CN111808884A - 杆状病毒表达系统及其构建方法和应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种杆状病毒表达系统及其构建方法和应用，包括杆状病毒穿梭载体、辅助载体和供体载体；所述杆状病毒穿梭载体上含有Tn7靶位点和毒素蛋白基因表达盒；所述辅助载体上含有抗毒素蛋白基因表达盒，所述抗毒素蛋白能够与所述毒素蛋白结合从而中和所述毒素蛋白的毒性，所述辅助载体和所述供体载体的复制子均为温敏型复制子，所述供体载体包含转座子Tn7的左右侧翼序列。利用本发明的杆状病毒表达系统，可快速直接地提取得到一种能够直接用于下游杆状病毒包装的高纯度无污染的重组阳性杆状病毒载体。

Description

杆状病毒表达系统及其构建方法和应用

技术领域

本发明涉及蛋白表达技术领域，特别是涉及一种杆状病毒表达系统及其构建方法和应用。

背景技术

基于苜蓿银纹夜蛾多核型多角体病毒(Autographa californica multiplenuclear polyhedrosis virus,AcMNPV)的昆虫杆状病毒表达载体系统(BaculovirusExpression Vector System,BEVS)是一种可在昆虫细胞中大规模表达外源重组蛋白的最通用和最强大的真核表达系统之一，自1985年在该系统中首次实现IL-2蛋白的大规模生产以来便得到了广泛的应用。与其他重组蛋白表达系统相比，重组杆状病毒表达系统具有明显的优势：1)安全性高：宿主局限于特定的无脊椎动物，对哺乳动物和植物无致病性；2)易于扩大生产规模：可用初始得到的重组杆状病毒感染更多的昆虫细胞，从而获得更高的病毒滴度；3)高水平及可溶性表达：可实现外源蛋白的高水平表达，在大多数情况下，重组蛋白是可溶的，且易于从感染细胞中纯化回收；4)修饰及折叠的准确性：重组杆状病毒载体可利用昆虫细胞的翻译后修饰系统对外源蛋白进行正确的修饰及折叠，从而得到具有生物活性的重组蛋白；5)悬浮培养：现有的细胞系在悬浮培养中生长良好，因此可在大规模生物反应器中生产重组蛋白；6)低成本：昆虫细胞无血清培养大大降低了生产成本。

杆状病毒穿梭载体系统是目前应用最广泛的一种基于Tn7转座的BEVS克隆系统，也被称为Bac-to-Bac杆状病毒表达载体系统。该系统包括三个主要成分：1)杆状病毒穿梭载体，又称为Bacmid载体，含有经修饰后携带lacZ基因的杆状病毒基因组和插入lacZ基因编码区的mini-attTn7位点，可在大肠杆菌中进行复制增殖；2)辅助载体pHelper，表达Tn7转座酶；3)pFastBac供体载体，包含转座位点Tn7R和Tn7L，以及两者之间的庆大霉素抗性基因(Gen)表达盒和外源基因表达盒。Bacmid和辅助载体pHelper共存于DH10Bac菌株中，当克隆了外源基因的pFastBac转化到DH10Bac菌株后，辅助载体pHelper表达的转座酶可介导pFastBac载体上Tn7R和Tn7L的之间的区域转座到Bacmid中的mini-attTn7位点，然后通过庆大霉素筛选和蓝/白筛选鉴定出重组的阳性克隆。

但是，利用传统的Bac-to-Bac杆状病毒表达载体系统所得到的表达外源基因的Bacmid DNA是一种混合的质粒，其中包含了供体载体、辅助载体、未转座的Bacmid载体以及重组阳性Bacmid载体。若直接用于转染昆虫细胞进行杆状病毒包装，污染质粒(供体载体和辅助载体)会以高达25％的非同源重组率整合到Bacmid病毒基因组中，引起病毒基因组的大片段缺失，并被包装到子代病毒颗粒中。同时，这也不利于计算杆状病毒包装过程中Bacmid DNA的精确加入量，导致包装体系非最优。虽然将转座重组产物提纯后重新电转感受态能够筛选得到纯化的菌株，然而该过程操作繁琐，耗时费力，大大降低了工作效率。

发明内容

基于此，有必要提供一种可快速直接得到高纯度重组Bacmid载体的杆状病毒表达系统。

一种杆状病毒表达系统，包括杆状病毒穿梭载体、辅助载体和供体载体；所述杆状病毒穿梭载体上含有Tn7靶位点和毒素蛋白基因表达盒；所述辅助载体上含有抗毒素蛋白基因表达盒，所述抗毒素蛋白能够与所述毒素蛋白结合从而中和所述毒素蛋白的毒性，所述辅助载体和所述供体载体的复制子均为温敏型复制子；所述供体载体包含转座子Tn7的左右侧翼序列。

