CN106906233A - 一种基于CcdB致死基因和SmaI酶切位点的酶切连接共体系同时进行的方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种基于ccdB致死基因和SmaI酶切位点的酶切连接共体系同时进行的方法。将ccdB基因插入载体pUC18的EcoRI和HindIII位点之间，得到pUC18‑ccdB质粒，然后将pUC18‑ccdB质粒、DNA片段、限制性内切酶SmaI、T4连接酶、T4连接酶buffer和水混合形成反应体系进行反应，由此得到连接产物。本发明以常见的pUC18载体为骨架载体，结合ccdB致死基因的筛选机制以及ccdB致死基因内部含有的SmaI酶切位点，构建出一套快速、高效、低背景的克隆方法，无需对ccdB重组载体及PCR产物进行双酶切及胶回收等步骤，可以直接将PCR产物连接到克隆载体，效率高，整个时间控制在20分钟以内，极大地减少了实验成本，加快了实验进度，该克隆体系具有极为广阔的应用前景。

Description

一种基于CcdB致死基因和SmaI酶切位点的酶切连接共体系同 时进行的方法

技术领域

本发明属于生物化学与分子生物学领域，具体涉及一种基于CcdB致死基因和SmaI酶切位点的酶切连接共体系同时进行的方法。

背景技术

自1970年代初基因克隆技术问世至今，分子克隆已经成为现代分子生物学实验室最重要及最基本实验操作之一。通过体外PCR扩增反应得到的目的基因片段往往需要先连接至克隆载体，为序列测定、蛋白表达、亚细胞定位及转基因载体构建等后续分子生物学操作提供便利。相比于酶切PCR片段后直接连入目的载体，将PCR片段首先连入商业化的T-A克隆载体或平末端克隆载体显得简单、快速和高效。

pGEM-T载体系统是目前最为广泛使用的T-A克隆载体，由Promega公司生产。它的原理为pGEM-T载体在其5’端具有一个突出的dT(脱氧胸苷酸)，可以和经绝大部分Taq DNA聚合酶所扩增的PCR片段(其3’端被非特异性添加一个dA(脱氧腺苷酸))互补，在T4 DNA连接酶的辅助下，使PCR片段连接到pGEMT克隆载体中。然而，由于普通的Taq DNA聚合酶缺少3'到5'的核酸外切酶校正活性，导致Taq DNA聚合酶的保真性不高，错配率达到2.1X10^-4(Dunning et al.1988；Keohavong and Thilly 1989；McInerney et al.2014)，对后续的亚克隆、蛋白表达纯化，SNP分析及高通量测序等实验的准确性造成了极大的影响。

高保真DNA聚合酶的开发有效的弥补了Taq DNA聚合酶错赔率高的不足，目前常用的高保真DNA聚合酶有Phusion-HF(Thermo Scientific)、Q5(NEB)、KOD(TOYOBO)、PrimeSTAR(Takara)及Pfu DNA聚合酶(Promega)等，该类DNA聚合酶具有3'到5'的核酸外切酶校正活性，能够切除PCR延伸反应中错配到3'端的碱基，具有极低的碱基错配率，从而保证了PCR反应的高保真性。为了确保扩增片段的精准性，研究者通常选择高保真DNA聚合酶作为基因扩增的首选DNA聚合酶。经高保真DNA聚合酶扩增得到的PCR片段均为平末端，无法直接用于T-A克隆，需将平末端PCR片段进行加A处理后才能连入T载体，费时费力，而商业化的平末端载体可以直接连接平末端PCR片段，从而深受研究者的喜爱。

为了有效的鉴定插入PCR片段的重组质粒，众多的筛选策略被提出，其中以蓝白斑筛选应用最为广泛。蓝白斑筛选以缺失LacZΔM15的大肠杆菌为宿主细胞，因外源质粒本身携带LacZα基因并带有一系列的多克隆位点，空载体情况下，形成“α-互补”，在IPTG的诱导下，大肠杆菌表达β－半乳糖苷酶活性，分解X-gal从而形成蓝色物质；反之当质粒的多克隆位点被外源片段插入后，LacZα基因的正常表达受到破坏，菌落显示为白色(Slilaty andLebel 1998)。然而这种方法在实际操作中往往存在假阴性(含有插入片段的蓝色菌落)和假阳性(未含有插入片段的白色菌落)的问题(Slilaty and Lebel 1998)，且对IPTG和X-gal的需求加重了实验成本，此外显示反应常常需要额外的时间(Cheong et al.2009)。为了克服蓝白斑筛选的不足，一种新型的通过阻断致死基因ccdB表达来进行阳性克隆筛选的技术被开发出来(Bernard et al.1994)。

