CN102559709A - 一种来自恶臭假单胞菌的黄素单加氧酶基因fmo及其制备方法和应用 - Google Patents

一种来自恶臭假单胞菌的黄素单加氧酶基因fmo及其制备方法和应用 Download PDF

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Abstract

本发明涉及一种来自恶臭假单胞菌的黄素单加氧酶基因FMO及其制备方法和应用。具体涉及一种利用功能互补法从来自被芳香族化合物污染的土壤中能以色氨酸为底物合成靛蓝的恶臭假单胞菌克隆、编码黄素单加氧酶(FMO)基因，并将该基因重组到大肠杆菌体内，得到的一种具有黄素单加氧酶活性的重组菌，将其命名为黄素单加氧酶基因FMO，其核苷酸序列如SEQ ID No 1所示，其编码的氨基酸序列如SEQ ID No2所示。在有色氨酸存在的条件下，用该黄素单加氧酶基因FMO可合成靛蓝。

Description

一种来自恶臭假单胞菌的黄素单加氧酶基因FMO及其制备方法和应用
技术领域
本发明属微生物领域，涉及一种来自恶臭假单胞菌的黄素单加氧酶基因FMO及其制备方法和应用，具体涉及一种利用功能互补法从来自被芳香族化合物污染的土壤中能以色氨酸为底物合成靛蓝的恶臭假单胞菌克隆、编码黄素单加氧酶(FMO)基因，并将该基因重组到大肠杆菌体内，得到的一种具有黄素单加氧酶活性的重组菌，将其命名为黄素单加氧酶基因FMO。在有色氨酸存在的条件下，用该黄素单加氧酶基因FMO可合成靛蓝。
背景技术
靛蓝是最早发现的天然染料之一，广泛应用于印染、医药和食品等工业。大部分靛蓝是由化学法生产，天然靛蓝比例非常小。从自然作物中提取远远不能满足生产需求，研究者将眼光转向能够生产色素的微生物。微生物生长快、培养容易，易于工业化，利用微生物生产天然色素的技术具有广阔的发展前景。
微生物合成靛蓝最早的报道是在1982年，研究者从土壤中分离到一株氧化吲哚假单胞菌(Pseudomonans indoloxidaes)通过氧化吲哚合成靛蓝【任吉元，王文涛等，染料工业，1997】。到20世纪80年代中期，研究者开始对生物合成靛蓝的原理进行深入研究，结果发现真菌合成靛蓝的周期太长，1个周期至少要1个月，而细菌的周期相对较短，1个周期一般为18-24h，产量较高，于是研究者重点对细菌进行相关研究。
20世纪80年代中期，研究者发现细菌合成靛蓝的两条路径。即微生物合成靛蓝的双加氧酶途径和羟化酶途径。1983年美国Texas大学微生物系和应用微生物学中心的Ensley等利用遗传工程技术，选育出能够产生靛蓝的菌株。这种菌株的选育，主要是把2种酶编码的基因组建在一个菌株中，首先由色氨酸酶将色氨酸转变成吲哚，然后由萘双加氧酶将吲哚氧化成吲羟【Ensley B.D.Science.1983，222(4620)：167-169】。1985年瑞士日内瓦大学的Mermod等报道了另一种合成靛蓝的途径。即一种假单胞菌(Pseudomonae putida mt-2)中含有可以降解甲苯、二甲苯或甲苯的其他衍生物的酶的基因。这种基因在TOL质粒上，利用二甲苯氧化酶的释放、产生、脱羟和单加氧化作用。以吲哚作为靛蓝的前体，在二甲苯氧化酶的作用下，直接在C3位置发生羟化生成吲羟，单加氧酶使双键发生环化再经空气氧化，自动二聚形成靛蓝【Mermod N.Bio Technology.1986，4(4)：321-324】。
长期以来研究者沿着这两条路径来寻找新的突破。并最终确定了苯乙烯单加氧酶、苯酚羟化酶、黄素单加氧酶等。在20世纪末，研究者发现细胞色素P450酶在生物合成靛蓝中的也具有重要作用【李红梅等，生物化学与生物物理进展。2005，32(7)：1-6】。
对生物合成靛蓝的酶的研究目前仍主要集中在双加氧酶和单加氧酶上，细胞色素酶的研究也是最近才开始，而其反应系统要比双加氧酶和单加氧酶复杂很多，并且由于反应机理的限制，要想取得重大突破还是需要付出更多努力来寻找创新点。开发新菌种仍然是未来的努力方向【辛嘉英等，现代化工，2008，28(7)：31-35】。
发明内容
本发明所要解决的技术问题在于提供一种来自恶臭假单胞菌的黄素单加氧酶基因FMO及其制备方法和应用，所述基因来源于受萘、苯酚等芳香族化合物污染的土壤中筛选获得的能在色氨酸存在时合成靛蓝的恶臭假单胞菌。
本发明的技术方案是通过以下方式来实现的。
所述的来自恶臭假单胞菌的黄素单加氧酶基因FMO，编码成一个新型的黄素单加氧酶，其核苷酸序列如SEQ ID No1所示，其编码的氨基酸序列如SEQ ID No2所示。
