CN104894153A - 温度敏感型载体pBBR1MCS-2-Ts1及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了温度敏感型载体pBBR1MCS-2-Ts1及其应用。本发明所提供的温度敏感型载体，是将SEQ ID No.1的第1557-2526位所示的DNA片段替换为目的基因表达盒，并保持SEQ ID No.1的其他核苷酸不变，得到的重组载体；目的基因表达盒编码的蛋白质为将SEQ ID No.2所示的蛋白质进行A1)的改造得到的蛋白质：A1)为如下A11)、A12)和A13)：A11)将SEQ ID No.2第12位的Ala突变为Thr；A12)将SEQ ID No.2第81位的Asp突变为His；A13)将SEQ ID No.2第140位的His突变为Leu。
Description
技术领域
本发明涉及生物技术领域中温度敏感型载体pBBR1MCS-2-Ts1及其应用。
背景技术
把一段有用的目的DNA片段通过DNA重组技术，送进受体细胞中去进行复制和表达的工具叫载体(Vector)。质粒是重组DNA技术中常用的载体，质粒存在于许多细菌以及酵母菌等生物中，是细胞染色体外能够自主复制的很小的环状DNA分子。一个理想的载体大致应有下列一些特性：(1)分子量小、多拷贝、松弛控制型；(2)具有多种常用的限制性内切酶的单切点；(3)能插入较大的外源DNA片段；(4)具有遗传标记，便于鉴定和筛选；(5)对宿主细胞无害。
宽宿主质粒pBBR1MCS-2是应用性很广的载体，该质粒由pBBR1质粒改造而来。pBBR1质粒来源于革兰氏阴性菌Bordetella bronchiseptica S87(Antoine R and LochtC.Isolation and molecular characterization of a novel broad-host-rangeplasmid from Bordetella bronchiseptica with sequence similarities to plasmidsfrom Gram-positive organisms.Mol Microbiol.1992,6(13):1785-1799)。pBBR1MCS-2含有一个卡那霉素(kan)抗性筛选标记，它的大小仅有5145bp，这些特性使得该质粒适用于DNA克隆、蛋白表达，广泛用于革兰氏阴性菌的分子操作。
温度敏感型质粒载体可以方便的控制质粒在宿主中的存在。当温度比较低时，质粒可以存在宿主中，而当温度提高后，温度敏感型质粒载体将丢失或整合到染色体上。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是如何构建温度敏感型载体。
为解决上述技术问题，本发明首先提供了构建重组载体的方法。
本发明所提供的构建重组载体的方法，为构建重组载体的方法1，是将SEQ ID No.1的第1557-2526位所示的DNA片段替换为目的基因表达盒，并保持SEQ ID No.1的其他核苷酸不变，得到的重组DNA即为所述重组载体，将该重组载体命名为pBBR1MCS-2-Ts1；
所述目的基因表达盒编码的蛋白质为将SEQ ID No.2所示的蛋白质进行A1)的改造、保持SEQ ID No.2的其它氨基酸残基均不变得到的蛋白质，即所述目的基因表达盒编码的蛋白质为SEQ ID No.4所示的蛋白质：所述A1)为如下A11)和/或A12)和/或A13)：
A11)将SEQ ID No.2第12位的Ala突变为Thr；
A12)将SEQ ID No.2第81位的Asp突变为His；
A13)将SEQ ID No.2第140位的His突变为Leu。
上述方法1中，所述目的基因表达盒中的目的基因为将SEQ ID No.1的第1794-2456位核苷酸所示的DNA分子进行B1)的改造、保持SEQ ID No.1的第1794-2456位核苷酸所示的DNA分子中的其它核苷酸均不变得到的DNA分子，即所述目的基因表达盒的序列为SEQ ID No.3：所述B1)为如下B11)和/或B12)和/或B13)和/或B14)：
B11)将SEQ ID No.1第1827位的G突变为A；
B12)将SEQ ID No.1第2034位的G突变为C；
B13)将SEQ ID No.1第2212位的A突变为T；
B14)将SEQ ID No.1第2249位的C突变为A。
其中，SEQ ID No.1由5145个核苷酸组成，SEQ ID No.1的第1794-2456位核苷酸为rep的编码基因，编码SEQ ID No.2所示的rep蛋白。SEQ ID No.3的第238-900位编码SEQ ID No.4所示的蛋白质。
上述方法1中，所述目的基因表达盒中启动所述目的基因表达的启动子为SEQ IDNo.1的第1557-1793位所示的DNA分子；所述目的基因表达盒中终止所述目的基因表达的终止子为SEQ ID No.1的第2457-2526位所示的DNA分子。
为解决上述技术问题，本发明还提供了构建重组载体的方法。
本发明所提供的构建重组载体的方法，为构建重组载体的方法2，是将SEQ ID No.1的第1557-2526位所示的DNA片段替换为目的基因表达盒，并保持SEQ ID No.1的其他核苷酸不变，得到的重组DNA即为所述重组载体；
所述目的基因表达盒编码的蛋白质为将SEQ ID No.2所示的蛋白质进行所述A1)及下述A2)、A3)和A4)这三种中至少一种的改造、保持SEQ ID No.2的其它氨基酸残基均不变得到的蛋白质：