本发明的杆状病毒表达系统的作用机制如下：在温敏型复制子能够复制的体系温度的情况下，将克隆了目的基因的供体载体转化到含有杆状病毒穿梭载体和辅助载体的大肠杆菌中，通过辅助载体表达的转座酶介导的重组反应，将目的基因表达盒转座到杆状病毒穿梭载体中。重组反应完成后，将体系温度变化为温敏型复制子不能复制的温度，辅助载体与供体载体会停止复制，从而随着大肠杆菌的分裂增殖而逐渐丢失。此时，由于辅助载体丢失引起的抗毒素蛋白缺失，使得杆状病毒穿梭载体表达的毒素蛋白无法被中和，从而导致含有未发生转座重组的杆状病毒穿梭载体的菌株产生致死效应。而已发生转座重组的阳性杆状病毒穿梭载体上的毒素蛋白基因无法正常表达，那么存活下来的菌株中仅仅包含已发生转座重组的阳性杆状病毒穿梭载体，最终可快速直接地提取得到一种能够直接用于下游杆状病毒包装的高纯度无污染的重组阳性杆状病毒载体。

在其中一个实施例中，所述温敏型复制子为pSC101 ori、pBBR1MCS2-Ts复制子或RK2复制子。

在其中一个实施例中，所述毒素蛋白选自RelE、MazF、ParE、Doc、YafQ、VapC、HicA、CcdB、Axe、YefM、RelJ、HigB和HipA中的一种，所述抗毒素蛋白对应地选自RelB、MazE、ParD、Phd、DinJ、VapB、HicB、CcdA、Txe、YoeB、RelK、HigA和HipB中的一种。

在其中一个实施例中，所述毒素蛋白为CcdB，所述抗毒素蛋白为CcdA。

在其中一个实施例中，所述杆状病毒穿梭载体上还含有第一抗生素抗性基因，所述供体载体上还含有第二抗生素抗性基因。

在其中一个实施例中，所述第一抗生素抗性基因为卡那霉素抗性基因，所述第二抗生素抗性基因为庆大霉素抗性基因。

本发明还提供了一种上述杆状病毒表达系统的构建方法，包括以下步骤：

提供Bacmid载体、pHelper载体和pFastBac载体；

将所述pHelper载体和所述pFastBac载体的复制子均替换为所述温敏型复制子；

在所述pHelper载体中插入所述抗毒素蛋白基因表达盒；

将所述Bacmid载体上的LacZα片段替换为毒素蛋白基因表达盒。

本发明还提供了一种上述杆状病毒表达系统在表达目的蛋白中的应用。

本发明还提供了一种蛋白表达试剂盒，包括上述杆状病毒表达系统和感受态制备试剂。

本发明还提供了一种目的蛋白的表达方法，包括以下步骤：

提供上述杆状病毒表达系统；

将目的蛋白的基因序列插入所述供体载体；

将所述杆状病毒穿梭载体、所述辅助载体和含有所述目的蛋白的基因序列的所述供体载体转化到细菌中，接种后在所述温敏型复制子能够复制的温度条件下培养12～24小时；

挑取单克隆接种，然后在所述温敏型复制子不能复制的温度条件下培养12～24小时；

收集培养产物并进行质粒提取，然后转染到昆虫细胞中进行目的蛋白的表达。

附图说明

图1为实施例1中改造Bacmid载体的流程示意图；

图2为实施例1和对比例1中的克隆流程示意图；

图3为实施例1和对比例1提取的重组产物电泳图。

具体实施方式

为了便于理解本发明，下面将对本发明进行更全面的描述，并给出了本发明的较佳实施例。但是，本发明可以以许多不同的形式来实现，并不限于本文所描述的实施例。相反地，提供这些实施例的目的是使对本发明的公开内容的理解更加透彻全面。

除非另有定义，本文所使用的所有的技术和科学术语与属于本发明的技术领域的技术人员通常理解的含义相同。本文中在本发明的说明书中所使用的术语只是为了描述具体的实施例的目的，不是旨在于限制本发明。本文所使用的术语“和/或”包括一个或多个相关的所列项目的任意的和所有的组合。