所述的黄素单加氧酶基因FMO的获取方法如下：利用含0.001％色氨酸的LB培养基，从被萘、苯酚等芳香族化合物污染的土壤微生物中，选择菌落颜色为靛蓝色的菌株；再将选择出来的菌落置于LB液体培养基中培养12小时以上；之后提取总DNA，用0.02-0.5u/μL浓度限制性核酸内切酶Sau3A酶切提取所得的总DNA，时间20-60分钟，并将酶切片段连接到表达载体pG251(CN1338515NCBI)中，将连接物转化到感受态大肠杆菌菌株DH5α中，提取质粒pFMO，再次转入大肠杆菌DH5α，涂布于含有0.001％色氨酸的LB平板上，挑选颜色为靛蓝色的菌落。从该靛蓝色菌种克隆抽提的质粒pFMO再次转入大肠杆菌DH5α，结果证明这个克隆所产生的菌落均为靛蓝色，对质粒pFMO进行测序，即得本发明的黄素单加氧酶基因FMO。
所述的来自恶臭假单胞菌的黄素单加氧酶基因FMO的具体获取方法，包括以下步骤：
1、菌种分离
称取被芳香族化合物污染的土壤样品1g，加入0.9％(w/v)氯化钠溶液1ml，5000转/分震荡混匀，3000转/分轻离心，倒掉上清，再加入0.9％(w/v)氯化钠溶液1ml，5000转/分震荡混匀，冰上10min静置，吸取150μl溶液涂布于含有0.001％色氨酸的LB固体培养基中培养24h。将颜色为靛蓝色的单菌落接种于加入1.6ml LB液体培养基的试管中，28℃培养48h，然后吸取150μl的培养液再次涂布与含有色氨酸的LB固体培养基中培养48h，观察并挑取菌落颜色为靛蓝色生长良好的菌株。
2、总DNA提取
将分离获得的细菌单株在液体LB培养基(5g/L酵母提取物，5g/L NaCl，10g/L胰蛋白胨，磷酸缓冲液pH7.5)中培养过夜(16小时)，菌体培养液以6，000g重力加速度离心5min，得到菌体沉淀。先将这些沉淀在-20℃下冷冻1h，之后使用TE缓冲液(10mM Tris-HCl，1mMEDTA，pH 8.0)清洗一次，然后悬浮于浓度为10mg/mL溶菌酶的无菌水中，37℃摇床培养1h。
接着向培养液中加入0.5M EDTA，10％(w/v)SDS和浓度为5M的NaCl并轻轻振荡混匀后，再加入浓度为20mg/mL蛋白激酶K，37℃培养1h。用与培养菌液液体体积相当(1倍体积)的苯酚∶氯仿∶异戊醇(25∶24∶1，体积比)提取DNA；水相用与相当水相体积1/2的氯仿∶异戊醇(24∶1，体积比)萃取，振荡混匀后离心5min。水相中加入与水相体积相当(1倍体积)的异戊醇，振荡混匀后离心15min。取沉淀，用70％(v/v)酒精冲洗DNA，干燥，之后在TE缓冲液中重悬浮，所得总DNA于4℃保存。
3、恶臭假单胞菌黄素单加氧酶基因FMO的获取与筛选
用0.02-0.5u/μL浓度限制性核酸内切酶Sau3A酶切提取所得的总DNA成团泛菌，时间20-60分钟，然后0.7％(w/v)琼脂糖凝胶电泳，切下长度为5-7kb的DNA片段，用胶试剂盒(上海生工生物工程有限公司)回收。选择pG251(CN1338515NCBI)作为表达载体，用限制性核酸内切酶BamHI酶切并进行胶回收。
先对酶切的载体质粒进行去磷酸化操作，以降低质粒自连，并对碱性磷酸酶进行失活操作(Sambrook，分子克隆手册，1989)，再与外源的DNA片段(即长度为5-7kb的恶臭假单胞菌DNA片段)连接。反应温度16℃，连接时间10-12h。
连接产物用正丁醇沉淀后，用70％(v/v)的乙醇离心洗涤，最后用10μl的超纯水溶解，将连接物进行电击转化大肠杆菌DH5α感受态细胞，电击参数为：电脉冲2.5μF，电压2.5kV，电阻200Ω，电击时间为4.5S。复苏后，将菌液涂布于LB固体培养基(含有50μg/mL氨苄青霉素)平板上，37℃培养12-16h，而后用质粒大量提取试剂盒(美国Omega公司)进行质粒pFMO提取，这样就构建成了包含有目的基因的基因组文库。
将大量提取的质粒转入大肠杆菌DH5α涂布与含有色氨酸的LB平板上培养48h，挑选颜色为靛蓝色的菌落。从靛蓝色菌落克隆抽提的质粒pFMO再次转入大肠杆菌DH5α将转化子用无菌牙签划于含0.001％色氨酸的LB培养基上，结果证明这个克隆产生的菌落均为靛蓝色，表明靛蓝合成功能确实是由于转入pFMO引起的。
从上述靛蓝色菌落中提取质粒pFMO进行测序，找出载体中插入恶臭假单胞菌的DNA片断进行序列分析，寻找阅读编码框，其中包含了一个1382bp的阅读框，即为本发明的黄素单加氧酶FMO，其序列如SEQ ID No 1所示，其编码的氨基酸序列如SEQ ID No2所示。在该阅读框的左右两侧设计引物：
PFMOZ：5’-GGATCCATGACTCTTCGTGTAGCTATC-3’和
PFMOF：5’-GAGCTCCTACCGGCGCAGGGCCTTCAC-3’为扩增引物，以pFMO质粒DNA为模版，对1382bp的阅读框进行PCR扩增。将回收片段用BamHI和SacI双酶解，与pG251表达载体连接，将连接产物转入大肠杆菌DH5α涂布与含有0.001％色氨酸的LB平板上培养48h，确定1382bp阅读框表达质粒的正确性。
利用PCR进行全长扩增，在Taq DNA聚合酶存在的反应体系中，使用多个扩增引物和2个外侧引物完成。扩增条件依次为：94℃预热1min；94℃30秒，50℃30秒，72℃延长10min，共25个循环。PCR结束后，0.8％(w/v)琼脂糖胶回收。