A2)将SEQ ID No.2第130位的His突变为Gln；
A3)将SEQ ID No.2第86位的Arg突变为Cys；
A4)如下A41)和/或A42)：
A41)将SEQ ID No.2第25位的Lys突变为Glu；
A42)将SEQ ID No.2第146位的Ile突变为Val。
上述方法2中，所述目的基因表达盒中的目的基因为将SEQ ID No.1的第1794-2456位核苷酸所示的DNA分子进行所述B1)及下述B2)、B3)和B4)这三种中至少一种的改造、保持SEQ ID No.1的第1794-2456位核苷酸所示的DNA分子中的其它核苷酸均不变得到的DNA分子：
B2)将SEQ ID No.1第2183位的C突变为G；
B3)将SEQ ID No.1第2049位的C突变为T；
B4)如下B41)和/或B42)：
B41)将SEQ ID No.1第1866位的A突变为G；
B42)将SEQ ID No.1第2229位的A突变为G。
上述方法2中，所述目的基因表达盒中启动所述目的基因表达的启动子为将SEQID No.1的第1557-1793位所示的DNA分子进行如下C2)、C3)和C4)这三种中至少一种的改造、保持SEQ ID No.1的第1557-1793位核苷酸所示的DNA分子中的其它核苷酸均不变得到的DNA分子：
C2)如下C21)和/或C22)：
C21)将SEQ ID No.1第1732位的A突变为G；
C22)将SEQ ID No.1第1780位的G突变为T；
C3)如下C31)和/或C32)：
C31)将SEQ ID No.1第1747位的C突变为T；
C32)将SEQ ID No.1第1776位的T突变为A；
C4)将SEQ ID No.1第1751位的T突变为A；
所述目的基因表达盒中终止所述目的基因表达的终止子为SEQ ID No.1的第2457-2526位所示的DNA分子。
为解决上述技术问题，本发明还提供了由所述方法1或所述方法2构建的重组载体。
为解决上述技术问题，本发明还提供了含有所述重组载体的重组微生物或重组细胞系。
所述重组微生物具体可为细菌、酵母、藻和真菌。其中，所述细菌可为大肠杆菌或类球红细菌。所述大肠杆菌具体可为大肠杆菌Escherichia coli T1、大肠杆菌Escherichia coli DH5α、大肠杆菌Escherichia coli BW25113或大肠杆菌Escherichia coli S17-1。所述类球红细菌具体可为类球红细菌Rhodobactersphaeroides 2.4.1。
所述重组细胞系不包括繁殖材料。
为解决上述技术问题，本发明还提供了下述任一产品：
P1、所述蛋白质；
P2、所述目的基因。
为解决上述技术问题，本发明还提供了下述任一应用：
L1、所述目的基因在制备温度敏感载体中的应用；
L2、所述重组载体在作为温度敏感载体中的应用。
上述L2所述应用可为所述重组载体在大肠杆菌或类球红细菌中作为温度敏感载体中的应用。所述大肠杆菌具体可为大肠杆菌Escherichia coli T1、大肠杆菌Escherichia coli DH5α、大肠杆菌Escherichia coli BW25113或大肠杆菌Escherichia coli S17-1。所述类球红细菌具体可为类球红细菌Rhodobactersphaeroides 2.4.1。
本申请中，所述温度敏感载体为所述载体在一定温度下可存在于宿主中，而改变温度后，所述载体不能存在于所述宿主中。具体可为所述载体在30℃下可存在于宿主中，当温度为37℃-42℃时，所述载体不能存在于所述宿主中。
实验证明，本发明的重组载体pBBR1MCS-2-Ts1为温度敏感载体：在宿主菌分别为大肠杆菌Escherichia coli T1、大肠杆菌Escherichia coli DH5α、大肠杆菌Escherichia coli BW25113和大肠杆菌Escherichia coli S17-1时，pBBR1MCS-2和pBBR1MCS-2-Ts1在30℃LB液体培养基和30℃LB+kan液体培养基中的丢失率以及pBBR1MCS-2在42℃LB液体培养基中的丢失率均在10％以下，而pBBR1MCS-2-Ts1在42℃LB液体培养基中的丢失率均达到99.99％；在宿主菌为类球红细菌Rhodobacter sphaeroides 2.4.1时，pBBR1MCS-2和pBBR1MCS-2-Ts1在30℃LB液体培养基和30℃LB+kan液体培养基中的丢失率以及pBBR1MCS-2在37℃LB液体培养基中的丢失率均在13％以下，而pBBR1MCS-2-Ts1在37℃LB液体培养基中的丢失率均达到78.18％。
实验证明，本发明的重组载体pBBR1MCS-2-Ts1为温度敏感载体可应用于：(1)载体消除，即通过提高温度移去载体；(2)单交换同源重组，即通过提高温度，让载体DNA整合到染色体的同源区域；(3)双交换同源重组，即通过提高温度，让载体DNA替换染色体上一段DNA。
附图说明
图1为pBBR1MCS-2的图谱。
具体实施方式
下面结合具体实施方式对本发明进行进一步的详细描述，给出的实施例仅为了阐明本发明，而不是为了限制本发明的范围。
下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。
下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
下述实施例中的宽宿主载体pBBR1MCS-2为Biovector中国质粒载体菌株细胞株基因保藏中心产品。