术语解释

转座酶，执行转座功能的酶，通常由转座子编码，识别转座子两端的特异序列，能把转座子从相邻序列中脱离出来，再插入到新的DNA靶位点，无同源性要求。

转座子，又称跳跃基因，一段可以从原位上单独复制或断裂下来，环化后插入另一位点，并对其后的基因起调控作用的DNA序列。

Tn7转座子，是大肠杆菌中的一种位点特异性的转座子，其必须的元件为Tn7-L(约150bp)和Tn7-R(约90bp)。任何片段只要带上了Tn7-L和Tn7-R这两个元件，就可以在Tn7转座蛋白的辅助下完成转座过程。Tn7-L与Tn7-R序列不同，它们决定了转座子插入的方向，Tn7的每个末端都含有约22bp的转座酶结合位点。Tn7编码5个转做蛋白，分别是TnsA,TnsB,TnsC,TnsD,TnsE。其中TnsA和TnsB形成转座酶，特异性识别转座子的末端，并将Tn7从供体上剪切下来，形成转座酶双链DNA断裂，然后将这些末端插入到目标位点中。TnsC非特异的结合DNA，在ATP存在下，会协助TnsA和TnsB完成剪切和插入过程。

Gibson克隆技术，非常适合用于拼接多个线性DNA片段，也适合将目的DNA插入载体中。首先，需要在DNA片段的末端加上同源片段(通过PCR法加上)；然后，将这些DNA片段和一种master mix(含有三种酶)混合孵育一个小时。这种master mix含有三种不同类型的酶：一种外切酶，从5’端开始对DNA进行消化，产生长的黏性末端，这样便于与另外的同源末端进行配对结合；一种聚合酶，用于修补gap；一种DNA连接酶，实现无痕拼接，形成完整的DNA分子。

本发明一实施例的杆状病毒表达系统，包括杆状病毒穿梭载体(Bacmid(ccdB))、辅助载体(pHelper(ts+ccdA))和供体载体(pFastBac(ts))。杆状病毒穿梭载体上含有Tn7靶位点和毒素蛋白基因表达盒，辅助载体上含有抗毒素蛋白基因表达盒，抗毒素蛋白能够与毒素蛋白结合从而中和毒素蛋白的毒性。辅助载体和供体载体的复制子均为温敏型复制子，供体载体包含转座子Tn7的左右侧翼序列。

本发明为了能快速直接地得到高纯度、无污染的重组阳性Bacmid载体，对Bac-to-Bac杆状病毒表达载体系统进行了一系列改造，包括引入温敏型复制子和毒素蛋白-抗毒素蛋白系统。一方面，将供体载体和辅助载体的普通复制子替换为温敏型复制子，携带该类型复制子的质粒只能在特定温度范围稳定存在于大肠杆菌中，当体系温度不在特定范围时，该质粒会停止复制，从而随着大肠杆菌的分裂增殖而逐渐丢失。另一方面，在重组前的Bacmid载体中插入毒素蛋白基因表达盒，在辅助载体中插入抗毒素蛋白基因表达盒。当毒素蛋白基因在大肠杆菌中单独表达时，会使宿主菌株产生致死效应。然而，当毒素蛋白基因和抗毒素蛋白基因在大肠杆菌中同时表达时，两种蛋白会形成结构紧密的复合物，从而中和毒素蛋白的毒性，使宿主菌株存活下来。

综上所述，改造后的杆状病毒表达系统的作用机制如下：在温敏型复制子能够复制的体系温度下，将克隆了目的基因的供体载体转化到含有杆状病毒穿梭载体和辅助载体的大肠杆菌中，通过辅助载体表达的转座酶介导的重组反应，将目的基因表达盒转座到杆状病毒穿梭载体中。重组反应完成后，将体系温度变化为温敏型复制子不能复制的温度，辅助载体与供体载体会停止复制，从而随着大肠杆菌的分裂增殖而逐渐丢失。此时，由于辅助载体丢失引起的抗毒素蛋白缺失，使得杆状病毒穿梭载体表达的毒素蛋白无法被中和，从而导致含有未发生转座重组的杆状病毒穿梭载体的菌株产生致死效应。而已发生转座重组的阳性杆状病毒穿梭载体上的毒素蛋白基因无法正常表达，那么存活下来的菌株中仅仅包含已发生转座重组的阳性杆状病毒穿梭载体，最终可快速直接地提取得到一种能够直接用于下游杆状病毒包装的高纯度无污染的重组阳性杆状病毒载体。