将上述SEQ ID No 1序列与表达载体相连接后转入微生物细胞中，能在含有色氨酸的LB培养基上合成靛蓝。
有益效果：
本发明采用来自被萘、苯酚等芳香族化合物污染的土壤中的恶臭假单胞菌(即一类能够在芳香族化合物中生长的细菌)，克隆此类细菌中的黄素单加氧酶基因，通过培养、提取总DNA和PCR扩增后，即得到如SEQ ID No1所示的黄素单加氧酶基因FMO，它可以应用于靛蓝燃料的生物合成，和降解芳香族污染物。
本发明所述的术语与其一般概念相同。
所述的“核苷酸”和“引物”序列均为5’端至3’端。
所述的“生物细胞”指微生物、植物细胞或组织。
所述的“微生物”指原核微生物或真核微生物，原核微生物主要为细菌；真核微生物为真菌或藻类，真菌主要指酵母菌。
附图说明
图1为FMO表达质粒与pG251空质粒转化大肠杆菌，其中A为DH5α(携带恶臭假单胞菌FMO表达质粒)，B为阴性对照，即DH5α(携带pG251空质粒)。
具体实施方式
以下结合附图详细描述本发明的技术方案。实施例仅用以说明本发明的技术方案而非限制，尽管参照较佳实施例对本发明进行了详细说明，本领域的普通技术人员应当理解，可以对发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的精神和范围，其均应涵盖在本发明的权利要求范围中。
本发明所用的试剂若未经说明，均购自西格玛-奥德里奇(Sigma-Aldrich)公司。
本发明涉及分子生物学实验，如没有特别注明，均参考自《分子克隆》一书(J.萨姆布鲁克、E.F.弗里奇、T.曼尼阿蒂斯著，科学出版社，1994)。该书及其后续出版版本是本领域技术人员在进行与分子生物学相关的实验操作时最常用的具有指导性的参考书籍。
实施例1菌种分离
称取被芳香族化合物污染的土壤样品1g，加入0.9％(w/v)氯化钠溶液1ml，5000转/分震荡混匀，3000转/分轻离心，倒掉上清，再加入0.9％(w/v)氯化钠溶液1ml，5000转/分震荡混匀，冰上10min静置，吸取150μl溶液涂布于含有色氨酸的LB固体培养基中培养24h。将颜色为靛蓝色的单菌落接种与加入1.6ml LB液体培养基的试管中，28℃培养48h，然后吸取150μl的培养液再次涂布与含有色氨酸的LB固体培养基中培养48h，观察并挑取菌落颜色为靛蓝色生长良好的菌株。
实施例2总DNA的提取及菌种鉴定
将实施例1分离获得的颜色为靛蓝色生长良好的细菌单株在10ml液体LB培养基(5g/L酵母提取物，5g/LNaCl，10g/L胰蛋白胨，磷酸缓冲液pH7.5)中培养16小时，菌体培养液以6，000g重力加速度离心5min，得到菌体沉淀。先将这些沉淀在-20℃下冷冻1h，之后使用TE缓冲液(10mM Tris-HCl，1mM EDTA，pH 8.0)清洗一次，然后加入20μl溶菌酶(Sigma-Aldrich)浓度为10mg/mL的无菌水悬浮，在37℃下摇床培养1h。
接着加入50μL浓度为0.5M EDTA，50μl浓度为10％(w/v)SDS和50μl浓度为5M的NaCl并轻轻振荡混匀后，再加入10μl浓度为20mg/mL蛋白激酶K(Takara日本)，反应物在37℃下培养1h。用与培养菌液体积相当(1倍体积)的苯酚∶氯仿∶异戊醇(25∶24∶1，体积比)提取DNA。水相用与相当水相体积1/2(0.5倍体积)的氯仿∶异戊醇(24∶1，体积比)萃取。振荡混匀后离心5min。水相中加入与水相体积相当(1倍体积)的异戊醇。振荡混匀后离心15min。取沉淀，用70％(v/v)酒精冲洗DNA，干燥，之后在TE缓冲液中重悬浮，所得的总DNA于4℃保存。
以抽提的总DNA为模板，利用细菌的16s rRNA特异性引物进行扩增。扩增的引物为P16SF：5’-GGTTACCTTGTTACGACTT-3’和P16SF：5’-AGAGTTGATCCTGGCTCAG-3’。以KOD Plus(Toyobo日本)为Taq DNA聚合酶，扩增条件依次为：94℃30秒，55℃30秒，72℃120秒，扩增30个循环。循环结束后，加入2个单位的rtaq酶(宝生物工程(大连)有限公司)，72℃延伸300秒，扩增片段长1500bp(GeneID：1045690NCBI)。PCR结束后，1％(w/v)琼脂糖凝胶回收，取10μl直接与T/A载体相连(宝生物工程(大连)有限公司)，4℃连接过夜。
先将上述利用16s rRNA特异性引物进行PCR扩增的片段与T/A载体的连接产物转化入大肠杆菌DH5α感受态细胞中，再用ABI Prism Big Dye的ABI3700毛细管自动化测序仪测序，测得的序列通过Blast程序与GenBank中核酸数据进行对比分析，得到菌株与恶臭假单胞菌中的16s rRNA有99％的同源性，说明该菌株为恶臭假单胞菌株。