下述实施例中的大肠杆菌Escherichia coli T1为北京全式金生物技术有限公司产品，目录号为CD501-01。
下述实施例中的大肠杆菌Escherichia coli DH5α为宝生物工程(大连)有限公司，目录号为9057。
下述实施例中的大肠杆菌Escherichia coli BW25113为Biovector中国质粒载体菌株细胞株基因保藏中心产品。
下述实施例中的大肠杆菌Escherichia coli S17-1为Biovector中国质粒载体菌株细胞株基因保藏中心产品。
下述实施例中的类球红细菌Rhodobacter sphaeroides 2.4.1为美国模式菌种收集中心(ATCC)产品，菌株号为17023。
下述实施例中的Sistrom培养基在文献(Sistrom WR.The kinetics of thesynthesis of photopigments in Rhodopseudomonas sphaeroides.J.Gen.Microbiol.1962.28:607-616)中报道过。
下述实施例中的LB液体培养基为由溶质和溶剂组成无菌培养基，溶剂为水，溶质及其浓度分别为胰蛋白胨1g/100mL，酵母浸粉0.5g/100mL，NaCl 0.5g/100mL；
LB+kan液体培养基为向LB液体培养基中加入卡那霉素得到的无菌培养基，LB+kan液体培养基中卡那霉素的含量为50mg/L；
LB平板为向LB液体培养基中加入琼脂得到的无菌固体培养基；
LB+kan平板为向LB液体培养基中加入琼脂和卡那霉素得到的无菌固体培养基，LB+kan平板中卡那霉素的含量为50mg/L。
实施例1、温度敏感载体的制备
1、温度敏感载体的筛选
对宽宿主载体pBBR1MCS-2(图1)中SEQ ID No.1的第1557-2526位所示的DNA片段进行随机突变，得到多条不同随机突变的突变后的DNA分子；将pBBR1MCS-2中SEQ ID No.1的第1557-2526位所示的DNA片段分别替换为上述各突变后的DNA分子，保持pBBR1MCS-2的其他序列不变，得到多个含有突变DNA片段的重组载体；将这些含有突变DNA片段的重组载体分别导入大肠杆菌Escherichia coli T1中，得到1068个含有突变DNA片段的重组大肠杆菌。将pBBR1MCS-2导入大肠杆菌Escherichiacoli T1中，得到重组大肠杆菌T1(pBBR1MCS-2)。
其中，SEQ ID No.1的第1794-2456位核苷酸编码SEQ ID No.2所示的rep蛋白。
对上述含有突变DNA片段的重组大肠杆菌按照下述方法进行筛选，并将T1(pBBR1MCS-2)作为对照：将这1068个重组大肠杆菌中的每个重组大肠杆菌的同一克隆分别进行①和②的处理：①将重组大肠杆菌接种至LB平板上，于42℃下培养18h，然后将LB平板上42℃下长出的重组大肠杆菌接种至LB+kan平板上，于42℃下培养18h；②将重组大肠杆菌接种至LB+kan平板上，于30℃下培养18h。对比42℃和30℃下的LB+kan的平板，发现有4株重组大肠杆菌在30℃下的LB+Kan平板上生长正常，但在42℃下的LB+Kan平板上不能生长(表1)，而T1(pBBR1MCS-2)在30℃下的LB+Kan平板与42℃下的LB+Kan平板上均能正常生长，表明，这4株重组大肠杆菌对温度敏感。将这4株重组大肠杆菌中从pBBR1MCS-2突变而来的重组载体分别命名为pBBR1MCS-2-Ts1、pBBR1MCS-2-Ts2、pBBR1MCS-2-Ts3和pBBR1MCS-2-Ts4，将对应的重组大肠杆菌分别命名为T1(pBBR1MCS-2-Ts 1)、T1(pBBR1MCS-2-Ts2)、T1(pBBR1MCS-2-Ts3)和T1(pBBR1MCS-2-Ts4)。
表1、重组大肠杆菌的筛选
| 转化子 | 30℃LB+Kan平板 | 42℃LB+Kan平板 | 温度敏感 |
| T1(pBBR1MCS-2-Ts1) | + | - | + |
| T1(pBBR1MCS-2-Ts2) | + | - | + |
| T1(pBBR1MCS-2-Ts3) | + | - | + |
| T1(pBBR1MCS-2-Ts4) | + | - | + |
| T1(pBBR1MCS-2) | + | + | - |
提取T1(pBBR1MCS-2-Ts1)、T1(pBBR1MCS-2-Ts2)、T1(pBBR1MCS-2-Ts3)和T1(pBBR1MCS-2-Ts4)中的pBBR1MCS-2-Ts1、pBBR1MCS-2-Ts2、pBBR1MCS-2-Ts3和pBBR1MCS-2-Ts4质粒，分别对pBBR1MCS-2-Ts1、pBBR1MCS-2-Ts2、pBBR1MCS-2-Ts3和pBBR1MCS-2-Ts4对应于SEQ ID No.1的第1557-2526位核苷酸所示的DNA片段进行测序，发现：
pBBR1MCS-2-Ts1为将pBBR1MCS-2进行如下B11)、B12)、B13)和B14)的改造并保持pBBR1MCS-2的其他序列不变得到的重组载体，pBBR1MCS-2-Ts1的第1557-2526位核苷酸序列为SEQ ID No.3：
B11)将SEQ ID No.1第1827位的G突变为A；
B12)将SEQ ID No.1第2034位的G突变为C；
B13)将SEQ ID No.1第2212位的A突变为T；
B14)将SEQ ID No.1第2249位的C突变为A。