Ccd(control of cell death)系统位于细菌的F质粒上，是研究最为深入的一种毒素-抗毒素系统(toxin-antitoxin system，TA系统)(Mruk and Kobayashi 2014)。该系统编码两个蛋白，分别是由101个氨基酸组成的CcdB毒性蛋白和由72个氨基酸组成的CcdA解毒蛋白。CcdB通过阻断细菌促旋酶-DNA复合体的活性，导致DNA复制的终止，从而影响基因的表达来发挥致死功能。抗毒素CcdA通过紧密结合CcdB形成蛋白复合体来解除毒性。Bernard和Couturier发现，当大肠杆菌的GyrA蛋白上的第462位的精氨酸(Arg)突变为半胱氨酸(Cys)后，大肠杆菌表现出对CcdB的毒性耐受，即CcdB不致死(Bernard and Couturier1992)。基于此思路，大量的以ccdB致死基因作为筛选的质体载体被构建出来。其原理为将插入ccdB致死基因的重组质粒在突变的大肠杆菌中保存(例如DB3.1大肠杆菌)，当外源PCR片段插入重组质粒的ccdB基因中，导致ccdB基因读码框改变，丧失了对普通大肠杆菌(例如DH5α等)的毒性，而没有插入外源PCR片段的重组质粒ccdB发挥毒性作用，从而达到阳性筛选的目的。

目前ccdB致死基因已经被广泛应用于构建T-A克隆，平末端克隆等克隆载体(Huet al.2010；Weibel et al.2013)。

发明内容

本发明的目的是提供一种基于ccdB致死基因和SmaI酶切位点的酶切连接共体系同时进行的方法，该方法是一套快速、高效、低背景的克隆方法，无需对ccdB重组载体及PCR产物进行双酶切及胶回收等步骤，可以直接将PCR产物连接到克隆载体，效率高，整个时间控制在20分钟以内，极大地减少了实验成本，加快了实验进度，该克隆体系具有极为广阔的应用前景。

本发明的基于ccdB致死基因和SmaI酶切位点的酶切连接共体系同时进行的方法，其特征在于，包括以下步骤：

将ccdB基因插入载体pUC18的EcoRI和HindIII位点之间，得到pUC18-ccdB质粒，然后将pUC18-ccdB质粒、DNA片段、限制性内切酶SmaI、T4连接酶、T4连接酶buffer和水混合形成反应体系进行反应，由此得到连接产物。

连接产物可以转化到大肠杆菌DH5α感受态细胞中，筛选获得转化连接产物的阳性克隆。

优选是每20μl反应体系含有1μg pUC18-ccdB、200ng DNA片段，加入0.5μl限制性酶切酶SmaI和1μl T4连接酶，2μl T4连接酶buffer，最终补水至20μl。

本发明以常见的pUC18载体为骨架载体，结合ccdB致死基因的筛选机制以及ccdB致死基因内部含有的SmaI酶切位点，构建出一套快速、高效、低背景的克隆方法，无需对ccdB重组载体及PCR产物进行双酶切及胶回收等步骤，可以直接将PCR产物连接到克隆载体，效率高，整个时间控制在20分钟以内，极大地减少了实验成本，加快了实验进度，该克隆体系具有极为广阔的应用前景。

附图说明：

图1是pUC18-ccdB载体构建示意图；

图2是ccdB基因的PCR扩增产物电泳图，M:DNA marke，1-4：ccdB PCR片段；

图3是重组质粒pUC18-ccdB阳性克隆筛选，M:DNA marke，1-14：菌落PCR筛选阳性克隆；

图4是pUC18-ccdB质粒在DH5α和DB 3.1的致死性比较；

图5是外源片段的连接转化效率，-PCR,连接体系中没有加入PCR片段。+PCR，连接体系中加入PCR片段；

图6是外源PCR片段连入的重组质粒菌落PCR阳性筛选，1-18：外源PCR片段插入的重组质粒PCR检测。

具体实施方式：

以下实施例是对本发明的进一步说明，而不是对本发明的限制。

实施例1：

1材料和方法

1.1材料、试剂与菌株

含有ccdB致死基因(其Genbank登录号为EU496090.1)的Reading Frame CassetteB质粒购自Invitrogen公司，限制性内切酶EcoRI、HindIII、SmaI购自NEB公司，高保真DNA聚合酶Phusion-HF，T4 DNA连接酶购自Thermo Fisher Scientific公司，骨架载体为pUC18。大肠杆菌菌株E.coli DH 5α和DB 3.1由本实验室保存。引物交由华大生物公司合成。