实施例3利用色氨酸合成靛蓝的DNA片断分离和序列分析
用不同浓度(0.02-0.5u/μL)限制性核酸内切酶Sau3A(宝生物工程(大连)有限公司)酶切实施例2提取所得的恶臭假单胞菌总DNA，时间20-60分钟，然后0.7％(w/v)琼脂糖凝胶电泳，切下长度为5-7kb的DNA片段，用胶试剂盒(上海生工生物工程有限公司)回收。
选择pG251(CN1338515NCBI)作为表达载体，用限制性核酸内切酶BamHI(宝生物工程(大连)有限公司)酶切并进行胶回收。
先对酶切的载体质粒进行去磷酸化操作，以降低质粒自连，并对碱性磷酸酶进行失活操作(Sambrook，分子克隆手册，1989)，再与外源的DNA片段(即长度为5-7kb的成团泛菌DNA片段)连接。连接前，将回收的部分酶解的细菌基因组DNA片段与pG251载体DNA，用琼脂糖凝胶电泳的方法估计浓度，确保连接反应中外源DNA的浓度至少是载体浓度3-5倍。反应温度16℃，连接时间为10-12h。
连接产物用正丁醇沉淀后，用70％(v/v)的乙醇离心洗涤，最后用10μl的超纯水溶解，将连接物进行电击转化大肠杆菌DH5α感受态细胞，电击参数为：电脉冲2.5μF，电压2.5kV，电阻200Ω，电击时间为4.5S。复苏后，将菌液涂布于LB固体培养基(含有50μg/mL氨苄青霉素)平板上，37℃培养12-16h，而后用质粒大量提取试剂盒(美国Omega公司)进行质粒pFMO提取，这样就构建成了包含有目的基因的基因组文库。
将大量提取的质粒转入大肠杆菌DH5α涂布于含有0.001％的色氨酸的LB平板上培养48h，发现有多个菌落生长良好。将这些菌落接种到含0.001％色氨酸的LB平板上，挑选较好的菌落，抽提该克隆的质粒pFMO再次转入大肠杆菌DH5α中，将转化子用无菌牙签点于含0.001％色氨酸的LB固体培养基上，结果证明这个克隆所产生的转化子可合成靛蓝，表名靛蓝合成功能确实是由于转入pFMO引起的。
利用逐步序列测定方法对上述筛选获得的转化子进行DNA测序。测序的引物分别为：
Par 1：5’-GATGTTTGATGTTATGGAGCAG-3’
Par2：5’-CTGACAGCGTTATTGATGACA-3’
Par3：5’-GATCACCGCATGGCGATGTGT-3’
Par4：5’-AACG CCAGTCCACCAGCACG-3’
分析结果表明，插入的片断大小为3170bp，从测序结果中寻找阅读编码框，其中包含了一个1382bp的阅读框。在阅读框的左右两侧设计引物：
PFMOZ：5’-GGATCCATGACTCTTCGTGTAGCTATC-3’和
PFMOF：5’-GAGC TCCTACCGGCGCAGGGCCTTCAC-3’为扩增引物，以pFMO质粒DNA为模版，对1382bp的阅读框进行PCR扩增。使用KOD FX taq酶(Toyobo公司，日本)，扩增条件依次为：94℃30秒，68℃30秒，72℃2分钟，30个循环。然后加入2单位rtaq(宝生物工程(大连)有限公司)，在72℃延伸30分钟。PCR结束后，1％(w/v)琼脂糖凝胶回收，获得长度为1382bp的SEQ ID No1核苷酸，即为本发明的黄素单加氧酶FMO，其编码的氨基酸序列如SEQ ID No2所示。
将回收片段用BamHI和SacI双酶解，与pG251表达载体连接，用琼脂糖凝胶电泳的方法估计浓度，确保连接反应中外源DNA的浓度至少是载体浓度3-5倍。反应温度16℃，连接时间为10-12h。再将该载体转化入DH5α感受态中。利用ABI Prism Big Dye的ABI3700毛细管自动化测序仪测序，确定1382bp阅读框(恶臭假单胞菌FMO)表达质粒的正确性。
将大肠杆菌DH5α(携带恶臭假单胞菌FMO表达质粒)和DH5α(携带pG251空质粒)接种到含色氨酸的LB固体培养基中，经28℃、48h培养。结果发现：阴性对照B在LB中呈现正常菌落的淡黄色；而DH5α(携带恶臭假单胞菌FMO表达质粒)A在LB中菌落呈现明显的靛蓝色(参看图1)。
实施例4恶臭假单胞菌黄素单加氧酶基因FMO的筛选与合成
通过基因合成方法(Nucleic Acids Research，2004，32，e98)克隆筛选合成本发明的恶臭假单胞菌黄素单加氧酶基因FMO，所用的引物如下：
1FM01：
ATGACTCTTC GTGTAGCTAT CATCGGTGCC GGCCCCTCCG GCCTTGCGCA ACTGCGTGCC
2FMO-2：
GATTTGCGGC ATGGCGGCGC CCTGGGCATG GGCGGACTGG AAGGCACGCA GTTGCGCAAG
3FMO-3：
GCCGCCATGC CGCAAATCGT CTGCTTCGAA AAGCAGGCCG ACTGGGGCGG CATGTGGAAC
4FMO-4：
CACCGGCTCG CCATGCTGGT CGAGTCCGGT GCGCCAGGTG TAGTTCCACA TGCCGCCCCA