pBBR1MCS-2-Ts2为将pBBR1MCS-2进行如下B2)、C21)和C22)的改造并保持pBBR1MCS-2的其他序列不变得到的重组载体，pBBR1MCS-2-Ts2的第1557-2526位核苷酸序列为SEQ ID No.5：
B2)将SEQ ID No.1第2183位的C突变为G；
C21)将SEQ ID No.1第1732位的A突变为G；
C22)将SEQ ID No.1第1780位的G突变为T；
pBBR1MCS-2-Ts3为将pBBR1MCS-2进行如下B3)、C31)和C32)的改造并保持pBBR1MCS-2的其他序列不变得到的重组载体，pBBR1MCS-2-Ts3的第1557-2526位核苷酸序列为SEQ ID No.7：
B3)为将SEQ ID No.1第2049位的C突变为T；
C31)将SEQ ID No.1第1747位的C突变为T；
C32)将SEQ ID No.1第1776位的T突变为A；
pBBR1MCS-2-Ts4为将pBBR1MCS-2进行如下B41)、B42)和C4)的改造并保持pBBR1MCS-2的其他序列不变得到的重组载体，pBBR1MCS-2-Ts4的第1557-2526位核苷酸序列为SEQ ID No.9：
B41)将SEQ ID No.1第1866位的A突变为G；
B42)将SEQ ID No.1第2229位的A突变为G；
C4)将SEQ ID No.1第1751位的T突变为A。
表明，与pBBR1MCS-2相比，pBBR1MCS-2-Ts1、pBBR1MCS-2-Ts2、pBBR1MCS-2-Ts3和pBBR1MCS-2-Ts4均发生了部分核苷酸的突变。
在1068个重组大肠杆菌中除T1(pBBR1MCS-2-Ts1)、T1(pBBR1MCS-2-Ts2)、T1(pBBR1MCS-2-Ts3)和T1(pBBR1MCS-2-Ts4)外的重组大肠杆菌(在30℃下的LB+Kan平板与42℃下的LB+Kan平板上均能正常生长，即对温度不敏感的重组大肠杆菌)中随机选取10株，对这10株中从pBBR1MCS-2突变而来的重组载体进行测序，结果发现，这10株对温度不敏感的重组大肠杆菌中从pBBR1MCS-2突变而来的重组载体也均发生了部分核苷酸的突变。
与pBBR1MCS-2相比，pBBR1MCS-2-Ts1的第1794-2456位核苷酸编码的蛋白质(氨基酸序列为SEQ ID No.4)为将SEQ ID No.2所示的蛋白质进行如下A11)、A12)和A13)的改造得到的蛋白质：
A11)将SEQ ID No.2第12位的Ala突变为Thr；
A12)将SEQ ID No.2第81位的Asp突变为His；
A13)将SEQ ID No.2第140位的His突变为Leu。
与pBBR1MCS-2相比，pBBR1MCS-2-Ts2的第1794-2456位核苷酸编码的蛋白质(氨基酸序列为SEQ ID No.6)为将SEQ ID No.2所示的蛋白质进行如下A2)的改造得到的蛋白质：A2)为将SEQ ID No.2第130位的His突变为Gln。
与pBBR1MCS-2相比，pBBR1MCS-2-Ts3的第1794-2456位核苷酸编码的蛋白质(氨基酸序列为SEQ ID No.8)为将SEQ ID No.2所示的蛋白质进行如下A3)的改造得到的蛋白质：A3)为将SEQ ID No.2第86位的Arg突变为Cys。
与pBBR1MCS-2相比，pBBR1MCS-2-Ts4的第1794-2456位核苷酸编码的蛋白质(氨基酸序列为SEQ ID No.10)为将SEQ ID No.2所示的蛋白质进行如下A41)和A42)的改造得到的蛋白质：
A41)将SEQ ID No.2第25位的Lys突变为Glu；
A42)将SEQ ID No.2第146位的Ile突变为Val。
2、pBBR1MCS-2-Ts1、pBBR1MCS-2-Ts2、pBBR1MCS-2-Ts3和pBBR1MCS-2-Ts4温度敏感性的验证
将步骤1的T1(pBBR1MCS-2-Ts1)接种至LB+kan液体培养基中，于30℃培养18小时，将得到的菌液进行以下处理：
①将菌液按1：1000的比例接种至3mL LB液体培养基中，然后于30℃下培养18小时，得到LB-30℃菌液；将LB-30℃菌液稀释后得到LB-30℃稀释菌液，将LB-30℃稀释菌液分别涂布至LB平板和LB+kan平板上，每个平板100μL LB-30℃稀释菌液，然后于30℃下培养18小时，分别得到LB-LB-30℃平板和LB-LB+kan-30℃平板，统计LB-LB-30℃平板和LB-LB+kan-30℃平板上的菌落数，计算得到重组载体pBBR1MCS-2-Ts1在30℃LB液体培养基中的丢失率(表2)，载体的丢失率＝(LB-LB-30℃平板上的菌落数－LB-LB+kan-30℃平板上的菌落数)÷LB-LB-30℃平板上的菌落数；
②将菌液按1：1000的比例接种至3mL LB+kan液体培养基中，然后于30℃下培养18小时，得到LB+kan-30℃菌液；将LB+kan-30℃菌液稀释后得到LB+kan-30℃稀释菌液，将LB+kan-30℃稀释菌液分别涂布至LB平板和LB+kan平板上，每个平板100μL LB+kan-30℃稀释菌液，然后于30℃下培养18小时，分别得到LB+kan-LB-30℃平板和LB+kan-LB+kan-30℃平板，统计LB+kan-LB-30℃平板和LB+kan-LB+kan-30℃平板上的菌落数，计算得到重组载体pBBR1MCS-2-Ts1在30℃LB+kan液体培养基中的丢失率(表2)，载体的丢失率＝(LB+kan-LB-30℃平板上的菌落数－LB+kan-LB+kan-30℃平板上的菌落数)÷LB+kan-LB-30℃平板上的菌落数；