1.2方法

1.2.1 ccdB基因的扩增

以Reading Frame Cassette B为模板，使用Phusion DNA polymerase及表1中引物ccdB-F、ccdB-R扩增ccdB致死片段，扩增程序为：98℃预变性30s，98℃变性10s，56℃退火30s，72℃延伸15s，30个循环，终末72℃延伸10min。用1％琼脂糖凝胶电泳检测PCR产物并切胶回收所需ccdB片段。

表1引物及序列

1.2.2载体pUC18-ccdB的构建

分别取1μg载体pUC18和200ng的ccdB回收片段，加入EcoRI和HindIII后按照Thermo Scientific FastDigest试剂的说明书，进行酶切实验，时间为30min。酶切完成后，进行凝胶电泳，分别对酶切片段进行回收。回收的质粒片段和ccdB片段，按照1:5的物质的量之比混合，加入1μl T4连接酶，2μl连接buffer，最终补水至20μl，室温反应10min后，取10μl连接产物，转化至100μl的DB3.1感受态中。37℃，过夜培养。使用ccdB-F、ccdB-R进行阳性克隆鉴定，挑选有阳性条带的单菌落，摇菌，提质粒，送样测序，将验证正确的重组质粒命名为pUC18-ccdB。

1.2.3 pUC18-ccdB致死检测

为验证pUC18-ccdB质粒的致死效率，将测序正确的pUC-ccdB质粒分别转入大肠杆菌感受态细胞DH5α和DB 3.1中，37℃培养过夜，次日观察大肠杆菌生长状态，检测质粒的致死性。

1.2.4 PCR片段插入含有pUC18-ccdB重组质粒的快速高效体系

分别取1μg构建好的pUC18-ccdB和200ng的PCR片段(扩增自水稻基因组，约700bp)，加入0.5μl限制性酶切酶SmaI和1μl T4连接酶，2μl T4连接酶buffer，最终补水至20μl，室温反应10min后，取10μl反应产物，转化至100μl的DH5α感受态中。37℃，过夜培养。使用M13-F、M13-R引物进行阳性克隆鉴定，挑选有阳性条带的单菌落，摇菌，提质粒，送样测序，检测连接片段的正确性。

2、结果与分析：

2.1重组质粒pUC18-ccdB的鉴定与分析

载体pUC18-ccdB的构建示意图见图1。ccdB的高保真PCR扩增片段电泳图见图2。将ccdB PCR片段胶回收及双酶切后和pUC18载体双酶切后胶回收片段进行连接，连接完成后转化DB3.1大肠杆菌。为确定阳性克隆效率，使用ccdB-F和ccdB-R引物随机挑选14个菌落进行菌落PCR检测，结果如图3所示。由图3可见，在随机挑选的14个单菌落中，有13个阳性菌落，任意选择3个菌落测序，ccdB基因正确的插入了pUC18的EcoRI和HindIII位点之间。

为了确定pUC18-ccdB在大肠杆菌菌株DH5α上的致死能力，将构建好的pUC18-ccdB质粒分别转入DB3.1和DH5α大肠杆菌中测定其致死效率，过夜培养后，大肠杆菌的生长结果如图4所示。转化DB3.1菌株的LB平板布满大量单菌落，而转化DH5α菌株的LB平板上只生长极少数的几个单菌落。说明pUC18-ccdB质粒对不耐受ccdB毒性蛋白的大肠杆菌DH5α菌株致死效果明显，可以作为后续阳性筛选的克隆载体使用。