5FMO-5：
CAGCATGGCG AGCCGGTGCA CGGCAGCATG TACCGCTACT TGTGGTCCAA CGGCCCCAAG
6FMO-6：
GAAATGTTCA TCGAAGCTG TAGTCGGCGA ACTCCAGGCA CTCCTTGGGGC CGTTGGACCA
7FMO-7：
AGCTTCGATG AACATTTCG GCCGGCCAAT CTCCTCATAT CCGCCGCGCGA GGTGCTGTGG
8FMO-8：
ATCGCGCACC CCGGCTTTT TTCACGCGGC CCTGGATGTA GTCCCACAGCA CCTCGCGCGG
9FMO-9：
AAAGCCGGGG TGCGCGATT TCATCCGCTT CAATACCGTG GTCAAGCACGT CAGCTTCAAT
10FMO-10：
GCCGTAGTCA TGGGCGCTG ACGGTGAACT CGCGTGTCTG CTCATTGAAGC TGACGTGCTT
11FMO-11：
AGCGCCCATG ACTACGGCG CAGGGGTCGG CATCGAGCAG GTGTTCGACTA CGTGGTGGTC
12FMO-12：
TTCGAACTCC GGCACATGCG GGGTGGAGA AGTGGCCACT GGCGACCACCA CGTAGTCGAA
13FMO-13：
CATGTGCCGG AGTTCGAAGG CTTCGAGCG TTTCACCGGG CGTATCCTGCA CGCCCACGAT
14FMO-14：
GATGAGCAGG TCCTGGCCCT TGAATTCCA CCGCTTCACG AAAATCGTGGG CGTGCAGGAT
15FMO-15：
GGCCAGGACC TGCTCATCGT TGGCAGCA GTTATTCCGCC GAAGACATAGG TTCGCAGTGC
16FMO-16：
GGTACGTTAG GCCGTGGTGA TCGACCGTGC ACCGTACTT GTAGCACTGCG AACCTATGTC
17FMO-17：
ACCACGGCCT AACGTACCCA GGCCGATGGG GCTTCAAGTG GCCCACGGGG TGGGAAGAGC
18FMO-18：
CGAAGAACGC CAGGTCGTTC TCGACCCTGA CCAGTTGCGG ACGCTCTTCC CACCCCGTGG
19FMO-19：
ACGACCTGGC GTTCTTCGCC GATGGATCGA GCAAGCGCAT CGACGCAATC ATCCTGTGCA
20FMO-20：
TCAGCTCATC CGGCAGGAAC GGGAAGTGAT GCTGGTAGCC CGTGCACAGG ATGATTGCGT
21FMO-21：
TCCTGCCGGA TGAGCTGACC CTCAAGACCA ACAACCGCCT GTGGCCTGCG GGGCTCTACC
22FMO-22：
CCAGGTAGAG CAACTGCGGG TTCTGCTCCC AGACCACGCC TTGGTAGAGC CCCGCAGGCC
23FMO-23：
CGCAGTTGCT CTACCTGGGC ATGCAGGACC TCTGGTACAG CTTCAACCTG TTCGACGCCC
24FMO-24：
GCTGCAGGCG CCCCAGCATA TAGTCGCGTG CAAACCATGC CTGGGCGTCG AACAGGTTGA
25FMO-25：
TGCTGGGGCG CCTGCAGCTA CCGCCCAAGG CGGACATGCA AGCCGACAGC AAGCGCTGGC
26FMO-26：
CATACATCGA GGCTGTGGTT TCCAGACGCT CCTCATCCTC GCGCCAGCGC TTGCTGTCGG
27FMO-27：
CCACAGCCTC GATGTATGAG TTCCAGGGTC GATACATCAA GCACCTGATC GAGCAGACCG
28FMO-28：
GGAAGATGCG ATTGACCGCA TCGATGTCGA AGCTTGGGTA ATCGGTCTGC TCGATCAGGT
29FMO-29：
CGGTCAATCG CATCTTCCTG CAATGGAAGC AGGACAAGAA GCACGACATC ATGGGCTATC
30FMO-30：
CTGCTTTCGT GCCGGTGATC ACCGAGCGGT ACGACTTGTC GCGATAGCCC ATGATGTCGT
31FMO-31：
TCACCGGCAC GAAAGCAGTG CCCCACCATA CCCGCTGGAT GCAGGCGCTG GACGACTCGC
32FMO-32：