③将菌液按1：1000的比例接种至3mL LB液体培养基中，然后于42℃下培养18小时，得到LB-42℃菌液；将LB-42℃菌液稀释后得到LB-42℃稀释菌液，将LB-42℃稀释菌液分别涂布至LB平板和LB+kan平板上，每个平板100μL LB-42℃稀释菌液，然后于42℃下培养18小时，分别得到LB-LB-42℃平板和LB-LB+kan-42℃平板，统计LB-LB-42℃平板和LB-LB+kan-42℃平板上的菌落数，计算得到重组载体pBBR1MCS-2-Ts1在42℃LB液体培养基中的丢失率(表2)，载体的丢失率＝(LB-LB-42℃平板上的菌落数－LB-LB+kan-42℃平板上的菌落数)÷LB-LB-42℃平板上的菌落数。
按照上述方法，将T1(pBBR1MCS-2-Ts1)替换为T1(pBBR1MCS-2-Ts2)、T1(pBBR1MCS-2-Ts3)、T1(pBBR1MCS-2-Ts4)和T1(pBBR1MCS-2)，其他步骤均不变，得到重组载体pBBR1MCS-2-Ts2、pBBR1MCS-2-Ts3、pBBR1MCS-2-Ts4和pBBR1MCS-2分别在30℃LB液体培养基、30℃LB+kan液体培养基和42℃LB液体培养基中的丢失率(表2)。
表2、重组载体在不同温度下的丢失率
上述pBBR1MCS-2-Ts1、pBBR1MCS-2-Ts2、pBBR1MCS-2-Ts3和pBBR1MCS-2-Ts4在30℃LB液体培养基中的丢失率在8.70％-9.62％间，在30℃LB+kan液体培养基中的丢失率在4.44％-7.84％间，而在42℃LB液体培养基中的丢失率均达99.99％，而pBBR1MCS-2在这三种液体培养基中的丢失率在4.76％-9.80％间，说明pBBR1MCS-2-Ts1、pBBR1MCS-2-Ts2、pBBR1MCS-2-Ts3和pBBR1MCS-2-Ts4均为温度敏感型载体。
实施例2、pBBR1MCS-2-Ts1、pBBR1MCS-2-Ts2、pBBR1MCS-2-Ts3和pBBR1MCS-2-Ts4在大肠杆菌Escherichia coli DH5α中的温度敏感性
分别将pBBR1MCS-2及实施例1步骤1的pBBR1MCS-2-Ts1、pBBR1MCS-2-Ts2、pBBR1MCS-2-Ts3和pBBR1MCS-2-Ts4分别导入大肠杆菌Escherichia coli DH5α中，分别得到重组大肠杆菌DH5α(pBBR1MCS-2)、DH5α(pBBR1MCS-2-Ts1)、DH5α(pBBR1MCS-2-Ts2)、DH5α(pBBR1MCS-2-Ts3)和DH5α(pBBR1MCS-2-Ts4)。
按照实施例1步骤2的方法，将T1(pBBR1MCS-2-Ts1)分别替换为上述DH5α(pBBR1MCS-2)、DH5α(pBBR1MCS-2-Ts1)、DH5α(pBBR1MCS-2-Ts2)、DH5α(pBBR1MCS-2-Ts3)和DH5α(pBBR1MCS-2-Ts4)，其他步骤均不变，分别得到宿主菌为大肠杆菌Escherichia coli DH5α时重组载体pBBR1MCS-2、pBBR1MCS-2-Ts1、pBBR1MCS-2-Ts2、pBBR1MCS-2-Ts3和pBBR1MCS-2-Ts4分别在30℃LB液体培养基、30℃LB+kan液体培养基和42℃LB液体培养基中的丢失率(表3)。
表3、温度敏感型载体在大肠杆菌Escherichia coli DH5α中的丢失率
在宿主菌为大肠杆菌Escherichia coli DH5α时，pBBR1MCS-2、pBBR1MCS-2-Ts1、pBBR1MCS-2-Ts2、pBBR1MCS-2-Ts3和pBBR1MCS-2-Ts4在30℃LB液体培养基和30℃LB+kan液体培养基中的丢失率以及pBBR1MCS-2在42℃LB液体培养基中的丢失率均在10％以下，pBBR1MCS-2-Ts1、pBBR1MCS-2-Ts2、pBBR1MCS-2-Ts3和pBBR1MCS-2-Ts4在42℃LB液体培养基中的丢失率均达到99.99％，说明pBBR1MCS-2-Ts1、pBBR1MCS-2-Ts2、pBBR1MCS-2-Ts3和pBBR1MCS-2-Ts4在大肠杆菌Escherichia coli DH5α中均可表现出其温度敏感性。
实施例3、pBBR1MCS-2-Ts1、pBBR1MCS-2-Ts2、pBBR1MCS-2-Ts3和pBBR1MCS-2-Ts4在大肠杆菌Escherichia coli BW25113中的温度敏感性
分别将pBBR1MCS-2及实施例1步骤1的pBBR1MCS-2-Ts1、pBBR1MCS-2-Ts2、pBBR1MCS-2-Ts3和pBBR1MCS-2-Ts4分别导入大肠杆菌Escherichia coli BW25113中，分别得到重组大肠杆菌BW25113(pBBR1MCS-2)、BW25113(pBBR1MCS-2-Ts1)、BW25113(pBBR1MCS-2-Ts2)、BW25113(pBBR1MCS-2-Ts3)和BW25113(pBBR1MCS-2-Ts4)。