在一个具体示例中，温敏型复制子选自pSC101 ori、pBBR1MCS2-Ts复制子或RK2复制子。可以理解，温敏型复制子的选择不限于此，可根据需要调整。

在一个具体示例中，毒素蛋白选自RelE、MazF、ParE、Doc、YafQ、VapC、HicA、CcdB、Axe、YefM、RelJ、HigB和HipA中的一种，抗毒素蛋白对应地选自RelB、MazE、ParD、Phd、DinJ、VapB、HicB、CcdA、Txe、YoeB、RelK、HigA和HipB中的一种。优选地，毒素蛋白为CcdB，抗毒素蛋白为CcdA。

在一个具体示例中，杆状病毒穿梭载体上还含有第一抗生素抗性基因，供体载体上还含有第二抗生素抗性基因。可选地，第一抗生素抗性基因为卡那霉素抗性基因，第二抗生素抗性基因为庆大霉素抗性基因。可以理解，抗性基因的选择不限于此，可根据需要调整。

本发明一实施例的杆状病毒表达系统的构建方法，包括以下步骤S1～S4：

S1、提供Bacmid载体、pHelper载体和pFastBac载体。

S2、将pHelper载体和pFastBac载体的复制子均替换为温敏型复制子。

具体地，可以采用Gibson克隆技术将供体载体pFastBac和辅助载体pHelper的普通复制子替换为温敏型复制子。

S3、在pHelper载体中插入抗毒素蛋白基因表达盒。

S4、将Bacmid载体上的LacZα片段替换为毒素蛋白基因表达盒。

在一个具体示例中，利用基于λ噬菌体Redα/Redβ/Redγ的DNA同源重组技术将Bacmid载体上的LacZα片段替换为毒素蛋白基因表达盒。具体地，首先通过同源重组将Bacmid载体上的LacZα片段替换为两端包含同源臂的ccdB cassette-FRT-Amp cassette-FRT片段，然后通过Flpe介导的位点特异性重组将FRT之间的Amp cassette删除。

在一个具体示例中，杆状病毒穿梭载体的构建方法包括以下步骤：将同源重组酶表达质粒pRed/ET(四环素抗性Tc)电转到仅含有Bacmid质粒(卡那抗性Kan)的DB3.1感受态中，加入SOC培养基于30℃复苏培养1小时；复苏培养产物涂布到含有Tc+Kan抗生素的LB板上，30℃培养两天，挑克隆PCR鉴定出同时含有pRed/ET和Bacmid质粒的阳性克隆；挑取阳性克隆接种到含有Tc+Kan抗生素的LB液体培养基中，30℃过夜培养；将过夜培养物按照1:100的比例接种到含有Tc+Kan抗生素的新鲜LB培养基中，30℃培养至OD600约0.3，加入0.3％～0.4％的L-阿拉伯糖，置于37℃诱导培养45分钟～1小时；将诱导产物制备成电转感受态，加入带同源臂的ccdB cassette-FRT-Amp cassette-FRT PCR产物进行电转，加入SOC培养基于37℃复苏培养1小时；复苏培养产物涂布到含有Kan+Amp抗生素的LB板上，37℃过夜培养，挑克隆PCR鉴定出重组阳性克隆；将707-FLPe(四环素抗性Tc)电转到上一步获得的阳性菌株感受态细胞中，加入SOC培养基于30℃复苏培养1小时；复苏培养产物涂布到含有Kan+Tc的LB板上，30℃培养两天，分别挑取几个克隆加入到含有Kan抗生素的LB培养液中，30℃培养2～3h；将复苏培养产物在含有Kan抗生素的LB板上划线，37℃过夜培养；挑几个单克隆一式两份，分别加入到分别含有Kan、Amp的2种LB培养基中，37℃过夜培养；取在含Amp的LB中不长，而在含Kan的LB液体中生长的克隆进行PCR鉴定，PCR阳性克隆即为改造后的杆状病毒穿梭载体。

在一个具体示例中，构建方法还包括以下步骤：将杆状病毒穿梭载体和辅助载体共电转感受态，PCR鉴定阳性克隆菌株，得到优化型的Bac-to-Bac克隆菌株VBUltraDH10Bac，保存甘油菌。