CCTCACCTTG CTTGCCGTCC GTTTCGCGCA GGTATTCCTG CAGCGAGTCG TCCAGCGCCT
33FMO-33：
ACGGCAAGCA AGGTGAGGTG AAGGCCCTGC GCCGGTAG
34FMO-34：
CTACCGGCGC AGGGCCTTCA
利用PCR进行β-胡萝卜素全长操纵子扩增，在100μl反应体系中，FMO-2-FMO-33共32个引物的添加量为2ng，外侧引物FMO-1和FMO-34添加量为30ng。以KOD FX taq酶(Toyobo公司，日本)为Taq DNA聚合酶。扩增条件依次为：94℃预热1min；94℃30s；50℃30s；72℃10min，使用的，共25个循环，扩增产物即为FMO基因。
PCR结束后，1％(w/v)琼脂糖胶回收，取10μl直接与T/A克隆载体相连(宝生物工程(大连)有限公司)，4℃连接过夜。高效转化大肠杆菌DH5α感受态细胞中，获得阳性克隆，将该阳性克隆经ABI Prism Big Dye的ABI3700毛细管自动化测序仪测序，获得长度为1382bp的SEQ ID No1核苷酸，即为本发明的黄素单加氧酶FMO，其编码的氨基酸序列如SEQIDNo2所示。
Figure IDA0000039875110000011
Figure IDA0000039875110000021
Figure IDA0000039875110000031

Claims (6)

1.一种来自恶臭假单胞菌的黄素单加氧酶基因FMO，其核苷酸序列如SEQ ID No 1所示。
2.权利要求1所述的恶臭假单胞菌的黄素单加氧酶基因FMO的制备方法，其特征在于，利用功能互补法对来自被芳香族化合物污染的土壤中能以色氨酸为底物合成靛蓝的恶臭假单胞菌克隆、编码黄素单加氧酶(FMO)基因，并将该基因重组到大肠杆菌体内而获得，具体包括以下步骤：
1)菌种分离；
2)总DNA的提取及菌种鉴定；
3)恶臭假单胞菌黄素单加氧酶基因FMO的筛选与合成。
3.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于，所述的芳香族化合物为萘或苯酚。
4.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于，通过基因合成方法克隆筛选与合成所述的黄素单加氧酶基因FMO。
5.根据权利要求4所述的制备方法，其特征在于，所述基因合成方法所用的引物如下：
1FMO 1：
ATGACTCTTC GTGTAGCTAT CATCGGTGCC GGCCCCTCCG GCCTTGCGCA ACTGCGTGCC
2FMO-2：
GATTTGCGGC ATGGCGGCGC CCTGGGCATG GGCGGACTGG AAGGCACGCA GTTGCGCAAG
3FMO-3：
GCCGCCATGC CGCAAATCGT CTGCTTCGAA AAGCAGGCCG ACTGGGGCGG CATGTGGAAC
4FMO-4：
CACCGGCTCG CCATGCTGGT CGAGTCCGGT GCGCCAGGTG TAGTTCCACA TGCCGCCCCA
5FMO-5：
CAGCATGGCG AGCCGGTGCA CGGCAGCATG TACCGCTACT TGTGGTCCAA CGGCCCCAAG
6FMO-6：
GAAATGTTCA TCGAAGCTG TAGTCGGCGA ACTCCAGGCA CTCCTTGGGGC CGTTGGACCA
7FMO-7：
AGCTTCGATG AACATTTCG GCCGGCCAAT CTCCTCATAT CCGCCGCGCGA GGTGCTGTGG
8FMO-8：
ATCGCGCACC CCGGCTTTT TTCACGCGGC CCTGGATGTA GTCCCACAGCA CCTCGCGCGG
9FMO-9：
AAAGCCGGGG TGCGCGATT TCATCCGCTT CAATACCGTG GTCAAGCACGT CAGCTTCAAT
10FMO-10：
GCCGTAGTCA TGGGCGCTG ACGGTGAACT CGCGTGTCTG CTCATTGAAGC TGACGTGCTT
11FMO-11：
AGCGCCCATG ACTACGGCG CAGGGGTCGG CATCGAGCAG GTGTTCGACTA CGTGGTGGTC
12FMO-12：
TTCGAACTCC GGCACATGCG GGGTGGAGA AGTGGCCACT GGCGACCACCA CGTAGTCGAA
13FMO-13：
CATGTGCCGG AGTTCGAAGG CTTCGAGCG TTTCACCGGG CGTATCCTGCA CGCCCACGAT
14FMO-14：
GATGAGCAGG TCCTGGCCCT TGAATTCCA CCGCTTCACG AAAATCGTGGG CGTGCAGGAT