按照实施例1步骤2的方法，将T1(pBBR1MCS-2-Ts1)分别替换为上述BW25113(pBBR1MCS-2)、BW25113(pBBR1MCS-2-Ts1)、BW25113(pBBR1MCS-2-Ts2)、BW25113(pBBR1MCS-2-Ts3)和BW25113(pBBR1MCS-2-Ts4)，其他步骤均不变，分别得到宿主菌为大肠杆菌Escherichia coli BW25113时重组载体pBBR1MCS-2、pBBR1MCS-2-Ts1、pBBR1MCS-2-Ts2、pBBR1MCS-2-Ts3和pBBR1MCS-2-Ts4分别在30℃LB液体培养基、30℃LB+kan液体培养基和42℃LB液体培养基中的丢失率(表4)。
表4、温度敏感型载体在大肠杆菌Escherichia coli BW25113中的丢失率
在宿主菌为大肠杆菌Escherichia coli BW25113时，pBBR1MCS-2、pBBR1MCS-2-Ts1、pBBR1MCS-2-Ts2、pBBR1MCS-2-Ts3和pBBR1MCS-2-Ts4在30℃LB液体培养基和30℃LB+kan液体培养基中的丢失率以及pBBR1MCS-2在42℃LB液体培养基中的丢失率均在10％以下，pBBR1MCS-2-Ts1、pBBR1MCS-2-Ts2、pBBR1MCS-2-Ts3和pBBR1MCS-2-Ts4在42℃LB液体培养基中的丢失率均达到99.99％，说明pBBR1MCS-2-Ts1、pBBR1MCS-2-Ts2、pBBR1MCS-2-Ts3和pBBR1MCS-2-Ts4在大肠杆菌Escherichia coli BW25113中均可表现出其温度敏感性。
实施例4、pBBR1MCS-2-Ts1、pBBR1MCS-2-Ts2、pBBR1MCS-2-Ts3和pBBR1MCS-2-Ts4在大肠杆菌Escherichia coli S17-1中的温度敏感性
分别将pBBR1MCS-2及实施例1步骤1的pBBR1MCS-2-Ts1、pBBR1MCS-2-Ts2、pBBR1MCS-2-Ts3和pBBR1MCS-2-Ts4分别导入大肠杆菌Escherichia coli S17-1中，分别得到重组大肠杆菌S17-1(pBBR1MCS-2)、S17-1(pBBR1MCS-2-Ts1)、S17-1(pBBR1MCS-2-Ts2)、S17-1(pBBR1MCS-2-Ts3)和S17-1(pBBR1MCS-2-Ts4)。
按照实施例1步骤2的方法，将T1(pBBR1MCS-2-Ts1)分别替换为上述S17-1(pBBR1MCS-2)、S17-1(pBBR1MCS-2-Ts1)、S17-1(pBBR1MCS-2-Ts2)、S17-1(pBBR1MCS-2-Ts3)和S17-1(pBBR1MCS-2-Ts4)，其他步骤均不变，分别得到宿主菌为大肠杆菌Escherichia coli S17-1时重组载体pBBR1MCS-2、pBBR1MCS-2-Ts1、pBBR1MCS-2-Ts2、pBBR1MCS-2-Ts3和pBBR1MCS-2-Ts4分别在30℃LB液体培养基、30℃LB+kan液体培养基和42℃LB液体培养基中的丢失率(表5)。
表5、温度敏感型载体在大肠杆菌Escherichia coli S17-1中的丢失率
在宿主菌为大肠杆菌Escherichia coli S17-1时，pBBR1MCS-2、pBBR1MCS-2-Ts1、pBBR1MCS-2-Ts2、pBBR1MCS-2-Ts3和pBBR1MCS-2-Ts4在30℃LB液体培养基和30℃LB+kan液体培养基中的丢失率以及pBBR1MCS-2在42℃LB液体培养基中的丢失率均在10％以下，pBBR1MCS-2-Ts1、pBBR1MCS-2-Ts2、pBBR1MCS-2-Ts3和pBBR1MCS-2-Ts4在42℃LB液体培养基中的丢失率均达到99.99％，说明pBBR1MCS-2-Ts1、pBBR1MCS-2-Ts2、pBBR1MCS-2-Ts3和pBBR1MCS-2-Ts4在大肠杆菌Escherichia coli S17-1中均可表现出其温度敏感性。
实施例5、pBBR1MCS-2-Ts1、pBBR1MCS-2-Ts2、pBBR1MCS-2-Ts3和pBBR1MCS-2-Ts4在类球红细菌Rhodobacter sphaeroides 2.4.1中的温度敏感性
1、重组类球红细菌的制备
(1)将实施例4的重组大肠杆菌S17-1(pBBR1MCS-2)在LB+kan液体培养基中37℃摇瓶过夜培养，次日以1/10的转接量转接至新鲜的LB液体培养基，继续培养约1-2小时至OD600为1.0左右，得到S17-1(pBBR1MCS-2)培养液；取1.5mL S17-1(pBBR1MCS-2)培养液7000rpm下离心3-5分钟，弃上清液，得到菌体沉淀，用新鲜的LB培养基洗涤菌体沉淀2次，用200μL LB液体培养基重悬菌体沉淀，得到供体菌悬浮液；
(2)将类球红细菌Rhodobacter sphaeroides 2.4.1在LB液体培养基中30℃下培养24小时后转接至新鲜的LB培养基继续培养约24小时至OD600为1.7-2.5左右，得到类球红细菌培养液；取1.5mL类球红细菌培养液7000rpm下离心3-5分钟，弃上清液，得到菌体沉淀，用新鲜的LB培养基洗涤菌体沉淀2次，用300μL LB液体培养基重悬菌体沉淀，得到受体菌悬浮液；
(3)将30μL步骤(1)的供体菌悬浮液和300μL步骤(2)的受体菌悬浮液混匀后涂布于LB平板上，30℃培养20-24小时；
(4)将步骤(3)LB平板上长出的菌用冰上预冷的1mL Sistrom培养基洗脱至EP管中。4℃5000rpm下离心2分钟，弃上清液，用500μl冰上预冷的Sistrom培养基洗涤沉淀两次，最后用100μL冰上预冷的Sistrom培养基重悬沉淀，得到菌体悬浮液；