1.2外源片段快速高效连接验证

将PCR片段及pUC18-ccdB混合后加入T4连接酶反应体系及0.5μl SmaI限制性内切酶，室温反应10min后，转化DH5α大肠杆菌，过夜培养，连接效率见图5。随机挑选取18个单菌落，用M13F，M13R引物进行PCR检测。挑选的单菌落中，有18个显示为阳性克隆，如图6所示。从其中各随机选择5个阳性菌落进行摇菌后测序，测序结果与已知基因序列一致，说明该PCR片段成功插入载体中，阳性选择率极高。

3讨论

目前广泛应用于实验室的分子克隆商业载体分为两大类，一类是T-A克隆载体，另一类是平末端克隆载体。经Taq DNA聚合酶扩增的PCR片段末尾带有一个突出的A，可以完美兼容T-A克隆载体，但由于Taq DNA聚合酶的保真性较差，部分研究者往往先采用高保真PCR酶进行PCR扩增后，再使用加A试剂盒对经高保真酶扩增的平末端PCR片段加A后连入T-A载体，但受试剂盒加A效率的影响及额外的工作时间，大部分研究者偏好直接使用平末端克隆载体对经高保真聚合酶PCR片段进行连接。

商业化的平末端克隆载体存在价格昂贵、产品质量批次波动及一次性使用等不足之处。当实验室长期进行大规模分子克隆时，商业化载体的价格问题往往也是研究者考虑的因素之一。若实验室能够自行制备出快速简洁高效且可永久保存的克隆载体，会极大地节约实验成本。

CcdB致死基因已经被广泛应用于构建平末端克隆载体(Hu et al.2010；Weibelet al.2013)。本研究将ccdB基因插入最常用的pUC18载体，成功构建出pUC18-ccdB重组载体，利用ccdB基因对大肠杆菌DH5α的致死能力，排除了载体自连对后续阳性克隆鉴定等实验的影响。利用pUC18-ccdB重组载体能够在大肠杆菌DB3.1中复制的特点，可以在实验室内大量扩增提取该质粒。此外，本研究进一步利用ccdB致死基因中含有的SmaI独特的碱基识别位点，经SmaI酶切后的pUC18-ccdB为平末端载体，可以直接连接经高保真酶扩增的PCR片段。本研究最大的创新点在于将pUC18-ccdB重组载体和PCR片段混合后加入T4连接酶及SmaI限制性内切酶，在T4连接酶体系中室温反应10min，pUC18-ccdB载体在混合体系中发生边酶切边连接，酶切pUC18-ccdB产生的平末端线性分子直接连接外源PCR产物，连接完成后含有外源PCR片段的重组载体丧失了SmaI的酶切位点，不受SmaI内切酶的影响，未酶切连接的pUC18-ccdB载体在转入大肠杆菌DH5α中由于ccdB发挥功能而死掉。本实验对0.6Kb外源片段在该系统连接后转化大肠杆菌，进行了菌落PCR及测序验证，阳性克隆比例高。

此外，Thermo Scientific公司的T4连接酶的连接温度为22℃，而NEB公司SmaI的酶切温度为25℃，二者对温度的要求相差不大，本研究发现在22℃SmaI也能极好的发挥酶切作用。本研究还发现，在T4连接酶buffer中，T4连接酶和SmaI内切酶完美兼容。本方法大大的缩短了PCR产物连接到克隆载体的时间(共同孵育10min后即可转化大肠杆菌)，无需对载体及片段进行双酶切后胶回收等步骤，并保留了pUC18载体上的M13F和M13R测序引物结合序列，为克隆片段的测序提供了便利。本研究所创建的载体及快速高效连接体系具有技术明确简洁，速度快，效率高，所用试剂均为分子生物学操作中的常规试剂，在保证实验质量的情况下极大地加速了实验进度并显著降低了实验成本，具有广阔的应用前景，非常适合实验室推广使用。

Claims (2)

1.一种基于ccdB致死基因和SmaI酶切位点的酶切连接共体系同时进行的方法，其特征在于，包括以下步骤：

将ccdB基因插入载体pUC18的EcoRI和HindIII位点之间，得到pUC18-ccdB质粒，然后将pUC18-ccdB质粒、DNA片段、限制性内切酶SmaI、T4连接酶、T4连接酶buffer和水混合形成反应体系进行反应，由此得到连接产物。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，每20μl反应体系含有1μg pUC18-ccdB质粒、200ng DNA片段，加入0.5μl限制性酶切酶SmaI和1μl T4连接酶，2μl T4连接酶buffer，最终补水至20μl。