15FMO-15：
GGCCAGGACC TGCTCATCGT TGGCAGCA GTTATTCCGCC GAAGACATAGG TTCGCAGTGC
16FMO-16：
GGTACGTTAG GCCGTGGTGA TCGACCGTGC ACCGTACTT GTAGCACTGCG AACCTATGTC
17FMO-17：
ACCACGGCCT AACGTACCCA GGCCGATGGG GCTTCAAGTG GCCCACGGGG TGGGAAGAGC
18FMO-18：
CGAAGAACGC CAGGTCGTTC TCGACCCTGA CCAGTTGCGG ACGCTCTTCC CACCCCGTGG
19FMO-19：
ACGACCTGGC GTTCTTCGCC GATGGATCGA GCAAGCGCAT CGACGCAATC ATCCTGTGCA
20FMO-20：
TCAGCTCATC CGGCAGGAAC GGGAAGTGAT GCTGGTAGCC CGTGCACAGG ATGATTGCGT
21FMO-21：
TCCTGCCGGA TGAGCTGACC CTCAAGACCA ACAACCGCCT GTGGCCTGCG GGGCTCTACC
22FMO-22：
CCAGGTAGAG CAACTGCGGG TTCTGCTCCC AGACCACGCC TTGGTAGAGC CCCGCAGGCC
23FMO-23：
CGCAGTTGCT CTACCTGGGC ATGCAGGACC TCTGGTACAG CTTCAACCTG TTCGACGCCC
24FMO-24：
GCTGCAGGCG CCCCAGCATA TAGTCGCGTG CAAACCATGC CTGGGCGTCG AACAGGTTGA
25FMO-25：
TGCTGGGGCG CCTGCAGCTA CCGCCCAAGG CGGACATGCA AGCCGACAGC AAGCGCTGGC
26FMO-26：
CATACATCGA GGCTGTGGTT TCCAGACGCT CCTCATCCTC GCGCCAGCGC TTGCTGTCGG
27FMO-27：
CCACAGCCTC GATGTATGAG TTCCAGGGTC GATACATCAA GCACCTGATC GAGCAGACCG
28FMO-28：
GGAAGATGCG ATTGACCGCA TCGATGTCGA AGCTTGGGTA ATCGGTCTGC TCGATCAGGT
29FMO-29：
CGGTCAATCG CATCTTCCTG CAATGGAAGC AGGACAAGAA GCACGACATC ATGGGCTATC
30FMO-30：
CTGCTTTCGT GCCGGTGATC ACCGAGCGGT ACGACTTGTC GCGATAGCCC ATGATGTCGT
31FMO-31：
TCACCGGCAC GAAAGCAGTG CCCCACCATA CCCGCTGGAT GCAGGCGCTG GACGACTCGC
32FMO-32：
CCTCACCTTG CTTGCCGTCC GTTTCGCGCA GGTATTCCTG CAGCGAGTCG TCCAGCGCCT
33FMO-33：
ACGGCAAGCA AGGTGAGGTG AAGGCCCTGC GCCGGTAG
34FMO-34：
CTACCGGCGC AGGGCCTTCA    。
6.权利要求1所述的来自恶臭假单胞菌的黄素单加氧酶基因FMO在靛蓝合成中的应用。
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Cited By (8)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN105802986A (zh) * 2016-04-05 2016-07-27 北京工商大学 一种产靛蓝色素基因工程菌的构建方法与应用
CN107384880A (zh) * 2016-11-09 2017-11-24 天津科技大学 一种黄素单加氧酶突变体及其制备方法
CN110305882A (zh) * 2019-06-21 2019-10-08 广东实验中学 一种降解四环素类抗生素的基因及其编码的酶蛋白
CN112280724A (zh) * 2020-10-27 2021-01-29 西安交通大学 含抗性标记的恶臭假单胞菌ND6偶联蛋白复合体dotN基因缺失突变菌及其构建方法、测定方法
CN112342177A (zh) * 2020-10-27 2021-02-09 西安交通大学 恶臭假单胞菌ND6偶联蛋白复合体dotM基因缺失突变菌及其构建方法、测定方法
CN112391328A (zh) * 2020-10-27 2021-02-23 西安交通大学 恶臭假单胞菌ND6偶联蛋白复合体dotL基因缺失突变菌及其构建方法、测定方法