(5)将步骤(4)的菌体悬浮液涂布在Sistrom平板(Sistrom平板为向Sistrom培养基中加入K2TeO3和卡那霉素得到的K2TeO3浓度为150mg/L、卡那霉素浓度为50mg/L的固体培养基)上，30℃下培养3-5天长出接合子，即为含有pBBR1MCS-2-Ts1的重组类球红细菌，将该重组菌命名为R.s(pBBR1MCS-2)。
按照上述步骤(1)-(5)的方法，分别将重组大肠杆菌S17-1(pBBR1MCS-2)替换为S17-1(pBBR1MCS-2-Ts1)、S17-1(pBBR1MCS-2-Ts2)、S17-1(pBBR1MCS-2-Ts3)和S17-1(pBBR1MCS-2-Ts4)，替他步骤均不变，得到分别含有pBBR1MCS-2-Ts1、pBBR1MCS-2-Ts2、pBBR1MCS-2-Ts3和pBBR1MCS-2-Ts4的重组类球红细菌，将这些重组菌分别命名为R.s(pBBR1MCS-2-Ts1)、R.s(pBBR1MCS-2-Ts2)、R.s(pBBR1MCS-2-Ts3)和R.s(pBBR1MCS-2-Ts4)。
2、pBBR1MCS-2-Ts1、pBBR1MCS-2-Ts2、pBBR1MCS-2-Ts3和pBBR1MCS-2-Ts4在类球红细菌Rhodobacter sphaeroides 2.4.1中的温度敏感性
将步骤1的R.s(pBBR1MCS-2-Ts1)接种至LB+kan液体培养基中，于30℃培养20小时，将得到的菌液进行以下处理：
①将菌液按1：500的比例接种至3mL LB液体培养基中，然后于30℃下培养24小时，得到LB-30℃菌液；将LB-30℃菌液稀释后得到LB-30℃稀释菌液，将LB-30℃稀释菌液分别涂布至LB平板和LB+kan平板上，每个平板100μL LB-30℃稀释菌液，然后于30℃下培养4天，分别得到LB-LB-30℃平板和LB-LB+kan-30℃平板，统计LB-LB-30℃平板和LB-LB+kan-30℃平板上的菌落数，计算得到重组载体pBBR1MCS-2-Ts1在30℃LB液体培养基中的丢失率，载体的丢失率＝(LB-LB-30℃平板上的菌落数－LB-LB+kan-30℃平板上的菌落数)÷LB-LB-30℃平板上的菌落数；
②将菌液按1：500的比例接种至3mL LB+kan液体培养基中，然后于30℃下培养24小时，得到LB+kan-30℃菌液；将LB+kan-30℃菌液稀释后得到LB+kan-30℃稀释菌液，将LB+kan-30℃稀释菌液分别涂布至LB平板和LB+kan平板上，每个平板100μL LB+kan-30℃稀释菌液，然后于30℃下培养4天，分别得到LB+kan-LB-30℃平板和LB+kan-LB+kan-30℃平板，统计LB+kan-LB-30℃平板和LB+kan-LB+kan-30℃平板上的菌落数，计算得到重组载体pBBR1MCS-2-Ts1在30℃LB+kan液体培养基中的丢失率，载体的丢失率＝(LB+kan-LB-30℃平板上的菌落数－LB+kan-LB+kan-30℃平板上的菌落数)÷LB+kan-LB-30℃平板上的菌落数；
③将菌液按1：500的比例接种至3mL LB液体培养基中，然后于37℃下培养24小时，得到LB-37℃菌液；将LB-37℃菌液稀释后得到LB-37℃稀释菌液，将LB-37℃稀释菌液分别涂布至LB平板和LB+kan平板上，每个平板100μL LB-37℃稀释菌液，然后于37℃下培养4天，分别得到LB-LB-37℃平板和LB-LB+kan-37℃平板，统计LB-LB-37℃平板和LB-LB+kan-37℃平板上的菌落数，计算得到重组载体pBBR1MCS-2-Ts1在37℃LB液体培养基中的丢失率(表6)，载体的丢失率＝(LB-LB-37℃平板上的菌落数－LB-LB+kan-37℃平板上的菌落数)÷LB-LB-37℃平板上的菌落数。
按照上述方法，将R.s(pBBR1MCS-2-Ts1)替换为R.s(pBBR1MCS-2-Ts2)、R.s(pBBR1MCS-2-Ts3)、R.s(pBBR1MCS-2-Ts4)和R.s(pBBR1MCS-2)，其他步骤均不变，分别得到宿主菌为类球红细菌Rhodobacter sphaeroides 2.4.1时重组载体pBBR1MCS-2、pBBR1MCS-2-Ts1、pBBR1MCS-2-Ts2、pBBR1MCS-2-Ts3和pBBR1MCS-2-Ts4分别在30℃LB液体培养基、30℃LB+kan液体培养基和37℃LB液体培养基中的丢失率(表6)。
表6、温度敏感型载体在类球红细菌Rhodobacter sphaeroides 2.4.1中的丢失率
在宿主菌为类球红细菌Rhodobacter sphaeroides 2.4.1时，pBBR1MCS-2、pBBR1MCS-2-Ts1、pBBR1MCS-2-Ts2、pBBR1MCS-2-Ts3和pBBR1MCS-2-Ts4在30℃LB液体培养基和30℃LB+kan液体培养基中的丢失率以及pBBR1MCS-2在37℃LB液体培养基中的丢失率均在13％以下，pBBR1MCS-2-Ts1、pBBR1MCS-2-Ts2、pBBR1MCS-2-Ts3和pBBR1MCS-2-Ts4在37℃LB液体培养基中的丢失率分别达到78.18％、81.36％、80.53％和78.57％，说明pBBR1MCS-2-Ts1、pBBR1MCS-2-Ts2、pBBR1MCS-2-Ts3和pBBR1MCS-2-Ts4在类球红细菌Rhodobacter sphaeroides 2.4.1中均可表现出其一定的温度敏感性。