本发明一实施例的目的蛋白的表达方法，包括以下步骤S1～S5：

S1、提供上述杆状病毒表达系统。

S2、将目的蛋白的基因序列插入供体载体。

可选地，利用Gibson克隆技术将目的蛋白的基因序列克隆到供体载体中。

S3、将杆状病毒穿梭载体、辅助载体和含有目的蛋白的基因序列的供体载体转化到细菌中，接种后在温敏型复制子能够复制的温度条件下培养12～24小时。

S4、挑取单克隆接种，然后在温敏型复制子不能复制的温度条件下培养12～24小时。

S5、收集培养产物并进行质粒提取，然后转染到昆虫细胞中进行目的蛋白的表达。

可选地，细菌为大肠杆菌，昆虫细胞为Sf9细胞或Sf21细胞。

以下通过具体实施例对本发明做进一步详细的描述。

实施例1

一、构建杆状病毒表达载体系统

采用Gibson克隆方法将pFastBac和pHelper的普通复制子替换为温敏型的pSC101ori复制子，然后在温敏型辅助质粒的基础上插入ccdA表达框，即构建出优化型供体载体pFastBac(ts)和辅助载体pHelper(ts+ccdA)。

如图1所示，将同源重组酶表达质粒pRed/ET(四环素抗性Tc)电转到仅含有Bacmid载体(卡那抗性Kan)的DB3.1感受态中，加入SOC培养基于30℃复苏培养1小时。

复苏培养产物涂布到含有Tc+Kan抗生素的LB板上，30℃培养两天，挑克隆PCR鉴定出同时含有pRed/ET和Bacmid载体的阳性克隆。

挑取阳性克隆接种到含有Tc+Kan抗生素的LB液体培养基中，30℃过夜培养。

将过夜培养物按照1:100的比例接种到含有Tc+Kan抗生素的新鲜LB培养基中，30℃培养至OD600～0.3，加入0.3％～0.4％的L-阿拉伯糖，置于37℃诱导培养45分钟～1小时。

将诱导产物制备成电转感受态，加入带同源臂的ccdB cassette-FRT-Ampcassette-FRT PCR产物进行电转，加入SOC培养基于37℃复苏培养1小时。

复苏培养产物涂布到含有Kan+Amp抗生素的LB板上，37℃过夜培养，挑克隆PCR鉴定出重组阳性克隆。

将707-FLPe(四环素抗性Tc)电转到步骤6获得的阳性菌株感受态细胞中，加入SOC培养基于30℃复苏培养1小时。

复苏培养产物涂布到含有Kan+Tc的LB板上，30℃培养两天。分别挑取几个克隆加入到含有Kan抗生素的LB培养液中，30℃培养2～3h。

将复苏培养产物在含有Kan抗生素的LB板上划线，37℃过夜培养。

挑几个单克隆一式两份，分别加入到分别含有Kan、Amp的2种LB培养基中，37℃过夜培养。

取在含Amp的LB中不长，而在含Kan的LB液体中生长的克隆进行PCR鉴定，PCR阳性克隆即为改造后的Bacmid(ccdB)载体。

将纯化后的Bacmid(ccdB)和pHelper(ts+ccdA)质粒共电转DH10B感受态，PCR鉴定含有两种质粒的阳性克隆菌株，即得到优化型的Bac-to-Bac克隆菌株VB UltraDH10Bac，保存甘油菌。

二、应用

首先利用Gibson克隆技术将EGFP(增强型绿色荧光蛋白)基因克隆到供体载体pFastBac(ts)中，构建出pFastBac-EGFP(ts)，然后转化到VB UltraDH10Bac菌株中进行转座重组反应，提取重组后DNA产物进行琼脂糖凝胶电泳，观察DNA形态。结合图2所示，具体操作步骤如下：

采用Gibson克隆技术构建pFastBac-EGFP(ts)。

按照常规化学感受态制备方法制备VB UltraDH10Bac感受态。

取浓度为10ng/μL的pFastBac-EGFP(ts)质粒1μL到VB UltraDH10Bac感受态中混匀。

冰浴30分钟，42℃热激45秒，立即冰浴2分钟。

加入900μL SOC培养基，30℃、250rpm震荡培养4小时。

取100μL复苏产物涂布到含有Kan+Gen抗生素的LB平板上，30℃培养20小时。

挑单克隆PCR鉴定阳性重组子。

挑取阳性重组克隆接种到含有Kan+Gen抗生素的液体LB中，37℃过夜培养。

将过夜培养产物按照常规BAC抽提方法进行质粒提取。

取1μL的质粒提取物进行琼脂糖凝胶电泳。

对比例1

利用Gibson克隆技术将EGFP克隆到改造前供体载体pFastBac中，构建出pFastBac-EGFP，然后转化到DH10Bac菌株中进行转座重组反应，提取重组后DNA产物进行琼脂糖凝胶电泳，观察DNA形态。如图2所示，具体操作步骤如下：