CN114222841A (zh) * 2019-07-22 2022-03-22 尚科纺织企业工业及贸易公司 纺织品染色工艺
CN114703222A (zh) * 2022-03-15 2022-07-05 上海市农业科学院 一种可完全降解多环芳烃植物的培育方法

Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN101631865A (zh) * 2006-08-22 2010-01-20 哥本哈根大学 芥子油苷生物合成中涉及的黄素单加氧酶和转录因子

Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN101631865A (zh) * 2006-08-22 2010-01-20 哥本哈根大学 芥子油苷生物合成中涉及的黄素单加氧酶和转录因子

Non-Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
A. SINGH ET AL.: "Identification of two flavin monooxygenases from an effluent treatment plant sludge metagenomic library", 《BIORESOURCE TECHNOLOGY》, 29 June 2010 (2010-06-29), pages 8481 - 8484 *
W.J.H. VAN BERKEL ET AL.: "Flavoprotein monooxygenases, a diverse class of oxidative biocatalysts", 《JOURNAL OF BIOTECHNOLOGY》, 31 December 2006 (2006-12-31), pages 670 - 689 *
张强，等: "芳香化合物羟基化酶研究进展", 《应用与环境生物学报》, vol. 15, no. 4, 25 August 2009 (2009-08-25), pages 540 - 545 *

Cited By (13)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN105802986A (zh) * 2016-04-05 2016-07-27 北京工商大学 一种产靛蓝色素基因工程菌的构建方法与应用
CN107384880A (zh) * 2016-11-09 2017-11-24 天津科技大学 一种黄素单加氧酶突变体及其制备方法
CN110305882A (zh) * 2019-06-21 2019-10-08 广东实验中学 一种降解四环素类抗生素的基因及其编码的酶蛋白
CN114222841A (zh) * 2019-07-22 2022-03-22 尚科纺织企业工业及贸易公司 纺织品染色工艺
CN114222841B (zh) * 2019-07-22 2024-04-12 尚科纺织企业工业及贸易公司 纺织品染色工艺
CN112280724A (zh) * 2020-10-27 2021-01-29 西安交通大学 含抗性标记的恶臭假单胞菌ND6偶联蛋白复合体dotN基因缺失突变菌及其构建方法、测定方法
CN112391328A (zh) * 2020-10-27 2021-02-23 西安交通大学 恶臭假单胞菌ND6偶联蛋白复合体dotL基因缺失突变菌及其构建方法、测定方法
CN112342177B (zh) * 2020-10-27 2022-08-05 西安交通大学 恶臭假单胞菌ND6偶联蛋白复合体dotM基因缺失突变菌及其构建方法、测定方法
CN112391328B (zh) * 2020-10-27 2022-08-05 西安交通大学 恶臭假单胞菌ND6偶联蛋白复合体dotL基因缺失突变菌及其构建方法、测定方法
CN112280724B (zh) * 2020-10-27 2022-08-09 西安交通大学 恶臭假单胞菌ND6偶联蛋白复合体dotN基因缺失突变菌及其构建方法、测定方法
CN112342177A (zh) * 2020-10-27 2021-02-09 西安交通大学 恶臭假单胞菌ND6偶联蛋白复合体dotM基因缺失突变菌及其构建方法、测定方法
CN114703222A (zh) * 2022-03-15 2022-07-05 上海市农业科学院 一种可完全降解多环芳烃植物的培育方法
CN114703222B (zh) * 2022-03-15 2024-02-02 上海市农业科学院 一种可完全降解多环芳烃植物的培育方法

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