Claims (10)
1.构建重组载体的方法，是将SEQ ID No.1的第1557-2526位所示的DNA片段替换为目的基因表达盒，并保持SEQ ID No.1的其他核苷酸不变，得到的重组DNA即为所述重组载体；
所述目的基因表达盒编码的蛋白质为将SEQ ID No.2所示的蛋白质进行A1)的改造、保持SEQ ID No.2的其它氨基酸残基均不变得到的蛋白质：所述A1)为如下A11)和/或A12)和/或A13)：
A11)将SEQ ID No.2第12位的Ala突变为Thr；
A12)将SEQ ID No.2第81位的Asp突变为His；
A13)将SEQ ID No.2第140位的His突变为Leu。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述目的基因表达盒中的目的基因为将SEQ ID No.1的第1794-2456位核苷酸所示的DNA分子进行B1)的改造、保持SEQ ID No.1的第1794-2456位核苷酸所示的DNA分子中的其它核苷酸均不变得到的DNA分子：所述B1)为如下B11)和/或B12)和/或B13)和/或B14)：
B11)将SEQ ID No.1第1827位的G突变为A；
B12)将SEQ ID No.1第2034位的G突变为C；
B13)将SEQ ID No.1第2212位的A突变为T；
B14)将SEQ ID No.1第2249位的C突变为A。
3.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于：所述目的基因表达盒中启动所述目的基因表达的启动子为SEQ ID No.1的第1557-1793位所示的DNA分子；所述目的基因表达盒中终止所述目的基因表达的终止子为SEQ ID No.1的第2457-2526位所示的DNA分子。
4.构建重组载体的方法，是将SEQ ID No.1的第1557-2526位所示的DNA片段替换为目的基因表达盒，并保持SEQ ID No.1的其他核苷酸不变，得到的重组DNA即为所述重组载体；
所述目的基因表达盒编码的蛋白质为将SEQ ID No.2所示的蛋白质进行权利要求1所述A1)及下述A2)、A3)和A4)这三种中至少一种的改造、保持SEQ ID No.2的其它氨基酸残基均不变得到的蛋白质：
A2)将SEQ ID No.2第130位的His突变为Gln；
A3)将SEQ ID No.2第86位的Arg突变为Cys；
A4)如下A41)和/或A42)：
A41)将SEQ ID No.2第25位的Lys突变为Glu；
A42)将SEQ ID No.2第146位的Ile突变为Val。
5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于：所述目的基因表达盒中的目的基因为将SEQ ID No.1的第1794-2456位核苷酸所示的DNA分子进行权利要求2所述B1)及下述B2)、B3)和B4)这三种中至少一种的改造、保持SEQ ID No.1的第1794-2456位核苷酸所示的DNA分子中的其它核苷酸均不变得到的DNA分子：
B2)将SEQ ID No.1第2183位的C突变为G；
B3)将SEQ ID No.1第2049位的C突变为T；
B4)如下B41)和/或B42)：
B41)将SEQ ID No.1第1866位的A突变为G；
B42)将SEQ ID No.1第2229位的A突变为G。
6.根据权利要求4或5所述的方法，其特征在于：所述目的基因表达盒中启动所述目的基因表达的启动子为将SEQ ID No.1的第1557-1793位所示的DNA分子进行如下C2)、C3)和C4)这三种中至少一种的改造、保持SEQ ID No.1的第1557-1793位核苷酸所示的DNA分子中的其它核苷酸均不变得到的DNA分子：
C2)如下C21)和/或C22)：
C21)将SEQ ID No.1第1732位的A突变为G；
C22)将SEQ ID No.1第1780位的G突变为T；
C3)如下C31)和/或C32)：
C31)将SEQ ID No.1第1747位的C突变为T；
C32)将SEQ ID No.1第1776位的T突变为A；
C4)将SEQ ID No.1第1751位的T突变为A；
所述目的基因表达盒中终止所述目的基因表达的终止子为SEQ ID No.1的第2457-2526位所示的DNA分子。
7.由权利要求1-6中任一所述方法构建的重组载体。
8.含有权利要求7所述重组载体的重组微生物或重组细胞系。
9.下述任一产品：
P1、权利要求1或4所述蛋白质；
P2、权利要求2或5所述目的基因。
10.下述任一应用：
L1、权利要求2或5所述目的基因在制备温度敏感载体中的应用；
L2、权利要求7所述重组载体在作为温度敏感载体中的应用。
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| WO2003076452A2 (en) * | 2002-03-08 | 2003-09-18 | E.I. Du Pont De Nemours And Company | Temperature sensitive mutant derivatives of the broad host range plasmid pbhr1 |
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