采用Gibson克隆技术构建pFastBac-EGFP。

按照常规化学感受态制备方法制备DH10Bac感受态。

取浓度为10ng/μL的pFastBac-EGFP质粒1μL到DH10Bac感受态中混匀。

冰浴30分钟，42℃热激45秒，立即冰浴2分钟。

加入900μL SOC培养基，30℃、250rpm震荡培养4小时。

取100μL复苏产物涂布到含有Kan+Gen抗生素的LB平板上，30℃培养20小时。

挑单克隆PCR鉴定阳性重组子。

挑取阳性重组克隆接种到含有Kan+Gen抗生素的液体LB中，37℃过夜培养。

将过夜培养产物按照常规BAC抽提方法进行质粒提取。

分别取1μL的质粒提取物进行琼脂糖凝胶电泳。

如图3所示，泳道1～3为对比例1得到的三个不同的Bacmid-EGFP克隆，泳道4～6为实施例1得到的三个不同的Bacmid-EGFP克隆，从中可以看到对比例1得到的质粒为混合物，而实施例1得到的则是单一无污染的Bacmid-EGFP质粒。

以上所述实施例的各技术特征可以进行任意的组合，为使描述简洁，未对上述实施例中的各个技术特征所有可能的组合都进行描述，然而，只要这些技术特征的组合不存在矛盾，都应当认为是本说明书记载的范围。

以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。

Claims (10)

1.一种杆状病毒表达系统，其特征在于，包括杆状病毒穿梭载体、辅助载体和供体载体；所述杆状病毒穿梭载体上含有Tn7靶位点和毒素蛋白基因表达盒；所述辅助载体上含有抗毒素蛋白基因表达盒，所述抗毒素蛋白能够与所述毒素蛋白结合从而中和所述毒素蛋白的毒性；所述辅助载体和所述供体载体的复制子均为温敏型复制子；所述供体载体包含转座子Tn7的左右侧翼序列。

2.根据权利要求1所述的杆状病毒表达系统，其特征在于，所述温敏型复制子为pSC101ori、pBBR1MCS2-Ts复制子或RK2复制子。

3.根据权利要求1所述的杆状病毒表达系统，其特征在于，所述毒素蛋白选自RelE、MazF、ParE、Doc、YafQ、VapC、HicA、CcdB、Axe、YefM、RelJ、HigB和HipA中的一种，所述抗毒素蛋白对应地选自RelB、MazE、ParD、Phd、DinJ、VapB、HicB、CcdA、Txe、YoeB、RelK、HigA和HipB中的一种。

4.根据权利要求3所述的杆状病毒表达系统，其特征在于，所述毒素蛋白为CcdB，所述抗毒素蛋白为CcdA。

5.根据权利要求1所述的杆状病毒表达系统，其特征在于，所述杆状病毒穿梭载体上还含有第一抗生素抗性基因，所述供体载体上还含有第二抗生素抗性基因。

6.根据权利要求5所述的杆状病毒表达系统，其特征在于，所述第一抗生素抗性基因为卡那霉素抗性基因，所述第二抗生素抗性基因为庆大霉素抗性基因。

7.一种权利要求1～6任一项所述的杆状病毒表达系统的构建方法，其特征在于，包括以下步骤：

提供Bacmid载体、pHelper载体和pFastBac载体；

将所述pHelper载体和所述pFastBac载体的复制子均替换为所述温敏型复制子；

在所述pHelper载体中插入所述抗毒素蛋白基因表达盒；

将所述Bacmid载体上的LacZα片段替换为毒素蛋白基因表达盒。

8.权利要求1～6任一项所述的杆状病毒表达系统在表达目的蛋白中的应用。

9.一种蛋白表达试剂盒，其特征在于，包括权利要求1～6任一项所述的杆状病毒表达系统和感受态制备试剂。

10.一种目的蛋白的表达方法，其特征在于，包括以下步骤：

提供权利要求1～6任一项所述的杆状病毒表达系统；

将目的蛋白的基因序列插入所述供体载体；

将所述杆状病毒穿梭载体、所述辅助载体和含有所述目的蛋白的基因序列的所述供体载体转化到细菌中，接种后在所述温敏型复制子能够复制的温度条件下培养12～24小时；

挑取单克隆接种，然后在所述温敏型复制子不能复制的温度条件下培养12～24小时；

收集培养产物并进行质粒提取，然后转染到昆虫细胞中进行目的蛋白的表达。

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