.5微升浓度为10微摩尔/升的上游引物（其序列为5－CCGGTACCTCTGCTGAAGCCAGTTACCTTC－3），2.5微升浓度为10微摩尔/升的下游引物（其序列为5－CCGGTACCCAAATATGTATCCGCTCATG－3），1毫升浓度为10纳克/毫升的质粒pET28a溶液作为模板。聚合酶链式反应的反应条件为94℃下反应5分钟，94℃30秒，55℃下30秒，72℃90秒，共30个循环，72℃延伸10分钟。反应得到1000个碱基长度的双链DNA片段，经过琼脂糖凝胶电泳，进行胶回收，定量为60纳克/微升；
（3）按照传统方法进行加A反应和连接：取4微升步骤（1）制备的taq DNA聚合酶的工作缓冲液，加入15微升步骤（2）得到的双链DNA溶液，1微升体积浓度为3单位/微升的Taq DNA聚合酶，在72℃下作用30分钟，形成含有3末端含有未配对的三磷酸腺嘌呤脱氧核苷酸（dATP）的粘端DNA分子溶液。将反应产物进行用浓度为1%的琼脂糖凝胶(含有1ug/毫升的溴化乙啶)进行DNA电泳，电压为120伏，电泳时间30—60分钟，然后在紫外灯下将1000个碱基的目的条带切下来，用天根公司生产的核酸琼脂糖凝胶回收试剂盒进行后续处理，得到30微升浓度为15纳克/微升的DNA溶液。取该DNA溶液6ul，加入到2微升步骤（1）制备的T4DNA连接酶工作缓冲液中，再加入1微升浓度为50纳克/微升的三磷酸胸腺嘧啶脱氧核苷酸载体（T载体）和1微升浓度为5单位/微升的T4噬菌体DNA连接酶，室温下反应2－4小时，使粘端DNA分子和载体DNA分子形成环状的DNA质粒，成为连接产物；
（4）按照本发明进行加A反应和连接：取2微升步骤（1）制备的通用缓冲液，加入5微升步骤（2）得到的双链DNA溶液，再加入1微升体积浓度为3单位/微升的Taq DNA聚合酶，在72℃下作用10分钟，形成含有3末端含有未配对的三磷酸腺嘌呤脱氧核苷酸（dATP）的粘端DNA分子溶液，再加入1微升浓度为50纳克/微升的三磷酸胸腺嘧啶脱氧核苷酸载体（T载体）和1微升浓度为5单位/微升的T4噬菌体DNA连接酶，室温下反应30分钟，使粘端DNA分子和载体DNA分子形成环状的DNA质粒，成为连接产物；
（5）分别取5微升步骤（3）和（4）得到的连接产物，各种进行细菌转化实验。具体步骤为将DNA分子置于50微升感受态大肠杆菌细胞溶液，冰浴30分钟，在42℃热处理90秒，冰浴2分钟，再加入200－500微升细菌液体培养基，在37℃摇床上以200转/分的速度培养45分钟后，从中取出200－400微升菌液涂布于含有1毫克异丙基β—D—硫代半乳糖苷（IPTG）和0.8毫克5-溴-4-氯-3-吲哚-6-D-半乳糖苷（Xgal）的固体培养基平板上，在37℃温箱培养12－16小时，在平板上会长出白色和蓝色的细菌菌落；
（6）对步骤（5）的平板上的克隆进行计数，并挑取20个白色菌落，用天根的菌落PCR鉴定试剂盒进行鉴定。
表二两种方法对基因克隆的效果比较(值取3次平均)
| pH值 | 克隆数（白斑+蓝斑） | 阳性克隆率 |
| 传统的分步法 | 127+16 | 80% |
| 通用缓冲液法 | 73+24 | 77% |
上述实施例中使用的试剂和材料，可以由天根生化科技北京有限公司生产和提供。
Claims (1)
1.一种使用通用缓冲液快速克隆基因的方法，其特征在于，该方法包括以下步骤：
(1)制备通用缓冲液，所述的通用缓冲液含有下列成份：三羟甲基氨基甲烷的浓度是250毫摩尔/升，氯化镁的浓度是10毫摩尔/升，二硫苏糖醇的浓度是10毫摩尔/升，dATP的浓度是5毫摩尔/升，ATP的浓度是100微摩尔/升，氯化六氨合高钴的浓度是50微摩尔/升，用盐酸将通用缓冲液的pH值调整为8.0；
(2)用高保真DNA聚合酶通过聚合酶链式反应得到双链DNA片段溶液；
(3)取2微升步骤(1)的通用缓冲液，加入5微升步骤(2)得到的双链DNA片段溶液，再加入1微升体积浓度为3单位/微升的Taq DNA聚合酶，在68－74℃下作用5—10分钟，使溶液中的DNA分子对3’末端形成未配对的腺嘌呤脱氧核糖核苷酸的粘尾；
(4)在步骤(3)的反应体系中加入1微升浓度为50纳克/微升的T载体和1微升浓度为5单位/微升的T4噬菌体DNA连接酶，室温下反应30分钟，使粘端DNA分子和载体DNA分子形成环状的DNA质粒，成为连接产物；
(5)取5微升步骤(4)得到的连接产物，置于50微升感受态大肠杆菌细胞溶液，冰浴30分钟，在42℃热处理90秒，冰浴2分钟，再加入200－500微升细菌液体培养基，在37℃摇床上以200转/分的速度培养45分钟后，从中取出200－400微升菌液涂布于含有1毫克X-Gal和0.8毫克IPTG的固体培养基平板上，在37℃温箱培养12－16小时，在平板上克隆出白色和蓝色的大肠杆菌细菌菌落。
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